CN115161204A - 天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基，培养基包括一级种培养基、二级种培养基和栽培种培养基；培养方法包括：将菌株蜜环菌进行活化培养的菌种活化复壮工序；将菌种活化复壮工序所得活化好的菌种接种在一级种培养基上进行培养的扩大化培养工序；将扩大化培养工序所得蜜环菌一级种接种在二级种培养基上进行培养的扩繁培养工序；将扩繁培养工序所得蜜环菌二级种接种在栽培种培养基上进行培养的栽培种培养工序。本发明提供的培养方法及培养基，解决了现有蜜环菌培养方法及培养基致使蜜环菌培养周期长、活力弱、成品率低、生产成本高、抗病及抗逆性弱、易退化等，进而导致天麻栽培时出现烂麻、空窝、天麻产量和品质下降的问题。

Description

天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基
技术领域
本发明涉及天麻种植技术领域，尤其涉及一种天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Blume)为兰科多年生共生草本植物，是传统的名贵中药。天麻具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗衰老、有助于记忆力、改善循环及免疫功能等药理作用。天麻的营养方式为异养型，须与萌发菌(如紫萁小菇)和蜜环菌共生获取营养，完成生长发育。天麻生长过程如下：靠小菇属等种子萌发菌供给营养，促使天麻种子萌发，发芽得到的原球茎靠同化蜜环菌才能正常生长，而蜜环菌在生长过程中能够产生菌索，菌索能够从为其提供营养物质的树木中分解木质素和纤维素，再转而向天麻供给营养，天麻才能进行自身正常的生长发育。因此，蜜环菌品质的好坏、生长特性将直接影响到天麻的品质和产量。
在天麻栽培生产中，要先制作出优质的、成品率高的蜜环菌菌种，这将直接影响或决定着天麻的产量和品质，也关系着栽培户的经济效益。目前天麻栽培生产中，蜜环菌的制种方法是：从分离材料(基质、菌索、子实体)上获得菌种后，培养成一级种(即母种)，然后再培养成二级种(即原种)，最后培养成栽培种。然而，蜜环菌厂家在培养蜜环菌时，经常出现培养方法不当、培养基配制不合理的情况，导致相同规格的一支一级种通常只能扩接6瓶左右二级种，蜜环菌的品质也参差不齐，还存在蜜环菌的培养周期长、活力弱、成品率低、生产成本高、抗病及抗逆性弱、易退化等缺点。又由于目前蜜环菌的生产比较混乱，栽培户种植天麻时，无法区分和试验就将蜜环菌菌种直接投入生产，因而导致烂麻、空窝、天麻产量和品质下降的事件屡屡发生。
因此，建立天麻种植共生用蜜环菌的明确并配套的培养方法及其培养基，用于培养出成本低、生产效率高、品质稳定的蜜环菌，对于提高天麻产量和品质具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基，用以解决现有蜜环菌培养方法及培养基致使蜜环菌的培养周期长、活力弱、成品率低、生产成本高、抗病及抗逆性弱、易退化等，进而导致天麻栽培时出现烂麻、空窝、天麻产量和品质下降的问题。
第一方面，本发明提供一种天麻种植共生用蜜环菌的培养基，包括：一级种培养基、二级种培养基和栽培种培养基；一级种培养基的成分及重量份如下：玉米粉195-205份，麦麸95-105份，红糖15-17份，琼脂15-17份，磷酸二氢钾2-2.5份，硫酸镁1-1.5份，水1950-2050份；
二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-52％，棉籽壳19-20％，玉米粉14-16％，麦麸14-16％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1‰，含水量65-68％；
栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-53％，棉籽壳15-18％，颗粒状玉米粉20-22％，麦麸10-13％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1.5‰，含水量67-72％。
本发明提供的一级种培养基、二级种培养基和栽培种培养基分别适用于蜜环菌培养的不同阶段，各阶段的培养基能提供最适宜的营养成分，增强菌丝对各种营养元素的吸收和转化，促进菌丝生长和子实体形成，培养得到的蜜环菌栽培种的产量高，对食用菌采收后，菌丝体恢复快，转茬快，增产增收效果明显。
上述的三种培养基一一对应的，在一级种培养时能显著缩短萌发时间，促进菌丝生长；二级种培养时能增强菌丝活力，使得蜜环菌长势优良；栽培种培养时能促进菌索粗壮生长，保证菌索分叉少、活力强；最后得到的蜜环菌栽培种用于天麻种植后，菌索能够快速侵染菌材，有效降低烂麻、空窝的现象。
根据本发明，二级种培养基中的玉米粉的粒度为16-24目；栽培种培养基中的颗粒状玉米粉的粒度为8-10目。
第二方面，本发明提供一种天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，包括：将菌株蜜环菌进行活化培养的菌种活化复壮工序；将菌种活化复壮工序得到的活化好的菌种接种在一级种培养基上进行培养的扩大化培养工序；将扩大化培养工序得到的蜜环菌一级种接种在二级种培养基上进行培养的扩繁培养工序；和，将扩繁培养工序得到的蜜环菌二级种接种在栽培种培养基上进行培养的栽培种培养工序。
本发明中将保藏期菌种进行活化后，分阶段培养成一级种、二级种和栽培种，最终得到的蜜环菌栽培种生长状况良好，缩短了蜜环菌栽培种的生产周期，菌索生长旺盛且粗壮；所得菌索的分枝多且干重量大，蜜环菌栽培种的性状优良，实用性强，生产效率高且品质稳定，对天麻有很好的促生作用，能提高天麻的产量。
优选地，上述扩大化培养工序、扩繁培养工序和栽培种培养工序的培养条件为：温度20-24℃，空气相对湿度50-60％，通风，避光。一级种、二级种和栽培种在培养期间，蜜环菌的菌丝生长迅速，培养期结束后，整个瓶身中布满菌丝，菌索粗壮，活力旺盛，且培养时间短，生产的时间成本显著降低。
根据本发明，菌种活化复壮工序的步骤如下：将保藏的蜜环菌菌株取出，按接种量0.5-3％接种于一级种培养基上进行活化培养，待菌丝、菌索长满培养基，即得到活化好的菌种。
根据本发明，活化培养条件为：温度为23-25℃，湿度为60-70％，时间为5-8d。蜜环菌菌株在保藏期间通常都采取低温保藏，使得蜜环菌处于半休眠的状态，以保证在保藏期间蜜环菌的种性不会发生明显变化，因此，在培养蜜环菌之前，要先对蜜环菌菌株进行活化。在活化的过程中，采用针对性的一级种培养基，有利于蜜环菌菌株快速生长为活力旺盛、繁殖能力和新陈代谢能力强的菌种，仅需5-8d就能布满整个一级种培养基，菌索和菌丝均快速萌发和生长。
根据本发明，扩大化培养工序中，一级种培养基的pH为6.5-7，活化好的菌种的接种量为一级种培养基重量的0.5-5％，培养时间为15-20d。活化好的菌种在一级种培养基中进一步进行扩大化培养，一级种培养基提供了丰富的营养源，能加快蜜环菌的繁殖速度和生长速度，使得菌种数量能迅速上升，为下一步的扩繁做准备。
根据本发明，扩繁培养工序中，二级种培养基的pH为6.5-7，蜜环菌一级种的接种量为二级种培养基重量的0.5-5％，培养时间为30-40d。蜜环菌一级种在二级种培养基上进一步扩繁培养，二级种培养基能为蜜环菌一级种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，促进蜜环菌一级种的生长速度进一步提升，不仅缩短了二级种培养时间，还能保证蜜环菌不受杂菌影响，品质稳定。
根据本发明，栽培种培养工序中，栽培种培养基的pH为6.5-7，蜜环菌二级种的接种量为栽培种培养基重量的0.5-5％，培养时间为50-60d。蜜环菌二级种在栽培种培养基中进行生长时，蜜环菌不仅能够快速萌发和生长，提高了蜜环菌栽培种的培养效率，缩短了培养时间，还能增大蜜环菌的代谢产物(如各种活性酶)的分泌量，同时蜜环菌多糖含量也得到提升，提高了蜜环菌的食用/药用价值。
根据本发明，一级种培养基的灭菌条件为：温度121-123℃，时间0.5h；二级种培养基的灭菌条件为：温度121-123℃，时间1.5-2h；栽培种培养基的灭菌条件为：常压100℃条件下灭菌10-12h，或，0.13-0.15MPa、121-123℃条件下灭菌2-2.5h。
根据本发明，二级种培养基和栽培种培养基在灌装结束后，需在二级种培养基和栽培种培养基的中心设置一个直通瓶底的接菌通道，接菌通道的直径为1-2cm。
在二级种培养基和栽培种培养基中设置接菌通道，方便进行菌种接种时，将菌种接种至玻璃瓶和栽培瓶的中下部位置，能方便蜜环菌从四周充分吸收营养，促进其生长，使得菌索能在短时间内布满整个瓶子，能大大提高接种的成功率，缩短蜜环菌的生长周期，与只将菌种接种在瓶口的培养基上的方式相比，至少能将扩繁培养工序和栽培种培养工序的培养时间分别减少10-20d，提高了生产效率，也提高了蜜环菌生产的成品率。
根据本发明，上述培养方法培养得到的蜜环菌能用于制备食品或药物。
本发明提供的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法及其培养基，通过在蜜环菌生长的每个阶段配制最适宜菌种生长的培养基的手段，实现了以下有益效果：
1)本发明中将保藏期菌种进行活化后，分阶段培养成一级种、二级种和栽培种，每个阶段均配制了最适宜菌种生长的培养基，培养基能显著缩短萌发时间，菌丝生长速度较快，最终得到的蜜环菌栽培种生长状况良好，培养时间较短，比现有技术中的培养时间缩短了5-10d，缩短了蜜环菌栽培种的生产周期，菌索生长旺盛且粗壮，所得菌索的分枝多且干重量大。若是在二级种培养基和栽培种培养基中设置接菌通道，则能分别再减少10-20d的培养时间，提高了生产效率，也提高了蜜环菌生产的成品率。
2)本发明培养所得蜜环菌栽培种在用于天麻种植后，在土壤中表现出抗逆性强、不易退化的特点，该栽培种能很快和天麻接菌共生，显著降低空窖率和污染率，能促使天麻生长，使得收获的天麻的个头增大，且能使天麻增产20％以上。
3)通过本发明培养的天麻种植共生用蜜环菌的综合性状较好，生长速度快，性状优良，实用性强，生产效率高且品质稳定，对天麻有很好的促生作用，能提高天麻的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为蜜环菌在不同培养基中的吃料深度的变化示意图；
图2为蜜环菌的胞外酶活力测定结果；
图3为蜜环菌多糖含量测定结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，也属于本发明保护的范围。
作为一种优选的实施方式，天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，具体包括：
1)将保藏的蜜环菌菌株取出，按接种量0.5-3％接种于一级种培养基上进行活化培养，待菌丝、菌索长满培养基，即得到活化好的菌种。
上述活化培养条件为：温度为23-25℃，湿度为60-70％，时间为5-8d。
蜜环菌菌株为蜜环菌京234、蜜环菌A9、法国蜜环菌(CICC编号14066)、发明人自保留菌种等。本发明的培养方法适用于目前栽培天麻用的主流蜜环菌栽培种的培养，因此，蜜环菌菌株的品种不局限于本发明的举例。
2)按比例配制pH为6.5-7的一级种培养基后，灌装至试管中，在0.13-0.15MPa、121-123℃条件下灭菌0.5h，冷却，然后取活化好的菌种，以0.5-5％的接种量接种至一级种培养基上，培养15-20d后，得到蜜环菌一级种。
一级种培养基的成分及重量份如下：玉米粉195-205份，麦麸95-105份，红糖15-17份，琼脂15-17份，磷酸二氢钾2-2.5份，硫酸镁1-1.5份，水1950-2050份。
优选地，一级种培养基的具体实例如下：玉米粉5000g，麦麸2500g，红糖400g，琼脂400g，磷酸二氢钾50g，硫酸镁25g，水50000g。
3)按比例配制pH为6.5-7的二级种培养基后，灌装至玻璃瓶中，密封，在0.13-0.15MPa、121-123℃条件下灭菌1.5-2h，冷却，然后取蜜环菌一级种，以0.5-5％的接种量接种至二级种培养基上，培养30-40d后，得到蜜环菌二级种。
二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-52％，棉籽壳19-20％，玉米粉14-16％，麦麸14-16％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1‰，含水量65-68％。上述玉米粉的粒度为16-24目。
优选地，二级种培养基的具体实例如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳19.4％，玉米粉15％，麦麸15％，轻质碳酸钙0.5％，营养素1‰，含水量65％。
4)按比例配制pH为6.5-7的栽培种培养基后，灌装至栽培瓶中，密封，灭菌，冷却，然后取蜜环菌二级种，以0.5-5％的接种量接种至栽培种培养基上，培养50-60d后，得到蜜环菌栽培种。
栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-53％，棉籽壳15-18％，颗粒状玉米粉20-22％，麦麸10-13％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1.5‰，含水量67-72％。上述颗粒状玉米粉的粒度为8-10目。
优选地，栽培种培养基的具体实例如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13.2％，轻质碳酸钙0.65％，营养素1.5‰，含水量70％。
上述栽培种培养基的灭菌条件为：常压100℃条件下灭菌10-12h；或，0.13-0.15MPa、121-123℃条件下灭菌2-2.5h。
在具体的实例中，玻璃瓶采用500ml的玻璃瓶子，栽培瓶采用1150ml的塑料瓶子。
作为对前述实施的改进，为了更进一步提升蜜环菌栽培种的生产效率，二级种培养基和栽培种培养基在灌装结束后，需在二级种培养基和栽培种培养基的中心设置一个直通瓶底的接菌通道，接菌通道的直径为1-2cm。
作为对前述实施的改进，为了更进一步提升蜜环菌的品质，在栽培种培养期间，培养温度实行分段调控，分段调控的具体步骤如下：培养开始后，在20-24℃条件下培养10-15d，然后降温至15-20℃，在15-20℃条件下培养3-5d后，再升温至20-24℃，在20-24℃条件下培养10-15d后，再次降温培养，以次循环，直至培养期结束。
在蜜环菌栽培种培养期间，采用温度分段调控的方式，通过在偏低温度下培养，迫使菌种做出应激反应进入保护机制，来激发菌种为了维持生理活性而提升其自身代谢的能力，从而产生更多应激因子和代谢产物(如各种胞外酶)，增加了代谢产物的分泌量，同时还可能刺激了菌种生长时的蛋白质的合成，使得菌种分泌的多种胞外酶的活力普遍升高，如漆酶活力、纤维素酶活力、木聚糖酶活力、果胶酶活力、淀粉酶活力显著被提升，这都有利于在天麻种植阶段促进天麻的生长发育，提高天麻中的药用成分(如天麻素)的含量，从而提升天麻的产量和品质。
作为对前述实施的改进，为了进一步提升蜜环菌栽培种的品质和生长速度，在栽培种培养基中还添加了0.5-1‰的异山梨醇二甲醚和1-1.5‰的焦性没食子酸。培养基中加入的异山梨醇二甲醚和焦性没食子酸协同培养基中的其他组分，在分段调控培养温度时，两者可能促进了菌种对培养基中能量的吸收，缓解了菌种应激适应的能量消耗，提高了菌种活力，以此增加和延长菌种的生存能力，使得菌丝生长速度加快，增加菌索干重，能使得菌丝的吃料深度提高，有效增加了蜜环菌栽培种的成品率，还提升了蜜环菌多糖含量，增加了蜜环菌的品质和药用价值。
需要说明的是，二级种培养基和栽培种培养基中的营养素为包括多种氨基酸、氮、磷、钾、维生素和微量元素的混合型营养素，可由市场上购得，通常用粉末装原粉或液体装溶液。本发明中给出一种实例，但在实际使用时，不受该实例的限制，具体如下：营养素包括无水硼酸10mg、五水合硫酸铜50mg、碘化钾2mg、六水合氯化铁150mg、钼酸铵5mg、七水合硫酸锌400mg、丝氨酸50mg、半胱氨酸35mg、精氨酸40mg、维生素D6 20mg、维生素D12 25mg。
需要说明的是，本发明中蜜环菌的培养全过程均在室内人为控制温度、湿度的条件下完成，所使用的培养基材料均经过消毒灭菌，且每步操作均保证在超净工作环境中进行，这样能避免栽培过程中的污染问题，提高生产效益，实现高效生产，大大提高蜜环菌的成品率。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，包括以下步骤：
1)将保藏的蜜环菌菌株取出，按接种量1.5％接种于一级种培养基上，在温度23℃、湿度60％条件下活化培养6d，待菌丝、菌索长满培养基，即得到活化好的菌种。蜜环菌菌株为蜜环菌京234。
2)按比例配制pH为6.5的一级种培养基后，灌装至试管中，在0.13MPa、121℃条件下灭菌0.5h，冷却，然后取活化好的菌种，以1％的接种量接种至一级种培养基上，在温度22℃、空气相对湿度55％的条件下通风、避光培养20d后，得到蜜环菌一级种。
一级种培养基的成分及重量份如下：玉米粉195份，麦麸95份，红糖15份，琼脂15份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁1份，水1950份。
3)按比例配制pH为6.5的二级种培养基后，灌装至500ml的玻璃瓶中，密封，在0.13MPa、121℃条件下灭菌1.5h，冷却，然后取蜜环菌一级种，以1.5％的接种量接种至二级种培养基上，在温度24℃、空气相对湿度50％的条件下通风、避光培养35d后，得到蜜环菌二级种。
二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳19％，玉米粉14.5％，麦麸15.9％，轻质碳酸钙0.5％，营养素1‰，含水量65％。上述玉米粉的粒度为16目。
4)按比例配制pH为6.5的栽培种培养基后，灌装至1150ml的塑料栽培瓶中，密封，常压100℃条件下灭菌12h后，冷却，然后取蜜环菌二级种，以1％的接种量接种至栽培种培养基上，在温度22℃、空气相对湿度55％的条件下通风、避光培养50d后，得到蜜环菌栽培种。
栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑53％，棉籽壳15％，颗粒状玉米粉20.35％，麦麸11％，轻质碳酸钙0.5％，营养素1.5‰，含水量67％。上述颗粒状玉米粉的粒度为8目。
实施例2：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例1的不同之处仅在于：
1)将保藏的蜜环菌菌株取出后，按接种量2.5％接种于一级种培养基上，在温度25℃、湿度70％条件下活化培养7d，待菌丝、菌索长满培养基，即得到活化好的菌种。蜜环菌菌株为蜜环菌A9。
2)一级种培养基灌装、灭菌后，取活化好的菌种以3.5％的接种量接种至一级种培养基上，在温度24℃、空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养18d后，得到蜜环菌一级种。
一级种培养基的成分及重量份如下：玉米粉205份，麦麸105份，红糖17份，琼脂17份，磷酸二氢钾2.5份，硫酸镁1.5份，水2050份。
3)二级种培养基灌装、灭菌后，取蜜环菌一级种，以3.5％的接种量接种至二级种培养基上，在温度22℃、空气相对湿度55％的条件下通风、避光培养40d后，得到蜜环菌二级种。
二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑51.5％，棉籽壳19.5％，玉米粉14％，麦麸14％，轻质碳酸钙0.9％，营养素1‰，含水量68％。上述玉米粉的粒度为24目。
4)栽培种培养基灌装，在0.15MPa、123℃条件下灭菌2.5h后，冷却，取蜜环菌二级种，以2.5％的接种量接种至栽培种培养基上，在温度23℃、空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养60d后，得到蜜环菌栽培种。
栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑51.5％，棉籽壳16.5％，颗粒状玉米粉21％，麦麸10.2％，轻质碳酸钙0.65％，营养素1.5‰，含水量72％。上述颗粒状玉米粉的粒度为10目。
实施例3：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例2的不同之处仅在于：
2)一级种培养基的成分及重量如下：玉米粉5000g，麦麸2500g，红糖400g，琼脂400g，磷酸二氢钾50g，硫酸镁25g，水50000g。
3)二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳19.4％，玉米粉15％，麦麸15％，轻质碳酸钙0.5％，营养素1‰，含水量65％。
4)栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13.2％，轻质碳酸钙0.65％，营养素1.5‰，含水量70％。
实施例4：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例3的不同之处仅在于：
步骤4)中，取蜜环菌二级种，以2.5％的接种量接种至栽培种培养基上，在空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养60d，培养期间的培养温度实行分段调控，分段调控的具体步骤如下：培养开始后，在24℃条件下培养13d，然后降温至18℃，在18℃条件下培养3d后，再升温至24℃，在24℃条件下培养13d后，再次降温培养3d，以次循环，直至培养期结束，得到蜜环菌栽培种。
实施例5：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例4的不同之处仅在于：
步骤4)中，栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13％，轻质碳酸钙0.7％，营养素1.5‰，异山梨醇二甲醚0.5‰，焦性没食子酸1‰，含水量70％。
实施例6：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例3的不同之处仅在于：
步骤4)中，栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13.2％，轻质碳酸钙0.8％，含水量70％。
实施例7：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例2的不同之处仅在于：
3)二级种培养基灌装后，然后在二级种培养基的中心设置一个直径为1.5cm的直通瓶底的接菌通道，灭菌，冷却，然后取蜜环菌一级种，以3.5％的接种量接种至二级种培养基上，在温度22℃、空气相对湿度55％的条件下通风、避光培养28d后，即得到蜜环菌二级种。
4)栽培种培养基灌装后，在栽培种培养基的中心设置一个直通瓶底的直径为1.5cm的接菌通道，在0.15MPa、123℃条件下灭菌2.5h后，冷却，将蜜环菌二级种以2.5％的接种量接种至栽培种培养基上，在温度23℃、空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养50d后，得到蜜环菌栽培种。
与实施例2对比发现，由于在二级种培养基和栽培种培养基的中心分别设置了一个直通瓶底的接菌通道，因而蜜环菌二级种的培养时间由实施例2中的40d缩短至实施例7中的28d，蜜环菌栽培种的培养时间由实施例2中的60d缩短至实施例7中的50d，培养时间分别减少了12d和10d，显著提高了生产效率。
对比例1：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例5的不同之处仅在于：
步骤4)中，栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13％，轻质碳酸钙0.7％，营养素1.5‰，异山梨醇二甲醚1.5‰，含水量70％。
对比例2：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例5的不同之处仅在于：
步骤4)中，栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳16％，颗粒状玉米粉20％，麦麸13％，轻质碳酸钙0.7％，营养素1.5‰，焦性没食子酸1.5‰，含水量70％。
对比例3：
天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，与实施例3的不同之处仅在于：
1)菌种活化复壮工序中，所用培养基的成分及重量如下：葡萄糖20g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、麸皮50g、玉米浆3g、水1000g。
2)一级种培养基的成分及重量如下：马铃薯浸出汁5000g，木屑浸出汁2500g，葡萄糖400g，琼脂400g，磷酸二氢钾50g，硫酸镁25g，水50000g。
3)二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑63％，棉籽壳15％，麦麸20％，白砂糖1％，石膏1％，含水量65％。
4)栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50％，棉籽壳40％，麦麸10％，含水量70％。
试验例1：
不同培养方法及培养基对蜜环菌生长的影响
试验方法：分别按照实施例3-实施例6和对比例1-对比例3的方法及培养基来进行蜜环菌栽培种的培养，在温度23℃、空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养30d，观察蜜环菌二级种的菌丝萌发时间和生长情况，记录菌索发生时间，并测定和计算菌索的平均生长速度，并在培养结束后，测定菌索干重(取干净菌索于80℃烘干24h称重)，同时记录培养期间，不同培养方法下菌种的吃料深度。每个试验例设有3个平行，并取平均值。结果如表1、图1所示。
表1蜜环菌生长情况
Figure BDA0003761242870000121
图1为蜜环菌在不同培养基中的吃料深度的变化示意图。由图可知，实施例3的吃料深度在整个培养期均显著高于其他组别，30d的培养期结束时的吃料深度为18.54cm；实施例4可能受温度影响，吃料速度比实施例3低，培养期结束时的吃料深度为16.21cm；实施例5较实施例4的吃料深度有显著提升，培养期结束时的吃料深度为17.83cm；对比例1和对比例2的吃料深度与实施例4相近；实施例5和对比例3的菌种生长最缓慢，吃料深度均较低，与其他组别有显著差距，培养期结束时，实施例6的吃料深度为14.87cm，对比例3的吃料深度均为12.96cm。
综合对比表1、图1的结果发现，相比对比例3的培养基，本发明的培养基能使得蜜环菌快速萌发，菌索也生长旺盛，能提前完成栽培种的培养，节约时间成本；对比实施例3和实施例6，说明营养素对蜜环菌的生长具有重要的促进作用；对比实施例3-实施例5和对比例1、对比例2，说明培养温度会影响蜜环菌的生长，但是通过实施例5中培养基的调整，培养基各组分间协同作用，就能减缓分段温控的不良影响，说明分段温控和实施例5的培养基配合，也能达到促进蜜环菌生长的有益作用。
试验例2：
不同培养方法及培养基对蜜环菌品质的影响
试验方法：分别按照实施例3-实施例5和对比例1-对比例3的方法及培养基来进行蜜环菌栽培种的培养，在温度23℃、空气相对湿度60％的条件下通风、避光培养30d后，对培养期间分泌的各种胞外酶的活力进行测定，同时对蜜环菌多糖含量进行测定。每个试验例设有3个平行，并取平均值。结果如图2、图3所示。
胞外酶活力测定方法如下：①粗酶液的制备：用接种针随机取菌丝周边的培养基装满2.0ml离心管，12000r/min离心15min，吸出上清液1ml于10ml容量瓶中用蒸馏水定容，作为稀释后的酶液，用于下列实验。②采用ABTS法测定漆酶活力：在2.0ml酶活反应体系中先加入0.5ml的0.5μmol/l的ABTS，以及1.0ml的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝4.0、0.2mol/l)混合均匀，再加入0.5ml稀释后的酶液，启动反应，每隔30s记录420nm吸光度值的变化，在符合线性关系处求出斜率并换算出酶活力。一个酶活单位定义为反应体系中每分钟催化1μmol ABTS氧化所需要的酶量。③DNS法分别测定纤维素酶活力、木聚糖酶活力、果胶酶活力及淀粉酶活力。纤维素酶活力测定：在刻度试管中分别加入用0.1mol/l的醋酸缓冲液(pH＝4.6)配制的1％CMC-Na溶液1.5ml，稀释后的酶液0.1ml，混匀后于40℃水浴保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5ml，置于沸水浴加热5min，待冷却后用蒸馏水稀释至10ml，于500nm测定吸光度值。其余酶活力测定方法与纤维素酶活测定方法相同，只是把1％CMC-Na溶液换成1％木聚糖溶液、1％果胶溶液、1％淀粉溶液，配置方法也相同。以上方法均以加热灭活的粗酶液作对照，分别按葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸标准曲线，计算底物被酶分解的葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸的含量，1个酶活单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸所需要的酶量。
蜜环菌多糖测定：准确称取干燥至恒重的蜜环菌菌丝体粉末0.1g，加入10ml 75％的乙醇，于50℃水浴加热30min过滤。取滤渣加入60ml蒸馏水，微波加热5min，冷却后过滤，滤液用蒸馏水定容至100ml。准确移取200μl提取液于10ml容量瓶，加入5％苯酚1ml，浓硫酸5ml后加入蒸馏水定容至10ml，混匀后放入沸水浴15min，室温冷却后于A490nm处测吸光度值，按葡萄糖标准曲线计算蜜环菌多糖含量。
图2为蜜环菌的胞外酶活力测定结果。图3为蜜环菌多糖含量测定结果。结果显示，实施例4的几种胞外酶活力显著高于实施例3，实施例5的几种胞外酶活力又略高于实施例4，实施例5的蜜环菌多糖含量最高，达到51.68mg/g，显著高于实施例3和实施例4；对比例1和对比例2的胞外酶活力和蜜环菌多糖含量与实施例4差异不显著；对比例3的几种胞外酶活力和蜜环菌多糖含量显著低于实施例的组别。
综合对比发现，实施例4中采用培养温度分段调控的方式，刺激菌种生长中分泌的多种活性酶的活性普遍升高；实施例5的培养基调整后，培养基各组分间协同作用，也有益于胞外酶活力的提升，同时还能显著蜜环菌多糖的含量，增加了蜜环菌的品质和药用价值。
试验例3：
天麻栽培试验
试验方法：天麻栽培试验地位于陕西省汉中市勉县，具体栽培方法按照中国发明专利CN202111617573.5记载的实施例2的方法进行。其中，栽培垄为0.9米宽、25厘米高，在栽培垄中均匀地平铺一层菌叶层(栎树树叶)、一层萌发菌种子层(萌发菌和天麻蒴果)、一层培养物层(菌棒、菌枝和蜜环菌栽培种)、一层萌发菌种子层、一层沙土层。蜜环菌分别采用实施例3-实施例6和对比例1-对比例3培养得到的蜜环菌栽培种。待将全部天麻采收后，测定空窝率、天麻产量、天麻素含量、总天麻素含量和天麻多糖含量，参照《中国药典》2020版中的药用成分检测方法。每个试验例设有3个平行，并取平均值。结果如表2所示。
表2天麻栽培试验结果
Figure BDA0003761242870000151
对比结果发现，实施例3-实施例5和对比例1、对比例2均未出现烂麻、空窝的现象；实施例3-实施例5的天麻产量较对比例3的天麻产量增产了20％以上；实施例3-实施例5的天麻的药用成分含量都显著高于中国药典规定的0.25％的标准，天麻多糖也显著高于实施例6和对比例3。
相比对比例3的培养基，本发明的培养基能使得蜜环菌快速萌发，菌索也生长旺盛，能够快速侵染菌材，有利于天麻的生长发育；对比实施例3和实施例6，发现营养素对蜜环菌的生长和品质都具有重要作用，甚至还会影响天麻的产量和品质；对比实施例3-实施例5和对比例1、对比例2，说明培养温度会影响蜜环菌的品质(如胞外酶活力等)，通过实施例5中培养基的调整，培养基各组分间协同作用，能提升蜜环菌的品质，通过分段温控和实施例5的培养基配合，能达到提升天麻的产量和品质的有益作用。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种天麻种植共生用蜜环菌的培养基，其特征在于，包括：一级种培养基、二级种培养基和栽培种培养基；
所述一级种培养基的成分及重量份如下：玉米粉195-205份，麦麸95-105份，红糖15-17份，琼脂15-17份，磷酸二氢钾2-2.5份，硫酸镁1-1.5份，水1950-2050份；
所述二级种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-52％，棉籽壳19-20％，玉米粉14-16％，麦麸14-16％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1‰，含水量65-68％；
所述栽培种培养基的成分及重量占比如下：以总和100％计，木屑50-53％，棉籽壳15-18％，颗粒状玉米粉20-22％，麦麸10-13％，轻质碳酸钙0.5-1％，营养素1.5‰，含水量67-72％。
2.根据权利要求1所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养基，其特征在于：所述二级种培养基中的玉米粉的粒度为16-24目；所述栽培种培养基中的颗粒状玉米粉的粒度为8-10目。
3.一种天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，使用权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养方法包括：
将菌株蜜环菌进行活化培养的菌种活化复壮工序；
将所述菌种活化复壮工序得到的活化好的菌种接种在一级种培养基上进行培养的扩大化培养工序；
将所述扩大化培养工序得到的蜜环菌一级种接种在二级种培养基上进行培养的扩繁培养工序；和，
将所述扩繁培养工序得到的蜜环菌二级种接种在栽培种培养基上进行培养的栽培种培养工序；
所述扩大化培养工序、所述扩繁培养工序和所述栽培种培养工序的培养条件为：温度20-24℃，空气相对湿度50-60％，通风，避光。
4.根据权利要求3所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述菌种活化复壮工序的步骤如下：将保藏的蜜环菌菌株取出，按接种量0.5-3％接种于一级种培养基上进行活化培养，待菌丝、菌索长满培养基，即得到活化好的菌种。
5.根据权利要求4所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述活化培养条件为：温度为23-25℃，湿度为60-70％，时间为5-8d。
6.根据权利要求3所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述扩大化培养工序中，一级种培养基的pH为6.5-7，活化好的菌种的接种量为一级种培养基重量的0.5-5％，培养时间为15-20d。
7.根据权利要求3所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述扩繁培养工序中，二级种培养基的pH为6.5-7，蜜环菌一级种的接种量为二级种培养基重量的0.5-5％，培养时间为30-40d。
8.根据权利要求3所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述栽培种培养工序中，栽培种培养基的pH为6.5-7，蜜环菌二级种的接种量为栽培种培养基重量的0.5-5％，培养时间为50-60d。
9.根据权利要求3所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述一级种培养基的灭菌条件为：温度121-123℃，时间0.5h；
所述二级种培养基的灭菌条件为：温度121-123℃，时间1.5-2h；
所述栽培种培养基的灭菌条件为：常压100℃条件下灭菌10-12h，或，0.13-0.15MPa、121-123℃条件下灭菌2-2.5h。
10.根据权利要求3-9任一项所述的天麻种植共生用蜜环菌的培养方法，其特征在于：所述二级种培养基和栽培种培养基在灌装结束后，需在二级种培养基和栽培种培养基的中心设置一个直通瓶底的接菌通道，所述接菌通道的直径为1-2cm。
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