CN104450584B - 放线菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株能够产生与宿主植物雷公藤一样的次生代谢物(雷公藤吉碱)的雷公藤内生放线菌，还涉及此株放线菌的特殊的两步培养方法。该菌株已于2014年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 9284。

Description

放线菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物及其应用领域，尤其是一种放线菌及其应用。
背景技术
植物次生代谢产物在植物适应环境中起到了巨大的作用，同时也是人类医药、农药、香料、染料和食物添加剂等的重要来源。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是一种生长在中国东南部，韩国，日本和台湾的木本植物。在中国，其作为治疗发烧、咳嗽、炎症等疾病的一种传统中药已经有很久远的历史了。生物化学分析表明，雷公藤中含有多种生物活性物质，具有很大的研究意义和利用价值。其中的倍半萜吡啶类生物碱具有很强的杀虫活性和药用活性。但是，雷公藤植物资源的匮乏以及天然植株内的吉碱合成量过低，使这种生物碱很难为人类所利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种放线菌，该放线菌的分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年6月9日，保藏编号：CGMCC9284，并通过两步微生物发酵法获得了通过CGMCC9284生产雷公藤吉碱的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种放线菌，该放线菌的名称为链霉菌，Streptomyces sp.，该放线菌的保藏编号为CGMCC 9284。
所述的放线菌用于制备雷公藤吉碱的应用。
具体的，将所述的放线菌用于制备雷公藤吉碱的方法包括：
步骤一：将所述的放线菌采用生长培养基进行扩大发酵；
所述的生长培养基的配方为：
黄豆粉：15g、
蛋白胨：5g、
葡萄糖：20g、
MgSO4·7H2O：0.05g、
NaCl：2g、
KH2PO4：1g、
CaCO3：2g、
(NH4)2SO4：2.5g、
可溶性淀粉：10g及蒸馏水1000mL；
步骤二：将步骤一中的扩大发酵后的放线菌于生产培养基中进行生产发酵；
所述的生产培养基的配方为：
酵母膏：4g、
麦芽汁：10g、
葡萄糖：4g及蒸馏水1000mL。
更进一步的，向所述的生产培养基中加入水杨酸或甲基水杨酸。
具体的，所述的水杨酸或甲基水杨酸在生产培养基中的浓度为100μM～10mM。
再进一步的，将所述的放线菌用于制备雷公藤吉碱的方法还包括对生产发酵后的放线菌菌丝进行雷公藤吉碱提取，雷公藤吉碱的提取方法为将生产发酵后的液体进行离心收集菌体，将收集后的菌体通过乙酸乙酯进行浸提后得到雷公藤吉碱。
本发明的优点在于：
(1)本发明所述的放线菌的名称为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏编号为CGMCC9284，是在雷公藤根部新分离得到的菌种，且已经在中国微生物保藏中心进行保存；
(2)本发明分离得到的放线菌能进行雷公藤吉碱的发酵生产；
(3)通过两步发酵法对本放线菌进行雷公藤吉碱生产的方法进行摸索，得到了能通过CGMCC9284发酵进行大量生产雷公藤吉碱的工艺。
附图说明
图1为菌株F4-20与不同的链霉菌属菌株之间的系统进化树图；
图2为CGMCC9284菌丝提取物的液相色谱图；
图3为雷公藤吉碱标准品的液相色谱图；
图4为CGMCC9284菌丝提取物的质谱图；
图5为雷公藤吉碱标准品的质谱图；
以下结合附图和具体实施方式对本发明进行具体说明。
具体实施方式
为解决现有技术的缺陷，发明人想到利用微生物作为生物碱的工业化生产材料。微生物作为工业化生产材料具有生长速度快，培养成本低的优点。植物内生微生物可以产生与宿主植物一样结构的次生代谢物，这为通过微生物生产雷公藤生物碱提供了可能。
通过筛选和鉴定，发明人获得了一株能够产生雷公藤吉碱的雷公藤内生放线菌CGMCC9284，该放线菌的分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年6月9日，保藏编号：CGMCC9284，并通过两步微生物发酵法获得了通过CGMCC9284生产雷公藤吉碱的方法。
通常植物内生菌产生的次生代谢物的含量都较小，为了能够提高CGMCC9284生产雷公藤吉碱的产量，发明人选用了一种两步培养法。在CGMCC9284菌株培养过程中发现，该菌株在某些培养基中的生长极为迅速但是生产的雷公藤吉碱的含量却几乎为零；当把此菌株换至麦芽膏-酵母膏培养基(ISP-2)中培养时，虽然菌丝生长缓慢但是雷公藤吉碱的含量却很高。因此，为了降低工业化生产的成本，提高雷公藤吉碱的产量，发明人采用了一种两步培养法。
CGMCC9284的分离方法
从雷公藤(Tripterygium wilfordii)新鲜植株中分离潜在雷公藤生物碱产生菌，其分离方法是：挑选无可见病斑的野生雷公藤(3年生)根、茎、叶，放入自封袋中，带回实验室4℃保存，3天之内进行分离。用自来水将无病斑的植物样品冲洗30min，叶直接摘下，将茎和根切成40mm长的小段，根部样品在超声清洗仪中清洗1min；无菌条件下进行以下操作：先用75％乙醇溶液浸泡样品5min，然后用有效氯含量为3.125％的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用75％的乙醇浸泡1 min，消毒后的植物样品在无菌水中冲洗3遍，用无菌滤纸吸干表面的液体，表面消毒后，剪去根和茎的两端，将木质部和韧皮部分开，弃去木质部，将韧皮部和叶片切成10mm×10mm的小段，用无菌手术刀片将组织块划伤，转移到改良HVA培养基上，有伤口的一面朝向培养基，每个平板接5-6片组织块，平板上做相应的标记，在光周期L:D＝12:12的条件下培养15d，光周期26℃，暗周期20℃；之后，菌株采用划线法进行纯化，直到镜检菌株为纯培养物，斜面保藏于4℃冰箱。
本发明所用的改良HVA培养基为：腐殖酸0.1g，CaCO30.02g，Na2HPO40.5g，MgSO47H200.5g，KCl 1.7g，FeSO47H200.01g，核黄素0.5mg，硫胺素0.5mg，维生素B60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇0.5mg，泛酸0.5mg，生物素0.25mg，对-氨基苯甲酸0.5mg，琼脂18g，pH7.2，萘啶酸，制霉菌素，用雷公藤煎汁将上述物质溶解定容至1L，该培养基中含萘啶酸15ug/mL，含制霉菌素50 ug/mL。
雷公藤煎汁为将10g雷公藤植物样品用蒸馏水熬制成的汁液。
CGMCC9284菌株的鉴定：
本发明放线菌CGMCC9284的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA的序列和菌种分类情况如下：
参见表1：CGMCC9284菌株在不同培养基上基质菌丝生长旺盛，气生菌丝均不发达，均无可溶性色素产生；菌落生长速度较慢，平均扩展为0.05～0.1mm/d。
参见表2：CGMCC9284能使淀粉水解，能产生硫化氢，不能使牛奶凝固和胨化，不能使明胶液化，不能产生硝酸还原酶，也不能产生纤维素酶；能利用葡萄糖、甘露糖、海藻糖、甘油、丙二酸钠、乙酸钠、鼠李糖、阿拉伯糖、乳糖等10种碳源；能利用苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等4种氮源。
表1.菌株F4-20在9种形态培养基上的培养特征
表2.菌株F4-20的生理生化特性测定
结合图1，通过对菌株CGMCC9284的16S rRNA基因的克隆和同源性分析得出，菌株CGMCC9284与链霉菌属有很大的同源性，其中与Streptomyces blastmyceticus strainNRRL B-5480(GenBank accession no.NR_043357)的相似度达到了98％。综合上述结果，我们将分离得到的此株雷公藤内生菌命名为链霉菌(Streptomyces sp.)。
实施例一：CGMCC9284菌株两步发酵获得雷公藤吉碱的方法
步骤一：种子液是将放线菌孢子悬浮液加入到生长培养基中，150～170r/min，25～27℃，培养36h后得到；按照生产培养基配方，配制培养液80L，加入到100L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30min，冷却后将种子液按照1％(v/v)的接种量接种于发酵罐中，搅拌转速为130～150 r/min，25℃培养5d。生长培养基配方为：黄豆粉15g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.05g，NaCl 2g，KH2PO41g，CaCO32g，(NH4)2SO42.5g，可溶性淀粉10g，蒸馏水1000mL；
步骤二：对上述发酵产物进行过滤，向滤液发酵罐中继续加入生产培养基ISP-280L，130～150 r/min，27℃培养3.5d，之后向培养基中加入终浓度为1 mM的水杨酸，刺激内生菌内次生代谢物的生物合成，将搅拌转速调节为150～170r/min继续发酵4.5d。生产培养基(ISP-2)配方为：酵母膏4g，麦芽汁10g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL；
菌丝提取物的分离提取方法为将发酵产物离心，收集菌体，并冷冻干燥处理，称取干菌丝体于容器中，并用一定量的乙酸乙酯超声提取3次，每次间隔5min，合并提取液，减压蒸发溶剂，即得胞内代谢物含有雷公藤吉碱的干样。
对实施例三中的发酵目标产物的进行结构鉴定：经过LCMSMS(液相色谱质谱测定法)，色谱条件为：
Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18column(250mm×4.6mm,3.5μm粒径)；
梯度洗脱程序为：20min内，乙腈浓度由5％线性升至75％，维持10min后在5min内线性降回5％，最后平衡5min；
系统运行温度为25℃，流速0.4mL/min，进样体积10μL；
LC-MS条件为：ESI喷雾电压，4kV；屏蔽气流速，70arb；毛细管气流速，20arb；毛细管电压，-38V；毛细管温度350℃；滤镜电压，95V，一级质谱(MS1)扫描范围选择m/z100-1000。
结合附图2、3、4和5对实施例三中的发酵产物进行鉴定分析，植物内生菌CGMCC9284能够产生化合物——雷公藤吉碱。
结合附图2和3，图2是实施例三中菌丝提取物的液相色谱图，图3是雷公藤吉碱标准品液相色谱图，色谱图中色谱峰m/z840是雷公藤吉碱最为丰富的子离子片段，菌丝提取物的色谱图上出现了与标准品雷公藤吉碱同样位置的色谱峰。
结合附图4和5，而对吉碱的分子离子峰的单离子监测结果显示，菌丝提取物和标准品的质谱图在关键的片段峰处都保持一致。
通过外标法定量，菌株CGMCC9284合成的雷公藤吉碱量约为宿主植物的八分之一。

Claims (2)

1.放线菌用于制备雷公藤吉碱的应用，该放线菌的名称为链霉菌，Streptomyces sp.，该放线菌的保藏编号为CGMCC 9284，该放线菌能进行雷公藤吉碱的大量发酵生产,其特征在于：
将所述的放线菌用于制备雷公藤吉碱的方法包括：
步骤一：将所述的放线菌采用生长培养基进行扩大发酵；
所述的生长培养基的配方为：黄豆粉：15g、蛋白胨：5g、葡萄糖：20g、
MgSO4·7H2O：0.05g、NaCl：2g、KH2PO4：1g、CaCO3：2g、(NH4)2SO4：2.5g、可溶性淀粉：10g及蒸馏水1000mL；
步骤二：将步骤一中的扩大发酵后的放线菌于生产培养基中进行生产发酵；
所述的生产培养基的配方为：酵母膏：4g、麦芽汁：10g、葡萄糖：4g及蒸馏水1000mL；
向所述的生产培养基中加入水杨酸；
所述的水杨酸在生产培养基中的浓度为1mM。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述的放线菌用于制备雷公藤吉碱的方法还包括对生产发酵后的放线菌菌丝进行雷公藤吉碱提取，雷公藤吉碱的提取方法为将生产发酵后的液体进行离心收集菌体，将收集后的菌体通过乙酸乙酯进行浸提后得到雷公藤吉碱。
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