CN106434459B - 一株硝酸盐还原菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株硝酸盐还原菌及其应用，菌株分类命名为Nitratireductor lacus，保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60065，本发明所述菌株Nitratireductor lacus能够将土壤中硝酸盐还原为氨态氮，减少土壤氮流失及作物氮含量，具有节省肥料、提高作物质量等多重功效。Nitratireductor lacus菌株可应用于生物固氮、农业生产和制备微生物制剂，菌株本身和由其制备得到的微生物制剂都可以用于土壤固氮。

Description

一株硝酸盐还原菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种新菌种及其在环境工程领域的应用，具体涉及一株硝酸盐还原菌及其应用。
背景技术
氮是一种重要的营养元素，是植物体内氨基酸及蛋白质的组成部分，也是植物进行光合作用起决定作用的叶绿素的组成部分，对作物生长起着非常重要的作用。因此，增施氮肥作为农业生产中的主要增产因子已为越来越多的人们理解与承认。施用氮肥可以获得明显的增产效果，但农田中过量的氮素通过氨挥发、硝化\反硝化等方式从土壤中损失，造成湖泊、河流等水体的富营养化程度加剧。其中硝态氮因具有易于流失的特性，成为肥料氮土壤中淋溶损失的主要形态。研究表明，土壤中硝态氮过高，作物吸收中硝酸盐含量高，因此，硝酸盐的含量也直接影响作物品质。
一般认为，土壤中氮素发生淋溶损失必须具备两个条件；一是土壤中具有以移动性的氮素累积，主要为硝态氮；二是水分的流动。因此在水分管理充分的条件下，控制土壤硝态氮的含量成为控制氮素淋溶损失的主要因素。目前，控制土壤氮素损失的方式主要是在土壤中添加硝化抑制剂，抑制土壤中硝化作用，从而减少硝态氮含量。但硝化抑制剂均为化学物质，容易造成二次污染。
硝酸盐还原菌是指能够还原硝酸盐的微生物，其还原主要途径有两个：一是某些微生物能将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氧化二氮、一氧化氮及氮气，从而增加土壤氮素损失；二是将易淋溶的硝酸盐还原为较稳定的氨态氮，可以降低土壤氮素损失。因此，控制土壤中硝酸盐还原菌的种类及数量，可以控制土壤中氮素的转化途径，从而达到降低土壤氮素损失的目的。
发明内容
为了弥补现有微生物资源的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一株硝酸盐还原菌及其应用。
本发明的硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus GSS14从山西运城盐湖底泥中进行分离、纯化所得，菌株为革兰氏阴性菌，卵圆形，杆状，具双生鞭毛，菌体大小为0.6-0.8×1.0-2.0μm。在琼脂固体培养基平板上好氧培养3d后，菌落圆形，奶白色，中央突起，边缘半透明，菌落直径为2-3mm。生长温度为10-45℃，在盐浓度范围为0-12％条件下均能生长与增殖。发 明人于2016年8月25日将该硝酸盐还原菌送至位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏中心于2016年8月25日收到该微生物，保藏中心给予本发明耐盐硝酸盐还原菌的分类命名为Nitratireductor lacus，保藏号为GDMCCNo：60065。
本发明所述Nitratireductor lacus GSS14能够将土壤中硝酸盐还原为氨态氮，减少土壤中可移动的氮素含量，进而减少土壤氮流失及作物氮含量，具有节省肥料、提高作物质量等多重功效。Nitratireductor lacus GSS14菌株可应用于控制土壤氮转化途径，达到减少土壤硝态氮含量，并达到土壤固氮的效果。
附图说明
图1为硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus GSS14在5000倍下的扫描电镜照片。
图2为硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus GSS14的系统发育树。
具体实施方式
实施例1：芽孢杆菌Nitratireductor lacus GSS14的培养、分离、筛选及鉴定
1.1菌株的培养、分离
本发明的芽孢杆菌N.lacus GSS14是通过对山西运城盐湖底泥富集培养进行分离纯化得到的。
具体分离纯化方法包括以下步骤：
(1)取5.0g山西运城盐湖底泥接种于pH值为7.2的富集分离培养基中，30℃、200rpm/min震荡培养；当培养3d后，以10％的接种量将培养液转接至另一新鲜的富集分离培养基，30℃、200rpm/min震荡培养。
(2)富集培养四代后，将第四代的培养液采用稀释平板法稀释到10-5-10-6，将稀释后的培养液0.1mL均匀涂布于琼脂固体培养基上，置于30℃培养48h，挑取单菌落进行分离与纯化。
所述富集分离培养基为2216E培养基，培养基组分为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO30.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO3 0.004g，NaF 0.0024g，NH4NO30.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。所述固体琼脂培养基是在上述富集分离培养基中加入琼脂粉20g。
1.2菌体形态特性
采用常规的细菌电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性菌，棒状，兼性厌氧，菌菌体大小为0.6-0.8×1.0-2.0μm。生长温度为10-45℃，在盐浓度范围为0-12％条件下能生长与增殖。
1.3菌落形态特性
在2216E固体培养基平板上好氧培养3d后，菌落圆形，奶白色，中央突起，边缘半透明，菌落直径为2-3mm。
1.4生理生化特征
对菌株N.lacus GSS14进行生理生化特征的鉴定，其结果见表1。
表1.菌株生理生化鉴定结果
(表中：+表示为阳性，W表示为弱阳性，-表示为阴性)
由鉴定结果(表1)可知：菌株N.lacus GSS14兼性厌氧，能在12％NaCl的培养液中生长，而最适NaCl为6％；生长温度为10-50℃，最适生长温度为37℃；pH值为6.5-7.0，最适pH为7.5；接触酶阳性，氧化酶阳性；具有脲酶及七叶灵水解活性。菌株N.lacus GSS14能够利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、苹果酸作为唯一碳源；G+C含量为61％。
1.5分子生物学特征
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24：1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用16S rRNA通用引物F27和R1492R扩增细菌的16S rRNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。测序结果见SEQ ID NO.KX531008。将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。N.lacus GSS14的系统发育树结果见图2。
根据比对结果发现，该菌株与芽孢杆菌N.kimnyeongensis KY 101T的16S rRNA序列具较高同源性，相似度为98.2％；分子杂交结果显示，该菌株与N.kimnyeongensis KY101T DNA-DNA相关性为52％。
综上所述，16S rRNA同源序列比对可以确定本发明菌株N.lacus GSS14属于Nitratireductor属。但由于本发明菌株N.lacus GSS14具有许多与现有Nitratireductor属菌显著不同的表型特征，加上DNA-DNA杂交和分子生物学分析结果表明本发明菌株不属于Nitratireductor属的已有任何种。因此，根据现有数据，可以判定本发明菌株为Nitratireductor属的一个新种。命名为Nitratireductor.lacus GSS14，简写为N.lacusGSS14，于2016年8月25日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，编号为：GDMCC No.60065。
实施例2：硝酸盐还原菌N.lacus GSS14的硝酸盐还原效果
(1)从N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm/min摇床震荡培养36h，制得的发酵液即为种子液。
在Giltay基础培养中分别加入葡萄糖、乙酸钠、乳酸钠等不同碳源，调节培养液中C/N比为3:1。将上述培养液分装入500mL锥形瓶中，每瓶100mL，接种N.lacus GSS14接种液1mL，37℃、200rpm/min摇床中序批式培养，检测培养液中硝态氮氮和氨态氮的含量。产氨率＝(NH4-N含量/NO3-N初浓度)/NO3-N初浓度×100。
所述2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO3 0.004g，NaF 0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO40.008g，水1000mL，pH 7.2。
所述Giltay基础培养液组分为：KNO3 1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，FeCl3·2H2O 0.1g，CaCl2·6H2O 0.1g，蒸馏水1L。
结果表明，培养72h后，培养液中硝态氮减少68％，氨态氮增加65％，表明N.lacusGSS14能够将氨态氮还原为硝态氮。
实施例3：微生物菌剂的制备
(1)摇瓶培养：从N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一环接入装有100mL 2216E液体培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm/min摇床震荡培养24h。所述的述的2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO30.004g，NaF 0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。
(2)种子罐发酵：将上述培养好的N.lacus GSS14发酵液接入10L发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养36h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(3)发酵罐发酵：将上述培养好的N.lacus GSS14发酵液接入发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养48h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(4)菌剂制备：将上述发酵液加入固体辅料中，固体辅料与发酵液的质量比为1.5∶1，搅拌均匀，28℃烘干，粉碎，经40目过筛，包装装袋。固体辅料含有活性炭60％，硅藻土40％。制得的脱氮微生物菌剂成品经活菌计数，总菌数达到5亿/克以上。
实施例4：微生物菌剂的制备
(1)摇瓶培养：从N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基的锥形瓶中，45℃、240rpm/min摇床震荡培养24h。所述的述的2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO3 0.004g，NaF0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。
(2)种子罐发酵：将上述培养好的N.lacus GSS14发酵液接入10L发酵罐中，45℃、200rpm/min发酵培养24h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(3)发酵罐发酵：将上述培养好的N.lacus GSS14发酵液接入发酵罐中，45℃、200rpm/min发酵培养48h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(4)菌剂制备：将上述发酵液加入固体辅料中，固体辅料与发酵液的质量比为2∶1，搅拌均匀，28℃烘干，粉碎，经40目过筛，包装装袋。固体辅料含有活性炭40％，硅藻土60％。制得的脱氮微生物菌剂成品经活菌计数，总菌数达到5亿/克以上。
实施例5：微生物菌剂N.lacus GSS14应用
试验采用盆栽方式，共设计2个处理，每个处理设4个重复，完全随机设计，共8盆。处理1为施用微生物菌剂N.lacus GSS14，施用量为0.1g/kg，处理2为对照，即不施用微生物菌剂。肥料与微生物菌剂以基肥方式一次性施入，肥料成分为尿素0.36g/kg、过磷酸钙(P2O5)0.28g/kg和氯化钾(K2O，20％)0.59g/kg。其余栽培及田间管理措施均按常规措施处理。定期取样测定土壤中硝态氮含量。小白菜成熟后将小白菜整株用自来水冲洗干净后再用去离子水冲洗两遍，晾干称重后，将植株分为根部和地上部，称植株地上部位鲜重，并测定地上部硝酸盐含量。
结果表明，随着时间的推移，施用N.lacus GSS14微生物制剂后土壤中硝酸盐含量明显减少，而小白菜中硝态氮含量为110.02mg/kg，明显低于对照的172.15，说明微生物菌剂N.lacus GSS14在减少氮流失的同时可降低小白菜中硝态氮含量，从而提高作物品质。
表2土壤硝态氮含量的变化(mg/kg)
实施例6：微生物菌剂N.lacus GSS14应用
在种植作物之前以施用基肥的方式按每公顷50kg的比例施用实施例4制备的N.lacusGSS14微生物菌剂，其他肥料及栽培措施按常规处理，以不施微生物菌剂的处理为对照。施肥后种植小白菜，品种为F-339。每个处理3个平行，每个平行10m2。每隔5d取样测定土壤中硝态氮含量。小白菜成熟后取样测定小白菜中硝态氮含量。结果表明，随着时间的推移，施用N.lacus GSS14微生物制剂后土壤中硝酸盐含量明显减少，而小白菜中硝态氮含量为123.45mg/kg，明显低于对照的189.35，说明微生物菌剂N.lacus GSS14在减少氮流失的同时可降低小白菜中硝态氮含量，从而提高作物品质。
表3土壤硝态氮含量的变化

Claims (6)

1.硝酸盐还原菌，其分类命名为Nitratireductor lacus，保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60065。
2.权利要求1所述的硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus在制备的固氮微生物制剂的应用。
3.权利要求1所述的硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus在制备的农业生产微生物制剂的应用。
4.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有权利要求1所述的硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus。
5.一种土壤固氮的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的硝酸盐还原菌Nitratireductor lacus接种到土壤中的步骤。
6.一种土壤固氮的方法，其特征在于，包括将权利要求4所述的微生物制剂投入土壤中的步骤。
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