CN115669468B - 光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物活性物质生产技术领域，具体涉及光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用。本发明提供了光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用，本发明通过对荆芥属植物幼苗进行光处理，在对应的光处理周期下可以有效提高荆芥属植物中包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮在内的多种次级产物的总量以及可以提高柠檬烯和胡薄荷酮各自在荆芥中的含量，进而得到次级代谢产物含量高的荆芥属植物，提高植物的品质和药物活性成分，进而提高荆芥属植物的药用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物活性物质生产技术领域，具体涉及光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用。
背景技术
植物药是天然药物的主体，占总数的90％左右，已成为创制新药的重要来源。如何充分利用中药材资源优势、应对中药材资源缺乏、提高中药材有效成分含量等问题成为了我国中药材行业亟需研究的问题。光作为自然界中重要的环境因素，不仅是无机物转化为有机物供给生长发育的能量，也对植物的生长及代谢起着重要的作用。
与初级代谢相比，次生代谢的含量在植物中占比较低，但是许多次生代谢产物可以作为药用的活性成分，人们利用这些活性成分来治疗一些病症。而活性成分的产量与光的关系密切。冷杉的活性物质主要是单萜类，通过减薄冷杉林冠层廓线，发现冷杉中的单萜含量从底层到顶层逐渐增加。茶多酚是茶叶中的活性成分，弱光强使茶树中的酚酸含量下降；而在生菜中，高光强显著提高了生菜的酚类化合物。除了萜类、酚类，黄酮的产量也受光调控，扁豆在相对光强为50-60％时其芦丁的含量较高。
唇形科荆芥属荆芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)为一年生草本植物，以其干燥地上部分入药，归肺肝经，味辛性微温，主治感冒、头痛等症状。2020中国药典规定荆芥药材中含挥发油不得少于0.30％(mL/g)，胡薄荷酮的含量不得少于0.020％。如何提高荆芥中挥发油(主要成分为胡薄荷酮，还包括薄荷酮和柠檬烯)及胡薄荷酮的含量，成为提高荆芥药材质量的关键。目前，在生产中，人们仅通过施肥的方法提高荆芥的产量及其中总黄酮、挥发油的含量。但此种提高荆芥产量及活性成分的方式过于单一，且虽然氮肥可以提高荆芥中总黄酮的含量，但是荆芥中主要药效成分为萜类物质，氮肥是否能提高荆芥的药效成分依然有待研究。此外，肥料如氮肥的施用不当，会引起土壤退化，对生态环境造成负面影响。
发明内容
本发明的目的在于提供光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用，采用本发明所述光处理条件可以显著提高荆芥属植物中包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮在内的次级代谢产物的含量，提高荆芥属植物中药用活性成分。
本发明提供了光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用。
优选的，所述次级代谢产物包括单萜类化合物。
优选的，所述荆芥属植物包括荆芥。
优选的，所述荆芥属植物为荆芥。
优选的，所述单萜类化合物包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮中的一种或多种。
本发明还提供了一种提高荆芥中单萜类化合物产量的光处理方法，包括如下步骤：
对荆芥幼苗进行光处理，得到高单萜类化合物含量的荆芥；
当所述单萜类化合物包括柠檬烯和/或胡薄荷酮时，所述光处理的光强度为 900～1000μmol·m-2·s-1，所述光处理的周期为12L：12D；
当所述单萜类化合物包括薄荷酮时，所述光处理的光强度为0μmol·m-2·s-1。
优选的，所述光处理的时长为7d。
优选的，所述荆芥幼苗为24天大小的幼苗；所述光处理的温度为23～25℃。
有益效果：
本发明提供了光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用，本发明通过对荆芥属植物幼苗进行光处理，在对应的光处理周期下可以，有效提高荆芥属植物中包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮在内的多种次级产物的总量以及可以提高柠檬烯和胡薄荷酮各自在荆芥中的含量，进而得到高次级产物含量的荆芥属植物，提高植物的品质和药物活性成分，进而提高荆芥属植物的药用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1～3及对比例1中荆芥的鲜重；
图2为实施例1、实施例3和对比例1中柠檬烯的含量结果，其中A为光照强度为0、140和1000μmol·m-2·s-1下柠檬烯的响应峰，B为0、140和 1000μmol·m-2·s-1下柠檬烯的定量分析结果；
图3为实施例1、实施例3和对比例1中胡薄荷酮的含量结果，其中A为0、 140和1000μmol·m-2·s-1下胡薄荷酮的响应峰，B为0、140和1000μmol·m-2·s-1下胡薄荷酮的定量分析结果；
图4为实施例1、实施例3和对比例1中薄荷酮的含量结果，其中A为0、 140和1000μmol·m-2·s-1下薄荷酮的响应峰，B为0、140和1000μmol·m-2·s-1下薄荷酮的定量分析结果；
图5为实施例3～4和对比例2中柠檬烯的含量结果；
图6为实施例3～4和对比例2中胡薄荷酮的含量结果。
具体实施方式
本发明提供了光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的应用。
本发明所述次级代谢产物优选包括单萜类化合物，进一步优选包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮中的一种或多种，更优选包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮。本发明所述荆芥属植物优选包括荆芥。基于上述优选方案，光处理在提高荆芥属植物中单萜类化合物产量中的应用以及光处理在提高荆芥中单萜类化合物产量中的应用均属于本发明中的保护范围。
本发明还提供了一种提高荆芥中单萜类化合物产量的光处理方法，包括如下步骤：
对荆芥幼苗进行光处理，得到高单萜类化合物含量的荆芥；
当所述单萜类化合物包括柠檬烯和/或胡薄荷酮时，所述光处理的光强度为 900～1000μmol·m-2·s-1，所述光处理的周期为12L：12D；
当所述单萜类化合物包括薄荷酮时，所述光处理的光强度为0μmol·m-2·s-1。
本发明对荆芥幼苗进行光处理前，优选还包括培养所述荆芥幼苗。在本发明中，所述荆芥幼苗的培养方法包括如下步骤：将荆芥种子同质化处理后，播种，培养，得到长出两片子叶的荆芥幼苗；将所述长出两片子叶的幼苗进行移栽，得到所述荆芥幼苗。
本发明优选将荆芥种子同质化处理，得到同质化荆芥种子。本发明所述同质化处理优选包括将荆芥种子于无菌水中浸泡后，冷藏黑暗处理。本发明所述无菌水浸泡的时间优选为2d；所述无菌水浸泡的作用为防止种子在同质化过程中发霉。本发明所述冷藏黑暗处理的温度优选为1～7℃，更优选为4℃；所述冷藏黑暗处理的时间优选为2d。本发明所述冷藏黑暗处理优选在冰箱中进行。本发明所述同质化处理可以使种子萌发时间接近。
得到所述同质化荆芥种子后，本发明优选将所述同质化荆芥种子播种和培养，得到长出两片子叶的荆芥幼苗。本发明对所述播种方式没有特殊限定，采用本领域中常规荆芥播种方式，保证均匀播种即可。本发明所述培养的光照强度优选为140μmol·m-2·s-1；所述培养的光照周期优选为12L：12D。本发明所述培养的温度优选为23～25℃，更优选为25℃。本发明所述培养优选在环境相对稳定的人工气候室中进行。
完成所述培养后，本发明优选将所述荆芥幼苗进行移栽。本发明优选将所述长出两片子叶的荆芥幼苗移栽至单株种植装置中；所述单株种植装置优选为口径尺寸为10cm×10cm的方形装置；所述方形装置的颜色优选为黑色。本发明对所述移栽步骤没有特殊限定，采用本领域中常规移栽步骤，保证荆芥幼苗根部不受损伤即可。
完成所述移栽之后，在光照强度为140μmol·m-2·s-1；光照周期为12L：12D，温度为23～25℃的人工气候室环境中生长24d。对本发明对所述荆芥幼苗进行光处理，得到高单萜类化合物含量的荆芥；
当所述单萜类化合物包括柠檬烯和/或胡薄荷酮时，所述光处理的光强度为 900～1000μmol·m-2·s-1，所述光处理的周期为12L：12D；
当所述单萜类化合物包括薄荷酮时，所述光处理的光强度为0μmol·m-2·s-1。
当所述单萜类化合物包括柠檬烯和/或胡薄荷酮时，本发明所述光处理的光强度优选为900～1000μmol·m-2·s-1范围内的任意值，更优选为1000μmol·m-2·s-1。当所述单萜类化合物包括薄荷酮时，所述光处理的光强度为0μmol·m-2·s-1，即在光处理阶段对所述荆芥幼苗进行黑暗处理。
本发明所述光处理的周期优选为12L：12D。本发明所述光处理的时长优选优选为7d。本发明所述荆芥幼苗优选为移栽后24天大小的幼苗。本发明所述光处理的温度优选为23～25℃。本发明所述光处理的光源类型没有特殊限定，本领域中常规人工光源均可。
本发明所述栽培方法简单易行，较易在实际应用中实施，所述光处理中的光照条件仅仅通过补光的形式便能实现，而黑暗条件也仅需要通过遮光的办法即可达到，且处理时间短，节省能量；同时不需要对植株进行转移或加工处理，节省劳动力；此外，所述栽培方法还可以根据所需要的化合物不同而调整为不同的光条件。
采用本发明所述光处理方法中的对应参数可以提高荆芥中包括柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮在内的多种单萜类化合物的总量以及可以提高柠檬烯和胡薄荷酮各自在荆芥中的含量，提高荆芥中药用活性成分的含量，提高荆芥药用质量，进而增加其作为原料制备植物药的药用价值。
基于本发明提供的高单萜类化合物含量的荆芥的上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的荆芥在制备植物药中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术效果进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种提高荆芥中单萜类化合物产量的栽培方法，由以下步骤组成：
1)种子的同质化处理和播种：用无菌水浸泡荆芥种子2天，于4℃冰箱黑暗处理2天，同质化种子后，将种子均匀播种；
2)培养：完成播种后，将播种后的荆芥在光照强度为140μmol·m-2·s-1，光周期为12L：12D，温度为23～25℃的人工气候室中培养，直至大部分荆芥苗长出两片子叶；
3)在不损伤荆芥苗根部的情况下，将步骤2)中的每株小苗单株移栽到口径为10cm×10cm的黑色方格中，继续培养；
4)在保证与步骤2)中相同的光周期和培养温度的情况下，对24天大小的小苗进行光强度为1000μmol·m-2·s-1的光处理7天，得到高单萜类化合物含量的荆芥。
实施例2
采用实施例1中的栽培方法培养高单萜类化合物含量的荆芥，区别在于步骤4)中光处理的光照强度为0μmol·m-2·s-1，即采用的是黑暗处理。
对比例1
采用实施例1中的栽培方法培养高单萜类化合物含量的荆芥，区别在于步骤4)中光处理的光照强度为140μmol·m-2·s-1。
测试例1
1)荆芥鲜重测定
将实施例1～2及对比例1中培养得到的荆芥从红白相接的根茎处剪断，称取鲜活的地上部分作为荆芥的鲜重，结果如表1和图1所示，在图1中横坐标表示光照强度，纵坐标表示荆芥植株鲜重：
表1实施例1～2及对比例1荆芥植株鲜重
| 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | |
| 鲜重(g) | 1.060±0.162 | 0.501±0.458 | 1.131±0.112 |
根据表1和图1中的结果可知，实施例1中高光强处理后的荆芥植株的鲜重与对比例1中的鲜重无显著性差异；但是实施例1中的荆芥植株的鲜重显著高于实施例2中黑暗处理组的鲜重；进而说明光处理条件对荆芥的生长具有较大的促进作用。
2)荆芥活性成分的提取及测定
2.1样品制备：
(1)将实施例1～2及对比例1中的荆芥，分别从根茎部整株剪下，马上放入液氮中；
(2)将研钵与研杵用液氮冷却，放入单株荆芥与适量液氮研磨，期间多次加入适量液氮研磨荆芥至均匀粉末状；
(3)分别取约0.2g荆芥粉末于棕色玻璃瓶中，用移液管加入1.5mL正己烷，得到混合溶液；
(4)将步骤(3)中的混合溶液在40W超声提取1小时，在此期间每隔20 分钟取出摇晃均匀；
(5)超声结束后，取出瓶中液体于离心管中，10000xg离心10分钟；
(6)取离心后的上清液转移至新的离心管中，加入适量无水硫酸钠除去多余的水分；
(7)用1mL注射器吸取样品，通过0.22μm滤膜过滤后，上GC-MS检测代谢物响应值。
2.2GC-MS检测代谢物
(1)安捷伦HP-5MS UI色谱柱(30m×0.250mm×0.25μm)，载气为氦气(He)。流速1mL/min，分流比为10：1，进样：1μL；
(2)程序升温：初始温度为80℃，保持3min；以每分钟10℃升温至110℃，保持3min；以每分钟10℃升温至210℃，保持3min；以每分钟10℃升温至230℃，保持3min；
(3)质谱设置：质量选择检测器(MSD)电离方式为电子轰击电离源(EI) (电离电压70V，离子源温度230℃，四极杆温度150℃)，MSD数据采集模式为m/z 40～500；
(4)使用外标法，对柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮的浓度进行定量。
其中实施例1、实施例2及对比例1中柠檬烯、胡薄荷酮和胡薄荷酮的定量结果分别如图2～4所示：其中在图2～4的A图中横坐标分别表示柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮的保留时间，纵坐标分别表示柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮的响应峰；B图中横坐标均表示光照强度，纵坐标分别表示柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮的含量。
根据图2可以得出，当光处理的光照强度分别是0μmol·m-2·s-1(实施例2)、 140μmol·m-2·s-1(对比例1)和1000μmol·m-2·s-1(实施例1)时，荆芥中的柠檬烯含量分别为2.324mg/L、4.395mg/L和11.882mg/L，且1000μmol·m-2·s-1高光强条件下的柠檬烯含量显著高于0μmol·m-2·s-1和140μmol·m-2·s-1；1000μmol·m-2·s-1高光强条件下的柠檬烯含量与光强度为140μmol·m-2·s-1条件下的柠檬烯含量差异的P值为0.00179＜0.01，具有极显著性差异。
根据图3可以得出，当光处理的光照强度分别是0μmol·m-2·s-1(实施例2)、 140μmol·m-2·s-1(对比例1)和1000μmol·m-2·s-1(实施例1)时，荆芥中的胡薄荷酮的含量分别为49.056mg/L、104.303mg/L和169.040mg/L，且1000μmol·m-2·s-1高光强条件下的胡薄荷酮含量显著高于0μmol·m-2·s-1和140μmol·m-2·s-1； 1000μmol·m-2·s-1高光强条件下与光强度为140μmol·m-2·s-1条件下的的胡薄荷酮含量的P值为0.038＜0.05，具有显著性差异。140μmol·m-2·s-1高光强条件下与光强度为0μmol·m-2·s-1条件下的的胡薄荷酮含量差异的P值为0.000021＜0.01，具有极显著性差异。
根据图4可以得出，当光处理的光照强度分别是0μmol·m-2·s-1(实施例2)、 140μmol·m-2·s-1(对比例1)和1000μmol·m-2·s-1(实施例1)时，荆芥中的薄荷酮的含量分别为3862.946mg/L、86.249mg/L和104.25mg/L。考虑到黑暗处理对荆芥的鲜重具有降低的作用，综合薄荷酮的浓度及荆芥鲜重，计算得到 0μmol·m-2·s-1情况下，薄荷酮的产量为14.49ng/株，140μmol·m-2·s-1和 1000μmol·m-2·s-1条件下薄荷酮的产量分别为0.73ng/株和0.83ng/株。
实施例1～2及对比例1中柠檬烯和胡薄荷酮的定量结果分别如图5～6所示：在图5～6中横坐标均表示光照强度，纵坐标分别表示柠檬烯和胡薄荷酮的含量。
为了进一步说明光处理在提高荆芥属植物中次级代谢产物产量中的用途，本发明选用另外一批不同时期采收种子的荆芥样本，进行试验。
实施例3
采用实施例1中的栽培方法培养高单萜类化合物含量的荆芥，区别在于采用的荆芥样本批次不同。
实施例4
采用实施例3中的栽培方法培养高单萜类化合物含量的荆芥，区别在于步骤4)中光处理的光照强度为900μmol·m-2·s-1。
对比例2
采用实施例3中的栽培方法培养高单萜类化合物含量的荆芥，区别在于步骤4)中光处理的光照强度为140μmol·m-2·s-1。
测试例2
对实施例3～4及对比例2中光处理后的荆芥中的柠檬烯和胡薄荷酮的浓度进行定量，方法同测试例1中的步骤2)，结果如图5～6所示，在图5～6中横坐标均表示光照强度，纵坐标分别表示柠檬烯或胡薄荷酮的含量。
根据图5可以得出：当光处理的光照强度分别是140μmol·m-2·s-1(对比例2)、900μmol·m-2·s-1(实施例4)、和1000μmol·m-2·s-1(实施例3)时，荆芥中的柠檬烯含量分别为2.627mg/L、7.189mg/L和9.805mg/L，且1000μmol·m-2·s-1和 900μmol·m-2·s-1高光强条件下的柠檬烯含量显著高于140μmol·m-2·s-1，尤其 1000μmol·m-2·s-1高光强条件下的柠檬烯含量相对更高；900μmol·m-2·s-1高光强条件下的柠檬烯含量与光强度为140μmol·m-2·s-1条件下的柠檬烯含量差异的P值为0.0000353＜0.01，具有极显著性差异。
根据图6可以得出：当光处理的光照强度分别是140μmol·m-2·s-1(对比例2)、900μmol·m-2·s-1(实施例4)、和1000μmol·m-2·s-1(实施例3)时，荆芥中的胡薄荷酮的含量分别为61.266mg/L、104.227mg/L和119.383mg/L，1000μmol·m-2·s-1高光强条件下的胡薄荷酮含量略高于900μmol·m-2·s-1条件下胡薄荷酮含量，且 1000μmol·m-2·s-1和900μmol·m-2·s-1高光强条件下的胡薄荷酮含量显著高于 140μmol·m-2·s-1；900μmol·m-2·s-1高光强条件下与光强度为140μmol·m-2·s-1条件下的的胡薄荷酮含量的P值为0.0000613＜0.01，具有极显著性差异。
由以上结果可以得出：对荆芥进行光处理，当光照强度在 900～1000μmol·m-2·s-1时可以显著增加荆芥中柠檬烯和胡薄荷酮的含量，当光处理的光照强度为0μmol·m-2·s-1时，可以显著增加荆芥中薄荷酮的含量；同时，不同批次样本中柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮含量的变化趋势相同，进而说明本发明中光处理可以显著提高荆芥中柠檬烯、胡薄荷酮和薄荷酮的含量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (1)
1.一种提高荆芥中单萜类化合物产量的光处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
对荆芥幼苗进行光处理，得到高单萜类化合物含量的荆芥；
当所述单萜类化合物包括柠檬烯和/或胡薄荷酮时，所述光处理的光强度为900~1000μmol·m-2·s-1，所述光处理的周期为12L：12D；
当所述单萜类化合物包括薄荷酮时，所述光处理的光强度为0μmol·m-2·s-1；
所述光处理的时长为7d，光处理的温度为23~25℃；
所述荆芥幼苗为24天大小的幼苗。
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