CN109652328A - 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用 - Google Patents

一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109652328A
CN109652328A CN201811547949.8A CN201811547949A CN109652328A CN 109652328 A CN109652328 A CN 109652328A CN 201811547949 A CN201811547949 A CN 201811547949A CN 109652328 A CN109652328 A CN 109652328A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
medium
obtains
cfu
bacillus cereus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811547949.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109652328B (zh
Inventor
黄玉杰
王加宁
宋繁永
陈贯虹
高永超
张闻
赵庆庆
王磊磊
郑立稳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Aerospace Weike Environmental Protection Technology Co., Ltd
Original Assignee
Ecology Institute Shandong Academy Of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecology Institute Shandong Academy Of Sciences filed Critical Ecology Institute Shandong Academy Of Sciences
Priority to CN201811547949.8A priority Critical patent/CN109652328B/zh
Publication of CN109652328A publication Critical patent/CN109652328A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109652328B publication Critical patent/CN109652328B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/341—Consortia of bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/347—Use of yeasts or fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/348—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used characterised by the way or the form in which the microorganisms are added or dosed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/20—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from animal husbandry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用。本发明中的复合微生物活菌制剂，是由蜡样芽胞杆菌2‑2、假单胞菌C2‑1、曼氏毕赤酵母2‑6和玉米乳杆菌2‑20组成的菌悬液，其中，蜡样芽孢杆菌2‑2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2‑1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2‑6活菌数大于等于0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2‑20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL。该复合微生物活菌制剂来处理含有高浓度COD和NH3‑N的废水，可实现COD和氮的高效去除。

Description

一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用
技术领域
本发明涉及一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用，属于高浓度养猪废水处理技术领域。
背景技术
畜禽养殖业是造成我国农村水源污染的主要原因之一。随着我国畜禽业的飞速发展，畜禽养殖废水污染问题日益严重，严重污染了地表水、地下水、土壤和环境空气，直接影响了人们的身体健康和正常生活。因此如何在畜禽业稳定发展的同时保护好生态环境，已成为目前研究的重点和难点。
养殖场中废弃物处理的目的是将其无害化、减量化和资源化，最大限度地满足环境可接受性及可行性。养殖场废水中有机物含量高，例如养猪场排放废水的COD在10000mg/L-30000mg/L之间，一般好氧工艺难以处理，针对养殖废水特性并结合各种工艺优势，主要采用厌氧工艺处理。目前我国养殖场中粪污清理方式主要采用人工清粪，清出的鲜粪作肥料，废水进入化粪池进行简单的处理，致使周围环境污染严重。部分养殖场采用生态循环方式进行处理，这种生态循环处理方法虽然消除了环境污染，有一定的经济效益，但由于养殖场的饲养规模偏大，粪污的排放总量与周围农田面积和农作物的消纳能力匹配不足，致使养殖废水无法及时消纳，导致土壤、地下水污染更严重。
微生物具有体积小，繁殖力强、适应范围广、应用效果好等特点，随着科学技术的发展，利用微生物处理污水技术近年来逐渐受到人们的重视，并在污水处理等领域中得到广泛应用。污水中具备微生物生长繁殖的各样营养条件，因而微生物能从污水中获取养分，同时利用有害物质作为碳氮源及营养元素，使其得到降解，最终使污水得到净化。微生物制剂主要由有机微生物构成，对环境没有危害，而且能够促进生物链的合理化和高效化。中国专利文献 CN104211184A公开了一种用于畜禽养殖废水处理的微生物污水处理剂，该微生物污水处理剂按照重量计包括以下活性成分：10-20份硝化细菌、15-30份反硝化细菌、10-50份芽孢杆菌、5-20份生物酶、5-15份乳酸菌群、10-20份酵母菌群、20-40份光合菌群，单种菌的每克培养基中均含有不低于2.0亿个活性菌；具有高效的处理效果，使得废水达标排放。我国于 20世纪90年代才开展相关实验室研究工作，实验室内已形成了成熟的菌种培养技术，通过不同的菌株复合，提高污水处理效率，但混合菌的发酵工艺还有待优化。因此微生物污水处理菌剂及其技术在今后理论研究与实际应用中还需要进一步加强筛选和驯化适宜微生物，研发高效、经济、环保的混合菌株。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用。结合我国养殖场废水污染现状，本发明提供了四株菌，分别是蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1、曼氏毕赤酵母(Pichiamanshurica)2-6、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20，以及这四株菌的筛选方法，同时提供了由这四株菌制备的复合微生物活菌制剂，及其在处理高浓度养猪废水中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种复合微生物活菌制剂，是由蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1、曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20组成的菌悬液，其中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数大于等于 0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL。
进一步优选的，所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16527，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步优选的，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16530，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步优选的，所述曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16529，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步优选的，所述玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16528，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述复合微生物活菌制剂的制备方法，步骤如下：
(1)菌悬液的制备
利用营养肉汤琼脂培养基活化培养蜡样芽胞杆菌2-2，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100(g/mL)进行稀释，得蜡样芽胞杆菌 2-2菌悬液；
利用营养肉汤琼脂培养基活化培养假单胞菌C2-1，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100(g/mL)进行稀释，得假单胞菌C2-1菌悬液；
利用YPD固体培养基活化培养曼氏毕赤酵母2-6，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于YPD培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100(g/mL)进行稀释，得曼氏毕赤酵母2-6菌悬液；
利用MRS固体培养基活化培养玉米乳杆菌2-20，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于MRS培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，再静置培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100(g/mL)进行稀释，得玉米乳杆菌 2-20菌悬液；
(2)将步骤(1)中制备得到的蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、假单胞菌C2-1菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液混匀，即得复合微生物活菌制剂；其中，所述复合微生物活菌制剂中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数大于等于0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL。
根据本发明优选的，上述培养基的组成如下：
营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为营养肉汤琼脂培养基；
YPD培养基：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为YPD固体培养基；
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0 g，其他不变，即为MRS固体培养基。
上述复合微生物活菌制剂在高浓度养猪废水中的应用，步骤如下：取高浓度养猪废水，利用氢氧化钠或者盐酸调整废水的pH值到6.5-7.5，将上述复合微生物活菌制剂按照与反应总体系的体积百分比为5％-10％的接种量接种到高浓度养猪废水中，25-35℃静置，期间每天曝气2-4次。
根据本发明优选的，所述静置的时间为7-12天。
有益效果：
本发明利用蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1、曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20组成的复合微生物活菌制剂来处理含有高浓度COD和NH3-N的废水，可实现COD和氮的高效去除。本发明制备的复合微生物活菌制剂可应用于各类养殖场废水处理中的生物脱氮工艺，同时对各种环境水体的富营养化污染防治也具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：不同接种量的复合微生物活菌制剂对养猪废水COD去除效果图；
图2：不同接种量的复合微生物活菌制剂对养猪废水NH3-N去除效果图；
图3：不同接种量的复合微生物活菌制剂的菌群在处理高浓度养猪废水时生长曲线；
图中，横坐标为废水处理时间，单位：h；纵坐标为OD600值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例用于说明本发明，而不是限定本发明。
实施例1菌株的分离
取养猪场粪便10g，放入到含有灭菌玻璃珠和50mL生理盐水的三角瓶中，于30℃，150r/min震荡2h，静置20min，取上清液1mL，用灭菌生理水连续作10倍梯度稀释，吸取不同稀释度悬液200μL，分别涂布在MRS固体培养基、营养肉汤琼脂培养基、YPD固体培养基上，28℃培养28-72h，观察菌株的生长情况，挑取单菌落进行培养。根据菌株形态及生长情况，挑取形态各异的菌株进行划线培养并低温保存。共分离40株菌，其中26株细菌，8 株酵母菌，6株乳酸杆菌。
上述培养基及其配方如下：
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为MRS固体培养基；
营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为营养肉汤琼脂培养基；
YPD培养基：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为YPD固体培养基。
实施例2：菌株的筛选及鉴定
1菌株的初筛
将150g新鲜猪粪加入到500mL带塞的锥形瓶中，按照体积百分比5％的接种量分别接种实施例1的分离菌株，于30℃恒温箱中培养10天，采用感官法评定臭味等级，结果见表1。从表1中可以看出，分离的微生物除臭能力各异，与对照相比，发现有三株细菌，一株乳酸菌，两株酵母菌具有较好的除臭能力。
感官法评定臭味等级，采用6级法划分气体臭度：
0级：无臭味，用“-”表示；
1级：勉强感觉到臭味，用“+”表示；
2级：微弱臭味，用“++”表示；
3级：臭味明显，用“+++”表示；
4级：臭味强烈，用“+++”表示；
5级：臭味难以忍受，用“++++”表示。
表1：利用感官法初步筛选除臭菌株
菌种编号 臭味等级 菌种编号 臭味等级 菌种编号 臭味等级 菌种编号 臭味等级
2-1 ++ 2-12 ++ C2-1 ++ C2-14 ++
2-2 ++ 2-15 ++++ C2-3 ++ C2-15 +++
2-4 +++ 2-17 ++++ C2-7 ++++ C2-16 ++++
2-6 ++++ 2-19 +++ C2-9 +++ C2-17 ++++
2-10 +++ 2-20 ++++ C2-11 ++++ C2-19 ++
2菌株的复筛
通过分别测定氨气和硫化氢气体的释放量进行菌株的复筛。
2.1除氨菌的筛选
按照体积百分比10％的接种量将菌株加入到含200g新鲜粪便的1000mL带盖的塑料烧杯中，充分混匀。每个大烧杯中放置1个装有30mL硼酸吸收液的50mL小烧杯，用以吸收氨气。封口密闭，28℃静置发酵3天，然后开始检测发酵粪便中氨气的释放量，添加相同体积的无菌水为阴性对照，每个处理重复3次。以甲基红-亚甲蓝为指示剂，采用硼酸吸收凯氏定氮法测定氨气释放量。与空白对照组菌株进行差异显著性分析，计算氨气的去除率，确定除臭菌株。
2.2除硫化氢菌的筛选
按照体积百分比10％的接种量将菌株加入到含200g新鲜粪便的1000mL带盖的塑料烧杯中，充分混匀。每个大烧杯中放入装有30mL碱性锌氨络盐溶液的50mL小烧杯，用于吸收硫化氢。封口密闭，28℃静置发酵3天，然后开始检测发酵粪便中硫化氢的释放量，添加相同体积的无菌水为阴性对照，每个处理重复3次。采用锌铵络盐比色法测定。与空白对照组菌株进行差异显著性分析，计算硫化氢的去除率，确定除臭菌株。
表2复筛菌株的除臭效果
处理 2-2 2-6 2-20 C2-1 C2-13 C2-19
氨气去除率/％ 62.79 55.22 42.86 52.04 36.26 25.64
硫化氢去除率/％ 49.22 52.49 46.39 35.68 37.04 22.01
由表2可以看出，菌株2-2对NH3的除臭效果最好，达到了60％以上，菌株2-6对NH3和H2S的去除率均达到了50％以上，表现了最佳的除臭性能。另外，菌株2-20也表现了较好的除臭效果，对NH3和H2S的去除率分别是42.86％和46.39％，菌株C2-1对NH3去除率较好为52.04％。其他菌株包括C2-13和C2-19对NH3和H2S的去除率表现一般，因此选择菌株 2-2、2-6、2-20、C2-1作为复合生物除臭菌的功能菌株。
2.3除臭微生物的菌种鉴定
2.3.1生理生化检测
将获得的各菌株接种于培养基上，28℃培养48h后，观察并记录菌落生长状况和菌落形态，显微镜下观察并记录菌体形态，并对各菌株进行生理生化测试。包括革兰氏染色、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚实验、VP实验、淀粉水解试验、硝酸盐及葡萄糖发酵检测。结果见表3。
菌株2-2在营养固体培养基上生长菌落呈乳白色，不透明，圆形或近似圆形，凸起，菌体单个，杆状，有芽孢。菌株C2-1在营养固体培养基上生长菌落呈淡黄色，不透明，圆形或者近似圆形，菌体单个，杆状，无芽孢。菌株2-6为酵母菌，在PDA琼脂平板上生长菌落呈白色，不透明，圆形，凸起，表面光滑，细胞椭圆形，适宜生长温度25-35℃，兼性厌氧。将菌株2-20在MRS培养基上培养，发现菌落呈乳白色，圆形，菌落中等大小，微凸起，湿润，边缘整齐，细胞形状为杆状，适宜生长温度25-35℃，有酸性气味，兼性厌氧。
获得的4株除臭菌株的生理生化实验结果如表3所示。
表3除臭菌株生理生化特征
处理 2-2 C2-1 2-6 2-20
细菌形态 杆状 杆状 短杆 短杆
革兰氏 + - + +
需氧型 好氧 好氧 兼性厌氧 兼性厌氧
过氧化氢酶 + + + -
明胶液化 + - + -
吲哚实验 - + + -
VP实验 + - + -
淀粉水解 + - + +
硝酸盐 - + - -
葡萄糖发酵 产酸不产气 产酸不产气 产酸不产气 产酸不产气
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
2.3.2分子验证
将2-2、C2-1、2-6、2-20分别接种在营养肉汤、YPD、MRS液体培养基中，28℃摇床培养36h，12000rpm离心收集菌体，利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒和Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒分别提取2-2、C2-1、2-20和2-6。利用引物7F和1540R对菌株 2-2、C2-1和2-20进行PCR扩增，利用引物NL1和NL4对菌株2-6进行PCR扩增。
上述引物序列如下：
7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’
1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’
NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’
PCR产物纯化后送至上海生物工程股份有限公司进行序列测定，测序结果与NCBI网站数据库中的序列进行同源性比对分析。最终这四株除臭菌株的生理生化特性结合分子验证，认为本专利中涉及到的四株菌2-2，C2-1，2-6，2-20分别是蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)。
经研究，上述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1、曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20除了具有除臭的能力，还具有除去废水中COD和NH3-N的能力。
实施例3
复合微生物活菌制剂的制备方法，步骤如下：
(1)菌悬液的制备
利用营养琼脂培养基活化培养蜡样芽胞杆菌2-2，活化培养48h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，160rpm，摇床培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比2％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养36h，获得培养菌液；将培养菌液在5000rpm下离心20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：50(g/mL)进行稀释，得蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液；
利用营养肉汤琼脂培养基活化培养假单胞菌C2-1，活化培养48h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，160rpm，摇床培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比2％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养36h，获得培养菌液；将培养菌液在5000rpm下离心20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：50(g/mL)进行稀释，得假单胞菌C2-1菌悬液；
利用YPD固体培养基活化培养曼氏毕赤酵母2-6，活化培养48h后得单菌落，挑取单菌落接种于YPD培养基试管中，25-35℃，160rpm，摇床培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比2％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养36h，获得培养菌液；将培养菌液在6000rpm下离心18min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：50(g/mL)进行稀释，得曼氏毕赤酵母2-6菌悬液；
利用MRS固体培养基活化培养玉米乳杆菌2-20，活化培养48h后得单菌落，挑取单菌落接种于MRS培养基试管中，25-35℃，160rpm，摇床培养24h，再静置培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比2％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养36，获得培养菌液；将培养菌液在7000rpm下离心15min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：50(g/mL)进行稀释，得玉米乳杆菌2-20菌悬液；
(2)将步骤(1)中制备得到的蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、假单胞菌C2-1菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液混匀，即得复合微生物活菌制剂；其中，所述复合微生物活菌制剂中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数大于等于0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL。
其中，所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16527，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16530，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16529，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20，2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16528，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述培养基配方同实施例1。
实施例4复合微生物活菌制剂处理养猪废水
取250mL三角瓶，每瓶含180mL高浓度养猪废水，利用氢氧化钠或者盐酸调整废水的pH 值到7.0，分别接种实施例3制备的复合微生物活菌制剂5mL、10mL、15mL、20mL，最终体积为200mL，不足200mL的添加无菌生理盐水补充到200mL。25-35℃下静置培养，每隔12小时进行人工曝气，每隔24小时取样，在0.22μm的滤膜下抽滤，利用去离子水稀释抽滤后的滤液，采用快速消解分光光度法测定稀释后的滤液中化学耗氧量(COD)，采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮含量(NH3-N)，最终计算处理前后废水中的COD和NH3-N去除率，其中，上述高浓度养猪废水COD含量是18810mg/L，NH3-N含量是3683.6mg/L。
不同复合微生物活菌制剂接种量对高浓度养猪废水COD的处理结果见图1，不同接种量的复合微生物活菌制剂对COD均具有一定的去除效果，尤其是处理到第7天时，各个处理对 COD的去除率均达到了57％以上，加入菌剂第9天后，接种量为5.0％及以上的复合微生物活菌制剂对COD的去除率达到70％以上，处理到12天后，接种量为7.5％和10.0％的复合微生物活菌制剂对高浓度养猪废水的COD去除率分别是80.09％和80.55％，均超过了80％，说明该菌剂对高浓度养猪废水具有较好的COD去除效果，尤其是复合微生物活菌制剂接种量为7.5％时，第7天COD去除率就达到63.30％。
不同复合微生物活菌制剂接种量对高浓度养猪废水NH3-N的处理结果见图2，不同接种量的复合微生物活菌制剂对高浓度NH3-N均具有一定的去除效果，尤其到第9天时，各个处理对NH3-N的去除率均达到了40％以上，处理到12天后，接种量为7.5％和10.0％的复合微生物活菌制剂对高浓度NH3-N的去除率分别是51.13％和52.85％，两者之间差异不显著。
实施例5复合微生物活菌制剂的菌群在处理养猪废水时的生长曲线变化
取250ml三角瓶，每瓶处理方法同实施例4，25-35℃下静置培养，定时采用分光光度计检测废水的OD600，结果如图3所示。复合微生物活菌制剂接种到废水后，随着时间的延长，细菌大量繁殖，废水逐渐浑浊，菌群的生物量增长主要集中在前36h，OD600随着时间的延长而增大，36小时后各处理组混合菌群都呈现下降趋势，细菌总体含量减少，是由于微生物大量繁殖，竞争废水中的有限碳氮源及营养物质，微生物的生长代谢受到抑制。
对比例1
按照实施例3所述的菌悬液的制备方法，制备得到蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、假单胞菌 C2-1菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液。
将蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液混合，得复合微生物活菌制剂I，其中，所述复合微生物活菌制剂I中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数为 1.68×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数为1.32×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数为 2.08×1010CFU/mL，活菌总数为5.08×1010CFU/mL。
以假单胞菌C2-1菌悬液为微生物活菌制剂II，其中，假单胞菌C2-1活菌数为 4.54×1010CFU/mL。
将蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、假单胞菌C2-1菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液混合，得复合微生物活菌制剂III，其中，所述复合微生物活菌制剂III中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数为1.68×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数为4.54×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数为1.32×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数为2.08×1010CFU/mL。
将上述复合微生物活菌制剂按照实施例4所述的方法处理养猪废水，接种量为7.5％，处理到第7天时，计算处理前后废水中的COD和NH3-N去除率，结果如表4所示，说明在复合微生物活菌制剂中假单胞菌C2-1与蜡样芽胞杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6、玉米乳杆菌2-20 有较好的协同增效的作用，用于处理养猪废水中COD和NH3-N的去除具有较好的效果。
表4不同活菌制剂对养猪废水中COD和NH3-N的去除效果
微生物活菌制剂 I II III
COD去除率/％ 40.67±0.57A 15.03±3.05A 64.69±4.15B
NH<sub>3</sub>-N去除率/％ 30.17±5.12AB 11.53±3.64A 52.98±2.21B
注：不同大写字母表示0.01水平上差异显著。

Claims (6)

1.一种复合微生物活菌制剂，其特征在于，是由蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1、曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20组成的菌悬液，其中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数大于等于0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL；
其中，所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)2-2，2018年09月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16527，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)C2-1，2018年09月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16530，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述曼氏毕赤酵母(Pichia manshurica)2-6，2018年09月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16529，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)2-20，2018年09月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16528，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的复合微生物活菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)菌悬液的制备
利用营养肉汤琼脂培养基活化培养蜡样芽胞杆菌2-2，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100进行稀释，单位：g/mL，得蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液；
利用营养肉汤琼脂培养基活化培养假单胞菌C2-1，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100进行稀释，单位：g/mL，得假单胞菌C2-1菌悬液；
利用YPD固体培养基活化培养曼氏毕赤酵母2-6，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于YPD培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100进行稀释，单位：g/mL，得曼氏毕赤酵母2-6菌悬液；
利用MRS固体培养基活化培养玉米乳杆菌2-20，活化培养45-50h后得单菌落，挑取单菌落接种于MRS培养基试管中，25-35℃，150-180rpm，摇床培养18-24h，再静置培养24h，获得种子液；取种子液，按照体积比1-5％转接到相同培养基中，相同条件下进行扩大培养，获得培养菌液；将培养菌液在5000-8000rpm下离心10-20min，弃上清液获得菌体细胞，用0.9％生理盐水按照湿菌体重量与生理盐水体积比为1：20-100进行稀释，单位：g/mL，得玉米乳杆菌2-20菌悬液；
(2)将步骤(1)中制备得到的蜡样芽胞杆菌2-2菌悬液、假单胞菌C2-1菌悬液、曼氏毕赤酵母2-6菌悬液、玉米乳杆菌2-20菌悬液混匀，即得复合微生物活菌制剂；其中，所述复合微生物活菌制剂中，蜡样芽孢杆菌2-2活菌数大于等于1.48×1010CFU/mL，假单胞菌C2-1活菌数大于等于2.04×1010CFU/mL，曼氏毕赤酵母2-6活菌数大于等于0.98×1010CFU/mL，玉米乳杆菌2-20活菌数大于等于1.78×1010CFU/mL。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，上述培养基的组成如下：
营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为营养肉汤琼脂培养基；
YPD培养基：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为YPD固体培养基；
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6，115℃灭菌30min，备用；该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为MRS固体培养基。
4.权利要求1所述的复合微生物活菌制剂在处理高浓度养猪废水中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：取高浓度养猪废水，利用氢氧化钠或者盐酸调整废水的pH值到6.5-7.5，将上述复合微生物活菌制剂按照与反应总体系的体积百分比为5％-10％的接种量接种到高浓度养猪废水中，25-35℃静置，期间每天曝气2-4次。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述静置的时间为7-12天。
CN201811547949.8A 2018-12-18 2018-12-18 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用 Active CN109652328B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811547949.8A CN109652328B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811547949.8A CN109652328B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109652328A true CN109652328A (zh) 2019-04-19
CN109652328B CN109652328B (zh) 2020-03-13

Family

ID=66114718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811547949.8A Active CN109652328B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109652328B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111137972A (zh) * 2020-02-26 2020-05-12 北京联合大学 一种快速生成废水处理用活性污泥的方法
CN113249276A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 王清 一种蜡样芽孢杆菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302485A (zh) * 2008-07-07 2008-11-12 中国科学院成都生物研究所 一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途
CN104211184A (zh) * 2014-08-07 2014-12-17 镇江华域环保设备制造有限公司 一种用于畜禽养殖废水处理的微生物污水处理剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302485A (zh) * 2008-07-07 2008-11-12 中国科学院成都生物研究所 一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途
CN104211184A (zh) * 2014-08-07 2014-12-17 镇江华域环保设备制造有限公司 一种用于畜禽养殖废水处理的微生物污水处理剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YE F X 等: "Preparation of complex microbial adsorbent for deodorization and its application to deodorization", 《TRANS CHIN SOC AGRIC ENG》 *
张军合 等: "光照度对猪粪污水条件下红假单胞菌光合产氢的影响", 《农业工程学报》 *
黄玉杰 等: "微生物除臭剂在畜禽粪便无害化处理中的应用进展", 《当代畜牧》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111137972A (zh) * 2020-02-26 2020-05-12 北京联合大学 一种快速生成废水处理用活性污泥的方法
CN111137972B (zh) * 2020-02-26 2022-04-19 北京联合大学 一种快速生成废水处理用活性污泥的方法
CN113249276A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 王清 一种蜡样芽孢杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109652328B (zh) 2020-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103232944B (zh) 一种秸秆与粪便混合堆肥微生物菌剂
CN104667320B (zh) 一种用于处理生活垃圾的复合微生物除臭剂及其制备方法
CN109182193A (zh) 微生物菌剂及其制备方法和应用
CN108048344B (zh) 两株除臭菌株及其在制备复合生物除臭剂中的应用
CN106906170A (zh) 复合微生物菌剂及其制备方法和应用
CN104312938B (zh) 恶臭假单胞菌菌株及其菌剂和应用
CN109609401A (zh) 一种复合微生物除臭菌剂及其制备方法与应用
CN108949739A (zh) 一种用于深度处理高浓度畜禽养殖废水的复合微生物菌剂及其制备方法
CN104164394A (zh) 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用
CN104707864B (zh) 强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂及其制备方法
CN105950495B (zh) 一株甲基营养型芽胞杆菌及其在畜禽养殖废水处理中的应用
CN106167776A (zh) 一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TH‑35及其应用
CN109762767B (zh) 一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用
CN108913626B (zh) 一种禽畜粪便除臭复合菌剂及其制备方法
CN106754571B (zh) 一种复合微生物除臭剂及其制备方法
CN104787899A (zh) 一种海洋水产养殖用抑菌型水质净化剂及其制备方法
CN105950516B (zh) 一株降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌的细菌菌株及其应用
CN106754572A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其用途
CN102250808A (zh) 一株产acc脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途
CN116396888A (zh) 一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂及其制备方法
CN109652328A (zh) 一种复合微生物活菌制剂及其在高浓度养猪废水中的应用
CN108504585A (zh) 一种治理大气污染的苯降解菌及其制备方法和应用
CN108192845B (zh) 动物尸体无害化处理用酶菌复合剂及其制备方法
CN110229762A (zh) 一株具有植物促生作用的氢氧化细菌及其分离培养和应用
CN106222107B (zh) 一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200217

Address after: 102401 a8-1590, No.1, Yuehua street, Gongchen street, Fangshan District, Beijing

Applicant after: Beijing Aerospace Weike Environmental Protection Technology Co., Ltd

Address before: 250014 Shandong Province, Lixia District, Ji'nan City Hospital Road, No. 19

Applicant before: Ecology Institute Shandong Academy of Sciences

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant