CN115336503A - 一种天麻栽培用替代菌材的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻栽培用替代菌材的制备方法。蜜环菌作为天麻赖以生存的共生菌，与天麻的品质息息相关，发明人对蜜环菌培养条件进行了探索，制定了如下的天麻栽培用替代菌材的制备方法：使用母种培养基培养蜜环菌原种，获得蜜环菌母种；使用扩种液体培养基对蜜环菌母种进行三级发酵，获得蜜环菌液；将蜜环菌液接种于栽培基质中，经培养后获得蜜环菌菌种；所述栽培基质的原料包括核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖；将蜜环菌菌种接种于青冈木中，获得菌材。本技术方案解决了蜜环菌的活性欠佳而导致的天麻栽培用菌材的种植效果不理想的技术问题，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻栽培用替代菌材的制备方法。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Bl.)属兰科(Orchidaceae)多年生草本植物，是我国传统中草药之一，多以块茎入药，具有极高的医疗和保健价值。蜜环菌(Armillaria mellea)又名榛蘑、蜜蘑，由于其子实体菌盖表面呈蜜黄色，菌柄上端呈环状花纹，故名“蜜环菌”。蜜环菌对天麻的生长有显著影响，特别是对天麻幼苗、营养器官和生殖器官的生长发育有显著影响。蜜环菌作为一种兼性寄生性真菌，不仅能对多种植物造成侵染还与天麻具有很强的共生关系。天麻的生长过程包括拒菌、控菌和开放几个阶段。蜜环菌菌索侵入天麻，当菌索附着在天麻表皮时，蜜环菌菌丝便开始生长。菌丝在生长过程中会分泌大量的化学物质，帮助穿过天麻皮层，顺利进入到内层。菌丝到达内层后，一边释放酶一边扩散。在整个侵入的过程中，天麻进行了一系列生理生化反应。首先，蜜环菌产生酶来消化天麻表层细胞，消化后的细胞会形成管状结构。随后，表层细胞的消化会刺激天麻开启保护机制，产生大量水解酶。最后，这类水解酶会将蜜环菌菌丝降解为小分子物质，供给天麻的生长发育。蜜环菌作为上述天麻赖以生存的共生菌，与天麻的品质息息相关。因此，关于蜜环菌培养条件的探索一直是众多学者的研究热点。
发明内容
本发明意在提供一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，以解决现有技术中的蜜环菌的活性欠佳而导致的天麻栽培用菌材的种植效果不理想的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，包括蜜环菌菌种的制备步骤：
S1：使用母种培养基培养蜜环菌原种，获得蜜环菌母种；
S2：使用扩种液体培养基对蜜环菌母种进行三级发酵，获得蜜环菌液；
S3：将蜜环菌液接种于栽培基质中，经培养后获得蜜环菌菌种；所述栽培基质的原料包括核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖；天麻茎秆的处理方法为：将天麻茎秆切成小段后喷洒短小芽孢杆菌菌液，经发酵培养、烘干以及粉碎后，获得天麻茎秆粉。
本方案的原理及优点是：
在本技术方案中，发明人对现有技术中常规的蜜环菌原种进行了母种培养、三级发酵以及在栽培基质上培养，进而获得了活性较为理想的用于制备菌材的蜜环菌菌种。使用上述蜜环菌菌种进行菌材制备以及天麻种植，可以显著提高天麻中功效成分的含量。解决了现有技术中的蜜环菌的活性欠佳而导致的天麻栽培用菌材的种植效果不理想的技术问题。其中，栽培基质的原料包括核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖，天麻茎秆通过小芽孢杆菌发酵而成，上述栽培基质对蜜环菌活性具有显著的正向影响，可以用于提升其共生的天麻的品质。本方案使用短小芽孢杆菌对天麻茎秆进行发酵，可以将天麻茎秆中的物质转换成一些具有促生功能的成分。种植天麻成为我国天麻药材商品的主要来源，在大量收获天麻块茎的同时，每年会产生大量的天麻地上部分(包括茎秆)副产品，被用来造纸、沼气或饲料，对天麻茎秆的附加价值未进行充分开发，通过本技术方案的方式，拓宽了天麻茎秆的用途，为天麻资源的综合利用创造了条件。
另外，本技术方案的栽培基质还使用到了另一废弃材料核桃壳。青冈木和苹果木都是现有技术中常用与菌材制作的木材，显示出较好的效果，所以也常被用于制备蜜环菌菌种的栽培基质。由于天麻种植需求量大，会出现青冈木和苹果木供应不足的问题。发明人尝试使用核桃壳代替青冈木和苹果木作为栽培基质的原料。但是，单独使用核桃壳的效果不理想，需要加入天麻茎秆的发酵物来共同使用，说明天麻茎秆的发酵物在作为栽培基质的原料的时候，其与核桃壳能够产生比较显著的协同增效作用。
本技术方案的天麻栽培用替代菌材为废弃作物的综合利用创造了条件，同时解决了蜜环菌的活性欠佳而导致的天麻栽培用菌材的种植效果不理想的技术问题，因此本技术方案具有广阔的应用前景。
进一步，在S1中，母种培养基的配方为：马铃薯提取物80-100g、青冈树枝提取物40-50g、葡萄糖15-20g、天麻茎秆提取物10-15g、牛肉膏6-12g，琼脂10g，维生素B1 8-10mg，水补齐至1000mL。采用上述母种培养基可以通过培养获得质量理想的用于液体发酵的蜜环菌母种。经过培养，蜜环菌于2天左右长出洁白菌丝，于7天左右长出洁白菌索，菌索长势较好，并且产生较多的分支。
进一步，在S1中，马铃薯提取物由如下方法制备：将新鲜马铃薯切块，水煮后过滤取滤液，获得马铃薯提取物；青冈树枝提取物由如下方法制备：将新鲜青冈树枝粉碎后水煮，然后过滤取滤液，获得青冈树枝提取物；天麻茎秆提取物由如下方法制备：将新鲜天麻茎秆粉碎，水煮后过滤取滤液，获得天麻茎秆提取物。
母种培养基中的天麻茎秆提取物的制备方法对培养效果产生一定的影响，水提的方式获得的天麻茎秆提取物效果最好。如果用发酵后乙醇提取或者直接乙醇提取的方法制备，该成分与培养基中其他成分的相容性欠佳，会对蜜环菌母种的生长产生负面影响。
进一步，在S2中，扩种液体培养基的配方为：葡萄糖45-50g/L、酵母粉7-9g/L、维生素B1 0.05-0.09g/L，水补齐至1000mL。采用上述配比的扩种液体培养基，可促进蜜环菌生长，获得活性理想的用于栽培基质接种的蜜环菌液。
进一步，在S3中，核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆的质量比为5-8:2-3:2-3:3-5；分别为核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆的总质量的12-16g/kg和0.5-0.6wt.％的磷酸二氢钾和葡萄糖。采用上述配比的栽培基质，可以培养获得活性理想的用于菌材接种的蜜环菌菌种。
进一步，在S2中，三级发酵包括第一级发酵、第二级发酵和第三级发酵；在第一级发酵和第二级发酵中，接种量为3wt.％，转速为200rpm，温度为28℃，时间为6天。通过三级发酵，提升蜜环菌生物量以及生长活性，用于后续的蜜环菌菌种的栽培。
进一步，第三级发酵在发酵罐中进行，接种量为5wt.％，温度为28℃，搅拌速度为120rpm，溶氧量为18％，发酵时间为144小时。采用上述第三级发酵可以充分提升蜜环菌生物量以及生长活性。
进一步，在S3中，栽培基质的制备方法为：将核桃壳、麦麸和玉米芯分别粉碎并烘干，混合后获得混合粉A；将混合粉A与天麻茎秆粉混匀，再使用水浸泡；过滤后取固体物质，再加入磷酸二氢钾和葡萄糖，获得物料混合物；将物料混合物装入培养瓶，并在培养瓶中补充水，获得栽培基质。采用上述栽培基质的制备方式，制造有利于蜜环菌生长的环境，促进蜜环菌菌种的形成。
进一步，在S3中，培养条件为：温度20℃且在黑暗环境中培养。上述培养条件为蜜环菌生长的适宜条件。
进一步，还包括菌材制备步骤：将菌材树种的枝条切断成棒材；在棒材上切出鱼鳞口，然后用沸水浸泡棒材；棒材晾干后，在鱼鳞口出接种蜜环菌菌种，获得菌材。在木材上切出鱼鳞口并接种蜜环菌菌种的方式，为现有技术中常规的菌材的制备方法，技术成熟且效果理想。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1
(1)蜜环菌液的获取
从来源于商业途径的蜜环菌A9的原种平板上挑取生长状态良好的约1cm3大小的菌索组织，接入母种培养基平板，于培养箱中28℃恒温且遮光培养10天左右，获得含有蜜环菌母种的平板。蜜环菌于2天左右长出洁白菌丝，于7天左右长出洁白菌索，菌索长势较好，并且产生较多的分支。然后将蜜环菌母种切碎为0.5×0.5cm的小块，在母种碎块中加入适量的无菌水，冰浴并手动匀浆处理，使得蜜环菌和水的混合物呈糊状。过滤除去多余水分之后，获得用于接种的母种。以3wt.％的接种量接种于200mL扩种液体培养基中，28℃恒温且遮光培养6天左右，并采用200rpm震荡培养的方式。经上述培养之后，获得一级种子液。然后将一级种子液中的菌丝球充分分散，过滤除去多余水分之后，获得用于接种的一级种子，以3wt.％的接种量接种于200mL扩种液体培养基中，28℃恒温且遮光培养6天左右，并采用200rpm震荡培养的方式。经上述培养之后，获得二级种子液。过滤除去多余水分之后，获得用于接种的二级种子。以5wt.％的接种量接种于含有1L扩种液体培养基的发酵罐中，28℃、120rpm的条件下进行发酵，溶氧控制在18％左右，发酵时间为144小时左右。经过发酵获得用于天麻栽培的蜜环菌液(用于栽培基质接种)。经检测，蜜环菌液中菌丝球密度为152个/mL，菌丝球平均直径为1.2mm。
母种培养基的配方为：马铃薯提取物80g、青冈树枝提取物50g、葡萄糖15g、天麻茎秆提取物10g、牛肉膏6g，琼脂10g，维生素B1 8mg，水补齐至1000mL。
母种培养基的制备方法为：将新鲜马铃薯切块(约3cm×3cm)，然后加入马铃薯质量8倍的水，水煮40分钟，过滤取滤液，获得马铃薯提取物。将新鲜青冈树枝(去叶，并选取较细的树枝)粉碎(过10目)，然后加入青冈树枝质量8倍的水，水煮40分钟，过滤取滤液，获得青冈树枝提取物。将新鲜天麻茎秆粉碎(过10目)，然后加入天麻茎秆质量8倍的水，水煮40分钟，过滤取滤液，获得天麻茎秆提取物。依照配方配制母种培养基，然后121℃高温高压灭菌20分钟(0.1MPa湿热灭菌)，灭菌后，待培养基凝固前，倒平板备用。
扩种液体培养基的配方为：葡萄糖45g/L、酵母粉9g/L、维生素B1 0.05g/L，水补齐至1000mL。按配方量配置后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用。
(2)栽培基质的制备
首先将栽培基质装入1L培养瓶，栽培基质装满培养瓶。栽培基质装瓶后，121℃高温高压灭菌30min，获得灭菌后装有栽培基质的培养瓶。
栽培基质的配方为：核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖。核桃壳、麦麸、玉米芯和天麻茎秆的质量比为5:2:2:3。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆(以原料计算质量)的总质量的12g/kg和0.5wt.％。
制备时，将配方量的核桃壳、麦麸和玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后60℃烘干至水分含量15wt.％以下，然后将上述粉料混合，获得混合粉A。
取新鲜的天麻茎秆切成约2cm左右长的小段，然后将切成小段的天麻茎秆平铺在培养盘上，厚度为3-4cm，然后平铺的天麻茎秆表面喷洒短小芽孢杆菌菌液，天麻茎秆和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：30ml。然后，在天麻茎秆表面平铺纱布，置于40℃恒温摇床上，100rpm培养48h，每4h补充喷洒等量的短小芽孢杆菌菌液。经上述处理之后，获得天麻茎秆培养物。短小芽孢杆菌菌液的获取方法为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus Meyerand Gottheil，ATCC 7061)按照5％的接种量接种至常规LB培养基中，37℃恒温、100rpm恒温培养至OD600值为1左右时停止培养，获得短小芽孢杆菌菌液。将天麻茎秆培养物在60℃的烘箱中放置，直至其含水量小于10％，然后对烘干后的天麻茎秆培养物进行粉碎处理，过8目筛，获得天麻茎秆粉。
将混合粉A与天麻茎秆粉混合，2倍体积无菌水，浸泡24小时。过滤除去多余的水，在浸泡后的固体物质中加入配方量的磷酸二氢钾和葡萄糖，混合均匀后装入培养瓶中，并在培养瓶中加入无菌水，无菌水的用量为混合粉A与天麻茎秆粉的质量之和的40％。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用。
(3)蜜环菌接种以及培养
在灭菌后装有栽培基质的培养瓶中接种(1)中获得的用于天麻栽培的蜜环菌液，接种量为每瓶80ml，接种前需要注意将蜜环菌液充分摇匀。完成接种之后，将培养瓶放置在室内，在黑暗环境中培养，培养温度控制在20℃左右。培养物约在接种后4天萌发出菌丝，于接种后10天左右萌发出菌索，并且在50天左右蜜环菌生长满瓶，获得用于制备菌材的蜜环菌菌种，可进行后续的天麻种植。
(4)菌材的制备：选择青冈树(Quercus glauca Thunb.)的枝条制作菌材，具体选用直径为8-10cm的青冈树新鲜的枝条，并将枝条切断为长度60-70cm左右的棒材。在棒材上砍出若干鱼鳞口。鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。然后将棒材置于沸水中浸泡5min，取出冷却并将棒材晾干，直至棒材的水分含量降为70％。然后使用小刀将鱼鳞口撬开，在每个鱼鳞口中放入小指头大小的蜜环菌菌种。完成接种之后，用力往鱼鳞口按压，菌材的制备完成。获得菌材后，需要尽快进行培育天麻种球或者培育成品天麻的步骤。
(5)培育天麻种球：在10月下旬进行种植，先在种植箱中铺上一层4-6cm厚的土壤(第一土壤层)，将菌材平铺于培养箱底部(形成第一菌材层)，相邻的菌材之间间隔1-2cm，再均匀洒入浸泡后的天麻种子(红杆天麻，Gastrodia elata Bl.f.elata)，以及紫萁小菇菌种(天麻萌发菌)。天麻种子的播撒量为0.5kg/m2左右(重量以未浸泡的种子计算)，紫萁小菇菌种切成小块之后播撒，播撒量为0.3kg/m2左右。再盖上1-2cm厚的土壤(第二土壤层)，在第二土壤层上平铺菌材(形成第二菌材层)，相邻的菌材之间间隔3-4cm，最后在第二菌材层上盖上5-7cm厚的土壤(第三土壤层)。对培养箱及时适量的进行喷水，使培养箱内的水分含量控制在60％左右，培养箱的温度控制在25℃左右，经过6个月的培养，获得天麻种球(即球茎，又称为白麻)。其中，浸泡天麻种子的方法为使用清水将天麻种子浸没即可，浸泡时间8h。
(6)培育成品天麻：在次年4月下旬进行种植，先在种植箱中铺上一层4-6cm厚的土壤(第一土壤层)，将菌材平铺于培养箱底部(形成第一菌材层)，相邻的菌材之间间隔1-2cm,再在第一菌材层上均匀摆放天麻种球(相邻的天麻种球间隔7cm)，然后盖上5-7cm厚的土壤(第二土壤层)。对培养箱及时适量的进行喷水，使培养箱内的水分含量控制在60％左右，培养箱的温度控制在25℃左右，经过7个月的培养，可获得成品天麻，收取其块茎进行实验研究。
(7)成品检测：对本实施例获得的天麻块茎进行功效成分检测，共选取了10个样本(10个天麻块茎)进行检测。检测方法参见《中国药典》中关于天麻的含量测定部分。
高效液相色谱条件具体如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸溶液(3∶97)为流动相；检测波长为220nm。
对照品溶液的制备方法如下：取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，加乙腈-水(3∶97)混合溶液制成每1ml含天麻素50μg、对羟基苯甲醇25μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备方法如下：取天麻块茎粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中，用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。天麻块茎粉末是先将天麻块茎50℃恒温烘干至恒重之后，再粉碎后获得。
测定法如下：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。检测结果参见表1。
实施例2
本实施例基本同实施例1，不同点在于：
母种培养基的配方为：马铃薯提取物100g、青冈树枝提取物50g、葡萄糖20g、天麻茎秆提取物15g、牛肉膏12g，琼脂10g，维生素B1 10mg，水补齐至1000mL。
扩种液体培养基的配方为：葡萄糖50g/L、酵母粉7g/L、维生素B1 0.09g/L，水补齐至1000mL。
栽培基质的配方为：核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖。核桃壳、麦麸、玉米芯和天麻茎秆的质量比为8:3:3:5。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆(以原料计算质量)的总质量的16g/kg和0.6wt.％。
对比例1
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：核桃壳、麦麸、玉米芯、磷酸二氢钾以及葡萄糖。核桃壳、麦麸、玉米芯的质量比为5:2:2。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占核桃壳、麦麸、玉米芯的总质量的12g/kg和0.5wt.％。
对比例2
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：青冈木、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖。青冈木、麦麸、玉米芯和天麻茎秆的质量比为5:2:2:3。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占青冈木、麦麸、玉米芯、天麻茎秆的总质量的12g/kg和0.5wt.％。
青冈木的处理方法为：青冈木去叶的细枝条粉碎过8目筛，然后阴干至水分含量15wt.％以下，然后与其他粉料混合，获得混合粉A。
对比例3
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：青冈木、麦麸、玉米芯、磷酸二氢钾以及葡萄糖。青冈木、麦麸、玉米芯和天麻茎秆的质量比为5:2:2。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占青冈木、麦麸、玉米芯的总质量的12g/kg和0.5wt.％。
对比例4
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：苹果木、麦麸、玉米芯、磷酸二氢钾以及葡萄糖。苹果木、麦麸、玉米芯和天麻茎秆的质量比为5:2:2。磷酸二氢钾和葡萄糖分别占苹果木、麦麸、玉米芯的总质量的12g/kg和0.5wt.％。
苹果木的处理方法为：苹果去叶的细枝条粉碎过8目筛，然后阴干至水分含量15wt.％以下，然后与其他粉料混合，获得混合粉A。
对比例5
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
扩种液体培养基的配方为：葡萄糖45g/L、酵母粉9g/L、天麻茎秆提取物X g/L(X＝1/5/10/15/20/25)、维生素B1 0.05g/L，水补齐至1000mL。
天麻茎秆提取物的制备方法为：将新鲜天麻茎秆粉碎(过10目)，然后加入天麻茎秆质量8倍的水，水煮40分钟，过滤取滤液，获得天麻茎秆提取物。
对比例6
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
扩种液体培养基的配方为：葡萄糖45g/L、酵母粉9g/L、天麻茎秆提取物Xg/L(X＝1/5/10/15/20/25)、维生素B1 0.05g/L，水补齐至1000mL。
天麻茎秆提取物的制备方法为：取新鲜的天麻茎秆切成月2cm左右长的小段，然后将切成小段的天麻茎秆平铺在培养盘上，厚度为3-4cm，然后平铺的天麻茎秆表面喷洒短小芽孢杆菌菌液，天麻茎秆和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：30ml。然后，在天麻茎秆表面平铺纱布，置于40℃恒温摇床上，100rpm培养48h，每4h补充喷洒等量的短小芽孢杆菌菌液。经上述处理之后，获得天麻茎秆培养物。短小芽孢杆菌菌液的获取方法为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus Meyer and Gottheil，ATCC 7061)按照5％的接种量接种至常规LB培养基中，37℃恒温、100rpm恒温培养至OD600值为1左右时停止培养，获得短小芽孢杆菌菌液。将发酵后天麻茎秆培养物置于体积分数为80％的乙醇中，每1g天麻茎秆培养物加入25mL乙醇，90℃浸泡10h，过滤使得固液分离，获得残渣和提取液。将提取液通过常规减压蒸馏将其浓缩为相对密度为1.10左右的浸膏，然后使用纯水将浸膏充分溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：25mL)，获得天麻茎秆提取物。
对比例7
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
母种培养基中的天麻茎秆提取物由如下方法制备：将新鲜天麻茎秆粉碎(过10目)，然后加入天麻茎秆质量8倍的80vol.％乙醇，80℃热浸提取2h，过滤取滤液，将滤液蒸干获得浸膏，浸膏相对密度为1.10左右，然后使用纯水将浸膏充分分散溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：8mL、1g：10mL、1g：20mL、1g：25mL)获得天麻茎秆提取物。
本对比例获得了四种浓度的天麻茎秆提取物，用上述天麻茎秆提取物制备母种培养基，定期观测蜜环菌生长情况。在两种培养条件下(浸膏和纯水的用量比为1g：20mL和1g：25mL)，蜜环菌于9天左右长出黑褐色的菌索，菌索分支不多，蜜环菌的菌索长势不佳。在两种培养条件下(浸膏和纯水的用量比为1g：8mL和1g：10mL)，蜜环菌于4天左右长出乌黑的菌丝，蜜环菌的菌丝长势不佳，最终未萌发形成菌索。由于母种培养效果不好，所以发明人弃用了本对比例的母种培养基，即母种培养基中的天麻茎秆提取物如果用乙醇提取的方法制备，该成分与培养基中其他成分的相容性欠佳，会对蜜环菌母种的生长产生负面影响。
对比例8
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
母种培养基中的天麻茎秆提取物由如下方法制备：
取新鲜的天麻茎秆切成月2cm左右长的小段，然后将切成小段的天麻茎秆平铺在培养盘上，厚度为3-4cm，然后平铺的天麻茎秆表面喷洒短小芽孢杆菌菌液，天麻茎秆和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：30ml。然后，在天麻茎秆表面平铺纱布，置于40℃恒温摇床上，100rpm培养48h，每4h补充喷洒等量的短小芽孢杆菌菌液。经上述处理之后，获得天麻茎秆培养物。短小芽孢杆菌菌液的获取方法为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus Meyerand Gottheil，ATCC 7061)按照5％的接种量接种至常规LB培养基中，37℃恒温、100rpm恒温培养至OD600值为1左右时停止培养，获得短小芽孢杆菌菌液。将发酵后天麻茎秆培养物置于体积分数为80％的乙醇中，每1g天麻茎秆培养物加入25mL乙醇，90℃浸泡10h，过滤使得固液分离，获得残渣和提取液。将提取液通过常规减压蒸馏将其浓缩为相对密度为1.10左右的浸膏，然后使用纯水将浸膏充分溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：8mL、1g：10mL、1g：20mL、1g：25mL)，获得天麻茎秆提取物。
本对比例获得了四种浓度的天麻茎秆提取物，用上述天麻茎秆提取物制备母种培养基，定期观测蜜环菌生长情况。在两种培养条件下(浸膏和纯水的用量比为1g：20mL和1g：25mL)，蜜环菌于8天左右长出黑褐色的菌索，菌索分支不多，蜜环菌的菌索长势不佳。在两种培养条件下(浸膏和纯水的用量比为1g：8mL和1g：10mL)，蜜环菌于3天左右长出洁白的菌丝，蜜环菌的菌丝长势不佳，最终未萌发形成菌索。由于母种培养效果不好，所以发明人弃用了本对比例的母种培养基，即母种培养基中的天麻茎秆提取物如果用发酵后乙醇提取的方法制备，该成分与培养基中其他成分的相容性欠佳，会对蜜环菌母种的生长产生负面影响。
对比例9
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
母种培养基的配方为：马铃薯提取物80g、青冈树枝提取物50g、葡萄糖15g、牛肉膏6g，琼脂10g，维生素B1 8mg，水补齐至1000mL。
本对比例未使用天麻茎秆提取物，蜜环菌于4天左右长出黑褐色菌丝，于9天左右长出黑褐色的菌索，菌索分支不多且较实施例1细，蜜环菌的菌索长势欠佳。由于母种培养效果不好，所以发明人弃用了本对比例的母种培养基。
综合实施例1、对比例7、对比例8和对比例9，天麻茎秆提取物采用水提的方式，对蜜环菌母种的培养具有正向促进作用。
实验例1
对实施例1和2、对比例1-6获得的天麻块茎进行检测，并且为保证实验的平行性，实施例1/2和对比例1-6使用的天麻种子、蜜环菌A9原种均为同一批次，结果参见表1，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总量以干燥品的两种物质的质量分数计算，表中的“总含量”是指天麻素和对羟基苯甲醇的总量。其中，对比例5和对比例6中采用的是天麻茎秆提取物5g/L的扩种液体培养基培养获得的蜜环菌液来接种栽培基质.
表1：实施例1/2、对比例1-6的天麻块茎的检测结果(平均总含量(％)的表示形式为平均值±标准方差，n＝10；“*”表示与实施例1相比具有显著差异，t检验，p＜0.05)
由表1的实验结果可知，采用实施例1和2使用本技术方案的菌材，获得的天麻成品的块茎中的天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量较为理想。对比例1的栽培基质中没有使用天麻茎秆作为原料，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量降低(经t检验，实施例1与对比例1有显著区别，p＜0.05)，说明天麻茎秆经过培养发酵之后获得的原料，对于提升天麻的功效物质的积累具有显著促进作用。天麻茎秆经过发酵之后产物，对于蜜环菌的活性可产生一定影响，进一步促进了其共生天麻的功效物质的积累。
对比例2将核桃壳替换为青冈木，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量相对于实施例1相差较小(经t检验，实施例1与对比例2无显著区别，p＞0.05)。对比例3在对比例2的基础上，省去了使用天麻茎秆作为栽培基质的原料，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量相对于对比例2没有显著变化(经t检验，对比例3与对比例2没有显著区别，p＞0.05)。分析对比例3和对比例2的实验结果，可见天麻茎秆的发酵物对于以青冈木为主要材料的栽培基质的天麻培育效果没有显著影响。对比例4将核桃壳替换为苹果木，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量相对于实施例1稍有下降(经t检验，实施例1与对比例4无显著区别，p＞0.05)。青冈木和苹果木都是现有技术中常用与菌材制作的木材，显示出较好的效果，所以也常被用于制备蜜环菌菌种的栽培基质。但是，由于天麻种植需求量大，会出现青冈木和苹果木供应不足的问题。发明人尝试使用核桃壳代替青冈木和苹果木作为栽培基质的原料。但是，单独使用核桃壳的效果不理想，需要加入天麻茎秆的发酵物来共同使用，说明天麻茎秆的发酵物在作为栽培基质的原料的时候，其与核桃壳能够产生比较显著的协同增效作用。但是，其与青冈木等其他木材的协同增效作用并不明显。
在对比例5和对比例6中，发明人对液体培养基的配方进行了探索。由于在发明人的在先研究中(CN114208616A一种天麻的有机种植方法)，发现将天麻茎秆应用到菌材的制备中，可以提升天麻药材的功效成分的含量。所以，发明人进一步考虑将天麻茎秆应用到菌材制备前的蜜环菌菌种以及的蜜环菌液培养中。但是，对比例5和对比例6的实验结果显示：将天麻茎秆的水提物或者天麻茎秆的发酵后醇提物加入液体培养基中，虽然在一定的用量下，对蜜环菌的液态发酵未产生显著影响(参见实验例2)；但是，如果将发酵后的蜜环菌液应用于栽培基质的接种中，就会对蜜环菌造成出一定的负面影响，特别是影响了用于菌材接种的蜜环菌菌种的性能，最终影响天麻中功效成分的含量。所以，在制备蜜环菌液的液体发酵过程中，最好不要使用天麻茎秆以及其他形式的天麻茎秆加工产物。
实验例2：三级发酵后菌丝球观测
检测“(1)蜜环菌液的获取”中用于天麻栽培的蜜环菌液中菌丝球情况，结果参见表2。
表2：蜜环菌液中菌丝球情况观测结果
上述实验数据说明，实施例1和2以及对比例1-4中，蜜环菌液中菌丝球密度以及直径适中，可以用于后续的蜜环菌菌种以及菌材的制备，但是，蜜环菌液对于蜜环菌菌种活性以及天麻生长的影响，还需要通过后续实验来确定。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，包括蜜环菌菌种的制备步骤：
S1：使用母种培养基培养蜜环菌原种，获得蜜环菌母种；
S2：使用扩种液体培养基对蜜环菌母种进行三级发酵，获得蜜环菌液；
S3：将蜜环菌液接种于栽培基质中，经培养后获得蜜环菌菌种；所述栽培基质的原料包括核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆、磷酸二氢钾以及葡萄糖；天麻茎秆的处理方法为：将天麻茎秆切成小段后喷洒短小芽孢杆菌菌液，经发酵培养、烘干以及粉碎后，获得天麻茎秆粉。
2.根据权利要求1所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S1中，母种培养基的配方为：马铃薯提取物80-100g、青冈树枝提取物40-50g、葡萄糖15-20g、天麻茎秆提取物10-15g、牛肉膏6-12g，琼脂10g，维生素B1 8-10mg，水补齐至1000mL。
3.根据权利要求2所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S1中，马铃薯提取物由如下方法制备：将新鲜马铃薯切块，水煮后过滤取滤液，获得马铃薯提取物；青冈树枝提取物由如下方法制备：将新鲜青冈树枝粉碎后水煮，然后过滤取滤液，获得青冈树枝提取物；天麻茎秆提取物由如下方法制备：将新鲜天麻茎秆粉碎，水煮后过滤取滤液，获得天麻茎秆提取物。
4.根据权利要求3所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S2中，扩种液体培养基的配方为：葡萄糖45-50g/L、酵母粉7-9g/L、维生素B1 0.05-0.09g/L，水补齐至1000mL。
5.根据权利要求4所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S3中，核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆的质量比为5-8:2-3:2-3:3-5；分别为核桃壳、麦麸、玉米芯、天麻茎秆的总质量的12-16g/kg和0.5-0.6wt.％的磷酸二氢钾和葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S2中，三级发酵包括第一级发酵、第二级发酵和第三级发酵；在第一级发酵和第二级发酵中，接种量为3wt.％，转速为200rpm，温度为28℃，时间为6天。
7.根据权利要求6所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，第三级发酵在发酵罐中进行，接种量为5wt.％，温度为28℃，搅拌速度为120rpm，溶氧量为18％，发酵时间为144小时。
8.根据权利要求7所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S3中，栽培基质的制备方法为：将核桃壳、麦麸和玉米芯分别粉碎并烘干，混合后获得混合粉A；将混合粉A与天麻茎秆粉混匀，再使用水浸泡；过滤后取固体物质，再加入磷酸二氢钾和葡萄糖，获得物料混合物；将物料混合物装入培养瓶，并在培养瓶中补充水，获得栽培基质。
9.根据权利要求8所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，在S3中，培养条件为：温度20℃且在黑暗环境中培养。
10.根据权利要求9所述的一种天麻栽培用替代菌材的制备方法，其特征在于，还包括菌材制备步骤：将菌材树种的枝条切断成棒材；在棒材上切出鱼鳞口，然后用沸水浸泡棒材；棒材晾干后，在鱼鳞口出接种蜜环菌菌种，获得菌材。
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