CN104726430B - 耐盐耐蛋白酶的α‑半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因 - Google Patents

耐盐耐蛋白酶的α‑半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐盐耐蛋白酶的α‑半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因。本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α‑半乳糖苷酶AgaAHJ8，编码上述α‑半乳糖苷酶的基因agaAHJ8、包含上述基因的重组载体、包含上述基因的重组菌株。本发明的α‑半乳糖苷酶在pH4.0–8.0的范围内维持72％以上的酶活性；最适温度为50℃，在37℃下稳定；具有良好的耐盐特性和蛋白酶抗性，可水解密二糖、棉籽糖及瓜尔胶。本发明的α‑半乳糖苷酶AgaAHJ8可应用于高盐食品和海产品加工领域，特别是应用于高盐食品的发酵(如高盐稀态酱油)。

Description

耐盐耐蛋白酶的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐盐耐蛋白酶的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因。
背景技术
具有α-半乳糖苷的低聚糖和多聚糖广泛存在于食品和饲料原料中，尤以豆科类植物种子含量最高(Karr-Lilienthal et al.,Livest Prod Sci,2005,97:1–12.)，如密二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖和角豆胶、瓜尔胶等半乳甘露聚糖。α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)又叫密二糖酶(melibiase)，可催化水解这些低聚糖和多聚糖底物中的α-半乳糖苷键，进而应用于饲料、食品、造纸和医疗等行业中(Zhou et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2010,88:1297–1309)。
耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(Zhou et al.Folia Microbiol,2014,59:423–431)；由于内源蛋白酶广泛存在于生物体中且外源蛋白酶常作为一种添加剂，所以耐蛋白酶的酶可应用于食品等多种行业(Zhou et al.Folia Microbiol,2014,59:423–431)。例如，高盐稀态工艺生产的酱油品质高，风味佳，酱醅或酱醪中的氯化钠浓度达18％(w/v)，制作酱油的原料中具有内源蛋白酶，发酵时可加入外源的蛋白酶及半乳糖苷酶，但由于酶活性在高浓度氯化钠条件下受到抑制，导致高盐稀态酱油发酵存在发酵周期长、设备利用率低、原料利用率和氨基态氮出品率较低等不足之处(专利：201110248389.8)。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐盐耐蛋白酶的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8。
本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明所述α-半乳糖苷酶AgaAHJ8可得自海洋杆菌(Pontibacter sp.)。AgaAHJ8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8总共含402个氨基酸，理论分子量为45.2kDa，其中N端19个氨基酸为预测信号肽序列“MKKLFLFFFLNLYIGAAYA”，成熟的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8含383个氨基酸。该酶的最适pH值为5.5，在pH4.0–8.0的范围内维持72％以上的酶活性；经pH4.0–8.0缓冲液在37℃下处理1h，该酶酶活剩余达73％以上。该酶最适温度50℃，在37℃下稳定，在50℃时半衰期小于5min。在pH5.5及50℃下，该酶对2mM pNPG(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside)的比活为43.5±1.0Umg-1，对0.5％(w/v)的密二糖(melibiose)、棉籽糖(raffinose)和瓜尔胶(guar gum)的比活分别为0.47±0.07、1.93±0.07和0.46±0.06U mg-1。该酶具有良好的耐盐性，在反应体系中加入3.5–30.0％(w/v)的NaCl，仍然具有70％以上的酶活。该酶也具有良好的蛋白酶抗性，经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，该酶仍能分别保持101.1％和108.9％的酶活。
本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因agaAHJ8，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明通过基因组测序的方法克隆了α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的编码基因agaAHJ8，其全长1209bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。经BLAST比对，该α-半乳糖苷酶AgaAHJ8全序列与GenBank中Pedobacter sp.V48来源的假定蛋白(hypothetical protein)N824_24065(ETZ22001)全序列具有最高的氨基酸序列一致性，为69.2％，该Pedobacter sp.V48来源的蛋白活性还未研究；AgaAHJ8全序列与确证活性的Cellvibrio japonicus Ueda107来源α-半乳糖苷酶(B3PGJ1)全序列的一致性为44.5％。说明α-半乳糖苷酶AgaAHJ8是一种新的α-半乳糖苷酶。
本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8的重组载体，优选为pEasy-E2-agaAHJ8。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半乳糖苷酶基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-agaAHJ8。
本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/agaAHJ8。
本发明制备α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的方法按以下步骤进行：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；
3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/agaAHJ8。
本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适pH5.5，最适温度，50℃，可水解密二糖、棉籽糖及瓜尔胶，具有良好的耐盐和耐蛋白酶特性。该酶可应用于高盐食品和海产品加工领域。
附图说明
图1：在大肠杆菌中表达的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；1：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8；
图2：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的pH活性；
图3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的pH稳定性；
图4：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的热活性；
图5：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的热稳定性；
图6：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8在不同浓度NaCl中的活性。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：海洋杆菌(Pontibacter sp.)同文献报道菌种性质，如中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株Pontibacter sp.CICC 23788；大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司。
2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶及dNTP购自TaKaRa公司；pNP(p-nitrophenol)、pNPG(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside)、半乳糖和密二糖(melibiose)购自Sigma公司；棉籽糖(raffinose)购自美国Amresco公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8的克隆
提取海洋杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，500mM NaCl，2％(w/v)SDS，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
用超声打断仪Biorupter将5μg的海洋杆菌基因组打断为400–600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3'端加A碱基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。
基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的制备
以5'CAACAGAAGGCATCCCTTGCCCCC 3'和5'GATCTTTTTGAGGCGGAAAAGCTTTG 3'为引物对，海洋杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸2min 30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将α-半乳糖苷酶基因agaAHJ8和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，获得含有agaAHJ8重组表达质粒pEasy-E2-agaAHJ8。将pEasy-E2-agaAHJ8转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/agaAHJ8。
取含有重组质粒pEasy-E2-agaAHJ8的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/agaAHJ8，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg mL-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris–HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。
实施例3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的性质测定
1、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的活性分析
纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的活性测定方法采用pNPG法：将pNPG溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量酶液，450μL的2mM底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加2mL 1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解pNPG产生1μmol pNP所需的酶量。对底物棉籽糖和瓜尔胶的活性测定方法采用DNS法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应适当时间，然后加2.0mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以半乳糖计)所需的酶量。对底物密二糖的活性测定方法采用葡萄糖氧化酶法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后根据葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法原理，利用葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，CAT361500)说明书测定酶活性；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量。
2、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的pH活性和pH稳定性测定：
酶的最适pH测定：将α-半乳糖苷酶AgaAHJ8在37℃下和0.1M pH3.0–10.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.1M pH3.0–10.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1MMcIlvaine buffer(pH3.0–8.0)和0.1M glycine–NaOH(pH9.0–10.0)。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAHJ8的酶学性质。结果表明：AgaAHJ8的最适pH为5.5，在pH4.0–8.0的范围内维持72％以上的酶活性(图2)；经pH4.0–8.0缓冲液在37℃下处理1h，该酶酶活剩余达73％以上(图3)。
3、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的热活性及热稳定性测定：
酶的热活性测定：在pH5.5的缓冲液中，于10–70℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液分别置于37℃和50℃，处理0–60min后，在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAHJ8的酶学性质。结果表明：AgaAHJ8的最适温度为50℃(图4)；该酶在37℃下稳定，在50℃时半衰期小于5min(图5)。
4、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的动力学参数测定：
酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH5.5及50℃下，以1mM pNPG或14mM密二糖为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–2.0mM pNPG或2.9–36.5mM密二糖为底物，在pH5.5、50℃和一级反应时间下，根据Lineweaver–Burk方法测定Km、Vmax和kcat。经测定，在50℃及pH5.5条件下，AgaAHJ8对pNPG的Km、Vmax和kcat分别为2.0mM-1、111.1μmol min-1mg-1和83.2s-1，对密二糖的Km、Vmax和kcat分别为13.2mM-1、0.9μmolmin-1mg-1和0.7s-1。
5、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组AgaAHJ8活力的影响：
在酶促反应体系中加入1.0mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃及pH5.5条件下，以pNPG为底物测定酶活性。结果(表1)表明，1.0mM的SDS、HgCl2及AgNO3可完全或几乎完全抑制AgaAHJ8；其余金属离子和化学试剂对AgaAHJ8的影响较小。
表1.金属离子及化学试剂对纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8活力的影响
6、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8在NaCl中的活性：
酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.5–30.0％(w/v)NaCl，于pH5.5及37℃下进行酶促反应。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAHJ8的酶学性质。结果表明：AgaAHJ8具有良好的耐盐性，在反应体系中加入3.5–30.0％(w/v)的NaCl，该酶仍然具有70％以上的酶活(图6)。
7、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的蛋白酶抗性测定：
酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶45倍(w/w)的胰蛋白酶(pH7.5)和蛋白酶K(pH7.5)在37℃对重组酶处理1h，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以置于蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。结果表明：经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，AgaAHJ8仍能分别保持101.1％和108.9％的酶活。
8、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAHJ8对底物的降解：
在pH5.5及50℃下，该酶对2mM pNPG的比活为43.5±1.0U mg-1，对0.5％(w/v)的密二糖(melibiose)、棉籽糖(raffinose)和瓜尔胶(guar gum)的比活分别为0.47±0.07、1.93±0.07和0.46±0.06U mg-1。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种耐盐耐蛋白酶的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8的基因，其特征在于，以5'CAACAGAAGGCATCCCTTGCCCCC 3'和5'GATCTTTTTGAGGCGGAAAAGCTTTG 3'为引物对，海洋杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸2min 30sec，30个循环后72℃保温10min；
所述海洋杆菌为Pontibactersp.，为中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株Pontibactersp.CICC 23788。
2.包含权利要求1所述编码基因的重组载体。
3.含有权利要求2所述重组载体的宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
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