CN116694481A - 天麻萌发菌的脱毒筛选方法 - Google Patents

天麻萌发菌的脱毒筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，属于脱毒技术领域，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；菌丝尖端脱毒循环进行4‑8次，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著，即视为脱毒结束；扩殖工序所得扩殖菌种用于保藏或天麻生产。该脱毒筛选方法的脱毒效果佳，脱毒成功率能达到95％以上，脱毒菌种和扩殖菌种都能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用，解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱问题，能避免萌发菌菌种退化影响天麻生产效益。

Description

天麻萌发菌的脱毒筛选方法
技术领域
本发明涉及脱毒技术领域，尤其涉及一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法。
背景技术
天麻为兰科天麻属多年生草本，根茎膨大，无根无叶，不能进行光合作用，靠与密环菌共生异养生活，主要分布于我国西南部秦巴山区、云贵高原和四川等地海拔700-2800m的落叶阔叶林地。天麻以块茎入药，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络、降压、降血脂、抗氧化、保肝、抗肿瘤、增强免疫力的功效。近年来，随着人们对天麻药用价值的了解，其市场需求量逐年增加，这对天麻的生产提出了新的挑战。
目前天麻的生产以有性繁殖为主，但天麻种子细小如尘，种子仅有种胚和种皮、无胚乳，难以独自萌发。自徐锦堂等发现小菇属(Mycenasp.)萌发菌可与天麻种子共生萌发以来，天麻的生产已有了较大发展。萌发菌是一类会发光的好氧真菌，主要营腐生生活，多腐生于林间枯枝落叶、朽枝、植物腐生根上。萌发菌与天麻种子拌播后，能和天麻种子形成特殊的共生关系，天麻种子萌发菌主要以菌丝的形态从种子胚柄细胞侵入种胚，为其提供种子萌发和生长所需的营养，萌发菌是天麻种子萌发的外营养来源，具有提高天麻种子萌发率的能力。到目前为止，报道的天麻种子萌发菌均属于小菇属的4种真菌，主要包括紫萁小菇Mycena osmundicola、兰小菇Mycena orchidicola、石斛小菇Mycena dendrobii和开唇兰小菇Mycenaanoectochila，其中，主要用于生产的萌发菌是石斛小菇和紫萁小菇这2种。
由于萌发菌和食用菌菌种一样，菌种保藏一般都用低温试管菌种的保藏方式，然而，菌种通过在低温保藏3-5个月后要进行活化转接重新保存，这样在日常生活中，菌株经过长时间的低温保存和多次的转接，就会出现严重的退化现象，在培养中污染杂菌率也大大增加，从而导致萌发菌活力降低、遗传稳定性差。天麻种子萌发菌退化现象的主要表现在：菌丝体生长缓慢，颜色变暗，菌丝活力弱，侵染天麻种子的能力下降，主要是因为萌发菌经过的多代的转接和长时间保存不当引起的。在实际生产中，天麻有性繁殖的产量、品质等常常因萌发菌菌种退化而受到严重的影响，而萌发菌种质资源严重缺乏。已表现出退化现象的菌株必须进行复壮，进行菌种复壮时可采用以下方法：1)改善培养基的营养环境；2)诱导子实体并分离；3)菌丝尖端的脱毒；4)天麻原球茎的分离，并进行优良性状的比较和筛选。其中菌丝尖端的脱毒技术最为快速有效，但是也仍存在一些不足，如：菌丝尖端脱毒后，脱毒菌种的菌丝生长情况及胞外酶活性等方面虽然比退化菌种有显著恢复和提升，但与最初保存的母种菌种的性状比较仍有差距。因此，将退化的萌发菌菌种进行脱毒，并筛选出优质的萌发菌菌种，避免萌发菌菌种退化影响天麻生产效益就显得尤为迫切。
发明内容
本发明提供一种脱毒效果佳，脱毒成功率能达到95％以上，脱毒菌种和扩殖菌种都能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用，解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱问题的天麻萌发菌的脱毒筛选方法。
本发明提供一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将活化工序所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端的脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；菌丝尖端的脱毒循环进行4-8次；脱毒工序的菌丝尖端的脱毒循环中，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著，即视为脱毒结束；扩殖工序得到的扩殖菌种用于保藏或天麻生产。
通过上述技术方案，萌发菌的退化菌种经活化、菌丝尖端脱毒循环和扩殖培养，脱毒成功率能达到95％以上，得到的扩殖菌种恢复了萌发菌菌种的优良性状，菌丝生长速度、外观及菌丝长势显著变化，具有优良的遗传稳定性，脱毒菌种解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱的问题，所得扩殖菌种能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用。
进一步设置为，活化工序的步骤为：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22-26℃恒温下黑暗培养5-8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。对保藏期的退化菌种进行活化，目的是打破退化菌种的休眠期，使得退化菌种能在脱毒培养基上快速适应环境并生长，有利于后期对菌丝尖端的剥离和脱毒处理。
进一步设置为，脱毒工序的步骤为：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2-0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行4-8次脱毒循环，脱毒结束后，得到脱毒菌种。
进一步设置为，脱毒循环的过程如下：
1)将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种；
2)将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种；
3)按步骤2)的方式再进行2-6次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。
通过上述技术方案，经过4-8次的菌丝尖端脱毒循环，完成脱毒的脱毒菌种的菌丝生长速度与退化菌种有显著差异，能有效恢复萌发菌菌种的生产能力，所得脱毒菌种的菌丝生长速度快、长势优，洁白、整齐且浓密，菌丝生长速度和萌发菌生物量也得到显著提升。
进一步设置为，脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100-200g、麦麸30-70g、土豆200-400g、葡萄糖10-30g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.5-3g、玉米粉15-25g、天麻10-20g、琼脂粉10-30g和蒸馏水。在脱毒培养基中加入天麻的目的是提供萌发菌菌丝生长的特殊营养，并使得萌发菌在早期培养中就能适应天麻存在的环境条件，增加萌发菌与天麻共生的快速适应性，在萌发菌与天麻种子共生培养时，萌发菌能更快速地侵染天麻种子，从而与天麻种子形成稳定的共生关系和营养供给关系，进而提高天麻种子的萌发率。脱毒培养基中玉米粉、麦麸等提供氮源，阔叶树木屑和土豆提供碳源，采用本发明的脱毒培养基对萌发菌的退化菌种进行脱毒，脱毒效果显著，脱毒成功率高。
进一步设置为，脱毒培养基的制备步骤如下：
a)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮30-60min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
b)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800-1000mL；
c)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
d)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
进一步设置为，扩殖工序的步骤为：在无菌操作台中将脱毒菌种转入扩殖培养基中，在22-26℃恒温下扩殖培养10-15d，得到的扩殖菌种用于保藏或生产。
进一步设置为，扩殖培养基的原料包括：土豆200-400g、阔叶树木屑100-150g、葡萄糖15-30g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.5-3g、麦麸30-50g、玉米粉15-30g、琼脂粉10-30g和蒸馏水。扩殖培养基用于将脱毒菌种进行扩大培养，以实现脱毒菌种的增殖和扩繁，扩殖菌种的菌落规则、边缘光滑，菌丝洁白致密，气生菌丝发达，锁状联合明显，扩繁菌种用于天麻种子萌发生产时，使得天麻种子也容易萌发，用于保藏时也具有较好的遗传稳定性。
进一步设置为，扩殖培养基的制备步骤如下：
a)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑加水煎煮30-60min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
b)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800-1000mL；
c)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
d)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得扩殖培养基。
进一步设置为，阔叶树木屑来自青冈木、桦木、栎树、法国梧桐中的至少一种。
本发明提供的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，与现有技术相比：
1)本发明的退化菌种被活化后，经过4-8次的菌丝尖端脱毒循环和扩殖培养，脱毒效果佳，且脱毒成功率能达到95％以上，得到的扩殖菌种恢复了萌发菌菌种的优良性状，菌丝生长速度、外观及菌丝长势显著变化，脱毒菌种解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱的问题。
2)本发明中脱毒培养基能对退化菌种进行脱毒复壮，脱毒成活率高，获得的脱毒菌种与传统培养基培养的脱毒菌种的脱毒率更高，且能够通过大规模的组培进行脱毒和扩殖。经过脱毒和扩殖的菌种菌丝致密光滑，菌丝生长势强，具有优良的遗传稳定性，抗杂菌污染能力强，扩殖菌种较母种菌种的性状差异不显著，有效保证了天麻萌发率和天麻的规模化生产。
3)本发明的方法能在短时间内获得大量的脱毒效果佳且生长健壮的扩殖菌种，提高了萌发菌菌种保藏过程中的遗传稳定性，脱毒菌种和扩殖菌种都能用于保藏和促进天麻种子的萌发，能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用，具有极大的推广潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为果胶酶的酶活性变化示意图；
图2为木聚糖酶的酶活性变化示意图；
图3为纤维素酶的酶活性变化示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，也属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
PDA固体培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁3g，琼脂粉15g，VB1 0.1g，加蒸馏水定容至1L，pH5-5.5。于101kPa，121℃灭菌20min。
本发明在天麻萌发菌的脱毒筛选方法的基础上，还提供了一种用于天麻萌发菌的菌丝尖端脱毒培养基，上述脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100-200g、麦麸30-70g、土豆200-400g、葡萄糖10-30g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.5-3g、玉米粉15-25g、天麻10-20g、琼脂粉10-30g和蒸馏水。
上述阔叶树木屑来自青冈木、桦木、栎树、法国梧桐中的至少一种。
上述脱毒培养基的制备步骤如下：
a)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮30-60min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
b)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800-1000mL；
c)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
d)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
本发明的脱毒培养基提供了天麻在萌发菌的菌丝尖端脱毒培养中的应用，提供了萌发菌菌丝生长的特殊营养并适应天麻存在的环境条件，增加萌发菌与天麻共生的快速适应性。采用本发明的脱毒培养基对萌发菌的退化菌种进行脱毒，脱毒效果显著，脱毒成功率能达到95％以上，脱毒成活率也高，获得的脱毒菌种与传统培养基培养的脱毒菌种的脱毒率更高，且能够通过大规模的组培进行脱毒和扩殖。
作为对前述实施的进一步改进，本发明的脱毒培养基的原料中还含有0.2-0.7g的乳酸乙酯和0.5-1.0g的复硝酚钠；乳酸乙酯和复硝酚钠在制备过程中与葡萄糖一起添加。本发明中意外发现，两者在特定比例下具有协同作用，用于脱毒培养基中能对菌丝的生长和分裂起到促进作用，能进一步提高菌丝生长速度和菌种生物量，有利于提高菌种的脱毒效率和成功率；而且在该脱毒培养基中得到的脱毒菌种的胞外酶活性更强，即使与母种菌种相比，胞外酶的酶活性也有一定程度的提升，其中果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶的酶活性提升更为显著，这对天麻种子的萌发和生长具有促进作用，能显著提高天麻种子的萌发率。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。但是应该理解，实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围。
实施例1：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)退化菌种活化：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22-26℃恒温下黑暗培养5-8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100g、麦麸30g、土豆250g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.5g、玉米粉15g、天麻15g、琼脂粉20g和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮30min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)菌丝尖端脱毒：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2-0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行5次脱毒循环，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著即视为脱毒结束，得到脱毒菌种。
脱毒循环的具体过程如下：
3.1)第一次脱毒循环：将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种。
3.2)第二次脱毒循环：将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种。
3.3)按步骤3.2)的方式再进行3次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。
4)制备扩殖培养基：扩殖培养基的原料包括：土豆200g、阔叶树木屑100g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、麦麸30g、玉米粉15g、琼脂粉15g和蒸馏水。
4.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑加水煎煮30min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
4.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800mL；
4.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
4.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得扩殖培养基。
5)脱毒菌种扩殖：在无菌操作台中将脱毒菌种转入扩殖培养基中，在22-26℃恒温下扩殖培养10-15d，得到的扩殖菌种用于保藏或生产。
实施例2：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)退化菌种活化：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22-26℃恒温下黑暗培养5-8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)菌丝尖端脱毒：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2-0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行7次脱毒循环，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著即视为脱毒结束，得到脱毒菌种。
脱毒循环的具体过程如下：
3.1)第一次脱毒循环：将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种。
3.2)第二次脱毒循环：将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种。
3.3)按步骤3.2)的方式再进行5次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。
4)制备扩殖培养基：扩殖培养基的原料包括：土豆350g、阔叶树木屑150g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.5g、麦麸40g、玉米粉25g、琼脂粉20g和蒸馏水。
4.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
4.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
4.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
4.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得扩殖培养基。
5)脱毒菌种扩殖：在无菌操作台中将脱毒菌种转入扩殖培养基中，在22-26℃恒温下扩殖培养10-15d，得到的扩殖菌种用于保藏或生产。
实施例3：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g、0.5g的乳酸乙酯、0.7g的复硝酚钠和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、乳酸乙酯和复硝酚钠，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例1：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：该脱毒培养基为步骤1)中的PDA培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)制备扩殖培养基：该扩殖培养基为步骤1)中的PDA培养基。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例2：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、琼脂粉25g、0.5g的乳酸乙酯、0.7g的复硝酚钠和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、乳酸乙酯和复硝酚钠，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例3：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g、0.5g的乳酸乙酯和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、乳酸乙酯，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例4：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g、0.7g的复硝酚钠和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和复硝酚钠，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例5：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g、0.5g的乳酸乙酯、1.5g的复硝酚钠和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、乳酸乙酯和复硝酚钠，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
对比例6：
一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括以下步骤：
1)与实施例2的步骤1)相同。
2)制备脱毒培养基：脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑200g、麦麸50g、土豆350g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁2g、玉米粉25g、天麻15g、琼脂粉25g、1.0g的乳酸乙酯、0.7g的复硝酚钠和蒸馏水。阔叶树木屑来自青冈木。
2.1)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮45min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
2.2)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至1000mL；
2.3)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、乳酸乙酯和复硝酚钠，溶解得到培养基溶液；
2.4)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
3)与实施例2的步骤3)相同。
4)与实施例2的步骤4)相同。
5)与实施例2的步骤5)相同。
试验例1：
脱毒菌种的生长特征
试验菌种：萌发菌为石斛小菇(Mycena dendrobii)，由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。脱毒菌种分别按照实施例2-实施例3、对比例1-对比例6中的方法制备，以退化菌种为对照组。结果见表1。
1)菌丝生长速度测定：利用直径6mm的打孔器打取脱毒菌种的菌片，转接至BDPAD标准培养基，每个菌株三个重复，记录下接种时间。然后以菌片中心为圆点，向八个方向各画一条线，在每条线与菌片的交点作为菌丝生长的起点，25℃恒温培养。第二天开始观察，在每条线上标记对应的菌丝生长点，注明时间，然后选择稳定生长的2-3次标记，用此区间的长度除以时间(时间以h计)从而算出稳定的生长速度，算出三个重复的稳定生长速度，再算出平均值即为该菌株在标准培养基上的生长速度。
2)菌丝体生物量测定：将脱毒菌种的菌丝接到液体PDA培养基中，设置摇床恒温25℃，150r/min暗培养15d。过滤菌丝，将菌丝烘干至恒重，进行干重测量，得到不同菌种菌丝的生物量，每株菌设置3个重复组。
表1
菌丝生长速度cm/d 菌丝生物量g/L
实施例2 0.667 9.14
实施例3 0.744 9.76
对比例1 0.536 7.12
对比例2 0.612 8.33
对比例3 0.665 9.17
对比例4 0.673 9.31
对比例5 0.624 8.97
对比例6 0.686 9.53
退化菌种 0.435 4.31
试验结果显示，实施例和对比例的萌发菌菌丝洁白、致密，毛绒状，呈放射状生长，轮廓整齐。表1结果对比可知，采用PDA培养基作为脱毒培养基的对比例1所得的脱毒菌种的菌丝生长速度和菌丝生物量均远低于实施例和其他对比例的脱毒菌种，说明本发明中的脱毒培养基对萌发菌的退化菌种的脱毒效果更显著，能有效恢复萌发菌的退化菌种的生产能力。
对比实施例2-实施例3和对比例3-对比例6，发现实施例3的数值显著优于其他组别，对比例5较其他组别更差，菌丝生长受到了轻微抑制，可见，在脱毒培养基中添加特殊比例的乳酸乙酯和复硝酚钠，有助于协同促进菌丝的生长和分裂，相较于退化菌种，脱毒菌种的菌丝的生长速度和生物量得到恢复和提升，而新生长的菌丝往往较有活力且性状不受退化菌种的影响，有利于提高菌种的脱毒效率和成功率。
试验例2：
胞外酶活性测定
试验菌种：萌发菌为石斛小菇(Mycena dendrobii)，由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。脱毒菌种分别按照实施例2-实施例3、对比例3-对比例6中的方法制备，以退化菌种为对照组，设置3个重复组。
1)粗酶液的制备：将脱毒菌种接在液体PDA培养基中，于24℃、150r/min恒温振荡，避光条件下培养。在液体培养期间，每3d定时取1次发酵液样品，样品离心5min(4℃8000r/min)，上清液即为粗酶液，取上清液1mL于10mL试管中定容至10mL，用于后续实验。
2)胞外酶活性测定：木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶活性用DNS法测定，略有调整：DNS用量均为1mL，做三组重复。每1min生成1μmoL木糖、葡萄糖或D-乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。酶活性以X表示，单位为U/L。
3)标准曲线的绘制：依据DNS法测定葡萄糖标准曲线为：y＝1.6517x-0.0363(R2＝0.9927)，用于纤维素酶的测定，木糖标准曲线为：y＝0.2454x-0.0318(R2＝0.9985)，用于木聚糖酶的测定，D-乳糖醛酸标准曲线为：y＝0.2781x-0.0389(R2＝0.9979)，用于果胶酶的测定。
4)酶活性计算方法：木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶从对应的标准曲线上查出相应的木糖、D-乳糖醛酸、葡萄糖含量折算成酶活单位U/L。木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶活性计算公式：X＝m·n/(M·V酶·t)，其中：m指根据标准曲线方程，带入OD值计算对应葡萄糖、木糖或D-乳糖醛酸的质量，单位为mg；M指木糖、葡萄糖或者D-乳糖醛酸的摩尔质量；V酶指反应添加的酶液体积，单位为L；t指酶反应时间，单位为min；n指酶液稀释倍数。
图1为果胶酶的酶活性变化示意图。图2为木聚糖酶的酶活性变化示意图。图3为纤维素酶的酶活性变化示意图。
从图1-图3对比可知，木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶的酶活性变化均是先升高再下降。实施例和对比例中，整体酶活性较高的是实施例3，最差的是对比例6，而对比例6的酶活性也显著高于退化菌种，可见，脱毒菌种的胞外酶活性与退化菌种相比也得到了恢复和显著提升，且在脱毒培养基中添加特殊比例的乳酸乙酯和复硝酚钠，在其协同作用下能得到胞外酶活性更强的脱毒菌种，而萌发菌的胞外酶活性对天麻种子的萌发和生长具有促进作用，有利于提高天麻种子的萌发率。
试验例3：
室内共生萌发试验
本实验所用天麻为汉中产区主栽品种-红天麻，采自宁强县，种植于盛有干净河沙的塑料盆(长×宽×高：65cm×40cm×20cm)中，天麻抽薹后，20d左右开始授粉，20d后收获天麻蒴果备用。在无菌条件下，将新鲜的、刚成熟采摘下来的天麻蒴果放入75％的酒精浸泡15s，无菌水冲洗5-6次后，把消毒好天麻蒴果放在无菌滤纸上凉干，为共生萌发种子材料。分别取按照实施例2-实施例3、对比例1-对比例6中的方法制备的脱毒菌种，以退化菌种为对照组，设置3个重复组。分别用直径为6mm的打孔器制作菌块，接着在水琼脂培养基上，将已表面消毒好的天麻蒴果一端剪开一小孔，轻挤蒴果，将种子均匀的播撒在菌块四周，封口膜封口后25℃暗培养。每周观察1次，播种培养30天开始镜检记数，统计种子萌发情况。结果见表2。
表2
对比发现，采用PDA培养基作为脱毒培养基的对比例1所得的脱毒菌种共生的天麻种子的萌发率显著低于实施例2和实施例3；未添加天麻作为培养基原料的对比例2的萌发率也显著低于实施例2；说明本发明的脱毒培养基在脱毒过程中能促进萌发菌菌种的生长，也能促进胞外酶的活性提升，最终有利于提高天麻种子萌发率。结合对比例5和对比例6在试验例1和试验例2中的数据，说明萌发菌的菌丝生长速度、生物量和胞外酶活性共同影响了天麻种子的萌发，而菌丝生长速度更高、生物量更大、胞外酶活性更高的萌发菌更利于提高天麻种子的萌发率，天麻种子萌发率高，则有利于提高天麻的产量。
天麻种子的萌发需萌发菌菌丝与种子接触后，侵入皮层细胞壁促进天麻种子萌发形成原球茎，与天麻种子共生萌发。因此萌发菌细胞壁降解酶活性的高低也就决定着天麻种子的萌发表现，其中植物细胞壁的重要组成部分为纤维素、半纤维素、果胶。胞外纤维素酶将纤维素分解为纤维二糖和寡糖，最终水解为葡萄糖被萌发菌吸收利用；木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，胞外木聚糖酶可以使其分解；果胶酶则能快速分解果胶。
对比实施例2-实施例3和对比例3-对比例6，发现实施例3的萌发率最高，结合试验例1和试验例2的结果可知，在脱毒培养基中添加特殊比例的乳酸乙酯和复硝酚钠，有助于协同提高菌丝生长速度和菌种生物量，提升胞外酶的酶活性，从而对天麻种子的萌发和生长具有促进作用，能显著提高天麻种子的萌发率。
需要说明的是，在本发明中，未做特殊说明的浓度、比例等均为重量浓度、重量比等，属于本领域技术人员常用的书写习惯，故在本发明中不再赘述。且，在本发明中，部分操作的详细步骤并未详述，但属于本领域技术人员已知的现有技术，故在此不再赘述。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将所述活化工序所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端的脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对所述脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；
所述菌丝尖端的脱毒循环进行4-8次；
所述脱毒工序的菌丝尖端的脱毒循环中，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著，即视为脱毒结束；
所述扩殖工序得到的扩殖菌种用于保藏或天麻生产。
2.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述活化工序的步骤为：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22-26℃恒温下黑暗培养5-8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。
3.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒工序的步骤为：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2-0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行4-8次脱毒循环，脱毒结束后，得到脱毒菌种。
4.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒循环的过程如下：
1)将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种；
2)将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22-26℃恒温培养，待菌落直径长至3-4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2-0.5mm转接在另一平皿中，再于22-26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种；
3)按步骤2)的方式再进行2-6次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。
5.根据权利要求1-4任一项所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100-200g、麦麸30-70g、土豆200-400g、葡萄糖10-30g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.5-3g、玉米粉15-25g、天麻10-20g、琼脂粉10-30g和蒸馏水。
6.根据权利要求5所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒培养基的制备步骤如下：
a)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑、天麻加水煎煮30-60min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
b)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800-1000mL；
c)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
d)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得脱毒培养基。
7.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述扩殖工序的步骤为：在无菌操作台中将脱毒菌种转入扩殖培养基中，在22-26℃恒温下扩殖培养10-15d，得到的扩殖菌种用于保藏或生产。
8.根据权利要求7所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述扩殖培养基的原料包括：土豆200-400g、阔叶树木屑100-150g、葡萄糖15-30g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.5-3g、麦麸30-50g、玉米粉15-30g、琼脂粉10-30g和蒸馏水。
9.根据权利要求8所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述扩殖培养基的制备步骤如下：
a)土豆去皮切片，将土豆与玉米粉、麦麸、阔叶树木屑加水煎煮30-60min，加水量以原料能全部被水浸透，并被水淹没即可；
b)将所得煎煮液进行过滤，滤液加蒸馏水补足至800-1000mL；
c)向所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解得到培养基溶液；
d)将所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌，即得扩殖培养基。
10.根据权利要求5所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述阔叶树木屑来自青冈木、桦木、栎树、法国梧桐中的至少一种。
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