CN114317327B - 一种可表达乳糖酶的弧菌属菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，公开了一种可表达乳糖酶的弧菌属菌株，该菌株为弧菌属菌株（Vibrio sp），菌株编号BHNC007003，保藏日期为2021年10月11日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211248。本发明的弧菌属菌株（Vibrio sp）从海水中筛选获得。所筛选获得的弧菌属菌株（Vibrio sp）所产的乳糖酶对酶活性适应温度和pH范围较广，在工业生产中有较大的优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体讲是一种可表达乳糖酶的弧菌属菌株。
背景技术
弧菌属菌株（Vibrio sp）是不产孢子的短杆菌，形状短小，约0.5×(1～5)微米，因弯曲如弧而得名。分散排列，偶尔互相连接成S状或螺旋状。革兰氏染色阴性，菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞，无荚膜。是一种化能有机营养菌，既是呼吸型又是发酵型代谢。碳水化合物类的代谢发酵有混杂的产物而无CO2或H2。见于淡水和海水，以及人或动物的消化道中。
而其所产的乳糖酶的工业生产方法主要是微生物发酵法，目前只有来源于微生物的乳糖酶有工业应用价值，在工业上主要用于乳制品工业。利用其水解作用分解乳制品中的乳糖，生产低乳糖或无乳糖乳制品，供乳糖不耐受的广大人群食用。而不同微生物来源的乳糖酶的性质差别较大。这些不同来源的乳糖酶分解乳糖的活性受pH值和温度的影响。因此筛选出一种能表达出温度范围广、拥有高活性的乳糖酶的菌株对工业化生产具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种能产出适应pH值及温度范围广，高活性的乳糖酶的弧菌属菌株。
本发明的技术解决方案如下：一种可表达乳糖酶的弧菌属菌株，该菌株为弧菌属菌株（Vibrio sp），菌株编号BHNC007003，保藏日期为2021年10月11日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20211248。
其表达乳糖酶酶活力适应温度范围为25-45℃。
其表达乳糖酶最适的酶反应温度为33℃。
其表达乳糖酶酶活力适应pH值范围为4.0-8.0
其表达乳糖酶在pH 6.0时的酶活力最高。
其核苷酸测序序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的有益效果是：本发明的弧菌属菌株（Vibrio sp）从海水中筛选获得。所筛选获得的弧菌属菌株（Vibrio sp）所产的乳糖酶对酶活性适应温度和pH范围较广，在工业生产中有较大的优势。
本发明的弧菌属菌株（Vibrio sp）保藏日期2021年10月11日、保藏单位中国典型培养物保藏中心（CCTCC）和保藏编号CCTCC NO：M 20211248。
附图说明
图1为本发明弧菌属菌株（Vibrio sp）的系统发育树；
图2为温度对本发明弧菌属菌株（Vibrio sp）表达的乳糖酶酶活性影响的结果图；
图3为pH对本发明弧菌属菌株（Vibrio sp）表达的乳糖酶酶活性影响的结果图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例1
一、菌株培养、鉴定及构建系统发育树
1、菌株培养
LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂20g/L，纯水配制，添加20mg/ml X-gal。
YPD培养基（选择性培养基）：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，纯水配制，添加20mg/ml X-gal。
LB深孔板：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，纯水配制。
采样：从海南采集一些海水和沙土样本，并将采集到样本逐一进行培养，分别涂布于LB和YPD平板培养基中，对应的平板分别编号，贴上封口膜，将平板置于30℃恒温倒置培养48h，之后平板上挑出了显蓝色单菌落，将挑出的单菌落分别接到LB摇瓶中，置于震荡培养箱培养，培养条件为30℃，避光，转速为245r/min。培养24h后，取样，添加50%甘油保存于-80℃冰箱。分别取培养24h，48h，72h的菌液，测定酶活。
、菌株鉴定
对该菌株进行16S rDNA的PCR扩增鉴定，具体步骤如下：
1）PCR扩增：通用引物515F和806R进行PCR扩增，其中，
引物515F序列为：5′- GTGYCAGCMGCCGCGGTAA -3′；
引物806R序列为：5′- GGACTACNVGGGTWTCTAAT -3′。
PCR反应体系为：25×TAQ酶5μL，515F引物2μL，806R引物2μL，菌液模板5μL，无菌水16μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94变性30s，49℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min，4℃终止反应。
2）凝胶电泳及PCR产物柱回收：PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)对目的PCR产物进行回收纯化，进行16S rRNA测序。
对所测得的16S rDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行相似性比对。
比对结果：该菌株BHNC007003为弧菌属菌株（Vibrio sp）的菌株。
、构建菌株BHNC007003的系统发育树
获得菌株BHNC007003的16S rDNA后，用MEGA 4软件（Neighbor-Joining）构建该菌株的系统发育树（见图1），分析各菌株的进化关系。
分析结果：菌株BHNC007003为弧菌属菌株（Vibrio sp）的菌株。
二、菌株保藏
本发明筛选得到的弧菌属菌株，分类命名为弧菌属菌株（Vibrio sp），菌株编号BHNC007003，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211248，保藏日期为2021年10月11日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国.武汉.武汉大学。
三、关于乳糖酶酶活力的最适温度
酶活力单位的定义：一个酶活单位（NLU）定义为在反应条件下释放1.30 μmol/min的邻硝基苯酚所需的酶量。
酶活测定方法：邻硝基苯酚β-D半乳糖苷（ONPG）溶于P-E-M缓冲液中（pH值为6.5）配制成质量分数为0.25％的底物溶液。取5ml底物溶液加入1ml酶液中，30℃保温10min。加入2mL碳酸钠溶液显色，测定420nm光吸收值。计算水解产物邻硝基酚（ONPG）的含量和酶活性。
在pH值为5.5条件下，分别在不同温度（20℃、25℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、50℃、60℃）下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，此乳糖酶的适应温度范围较广，在25-45℃之间相对酶活都在75%以上，最适的酶反应温度为33℃。
可见，本发明筛选得到的菌株BHNC007003其所产的乳糖酶酶具有较广的适应温度范围，菌株BHNC007003工业中具有一定的优势。
四、关于乳糖酶酶活力的最适PH.
取酶液分别用pH为（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、6.8、 7.0、7.2、7.5、8.0）的缓冲液稀释，测定酶活力，相对酶活力变化曲线如图3所示，乳糖酶在pH 6.0时的酶活力最高，pH适用范围为4.0-8.0。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
序列表
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Claims (1)
1.一种可表达乳糖酶的弧菌属菌株，其特征在于：该菌株为弧菌属菌株（Vibrio sp.），保藏日期为2021年10月11日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 20211248。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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