CN114208616A - 一种天麻的有机种植方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻的有机种植方法，包括菌材制备步骤：将青杠树的枝条切断成棒材；在棒材上切出鱼鳞口，获得带鱼鳞口的棒材；然后依次使用沸水和促生液浸泡带鱼鳞口的棒材，获得促生处理后的棒材；然后在促生处理后的棒材的每个鱼鳞口中放入蜜环菌菌种和接种基质，获得菌材。促生液和接种基质是由新鲜天麻茎秆经过短小芽孢杆菌处理和乙醇热浸提取处理等步骤制备而成。本技术方案制备的菌材可以促进天麻生长以及功效成分的积累，并且对天麻种植的废弃部分进行回收处理，进一步提升了种植天麻的品质，具有广阔的应用前景。

Description

一种天麻的有机种植方法
技术领域
本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻的有机种植方法。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Bl.)属兰科(Orchidaceae)多年生草本植物，是我国传统中草药之一，最早以赤箭之名始载于《神农本草经》，被列为上品，多以块茎入药，具有极高的医疗和保健价值。天麻中含有天麻素、对羟基苯甲醇、多糖、蛋白质、氨基酸以及微量元素等多种成分，其中天麻素(gastrodin，GAS)、对羟基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HBA)是天麻的主要药用活性成分，并且是评价天麻质量的关键指标。过去天麻多为野生，近年来采用人工栽培获得成功。天麻是一种无根植物，其块茎整个生长周期埋于地下，依靠蜜环菌菌丝为其提供生长所需的营养，而且菌丝只能在其块茎的皮层细胞内生存而不能进一步深入天麻茎内部。当正在生长的蜜环菌菌索触及天麻后，菌索分枝尖端的生长点侵入天麻原球茎或块茎，天麻与蜜环菌的共生结合从此开始。天麻栽培首要环节就是要培育好的蜜环菌材，蜜环菌材要求发菌快速、生长旺盛及无杂菌污染。蜜环菌材对于天麻人工种植质量的影响较大，特别是对天麻的功效成分的含量存在一定影响，因此，如何培育出适合的蜜环菌材，是提升人工种植天麻品质的关键。
发明内容
本发明意在提供一种天麻的有机种植方法，以解决现有技术中的蜜环菌材对天麻的促生作用有限的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天麻的有机种植方法，包括菌材制备步骤：将青杠树的枝条切断成棒材；在棒材上切出鱼鳞口，获得带鱼鳞口的棒材；然后依次使用沸水和促生液浸泡带鱼鳞口的棒材，获得促生处理后的棒材；然后在促生处理后的棒材的每个鱼鳞口中放入蜜环菌菌种和接种基质，获得菌材；
所述促生液和所述接种基质由如下方法制备：将新鲜天麻茎秆切碎，获得待处理物料，将短小芽孢杆菌菌液喷洒在所述待处理物料上，经发酵培养后获得发酵后物料；使用乙醇作为溶剂对发酵后物料进行热浸提取，然后固液分离获得残渣和提取液；所述残渣经过湿热灭菌、烘干处理和粉碎之后，获得所述接种基质；所述提取液经浓缩、复溶和湿热灭菌之后，获得促生液。
本方案的原理及优点是：
使用短小芽孢杆菌对天麻茎秆进行发酵，可以将天麻茎秆中的物质转换成一些具有促生功能的成分，然后再通过乙醇将这些成分提取，形成促生液。使用促生液处理棒材并制备菌材，可以对天麻的生长和功效成分的积累起到促进作用。并且使用乙醇提取之后的药渣制备种植基质，也能为蜜环菌的生长提供养料。在天麻生长过程中，蜜环菌菌丝为其提供生长所需的营养，采用本技术方案的菌材，可促进天麻和蜜环菌共生过程中对天麻的营养的供给，以及促进天麻次生代谢产物的累积。采用本技术方案制备的菌材进行天麻培养，获得的天麻成品的块茎中的天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量较为理想。另外，短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、环状芽胞杆菌和左乳酸芽胞杆菌均为天麻野生的生长环境中常见的微生物，发明人尝试利用这些微生物来进行天麻种植质量的提升。经过筛选发现，使用短小芽孢杆菌处理天麻茎秆，获得的微生物转化产物的促生效果最佳。
种植天麻成为我国天麻药材商品的主要来源，在大量收获天麻块茎的同时，每年会产生大量的天麻地上部分(包括茎秆)副产品，被用来造纸、沼气或饲料，对天麻茎秆的附加价值未进行充分开发，本技术方案采用短小芽孢杆菌发酵的方式，将天麻茎秆转化成为了的具有促生效应的物质，拓宽了天麻茎秆的用途，为天麻资源的综合利用创造了条件。
综上所述，本技术方案制备的菌材可以对天麻生长以及功效成分的积累起到正向促进作用，并且本技术方案还对天麻种植的废弃部分进行了回收处理，变废为宝，进一步提升了天麻资源的综合利用率以及种植天麻的品质。
进一步，所述发酵培养的温度为40-45℃，转速为100rpm，时间为48h；在发酵培养过程中，每2-3h向所述待处理物料喷洒短小芽孢杆菌菌液；每次喷洒时，待处理物料和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：15-20ml。
采用上述技术方案，在上述发酵培养条件下，短小芽孢杆菌可以对天麻茎秆中的成分进行微生物转化，产生具有促生效应的物质。在发酵培养过程中，向待处理物料喷洒短小芽孢杆菌菌液既补充了新鲜菌种，又补充了发酵培养过程中损失的水分。
进一步，短小芽孢杆菌菌液的OD600值为1。
采用上述技术方案，采用上述浓度的短小芽孢杆菌菌液，可对天麻茎秆进行充分发酵。OD600值为1时，细菌具有较为理想的活性。一般来说，OD600值为1代表菌的数量为2×109cfu/ml。
进一步，所述热浸提取的温度为80-90℃；时间为10-12h。
采用上述技术方案，可以充分地将发酵后物料中的具有促生功效的成分提取。
进一步，在热浸提取中，所述乙醇的体积百分数为80％，发酵后物料和乙醇的用量比为1g：25mL。
采用上述技术方案，上述乙醇浓度和用量，可以保证溶剂对发酵后物料中的功效成分的浸出。
进一步，将所述提取液浓缩为相对密度为1.10的浸膏，然后每1g浸膏使用25mL水复溶，再经过湿热灭菌之后，获得所述促生液。
采用上述技术方案，经过浓缩、灭菌处理，可以促使物料中的乙醇充分挥发，并除去其中的杂菌，避免杂菌影响天麻以及蜜环菌等的生长。
进一步，所述残渣经过湿热灭菌后，然后在50℃条件下烘干至含水量小于5％，再粉碎后过一号筛，获得所述接种基质。
采用上述技术方案，对残渣进行灭菌处理，除去其中的杂菌，避免杂菌影响天麻以及蜜环菌等的生长。将残渣烘干和粉碎，便于后续其与蜜环菌菌种混合。
进一步，蜜环菌菌种和接种基质的质量比为2-4:1。
采用上述技术方案，按照上述配比，接种基质可以充分发挥其促生作用。
进一步，依次使用沸水和促生液浸泡带鱼鳞口的棒材的方法为：使用沸水浸泡棒材5min，待棒材冷却后使用促生液浸泡棒材12h。
采用上述技术方案，先使用沸水浸泡，初步除去棒材中微生物和虫卵等。采用上述的浸泡时间，可以保证棒材对促生液中的促生物质的充分吸收。
进一步，所述棒材的直径为8-10cm，长度为60-70cm；所述鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。
采用上述技术方案，直径为8-10cm是现有技术中菌材(棒材)的常规尺寸，长度为60-70cm适合于培养箱的尺寸。相邻鱼鳞口相距2-3cm，确保菌材上接入充足的蜜环菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1
(1)菌材的制备：选择青杠树(Quercus acutissima Carruth.)的枝条制作菌材，具体选用直径为8-10cm的青杠树新鲜的枝条，并将枝条切断为长度60-70cm左右的棒材。在棒材上砍出若干鱼鳞口。鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。然后将棒材置于沸水中浸泡5min，取出冷却之后，再使用促生液浸泡棒材12h，获得促生处理后的棒材。然后将促生处理后的棒材晾干，直至棒材的水分含量降为70％。然后使用小刀将鱼鳞口撬开，在每个鱼鳞口中放入小指头大小的蜜环菌菌种，并同时放入接种基质，接种基质与蜜环菌菌种的质量比为1:2(为了便于操作，一般是将接种基质涂抹在蜜环菌菌种外侧，然后放入鱼鳞口中)。完成接种之后，用力往鱼鳞口按压，菌材的制备完成。获得菌材后，需要尽快进行培育天麻种球或者培育成品天麻的步骤。
促生液和接种基质的制备利用了天麻种植中的废弃的天麻茎秆，方法具体如下：
取新鲜天麻茎秆切碎，获得待处理物料。将待处理物料平铺在培养盘上，厚度为3-4cm，然后在待处理物料表面喷洒短小芽孢杆菌菌液，待处理物料和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：20ml。然后置于40℃恒温摇床上，100rpm培养48h(需要用纱布覆盖在待处理物料上方)，每3h补充喷洒等量的短小芽孢杆菌菌液。经过发酵处理之后，获得发酵后物料。短小芽孢杆菌菌液的获取方法为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus Meyer andGottheil，ATCC 7061)按照5％的接种量接种至常规LB培养基中，37℃恒温、100rpm恒温培养至OD600值为1左右时停止培养，获得短小芽孢杆菌菌液。
将发酵后物料置于体积分数为80％的乙醇中，每1g发酵后物料加入25mL乙醇，90℃浸泡10h，过滤使得固液分离，获得残渣和提取液。将提取液通过常规减压蒸馏将其浓缩为相对密度为1.10左右的浸膏，然后使用纯水将浸膏充分溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：25mL)，再置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，获得促生液。将残渣置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，然后在50℃烘箱中烘干至恒重，再粉碎后过一号筛，获得接种基质。
(2)培育天麻种球：在10月下旬进行种植，先在种植箱中铺上一层4-6cm厚的土壤(第一土壤层)，将菌材平铺于培养箱底部(形成第一菌材层)，相邻的菌材之间间隔1-2cm，再均匀洒入浸泡后的天麻种子，以及紫萁小菇菌种(天麻萌发菌)。天麻种子的播撒量为0.5kg/m2左右(重量以未浸泡的种子计算)，紫萁小菇菌种切成小块之后播撒，播撒量为0.3kg/m2左右。再盖上1-2cm厚的土壤(第二土壤层)，在第二土壤层上平铺菌材(形成第二菌材层)，相邻的菌材之间间隔3-4cm，最后在第二菌材层上盖上5-7cm厚的土壤(第三土壤层)。对培养箱及时适量的进行喷水，使培养箱内的水分含量控制在60％左右，培养箱的温度控制在25℃左右，经过6个月的培养，获得天麻种球(即球茎，又称为白麻)。其中，浸泡天麻种子的方法为使用清水将天麻种子浸没即可，浸泡时间8h。
(3)培育成品天麻：在次年4月下旬进行种植，先在种植箱中铺上一层4-6cm厚的土壤(第一土壤层)，将菌材平铺于培养箱底部(形成第一菌材层)，相邻的菌材之间间隔1-2cm,再在第一菌材层上均匀摆放天麻种球(相邻的天麻种球间隔7cm)，然后盖上5-7cm厚的土壤(第二土壤层)。对培养箱及时适量的进行喷水，使培养箱内的水分含量控制在60％左右，培养箱的温度控制在25℃左右，经过7个月的培养，可获得成品天麻，收取其块茎进行实验研究。
(4)成品检测：对本实施例获得的天麻块茎进行功效成分检测，共选取了10个样本(10个天麻块茎)进行检测。检测方法参见《中国药典》中关于天麻的含量测定部分。
高效液相色谱条件具体如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸溶液(3∶97)为流动相；检测波长为220nm。
对照品溶液的制备方法如下：取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，加乙腈-水(3∶97)混合溶液制成每1ml含天麻素50μg、对羟基苯甲醇25μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备方法如下：取天麻块茎粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中，用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。天麻块茎粉末是先将天麻块茎50℃恒温烘干至恒重之后，再粉碎后获得。
测定法如下：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。检测结果参见表1。
实施例2
本实施例基本同实施例1，不同点在于，促生液和接种基质的制备方法，具体如下：
取新鲜天麻茎秆切碎，获得待处理物料。将待处理物料平铺在培养盘上，厚度为3-4cm，然后在待处理物料表面喷洒短小芽孢杆菌菌液，待处理物料和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：15ml。然后置于45℃恒温摇床上，100rpm培养48h，每2h补充喷洒等量的短小芽孢杆菌菌液。经过发酵处理之后，获得发酵后物料。短小芽孢杆菌菌液的获取方法为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus Meyer and Gottheil，ATCC 7061)按照5％的接种量接种至常规LB培养基中，培养至OD600值为1时停止培养，获得短小芽孢杆菌菌液。
将发酵后物料置于体积分数为80％的乙醇中，每1g发酵后物料加入25mL乙醇，80℃浸泡12h，过滤使得固液分离，获得残渣和提取液。将提取液浓缩成相对密度为1.10左右的浸膏，然后使用纯水将浸膏充分溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：25mL)，再置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，获得促生液。将残渣置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，然后在50℃烘箱中烘干至恒重，再粉碎后过一号筛，获得接种基质。
实施例3
本实施例基本同实施例1，不同点在于，接种基质与蜜环菌菌种的质量比为1:4。
对比例1
本对比例基本同实施例1，不同点在于，棒材不经过促生液浸泡处理，菌材的制备过程具体如下：
选择青杠树的枝条制作菌材，具体选用直径为8-10cm的青杠树新鲜的枝条，并将枝条切断为长度70cm左右的棒材。在棒材上砍出若干鱼鳞口，然后将棒材置于沸水中浸泡5min，取出冷却之后，将棒材晾干，直至棒材的水分含量降为70％。然后使用小刀将鱼鳞口撬开，在每个鱼鳞口中放入小指头大小的蜜环菌菌种。完成接种之后，用力往鱼鳞口按压，菌材的制备完成。获得菌材后，需要尽快进行培育天麻种球或者培育成品天麻的步骤。
对比例2
本对比例基本同实施例1，不同点在于，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn，ATCC 6051)等量替换短小芽孢杆菌。
对比例3
本对比例基本同实施例1，不同点在于，使用环状芽胞杆菌(Bacillus circulansJordan，ATCC 4513)等量替换短小芽孢杆菌。
对比例4
本对比例基本同实施例1，不同点在于，使用左乳酸芽胞杆菌(Bacillus mycoidesFlugge，ATCC 19647)等量替换短小芽孢杆菌。
对比例5
本对比例基本同实施例1，不同点在于如下技术环节：
将发酵后物料置于纯水中，每1g发酵后物料加入25mL纯水，90℃浸泡10h，过滤使得固液分离，获得残渣和提取液。将提取液浓缩成相对密度为1.10左右的浸膏，然后使用纯水将浸膏充分溶解(浸膏和纯水的用量比为1g：25mL)，再置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，获得促生液。将残渣置于121℃、0.1MPa的条件下湿热灭菌30min，然后在50℃烘箱中烘干至含水量小于5％(质量百分数)，再粉碎后过一号筛，获得接种基质。
对实施例1-3、对比例1-5获得的天麻块茎进行检测(为保证实验的平行性，实施例1-3和对比例1-5使用的天麻种子均为同一批次)，结果参见表1，天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总量以干燥品的两种物质的质量分数计算，表中的“总含量”是指天麻素和对羟基苯甲醇的总量。
表1：实施例1-3、对比例1-5的天麻块茎的检测结果(平均总含量(％)的表示形式为平均值±标准方差)
Figure BDA0003449367420000071
Figure BDA0003449367420000081
由表1的实验结果可知，采用实施例1-3使用本技术方案的天麻有机种植方法，获得的天麻成品的块茎中的天麻素(C13H18O7)和对羟基苯甲醇(C7H8O2)的总含量较为理想。这说明使用短小芽孢杆菌对天麻茎秆进行发酵，可以将天麻茎秆中的物质转换成一些具有促生功能的成分，然后再通过乙醇将这些成分提取，形成促生液。使用促生液处理棒材并制备菌材，可以对天麻的生长和功效成分的积累起到促进作用。并且使用乙醇提取之后的药渣制备种植基质，也能为蜜环菌的生长提供养料。在天麻生长过程中，蜜环菌菌丝为其提供生长所需的营养，采用本技术方案的菌材，可促进天麻和蜜环菌共生过程中，对天麻的营养的供给，以及促进天麻次生代谢产物的累积。对比例1中没有使用本方案的促生液和接种基质，获得的天麻中的天麻素＝和对羟基苯甲醇的总含量较低。对比例2-4中分别使用了枯草芽孢杆菌、环状芽胞杆菌和左乳酸芽胞杆菌对天麻茎秆进行发酵处理，但是，其效果不及短小芽孢杆菌。短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、环状芽胞杆菌和左乳酸芽胞杆菌均为天麻野生的生长环境中常见的微生物，发明人尝试利用这些微生物来进行天麻种植质量的提升。但是实验发现，这些芽孢杆菌的发酵效果存在差异，短小芽孢杆菌的效果显著优于其他(t检验，p＜0.01)。对比例5中使用了纯水来提取发酵后物料，其效果不是非常理想，这说明具有促生作用的成分大多是醇溶性的，采用乙醇提取更为适合。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种天麻的有机种植方法，其特征在于，包括菌材制备步骤：将青杠树的枝条切断成棒材；在棒材上切出鱼鳞口，获得带鱼鳞口的棒材；然后依次使用沸水和促生液浸泡带鱼鳞口的棒材，获得促生处理后的棒材；然后在促生处理后的棒材的每个鱼鳞口中放入蜜环菌菌种和接种基质，获得菌材；
所述促生液和所述接种基质由如下方法制备：将新鲜天麻茎秆切碎，获得待处理物料，将短小芽孢杆菌菌液喷洒在所述待处理物料上，经发酵培养后获得发酵后物料；使用乙醇作为溶剂对发酵后物料进行热浸提取，然后固液分离获得残渣和提取液；所述残渣经过湿热灭菌、烘干处理和粉碎之后，获得所述接种基质；所述提取液经浓缩、复溶和湿热灭菌之后，获得促生液。
2.根据权利要求1所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为40-45℃，转速为100rpm，时间为48h；在发酵培养过程中，每2-3h向所述待处理物料喷洒短小芽孢杆菌菌液；每次喷洒时，待处理物料和短小芽孢杆菌菌液的用量比为100g：15-20ml。
3.根据权利要求2所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，短小芽孢杆菌菌液的OD600值为1。
4.根据权利要求3所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，所述热浸提取的温度为80-90℃；时间为10-12h。
5.根据权利要求4所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，在热浸提取中，所述乙醇的体积百分数为80％，发酵后物料和乙醇的用量比为1g：25mL。
6.根据权利要求5所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，将所述提取液浓缩为相对密度为1.10的浸膏，然后每1g浸膏使用25mL水复溶，再经过湿热灭菌之后，获得所述促生液。
7.根据权利要求6所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，所述残渣经过湿热灭菌后，然后在50℃条件下烘干至含水量小于5％，再粉碎后过一号筛，获得所述接种基质。
8.根据权利要求7所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，蜜环菌菌种和接种基质的质量比为2-4:1。
9.根据权利要求8所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，依次使用沸水和促生液浸泡带鱼鳞口的棒材的方法为：使用沸水浸泡棒材5min，待棒材冷却后，使用促生液浸泡棒材12h。
10.根据权利要求9所述的一种天麻的有机种植方法，其特征在于，所述棒材的直径为8-10cm，长度为60-70cm；所述鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。
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