CN114214209A - 一株可产乳糖酶的裂褶菌变种及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株可产乳糖酶的裂褶菌变种(Schizophyllum commune)，所述裂褶菌变种菌株于2021年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉，保藏编号为CCTCC No：M20211407。本发明还提供了一株裂褶菌变种在表达乳糖酶中的应用，本发明中的裂褶菌变种易培养，由裂褶菌变种生产表达的乳糖酶酶活温度和酶活PH值适应范围广，活性较高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一株可产乳糖酶的裂褶菌变种及其应用。
背景技术
乳糖酶(lactase)，学名β-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶，是一种白色粉末，无特异性气味。乳糖酶通过特定条件催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解，将人体内过多的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被肠道吸收。目前乳糖酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶，如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产乳糖酶均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。
裂褶菌(Schizophyllum commune)裂褶菌菌丝体白色，绒毛状，气生菌丝较旺。菌丝有间隔，有分枝，锁状联合明显。菌丝粗细不均，直径1.25～7.5μm。子实体白至灰白色，菌盖直径0.5～4.5cm，质韧，菌盖表面密被绒毛，扇形或肾形，边缘内卷，常掌状开裂。菌肉薄，白色或淡黄色。菌褶窄，线状，从基部辐射状而出，不均匀、不等长，白色或灰白色，沿边缘纵裂而反卷，菌柄短或无。孢子印白色。孢子无色、圆柱状，(5～5.5)μm*(1.5～2.5)μm。其隶属于真菌界，担子菌纲，伞菌目，裂褶菌属(Schizophyllum),是一种具有高食药用价值的真菌。现有技术中较少存在有关裂褶菌能够表达乳糖酶研究的报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一株可产乳糖酶的裂褶菌变种(Schizophyllum commune)，所述裂褶菌变种菌株于2021年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉，保藏编号为CCTCC No：M20211407。
可选地，所述裂褶菌变种DNA序列为SEQ ID NO.1。
可选地，所述裂褶菌变种是从海南文昌市高隆港海域(E110.811471,N19.508358)的海水中分离得到的。
本发明要解决的技术问题之二是提供一株裂褶菌变种在表达乳糖酶中的应用。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为20-35℃。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为25-33℃。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度为20℃、25℃、30℃、33℃或35℃。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为4.0-7.5。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为4.5-6.0。
可选地，所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明分离和鉴定了一株可产乳糖酶的裂褶菌变种(Schizophyllumcommune)，更具体的为本发明鉴定了一株可产乳糖酶的裂褶菌海南变种。通过基因组序列分析和构建系统发育树，确定该菌株为裂褶菌。
2、与现有技术相比，本发明中的裂褶菌变种易培养，由裂褶菌变种生产表达的乳糖酶酶活温度和酶活PH值适应范围广，活性较高。
附图说明
图1为本发明实施例1中菌株FNHB007001的菌落图；
图2为本发明实施例2中菌株FHNB007001的Pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例2中菌株FHNB007001的系统发育树；
图4为本发明实施例4中乳糖酶在不同PH值下酶活的影响图；
图5为本发明实施例3中乳糖酶在不同温度下酶活的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1裂褶菌变种(Schizophyllum commune)菌株的获得
1、培养基的配制
PDA培养基：马铃薯洗净去皮，称取200g,加纯水煮烂(煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即煮烂马铃薯)，用八层纱布过滤，加热，再根据实际需求加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20分钟后去除摇匀，冷却到60℃左右，添加20mg/ml X-gal，配制平板，凝固后4℃冰箱贮存备用。
2、菌株的筛选
将从海南文昌市高隆港海域(E110.811471,N19.508358)滩涂采集的一些海水样本搅拌混匀后，取样涂布于PDA平板培养基中，对应的平板分别写上编号，贴上封口膜，30℃倒置培养3-5天，将获得单菌落(如图1)接种于PDA液体培养基中，置于震荡培养箱内避光培养5天(28℃，245rpm/min)。菌丝球轮廓较明显，颜色偏白色。
3.裂褶菌乳糖酶的酶活测定
取一些避光培养5天的菌液，进行离心，取上清液，按照实际需求进行稀释，准备2支试管，吸取2mlONPG底物溶液加入到大试管中，在37℃水浴中平衡5分钟。在零时刻，迅速吸取0.5ml的稀释液加入到样品管中，0.5ml去离子水加入到空白管中，混合，然后立即将试管重新放入水浴锅中反应。经过15min反应后，在所有管中加入2.5ml的10％碳酸钠溶液，迅速混匀，从水浴中移出。从水浴中移出后在样品和空白管中加入20ml的水，然后彻底混匀。分光光度计用水对仪器调零，在420nm，测定样品各管和空白的吸光值并记录数据，计算酶活。
实施例2裂褶菌变种(Schizophyllum commune)菌株的基因序列分析
1.真菌DNA基因组提取
取实施例1得到的菌株培养液，离心后取沉淀加液氮进行充分研磨破碎，选用生工的商品化真菌核酸提取试剂盒进行DNA提取。
2.对该菌株进行ITS的PCR扩增：
PCR扩增：ITS用引物ITS1和ITS2进行PCR扩增。ITS1序列为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS2序列为5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR反应体系为：25×TAQ酶5μL，ITS1引物2μL，ITS2引物2μL，模板5μL，无菌水16μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸7min，4℃终止反应。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(如图2)。观察是否扩增出目的条带。
3.rDNA-ITS测序与分析
利用快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)对目的PCR产物进行回收纯化，将纯化后的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，基因序列如SEQ ID NO：1所示。将测得的序列提交美国NCBI的GENBANK获取相似序列，通过BLAST工具和DNAMAN软件进行对比分析并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树，如图3所示。
通过系统发育树发现该菌株与Schizophyllum commune等具有极高的亲缘性，因此可确定为一株海洋来源的裂褶菌，我们将其命名为Schizophyllum communeFHNB007001。
由上述筛选得到的裂褶菌菌株，命名为裂褶菌菌株(Schizophyllum commune)，菌株编号FHNB007001，其保藏编号为CCTCC M 20211407，保藏日期为2021年11月12日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为武汉，武汉大学。
实施例3裂褶菌变种(Schizophyllum commune)菌株表达的乳糖酶的酶活力最适作用PH
酶活力单位的定义：一个酶活单位(NLU)定义为在反应条件下释放1.30μmol/min的邻硝基苯酚所需的酶量。
酶活测定方法：邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)溶于P-E-M缓冲液中(pH值为6.5)配制成质量分数为0.25％的底物溶液。取5ml底物溶液加入1mlL酶液中，30℃保温10min。加入2mL碳酸钠溶液显色，测定420nm光吸收值。计算水解产物邻硝基酚(ONP)的含量和酶活性。
取酶液分别用pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、6.8、7.0和7.5的缓冲液稀释，测定酶活力，相对酶活力变化如下表所示：
相对酶活力变化曲线如图4所示，乳糖酶在pH 5.5时的酶活力最高，pH适用范围为4.0-7.5。
实施例4裂褶菌表达的乳糖酶的酶活力最适作用温度
在pH值为5.5条件下，分别在20℃、25℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃以及50℃下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化下表所示：
相对酶活力变化曲线如图5所示，此乳糖酶的适应温度范围较广，在20-35℃之间相对酶活都在70％以上，最适的酶反应温度为30℃。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司
<120> 一株可产乳糖酶的裂褶菌变种及其应用
<130> 2021.12.10
<141> 2021-12-10
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctacgaat caacagttca tcttgttctg atcctgtgca ccttatgtag tcccaaagcc 60
ttcacgggcg gcggttgact acgcctacct cacaccttaa agtatgttaa cgaatgtaat 120
catggtcttg acagacccta aaaagttaat acaactttcg acaacggatc tcttggctct 180
cgcatcgata agaacgcagc a 201
Claims (10)
1.一株可产乳糖酶的裂褶菌变种(Schizophyllum commune)，其特征在于：所述裂褶菌变种菌株于2021年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNo：M20211407。
2.根据权利要求1所述的一株可产乳糖酶的裂褶菌变种，其特征在于：所述裂褶菌变种DNA序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的一株可产乳糖酶的裂褶菌变种，其特征在于：所述裂褶菌变种是从海南博高隆港海域的海水中分离得到的。
4.如权利要求1-3任一所述的一株裂褶菌变种在表达乳糖酶中的应用。
5.根据权利要求4所述的一株裂褶菌变种的应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为20-35℃。
6.根据权利要求5所述的一株裂褶菌变种的应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度为25-33℃。
7.根据权利要求5所述的一株裂褶菌变种的应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活温度为20℃、25℃、30℃、33℃或35℃。
8.根据权利要求4所述的一株裂褶菌变种的应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为4.0-7.5。
9.根据权利要求7所述的一株可产乳糖酶的裂褶菌变种及其应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值为4.5-6.0。
10.根据权利要求7所述的一株可产乳糖酶的裂褶菌变种及其应用，其特征在于：所述裂褶菌变种表达的乳糖酶酶活PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5。
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| CN105886408A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-08-24 | 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 | 海洋裂褶菌菌株的筛选及其应用 |
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2021
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