CN107613772A - 基于兼养小球藻的组合物，及其制备方法和对于植物的施用 - Google Patents
基于兼养小球藻的组合物，及其制备方法和对于植物的施用 Download PDFInfo
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Abstract
提供了制备液体的基于兼养小球藻的组合物的方法，包括巴氏灭菌和稳定没有经过干燥过程的低浓度的兼养小球藻全细胞。所述液体组合物可以在低浓度和低频率土壤和叶面应用中，用于增强植物出苗和生长。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年12月16日提交的，名称为“制备用于植物的基于兼养小球藻的组合物的方法”的美国临时申请号62/092,766；于2014年12月16日提交的，名称为“用于加速豆科植物出苗和成熟的兼养小球藻的应用”的美国临时申请号62/092,771；于2014年12月16日提交的，名称为“用于加速茄科植物出苗和成熟的兼养小球藻的应用”的美国临时申请号62/092,774；于2014年12月16日提交的，名称为“用于改善茄科植物的产量和品质的兼养小球藻的应用”的美国临时申请号62/092,703；于2014年12月16日提交的，名称为“用于植物的基于兼养小球藻的组合物”的美国临时申请号62/092,777；于2015年1月22日提交的，名称为“制备用于植物的基于兼养小球藻的组合物的方法”的美国申请号14/602,331；于2015年1月22日提交的，名称为“用于加速豆科植物出苗和成熟的兼养小球藻的应用”的美国申请号14/602,348；于2015年1月22提交的，名称为“用于加速茄科植物出苗和成熟的兼养小球藻的应用”的以及美国专利申请号14/602,356，以及于2015年1月22日提交的，名称为“用于改善茄科植物的产量和品质的兼养小球藻的应用”的美国专利申请号14/602,362。所有这些文献的全部内容在此引入本文作为参考。
背景技术
种子出苗(emergence)发生为不成熟的植物突破其种皮，通常地紧接着从土壤中长出茎。在许多幼苗上出现的第一叶片是所谓的子叶(seed leave)，或子叶(cotyledon)，其通常与后生的叶子相似性很小。第一片真叶后不久(这通常或多或少取决于植物)，出现子叶下降(drop off)。种子萌发是在通过适当的触发释放可能的休眠机制之后通过吸水触发的复杂的生理学过程。在有利的条件下，胚胎快速膨胀生长终结在覆盖层的破裂和出现胚根。已经提出许多试剂作为种子出苗调节剂。温度和湿度调节是影响种子出苗的常见方法。将营养物加入土壤也已经被提出以促进某些植物种子出苗。
类似地，成熟植物的生长和果实生产也是复杂的生理过程，涉及根、芽和叶的输入和路径。不论在商业规模或家庭花园规模，种植者一直致力于优化作物的产量和质量，以确保在每个生长季节进行的投资的高回报。随着人口增长，对于食物和可再生技术市场而言，对于植物原料的需求上升，增强了高效农业生产的重要性。环境对植物健康和生产的影响导致需要这样的策略(在生长季节，其允许植物补偿环境的影响并使产量最大化)。将营养物添加到土壤中或施用到叶面也已经被提出以促进某些植物的产量和质量。有效性可归因于制备产品的组分或方法。增加产品的有效性可减少需要的产品的量，并增加农业过程的效率。
发明内容
本发明的实施例提供用于制备液体的基于兼养小球藻的组合物的方法。该组合物可包括巴氏灭菌和稳定低浓度的兼养小球藻全细胞(其没有经过干燥处理)。所述液体组合物可用于在低浓度和低频率土壤和叶面应用中增强植物出苗和生长。
一些实施例包括植物增强的方法，其包括给予植物液体组合物处理，所述处理包括小球藻的培养物。该组合物可以包括全巴氏灭菌的小球藻细胞。在一些实施方案中，组合物可以以0.003-0.080重量％固体的浓度施用。
在一些实施例中，小球藻细胞在50-80℃下巴氏灭菌15-360分钟。在一些实施例中，小球藻细胞可以在具有大于11重量％小球藻浓度的培养物中在55-65℃下巴氏灭菌90-150分钟。在一些实施例中，可将该培养物稀释到10-11重量％小球藻，以及冷却至35-45℃。在一些实施例中，将巴氏灭菌的培养物调节到pH 3.5-4.5。
在一些实施例中，小球藻细胞可以培养在兼养条件下。在一些实施例中，所述兼养条件包括在合适的培养基中培养小球藻细胞7-14天的培养长度，温度为20-30℃，pH值在6.5-8.5之间，以及溶解氧浓度可为0.1-4mg L。
在一些实施例中，小球藻细胞可以培养在非无菌(non-axenic)兼养条件下。在一些具体实施方案中，至少一种形成孢子的细菌可存在于非无菌培养物中。该细菌可以是假芽孢杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、短芽孢杆菌或类似物。
在一些实施例中，可以通过以下各项给予所述组合物：在种植前在组合物中浸泡种子；使种植种子的非常邻近的土壤与有效量的组合物接触；使植物的根部与有效量的组合物水培地接触；在出苗后使有效量的组合物接触植物的可接触部分；或类似物。
在一些实施例中，所述液体组合物可以范围为10-150加仑/英亩的速率施用至土壤或土壤中出苗的植物。
在一些实施例中，种子可以浸泡90-150分钟。
在一些实施例中，所述液体组合物可包括0.008％-0.080重量％固体的全巴氏灭菌的小球藻细胞。
在一些实施例中，所述液体组合物可以通过喷雾给予。该组合物可以每3-28天或每4-10天或类似地给予。在一些实施例中，所述液体组合物可在出苗后5-14天首次施用。
在一些实施例中，所述液体组合物可以通过低容量灌溉系统，土壤浸润应用，空中喷施系统等施用于土壤。
在一些实施例中，所述植物可以是以下植物家族，茄科，豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，禾本科(Poaceae)，蔷薇科(Roasaceae)，葡萄科(Vitaceae)，芸苔科(Brassicaeae)(十字花科(Cruciferae))，番木瓜科(Caricaceae)，锦葵科(Malvaceae)，无患子科(Sapindaceae)，漆树科(Anacadiaceae)，芸香科(Rutaceae)，桑科(Moraceae)，旋花科(Convolvulaceae)，薄荷科(Lamiaceae)，马鞭草科(Verbenaceae)，胡麻科(Pedaliaceae)，菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))，伞形科(Apiaceae)(伞形科(Umbelliferae))，五加科(Araliaceae)，木犀科(Oleaceae)，杜鹃花科(Ericaceae)，猕猴桃(Actinidaceae)，仙人掌(Cactaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，蓼科(Polygonaceae)，山茶科(Theaceae)，玉蕊(Lecythidaceae)，茜草科(Rubiaceae)，罂粟科(Papveraceae)，八角科(Illiciaceae)茶藨子科(Grossulariaceae)，桃金娘科(Myrtaceae)，胡桃科(Juglandaceae)，桦木科(Bertulaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，天门冬科(Asparagaceae)(百合科(Liliaceae))，葱科(Alliaceae)(百合科(Liliceae))，凤梨科(Bromeliaceae)，姜科(Zingieraceae)，芭蕉科(Muscaceae)，棕榈科(Areaceae)，薯蓣科(Dioscoreaceae)，肉豆蔻科(Myristicaceae)，番荔枝科(Annonaceae)，大戟科(Euphorbiaceae)，樟科(lauraceae)，胡椒科(Piperaceae)，龙眼科(Proteaceae)等。
在一些实施例中，全小球藻细胞没有经过干燥过程。
在一些实施方案中，液体组合物处理可以进一步包括至少一种适于植物培养稳定剂。培养稳定剂可以是山梨酸钾，磷酸，抗坏血酸，苯甲酸钠，或类似物，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，液体组合物处理不含除了全小球藻细胞的培养之外，用于增强出苗或成熟的活性成分。
在一些实施例中，通过比较处理的植物和基本上相同的未处理的植物可以确定增强。可以观察至少一种植物特性的至少10％的可量化的差异。
在一些实施例中，所述植物特性可以是种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤等，或它们的任何组合。
在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，从土壤中出苗的植物数可以增加至少10％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，通过叶形成显示成熟的植物数增加至少10％。
本发明的实施例提供了用于植物增强的液体组合物，该组合物包括全巴氏灭菌的小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以是巴氏灭菌的无菌培养物，其中可以存在至少一种孢子形成细菌。在一些实施例中，该菌可选自假芽孢杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、短芽孢杆菌和它们的任何组合。在一些实施例中，细菌菌群包括除了所有的假芽孢杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、短芽孢杆菌之外，至少五种其它细菌。本发明的细菌菌群也可以包括下面列出的细菌的任何一种或多种：
类芽孢杆菌属
芽孢杆菌属
乳酸菌属
短芽孢杆菌属
马赛菌属
假单胞菌属
食菌蛭弧菌
寡养单胞菌属
不动杆菌属
肠杆菌属
黄杆菌属
动胶菌属藻类相关的
伯克氏菌科
黄单胞菌科
肠杆菌科
丛毛单胞菌科
草酸杆菌科；
噬几丁质杆菌科
γ变形杆菌纲
伯克氏菌目
变形菌门
单体分类群
未分类的细菌
在本发明的一些实施方案中，所述组合物可以为0.0001％-40重量％的小球藻。在一些实施例中，可以是10-11重量％小球藻。在一些实施例中，巴氏灭菌的培养物可在pH值为3.5-4.5。在各个实施例中，小球藻可以是兼养培养物，在至少一种有机碳源上以及通过光合作用生长。在一些实施方案中，组合物进一步包括合适小球藻生长的介质。在一些实施方案中，组合物可以用水稀释。同样地，在一些实施方案中，组合物可包含其它添加剂，包括肥料，pH调节剂，植物激素，杀虫剂，矿物质，洗涤剂。在一些实施方式中，组合物不含除了全小球藻细胞的培养物之外，用于提高出苗或成熟的添加剂。
本发明的一些实施例提供了包括所述组合物的含有植物种子的土壤，其中所述种子具有改善的特性。在一些实施例中，本发明提供了与所述组合物接触的植物种子，其中所述种子具有改进的特性。同样地，在一些实施例中，本发明提供了水培地或在土壤中的与有效量的所述组合物接触的植物根部，其中所述根或整个植物具有改进的特性。在其他实施方案中，本发明提供了出苗后与组合物接触的植物，其中所述植物具有改良的特性。
本发明的一些实施例包括包含所述组合物的低容量灌溉系统。在一些实施例中，本发明包括土壤浸润系统，和/或空中喷洒系统(包括所述组合物)。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种适合植物的培养稳定剂。在一些实施例中，培养稳定剂可选自：山梨酸钾，磷酸，抗坏血酸，苯甲酸钠，以及它们的任何组合
本发明的一些实施例提供了从与所述组合物接触的植物收获的材料，其中所述植物显显示改善的特性。在一些实施例中，改善的特性可以存在于收获的材料中。
本发明的一些实施例包括接触所述组合物的草皮，该草皮具有改进的特性。在一些实施例中，这样的草皮场地可提供作为本发明的一部分。在一些实施例中，本发明包括具有该草皮的高尔夫球场。
本发明的一些实施例通过与组合物接触提供了具有抗胁迫性的植物。同样地，本发明的一些实施例提供在足够抗胁迫性从而能够在土壤中生长的种子或植物存在下通过用组合物喷雾或浸泡可耕种的土壤。
附图说明
图1显示了巴氏灭菌后针对小球藻细胞DNA的情况测试的结果(DAPI)。
图2显示了在巴氏杀菌后针对小球藻细胞的细胞膜情况测试的结果(碘化丙锭)。
图3显示了组合物的各种巴氏灭菌条件的结果。
图4显示了组合物的各种施用速率的结果。
图5显示了组合物在盐胁迫的植物上的结果的曲线图。
图6显示了使用所述组合物在草皮上的实验结果。
图7显示了使用所述组合物在花生上的实验结果。
图8显示了包括组合物的不同制剂的实验结果。
具体实施方式
许多植物可获益于施用提供生物刺激作用的液体组合物。可以获益于这样的组合物的植物家族的非限制性例子可包括：茄科，豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，禾本科(Poaceae)，蔷薇科(Roasaceae)，葡萄科(Vitaceae)，芸苔科(Brassicaeae)(十字花科(Cruciferae))，番木瓜科(Caricaceae)，锦葵科(Malvaceae)，无患子科(Sapindaceae)，漆树科(Anacadiaceae)，芸香科(Rutaceae)，桑科(Moraceae)，旋花科(Convolvulaceae)，薄荷科(Lamiaceae)，马鞭草科(Verbenaceae)，胡麻科(Pedaliaceae)，菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))，伞形科(Apiaceae)(伞形科(Umbelliferae))，五加科(Araliaceae)，木犀科(Oleaceae)，杜鹃花科(Ericaceae)，猕猴桃(Actinidaceae)，仙人掌(Cactaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，蓼科(Polygonaceae)，山茶科(Theaceae)，玉蕊(Lecythidaceae)，茜草科(Rubiaceae)，罂粟科(Papveraceae)，八角科(Illiciaceae)茶藨子科(Grossulariaceae)，桃金娘科(Myrtaceae)，胡桃科(Juglandaceae)，桦木科(Bertulaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，天门冬科(Asparagaceae)(百合科(Liliaceae))，葱科(Alliaceae)(百合科(Liliceae))，凤梨科(Bromeliaceae)，姜科(Zingieraceae)，芭蕉科(Muscaceae)，棕榈科(Areaceae)，薯蓣科(Dioscoreaceae)，肉豆蔻科(Myristicaceae)，番荔枝科(Annonaceae)，大戟科(Euphorbiaceae)，樟科(lauraceae)，胡椒科(Piperaceae)，和龙眼科(Proteaceae)。
豆科植物家族(也称为豆科)所述第三大植物家族，具有超过18,000个物种，包括许多重要的农业和食品植物。在植物界分类学分类，维管束植物亚界(Tracheobionta)(亚界)，种子植物总门(Spermatophyta)(总门(superdivision))，木兰门(Magnoliophyta)(门)，木兰纲(Manoliopsida)(纲)，蔷薇亚纲(Rosidae)(亚纲)和豆目(目)，所述豆科家族包括但不限于，大豆，菜豆，绿豆，豌豆，鹰嘴豆，苜蓿，花生，甜豆，角豆，甘草。在豆科家族中的植物的大小和类型的范围，包括但不限于树，较小的一年生草本植物，灌木和藤蔓，并通常发育成豆科植物。在豆科家族中的植物可存在于所有大陆(不包括南极洲)，因此在全球的农业中具有广泛的重要性。除了食品，豆科家族中的植物可以用于产生天然树胶，染料和观赏植物。
茄科植物家族包括大量的农作物，药用植物，香料，和观赏植物，具有超过2500个物种。在植物界分类学分类，维管束植物亚界(Tracheobionta)(亚界)，种子植物总门(Spermatophyta)(总门(superdivision))，木兰门(Magnoliophyta)(门)，木兰纲(Manoliopsida)(纲)，菊亚纲(Asteridae)(亚纲)和茄目(目)，茄科(Solanaceae)家族包括但不限于，马铃薯，番茄，茄子，各种胡椒，烟草，和矮牵牛。茄科中的植物可存在于所有大陆(不包括南极洲)，从而在全球农业中具有广泛的重要性。
禾本科植物家族提供食品，建材，和用于燃料处理的原料。在植物界中分类学分类，维管束植物亚界(Tracheobionta)(亚界)，种子植物总门(Spermatophyta)(总门(superdivision))，木兰门(Magnoliophyta)(门)，百合纲(Liliopsida)(纲)，鸭跖草亚纲(Commelinidae)(亚纲)，和莎草目(Cyperales)(目)，所述禾本科家族包括但不限于，开花植物，草，谷物作物如大麦(barely)，玉米，柠檬草，小米，燕麦，黑麦，大米，小麦，甘蔗和高粱。在Arizona发现的草坪草的类型包括但不限于，混合百慕大草(Bermuda grass)(例如，328 tifgrn，419 tifway，tif sport)
蔷薇科植物家族包括开花植物，草本植物，灌木和树木。在植物界中分类学分类，维管束植物亚界(Tracheobionta)(亚界)，种子植物总门(Spermatophyta)(总门(superdivision))，木兰门(Magnoliophyta)(门)，木兰纲(Magnoliopsida)(纲)，蔷薇亚纲(Rosidae)(亚纲)，及蔷薇目(Rosales)(目)，蔷薇科家族包括但不限于，杏(almond)，苹果，杏(apricot)，黑莓，樱桃，油桃，桃，李子，树莓，草莓，柑橘。
葡萄科植物家族包括开花植物和藤蔓。在植物界中分类学分类，维管束植物亚界(Tracheobionta)(亚界)，种子植物总门(Spermatophyta)(总门(superdivision))，木兰门(Magnoliophyta)(门)，木兰纲(Magnoliopsida)(纲)，蔷薇亚纲(Rosidae)(亚纲)，及Rhammales(目)，葡萄科家族包括(但不限于)葡萄。
对于植物生产而言特别重要的是生长的开始阶段，其中植物出苗和成熟进入生根。因此处理种子，幼苗或植物直接提高植物的萌发，出苗和成熟；或间接增强种子或幼苗附近微生物土壤群体的方法，在启动植物开始可销售生产的路径上有价值。通常用于评估出苗的标准是完成下胚轴阶段，其中可见到茎从土壤中突出。通常用于评估成熟的标准是完成子叶阶段，其中可见到两个叶片在出苗的茎上形成。
在从植物生产果实中同样重要的是果实的产量和品质，它们可以表示为例如，数量，重量，颜色，硬度，成熟度，水分，昆虫侵袭的程度，疾病或腐烂程度，和/或果实晒伤程度。处理植物以直接提高植物的特性，或间接增强植物的生化的光合能力和植物的叶、根和芽的健康情况以使果实强劲地生产的方法因此在提高可销售的生产效率方面有价值。可销售和不可销售的界定可以应用于植物和果实，可基于产品的最终用途不同地定义，例如但不限于，新鲜市场生产和处理用于包括作为组合物中的成分。可销售的定义可以评估这样的品质，如，但不限于，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软和晒伤。术语总生产可以包括可销售和不可销售的植物和果实。可销售的植物或果实与不可销售的植物或果实的比例可以称为利用率并表示为百分比。利用率可作为农业过程的效率的指示物，因为它显示成功生产可销售的植物或果实，对于种植者而言其将获得最高的财务回报，而总生产不一定提供这样的指示。另外，植物健康的改善和措施可以包括植物耐胁迫性。胁迫可以是非生物的，例如，温度胁迫(高温以及冷冻)，盐胁迫，重金属胁迫，水分胁迫(无论是旱或涝)等。同样地，胁迫可以是生物的，诸如，例如，由真菌，细菌，昆虫，杂草，病毒等引起的胁迫。改进的植物健康的度量可以是定性的或定量的。当是定量的时，植物健康改进的实施例可以是相对于未处理的植物，任何特性的相对改善，其中所述改进是至少1％，2％，3％，4％，5％，10％，15％，20％，25％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％，250％，300％，400％，500％，750％，1000％或更多。
为了实现植物的健康，出苗，成熟，产量，和品质方面的这种改善，本发明的实施例提供了基于微藻的组合物，制备液体的基于微藻的组合物的方法，和将基于微藻的组合物用于植物的方法。所述液体组合物的微藻可包括在兼养条件下培养的小球藻属(Chlorellasp.)，所述兼养条件包括的培养基主要由水和微量营养物组成(例如，硝酸盐，磷酸盐，维生素，在BG-11配方中存在的金属(购自UTEX The Culture Collection of Algae atUniversity of Texas at Austin，Austin，Texas))，光作为光合作用的能源，有机碳(例如，乙酸盐，乙酸)作为能源和碳源。在一些实施例中，小球藻可培养在存在污染微生物(例如但不限于细菌)的非无菌的兼养条件下。在非无菌的兼养条件下培养这样的微藻的方法可参见WO2014/074769A2(Ganuza，et al。)，在此引入作为参考。
在针对所描述的制备用于植物的组合物的方法的兼养培养小球藻的一个非限制性实施例中，小球藻在开放培养容器中在BG-11培养基或源自BG-11培养基的介质(例如其中加入另外的组分至介质和/或相比于未修改的BG-11介质，将介质的一种或多种元素增加5％，10％，15％，20％，25％，33％，50％或更多)中培养7-14天的培养。温度范围可以是从20-30℃，pH为6.5-8.5。溶解氧浓度可为0.1-4mg/L。培养物接收乙酸或乙酸盐作为提供碳的有机碳源和小球藻细胞的能源，并通过pH auxostat系统使用浓度范围10-90％在进料中提供给培养物。培养物接收自然太阳光(包括光合有效辐射)作为能量源。混合是通过空气喷射通过气体管(aerotube)和流体通过浸没在液体培养中的推进器推进而提供。
通过人工控制小球藻培养过程的多个方面，如有机碳进料，氧气水平，pH和光，培养过程不同于小球藻在自然界中经历的培养过程。除了控制培养过程的各个方面，通过污染控制方法在非无菌地兼养培养小球藻期间由操作人员或自动系统进行干预以防止小球藻被污染生物(例如真菌，细菌)。用于微藻培养的污染控制方法在本领域是已知的，适合非无菌的兼养微藻培养物的这样的污染控制方法公开于WO2014/074769A2(Ganuza,et al)，在此引入作为参考。通过在微藻培养过程中插入，可以通过抑制含生物群体的增殖和对微藻细胞的影响(例如，裂解，感染，死亡，结块)来减轻污染微生物的影响。因此，通过人工控制培养过程的多个方面及在培养过程中插入污染控制方法，作为整体产生的以及在所描述的本发明的组合物中使用的小球藻培养物不同于从在自然界发生的小球藻培养过程得到的培养物。
在替代实施例中，兼养培养小球藻的方法可包括其它已知有机碳的来源或有机碳源的组合，如亚油酸铵，阿拉伯糖，精氨酸，天冬氨酸，丁酸，纤维素，柠檬酸，乙醇，果糖，脂肪酸，半乳糖，葡萄糖，甘油，甘氨酸，乳酸，乳糖，马来酸，麦芽糖，甘露糖，甲醇，糖蜜，蛋白胨，基于植物的水解液，脯氨酸，丙酸，核糖，蔗糖(sacchrose)，淀粉的部分或完全水解产物，蔗糖(sucrose)，酒石酸，TCA循环有机酸，酒糟水(thin stillage)，尿素，工业废液，和酵母提取物；以及其它已知的混合方法，有机碳供应的方法，照明，培养基，营养物母液，培养容器，和培养参数的优化，例如但不限于温度，pH，溶解氧和溶解二氧化碳。可从培养容器收获兼养小球藻培养物和/或通过本领域已知的方法浓缩，例如但不限于，沉淀，离心，过滤，电脱水以形成基于兼养小球藻的组合物，其用于最终产品组合物中。
在兼养培养过程中，小球藻培养物也包括细胞碎片和小球藻细胞分泌到培养基中的化合物。小球藻兼养培养过程的结果提供组合物的活性成分，该组合物应用于植物以提高至少一种植物性能特性，例如，出苗，成熟，产量，品质等。典型地，施用该组合物，而没有单独加入到所述组合物或在所述兼养小球藻全细胞和伴随的来自兼养培养过程的培养基中发现的其它活性成分补充所述组合物，如，包括但不局限于：非小球藻微藻细胞，微藻提取物，大型海藻，大型海藻提取物，液体肥料，颗粒状肥料，矿物复合物(例如，钙，钠，锌，锰，钴，硅)，真菌，细菌，线虫，原生动物，消化固体，化学物质(例如，乙醇胺，硼砂，硼酸)，腐植酸，氮和氮衍生物，磷矿石，杀虫剂，除草剂，杀昆虫剂，酶，植物纤维(例如，椰子纤维)；然而，在一些实施例中，考虑了用前述任一项增强基础组合物。在替代方案中，所述基于兼养小球藻的组合物可以补充氮，磷，或钾以将组合物中的水平提高到总组合物的至少1％(即添加N，P，或K以增加水平至少1-0-0，0-1-0，0-0-1，或它们的组合)。在一些实施例中，补充的营养物不被微藻摄取，螯合，或吸收。
兼养小球藻是在液体组合物中的主要的微藻物种。在一些实施例中，液体组合物的微藻群体基本是兼养小球藻。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包括液体组合物的至少90％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包括液体组合物的至少91％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包含液体组合物的至少92％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包含液体组合物的至少93％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包括液体组合物的至少94％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包含液体组合物的至少95％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包括液体组合物的至少96％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包括液体组合物的至少97％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包含液体组合物的至少98％的微藻群体。在一些实施例中，兼养或非兼养小球藻包含液体组合物的至少99％的微藻群体。具有至少99％的小球藻微藻菌株(例如，至少99.3％，至少99.5％，或甚至至少99.9％)，例如兼养小球藻的液体组合物可认为具有在液体组合物中的单一藻类物种。在一个方面，所述液体组合物缺乏任何可检测量的任何其它微藻物种。在另一个方面，液体组合物缺乏在所述液体组合物中任何量的任何其它微生物(例如，细菌)(不同于高于组合物的1％(重量)的所期望的小球藻微藻)。
由培养阶段得到的兼养小球藻由全细胞构成：近似分析示于表1中，脂肪酸曲线示于表2中，并进一步分析的结果示于实施例1-3。在大多数实施例中发现巴氏灭菌前后，以及在随后的储存期间，兼养小球藻细胞的营养物曲线(即近似分析)具有较小差异。
表1
| 范围 | |
| 水分&挥发物 | 1-2％ |
| 灰分含量 | 3-4.5％ |
| 糖类(计算的) | 30-36％ |
| ％蛋白(Leco) | 15-45％ |
| ％脂质(AOAC) | 5-20％ |
表2
| 分析物 | 范围(％) |
| C16棕榈酸 | 0.1-4 |
| C18:1n9c油酸(ω-9) | 0.1-2 |
| C18:2n6c亚油酸(ω-6) | 0.1-5 |
| C18:3n3α-亚油酸(ω-3) | 0.1-2 |
| 其他 | 0.1-4 |
| 总计 | 0.5-17 |
兼养小球藻细胞还可含有可检测水平的植物激素，例如但不限于：脱落酸和代谢物(它们已知与气孔装置功能，生长抑制，和种子休眠相关)；细胞分裂素(cytokinin)(它们已知与细胞分裂，芽发育，叶片的发展，衰老迟缓相关)；生长素(auxin)(它们已知与伸长生长，韧皮部元件的分化，顶端优势，取向性和初始根形成相关)；和赤霉素(gibberellin)(它们已知与茎伸长和种子萌发的启动相关)。
在一些实施例中，兼养小球藻可包含5-45ng/g干重(DW)的脱落酸和脱落酸代谢物。在一些实施例中，所述兼养小球藻可以包括60-300ng/g干重(DW)的细胞分裂素。在一些实施例中，兼养小球藻可以包括400-815ng/g干重(DW)的生长素。在一些实施例中，兼养小球藻可包含0.1-15ng/g干重(DW)的赤霉素。在一些实施例中，兼养小球藻可以包括在表3中所示范围内的特定植物激素。
在一些实施例中，兼养小球藻可包含0.1-1ng/g鲜重(FW)的脱落酸和脱落酸代谢物。在一些实施例中，所述兼养小球藻可以包括10-30ng/g鲜重(FW)的细胞分裂素。在一些实施例中，兼养小球藻可包含1-30ng/g鲜重(FW)的生长素。在一些实施例中，兼养小球藻可包含0.1-1ng/g鲜重(FW)的赤霉素。
表3
在从培养容器中收获兼养小球藻组合物之后，通常将基于兼养小球藻的组合物加入施用于植物的液体组合物中。通常通过在巴氏灭菌过程中加热和冷却，调节pH，以及添加酵母和霉菌生长的抑制剂来稳定液体组合物。
在一些实施例中，兼养小球藻可预先冷冻和解冻，然后加入液体组合物中。在一些实施例中，兼养小球藻没有进行先前的冷冻或解冻过程。在一些实施例中，兼养小球藻全细胞没有经历干燥处理。在一些实施例中，组合物的兼养小球藻的细胞壁没有溶解或破坏，以及兼养小球藻细胞没有经历萃取过程或粉碎细胞的过程。兼养小球藻全细胞通常不经历用于从培养过程的伴随的成分(例如，微量营养物，残余有机碳，细菌，细胞碎片，细胞分泌物)中分离兼养小球藻全细胞的纯化过程，从而使来自包含小球藻全细胞，培养基，细胞分泌物，细胞碎片，细菌，残余有机碳，以及微量营养物的兼养小球藻培养过程的全部输出用于液体组合物中(以用于植物)。在一些实施例中，兼养小球藻全细胞和培养过程的伴随的组分在组合物中浓缩。在一些实施例中，兼养小球藻全细胞和培养过程的伴随的组分在组合物中稀释至低浓度。通常组合物的兼养小球藻全细胞不是过时的(fossilized)。在一些实施例中，在组合物中兼养小球藻全细胞通常不能保持在存活状态，用于在土壤或叶面施用中使用组合物的方法之后继续生长。在一些实施例中，在制备所述组合物之后，基于兼养小球藻的组合物可以是生物无活性的。在一些实施例中，在制备组合物之后，基于兼养小球藻的组合物可以是基本上无生物活性的。在一些实施例中，在制备的组合物暴露于空气之后，基于兼养小球藻的组合物能够提高生物活性。
在使用用于植物的基于兼养小球藻的组合物制备液体组合物的一个非限制性实施例中，从培养系统收获的基于兼养小球藻的组合物首先保持在收获罐中，然后离心培养物。在离心兼养小球藻培养物之后，离心排出富含兼养小球藻全细胞固体，还含有来自培养基的伴随组分的部分，加入容器中(温度为约30℃)。在制备液体组合物的过程中可以继续基于兼养小球藻的组合物(即，新鲜的)或存储在冰箱中以及在稍后的时间解冻(即，存储的)(用于处理成液体组合物)。当基于兼养小球藻的组合物贮存在冰箱中时，存储温度为约-10℃，花费约1-2天使得所述组合物冷冻。当从冰箱中取出后，将存储的基于兼养小球藻的组合物放置在外面解冻约7天。新鲜的或存储的基于兼养小球藻的组合物然后置于罐中，并且加热至约60℃约2小时以开始巴氏消毒过程。然后，将基于兼养小球藻的组合物稀释至全细胞固体浓度约为10-11％(重量)，并且冷却至约40℃以完成巴氏灭菌过程。然后通过混合用于稳定目的的有效量的磷酸，将基于兼养小球藻的组合物的pH调节至pH值大约4。然后将约0.3％的山梨酸钾与用于稳定目的的基于兼养小球藻的组合物混合。然后将所得液体组合物转移到希望的尺寸的容器中，存储在3-5℃下，直至运送。
虽然在离心后使用干燥微藻的额外的步骤可以执行使用用于植物的兼养培养的小球藻来制备液体组合物的类似方法，本发明人令人惊讶地发现当施用于植物时，液体组合物(该组合物含有未干燥微藻)产生更好的效果。当兼养小球藻没有干燥时，本发明人发现增加的这种效果包括：加速萌发，叶绿素含量，芽重量。发明人还发现使兼养小球藻经历滚筒干燥过程降低微藻生物质中植物激素的可检测水平。
虽然单独的活性成分没有添加或补充至基于兼养小球藻的组合物中，可通过在巴氏灭菌过程中加热和冷却来稳定包含兼养小球藻全细胞和来自培养基和过程的伴随的组分(例如，微量营养物，残余有机碳，细菌，细胞碎片，细胞分泌物)的液体组合物。如在实施例中所示，发明人发现当施用于植物时在经历巴氏杀菌过程的加热和冷却之后基于兼养小球藻的组合物的活性成分在改善植物萌发，出苗，成熟和生长方面保持有效性，以及与制剂的非巴氏杀菌的形式相比较，还观察到巴氏杀菌引起的各种性能增强。
虽然在从所述培养物中收获之后，兼养小球藻细胞是完整的和有活性的(即，物理上适合存活，能够进一步生长或细胞分裂)，从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞被证实具有完整的细胞壁但没有活性。在显微镜下观察从巴氏灭菌过程得到的兼养小球藻细胞，以确定在经历该过程的加热和冷却后细胞壁的情况，用肉眼证实小球藻细胞壁是完整的，没有破开。为了进一步研究细胞的状态，用碘化丙啶处理活的兼养小球藻细胞的培养物和从巴氏灭菌法得到的兼养小球藻细胞(碘化丙啶，为一种排除荧光染料，如果细胞膜受损其标记DNA)，以及在显微镜下目测比较。碘化丙锭比较表明从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞包含高量的染色的DNA，得出结论：兼养小球藻细胞壁完整，但细胞膜受损(图2)。因此，巴氏灭菌的小球藻细胞的渗透性不同于具有完整的细胞壁和细胞膜的小球藻细胞的渗透性。
此外，用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)-DNA结合荧光染料处理活的兼养小球藻细胞的培养物和巴氏灭菌法得到的兼养小球藻细胞，以及在显微镜下目测比较。DAPI-DNA结合染料比较显示从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞在细胞中包含大大减小量的有活性的DNA，指示在巴氏灭菌后兼养小球藻细胞是无活性的(图1)。两种DNA染色比较表明通过改变以下各项，巴氏灭菌过程从天然状态改变小球藻细胞的结构和功能：细胞从有活性至无活性，细胞膜的状态，和细胞的渗透性。
在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为50-90℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为55-65℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为58-62℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为50-60℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为60-70℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为70-80℃的温度。在一些实施例中，可将基于微藻的组合物加热到范围为80-90℃的温度。
在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热90-150分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热110-130分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热90-100分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热100-110分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热110-120分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热120-130分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热130-140分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热140-150分钟。
在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热15-360分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热15-30分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热30-60分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热60-120分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热120-180分钟。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以加热180-360分钟。
在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到35-45℃。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到36-44℃。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到37-43℃。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到38-42℃。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到39-41℃。在一些实施例中，基于微藻的组合物可以冷却到适合于进一步加工或处理的温度。
在一些实施例中，制备用于植物的低浓度的基于兼养小球藻的液体组合物的方法可以包括：在液体培养基中和兼养条件下(包括利用有机碳源和光合有效辐射作为培养容器中的能源)培养小球藻；从培养容器中收获兼养小球藻培养物；将兼养小球藻培养物与酸和酵母和霉菌抑制剂混合以形成组合物(浓度为用于植物的有效量的基于兼养小球藻的组合物以增强特性)，其中全部兼养小球藻细胞没有经历干燥过程。
在一些实施例中，制备用于植物的基于兼养小球藻的液体组合物的方法可以包括：在50-70℃温度下加热在液体介质中包含全部微藻细胞的组合物；将加热的组合物中全细胞的浓度调整至5％-30％(重量)全微藻细胞的浓度；将组合物冷却至35-45℃温度；将组合物的pH值调节到pH值为3-5；和使所述组合物与酵母和霉菌抑制剂接触。
在一些实施方案中，所述组合物可包括5-30％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可包括5-20％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可包括5-15％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可包括5-10％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包括10-20％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包括10-20％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包括20-30％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施例中，可以在施用低浓度的组合物之前进一步稀释全兼养小球藻细胞百分比固体(重量)。
在土壤或叶面施用中通过在一定体积的水混合一定体积的所述组合物，可以将该组合物稀释至有效量的较低浓度。生成稀释的组合物的兼养小球藻全细胞的固体百分数可以计算如下：在组合物中兼养小球藻全细胞的初始固体百分比乘以组合物的体积与水的体积的比率。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于1％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.9％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.8％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.7％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.6％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.5％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.4％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.3％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.2％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.1％(重量)固体的全兼养小球藻细胞。在一些实施例中，为了增强植物发芽，出苗，或成熟，施用所述液体组合物的有效量可以包括兼养小球藻全细胞的固体浓度范围0.002642-0.079252％(例如，约0.003％至约0.080％)，相当于稀释浓度2-10毫升/加仑的溶液(具有5％-30％的兼养小球藻全细胞的初始固体百分比)。
在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为1-50mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.001321-0.396258％(例如，约0.001％至约0.400％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为1-10毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.001321-0.079252％(例如，约0.001％至约0.080％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为2-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.002642-0.055476％(例如，约0.003％至约0.055％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为10-20mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.013201-0.158503％(例如，约0.013％至约0.160％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为20-30mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.026417-0.237755％(例如，约0.025％至约0.250％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为30-45毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.039626-0.356631％(例如，约0.040％至约0.360％)。在一些实施例中，施用所述液体组合物的有效量可以包括浓度范围为30-40mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.039626-0.317007％(例如，约0.040％至约0.320％)。在一些实施方案中，施用液体组合物的有效量可包含浓度范围为40-50mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.052834-0.396258％(例如，约0.055％至约0.400％)。
在一些实施例中，所述液体组合物可含有低浓度的细菌(其提供除了全兼养小球藻细胞之外，所述组合物的固体百分率)。在WO2014/074769A2(Ganuza等人)中找到在非无菌(non-axenic)兼养条件下找到的细菌的例子，在此引入作为参考。可以使用本领域已知的方法如平板计数，使用购自3M(St.Paul，Minnesota)的Petrifilm的平板计数，分光光度计(浊度测量)测量，与已知标准视觉比较浊度，在显微镜下直接细胞计数，细胞质量测定，和测定细胞活性来确定活菌计数。在非无菌(non-axenic)兼养微藻培养物中活菌计数可以为104-109CFU/mL，并可依赖于微藻培养过程中采取的污染控制装置。所述组合物中细菌的水平可以由耗氧平板计数确定(其量化在指定体积中好氧菌落形成单位(CFU))。在一些实施例中，所述组合物包括需氧平板计数为40,000-400,000CFU/mL。在一些实施方案中，所述组合物包含需氧平板计数为40,000-100,000CFU/mL。在一些实施方案中，所述组合物包含需氧平板计数为100,000-200,000CFU/mL。在一些实施方案中，所述组合物包含需氧平板计数为200,000-300,000CFU/mL。在一些实施方案中，所述组合物包含需氧平板计数为300,000-400,000CFU/mL。
用QPCR(定量聚合酶链反应)分析巴氏消毒前后兼养小球藻培养物中的细菌群体，观察到巴氏杀菌之后培养物中细菌曲线改变。具体地，细菌的巴氏杀菌后曲线包括较高比例的孢子形成细菌，并且包括，但不限于，假芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)、和短芽孢杆菌(Brevibacillus sp)作为主要类型的细菌。比较在巴氏杀菌前后兼养小球藻培养物的需氧平板计数，还观察到在巴氏灭菌后培养物中细菌的总数更低。针对15，30，60，120，180和360分钟，和50，60，70，80和90℃，巴氏灭菌过程的温度和时间的组合，用兼养小球藻的培养物进行测试，并且所得的需氧平板计数为7.58×106CFU至低至1.74×103CFU。还显示存储温度，以改变兼养小球藻的巴氏灭菌培养物的细菌曲线，样品存储在2-4℃，25℃和40℃的温度下，随着时间改变需氧平板计数数量和主要细菌种类的类型。
在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH向下调节到pH值为3-5。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH向上调节到pH值为3-5。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH调节到pH范围为3.5-4.5。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH值调节到pH值为3-3.5。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH调节到pH范围为3.5-4。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH调节到pH为4-4.5。在一些实施例中，可以将基于微藻的组合物的pH调节到pH范围为4.5-5。
在一些实施例中，可以添加稳定装置(在改善植物发芽，出苗，和成熟方面无活性，但是有助于稳定基于微藻的组合物)以防止不想要的微生物的增殖(例如，酵母菌，霉菌)并延长保存期。这样的无活性的但稳定的装置可以包括酸、和酵母和霉菌抑制剂。在一些实施例中，所述稳定装置适于植物，但是不抑制植物的生长或健康。在替代实施例中，稳定装置可有助于液体组合物的营养特性，例如但不限于，氮，磷或钾的水平。
在一些实施例中，调节组合物pH的步骤包括使该组合物与包含酸的稳定装置接触。在一些实施例中，这种酸可以包括磷酸(H3PO4)。在一些实施方案中，调整pH所需的酸的量可包括不同量的酸，这取决于微藻组合物的起始pH，其可根据微藻的培养条件，残余浓度的有机碳或其他营养物，和组合物的先前处理而改变。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以包含小于0.3％的磷酸。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以包含0.01-0.3％的磷酸。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以含有0.05-0.25％的磷酸。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以包含0.01-0.1％的磷酸。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以包含0.1-0.2％的磷酸。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可含有0.2-0.3％的磷酸。
在一些实施例中，酵母和霉菌抑制剂可以包含山梨酸钾(C6H7KO2)。在一些实施方案中，所述组合物可以包含小于0.5％山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包含0.01-0.5％山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包括0.05-0.4％山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包含0.01-0.1％的山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包含0.1-0.2％的山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包括0.2-0.3％山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包括0.3-0.4％的山梨酸钾。在一些实施方案中，所述组合物可以包含0.4-0.5％山梨酸钾。在其它实施例中，山梨酸钾和/或磷酸的稳定功能可以使用具有相似功能的可比较的添加剂(例如，如，抗坏血酸，苯甲酸钠，或类似物)，以类似于山梨酸钾和磷酸在此列出的量/浓度来实现。
基于微藻的组合物是液体，并且基本上由水组成。在一些实施方案中，所述组合物可以包含70-95％的水。在一些实施方案中，组合物可包含85-95％的水。在一些实施方案中，所述组合物可以包含70-75％的水。在一些实施方案中，所述组合物可以包含75-80％的水。在一些实施方案中，所述组合物可以包括80-85％的水。在一些实施方案中，组合物可包含85-90％的水。在一些实施方案中，所述组合物可以包含90-95％的水。基于微藻的组合物的液体性质和高含水量有助于以多种方式施用组合物，例如但不限于：流经灌溉系统，流经地上滴灌系统，流经地埋滴灌系统，流经中心枢转灌溉系统，喷雾器，喷灌器，水罐等。
基于微藻的组合物可以在配制之后立即使用，或者可以存储在容器中以便以后使用。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以避开直射阳光存储。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以冷藏。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可储存在1-10℃。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可储存在1-3℃。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可以储存在3-5℃。在一些实施例中，所述基于微藻的组合物可储存在5-8℃。在一些实施方案中，所述组合物可以存储在8-10℃。
在一些实施例中，对于土壤施用，在制备过程中不干燥基于兼养小球藻的组合物可以增加种子出苗40-4000％，或更多。在一些实施例中，对于叶面施用，在制备过程中不干燥基于兼养小球藻的组合物可以提高叶绿素含量10-30％。在一些实施例中，对于叶面施用，在制备过程中不干燥基于兼养小球藻的组合物可以增加全植物重量出苗10-20％。在一些实施例中，对于叶面施用，在制备过程中不干燥基于兼养小球藻的组合物可以增加芽重量20-30％。
将基于兼养小球藻的液体组合物处理给予种子或植物，与未处理植物的基本上相同的群体相比，用量可有效地产生植物的增强特性。这样的增强特征可包括加速种子萌发，加速出苗，提高出苗，提高叶形成，加快叶形成，提高植物成熟，加速植物成熟，增加植物产量，增加植物生长，提高植物品质，增加植物健康，增加果实产量，增加果实生长，和提高果实品质。这样的增强特征的非限制性例子可以包括加速完成下胚轴阶段，加速茎从土壤中突出，加速完成子叶阶段，加速叶形成，增加可销售植物重量，增加可销售的植物产量，提高可销售的果实重量，增加生产植物重量，增加生产果实重量，增加利用率(基于可销售果实与不可销售果实的比率，农业过程的效率的指示物)，增加叶绿素含量(植物健康的指示物)，增加植物重量(植物健康的指示物)，增加根重量(植物健康的指示物)，以及增加芽重量(植物健康的指示物)。这样的增强特性可单独地出现于植物中，或与多个增强特性组合。
令人惊奇的是，本发明人发现在低浓度应用中施用希望的基于兼养小球藻的组合物有效地产生植物的增强特性。在一些实施例中，在种植种子之前，施用基于兼养小球藻的液体组合物处理。在一些实施例中，在种植种子时，施用基于兼养小球藻的液体组合物处理。在一些实施例中，在种植种子后，施用基于兼养小球藻的液体组合物处理，例如包括在植物的各种出苗后生长和成熟阶段。
在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量20-160％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少20％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少60％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少80％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少100％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少120％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少140％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少150％。
在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量25-2000％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少25％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少50％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少60％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少70％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少80％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少90％。
在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少100％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少200％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少300％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少400％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少500％，。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少600％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少700％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少800％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少900％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少1000％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加出苗植物的数量至少1500％。
在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量30-180％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少50％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少70％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少90％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少110％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少130％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少150％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少160％。在一些实施例中，相比于未处理的种子或植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少170％。
在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量20-350％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少20％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少50％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少60％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少70％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少80％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少90％。
在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少100％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量的至少150％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少200％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量至少250％。在一些实施例中，相比于未处理的植物种子的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加通过叶形成显示成熟的植物的数量的至少300％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高利用率80-100％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高利用率至少80％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高利用率至少85％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高利用率至少90％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高利用率至少95％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量200-290％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少200％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻液体的组合物可增加可销售的植物重量至少210％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少220％。在一些实施方式中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，施用基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少230％。在一些实施方式中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，施用基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少240％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少250％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少260％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少270％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物重量至少280％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物产量150-230％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高可销售的植物产量至少150％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物产量至少180％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物产量至少190％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物产量至少200％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高可销售的植物产量至少210％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的植物产量至少220％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高可销售的果实重量10％-50％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高可销售的果实重量至少10％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的果实重量至少20％。在一些实施例中，相比未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高可销售的果实重量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加可销售的果实重量40％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高可销售的果实重量至少45％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高生产植物重量70％-120％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高生产植物重量至少70％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产植物重量至少80％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产植物重量至少90％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于小球藻的液体组合物可以提高生产植物重量至少100％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产植物重量至少110％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高生产果实重量70％-110％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可提高生产果实重量至少70％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产果实重量至少80％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产果实重量至少90％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产果实重量至少100％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高生产果实重量至少105％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加叶绿素含量15-40％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加叶绿素含量至少15％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加叶绿素含量至少20％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加叶绿素含量至少25％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加叶绿素含量至少30％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量(whole plant weight)30％-60％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少35％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少45％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少50％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加全部植物重量至少55％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加根重量30％-60％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加根重量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高根重量至少35％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加根重量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以提高根重量至少45％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可以增加根重量至少50％。
在一些实施方案中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加芽重量30％-70％，或更多。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加芽重量至少30％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物能够提高芽重量至少35％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加芽重量至少40％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物能够增加芽重量至少45％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物可增加芽重量至少50％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物能够增加芽重量至少55％。在一些实施例中，相比于未处理植物的基本上相同的群体，给予基于兼养小球藻的液体组合物能够增加芽重量至少60％。
无论在种子浸泡，毛细作用，土壤，或叶面施用中，使用方法包括较低浓度的基于兼养小球藻的液体组合物。即使在如此低的浓度下，所述组合物显示可有效地在植物中产生增强的特性。能够使用低浓度允许减小对环境的影响(由于过度施用所致)和增加使用液体组合物的方法的效率(通过需要小量的材料以产生所需的效果)。在一些实施例中，在土壤应用中使用具有低体积灌溉系统的基于兼养小球藻的液体组合物可以使低浓度的液体组合物保持有效和不被稀释到组合物的浓度不再能对植物产生所需的效果，同时还增加种植者的水利用效率的点。能够使用低浓度的兼养小球藻全细胞和缺乏纯化过程以分离细胞也减少了可以在低浓度下在培养阶段产生的微藻的脱水和处理需要，从而提高制备该产品的方法的能量效率。
结合在液体组合物中低浓度的兼养小球藻全细胞固体需要有效地提高植物的所述特性，所述液体组合物可以不必连续地或高频给予(例如，每天多次，每天地)。在低浓度下和低频率施用下能够有效的基于兼养小球藻的液体组合物具有出乎意料的结果，由于传统的想法，随着活性成分的浓度降低，施用的频率应当增加以提供足够量的活性成分。在低浓度和施用频率下的有效性增加使用液体组合物的方法的材料使用效率，同时还增加农业过程的生产效率。使用兼养小球藻全细胞的组合物(其不需要处理以干燥，提取，溶解、或其他方式破坏细胞壁)，还提高了制备产品的方法的能量效率，以及使得产品在更快的时间期限中产生。
种子浸泡应用
在一个非限制性实施方案中，给予基于兼养小球藻的液体组合物处理可以包括在种植种子前，将种子浸泡在有效量的液体组合物中。在一些实施方案中，给予基于兼养小球藻的液体组合物进一步包括浸泡后从液体组合物中移开种子，以及在种植前将种子干燥。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物90-150分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物110-130分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物90-100分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物100-110分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物110-120分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物120-130分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物130-140分钟。在一些实施例中，可以将种子浸泡在基于兼养小球藻的液体组合物140-150分钟。
组合物可以稀释到对于种子浸泡应用有效量的较低的浓度(通过在一定体积水中混合一定体积的基于兼养小球藻的组合物)。导致该稀释组合物的兼养小球藻全细胞的固体百分比可以计算如下：组合物中原始固体百分比乘以组合物的体积与水的体积的比率。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为6-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.007925-0.079252％(例如，约0.008％-约0.080％)。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为7-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009245-0.071327％(例如，约0.009％至约0.070％)。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为6-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.007925-0.05547％(例如，约0.008％至约0.055％)。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为7-8mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009246-0.063401％(例如，约0.009％至约0.065％)。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为8-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.010567-0.071327％(例如，约0.010％至约0.070％)。在一些实施方案中，在种子浸泡应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为9-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.011888-0.079252％(例如，约0.012％至约0.080％)。
土壤施用
在另一个非限制性实施方案中，给予基于兼养小球藻的液体组合物处理可以包括用有效量的液体组合物接触种植的种子或植物非常邻近的土壤。在一些实施例中，可以通过注射到低容量灌溉系统中，将基于兼养小球藻的液体组合物提供给土壤，例如但不限于滴灌系统(在土壤下面通过多孔导管供水或在土壤水平通过高于地面或从地面突出的流体导管供水)。在一些实施例中，可以通过土壤浸润(soil drench)方法将基于兼养小球藻的液体组合物提供给土壤，其中所述液体组合物倾倒在土壤上。
通过在一定体积的水中混合一定体积的组合物，可以将基于兼养小球藻的组合物稀释至用于土壤施用有效量的较低浓度。导致稀释组合物的基于兼养小球藻全细胞的固体百分比计数如下：组合物中初始固体百分比乘以组合物的体积与水的体积的比率。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为3.5-10毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.004623-0.079252％(例如，约0.004％至约0.080％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为3.5-4mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.004623-0.031701％(例如，约0.004％至约0.032％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为4-5毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.005283-0.039626％(例如，约0.005％至约0.040％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为5-6mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.006604-0.047551％(例如，约0.006％至约0.050％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为6-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.0.007925-0.055476％(例如，约0.008％至约0.055％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为7-8mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009246-0.063401％(例如，约0.009％-约0.065％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为8-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.010567-0.071327％(例如，约0.010％至约0.075％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为9-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.011888-0.079252％(例如，约0.012％至约0.080％)。
在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为1-50mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.001321-0.396258％(例如，约0.001％至约0.400％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为1-10毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.001321-0.079252％(例如，约0.001％至约0.080％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为2-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.002642-0.055476％(例如，约0.003％至约0.055％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为10-20mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.013201-0.158503％(例如，约0.013％-约0.160％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为20-30mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.026417-0.237755％(例如，约0.025％至约0.250％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为30-45毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.039626-0.356631％(例如，约0.040％至约0.360％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为30-40mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.039626-0.317007％(例如，约0.040％至大约0.320％)。在一些实施方案中，在土壤应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为40-50mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.052834-0.396258％(例如，约0.055％至约0.400％)。
在希望的浓度下基于兼养小球藻的组合物的施用速率可以表示为每单位面积的体积。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为50至150加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为75-125加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为50-75加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为75-100加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为100-125加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在土壤施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包括范围为125-150加仑/英亩的速率。
基于兼养小球藻的组合物的施用频率可表示为每个时间段的施用次数(例如，每月两次施用)，或施用之间的时间段(例如，每21天的一次施用)。在一些实施例中，在土壤施用中每3-28天植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在土壤应用中每隔4-10天植物可以接触的液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中每18-24天植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在土壤应用中每3-7天植物可以接触液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中每7-14天植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中每14-21天植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中每21-28天植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。
通常在植物生根之后开始土壤施用基于兼养小球藻的组合物，但是在一些实施例中可以在生根之前，在种植后规定的时间段，或者在从土壤出苗后的规定的时间段开始。在一些实施例中，在土壤应用中在植物从土壤出苗后5-14天植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在土壤应用中在植物从土壤出苗后5-7天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中在植物从土壤出苗后7-10天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在土壤应用中在植物从土壤出苗后10-12天植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在土壤应用中在植物从土壤出苗后12-14天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。
毛细作用应用
在另一个非限制性实施方案中，给予基于兼养小球藻的液体组合物处理可以包括首先在水中浸泡种子，从水中移开种子，干燥种子，施用有效量的液体组合物(低于土壤中的种子种植水平)，以及种植种子，其中通过毛细作用从下方将液体组合物提供给种子。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中90-150分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中110-130分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中90-100分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中100-110分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中110-120分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中120-130分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中130-140分钟。在一些实施例中，种子可以浸泡在水中140-150分钟。
通过在一定体积的水中混合一定体积的组合物，可以将基于兼养小球藻的组合物稀释至在毛细作用应用中有效量的较低浓度。产生稀释的组合物的兼养小球藻全细胞的固体百分数可以如下计算：组合物中的初始固体百分比乘以组合物的体积与水的体积的比率。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为6-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.007925-0.079252％(例如，约0.008％至约0.080％)。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为7-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009245-0.071327％(例如，约0.009％至约0.075％)。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为6-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.007925-0.05547％(例如，约0.008％至约0.055％)。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为7-8mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009246-0.063401％(例如，约0.009％至约0.065％)。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为8-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.010567-0.071327％(例如，约0.010％至约0.075％)。在一些实施方案中，在毛细作用应用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可包含浓度范围为9-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.011888-0.079252％(例如，约0.012％-0.080％)。
叶面施用
在一个非限制性实施方案中，给予基于兼养小球藻的液体组合物处理包括使植物叶面与有效量的液体组合物接触。在一些实施例中，可以通过手持喷雾器，农业应用中的喷雾器，喷淋器(sprinkler)，宽分布系统(例如作物喷洒器(cropduster))等将基于兼养小球藻的液体组合物喷到叶面上。
通过在一定体积的水中混合一定体积的组合物，可以将基于兼养小球藻的组合物稀释至用于叶面施用的有效量的较低浓度。产生稀释的组合物的兼养小球藻全细胞的固体百分数可以如下计算：组合物中初始的固体百分比乘以组合物的体积与水的体积的比率。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为2-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.002642-0.079252％(例如，约0.003％至约0.080％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为2-3毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.002642-0.023775％(例如，约0.003％至约0.025％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为3-4毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.003963-0.031701％(例如，约0.004％至约0.035％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为4-5毫升/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.005283-0.039626％(例如，约0.005％至约0.040％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为5-6mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.006604-0.047551％(例如，约0.007％至约0.050％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为6-7mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.007925-0.055476％(例如，约0.008％至约0.055％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为7-8mL加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.009246-0.063401％(例如，约0.009％至约0.065％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为8-9mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.010567-0.071327％(例如，约0.010％至约0.070％)。在一些实施方案中，在叶面施用中有效量的基于兼养小球藻的液体组合物可以包括浓度范围为9-10mL/加仑，从而将兼养小球藻全细胞的固体百分比从5％-30％减少至0.011888-0.079252％(例如，约0.012％至约0.080％)。
在希望的浓度下基于兼养小球藻的组合物的施用速率可以表示为每单位面积的体积。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为10-50加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中液体组合物的施用速率可包括范围10-15加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为15-20加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为20-25加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为25-30加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为30-35加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率在可包括范围为35-40加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可以包含范围为40-45加仑/英亩的速率。在一些实施例中，在叶面施用中基于兼养小球藻的液体组合物的施用速率可包括范围为45-50加仑/英亩的速率。
基于兼养小球藻的组合物的施用频率可表示为每个时间段的施用次数(例如，每月两次施用)，或施用之间的时间段(例如，每21天施用一次)。在一些实施例中，在叶面施用中每3-28天或更多，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每4-10天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每18-24天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每3-7天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每7-14天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每14-21天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中每21-28天，植物可以接触基于兼养小球藻的液体组合物。
通常在植物生根之后开始叶面施用基于兼养小球藻的组合物，但在一些实施例中可以在生根之前，在种植后规定的时间段，或者在从土壤中出苗之后的规定的时间段开始。在一些实施例中，在叶面施用中在植物从土壤中出苗后5-14天，植物首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在叶面施用中在植物从土壤中出苗后5-7天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中在植物从土壤中出苗后7-10天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施方式中，在叶面施用中在植物从土壤中出苗后10-12天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。在一些实施例中，在叶面施用中在植物从土壤中出苗后12-14天，植物可首先接触基于兼养小球藻的液体组合物。
水培应用
在另一个非限制性实施方案，将基于兼养小球藻的液体组合物给予种子或植物可包括将组合物与营养物培养基一起施用至设置在水培生长培养基或惰性生长培养基(例如，椰壳)中的种子和生长在水培生长培养基或惰性生长培养基中的植物。可以每天，每周或每生长季节多次施用基于兼养小球藻的液体组合物。
实施例
举例说明了本发明的实施方式并且在以下实施例中进一步详细公开另外的实施方式，在任何情况下都不试图限制在本文所述的本发明的任何方面的范围。
实施例1
分析兼养的小球藻全细胞样品的含量。样品分析和基于标准偏差的外推范围的结果示于表4，NA指示对于检测而言太低的水平。蛋白质分析的结果是基于干重给出的，而其余结果基于湿重给出
表4
实施例2
分析兼养的小球藻全细胞样品的氨基酸含量。样品分析和外推范围的结果如表5所示
表5
| 分析物 | ％生物质 | 范围(％) |
| 天冬氨酸 | 3.88 | 2.0-5.0 |
| 苏氨酸 | 1.59 | 0.1-3.0 |
| 丝氨酸 | 2.3 | 0.1-4.0 |
| 谷氨酸 | 6.01 | 4.0-8.0 |
| 脯氨酸 | 2.73 | 0.1-5.0 |
| 甘氨酸 | 2.45 | 0.1-4.0 |
| 丙氨酸 | 3.34 | 1.0-5.0 |
| 半胱氨酸 | 0.56 | 0.1-2.0 |
| 缬氨酸 | 1.99 | 0.1-4.0 |
| 甲硫氨酸 | 0.85 | 0.1-2.0 |
| 异亮氨酸 | 1.39 | 0.1-3.0 |
| 亮氨酸 | 3.13 | 1.0-5.0 |
| 酪氨酸 | 1.50 | 0.1-3.0 |
| 苯丙氨酸 | 1.77 | 0.1-4.0 |
| 赖氨酸 | 1.87 | 0.1-3.0 |
| 组氨酸 | 0.96 | 0.1-2.0 |
| 精氨酸 | 4.42 | 2.0-6.0 |
| 色氨酸 | 0.95 | 0.1-2.0 |
| 总计 | 41.69 | 11.3-70 |
分析兼养的小球藻全细胞样品的糖类含量。样品分析和外推范围的结果示于表6-7中
表6
| 分析物 | ％糖类 | ％生物质 | 范围(％生物质) |
| 多糖 | 81.61 | 32.6 | 20-40 |
| 棉子糖 | 1.47 | 0.6 | 0.1-2.0 |
| 纤维二糖 | 1.89 | 0.8 | 0.1-2.0 |
| 麦芽糖 | 5.18 | 2.1 | 0.1-4.0 |
| 葡萄糖 | 5 | 2 | 0.1-4.0 |
| 木糖 | 0.7 | 0.3 | 0.1-1.0 |
| 半乳糖 | 1.21 | 0.5 | 0.1-1.0 |
| 甘露糖 | 0.86 | 0.3 | 0.1-1.0 |
| 果糖 | 0.41 | 0.2 | 0.1-1.0 |
| 葡萄糖醛酸 | 1.67 | 0.7 | 0.1-2.0 |
| 总计 | 100 | 40.1 | 20.9-58.0 |
表7
| 分析物 | ％糖类 | ％生物质 | 范围(％生物质) |
| 葡萄糖 | 54.5 | 21.8 | 10-30 |
| 木糖 | 4.5 | 1.8 | 0.1-4 |
| 半乳糖 | 16.5 | 6.6 | 4.0-8.0 |
| 阿拉伯糖 | 5.2 | 2.1 | 0.1-4.0 |
| 甘露糖 | 5.6 | 2.2 | 0.1-4.0 |
| 果糖 | 2.7 | 1.1 | 0.1-2.0 |
| 葡萄糖醛酸 | 10 | 4 | 2.0-6.0 |
| 总计 | 99 | 39.6 | 16.4-58.0 |
实施例4
分析包含按重量计10％兼养小球藻全细胞，＜0.1％磷酸，0.3％的山梨酸钾，以及余量为水的基于低浓度兼养小球藻的组合物样品的含量。样品分析和基于标准偏差外推范围的结果示于表8，NA指示对于检测而言太低的水平。蛋白质分析的结果基于干重给出，而其余结果基于湿重给出。
表8
实施例5
通过加拿大国家研究委员会(National research council Canada)(渥太华，安大略)分析兼养小球藻全细胞和包括按重量计10％兼养小球藻全细胞，＜0.1％磷酸，0.3％山梨酸钾，余量为水的低浓度的基于兼养小球藻的组合物的样品的植物激素含量。没有分析本实施例中使用的基于兼养小球藻的组合物以量化组合物中的细菌，然而以同样的方式使用相同组分制备的先前的组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。所有兼养小球藻全细胞样品必须干燥用于分析，结果相对于干重(DW)报告。分析的兼养小球藻全细胞的两个样品包含兼养小球藻(其在分析之前已经通过转鼓干燥器干燥)，构成如下：一个样品，其中兼养小球藻全细胞已经预先存储在冰箱(旧)中和一个样品，其中兼养小球藻全细胞先前未被存储(新)。分析之前进行冷冻干燥的兼养小球藻全细胞的样品用作没有经过干燥过程的兼养小球藻细胞的含量的最接近的近似。干燥的光养培养的普通小球藻(Chlorella vulgaris)的样品得自Hoosier Hill Farm LLC(安哥拉，印第安纳州)。
作为液体样品分析低浓度的基于兼养小球藻的组合物样品，相对于鲜重(FW)报告结果。一个样品包含基于兼养小球藻的组合物(其已经预先存储在冰箱(旧)中)，一个样品包含基于兼养小球藻的组合物(其先前未被存储(新鲜))。样品分析的结果示于表9-12，n.d.指示没有检测到的代谢物。所报道的ng/g相当于分数/十亿分的水平(ppb)。
表9
表9中的植物激素缩写如下：ABA＝顺式-脱落酸；ABAGE＝脱落酸葡萄糖酯；PA＝红花菜豆酸；Neo-PA＝新红花菜豆酸；和t-ABA＝反式-脱落酸。如表9所示，相比于冻干样品，两个转鼓干燥的样品显示较低水平的ABA和ABA代谢物。兼养小球藻细胞显示与光养小球藻细胞样本相当水平的ABA和ABA代谢物。没有低浓度的基于兼养小球藻的组合物样品显示可检测水平的ABA和ABA代谢物。
表10
表10中的植物激素缩写如下：t-ZOG＝(反式)玉米素-O-糖苷；t-Z＝(反式)玉米素；c-Z＝(顺式)玉米素，t-ZR＝(反式)玉米素核苷，c-ZR＝(顺式)玉米素核苷；dhZR＝二氢玉米素核苷；iP＝异戊烯基腺嘌呤；和iPR＝异戊烯基腺苷。如表10所示，与冻干样品相比，两个滚筒干燥的样品显示较低水平的t-Z，c-Z，和iP。组合物的样品表现出可检测水平的t-ZOG，c-Z，c-ZR，iP，和iPR，表明对基于兼养小球藻的组合物进行滚筒干燥过程可以降低组合物的c-Z和iP含量的。与光养小球藻细胞样品相比，兼养小球藻细胞样品显示较高含量的t-ZR。低浓度的基于兼养小球藻的组合物样品显示可检测水平的t-ZOG，c-Z，c-ZR，iP，和iPR。
表11
表11中的植物激素缩写如下IAA＝吲哚-3-乙酸；IAA-Ala＝N-(吲哚-3-基-乙酰基)-丙氨酸；IAA-Asp＝N-(吲哚-3-基-乙酰基)天冬氨酸；IAA-Glu＝N-(吲哚-3-基-乙酰基)谷氨酸；和IAA-Leu＝N-(吲哚-3-基-乙酰基)-亮氨酸。如表11所示，与冻干样品相比，两个滚筒干燥的样品显示较低水平的IAA；相比于光养小球藻细胞样本，兼养小球藻细胞样品显示较高的IAA水平。组合物样品显示可检测水平的IAA，表明对基于兼养小球藻的组合物进行滚筒干燥过程可以减少组合物的IAA含量。
表12
表12中的植物激素缩写如下：GA＝赤霉素。如表12所示，相比于冷冻干燥样品，两个滚筒干燥样品显示较低水平的GA 3。组合物样品没有显示可检测水平的赤霉素，
实施例6
进行实验来确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物至土壤中种植的番茄种子是否影响从土壤中出苗的速率。番茄是茄科(Solanaceae)的一部分。番茄种子(番茄，Solanum lycopersicum)在具有标准无土植物盆栽土壤混合物的托盘中种植。将10个处理与未处理的对照(UTC)相比，并列于表13，其中处理3和9是一式两份的。该处理构成如下：一个处理，其中在配制用于处理之前通过滚筒干燥器(DD)干燥基于兼养小球藻的组合物，两个处理，其中没有干燥(湿)基于兼养小球藻的组合物。在处理3和9中基于兼养小球藻的组合物不进行干燥或溶解过程。在进行超临界二氧化碳萃取过程之前，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)提取的生物质被机械溶解。将兼养培养的Galidieria sp.裂解细胞机械裂解。BG-11培养基处理由在兼养小球藻培养过程中使用的相同的培养基构成。离心的介质处理构成如下：在培养过程结束时(即，在收获兼养小球藻之后)通过离心从兼养小球藻培养物中分离的培养的介质。商业可获得的基于大型海藻提取物的产品从Acadian Seaplants Limited(30Brown Avenue，Dartmouth，Nova Scotia，Canada，B3B1X8)得到，用于比较。还测试了从FBSciences，Inc(153 N Main Street，Ste 100，Collierville，TN 38017)可商购的产品运输土壤(Transit Soil).
表13
| 处理号 | 处理描述 |
| 1 | UTC-未处理的水检查 |
| 2 | 兼养小球藻属-转鼓干燥的全细胞(DD) |
| 3 | 兼养小球藻属-全细胞(湿地块1) |
| 4 | 光养雨生红球藻-提取的生物质 |
| 5 | 兼养Galdieria sp.-全细胞 |
| 6 | 兼养Galdieria sp.-溶解的细胞 |
| 7 | 从兼养小球藻属培养物离心的介质 |
| 8 | BG-11培养基 |
| 9 | 兼养小球藻属-全细胞(湿地块2) |
| 10 | 种植者标准产物-Acadian液体海藻浓缩物 |
| 11 | 种植者标准产物-运输土壤 |
将处理物巴氏杀菌，归一化至10％的固体(用于用微藻固体处理)，以及用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。基于兼养小球藻的组合物先前冷冻和解冻，并且在从微藻培养系统中收获之后在冷藏后，加入本实验中使用的配制处理中。没有分析用于本实验处理的基于兼养小球藻的组合物以量化组合物中的细菌。然而，以同样的方式使用相同组分制备的先前的组合物的需氧平板计数具有包含40,000-400,000CFU/mL。
以低浓度4.73mL/加仑将所有处理施用于种子。该处理方法构成如下：使用洒水壶以100加仑/英亩的速率润湿土壤。种植种子后立即进行处理。测试浓度4.73mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.012495％的低百分比固体含量。
每个处理施加到以10×10方式种植在种植盘中的100个种子，每排十个作为重复计数(总共10个重复)。每天视觉观察记录从土壤中出苗的植物的百分比。用于评估出苗的标准是下胚轴阶段，其中可见茎从盆栽土混合物中突出。在温室内进行实验，所有的种子和处理经历相同的控制条件，包括温度和光。在整个实验中所有托盘用相同量的水处理。在实验期间没有额外的营养物提供给植物。评级为显著的所有数据是这样做的，在90％的置信水平下利用New Duncan’s Multiple Test Range，使得具有相同字母的统计显著标识符的值不是显著不同的。
结果示于表14-18，伴随统计显著分组标识符。
表14
表15
如表14-15中所示，与UTC相比较，包含基于兼养小球藻的组合物的处理3和9更早地从土壤出苗，在第2天上午，在处理10和11以及处理5-8中的种植者标准商业产品显示统计显著差异。对于所有处理出苗植物的百分比在实验结束时汇聚。
表16
表16显示相对于UTC，包括基于兼养小球藻的组合物的处理3和9。如表16中所示，在第1下午处理3和9开始从土壤中出苗，而直到第2下午UTC处理才开始出苗，并且滞后处理3和9，统计显著的裕量最多的天数直到第5天下午。在接受包括基于兼养小球藻的组合物的处理的地块中，处理3显示在第2天下午，第3天下午，第4天上午，第4天下午和第5天上午与UTC统计显著的差异，并且处理9显示从第1天下午到第5上午与UTC统计显著的差异。在UTC前一天，处理3和9还达到至少70％出苗，到第5天下午，相比于UTC，保持至少27％的数值增加。
表17
如表17所示，相比于UTC和包括基于DD兼养小球藻的组合物的处理，包括基于湿兼养小球藻的组合物的两个处理更快地从土壤中出苗。在接受包括基于湿兼养小球藻的组合物的处理的地块中，在第2天下午，第3天下午，第4天上午，第4天下午，和第5天上午第1地块显示与UTC和包括基于DD兼养小球藻的组合物的处理统计显著差异，第2地块显示从第1天下午至第5天上午与UTC和包括基于DD兼养小球藻的组合物的处理统计显著差异。在UTC和包括基于DD兼养小球藻的组合物的处理前一天，包含基于湿兼养小球藻的组合物的处理还达到至少70％出苗，直到第5天上午相比于UTC和包含基于DD小球藻的组合物的处理，保持至少27％的数值增加。包括基于DD兼养小球藻的组合物的处理的性能极大地反映UTC的性能，相比于实验过程没有统计显著差异，并且仅在第3天下午到第4天下午数值增加10％以上。因此，结果表明，当用作土壤浸液时，在制备过程中用转鼓干燥器干燥基于兼养小球藻的组合物降低了组合物加速番茄植物出苗的有效性。
表18
表18显示来自第4天上午的数据，将重复的基于兼养小球藻的组合物处理平均用于与其它处理相比，并且显示与UTC相比，对于没有干燥(即，湿的)基于兼养小球藻的组合物统计显著差异，这总计306％的数值增加。表18还显示了没有干燥的基于兼养小球藻的组合物处理性能优于商购产品，并且显著不同于兼养Galdieria和转鼓干燥的基于兼养小球藻的组合物处理。
实施例7
进行实验来确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物至土壤中种植的番茄种子的方法是否影响从土壤出苗和成熟的速率。番茄种子(Solanum lycopersicum)种植在具有苔藓泥炭沼，珍珠岩和蛭石(2∶1∶1)的盆栽土壤混合物的托盘中。包括基于兼养小球藻的组合物的三种处理与未处理的对照(UTC)相比。将处理物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。在从微藻培养系统获得后将存储的基于兼养小球藻的组合物冷冻以及在实验中使用的用于处理的液体组合物中配制之前解冻。新鲜的基于兼养小球藻的组合物没有预先冷冻，并在从微藻培养系统中收获之后直接加入在此实验中使用的用于处理的液体组合物中。没有分析在本实验的处理中使用的组合物以量化组合物中的细菌，但是以同样的方式使用相同组分制备的先前的组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。
通过两个不同的处理方法，将基于兼养小球藻的液体组合物处理施用于种子。第一种处理方法包括将种子浸泡在低浓度8mL/加仑的基于兼养小球藻的液体组合物中两小时，恒定地喷射空气以避免缺氧，从组合物中移开种子，将种子干燥过夜，然后将种子种植在盆栽土壤混合物中。第二处理方法包括将种子浸泡在水中两个小时，恒定地喷射空气以避免缺氧，从水中移开种子，干燥种子过夜，将种子种植在种植盘的基底中具有低浓度8mL/加仑的基于兼养小球藻的液体组合物的盆栽土混合物中以允许通过毛细作用用液体组合物处理种子。测试浓度8mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.021134％的低百分比固体含量。
将三个处理的每一个施用至72个种子。在第6天和第7天，每天视觉观察土壤和植物记录多少种子出苗和成熟(如下所述)。用于评估出苗的标准是完成下胚轴阶段，其中茎显著地从盆栽土壤混合物中突出。用于评估成熟的标准是完成子叶阶段，其中在出苗的茎上明显形成两个叶片。室内进行实验，所有的种子和处理经历相同的控制条件，包括温度，光，和水供应。在实验过程中没有提供其他营养物。提供的光是人工的并且通过荧光灯泡每天24小时提供。实验结果列于表19-24。
表19
表20
表21
如表19-21中所示，关于植物出苗，相比于UTC，至第7天毛细作用处理和种子浸泡处理显示更高的性能。在第七天毛细管作用处理显示增加38％，用存储的基于兼养小球藻的组合物的种子浸泡处理显示增加12％；相比于UTC，用新鲜的基于兼养小球藻的组合物的种子浸渍处理显示增加10％。这些结果表明当用于毛细作用应用时，相比于未处理的种子，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高出苗。
表22
表23
表24
如22-24表中所示的，关于植物的成熟，相比于UTC，毛细作用处理和种子浸泡处理在第6和第7天显示更高的性能。毛细作用处理显示增加至少27％，用存储的基于兼养小球藻的组合物的种子浸泡处理显示增加至少5％，用新鲜的基于兼养小球藻的组合物的种子浸渍处理显示增加至少11％(相比于UTC)。这些结果表明当用于毛细作用应用时，与未处理的种子相比，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高幼苗成熟。
实施例8
进行实验来确定施用低浓度的基于养小球藻的组合物至土壤中种植的番茄种子的方法是否影响从土壤出苗和成熟的速率。番茄种子(Solanum lycopersicum)种植在具有苔藓泥炭沼，珍珠岩和蛭石(2∶1∶1)的盆栽土壤混合物的托盘中。将包括兼养的基于兼养小球藻的组合物的两个处理与未处理的对照(UTC)相比较。将处理物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，并且用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。基于兼养小球藻的组合物先前没有冷冻，在从微藻培养系统获得之后直接加入用于本实验的处理的液体组合物中。没有分析在本实验的处理中使用的组合物以量化组合物中的细菌，然而以同样的方式使用相同组分制备的先前的组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。
使用相同的处理方法，以两种不同浓度4.7毫升/加仑或8毫升/加仑将基于兼养小球藻的液体组合物施用至种子。测试浓度4.7毫升/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.012416％的低百分比固体含量。测试浓度8mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻细胞)至仅0.021134％的低百分比固体含量。处理方法构成如下：在种植种子后，以指定的浓度，用0.75加仑的液体组合物(相当于施用速率为100加仑/英亩)从顶部浸润土壤。
将两个处理的每一个施用于两个托盘，72个种子。每天视觉观察土壤和植物记录多少种子出苗和成熟(如下所述)。用于评估出苗的标准是完成下胚轴阶段，其中茎显著地从盆栽土壤混合物中突出。用于评估成熟的标准是完成子叶阶段，其中在出苗的茎上明显地形成两个叶。室内进行实验，所有的种子和处理经历相同的控制条件，包括温度，光，水供应。在实验过程中没有提供其他营养物。提供的光是人工的并且通过荧光灯泡每天24小时提供。实验结果列于表25-30中
表25
表26
表27
如表25-27中所示，关于植物出苗，相比于UTC，8和4.7毫升/加仑施用显著持续地较高性能，8毫升/加仑施用持续地性能优于4.7毫升/加仑。在比较日相比于UTC，4.7毫升/加仑施用显示至少26％和多达100％增加，以及相比于UTC，8毫升/加仑施用显示至少28％和高达290％增加。在第6天在4.7和8mL/加仑施用之间出现最大差异。这些结果表明当用于土壤浸润应用时，与未处理的种子相比较，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高出苗。
表28
表29
表30
如表28-30中所示，关于植物的成熟，相比于UTC，8和4.7毫升/加仑施用显示持续地较高性能，在第6，8，和9天，4.7毫升/加仑施用性能优于8毫升/加仑。在比较日相比于UTC，4.7毫升/加仑施用显示至少28％到多达350％增加，相比于UTC，8毫升/加仑施用显示至少22％和高达300％增加。这些结果表明当用于土壤浸润应用时，相比于未处理的种子，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效增加幼苗成熟。
实施例9
进行实验来确定通过叶面施用，低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物至传统番茄(heirloom tomato)(cv德国条纹(German striped))植物是否影响植物的初始生长和尺寸。番茄种子(Solanum lycopersicum)种植在具有标准的无土植物盆栽土壤混合物的托盘中并生长于苗圃温室。将基于兼养小球藻的组合物和可商购的参考产物的处理与未处理的对照(UTC)相比，并列于表31，测试基于兼养小球藻的组合物的重复处理。可商购的基于大型海藻提取物的产品得自Acadian Seaplants Limited(30 Brown Avenue，Dartmouth，Nova Scotia，Canada，B3B 1X8)，用于比较。
表31
| 处理号 | 处理描述 |
| 1 | UTC-未处理的水检查 |
| 2 | 兼养小球藻属-转鼓干燥的全细胞(DD) |
| 3 | 兼养小球藻属-全细胞(湿地块1) |
| 4 | 兼养小球藻属-全细胞(湿地块2) |
| 5 | 种植者标准产物-Acadian液体海藻浓缩物 |
将基于兼养小球藻的组合物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。兼养小球藻全细胞没有预先进行纯化过程从微藻培养基中分离细胞，所述细胞也没有预先进行干燥，萃取或其它过程(其可以溶解或破坏细胞壁)，除了指明的用于转鼓干燥处理。没有分析包含用于本实验的处理的兼养小球藻的组合物以量化组合物中的细菌，但是以同样的方式使用相同组分制备的先前的组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。兼养小球藻组合物预先冷冻和解冻，并在从微藻培养系统获得之后在冷存储之后加入本实验中使用的用于处理的液体组合物中。
以4毫升/加仑浓度将基于兼养小球藻的组合物处理施用于植物。测试浓度4毫升/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.010567％的低百分比固体含量。以9.46mL/加仑的浓度将Acadian处理施用于植物。低浓度和低频处理方法由以下构成：使用喷雾瓶(spray bottle)以25加仑/英亩的速率直接喷雾植物叶面。进行总共三个施用，第一施用发生在种植后三周(出苗后7-10天)。在第一施用之后5天进行第二施用，以及在第二施用之后六天，进行第三施用。
将每个处理施加到14英寸×14英寸的种植平面(包含由25-30个种子产生的植物)。每个处理重复八次。所有的种子种植在标准无土盆栽植物混合物中。每个分析的植物计数为针对每个处理评价所考虑的八次重复的重复(replicate)。第二次处理后和第三次处理后进行分析。通过SPAD(土壤-植物分析发展)值估计叶绿素含量，SPAD值是由MinoltaSPAD计提供的数值，该Minolta SPAD计分析通过叶的特定光谱中光的量，并将该读数转化为数值作为叶中叶绿素浓度的指示物。在温室内进行实验，所有的种子和处理经历相同的控制条件，包括温度和光。在整个实验中，所有托盘用相同量的水处理。在实验期间，没有额外的营养物提供给植物。所有评定为显著的数据是这样做的，在90％的置信水平下利用NewDuncan’s Multiple Test Range，使得具有相同字母的统计显著标识符的值没有显著不同。结果示于表32-37，用F指定叶面施用，伴随统计显著性分组标识符。
实施例10
进行实验来确定通过土壤施用，低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物到传统番茄(cv德国条纹)植物(Solanum lycopersicum)是否影响植物的初始生长和尺寸。在相同的位置，使用相同的处理，和使用与实施例9中的实验相同的设计进行土壤施用实验。
以较低的浓度4.73mL/加仑，将基于兼养小球藻的组合物处理施用于植物。测量浓度4.73mL/加仑稀释组合物，(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.012495％低百分数固体含量。以9.46mL/加仑的浓度将Acadian处理施用于植物。低浓度和低频处理方法构成如下：以100加仑/英亩的速率润湿土壤。进行总共三个处理，在种植后两周(出苗后7-10天)进行第一施用。在第一处理后9天进行第二处理，以及在第二处理后5天进行第三处理。所有评定为显著的数据是这样做的，在90％的置信水平下利用NewDuncan’s Multiple Test Range，使得具有相同字母的统计显著标识符的值没有显著不同。结果示于表32-37，S指示土壤施用，伴随统计显著性分组标识符。
表32
如表32所示，关于植物高度，相比于UTC，包含基于湿兼养小球藻的组合物的处理没有显示统计学显著的或数值增加。另外，与基于DD兼养小球藻的组合物处理相比较，基于湿兼养小球藻的组合物没有显示统计显著的或数值增加。
表33
如表33中所示，关于叶数，相比于UTC或基于DD兼养小球藻的组合物处理，包括基于湿兼养小球藻的组合物的处理没有显示统计显著性。
表34
如表34中显示，关于叶绿素含量，相比于UTC和基于DD兼养小球藻的组合物处理，包括基于湿兼养小球藻的组合物的叶面处理确实显示统计显著的增加。相比于UTC，叶面处理也显示数值增加24％和31％，以及相比于基于DD兼养小球藻的组合物处理，数值增加15％和22％。这些结果表明，在低浓度和低频率使用下，当施用于叶面时，少量的基于兼养小球藻的组合物有效提高植物叶绿素含量。该结果还表明在制备过程中使用滚筒干燥器干燥基于兼养小球藻的组合物降低组合物增强番茄植物的叶绿素含量的有效性(当用于叶面施用时)。相比于UTC或基于DD小球藻的组合物处理，包括基于湿兼养小球藻的组合物的土壤施用没有显示统计显著的或数值的增加。
表35
如表35中所示，关于全植物重量，相比于UTC，包括在地块2中基于湿兼养小球藻的组合物的叶面处理确实显示统计显著的增加，并且数值增加56％。叶面施用Acadian产品性能较低，相比于UTC，仅显示31％增加。相比于基于DD兼养小球藻的组合物处理，包含在地块2中基于湿兼养小球藻的组合物的叶面处理没有显示统计显著的差异，但是确实显示数值增加15％。相比于UTC或基于DD兼养小球藻的组合物处理，地块1中的叶面处理和包括基于湿兼养小球藻的组合物的土壤施用没有显示统计显著的增加。这些结果表明，当施用于叶面时，在低浓度和低频率施用下，少量的基于兼养小球藻的组合物有效地提高全植物重量。
表36
如表36所示，关于根重，在处理4(湿地块2，wet plot 2)中叶面施用基于兼养小球藻的组合物导致与UTC显著差异，显示相比于UTC增加51％。叶面施用圆筒干燥的基于兼养小球藻的组合物还导致与UTC显著差异，数值增加57％。叶面施用Acadian产品性能较差，显示相比于UTC，仅增加28％。这些结果表明，当施用到叶面上时，在低浓度和低频率施用下，少量的基于兼养小球藻的组合物有效地提高植物的根重。
表37
如表37所示，关于芽重量，相比于UTC，在处理4中(湿地块2，wet plot 2)包括基于湿兼养小球藻的组合物的叶面处理显示统计显著的增加，以及数值增加60％。Acadian产品性能较差，在叶面施用中，相对于UTC，仅显示33％增加，并且在土壤施用中，相对于UTC，显示降低28％。相比于基于DD兼养小球藻的组合物处理，在处理4中包括基于湿兼养小球藻的组合物的叶面处理还显示统计显著的差异，以及数值增加24％。因此结果表明，当用于叶面施用时，在制备过程中使用滚筒干燥器干燥基于兼养小球藻的组合物降低组合物增强番茄植物芽重量的有效性。相比于UTC或基于DD兼养小球藻的组合物处理，在处理3(湿地块1，wet plot 1)中的叶面施用和包含基于湿兼养小球藻的组合物的土壤施用没有显示统计显著的增加，然而相比于基于DD兼养小球藻的组合物处理，在处理4中的土壤施用显示18％增加。这些结果表明，当施用于叶面时，在低浓度和低频率施用下，少量的基于兼养小球藻的组合物有效地提高植物的芽重量。
实施例11
进行实验来确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物至在土壤中种植的绿豆种子(菜豆，Phaseolus vulgaris)的方法是否影响从土壤中出苗和成熟的速率。绿豆是豆科(Fabaceae)家族的一部分。绿豆种子种植在具有苔藓泥炭沼(sphagnum moss)，珍珠岩和蛭石(2∶1∶1)的盆栽土壤混合物的托盘中。将包括基于兼养小球藻的组合物的三种处理与未处理的对照(UTC)相比。将处理物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(H6H7KO2)稳定，余量由水组成。在从微藻培养系统收获后，将存储的基于兼养小球藻的组合物冷冻并且在配制成用于实验的处理物的液体组合物之前解冻。新鲜的基于兼养小球藻的组合物没有预先冷冻，并且在从微藻培养系统收获之后直接加入在此实验中使用的处理物的液体组合物中。没有分析该实验的处理物中使用的组合物以定量组合物中的细菌，然而以相同方式使用相同组分制备的先前组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。
通过两个不同的处理方法将基于兼养小球藻的液体组合物处理施用到种子。第一种处理方法包括将种子浸泡在低浓度8mL/加仑的基于兼养小球藻的液体组合物中两小时，同时恒定地喷射空气以避免缺氧，从组合物中移开种子，将种子干燥过夜，然后将种子种植在盆栽土壤混合物中。第二处理方法包括将种子在水中浸泡两个小时，同时恒定地喷射空气以避免缺氧，从水中移开种子，将种子干燥过夜，将种子种植在盆栽土混合物中(在种植盘的基底中具有低浓度8mL/加仑的基于兼养小球藻的液体组合物)以允许通过毛细作用用液体组合物处理种子。测试浓度8mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.021134％的低百分比固体含量。
三个处理的每一个应用到72个种子。每天视觉观察土壤和植物，以记录多少种子出苗和成熟(如下所述)。用于评估出苗的标准是完成下胚轴阶段，其中杆显著地从盆栽土壤混合物中突出。用于评估成熟的标准是完成子叶阶段，其中明显地在出苗的茎上形成两个叶片。进行室内实验，所有的种子和处理物经受相同的控制条件，包括温度，光，和水的供应。在实验过程中未提供其他营养物。提供的光是人造的并且通过荧光灯泡每天24小时提供。实验结果显示于表38-43中
表38
表39
表10
如表38-40中所示，关于植物出苗(emergence)，相比于毛细作用处理和UTC，对于新鲜和存储的基于兼养小球藻的组合物的种子浸泡处理显示持续地更高的性能。在比较日相比于UTC，存储的基于兼养小球藻的组合物种子浸泡处理显示至少27％和多达50％增加，并且相比于UTC，新鲜的基于兼养小球藻的组合物种子浸泡处理显示至少36％和多达400％的增加。在种子浸泡处理中，新鲜的基于兼养小球藻的组合物的出苗一致地超过存储的基于兼养小球藻的组合物，两个处理之间的差异在第4天最大，并且在实验持续期间内收窄。这些结果表明当用于种子浸泡施用时，与未处理的种子相比较，低浓度的基于兼养小球藻为的组合物能有效提高出苗。
表41
表42
表43
如表41-43所示，关于植物成熟，相比于毛细作用处理和UTC，对于新鲜和存储的基于兼养小球藻的组合物的种子浸泡处理显示持续地较高性能。在比较日相比于未处理的对照，存储的基于兼养小球藻的组合物种子浸泡处理显示至少30％和高达43％增加，以及相比于UTC，新鲜的基于兼养小球藻的组合物种子浸泡处理显示至少37％和高达92％增加。在种子浸泡处理中，新鲜的兼养小球藻组合物的成熟持续地超过存储的基于兼养小球藻的组合物，两个处理之间的差异在第6天最大，并且在实验持续期间收窄。关于植物成熟，毛细作用处理一致地优于UTC。这些结果表明在用于种子浸泡应用时，与未处理的种子相比，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高苗成熟。
实施例12
进行实验来确定施用低浓度养的基于兼养小球藻的组合物至在土壤中种植的绿豆种子(菜豆，Phaseolus vulgaris)的方法是否影响从土壤出苗和成熟的速率。绿豆种子种植在具有苔藓泥炭沼，珍珠岩和蛭石(2∶1∶1)的盆栽土壤混合物的托盘中。将包括基于兼养小球藻的组合物的两个处理与未处理对照(UTC)比较。将处理物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。所述基于兼养小球藻的组合物没有预先冷冻，并且在从微藻培养系统收获之后，直接加入在此实验中使用的处理物的液体组合物中。没有分析本实验的处理中使用的组合物以量化组合物中的细菌，但是以同样的方式使用相同组分制备的先前组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。
使用相同的处理方法，以两个不同的低浓度，4.7毫升/加仑或8毫升/加仑，将基于兼养小球藻的液体组合物处理应用于种子。测试浓度4.7毫升/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.012416％的低百分比固体含量。测试浓度8mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.021134％的低百分比固体含量。处理方法构成如下：在种植种子后，以指定的浓度，使用0.75加仑的液体组合物(相当于施加速率为100加仑/英亩)从顶部浸湿土壤。
将两个处理的每一个应用于两个托盘72个种子。每天视觉观察土壤和植物以记录多少种子出苗和成熟(如下所述)。用于评估出苗的标准是完成下胚轴阶段，其中茎显著地从盆栽土壤混合物中突出。用于评估成熟的标准是完成子叶阶段，其中明显地在出苗的茎上形成两个叶片。进行室内实验，所有的种子和处理经历相同的控制条件，包括温度，光，水供应。在实验过程中未提供其他营养物。提供的光是人工的和通过荧光灯泡每天24小时提供。实验结果显示于表44-49中
表44
表45
表46
如表44-46中所示，关于植物出苗，相比于UTC，8和4.7毫升/加仑施用显示持续地更高的性能，而8毫升/加仑的施用持续地性能好于4.7毫升/加仑。在比较日，相比于UTC，4.7毫升/加仑施用显示至少22％和高达61％增加，以及相比于UTC，8毫升/加仑使用显示至少44％和高达153％增加。这些结果表明当用于土壤浸润应用时，与未处理的种子相比较，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高出苗。
表47
表48
表49
如表47-49中所示，关于植物的成熟，相比于UTC，8和4.7毫升/加仑施用显示持续地较高的性能，8毫升/加仑施用持续地性能优于4.7毫升/加仑。在比较日相比于UTC，在第6天开始，4.7毫升/加仑施用显示至少71％和多达100％增加，以及相比于UTC，8毫升/加仑的应用显示至少107％和多达176％增加。相比于UTC，8mL加仑应用的成熟性能增加也也随时间而增加。这些结果表明当用于土壤浸润应用时，与未处理的种子相比，低浓度的基于兼养小球藻的组合物能有效提高苗的成熟。
使用豆科植物家族的植物中共享的特性，实施例11-12中显示的结果可能代表在整个说明书中描述的基于兼养小球藻的组合物对豆科植物家族中的所有植物以及其它家族的植物的有效性的。
实施例13
进行实验来确定通过土壤施用，低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物至柿子椒植物是否影响植物的产量。柿子椒(辣椒，Capsicum annuum)是茄科植物家族的一部分，将种子种植在加利福尼亚州Ventura县的农场。将两个处理与未经处理的对照(UTC)相比，并且列于表50。市场上可买到的基于大型海藻提取物的产品从Acadian SeaplantsLimited(30 Brown Avenue，Dartmouth，Nova Scotia，Canada，B3B 1X8)进行比较。
表50
| 处理号 | 处理描述 |
| 1 | UTC-未处理水检查 |
| 2 | 兼养小球藻属-全细胞 |
| 3 | 种植者标准产物-Acadian液体海藻浓缩物 |
将基于兼养小球藻的组合物巴氏灭菌，归一化至10％的固体，用磷酸(H3PO4)和山梨酸钾(C6H7KO2)稳定，余量由水组成。兼养小球藻全细胞没有预先进行纯化过程以从微藻培养基中分离细胞，所述细胞也没有预先进行干燥，萃取或其它过程(其可以溶解或破坏细胞壁)。兼养小球藻组合物预先冷冻和解冻，并在从所述微藻培养系统收获之后，在冷存储之后，加入在此实验中使用的用于处理的液体组合物中。没有分析包含用于本实验处理的兼养小球藻的组合物以量化组合物中的细菌，然而以同样的方式，使用相同组分制备的先前组合物的需氧平板计数包含40,000-400,000CFU/mL。
以低浓度37.85mL加仑施用基于兼养小球藻的组合物。测试浓度37.85mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.099989％的低百分比固体含量。以浓度18.9mL/加仑施用Acadian处理。在植物生根后三周开始，以低频率(即，施用之间平均约20天)进行总共五个处理。以第一和第二处理之间20天，第二和第三处理之间24天，第三和第四处理之后11天，以及第四和第五处理之间26天，以及进行处理。使用在25psi下运行的Hypro泵，以100加仑/英亩的速率供应水，通过注射到低容量灌溉滴灌系统中，进行低浓度和低频率处理。
该实验建立为由各自30个种子构成的8个重复的块设计研究。视觉观察用来评价植物活力，标度为0-5，其中0对应于植物死亡以及5对应于完全健康。以可销售和不可销售两类通过品质评价生产。不可销售果实被认为是果实具有严重虫害，蒂腐病，柔软，和/或严重晒伤。该实验中使用的农场是生长柿子椒用于加工处理，从而产生新市场所需的品质不是目标成效。另外，柿子椒留在农田一段时间以确保在收获进行处理之前最大量的变红。叶绿素含量通过SPAD值(土壤-植物分析发展)估计，所述SPAD值是通过Minolta SPAD计提供的数值，该Minolta SPAD计分析通过叶的特定光谱中光的量并将该读数转化为数值作为叶中叶绿素密度的指示物。基于在两种植物上采摘有待找到的所有果实，并且每次处理重复该过程8次，通过采样评价生产。所有的果实称重，计数，并报告为每两植株的克总重量，平均每个果实克总重量。所有评定为显著的数据是这样做的，在90％的置信水平下使用最小显著性差异分析，使得具有相同字母的统计显著标识符的值没有显著不同。处理的结果示于表51-65中，土壤施用用S指定，连同伴随的统计显著性标识符。
实施例14
进行实验来确定通过叶面施用低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物至柿子椒植物(辣椒(Capsicum annuum))是否影响植物的产量。使用相同的处理，以及使用与实施例13的实验相同的设计，在相同的位置进行叶面试验。
在7mL/加仑的低浓度下施用基于兼养小球藻的组合物。7mL/加仑的测试浓度稀释组合物，该组合物最初含有按重量计10％固体的兼养小球藻全细胞至仅0.018492％的低百分比固体含量。在18.9mL/加仑的浓度下进行Acadian处理。在植物生根(plantestablishment)后三周开始，在低频率下(即，施用之间平均约21天)进行总计五个处理。处理如下进行，第一和第二之间20天，第二和第三天之间23天，第三和第四之间15天，第四和第五之间27天。在25加仑/英亩速率下，使用在40psi下运行的背负式喷雾器，通过HollowCo.喷嘴尺寸D-6直接对叶面进行低浓度和低频率处理。
所有评定为显著的数据是在90％的置信水平下使用最小显著差异分析来完成的，使得具有相同字母的统计显著标识符的值没有显著不同。处理的结果示于表51-65中，用F标记用于叶面施用，连同伴随的统计显著标识符。在收获农田的时候，注意到许多上面提到的不可销售的质量问题确实发生，因此在该农田中不可销售果实的比率比人们预期的高。
表51
表51显示关于全植物重量，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物治疗的结果没有统计显著性。叶面施用基于兼养小球藻的组合物性能好于在第一测量时的土壤施用，并且导致与UTC相比6％增加，但是在第二测量时并不保持该优点。在第二测量时的土壤施用性能好于叶面施用，并且导致与UTC相比8％增加。
表52
表52显示关于根重量，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性。叶面和土壤施用基于兼养小球藻的组合物性能好于在第一测量时的UTC，与UTC相比有7％和8％增加。在第二测量时，叶面施用并不保持该优点，但是土壤施用保持该优点，显示相比于UTC，9％增加。
表53
表53显示关于幼苗重量，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性。叶面施用基于兼养小球藻的组合物性能好于在第一测量时UTC和土壤施用，具有相比于UTC，6％增加。在第二测量时叶面施用并不保持该优点。
表54
表54显示关于叶绿素含量，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性。叶面和土壤施用基于兼养小球藻的组合物性能在UTC的3％之内。
表55
表55显示关于植物活力，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性，也没有数值优点。
表56
表56显示与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物在不可销售植物重量方面具有统计显著的降低，以及与UTC相比，叶面施用结果不是统计显著的。
表57
表57显示与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物在不可销售植物产量方面具有统计显著的降低，以及与UTC相比，叶面施用结果不是统计显著的。
表58
表58对于不可销售果实重量，与UTC相比，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物不是统计显著的，但是相比于UTC，两者都显示2％的数值增加。土壤施用基于兼养小球藻的组合物也优于Acadian产品(其显示相比于UTC，37％的降低)。
表59
表59显示了对于可销售的植物重量，与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的，并且相比于UTC(其与商业上成功的Acadian产品相当)，土壤和叶面施用显示286％和220％的较大数值增加。这些结果表明在低浓度和低频率施用下，当施用于土壤或叶面时，少量的基于兼养小球藻的组合物不仅能有效地提高植物重量，而且可以有效地改善较高品质植物(即，可销售的)的植物重量。
表60
表60显示相比于UTC(其与商业上成功的Acadian产品相当)，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果显示200％和220％的较大数值增加。这些结果表明在低浓度和低频率施用下少量的基于兼养小球藻的组合物，当施用于土壤或叶面时，不仅能有效地提高植物产量，而且能够改善较高品质植物(即，可销售的)的植物产量。
表61
表61显示了对于可销售果实重量，与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的。土壤施用基于兼养小球藻的组合物还显示相比于UTC，数值增加48％。土壤施用基于小球藻的组合物也优于Acadian产品(其显示相比于UTC，46％降低)。这些结果表明在低浓度和低频率施用下，少量的基于兼养小球藻的组合物，当施加到土壤中时，不仅能有效地提高果实重量，而且能够提高较高品质植物(即，可销售的)的果实重量。
表62
表62显示了对于生产植物重量，与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的。与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物也显示数值增加114％，与UTC相比，叶面施用显示9％增加，两者都与Acadian产品相当。这些结果表明，在低浓度和低频率施用下，当施用于土壤时，少量的基于兼养小球藻的组合物不仅对于总生产植物重量是有效的。
表63
表63显示了对于生产植物产量，相比于UTC，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，但相比于UTC，确实显示5％和3％的数值增加。
表64
表64显示了对于生产果实重量，相比于UTC，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的。相比于UTC，土壤施用基于兼养小球藻的组合物也显示数值增加117％，相比于UTC，叶面施用显示6％增加，两者都与Acadian产品相当。这些结果表明，在低浓度和低频率施用下，当施用于土壤或叶面时，少量的基于兼养小球藻的组合物不仅对于总生产果实重量是有效的。
表65
表65显示对于利用百分比(可销售果实与生产的总果实的重量比率)，相比于UTC，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的。与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物也显显示96％的数值增加，与UTC相比，叶面施用显示81％增加。这些结果表明，在低浓度和低频率施用下，当施用于土壤或叶面时，少量基于兼养小球藻的组合物能有效地提高田地的总质量。
实施例15
进行实验来确定通过土壤施用，低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物至gavilon蕃茄植物(番茄，Solanum lycopersicum)是否影响植物的产量。番茄也是茄科(Solanaceae)植物家族的成员。在相同的位置，使用相同的处理，并使用与实施例13的实验相同的设计，进行土壤施用测试。对于该实验，番茄植物生长为在地面上的矮树丛。
以37.85mL/加仑的低浓度施用基于兼养小球藻的组合物。测试浓度37.85mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全细胞)至仅0.099989％的低百分比固体含量。以18.9mL/加仑的浓度施用Acadian处理。在植物生根后三周开始，以低频率(即，施用之间平均约23天)施用总共五个处理。以第一处理和第二处理之间19天，第二处理和第三处理之间29天，第三处理和第四处理之间23天和第四处理和第五处理之间21天，进行处理。使用在25psi下运行的Hypro泵以，100加仑/英亩的速率，通过注射到低容量灌溉滴流系统，施用低浓度和低频率处理。
所有评定为显著的数据是这样做的，在90％的置信水平下使用最低显著性差异分析，使得具有相同字母的统计显著标识符的值不是显著不同的。处理的结果示于表66-78，土壤施用使用S指定，连同伴随的统计显著性标识符。
实施例16
进行实验来确定通过叶面施用，低浓度和低频率施用基于兼养小球藻的组合物至gavilon番茄植物(番茄，Solanum lycopersicum)是否影响植物的产量。在相同的位置，使用相同的处理，并且使用与实施例14的实验相同的设计，进行叶面试验。对于该实验，番茄植物生长在桩(stake)上。
以7毫升/加仑的低浓度施用基于兼养小球藻的组合物。测试浓度7mL/加仑稀释组合物(该组合物最初含有10％(重量)固体的兼养小球藻全)细胞至仅0.018492％的低百分比固体含量。以18.9mL/加仑的浓度施用Acadian处理。在植物生根后三周开始，以低频率(即，施用之间平均约21天)施用总共五个处理。以第一和第二处理之间19天，第二和第三处理之间21天，第三和第四处理之间23天，和第四和第五处理之间21天进行处理。以25加仑/英亩速率，使用在40psi下工作的背负式喷雾器，通过Hollow Co.喷嘴尺寸D-6，将低浓度和低频率处理直接施用到叶面。
所有评定为显著的数据是这样做的，使用在90％的置信水平下的最低显著性差异分析，使得具有相同字母的统计显著标识符的值不是显著不同的。处理的结果示于表66-78，叶面施用指定为F，连同伴随的统计显著性标识符。
表66
表66显示关于叶绿素含量，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性，也没有数值增加。
表67
表67显示关于植物活力，与UTC相比，对于基于兼养小球藻的组合物处理的结果没有统计显著性，但是相比于UTC，土壤施用显示7％增加。
表68
表68显示与UTC相比，施用基于兼养小球藻的组合物，在不可销售的植物重量方面不具有统计显著减少，然而相比于UTC，叶面施用显示降低32％。相比于UTC，土壤施用基于兼养小球藻的组合物显示增加6％，而在商业上取得成功的Acadian产品土壤施用显示减小54％。
表69
表69显示与UTC相比，施用基于兼养小球藻的组合物，在不可销售植物产量方面不具有统计显著减少，然而相对于UTC，叶面施用显示降低49％以及土壤施用显示降低3％，这小于Acadian产品土壤施用的42％降低。
表70
表70显示对于不可销售果实重量，与UTC相比，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物不是统计显著的，但是土壤施用显示增加3％，而Acadian产品显示降低24％，以及叶面施用显示降低7％(相对于UTC)。
表71
表71显示了对于可销售植物重量，与UTC相比，施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，但是相比于UTC，土壤施用显示增加7％。
表72
表72显示了对于可销售植物产量，与UTC相比，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，但是相比于UTC，土壤施用显示增加11％。
表73
表73显示了对于可销售果实重量，与UTC和Acadian产品相比，叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果是统计显著的，并且相对于UTC，导致11％增加。这些结果表明，在低浓度和低频率施用下，当施用于叶面时，少量的基于兼养小球藻的组合物不仅能有效地提高果实重量，而且改善高品质植物(即，可销售的)的果实重量。
表74
表74显示了对于生产植物重量，与UTC相比，土壤施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，然而相比于UTC，土壤施用导致数值增加13％，而Acadian产品显示降低5％。
表75
表75显示对于生产植物产量，与UTC相比，土壤和叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，但是相比于UTC，土壤施用显示增加7％，而Acadian产品显示降低4％。
表76
表76显示对于生产果实重量，与UTC相比，叶面施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的，然而相比于UTC，叶面施用显示数值增加9％。
表77
表77显示对于利用百分比(可销售果实与生产的总果实的重量比率)，与UTC相比，施用基于兼养小球藻的组合物的结果不是统计显著的。
使用茄科植物家族内的植物之间共享的特性，示于实施例6-10和13-16的结果可能代表如在整个说明书中描述的基于兼养小球藻的组合物对茄科植物家族中所有植物，以及其它家族中的植物的有效性。
实施例17
进行实验来确定不同施用速率的低浓度的基于兼养小球藻的组合物(在本公开中各种图例中称为“PT”或“PhycoTerra”)对植物的影响。在水栽培条件下，已3mL/加仑-150mL/加仑施用组合物。还测试了仅营养物的模拟组合物。模拟组合物仅包含非生物组分。所有的处理条件包括肥料。对照是仅肥料处理(仅Veg)。实验证明在低浓度下该组合物对植物具有生物作用。实验结果示于图4
实施例18
进行实验以确定低浓度的基于兼养小球藻的组合物施用于在播种时进行盐胁迫的植物是否影响植物的产量。这些实验结果示于图5A-5F在一个实验，架菜豆(pole bean)浸泡在自来水或18毫升/加仑的基于微藻的组合物中4小时。种子种植在coco(一种惰性椰子纤维介质)中，以及生长在水培平台上。以随机方式种植种子(不洗涤)，用80mMol盐处理(第一天)。为了测试径流(run-off)(RO)的重要性，每个种子浸泡类型的一半用57mL RO水(完全饱和)或171mL 80mMol盐溶液(重径流(Heavy run-off))掺水。一些细胞仅包含coco，并且收获这些细胞，在具有和不具有径流的coco中查看盐度曲线。通过测量干重，周长、和光合产量(Y[ii])(图5A)来评价处理的效果。还评价了总鲜重(图5B)和发芽重量(图5C)。该结果还表明，在种植前浸泡在基于兼养小球藻的组合物中的种子发芽率增加40％(图5D)。此外，与浸泡在自来水中的种子相比，浸泡在基于兼养小球藻的组合物中的种子发芽更早，以及与用具有重径流的80mMol盐溶液掺水的种子相比，用RO水掺水至完全饱和的种子萌发降低(图5E)。
实施例19
进行实验来确定施加低浓度的基于兼养小球藻的组合物(PT)至在播种时间进行干旱胁迫的植物是否影响了植物的产量。条件是(1)对照：外部加热但是饱和，(2)无水+外部加热，3)无水+外部加热+1小时日照。实验结果表明，当暴露于干旱和日光时，用PT处理的植物没有显示有害效果，然而未用PT处理的植物对干旱和阳光做出反应。
实施例20
进行实验以确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物(在图例中称为“PhycoTerra”或“PT”)至草皮(turf)是否影响植物的产量。在该实验中，在6种不同浓度下连同尿素一起，将组合物施加到草坪草(turfgrass)。浓度范围为0.3-15升/英亩，以14或21天的时间间隔对草皮进行处理。这些处理与给予以下各项的草皮样品进行比较：(1)没有处理(UTC)(2)Acadian(海藻提取物组合物)和2)仅尿素。实验结果示于图6。发芽重量显示对以下处理做出显著的反应：施用速率15L英亩，间隔14天，发现与未处理的对照(UTC)相比较，发芽重量是＜30％更高，以及与施用Acadian，21天施用间隔所实现的结果相比较，所有施用速率产生显著更高的发芽重量。
实施例21
进行实验以确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物(PT)至花生是否影响植物的产量。在该实验中，在5种不同的浓度下施用组合物。这些处理与未处理(UTC)的植物相比，以及与用Acadian(一种海藻提取物的组合物)处理的植物相比。在实验中，测试植物周围的土壤的pH和腐植酸。如本领域中已知的，土壤pH范围为5.5-6.5对于花生是理想的。腐植酸是土壤中分解的指示物。实验表明，给予75.7mL/加仑-300mL/加仑的PT，地块重量显著增加，给予300毫升/加仑的PT，种子重量同样显著增加。实验结果显示在以下表78和图7中。
表78
实施例22
进行实验以确定施用低浓度的基于兼养小球藻的组合物至罗勒属(Basil)植物是否影响植物的产量。在该实验中，在施用商业水培肥料之后/另外地，施用该组合物。该处理与单独的肥料(作为对照)进行比较。在这些实验中，根据茎直径和植物鲜重的测量值将暴露于该处理的植物，和暴露于对照的其他植物进行比较。尽管在该处理和对照之间茎直径没有显示显著差异，鲜重的测量的确表明该组合物对植物生长具有正面影响(与单独的肥料相比)。
实施例23-蝶形花科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至蝶形花科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将组合物施用至植物的叶。结果是对于适当的植物特性的测量包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属应胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特征至少10％定量的改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量的改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例24-禾本科(Poaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至禾本科的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将组合物施用至土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物的施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特性至少10％的定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例25-蔷薇科(Roasaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至蔷薇科的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤，(c)发芽后将所述的组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特性至少10％定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例26-葡萄科
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至葡萄科的作物的效果。施用与如在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤，(c)发芽后所述的组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属应胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特性至少10％定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例27-芸苔科(Brassicaeae)(十字花科，Cruciferae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至芸苔科(Brassicaeae)(十字花科，Cruciferae)的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地施用所述组合物至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下，对于至少一个特性至少10％定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例28-番木瓜科(Caricaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至番木瓜科(Caricaceae)的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将所述的组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用于土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特征至少10％定量改善。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例29-锦葵科(Malvaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至锦葵科的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)在发芽前将组合物施用到土壤，；(c)在发芽后将组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特征至少10％定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例30-无患子科(Sapindaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至无患子科的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用至土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特征至少10％定量改进。在一些实施例中，结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例31-漆树科(Anacardiaceae)
进行实验以测试施用基于微藻的组合物至漆树科的作物的效果。施用与在本文中的其它实施例一样，从而，在各种处理中，(a)在所述组合物中润湿或浸泡种子；(b)发芽前将组合物施用到土壤；(c)发芽后将组合物施用于土壤；(d)在生长季节定期地将所述组合物施用于土壤；和/或(e)在生长季节一次性或定期地将该组合物施用于植物的叶子。结果是对于适当的植物特性的测量，包括：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，和晒伤。结果显示在所述组合物施用(a-e)的至少一个模式下对于至少一个特征的至少10％定量改进。在一些实施例中，在结果显示至少一个特性的至少25％定量改进和/或至少两个特性的统计显著改善。
实施例32
进行实验以测试不同批次的低浓度的基于兼养小球藻的组合物之间细菌群体的变化(PT Brown，PT Field，PT Fresh，PT Hydro，PT New和PT Texas)。在所有批次中，主要的分类包括类芽孢杆菌(Paenibacillus)，芽孢杆菌(Bacillus)，乳杆菌(Lactobacillus)，和短芽孢杆菌(Brevibacillus)。已知类芽孢杆菌和芽孢杆菌在植物根际分泌许多有益化合物(植物激素，含氮化合物，抗生素)。还已知，它们减轻病原体。乳杆菌是在青贮饲料的农业实践中使用的产生发酵乳酸的细菌。短芽孢杆菌很少认为是促进普通植物生长的属种，然而，一些文献显示它们从根际沥滤重金属的能力。虽然批次之间存在每个细菌种群的一些定量差异，这四个孢子形成细菌分类是主要的。相信该组合物经过巴氏杀菌处理差异性地抑制其它的非孢子形成的分类(其被发现是存在的，但是明显更低的量)。
实施例33
进行实验以测试在不同贮藏温度下基于微藻小球藻的组合物的批次变化的稳定性。在不同温度(2-5℃，35℃或40℃)下每月测试样品，持续6个月。确定细菌计数以及总氮，磷，和钾的水平。实验结果表明，在不同的条件下，细菌计数变化但营养物水平保持基本稳定。
实施例34
进行实验以测试基于微藻小球藻的组合物(PT)的不同制备方法。小球藻能够是异养的(消耗外部碳源)，光养的(光合作用将CO2转化成可用的碳源)，以及兼养的(同时地，接收通过光合作用产生的营养物/碳和消耗可用外部碳源)。在两种不同的碳源(乙酸或葡萄糖)上饲养的纯异养小球藻的组合物，与光养小球藻和兼养小球藻(也分两批生长，各自在作为碳源的乙酸或葡萄糖上喂养)比较。实验结果示于图8。当施用于植物时，相比于其它培养物，兼养培养物生长最快，而且还表现出更好的结果。
实施例35
在兼养培养小球藻(对于施用于植物的组合物的所描述的制备方法)的一个非限制性实施例中，在开放培养容器中在BG-11培养基或衍生自BG-11培养基的介质(例如，其中将另外的组分加入介质和/或相比于未修改的BG-11介质，介质的一个或多个元素增加5％，10％，15％，20％，25％，33％，50％或更多)中培养小球藻7-14天。温度范围可以是从20-30℃，或更高，pH为6.5-8.5。溶解的氧浓度可为0.1-4mg L。培养物接收乙酸或乙酸盐作为有机碳源，将碳作为能源提供给小球藻细胞并调节pH，并且通过pH加速稳定系统(pHauxostat system)提供给在具有10-90％范围的浓度的进料中培养物。培养接收自然太阳光(包括光合有效辐射)作为能量源。混合是通过空气喷射通过空气管(aerotube)，通过浸没在液体培养物中的推进器的流体推进来提供的。可替代的有机碳源可以包括，例如，以下任一种：亚油酸铵，阿拉伯糖，精氨酸，天冬氨酸，丁酸，纤维素，柠檬酸，乙醇，果糖，脂肪酸，半乳糖，葡萄糖，甘油，甘氨酸，乳酸，乳糖，马来酸，麦芽糖，甘露糖，甲醇，糖蜜，蛋白胨，基于植物的水解液，脯氨酸，丙酸，核糖，蔗糖(Sacchrose)，淀粉的部分或完全水解产物，蔗糖(sucrose)，酒石酸，TCA循环有机酸，酒糟水，尿素，工业废液，酵母提取物，前述的任何组合，或其它的有机碳源
实施例36
在实施例40中描述的实施方案的替代实施方案中，通风装置(aerator)可用于代替喷射器和浸没的推进器来提供注入气体(例如，氧气)进入含水微藻培养物，以及紊流混合微藻培养物。用于代替喷射器和浸没的推进器的组合的通风装置的一个非限制性实施例是系列275 Aspirator Aerator(Aeration Industries International，Chaska，MN，USA)。这些通风装置包括安装在以一定角度从培养基表面上方延伸到培养物中的浮动的空心轴上的培养基表面上方的电机驱动，以及设置在浸没在培养基中的轴的端部的螺旋桨。马达连接并驱动轴和螺旋桨。螺旋桨推动水培养基经过在所述轴端部的扩散器以引起空心轴中的压力差，抽吸空气通过培养基表面上方轴中的入口孔向下穿过旋转空心轴和扩散器进入微藻培养物。当通风装置造成湍流混合和注入氧气，前述提供营养物，提供有机碳，和控制pH的装置和方法可与这样的通风装置结合使用。
实施例37
在制备具有施用于植物的基于兼养小球藻的组合物的液体组合物的一个非限制性实施例中，在离心培养物之前，首先将从培养系统收获的基于兼养小球藻的组合物保持在收获罐中。兼养小球藻培养物离心后，离心排出富含兼养小球藻全细胞固体，还含有伴随的来自培养基的成分的部分，进入容器中(在约30℃温度下)。基于兼养小球藻的组合物在制备液体组合物的过程中可以继续(即，新鲜的)或被存储在冷冻室并且在稍后的时间解冻(即，存储的)来处理成液体组合物。当基于兼养小球藻的组合物在冰箱中贮存时，存储温度为约-10℃并且需要约1-2天来冷冻组合物。当从冷冻装置中取出后，将存储的基于兼养小球藻的组合物放置在外面解冻约7天。新鲜的或存储的基于兼养小球藻的组合物然后置于罐中，并且加热至约60℃温度约2小时以开始巴氏消毒过程。然后，将基于兼养小球藻的组合物稀释至全细胞固体浓度约10-11％(重量)，并且冷却至约40℃以完成巴氏灭菌过程。通过混合用于稳定目的有效量的磷酸，基于兼养小球藻的组合物的pH然后调节至pH值约4。然后将约0.3％的山梨酸钾与基于兼养小球藻的组合物混合用于稳定目的。所得液体组合物然后转移到所需尺寸的容器中存储在3-5℃下，直至运送。
实施例38
在巴氏消毒前后，用QPCR(定量聚合酶链式反应)分析在兼养小球藻培养物中的细菌群体，观察到巴氏杀菌之后培养物中细菌曲线改变。具体地，巴氏杀菌后细菌曲线包括高比例的孢子形成细菌，并且包括，但不限于，假芽孢杆菌属，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，乳杆菌属，和短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp)作为主要细菌类型。比较巴氏消毒前后兼养小球藻培养物的需氧平板计数，还观察到，巴氏灭菌后培养物中细菌总数更低。使用兼养小球藻的培养物，对于时间15，30，60，120，180和360分钟，50，6-0，70，80和90℃，测试巴氏灭菌过程的温度和时间的组合，所得的需氧平板计数为7.58×106CFU至低至1.74×103CFU。还显示存储温度以改变兼养小球藻的巴氏灭菌培养物的细菌曲线(使用存储在温度为2-4℃，25℃和40℃的样品，随着时间改变需氧平板计数数量和主要菌种的类型)。
虽然在从所述培养物中收获后兼养小球藻细胞是完整的和有活力的(即，物理上适合生存，能够进一步生长或细胞分裂)，从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞被证实具有完整的细胞壁但不具有活力。在显微镜下观察从巴氏灭菌过程得到的兼养小球藻细胞，以确定在经历加热和冷却过程之后细胞壁的情况，并且目测证实小球藻细胞壁是完整的，没有破开。为了进一步研究细胞的状态，将活的兼养小球藻细胞培养物和从巴氏灭菌法得到的兼养小球藻细胞进行碘化丙啶处理，它是一种排除荧光染料(exclusion florescentdye)，其标记DNA，如果细胞膜受损，在显微镜下目测比较。碘化丙锭比较表明从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞包含大量的染色的DNA，从而得出结论是兼养小球藻细胞壁是完整的，但细胞膜受损。因此，巴氏灭菌的小球藻细胞的渗透性不同于具有完整的细胞壁和细胞膜的小球藻细胞的渗透性。
此外，对活的兼养小球藻细胞的培养物和从巴氏灭菌法得到的兼养小球藻细胞进行DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)-DNA结合荧光染料处理，在显微镜下目测比较。DAPI-DNA结合染料比较表明从巴氏灭菌过程得到的小球藻细胞在细胞中包含大大减小的量有活力的DNA，得出结论，表明巴氏灭菌以后所述兼养小球藻细胞不具有活力。两个DNA染色比较表明巴氏消毒过程已经通过改变以下各项从天然状态改变了小球藻细胞的结构和功能：细胞从有活力至无活力，细胞膜的状态，和细胞的渗透性。
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Claims (26)
1.一种植物增强的方法，包括对植物进行包括小球藻(Chlorella)培养物的液体组合物处理，所述组合物包含完全巴氏灭菌的小球藻细胞，其中施用所述组合物的浓度范围为按重量计0.003-0.080％固体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小球藻细胞在50-80℃之间巴氏杀菌15-360分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在55-65℃下，所述小球藻细胞在浓度大于按重量计11％的小球藻的培养物中进行巴氏灭菌90-150分钟，并且其中，然后将所述培养物稀释到按重量计10-11％的小球藻，并且冷却至35-45℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将巴氏消毒的培养物的pH值调节至3.5-4.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在兼养条件下培养所述小球藻细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，所述性兼养条件包括在温度为20-30℃、pH 6.5-8.5、溶解氧浓度可以为0.1-4mg L下，在合适的培养基中培养小球藻细胞7-14天。
7.根据权利要求5所述的方法，其中在非无菌兼养条件下培养所述小球藻细胞，并且其中至少一种孢子形成细菌存在于所述非无菌培养物中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌选自类芽孢杆菌属(paenibacillussp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、乳杆菌属(lactobacillus sp.)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用选自：在种植前将种子浸泡在组合物中；使紧邻种植的种子附近的土壤与有效量的组合物接触；以水培的方式使植物的根部与有效量的组合物接触溶液；在出苗后使有效量的组合物接触植物的可接近部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中以10-150加仑/英亩的速率将所述液体组合物施用至土壤或土壤中的出苗植物。
11.根据权利要求9所述的方法，其中将种子浸泡90-150分钟。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体组合物处理包括按重量计0.008-0.080％固体的完全巴氏灭菌的小球藻细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中通过喷雾给予所述液体组合物。
14.根据权利要求1所述所述的方法，其中每3-28天给予所述液体组合物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中每4-10天给予所述液体组合物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中首先在出苗后5-14天施用所述液体组合物。
17.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自以下的系统将所述液体组合物施用于土壤：低容量灌溉系统、土壤浇灌应用、飞机喷洒系统。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是选自以下各项的植物家族的成员：茄科(Solanaceae)、蝶形花科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(蔷薇科)、葡萄科(Vitaceae)、芸苔科(Brassicaeae)(Cruciferae(十字花科))、番木瓜科(Caricaceae)、锦葵科(Malvaceae)、无患子科(Sapindaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、芸香科(Rutaceae)、桑科(Moraceae)、旋花科(Convolvulaceae)、薄荷科(Lamiaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))、伞形科(Apiaceae)(伞形科(Umbelliferae))、五加科(Araliaceae)、木犀科(Oleaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃(Actinidaceae)、仙人掌(Cactaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、蓼科(Polygonaceae)、山茶科(Theaceae)、玉蕊(Lecythidaceae)、茜草科(Rubiaceae)、罂粟科(Papveraceae)、八角科(Illiciaceae)茶藨子科(Grossulariaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桦木科(Bertulaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、天门冬科(Asparagaceae)(百合科(Liliaceae))、葱科(Alliaceae)(百合科(Liliceae))、凤梨科(Bromeliaceae)、姜科(Zingieraceae)、芭蕉科(Muscaceae)、棕榈科(Areaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、肉豆蔻科(Myristicaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、樟科(lauraceae)、胡椒科(Piperaceae)、和龙眼科(Proteaceae)。
19.根据权利要求1的方法，其中所述全小球藻细胞没有经过干燥过程。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体组合物处理进一步包括适用于植物的至少一种培养稳定剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述培养稳定剂选自：山梨酸钾，磷酸，抗坏血酸，苯甲酸钠，以及它们的任何组合。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体组合物处理不包含除了全小球藻细胞的培养之外，用于增强出苗和成熟的活性成分。
23.根据权利要求1所述的方法，其中通过将处理的植物与基本相同的未处理植物比较来确定增强，并且其中针对至少一种植物特性观察到至少10％的可量化的差异。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述植物特征选自：种子发芽率，种子发芽时间，出苗，出苗时间，苗大小，植物鲜重，植物干重，利用率，果实产生，叶产生，叶形成，茅草高度，植物健康情况，植物抗盐胁迫性，植物抗热胁迫性，植物抗重金属胁迫性，植物抗旱性，成熟时间，产量，根长，根质量，颜色，虫蛀，蒂腐病，柔软，果实品质，和晒伤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述特性是出苗，并且其中相比于未处理植物的基本上相同的群体，从土壤出苗的植物数增加至少10％。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述特征是通过叶形成的成熟，并且其中相比于未处理植物的基本上相同的群体，通过叶形成显示成熟的植物数增加至少10％。
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