CN102782127B - 突变碱性纤维素酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种碱性纤维素酶，其具有更高的防止再污染能力。本发明提供的碱性纤维素酶由在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位、45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位、368位、418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列组成。

Description

突变碱性纤维素酶

技术领域

本发明涉及提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶、以及提高了防止再污染能力和蛋白酶耐性的突变碱性纤维素酶。

背景技术

对于衣物品等的有效清洗，重要的是使污垢物质从被清洗物上充分脱离或通过酶分解等迅速地除去污垢物质，此外，防止已经从被清洗物脱离的污垢物质再次附着（防止再污染）也是非常重要的。已知特别是灰尘等微小的污垢物质如果在清洗液中一旦扩散再次附着于被清洗物，将其除去则非常困难。因此，可以在例如衣物用洗剂中一直以来配合各种再污染防止剂。作为再污染防止剂，使用的有羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素等纤维素类化合物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等非离子性高分子、氨基酸聚合物等，但是希望开发具有更高效果的再污染防止剂。

另一方面，一直以来将蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶作为洗涤助剂配合于洗涤剂。作为水解酶其中之一的纤维素酶已知作为本来在中酸性范围起作用的酶，不适合配合于通常的碱性衣物用洗涤剂。然而，近年来，来自以嗜热性或嗜碱性芽孢杆菌属细菌为首的多种物种的碱性纤维素酶或其突变体等也可以配合于碱性衣物用洗剂中（例如，专利文献1~6）。

纤维素酶是水解以纤维素为首的β1,4-葡聚糖中的糖苷键的酶。纤维素酶主要由细菌或植物产生，在生物界广泛存在。纤维素酶分类为从分子内部切割纤维素的内切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）和从糖链的还原末端或非还原末端分解纤维释放出纤维二糖的外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶）（EC3.2.1.91）。另一方面，以纤维素酶为首的糖苷水解酶被概括为糖苷水解酶族，其现在被分类为1~108的亚族。纤维素酶基于其结构分类为糖苷水解酶族的5、6、7、8、9、10、12、44、45、48、51、61、74族，已知这些族之间的氨基酸序列同一性非常低。

然而，近年来，从氨基酸序列和立体结构的解析等已知，纤维素酶都具有通过连接区（linker）相互连接的有催化剂活性的区域（催化区域，CD）和其它功能区域。上述其它功能区域的代表例子为对纤维素具有结合性的纤维素结合区域（CBM，也称为纤维素结合模块）（参照图1A）。纤维素酶通常具有多个CBM。因为纤维素基本上是水不溶性的，所以纤维素酶通过其CBM结合于纤维素表面，从而相对地提高基质浓度。CBM基于氨基酸序列同一性也分类为超过40个族。对于该CBM也进行与纤维素结合直接相关的氨基酸残基的鉴定（非专利文献1）。

上述专利文献1中公开了来源于芽孢杆菌（Bacillus sp.）KSM-S237株的具有耐热性的碱性纤维素酶，专利文献2中公开了将最适pH提高到pH10.5附近的突变碱性纤维素酶，专利文献3中公开了提高了生产性的突变碱性纤维素酶。另外，专利文献4和6中记载了这些纤维素酶的一部分具有防止再污染作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第3512981号说明书

专利文献2：日本特开2003-310270号公报

专利文献3：日本特开2004-140号公报

专利文献4：日本特表2004-536593号公报

专利文献5：日本特表2006-509850号公报

专利文献6：日本特开2002-265998号公报

非专利文献

非专利文献1：BorastonA.B.et al.,Bicochem.J.,(2002)361,p.35-40

发明内容

本发明包含以下发明。

[1]一种突变碱性纤维素酶，其中，该突变碱性纤维素酶由在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位、45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位、368位、418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的氨基酸序列组成。

[2]上述[1]的突变碱性纤维素酶，其中，上述1个以上的氨基酸残基为在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有90%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基。

[3]上述[2]的突变碱性纤维素酶，其中，上述其它氨基酸残基为精氨酸或谷氨酸。

[4]上述[1]的突变碱性纤维素酶，其中，上述1个以上的氨基酸残基选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基，上述其它氨基酸残基为带电氨基酸残基。

[5]上述[4]的突变碱性纤维素酶，其中，上述带电氨基酸残基选自谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。

[6]上述[4]的突变碱性纤维素酶，其中，上述不带电氨基酸残基为丙氨酸、丝氨酸、谷酰胺或天冬酰胺，并且上述带电氨基酸残基为谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸。

[7]上述[4]的突变碱性纤维素酶，其中，上述不带电氨基酸残基为选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的71位、193位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基，并且上述带电氨基酸残基为酸性氨基酸残基。

[8]上述[1]的突变碱性纤维素酶，其中，上述1个以上的氨基酸残基选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基。

[9]上述[8]的突变碱性纤维素酶，其中，上述1个以上的氨基酸残基选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的419位、421位、454位以及501位的位置的氨基酸残基。

[10]上述[8]的突变碱性纤维素酶，其中，上述1个以上的氨基酸残基为色氨酸并且其它氨基酸残基为酪氨酸，或者该1个以上的氨基酸残基为色氨酸以外的氨基酸残基并且该其它氨基酸残基为丙氨酸。

[11]上述[1]~]10]的突变碱性纤维素酶，其中，由序列号2所示的氨基酸序列的1~30位的氨基酸残基或相当于该氨基酸残基的氨基酸残基组成的信号序列缺失。

[12]一种基因，其中，该基因编码上述[1]～[11]中任意的突变碱性纤维素酶。

[13]一种重组载体，其中，该重组载体含有上述[12]的基因。

[14]一种转化体，其中，该转化体包含上述[13]的重组载体。

[15]上述[14]的转化体，其中，上述转化体为微生物。

[16]一种再污染防止剂，其中，该再污染防止剂包含上述[1]～[11]中任意的突变碱性纤维素酶。

[17]一种酶组合物，其中，该酶组合物包含上述[1]~[11]中任意的突变碱性纤维素酶。

[18]上述[17]的酶组合物，其中，上述酶组合物进一步包含选自蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、糖化酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、普鲁兰酶、果胶酸裂解酶（pectate lyase）、木葡聚糖酶（Xyloglucanase）、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶（rhamnogalacturonase）、果胶裂解酶（pectin lyase）、其它的甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶和转谷氨酰胺酶以及它们的混合物中的至少1种酶。

[19]一种洗涤剂组合物，其中，该洗涤剂组合物包含上述[1]~[11]的突变碱性纤维素酶、[16]的再污染防止剂、或者[17]或[18]的酶组合物。

[20]一种突变碱性纤维素酶的制造方法，其中，该制造方法包括使突变碱性纤维素酶从[12]的基因表达。

[21]一种提高碱性纤维素酶的防止再污染能力的方法，其中，该方法通过在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位、45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位、368位、418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，从而使碱性纤维素酶的防止再污染能力提高。

[22]上述[21]的方法，其中，上述1个以上的氨基酸残基为在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有90%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基。

[23]上述[21]的方法，其中，上述1个以上的氨基酸残基选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基，上述其它氨基酸残基为带电氨基酸残基。

[24]上述[21]的方法，其中，上述1个以上的氨基酸残基选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基。

[25]一种提高碱性纤维素酶的防止再污染能力、或提高碱性纤维素酶的防止再污染能力和蛋白酶耐性的方法，其特征在于，在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有90%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸。

附图说明

图1是S237纤维素酶的结构（A）和由纤维素酶产生的防止再污染效果的推测机理（B）的概略图。图1A所示的信号序列通常在S237纤维素酶的成熟蛋白质中被切割除去。

图2是将由添加S237纤维素酶产生的防止再污染促进效果与其它酶比较的图。图2A是比较S237纤维素酶与其它水解酶的结果，图2B是比较S237纤维素酶与其它纤维素酶的结果。

图3是表示由添加S237纤维素酶产生的防止再污染促进效果的pH依赖性的结果。

图4是比较在各种蛋白酶存在下的纤维素酶的残留活性（将S237_Q242S（QS）作为100的情况）的图。

具体实施方式

纤维素酶的具体再污染防止机理尚不明确，关于取得具有更高的防止再污染能力的纤维素酶的方法还不知道。并且，纤维素酶也存在由于共存的蛋白酶而容易分解等问题，需要进一步改良。

本发明涉及提供提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶、以及提高了防止再污染能力和蛋白酶耐性的突变碱性纤维素酶。

本发明者们为了解决上述课题进行了潜心研讨，其结果发现：在来源于芽孢杆菌KSM-S237株的碱性纤维素酶中，通过将规定位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基从而可以提高防止再污染能力，以及在一部分突变碱性纤维素酶可以提高防止再污染能力和蛋白酶耐性。

另外，本发明者们发现，通过将在碱性纤维素酶的催化区域内的露出于酶表面的规定位置的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基以提高碱性纤维素酶表面的亲水性，从而可以显著地提高该碱性纤维素酶的防止再污染能力。

另外，本发明者们发现，通过取代纤维素结合区域内与纤维素结合相关的区域或其附近的氨基酸残基以减弱碱性纤维素酶的纤维素结合性，从而可以进一步提高该碱性纤维素酶的防止再污染能力。

本发明所涉及的提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶以及包含其的再污染防止剂可以在例如洗涤过程中带来高的防止再污染促进效果。通过配合本发明所涉及的酶组合物，可以赋予洗涤剂组合物等防止再污染效果。本发明所涉及的洗涤剂组合物在洗涤时可以发挥高的防止再污染效果。另外，如果使用本发明所涉及的突变碱性纤维素酶的制造方法，则能够制造提高了防止再污染能力的碱性纤维素酶。进一步，根据本发明，可以提供一种具有高的防止再污染效果的，以及具有高的防止再污染效果和高的蛋白酶耐性的，作为洗涤剂配合用酶有用的碱性纤维素酶。

以下，详细地说明本发明。

1．突变碱性纤维素酶及其制造

本发明的突变碱性纤维素酶是在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上的同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位、45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位、368位、418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。本发明的该突变碱性纤维素酶与突变前（亲本碱性纤维素酶）相比，防止再污染能力提高，或防止再污染能力和蛋白酶耐性都提高。

在一个实施方式中，本发明的突变碱性纤维素酶为通过在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有90%以上的同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为其它氨基酸从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶、或提高防止再污染能力和蛋白酶耐性的突变碱性纤维素酶。

更具体来说，本发明的突变碱性纤维素酶为通过将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶、或提高防止再污染能力和蛋白酶耐性的突变碱性纤维素酶。

在其它实施方式中，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为通过将作为亲本的任意的碱性纤维素酶的催化区域内的特定位置的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶。

更具体来说，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为将氨基酸取代导入由芽孢杆菌（Bacillus sp.）KSM-S237株等来源于芽孢杆菌属的碱性纤维素酶或与该碱性纤维素具有高的氨基酸序列同一性的碱性纤维素酶组成的任意的碱性纤维素酶的氨基酸序列而得到的突变碱性纤维素酶，其中，通过将存在于碱性纤维素酶催化区域并露出于酶表面的不带电氨基酸残基中特别挑选出的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基从而提高了防止再污染能力。

更具体来说，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为通过在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶。

在其它实施方式中，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为通过取代作为亲本的任意的碱性纤维素酶的纤维素结合区域内与纤维素结合直接相关的区域或与其相邻的氨基酸残基从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶。

更具体来说，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为将氨基酸取代导入由芽孢杆菌（Bacillus sp.）KSM-S237株等来源于芽孢杆菌属的碱性纤维素酶或与该碱性纤维素具有高的氨基酸序列同一性的碱性纤维素酶组成的任意的碱性纤维素酶的氨基酸序列而得到的突变碱性纤维素酶，其中通过将碱性纤维素酶的纤维素结合区域内的与纤维素结合直接相关的区域或存在于其附近的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基从而提高了防止再污染能力。

更具体来说，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为通过在序列号2所示的氨基酸序列或与序列号2所示的氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基从而提高了防止再污染能力的突变碱性纤维素酶。

在本说明书中，将作为亲本的碱性纤维素酶、即氨基酸取代前的任意的碱性纤维素酶称为“亲本碱性纤维素酶”，将其氨基酸序列称为“亲本氨基酸序列”，将编码该碱性纤维素酶的基因称为“亲本碱性纤维素酶基因”。

本发明中的氨基酸序列是指构成蛋白质的20种氨基酸残基，即Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val。

本发明中的不带电氨基酸是指构成蛋白质的20种氨基酸中没有电荷的氨基酸，即非极性氨基酸（缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸）和极性氨基酸（甘氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）。本发明中的能够作为氨基酸取代的对象的不带电氨基酸残基可以是任意的非极性氨基酸或极性氨基酸，更优选丙氨酸、丝氨酸、谷酰胺或天冬酰胺。

另外，本发明中的带电氨基酸是指构成蛋白质的20种氨基酸中具有电荷的氨基酸，即酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）和碱性氨基酸（精氨酸、组氨酸和赖氨酸）。本发明中的通过取代不带电氨基酸残基而导入突变碱性纤维素酶中的带电氨基酸残基可以是任意的酸性氨基酸或碱性氨基酸，优选为谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸。

在本说明书中，氨基酸序列间的同一性是指将2个氨基酸序列比对时两个序列中同一氨基酸残基存在的位置的数目相对于全长氨基酸残基的数目的比例（%）。具体来说，可以通过用Lipman-Pearson法（Lipman-Pearson Method，Science,227,1435,(1985)）计算，并使用遗传信息处理软件Genetyx-Win（Ver.5.1.1，软件开发）的同源性分析（Search homology）程序，将unit size to compare（ktup）作为2进行分析从而算出。

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列可以将任意的碱性纤维素酶的氨基酸序列作为亲本进行设计。作为这样的亲本氨基酸序列，例如可以列举属于糖苷水解酶族的5族的各种碱性纤维素酶的氨基酸序列。另外，作为亲本氨基酸序列，可以列举例如芽孢杆菌属细菌、梭菌属细菌、热酸菌属（Acidothermus）细菌等产生碱性纤维素酶的任意来自生物的碱性纤维素酶的氨基酸序列，其中，可以优选使用来自芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶的氨基酸序列。

作为芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，优选可以列举来自芽孢杆菌KSM-S237株的碱性纤维素酶[S237纤维素酶]。对于来自芽孢杆菌KSM-S237株的碱性纤维素酶，作为包含N末端信号序列（序列号2的1位~30位，MMLRKKTKQLISSILILVLLLSLFPAALAA[氨基酸1个字表示]）的前体蛋白质具有序列号2所示的氨基酸序列，作为成熟蛋白质具有已经除去其信号序列的氨基酸序列。

因此，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶的亲本氨基酸序列，除了序列号2所示的氨基酸序列之外，还可以列举相对于序列号2所示的氨基酸序列具有70%以上、优选为80%以上、进一步优选为90%以上、更优选为95%以上、更优选为96%以上、特别优选为98%以上的同一性的氨基酸序列，这些氨基酸序列既可以是开放阅读框架（ORF）上经过编码的氨基酸序列，也可以是从该序列中除去信号序列的氨基酸序列。

作为S237纤维素酶以外的芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，例如除了报道有来自芽孢杆菌DSM12648株的碱性纤维素酶（序列号4）[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性为98.2%]、来自芽孢杆菌1139株的碱性纤维素酶（序列号6）[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性为91.3%]、来自芽孢杆菌KSM-64株的碱性纤维素酶（序列号8）[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性为91.6%]、来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（序列号10）[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性为71.0%]以及来自芽孢杆菌N-4株的碱性纤维素酶（序列号12）[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性为64.0%]之外，还报道有来自芽孢杆菌KSM-N131株（日本特开2001-231569号）的N131a和N131b这2种碱性纤维素酶[与S237纤维素酶（包含信号序列）的氨基酸序列同一性分别为87.9%和97.1%]等各种来自芽孢杆菌菌株的碱性纤维素酶，这些碱性纤维素酶相互具有高的氨基酸序列同一性和相似性。

因此，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶的亲本氨基酸序列，包括来自芽孢杆菌DSM12648株的碱性纤维素酶（序列号4）、来自芽孢杆菌1139株的碱性纤维素酶（序列号6）、来自芽孢杆菌KSM-64株的碱性纤维素酶（序列号8）、来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（序列号10）或来自芽孢杆菌N-4株的碱性纤维素酶（序列号12）的氨基酸序列，或者相对于其具有90%以上、更优选为95%以上、更优选为96%以上、特别优选为98%以上的同一性的氨基酸序列。

或者，在本发明所涉及的突变碱性纤维素酶为相当于58位的氨基酸残基被取代的突变体（58位突变体）的情况下，作为其亲本氨基酸序列，除了序列号2所示的来自芽孢杆菌KSM-S237株的碱性纤维素酶的氨基酸序列之外，还包括相对于序列号2所示的氨基酸序列具有90%以上、更优选为95%以上、更优选为96%以上、特别优选为98%以上的同一性的氨基酸序列。

作为由相对于序列号2所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列组成的除了S237纤维素酶以外的芽孢杆菌属细菌的亲本碱性纤维素酶，可以列举上述序列号4、序列号6、序列号8所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶、以及来自芽孢杆菌KSM-N131株的碱性纤维素酶N131b等各种来自芽孢杆菌菌株的碱性纤维素酶。

作为该58位突变体的亲本氨基酸序列，可以是开放阅读框架（ORF）上经过编码的氨基酸序列，也可以是从其序列中除去了信号序列（序列号2的1~30位）的氨基酸序列。

此外，本发明中的亲本氨基酸序列可以包括在序列号2、4、6、8、10或12的各氨基酸序列中，缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。在此，1个或多个是指例如1~50个、优选为1~30个、更优选为1~20个、进一步优选为1~10个、更优选为1~5个。作为这样的亲本氨基酸序列的一例，可以列举以下专利文献2和3记载的突变碱性纤维素酶的氨基酸性序列：将相当于序列号2所示的氨基酸序列的10位的位置取代为谷酰胺、丙氨酸、脯氨酸或蛋氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于16位的位置取代为天冬酰胺或精氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于22位的位置取代为脯氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于33位的位置取代为组氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于39位的位置取代为丙氨酸、苏氨酸或酪氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于76位的位置取代为组氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苏氨酸或丙氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于109位的位置取代为异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸或缬氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于242位的位置取代为丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或甘氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于263位的位置取代为异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于308位的位置取代为丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于462位的位置取代为苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或精氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于466位的位置取代为亮氨酸、丙氨酸或丝氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于468位的位置取代为丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸或赖氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于552位的位置取代为蛋氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于564位的位置取代为缬氨酸、苏氨酸或亮氨酸的突变碱性纤维素酶，将相当于608位的位置取代为异亮氨酸或精氨酸的突变碱性纤维素酶，或者组合1个以上上述氨基酸残基的取代的突变碱性纤维素酶等，但是并不限定于此。在上述氨基酸序列中，作为优选的例子，可以列举序列号2所示的氨基酸序列的242位的氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的有突变的碱性纤维素酶的氨基酸序列；作为更优选的例子，可以列举序列号2所示的氨基酸序列的242位的谷酰胺残基被取代为丝氨酸残基的有突变的碱性纤维素酶的氨基酸序列。

在本发明中，如上所述的亲本氨基酸序列中，序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位、45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位、368位、418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基能被取代为其它氨基酸残基。

在一个实施方式中，本发明中，如上所述的亲本氨基酸序列中，相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基能被取代为其它氨基酸。

优选在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有90%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基能被取代为谷氨酸或精氨酸。

另外，优选本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在序列号2所示的氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为其它氨基酸的突变碱性纤维素酶。例如，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶的氨基酸残基中的1~20个、更优选为1~10个、进一步优选为1~5个的氨基酸残基取代为其它氨基酸的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸的突变碱性纤维素酶。

更优选本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中242位氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为其它氨基酸的突变碱性纤维素酶。

进一步优选本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将序列号2所示的氨基酸序列的58位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸的突变碱性纤维素酶。

在其它实施方式中，在本发明中，如上所述的亲本氨基酸序列中，选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基能够作为带电氨基酸残基取代的对象。

优选为，在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基能够作为带电氨基酸残基取代的对象。

另外，优选为，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中氨基酸残基的1个或多个氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。例如，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶的氨基酸序列中的1~20个、更优选为1~10个、进一步优选为1~5个的氨基酸残基被取代为其它氨基酸的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

更优选为，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中242位氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

进一步优选，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

进一步，在其它实施方式中，在本发明中，如上所述的亲本氨基酸序列中，纤维素结合区域内与纤维素结合直接相关的区域或与其相邻的氨基酸残基作为取代的对象

优选为，在序列号2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有70%以上同一性的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基的至少1个能够作为氨基酸取代的对象。

另外，优选为，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中氨基酸残基的1个或多个氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。例如，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在由序列号2所示的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶的氨基酸序列中的1~20个、更优选为1~10个、进一步优选为1~5个的氨基酸残基被取代为其它氨基酸的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

更优选为，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在序列号2所示的氨基酸序列的242位氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自相当于序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

进一步优选，本发明的突变碱性纤维素酶可以为，在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基被取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自序列号2所示的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

上述“相当于序列号“X”所示的氨基酸序列的“Y”的位置”的表达是用来将序列号“X”所示的碱性纤维素酶的氨基酸序列（例如序列号2所示的S237纤维素酶的氨基酸序列）作为参照序列，指定任意的碱性纤维素酶的氨基酸序列中的规定的氨基酸残基的位置。例如，“相当于序列号“X”所示的氨基酸序列的“Y”的位置的氨基酸残基”是指，对于序列号“X”所示的氨基酸序列，从其序列的第一个氨基酸残基开始数出现的第Y个氨基酸残基。

另一方面，对于序列号“X”以外的碱性纤维素酶的氨基酸序列（“Z”），“相当于序列号“X”所示的氨基酸序列的“Y”位的位置的氨基酸残基”是指，将该氨基酸序列“Z”与序列号“X”的氨基酸序列比对时，对于从序列号“X”的氨基酸序列的第一个氨基酸残基开始数第Y个氨基酸残基进行比对（即，比对中排列为相同纵列）的，氨基酸序列“Z”中的氨基酸残基。另外，序列号“X”的氨基酸序列与其它氨基酸序列的比对也可以用手操作进行，例如可以通过以默认设定使用Clustal W多比对程序（Thompson,J.D.et al,(1994)NucleicAcids Res.22,p.4673-4680）来制作。Clustal W可以从例如欧洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute：EBI，http://www.ebi.ac.uk/index.html）或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库（DDBJ，http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）的网站利用。

如果是本领域的技术人员，则可以根据需要进一步微调整得到的比对以使之成为最适比对。这样的最适比对优选考虑到氨基酸序列的相似性或所插入的间隙的频率等来确定。在此，氨基酸序列的相似性是指，将2个氨基酸序列比对时该两方的序列中存在相同或相似的氨基酸残基的位置的数目相对于全长氨基酸残基的数目的比例（%）。相似的氨基酸残基是指构成蛋白质的20种的氨基酸中，在极性或电荷方面相互具有相似的性质，如产生所谓的保守取代的氨基酸残基。由这样的类似的氨基酸残基组成的群对于本领域的技术人员来说是已知的，例如可以分别列举出精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等，但并不限定于此。

如果用上述的方法进行比对，则序列号4（来自DSM12648株）的29位的谷酰胺残基、序列号6（来自1139株）的58位的谷酰胺残基、序列号8（来自KSM-64株）的57位的谷酰胺残基分别成为“相当于序列号2所示的氨基酸序列的58位的位置的氨基酸残基”。

另外，为了参考，在后述的表5和表6中对于能作为亲本氨基酸序列使用的序列号2（来自芽孢杆菌KSM-S237株）、4（来自DSM12648株）、6（来自1139株）、8（来自KSM-64株）、10（来自KSM-635株）、12（来自N-4株）的各氨基酸序列，表示序列号2的上述位置分别对应的氨基酸残基。

在一个优选的实施方式中，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶，例如可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号2所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将相当于序列号2的氨基酸序列的58位的位置的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列（相当于序列号2的1位~30位的序列）的氨基酸序列。上述取代赋予突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力，或赋予突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力和高的蛋白酶耐性。

作为该实施方式中的本发明的突变碱性纤维素酶的优选例子，可以列举包含将序列号2所示的氨基酸序列的58位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸序列或从该序列中进一步除去了信号序列的氨基酸序列的突变碱性纤维素酶。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将其58位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去了信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号4所示的氨基酸序列，将序列号4的氨基酸序列的29位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去了信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号6所示的氨基酸序列，将序列号4的氨基酸序列的58位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸性序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号8所示的氨基酸序列，将序列号4的氨基酸序列的57位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸而得到的氨基酸性序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

在其它优选的实施方式中，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶，例如可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有70%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，其催化区域内的特定位置的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列（相当于序列号2的1位~30位的序列）的氨基酸序列。

在上述实施方式中的突变碱性纤维素酶由于基于其酶表面的高亲水性和酶的整体结构发挥防止再污染能力，因此在仅将得到防止再污染效果作为目的的情况下，可以具有纤维素酶活性，也可以没有纤维素酶活性。然而，从同时得到包括纤维素在内的糖类的分解作用的观点来看，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶更优选具有纤维素酶活性。该突变碱性纤维素酶在其N末端可以具有信号序列，也可以是除去了信号序列的成熟的蛋白质形态。

对于上述实施方式中的突变碱性纤维素酶，催化区域内的由不带电氨基酸残基向带电氨基酸残基的取代没有限定，例如可以是由丙氨酸、丝氨酸、谷酰胺或天冬酰胺向谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸的取代。这样的取代赋予本发明所涉及的碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为该实施方式中的本发明的突变碱性纤维素酶的优选例子，可以是序列号2所示的氨基酸序列的71位（这是接近酸性氨基酸的氨基酸残基的位置）的不带电氨基酸残基被取代为酸性氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。这样的取代特别高效地增加取代后的氨基酸残基附近的亲水性，赋予得到的突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为其它优选的例子，可以是在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，其71位（这是接近酸性氨基酸的氨基酸残基的位置）的不带电氨基酸残基被取代为酸性氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。这样的取代特别高效地增加取代后的氨基酸残基附近的亲水性，赋予得到的突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为其它优选的例子，可以是序列号2所示的氨基酸序列的193位（这是不接近酸性氨基酸的氨基酸残基存在的位置）的不带电氨基酸残基被取代为碱性氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。这样的取代特别高效地增加取代后的氨基酸残基附近的亲水性，赋予得到的突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为其它优选的例子，可以是在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，其193位（这是不接近酸性氨基酸的氨基酸残基存在的位置）的不带电氨基酸残基取代为碱性氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。这样的取代特别高效地增加取代后的氨基酸残基附近的亲水性，赋予得到的突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为其它的优选例子，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶例如可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号2所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号2的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列（相当于序列号2的1位~30位的序列）的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号4所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号4的氨基酸序列的16位、23位、27位、31位、35位、37位、42位、74位、90位、93位、94位、95位、96位、98位、101位、111位、132位、135位、146位、147位、149位、150位、152位、164位、165位、166位、167位、168位、170位、173位、174位、188位、196位、198位、199位、222位、238位、243位、247位、248位、251位、253位、268位、281位、283位、289位、295位、316位、325位、327位、328位、331位、334位以及339位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号6所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号6的氨基酸序列的45位、52位、56位、60位、64位、66位、71位、103位、119位、122位、123位、124位、125位、127位、130位、140位、161位、164位、175位、176位、178位、179位、181位、193位、194位、195位、196位、197位、199位、202位、203位、217位、225位、227位、228位、251位、267位、272位、276位、277位、280位、282位、297位、310位、312位、318位、324位、345位、354位、356位、357位、360位、363位以及368位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号8所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号8的氨基酸序列的44位、51位、55位、59位、63位、65位、70位、102位、118位、121位、122位、123位、124位、126位、129位、139位、160位、163位、174位、175位、177位、178位、180位、192位、193位、194位、195位、196位、198位、201位、202位、216位、224位、226位、227位、250位、266位、271位、275位、276位、279位、281位、296位、309位、311位、317位、323位、344位、353位、355位、356位、359位、362位以及367位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号10所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号10的氨基酸序列的226位、233位、237位、241位、245位、247位、284位、300位、303位、304位、305位、306位、320位、344位、361位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、386位、400位、431位、447位、456位、460位、462位、477位、490位、492位、498位、504位、525位、534位、536位、537位以及548位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号12所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号12的氨基酸序列的63位、71位、75位、79位、83位、85位、90位、122位、138位、142位、143位、144位、146位、193位、207位、208位、210位、222位、223位、224位、225位、226位、228位、231位、232位、246位、254位、256位、257位、281位、297位、302位、306位、310位、348位、354位、375位、384位、386位以及387位的位置的不带电氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

进一步，在其它优选的实施方式中，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶，例如可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有70%以上同一性的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，将其纤维素结合区域内的与纤维素结合直接相关的区域或与其相邻的区域的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或从该序列中进一步除去信号序列（相当于序列号2的1位~30位的序列）的氨基酸序列。

在该实施方式中的突变碱性纤维素酶由于基于其纤维素结合区域中的纤维素结合性的降低而发挥防止再污染能力，因此在仅将得到防止再污染效果作为目的的情况下，可以具有纤维素酶活性，也可以没有纤维素酶活性。然而，从同时得到包括纤维素在内的糖类的分解作用的观点来看，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶更优选具有纤维素酶活性。本发明所涉及的突变碱性纤维素酶可以在其N末端具有信号序列，也可以是已经除去信号序列的成熟蛋白质形态。

对于上述实施方式中的突变碱性纤维素酶，由取代对象的氨基酸残基向其它氨基酸残基的取代，例如可以是由色氨酸（非极性氨基酸）向酪氨酸（极性氨基酸）的取代，也可以是由除了色氨酸以外的氨基酸残基[即，作为非极性氨基酸的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸；作为极性氨基酸的甘氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；作为酸性氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸；以及作为碱性氨基酸的精氨酸、组氨酸和赖氨酸]向丙氨酸（非极性氨基酸）的取代。这样的取代赋予本发明所涉及的突变碱性纤维素酶显著高的防止再污染能力。

作为上述实施方式中的本发明的突变碱性纤维素酶的优选的例子，可以列举将选自序列号2所示的氨基酸序列的419位、421位、454位以及501位（这些是与纤维素结合直接相关的氨基酸残基和其优选的相邻部位（640位）的位置）的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。这样的取代使取代后的氨基酸残基附近的纤维素结合性降低，其结果使得所得到的突变碱性纤维素酶对部分纤维素的结合性降低，并且赋予显著高的防止再污染能力。

作为其它优选的例子，可以列举在序列号2所示的氨基酸序列的242位由谷酰胺残基取代为丝氨酸残基的有突变的突变碱性纤维素酶的氨基酸序列中，将选自其419位、421位、454位以及501位（这些是与纤维素结合直接相关的氨基酸残基和其优选的相邻部位（640位）的位置）的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基的突变碱性纤维素酶。

作为其它优选的例子，作为本发明所涉及的突变碱性纤维素酶，例如可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号2所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号2的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、453位、454位、455位、457位、458位、459位、494位、495位、496位、500位、501位、502位、503位、504位、550位、551位、552位、604位、605位、606位、607位、608位、640位、641位、642位、644位、645位、646位、683位、684位、685位、690位、691位、692位、693位、694位、739位、740位以及741位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列（相当于序列号2的1位~30位的序列）的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号4所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号4的氨基酸序列的389位、390位、391位、392位、393位、424位、425位、426位、428位、429位、430位、465位、466位、467位、471位、472位、473位、474位、475位、521位、522位、523位、575位、576位、577位、578位、579位、611位、612位、613位、615位、616位、617位、654位、655位、656位、661位、662位、664位、665位、710位、711位以及712位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号6所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号6的氨基酸序列的418位、419位、420位、421位、422位、452位、453位、454位、456位、457位、458位、493位、494位、495位、499位、500位、501位、502位、503位、548位、549位、550位、602位、603位、604位、605位、606位、638位、639位、640位、642位、643位、644位、681位、682位、683位、688位、689位、690位、691位、692位、737位、738位以及739位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列（来自1139株纤维素酶包含30个氨基酸的信号序列）。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号8所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号8的氨基酸序列的417位、418位、419位、420位、421位、451位、452位、453位、455位、456位、457位、492位、493位、494位、498位、499位、500位、501位、502位、547位、548位、549位、601位、602位、603位、604位、605位、637位、638位、639位、641位、642位、643位、680位、681位、682位、687位、688位、689位、690位、691位、736位、737位以及738位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列（来自KSM-64株纤维素酶包含29个氨基酸的信号序列）。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号10所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号10的氨基酸序列的598位、599位、600位、601位、602位、633位、634位、635位、637位、638位、639位、674位、675位、676位、680位、681位、682位、683位、684位、729位、730位、731位、783位、784位、785位、786位、787位、819位、820位、821位、823位、824位、825位、862位、863位、864位、869位、870位、871位、872位、873位、919位、920位以及921位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列（来自KSM-635株纤维素酶包含29个氨基酸的信号序列）。

作为其它优选的例子，可以列举一种突变碱性纤维素酶包含：对于序列号12所示的氨基酸序列或相对于该序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，将选自相当于序列号12的氨基酸序列的451位、452位、453位、454位、455位、486位、487位、488位、490位、491位、492位、527位、528位、529位、533位、534位、535位、536位、537位、583位、584位、585位、639位、640位、641位、642位、643位、675位、676位、677位、679位、680位、681位、720位、721位、722位、727位、728位、729位、730位、731位、775位、776位以及777位的位置的氨基酸残基中的1个以上的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者从该序列中进一步除去信号序列的氨基酸序列（来自N-4株纤维素酶包含28个氨基酸的信号序列）。

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶可以使用该技术领域中公知的各种突变导入技术来进行制造。例如，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶可以通过使编码其亲本氨基酸序列的碱性纤维素酶基因（亲本碱性纤维素酶基因）内的取代对象的编码氨基酸残基的核苷酸序列突变为编码取代后的氨基酸残基的核苷酸序列，再由其突变基因使突变碱性纤维素酶表达，从而进行制造。

对亲本碱性纤维素酶基因的目标突变导入，可以基于基本上将亲本碱性纤维素酶基因用作模板DNA的PCR扩增或各种DNA聚合酶的复制反应，使用本领域技术人员公知的各种位点特异性突变导入法来进行。位点特异性突变导入法例如可以通过逆PCR法或退火法等（村松等编著，《修订第4版新基因工学手册》，羊土社，p.82-88）的任意的手法来进行。也可以根据需要使用Stratagene公司的QuickChangeⅡ单点突变试剂盒（Site-Directed Mutagenesis Kit）或QuickChange多点突变试剂盒（Multi Site-Directed Mutagenesis Kit）等各种市售的位点特异性突变导入用试剂盒。在本发明中，另外也可以采用通过SOE（重叠延伸拼接技术，Splicing by overlap extension）-PCR（Horton R.M.etal.,Gene(1989)77(1),p.61-68）将分别使用包含应导入的核苷酸突变的2个互补突变引物而分别扩增突变部位的上游侧和下游侧得到的DNA片段连接为1个的方法。对于使用了该SOE-PCR法的突变导入操作顺序，在后述的实施例中也进行详述。

包含亲本碱性纤维素酶基因的模板DNA可以根据通常方法从产生碱性纤维素酶的生物中提取基因组DNA或提取RNA并逆转录来合成cDNA从而进行制备。产生碱性纤维素酶的生物除了包括枯草杆菌（Bacillus subtilis）等芽孢杆菌属细菌、梭菌属细菌、热酸菌属细菌的细菌以外，在植物或动物中也有报道，但是关于枯草杆菌（Bacillus subtilis）等芽孢杆菌属细菌的研究进展对大，本领域的技术人员可以容易地得到这些生物。例如，芽孢杆菌的KSM-S237株（保藏号FERMBP-7875）、KSM-64株（保藏号FERM BP-2886）、KSM-635株（保藏号FERM BP-1485）分别基于一并记载的保藏号被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）。

由这些芽孢杆菌属菌株制备基因组DNA例如可以使用Pitcher etal.,Lett.Appl.Microbiol.,1989,8:p.151-156中记载的方法等进行。包含亲本碱性纤维素酶基因的模板DNA可以以将包含从已制备的cDNA或基因组DNA中切出的亲本碱性纤维素酶基因的，DNA片段插入任意的载体中的形式来进行制备。另外，将包含编码来自芽孢杆菌KSM-S237的碱性纤维素酶（序列号2）、来自DSM12648株的碱性纤维素酶（序列号4）、来自1139株的碱性纤维素酶（序列号6）、来自KSM-64株的碱性纤维素酶（序列号8）、来自KSM-635株的碱性纤维素酶（序列号10）和来自N-4株的碱性纤维素酶（序列号12）的碱基序列的已经报道的DNA序列（GenBank注册序列）分别表示为序列号1（GenBank注册号AB018420）、序列号3、序列号5（GenBank注册号D00066）、序列号7（GenBank注册号M84963）、序列号9（GenBank注册号M27420）和序列号11（GenBank注册号M25500）。

对亲本碱性纤维素酶基因的位点特异性突变导入，通常可以使用包含应导入的核苷酸突变的突变引物来进行。这样的突变引物被设计为包含：在包含编码亲本碱性纤维素酶基因内的取代对象的氨基酸残基的核苷酸序列的区域中进行退火，并且代替编码其取代对象的氨基酸残基的核苷酸序列（密码子）而具有编码取代后的氨基酸残基的核苷酸序列（密码子）的碱基序列即可。编码取代对象和取代后的氨基酸残基的核苷酸序列（密码子）只要是本领域的技术人员可以基于通常的教科书等适当认识选择。

例如，在将S237纤维素酶（序列号2）的58位的谷酰胺残基取代为精氨酸残基的情况下，可以使用包含将对应于该谷酰胺的密码子CAA（序列号1的744位~746位）变更为精氨酸密码子GAA的序列的引物（Q58R-FW，序列号30）、和与其具有互补序列的引物（Q58R-RV，序列号29）作为突变引物。

另外，例如，在将S237纤维素酶（序列号2）的56位的丙氨酸取代为天冬氨酸的情况下，可以使用包含将对应于该丙氨酸的密码子GCA（序列号1的738位~740位）变更为天冬氨酸的密码子GAT的序列的引物5’-TCTGAGGCTGGCGATTTACAATTACAAG-3’（A56D-FW，序列号33）、和与其具有互补序列的引物5’-CTTGTAATTGTAAATCGCCAGCCTCAGA-3’（A56D-RV，序列号34）作为突变引物。

另外，例如，在将S237纤维素酶（序列号2）的419位的天冬酰胺取代为丙氨酸的情况下，可以使用包含将对应于该天冬酰胺的密码子AAT（序列号1的1827位~1829位）变更为丙氨酸的密码子GCT的序列的引物5’-AGGATTTGGAGTGGCTTCGGATTCTCCAAA-3’（N419A-FW，序列号22）、和与其具有互补序列的引物（N419A-RV，序列号21）作为突变引物。

本发明中使用的引物可以根据亚磷酰胺法（Nucleic Acids Research,17,7059-7071,1989）等公知的寡核苷酸合成法来进行制作。这样的引物合成也可以使用例如市售的寡核苷酸合成装置（ABI公司制造等）进行制作。可以通过使用包含突变引物的引物对，将亲本碱性纤维素酶基因作为模板DNA进行如上所述的位点特异性突变导入，从而得到导入了目标突变的突变碱性纤维素酶基因。本发明也涉及由此得到的突变碱性纤维素酶基因。另外，本发明中的“突变碱性纤维素酶基因”是指编码突变碱性纤维素酶的氨基酸序列的任意的核酸片段（包括DNA、mRNA和人工核酸等）。本发明所涉及的“基因”除了开放阅读框架（open reading frame）也包括非翻译区域（UTR）等其它碱基序列。

通过用通常方法将得到的突变碱性纤维素酶基因插入任意的载体中进行连接，从而可以制作重组载体。本发明所用的载体没有特别地限定，可以是质粒、噬菌体、噬粒（phagemid）、粘粒、病毒、YAC载体、穿梭载体等任意的载体。作为这样的载体没有限定，更优选在细菌内、特别是芽孢杆菌属细菌内能够扩增的载体，更优选在芽孢杆菌属细菌内能够诱导导入基因表达的表达载体。其中，在重组产生突变碱性纤维素酶的方面，特别优选使用作为芽孢杆菌属细菌和其它生物都能够复制的载体的穿梭载体。作为优选的载体的例子没有限定，可以列举pHY300PLK（能够转化大肠杆菌和枯草杆菌两者的表达载体，Ishikawa,H.and Shibahara,H.,Jpn.J.Genet,(1985)60,p.235-243）、pAC3（Moriyama,H.et al.,Nucleic Acids Res.(1988)16,p.8732）等的穿梭载体、pUB110（Gryczan,T.J.et al.,J.Bacteriol.(1978)134,p.318-329）、pTA10607（Bron,S.et al.,Plasmid,18(1987)p.8-15）等能够用于芽孢杆菌属细菌的转化的载体、能够赋予重组蛋白质分泌信号的分泌载体（山根等，“根据枯草杆菌分泌载体的融合蛋白质”，淀粉科学，34.(1987),p.163-170）等。另外，也可以使用来自大肠杆菌的质粒（例如，pET22b（+）、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）。

为了重组生产突变碱性纤维素酶的目的，载体优选为表达载体。表达载体除了转录启动子、终止子、核糖体结合位点等宿主生物中表达所必需的各种元件以外，可以根据需要包含选择标记基因或多聚接头（polylinker）、增强子等顺式元件、PolyA信号（polyadenylationsignal）、核糖体结合序列（SD序列）等有用的序列。

可以使用包含突变碱性纤维素酶基因的重组载体来制作转化体。在本发明中，可以通过将包含本发明所涉及的突变碱性纤维素酶基因的重组载体（具体为重组表达载体）导入宿主细胞中来制作转化体（转化细胞），将其在诱导重组蛋白质表达的条件下进行培养，从而使突变碱性纤维素酶产生。本发明也涉及由此制成的转化体、以及使用该转化体的突变碱性纤维素酶的制造方法。作为导入重组载体的宿主细胞，除了大肠杆菌或枯草杆菌等细菌、以酵母细胞为首的微生物以外，还可以使用昆虫细胞、动物细胞（例如，哺乳动物细胞）、植物细胞等任意的细胞。在本发明中，特别优选使用枯草杆菌等芽孢杆菌属细菌。

对于转化，例如可以适用磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪转化法（Microprojectile Bombardment Method）、PEG法等公知的转化技术。例如，作为能够适用于芽孢杆菌属细菌的转化法，可以列举感受态细胞转化法（Bott.K.F.and Wilson,G.A.,J.Bacteriol.(1967)93,1925）、电穿孔法（Brigidi.P.et al.,FEMS Microbiol.Lett.(1990)55,135）、原生质体转化法（Chang,S.and Cohen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,(1979)168,p.111-115）、Tris-PEG法（Takahashi W.et al.,J.Bacteriol.(1983)156,p.1130-1134）等。

用于重组蛋白质生产的上述转化体的培养对于本领域技术人员可以按照通常的方法进行。例如，作为基于大肠杆菌或酵母细胞等微生物宿主来培养转化体的培养基，只要是含有宿主微生物能够同化的碳源、氮源、无机盐类等且能够高效地进行转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基的任意一种。也可以对应于药剂筛选标记的种类在培养基中添加氨苄西林或四环素等。在对使用诱导性的启动子作为启动子的表达载体而转化得到的微生物进行培养的情况下，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对使用Lac启动子的表达载体而转化得到的细菌等进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）等；在对使用trp启动子的表达载体而转化得到的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚乙酸（IAA）等。培养条件没有特别地限定，优选在适合于转化所使用的宿主生物的条件下进行。例如，对于用于生产重组蛋白质的枯草杆菌转化体的培养，可以使用例如LB培养基、2×YT培养基、2×L-麦芽糖培养基或者CSL发酵培养基等。

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶可以使用无细胞翻译体系使其从突变碱性纤维素酶基因或其转录产物表达。“无细胞翻译体系”是指在机械性地破坏作为宿主的细胞得到的悬浊液中加入蛋白质翻译所必需的氨基酸等试剂，从而构成体内（in vitro）转录翻译体系或体内（in vitro）翻译体系。己表达的突变碱性纤维素酶可以通过单独或适当组合使用蛋白质精制所用的通常的方法，例如离心分离、硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱等，从培养液、细胞破碎液或者无细胞翻译体系中取得。然而，使用离心分离或超滤膜等进行分离或浓缩得到的其培养上清液或溶菌液上清液等溶液可以直接用作粗酶液。在没有从细胞内分泌已表达的突变碱性纤维素酶的情况下，破碎其细胞进行蛋白质的分离精制即可。

对于如上所述制造的突变碱性纤维素酶，可以用后述的防止再污染能力评价法确认防止再污染能力的提高。

另外，本发明中使用的mRNA的制备、cDNA的制作、PCR、RT-PCR、文库的制作、对载体中的连接、细胞的转化、DNA的碱基序列的确定、核酸化学合成、蛋白质的N末端侧的氨基酸序列的确定、致突变、蛋白质的提取等实验可以根据通常的实验书中记载的方法来进行。作为这样的实验书，例如可以列举Sambrook等的分子克隆实验指南（2001年）第3版（Molecular Cloning,A laboratory manual,(2001)3rdEd.,Sambrook,J.&Russell,DW.Cold Spring Harbor Laboratory Press）。特别是，对于枯草杆菌的基因重组实验，可以参照例如，吉川博文著“7.2枯草杆菌类”《续生化学实验讲座1.基因研究法Ⅱ》，（1986）东京化学同人社（东京），p.150-169等与枯草杆菌的基因操作相关的一般实验书。

2．突变碱性纤维素酶的性质的评价

（2-1）防止再污染能力

本发明的突变碱性纤维素酶，与其亲本碱性纤维素酶比较提高了防止再污染能力。

本发明中的碱性纤维素酶（突变碱性纤维素酶或亲本碱性纤维素酶）的“防止再污染能力”是指，添加在水溶液中的碱性纤维素酶阻止分散于水溶液中的疏水性（亲油性）的污垢物质对存在于水溶液中的布等基质的再附着的能力。另一方面，“防止再污染效果”是指在碱性纤维素酶（突变碱性纤维素酶或亲本碱性纤维素酶）存在下，阻止分散于水溶液中的疏水性（亲油性）的污垢物质对水溶液中的布等基质的再附着及其阻止水平。

防止再污染能力的评价优选通过使用以下的洗涤液来洗涤棉白布，测定洗涤后的白布在550nm下的反射率，并与未洗涤的棉白布的同反射率进行比较来进行，该洗涤液通过在溶解了洗涤剂组合物的使用水中加入作为疏水性灰尘污垢的模型的碳黑并使之分散的分散液中，添加上述制造的突变碱性纤维素酶来制备。防止再污染能力评价法的具体操作顺序记载于后述的实施例中。另外，本发明的防止再污染能力评价中使用的使用水可以通过对于去离子水使CaCl₂和MgCl₂·6H₂O适当溶解来进行制备。

在防止再污染能力评价中，可以基于洗涤前和洗涤后的棉白布的反射率用下式算出各试验体系中得到的防止再污染率。

防止再污染率（%）={（试验后的棉白布的反射率）／（试验前的棉白布的反射率）}×100

该防止再污染率越接近100%，表示由碳黑造成的再污染量越少。

此外，对于使用添加了突变碱性纤维素酶的洗涤液（酶添加组）和没有添加突变碱性纤维素酶的洗涤液（酶未添加组）的试验体系，基于算出的防止再污染率，可以用下式算出由添加突变碱性纤维素酶产生的防止再污染促进度（%）。

由添加酶产生的防止再污染促进度（%）={（酶添加组的防止再污染率）-（酶未添加组的防止再污染率）}／{100-（酶未添加组的防止再污染率）}×100

该防止再污染促进度（%）越高，则表示通过添加突变碱性纤维素酶而越大地改善防止再污染效果。

另外，在各个突变碱性纤维素酶中，用下式算出防止再污染能力提高度。另外，下式中的“突变酶”是突变碱性纤维素酶，对照酶是亲本碱性纤维素酶、即野生型碱性纤维素酶或突变导入前的碱性纤维素酶。

突变碱性纤维素酶的防止再污染能力提高度（%）={（突变酶添加组的防止再污染率）-（对照酶添加组的防止再污染率）}／{100-（对照酶添加组的防止再污染率）}×100

该防止再污染能力提高度（%）越高，则表示该突变碱性纤维素酶的防止再污染能力与突变导入前相比提高越大。

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶没有限定，但能够示出例如1~25%、通常为2~15%、更通常为3~12.5%的防止再污染能力提高度（%）。

（2-2）纤维素结合性

另外，对于本发明的突变碱性纤维素酶与其亲本碱性纤维素酶相比纤维素结合性降低。

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶中的纤维素结合性降低可以通过与后述的防止再污染能力评价法类似的方法进行确认。具体来说，在溶解了洗涤剂组合物的使用水中添加规定量的碱性纤维素酶和相对于洗涤液总量为5%量的氯化钠所制备的洗涤液中，20℃下使用搅拌式清洁试验机洗涤评价布（棉白布），洗涤后取出白布并轻轻拧干，在将其迅速投入2000mL自来水中之后，将其取出不进行洗涤地进行脱水，用考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）进行染色，轻轻拧干布浸渍于脱色液中，对其进行水洗进行熨烫之后，使用分光测色计测定明度（L值）。对照实验除了在洗涤液中添加野生型碱性纤维素酶以外以同样的操作顺序进行。比较得到洗涤后的评价布的明度（L值）。该L值随着蛋白质对评价布的吸附量的增加而降低。因此，与添加野生型碱性纤维素酶而得到的L值相比，L值越高表示突变碱性纤维素酶对评价布的吸附量越低，即表示纤维素结合性降低。

（2-3）蛋白酶耐性

另外，对于本发明的突变碱性纤维素酶与其亲本碱性纤维素酶相比能够提高蛋白酶耐性。

在本发明中，“蛋白酶耐性”是指通过配合了各种蛋白酶、特别是碱性蛋白酶的洗涤剂组合物中的纤维素酶的残留活性来进行评价的，纤维素酶相对于蛋白酶的稳定性。

具体来说，例如可以列举在添加了碱性蛋白酶的洗涤剂组合物中40℃下保存对象纤维素酶24小时的情况下，算出的该纤维素酶的残留活性（参照下式）。

纤维素酶残留活性（%）=（保存24小时后的纤维素酶活性／刚制备后的纤维素酶活性）×100

本发明的突变碱性纤维素酶的上述纤维素酶残留活性（%）示为例如20~75%、通常为50~70%，与亲本碱性纤维素酶相比提高了15~35%。

因此，本发明的提高了蛋白酶耐性的突变碱性纤维素酶优选在各种蛋白酶共存下使用。在此，作为蛋白酶，例如可以列举市售的Alcalase、Esperase、Savinase、Everlase、KANNASE（注册商标，Novozymes公司）、Properase、PLAFFECT（注册商标，Genencor公司）、KAP（花王）等。

3．突变碱性纤维素酶的用途

本发明所涉及的突变碱性纤维素酶对于水溶液中的疏水性污染物质具有高的防止再污染能力。因此，本发明所涉及的突变碱性纤维素酶可以有利地用作再污染防止剂。在再污染防止剂中除了突变碱性纤维素酶以外，还可以含有惰性载体、pH调节剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂等任意的添加剂。通过将这样的再污染防止剂添加到包含被洗涤物的水溶液中，从而可以有利地防止被洗涤物的再污染。例如，本发明所涉及的再污染防止剂可以配合于衣物用洗剂或家庭用洗剂等洗剂、柔软剂等中使用。

另外，本发明也提供一种包含本发明所涉及的突变碱性纤维素酶的酶组合物。本发明所涉及的酶组合物是指含有突变碱性纤维素酶作为活性成分的酶制剂。本发明所涉及的酶组合物除了突变碱性纤维素酶，还可以进一步包含以蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、糖化酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、普鲁兰酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶（xyloglucanase）、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、其它的甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶和转谷氨酰胺酶等为首的水解酶以及其中的2种以上的混合物。

本发明所涉及的酶组合物，另外，除了突变碱性纤维素酶和其它的酶以外，还可以含有pH调节剂、缓冲剂、防腐剂、盐、醇、糖类、培养基成分等其它成分。本发明所涉及的酶组合物可以是粉末、颗粒、冻结干燥物等任意的形态。

另外，本发明还提供一种含有本发明所涉及的突变碱性纤维素酶、再污染防止剂和酶组合物中的至少1种的洗涤剂组合物。本发明所涉及的洗涤剂组合物除了上述突变碱性纤维素酶或者、含有其的再污染防止剂和/或酶组合物，还可以配合公知的洗涤剂成分、例如表面活性剂、二价金属离子螯合剂、碱剂、再污染防止剂、漂白剂、荧光剂等。

作为上述表面活性剂，可以将阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂以及阳离子表面活性剂等任意表面活性剂的1种单独使用或2种以上组合使用。更优选的表面活性剂是阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。

作为阴离子表面活性剂，优选碳原子数为10~18的醇的硫酸酯盐、碳原子数为8~20的醇的烷氧基化物的硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸酯盐、烷烃磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、α-磺基脂肪酸烷基酯盐或脂肪酸盐。例如，优选使用烷基链的碳原子数为10~14、更优选为12~14的直链烷基苯磺酸盐和烷基硫酸盐作为本发明中的阴离子表面活性剂。作为这些盐的反离子，优选为碱金属盐或胺类，特别优选为钠、钾、单乙醇胺、二乙醇胺。

作为非离子表面活性剂，优选聚氧化烯烷基（碳原子数为8~20）醚、烷基糖苷（alkyl polyglycoside）、聚氧化烯烷基（碳原子数为8~20）苯基醚、聚氧化烯山梨醇酐脂肪酸（碳原子数为8~22）酯、聚氧亚烷基二醇脂肪酸（碳原子数为8~22）酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物。例如，可以优选使用聚氧乙烯（EO平均加成摩尔数6）烷基（碳原子数为12~14）醚作为本发明中的非离子表面活性剂。

本发明所涉及的洗涤剂组合物中的表面活性剂的合计量只要是本领域技术人员可以适当设定，从清洁力和溶解性的观点出发，相对于洗涤剂组合物的质量优选为10~60质量%、进一步优选为15~50质量%、更优选为20~45质量%。其中，阴离子表面活性剂的含量相对于洗涤剂组合物的质量优选为1~60质量%、进一步优选为1~50质量%、特别优选为3~40质量%。另外，非离子表面活性剂的含量相对于洗涤剂组合物的质量优选为1~45质量%、进一步优选为1~35质量%、特别优选为4~25质量%。阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂也可以分别单独使用，但是优选混合使用。另外，也可以根据目的并用两性表面活性剂或阳离子表面活性剂。

本发明所涉及的洗涤剂组合物可以进一步含有助洗剂。助洗剂是其自身虽然没有清洁力或只有极弱的清洁力，但是如果将其与表面活性剂一起配合，则能够显著提高其洗剂能力的化合物。作为助洗剂的作用，例如可以列举多价金属阳离子螯合作用、污垢分散作用或碱缓冲作用或这些作用的2种以上的组合等。所涉及的助洗剂有水溶性无机化合物、水不溶性无机化合物、有机化合物等。

作为水溶性无机化合物的助洗剂，可以列举磷酸盐（三聚磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐、磷酸三钠等）、硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐等。其中，从具有全部上述3种作用的观点出发，优选磷酸盐。作为水不溶性无机化合物的助洗剂，可以列举铝硅酸盐（A型沸石、P型沸石、X型沸石、非晶质铝硅酸盐等）、结晶性硅酸盐等。作为有机化合物的助洗剂，可以列举羧酸（氨基羧酸盐、羟氨基羧酸盐、羟基羧酸盐、环羧酸盐、马来酸衍生物、草酸等）、有机羧酸（盐）聚合物（丙烯酸聚合物和共聚物、多价羧酸（例如马来酸等）聚合物和共聚物、乙醛酸聚合物、多糖类及其盐等）等。其中，优选有机羧酸（盐）聚合物。对于助洗剂的盐，作为反离子优选碱金属盐、胺类，特别优选钠、钾、单乙醇胺或二乙醇胺。本发明所涉及的洗涤剂组合物所含的助洗剂优选包含上述水溶性无机化合物，进一步优选上述水溶性无机化合物和有机化合物的组合，更优选水溶性无机化合物、有机化合物和水不溶性无机化合物的组合。

本发明所涉及的洗涤剂组合物中的助洗剂的合计量只要是本领域的技术人员可以适当设定，但是相对于洗涤剂组合物的质量优选为20~80质量%、进一步优选为30~70质量%、更优选为35~60质量%。其中水溶性无机化合物助洗剂相对于洗涤剂组合物的质量优选为10~50质量%、进一步优选为15~45质量%、更优选为20~40质量%。其中水不溶性无机化合物助洗剂相对于洗涤剂组合物优选为5~50质量%、进一步优选为10~45质量%、更优选为15~40质量%。其中有机化合物助洗剂相对于洗涤剂组合物优选为0.1~20质量%、进一步优选为0.3~15质量%、更优选为0.5~10质量%。

作为本发明所涉及的洗涤剂组合物的具体的优选的组成，可以列举以下的组成A~E等。

组成A：直链烷基（碳原子数为12~14）苯磺酸钠盐20重量%、非离子表面活性剂（碳原子数为12~16，平均环氧乙烷加成摩尔数6.0的聚氧乙烯烷基醚）4重量%、碳酸钠30重量%、硫酸钠10重量%、沸石（4A型沸石（TOSOH CORPORATION制造））30重量%、丙烯酸马来酸共聚物2重量%、结晶性硅酸盐（粉末SKS-6（HOECHSTTOKUYAMA Co.,Ltd.制造））4重量%

组成B：直链烷基（碳原子数为12~14）苯磺酸钠盐24重量%、直链烷基（碳原子数为10~13）硫酸酯钠5%、脂肪酸（碳原子数为14~18）钠盐6%、非离子表面活性剂（碳原子数为12~16，平均环氧乙烷加成摩尔数为6.0的聚氧乙烯烷基醚）7重量%、三聚磷酸钠12%、碳酸钠12重量%、硫酸钠6重量%、沸石（4A型沸石（TOSOH CORPORATION制造））14重量%、聚丙烯酸钠（平均分子量10000）6重量%、结晶性硅酸盐（粉末SKS-6（HOECHST TOKUYAMA Co.,Ltd.制造））8重量%

组成C：直链烷基（碳原子数为12~14）苯磺酸钠盐12重量%、非离子表面活性剂（碳原子数为12~16、平均环氧乙烷加成摩尔数为6.0的聚氧乙烯烷基醚）11重量%、碳酸钠28重量%、硫酸钠11重量%、沸石（4A型沸石（TOSOH CORPORATION制造））28重量%、聚丙烯酸钠（平均分子量10000）8重量%、结晶性硅酸盐（粉末SKS-6（HOECHST TOKUYAMA Co.,Ltd.制造））2重量%

组成D：直链烷基（碳原子数为12~14）苯磺酸钠盐14重量%、脂肪酸（碳原子数为14~18）钠盐2%、非离子表面活性剂（碳原子数为12~16，平均环氧乙烷加成摩尔数为6.0的聚氧乙烯烷基醚）10重量%、三聚磷酸钠23%、碳酸钠29重量%、硫酸钠6重量%、沸石（4A型沸石（TOSOH CORPORATION制造））11重量%、聚丙烯酸钠（平均分子量10000）3重量%、结晶性硅酸盐（粉末SKS-6（HOECHSTTOKUYAMA Co.,Ltd.制造））2重量%

组成E：非离子表面活性剂（碳原子数为12~16，平均环氧乙烷加成摩尔数为12.0的聚氧乙烯烷基醚）20重量%、烷基苄基二甲基氯化铵（烷基碳原子数为8~18）1重量%、Softanol 70H（日本触媒制造）20重量%、丙烯酸马来酸共聚物1.5重量%、单乙醇胺1.5重量%、柠檬酸1.15重量%、丁二醇5重量%、乙醇2重量%、亚硫酸钠0.2重量%、水47.65重量%

本发明所涉及的洗涤剂组合物可以进一步包含水、pH调节剂、缓冲剂、分散剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂、荧光染料等染料、除臭剂、防臭剂、香料、柔软剂、植物提取物等其它成分。本发明所涉及的洗涤剂组合物可以是粉末、颗粒、压缩成型片、液状等任意的形态。本发明所涉及的洗涤剂组合物，从携带性和简便性的观点出发，可以将一次使用量分包包装，在该情况下，优选包装材料是水溶性。

本发明所涉及的洗涤剂组合物没有限定，但是优选为衣物用或布制品（床单、窗帘、地毯、壁布等）用的洗涤剂组合物。本发明所涉及的洗涤剂组合物因为含有具有高防止再污染能力的突变碱性纤维素酶，所以可以发挥良好的防止再污染效果。

本发明突变碱性纤维素酶在洗涤剂组合物中的配合量只要表现出碱性纤维素酶活性的量就没有特别地限制，每1kg洗涤剂组合物优选为0.1~5000U、进一步优选为1~3000U、更优选为10~2000U。

实施例

以下，使用实施例来更具体地说明本发明。但是，本发明的技术范围并不限定于这些实施例。

另外，下文中首先记载共同使用的实验操作顺序和试剂等。

1）DNA片段的扩增

使用GeneAmp PCR系统（应用生物系统，Applied Biosystems），用Pyrobest DNA聚合酶（Takara Bio,Inc.）和附带的试剂类，通过聚合酶链式反应（PCR）来进行DNA片段的扩增。PCR的反应液组成如下：混合1μL适当稀释的模板DNA、各20pmol的正义引物（senseprimer）和反义引物（antisense primer）、以及2.5U Pyrobest DNA聚合酶，并加入水将反应液总量调整为50μL。PCR反应在重复循环30次以下3阶段的温度变化后，在72℃下使之反应5分钟的条件下进行，3阶段的温度变化为98℃下10秒、55℃下30秒和72℃下1~5分钟（根据目标扩增产物进行调整，基准为每1kb为1分钟）。

将后述的DNA片段扩增中使用的引物表示于表1-1~表1~3中。

表1-1：

引物名称	引物序列（5'→3'）	序列号
			237UB1	TTGCGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAGGAAATTTC	13
S237RV	TCGCTACCCTTTTATTATCG	14
			Q71E-RV	ATTTTTTCTCCATGTTCATCTACTAATGTC	15
Q71E-FW	GACATTAGTAGATGAACATGGAGAAAAAAT	16
			S193R-RV	TCCACCATTATTATTACGACTCGGCTCA	17
S193R-FW	TGAGCCGAGTCGTAATAATAATGGTGGA	18
			Q242S-RV	AGTCCGGACGCGAACTCCAGTTTG	19
Q242S-FW	CAAACTGGAGTTCGCGTCCGGACT	20

表1-2：

引物名称	引物序列（5'→3'）	序列号
			N419A-RV	TTTGGAGAATCCGAAGCCACTCCAAATCCT	21
N419A-FW	AGGATTTGGAGTGGCTTCGGATTCTCCAAA	22
			D421A-RV	CTTTATTTGGAGAAGCCGAATTCACTCCA	23
D421A-FW	TGGAGTGAATTCGGCTTCTCCAAATAAAG	24
			W454Y-RV	AGACGAGCATTAGCATAGAAGTTGCCATCT	25
W454Y-FW	AGATGGCAACTTCTATGCTAATGCTCGTCT	26
			W501Y-RV	CTCTGGATTTGCATATCCACTTTTAC	27
W501Y-FW	GTAAAAGTGGATATGCAAATCCAGAG	28

表1-3：

引物名称	引物序列（5'→3'）	序列号
			Q58R-RV	ATCGACTTCTTGTAATTCTAATGCGCCA	29
Q58R-FW	TGGCGCATTAGAATTACAAGAAGTCGAT	30
			Q58E-RV	ATCGACTTCTTGTAAACGTAATGCGCCA	31
Q58E-FW	TGGCGCATTACGTTTACAAGAAGTCGAT	32

此外，将在实施例3~5中用于将目标氨基酸突变导入S237纤维素酶或突变S237纤维素酶中所用的上游侧区域扩增用和下游侧区域扩增用的引物对表示于表2-1~表2-3中（具体参照后述的实施例）。

表2-1：

表2-2：

表2-3：

2）对枯草杆菌的基因导入

将编码S237纤维素酶或突变S237纤维素酶的基因导入枯草杆菌通过感受态细胞转化法（J.Bacteriol.93,1925(1967)）、电穿孔法（FEMSMicrobiol.Lett.55,135(1990)）或原生质体转化法（Mol.Gen.Genet.168,111(1979)）的任意一种来进行。

在感受态细胞转化法中，首先，通过在SPI培养基（0.20%硫酸铵、1.40%磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%柠檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸（Difco）、5mM硫酸镁、0.25μM氯化锰、50μg/mL色氨酸）中37℃下振荡培养枯草杆菌（Bacillus subtilisMarburg No.168株（Nature,390,(1997)p.249））直至生长度（OD600）的值达到1左右。在振荡培养之后，将一部分培养液接种于9倍量的SPII培养基（0.20%硫酸铵、1.40%磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%柠檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.01%酪蛋白氨基酸（Difco）、5mM硫酸镁、0.40μM氯化锰、5μg/mL色氨酸），再进行振荡培养直至生长度（OD600）的值达到0.4左右，从而制备枯草杆菌细胞作为感受态细胞。接着，在100μL制备的感受态细胞悬浊液（SPII培养基中的感受态细胞培养物）中添加2μL含有质粒载体的溶液，该质粒载体包含编码S237纤维素酶或突变S237纤维素酶的基因，在37℃下振荡培养1小时之后，将其全部涂抹于包含适当的选择药剂的LB琼脂培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl、1.5%琼脂）上。在37℃下静置培养之后，将生长的菌落分离为转化体。

在原生质体转化法中，首先，通过在50mL的LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl）中37℃下振荡培养枯草杆菌（Bacillus subtilis MarburgNo.168株（Nature,390,(1997)p.249））约2小时，在600nm下的吸光度变为0.4时室温下通过离心分离（7000prm、15分钟），收集菌体。在将收集到的菌体悬浊于5mL的SMMP[0.5M蔗糖、20mM马来酸二钠、20mM氯化镁6水盐、35%（w/v）抗生素培养基3号（Antibiotic Medium 3，Difco）]之后，在SMMP溶液中添加已经溶解的500μL的溶菌酶溶液（30mg/mL），37℃下保温1小时，将菌体原生质体化。在保温结束之后，室温下通过离心分离（2800rpm，15分钟）收集原生质体，将其悬浊于5mL的SMMP中，制备原生质体溶液。在0.5mL的原生质体溶液中加入10μL的质粒溶液（含有质粒载体，该质粒载体包含编码S237纤维素酶或S237纤维素酶突变体的基因）和1.5mL的40%（w/v）聚乙二醇（PEG8000，Sigma），进行缓慢搅拌，在室温下放置2分钟之后，立刻混合5mL的SMMP溶液，室温下通过离心分离（2800rpm，15分钟）来收集原生质体，将其再次悬浊于1mL的SMMP溶液中。在37℃下振荡（120rpm）原生质体悬浊液90分钟之后，将该原生质体悬浊液涂布于含有四环素（15μg/mL，Sigma）的DM3再生琼脂培养基[0.8%（w/v）琼脂（和光纯药）、0.5%琥珀酸二钠6水盐、0.5%工业级酪蛋白氨基酸（Casamino AcidsTechnical，Difco）、0.5%酵母提取物、0.35%磷酸一钾、0.15%磷酸二钾、0.5%葡萄糖、0.4%氯化镁6水盐、0.01%牛血清蛋白（Sigma）、0.5%羧甲基纤维素、0.005%台盼蓝（Merck）和氨基酸混合液（色氨酸、亮氨酸、蛋氨酸各10μg/mL）]上，在30℃下培养72小时，分离生长的菌落作为转化体。

对于后述的实施例中的用于重组蛋白质生产的转化体的培养，作为种子培养培养基使用LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl），作为主培养培养基使用2×YT培养基（1.6%胰蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%NaCl）或2×L-麦芽糖培养基（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、1%NaCl、7.5%麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物）。

3）洗涤剂组合物的制备

对于防止再污染能力的评价，作为洗涤剂组合物使用前述的优选的组成C或E的洗涤剂、或者由Wfk Testgewebe GmbH（D-41379，Gemany）提供的IEC-A洗剂（组成F）。对于酶稳定性试验的评价，使用组成E的洗涤剂。

4）防止再污染能力评价

防止再污染能力的评价基于JIS K3362:1998记载的清洁力评价方法如下所述进行。将0.33g洗涤剂组合物溶解于50mL使用水（在4°DH的情况下CaCl₂：55.42mg/L、MgCl₂·6H₂O：43.51mg/L，在12°DH的情况下CaCl₂：166.26mg/L、MgCl₂·6H₂O：130.53mg/L）中，在其中添加0.125g作为疏水性灰尘污垢的模型的碳黑（Asahi CarbonCo.,Ltd.制造的Asahi清洁用碳黑或三菱化学制造的碳黑#4000B、MA100或者#40），加入50mL使用水（CaCl₂：55.42mg/L、MgCl₂·6H₂O：43.51mg/L）之后，照射26±1.5KHz的超声波5分钟使成分均匀地分散。在该分散液中进一步加入400mL20℃的使用水（CaCl₂：55.42mg/L、MgCl₂·6H₂O：43.51mg/L），添加碱性纤维素酶（S237纤维素酶或突变S237纤维素酶）以使其为规定的酶量，将其作为洗涤液。将制得的洗涤液移至20℃下的搅拌式清洁力试验机Terg-O-To meter（上岛制作所）的试料杯中。将5块作为评价布的6cm×6cm的棉白布（#2003白色织制100%棉，谷头商店（大阪府大阪市东淀川区小松4-11-15）供给）放入试料杯中，进一步适当投入用于调节相对于溶液的布量（浴比）的棉针织品白布[将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤得到的布]，在转速80±4rpm下搅拌10分钟。接着，将棉白布与棉针织品白布一起取出，轻轻拧干之后，迅速地投入2000mL的自来水中。之后仅取出棉白布，再用流动的自来水进行3分钟洗涤之后，进行脱水·熨烫，使用分光测色计CM-3500d（KONICA MINOLTA）测定550nm下的反射率（将以上称为酶添加组）。对于棉白布，在洗涤试验之前，预先使用分光测色计CM-3500d（KONICA MINOLTA）测定550nm下的反射率。对照实验除了不在上述分散液中添加碱性纤维素酶以外按照同样的操作顺序进行（酶未添加组）。

基于得到的反射率，用下式算出各洗涤试验中的防止再污染率。

防止再污染率（%）={（试验后的棉白布的反射率）／（试验前的棉白布的反射率）}×100

接着，基于算出的防止再污染率，基于下式算出添加酶对于防止再污染的效果、即由添加碱性纤维素酶产生的防止再污染促进度。在后述的实施例中，将该防止再污染促进度（%）作为指标，评价添加了碱性纤维素酶的防止再污染能力。

由添加酶产生的防止再污染促进度（%）={（酶添加组的防止再污染率）-（酶未添加组的防止再污染率）}／{100-（酶未添加组的防止再污染率）}×100

此外，用下式算出对碱性纤维素酶的突变导入对于防止再污染带来的效果、即突变碱性纤维素酶中的防止再污染能力提高度。另外，突变酶是已经导入目标氨基酸取代的突变碱性纤维素酶，对照酶是亲本碱性纤维素酶、即野生型碱性纤维素酶或氨基酸残基取代前的碱性纤维素酶。

突变碱性纤维素酶中的防止再污染能力提高度（%）={（突变酶添加组的防止再污染率）-（对照酶添加组的防止再污染率）}／{100-（对照酶添加组的防止再污染率）}×100

5）来自芽孢杆菌（Bacillus sp.）KSM-S237株的碱性纤维素酶（S237 纤维素酶）的防止再污染能力的评价

（1．S237纤维素酶的重组生产）

将包含编码来自芽孢杆菌（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERMBP-7875）的S237纤维素酶（序列号2）的碱性纤维素酶基因[以下，也称为S237纤维素酶基因；碱基序列基于GenBank注册号AB18420（序列号1）能够得到；Hakamada et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(11),(2000)p.2281-2289；日本特开2000-210081号公报]的核酸片段（3.1kb），使用由上述表1-1所示的引物237UB1和S237RV组成的引物对，按照上述“1）DNA片段的扩增”来进行扩增。作为模板DNA，使用根据通常方法由上述KSM-S237株提取的基因组DNA。

扩增片段插入穿梭载体pHY300PLK（Yakult Honsha Co.,Ltd.；Ishiwa，H.& Shibahar，H，.Jpn.J.Genet.(1985)60，p.235-243）的SmaI限制酶切割部位，构建重组质粒pHY-S237。对于质粒中所插入的S237纤维素酶基因片段，通过使用3100DNA定序器（Applied Biosystems）进行序列确定，从而可以确认具有序列号1所示的碱基序列。接着，按照上述的“2）对枯草杆菌的基因导入”，通过原生质体转化法，使用重组质粒pHY-S237来转化枯草杆菌（Bacillus subtilis MarburgNo.168株（Nature,390,(1997)p.249））。在30℃下将由此得到的转化体用10mL的LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl）进行一夜振荡培养，再将0.05mL该培养液接种于50mL的2×L-麦芽糖培养基（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、1%NaCl、7.5%麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物、15ppm四环素），在30℃下进行振荡培养3天。将通过离心分离除去了菌体的培养液上清液用去离子水稀释10倍之后，添加到已经用20mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）平衡化的DEAE-Toyopearl 650C（TOSOH）柱（1cm×3cm）中。在用10mL包含0.075M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）清洗柱之后，用10mL包含0.4M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）使蛋白质从柱中洗脱。作为目标的重组S237纤维素酶在电泳中作为几乎单一的成分被洗脱。将洗脱样品用包含1mM CaCl₂的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（pH7.5）进行透析，脱盐处理之后，通过以下的方法测定碱性纤维素酶含量。具体而言，在用1/7.5M磷酸缓冲液（pH7.4，和光纯药）适当稀释的上述样品溶液50μL中加入50μL 0.4mM对硝基苯基-β-D-纤维三糖苷（生化学工业）并进行混合，在30℃下进行反应时基于420nm下的吸光度（OD420）变换来定量游离的对硝基苯酚的量。将1分钟内使1μmol的对硝基苯酚游离的酶量作为1U。另外，使用PROTEIN ASSAY RAPID KIT（和光纯药工业制造），将试剂盒所带的牛血清蛋白作为标准进行蛋白质量测定。

将含有由此得到的重组S237纤维素酶（野生型S237纤维素酶）的样品供给于后述的防止再污染能力评价。此时，相对于500mL的清洗体系，添加相当于26.4mU、52.8mU、106mU、211mU和264mU的酶蛋白质量并进行评价。

（2．使用各种碳黑的防止再污染能力评价）

使用各种碳黑评价S237纤维素酶的防止再污染能力。作为碳黑，使用Asahi Carbon Co.,Ltd.制造的Asahi清洁用碳黑、或者三菱化学制造的碳黑#4000B、MA100或#40这4种。

在评价防止再污染能力之前，如以下所述调查各碳黑的特性（疏水性和酸性官能团含量）。具体而言，取0.1%（w/v）聚氧乙烯（EO平均加成摩尔数为6）烷基（碳原子数为12~14）醚水溶液100mL在100mL容量的烧杯（IWAKI）中，将0.1g各碳黑的粉末从距离水溶液表面10cm的高度落下，测量直至全部粉末沉淀的时间。3次测量的结果为，#4000B用4.9±0.6秒沉淀，MA100用14.1±1.0秒沉淀，#40用60.5±4.6秒沉淀。Asahi清洁用碳黑即使经过10分钟以上，也有一部分留在水溶液表面，但是直至全部沾湿的时间为78.8±9.1秒。由这些结果可知，各碳黑中的疏水性以#4000B最低，其次按MA100、#40的顺序，Asahi清洁用碳黑的疏水性最高。接着，对各个碳黑悬浊液照射26±1.5KHz的超声波5分钟使之分散，一边充分地搅拌、一边进行pH测定。不含碳黑的0.1%（w/v）聚氧乙烯（EO平均加成摩尔数为6）烷基（碳原子数为12~14）醚水溶液的pH为4.75，如果使各碳黑分散于其中，则分散了#4000B的溶液的pH为4.97，分散了MA100的溶液的pH为4.69，分散了#40的溶液的pH为4.81，分散了Asahi清洁用碳黑的溶液的pH为4.86。这样因为其添加而使分散液的pH降低，所以认为MA100包含最多的酸性官能团（认为大部分为羧基）。另一方面，在调查中认为#4000B的酸性官能团含量最少。

依据以上的各碳黑的特性，按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来进行防止再污染能力的评价。使用上述组成C的洗涤剂，将添加了相当于0mU、106mU或264mU酶量的S237纤维素酶时的结果表示于表3（防止再污染率）和表4（防止再污染促进度）中。

表3：

表4：

如表4所示，确认通过添加S237纤维素酶，对于任意的碳黑都有促进防止再污染的效果。Asahi清洁用碳黑表现出最显著的防止再污染促进效果，虽然只有微小差距按MA100、#40、#4000B的顺序继续。从该顺序可以推测，由添加S237纤维素酶产生的防止再污染促进效果受到碳黑的疏水性高的较大影响。

为了进一步比较，分别使用作为其它种类的水解酶的蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶来代替S237纤维素酶，还分别使用作为其它种类的纤维素酶的Endolase（Novozymes公司）和Carezyme（Novozymes公司）来代替S237纤维素酶，采用与上述同样的方法进行防止再污染能力评价。以相当于26.4mU、52.8mU、211mU的各浓度的蛋白质量使用各酶。碳黑使用Asahi Carbon Co.,Ltd.制造的Asahi清洁用碳黑。作为对照实验，使用S237纤维素酶在相同条件下进行防止再污染能力评价。将其结果表示于图2。

其结果，在使用蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶的情况下，酶添加组和酶未添加组的防止再污染率都为52%左右没有差异，通过添加这些酶产生的防止再污染促进效果没被确认。另一方面，在使用S237纤维素酶的情况下，由于伴随着酶添加量的增加确认防止再污染率上升，因此，确认具有防止再污染促进效果。

在分别使用Endolase（Novozymes公司）和Carezyme（Novozymes公司）的情况下，伴随着酶添加量的增加，防止再污染率慢慢上升。然而，如果与S237纤维素酶相比，其上升的程度较小，防止再污染促进效果微小。另一方面，在使用S237纤维素酶的情况下，确认表现出比Carezyme高的防止再污染促进效果、Endolase的2倍或其以上的防止再污染促进效果。该结果表明，S237纤维素酶带来高的防止再污染促进效果，而这些效果是在使用其它酶的情况下所没有的。

（3．防止再污染促进效果的pH依赖性的探讨）

如以下所述调查洗涤液pH值对于由酶添加产生的防止再污染促进效果的影响。使用组成E的洗涤剂以及相当于0mU或52.8mU的酶量的S237纤维素酶，按照上述的防止再污染能力评价法进行评价。但是使用洗涤液的pH通过添加硫酸而调整为8.0、4.3、4.1或3.6的洗涤液。

其结果如图3所示，在pH4.1时防止再污染促进效果少许降低，在pH3.6时防止再污染促进效果降低较大。即使考虑到在记载了关于S237纤维素酶的发明的专利文献1中所表明的，S237纤维素酶的pH稳定性在pH4附近降低较大（专利文献1的图3），也认为上述结果表明S237纤维素酶所具有的防止再污染能力在发生pH降低这样不可逆结构变化的条件下受损较大。此外，在pH5以下的条件下S237纤维素酶应该几乎不表现出活性（专利文献1的图5），但是pH4.3时的防止再污染促进效果与pH8时几乎相等，由此也认为S237纤维素酶的防止再污染促进效果来自于其结构。

根据上述的防止再污染能力评价，确认疏水性低的MA100具有等于或大于#40的促进效果，因而推测S237纤维素酶的防止再污染能力受到碳黑的酸性官能团的含量，即负电荷因子的多少的影响。因此，认为S237纤维素酶的防止再污染能力依赖于S237纤维素酶与疏水性物质间的物理排斥（亲水性基团与疏水性基团间的排斥+静电排斥）。

另外，基于在上述pH依赖性的探讨中得到的结果，推测通过改变源于S237纤维素酶的结构的性质，可以提高其防止再污染能力。

具体来说，认为通过维持S237纤维素酶的基本的结构同时进一步提高酶表面的亲水性，从而使疏水性碳黑间产生高的排斥，其结果可以提高S237纤维素酶的防止再污染能力（参照图1B）。

6)S237纤维素酶的立体结构建模

作为提高S237纤维素酶表面的亲水性的方法，考虑了在S237纤维素酶中露出于酶表面的不带电氨基酸残基存在的氨基酸序列上的位置中，选择即使进行取代对S237纤维素酶总体结构的影响也小的位置，将该位置的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的手法。因此，为了选择优选的取代对象位置，首先，如以下所述构建S237纤维素酶的立体结构模型。

将来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（635纤维素酶）的催化区域的立体结构（注册Protein Data Bank (PDB)，1G01和1G0C）作为模型，按以下的操作顺序进行S237纤维素酶催化区域的立体结构建模。在计算机中使用IRIS Indigo2Extreme，作为转换用户接口程序（convert user interface program）使用insightII（Ver.95.5）。使用insightII的模块modeler 4，基于635纤维素酶的结构来构建S237纤维素酶的结构。具体而言，参照635纤维素酶的坐标作成S237纤维素酶序列的拓扑（topology），对于不能定义坐标的原子，参照高分子体系建模程序CHARMm（Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics，从http://www.charmm.org/能够访问）的残基拓扑结构文件（residuetopology file，RTF）来进行坐标的分配。接着，基于635纤维素酶和S237纤维素酶的氨基酸序列的比对，算出S237纤维素酶结构上的约束（restraint）作为概率密度函数（PDF）。制成模型的数预先指定为1，制成满足尽可能多的约束的模型。通过可变目标函数法（Veriable targetfunction method，VTF）如下所述进行模型的最优化。首先，仅选择容易优化的约束（对应的原子自身接近的约束条件），通过共轭梯度法（conjugate gradient method）实行能量最小化（Energy minimization），接着，对于其它约束条件重复这些步骤，从而最终对于全部约束实施采用共轭梯度法的能量最小化。接着，通过模拟退火进行模型的优化。在使用优化协议“Low”（通过最快分子动态（MD）模拟退火），仅选择不满足条件的约束和与其对应的原子，并且将除此以外的原子的固定的条件下，采用共轭梯度法进行能量最小化，通过模拟退火（加热条件（Heating）→冷却条件（cooling）），进一步共轭梯度法来进行能量最小化。接着，选择全部的约束和原子并通过共轭梯度法来进行能量最小化。计算约束违反度（Restraint violation），在确认没有特别问题的水平的基础上，构建最终模型。

构建的模型用程序Discovery Studio Visualizer Ver.1.5（AccelrysSoftware Inc.）进行可视化·解析。各氨基酸残基的残基溶剂可及性（Residue Solvent Accessibility）通过使用Discovery Studio VisualizerVer.1.5的Solvent Accessibility程序，并将原子每个的格点作为240、探针半径作为1.40进行解析，从而计算出。

将该残基溶剂可及性的值为50以上的氨基酸残基判断为表面露出度高的氨基酸残基，作为本发明中能作为取代对象的氨基酸残基的初级候选。从该初级候选中，首先排除带电氨基酸残基。接着，将模型的信赖性低的N末端区域的3个氨基酸残基和C末端区域的36个氨基酸残基也排除。另外，考虑到构建的模型是缺少纤维素结合区域（CBM区域）的模型，将S237纤维素酶的实际立体结构中有可能被CBM区域覆盖而没有露出于表面的369位的天冬氨酸（Asp369）以后的氨基酸残基从取代对象候选中排除。进一步，将S237纤维素酶的实际立体结构中构建模型时排除的有可能被氨基末端区域覆盖的42位的亮氨酸（Leu42）~44位的甘氨酸（Gly44）从取代对象候选中排除。另外，因为有可能与基质结合相关，所以将S237纤维素酶的基质结合袋附近的88位和240位的2个色氨酸（Trp88和Trp240）也从候选中排除。而且，将附近同时存在酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的250位和330位的天冬酰胺（Asn250和Asn330）也从取代对象候选中排除。其结果，选出55个不带电氨基酸残基作为本发明的取代对象氨基酸残基。通过将选出的这些不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基，使S237纤维素酶的表面电荷增大，从而可以提高S237纤维素酶的防止再污染能力。

此外，对于S237纤维素酶表现出高的同一性的其它纤维素酶也同样，因为在对应于这些55个氨基酸残基的位置上存在露出于酶表面的不带电氨基酸残基的可能性高，所以同样地通过将这些位置的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基，从而可以提高纤维素酶的防止再污染能力。

在下述表5的“S237”的列中，对于S237纤维素酶的催化区域示出了如上所述选拔出的能够作为取代对象的54个氨基酸残基。此外，在表5中，对于S237纤维素酶表现出高的氨基酸序列同一性的其它碱性纤维素酶的来自芽孢杆菌DSM12648株的碱性纤维素酶（DSM12648纤维素酶，序列号4）、来自芽孢杆菌1139株的碱性纤维素酶（1139纤维素酶，序列号6）、来自芽孢杆菌KSM-64株的碱性纤维素酶（内切-1,4-β-葡聚糖酶）（64纤维素酶，序列号8）、来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（KSM-635纤维素酶，序列号10）、以及来自芽孢杆菌N-4株的碱性纤维素酶（内切葡聚糖酶）（N4纤维素酶，序列号12），分别示出了将这些氨基酸序列和S237纤维素酶的氨基酸序列进行比对时相对于S237纤维素酶的上述55个氨基酸残基被比对（即，相当于这些残基的位置）的氨基酸残基（表5）。另外，各氨基酸残基的位置用各个序列号所示的碱性纤维素酶的氨基酸序列中的氨基酸残基的编号表示。

表5：

在后述的实施例3~4中，将这样选出的位置的不带电氨基酸残基中的71位和193位的氨基酸残基取代为带电氨基酸残基，进行突变S237纤维素酶的制作。

7）碱性纤维素酶对纤维素的吸附力与防止再污染能力的关系的探讨，以及使防止再污染能力提高的取代对象氨基酸残基的确定

如以下所述，根据与“4）防止再污染能力的评价”类似的方法，表明通过添加氯化钠促进碱性纤维素酶对纤维素的吸附。

按照已经报道的（Agric.Bio.Chem.,55,2387,1991）制备来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（635纤维素酶）。接着，将0.33g洗涤剂组合物溶解于550mL使用水（CaCl₂：55.42mg/L、MgCl₂·6H₂O：43.51mg/L）中，在其中添加2110mU的635纤维素酶和相对于洗涤液总量为5%量的氯化钠，作为洗涤液。将制得的洗涤液移至20℃下的搅拌式清洁力试验机Terg-O-To meter（上岛制作所）的试料杯中。将5块作为评价布的6cm×6cm的棉白布（#2003白色织制100%棉，谷头商店供给）放入试料杯中，投入40g洗涤棉针织品白布（在将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤的布），以转速80±4rpm搅拌10分钟。接着，将棉白布与棉针织品白布一起取出，轻轻拧干之后，将其迅速投入2000mL的自来水中。之后仅取出棉白布，不进行洗涤就脱水之后，将其投入考马斯亮蓝G染色液（将2.5g考马斯亮蓝G250（Merck）、4g甲醇、90mL乙酸溶解于910mL去离子水来制备）中。在浸渍30分钟之后，轻轻地拧干布并移至脱色液（将50mL去离子水、50mL甲醇、10mL乙酸混合来制备）中，浸渍30分钟并重复2次。其后，水洗布并进行熨烫之后，使用分光测色计CM-3500d（KONICAMINOLTA）测定明度（L值）。对照实验除了不向洗涤液中添加氯化钠以外按照同样的操作顺序进行。

其结果，不添加氯化钠情况下的L值为92，相对于此，添加了5%量的氯化钠情况下的L值为71。因为L值随着蛋白质对布的吸附而降低，所以该L值的降低意味着635纤维素酶对棉白布的吸附量增加。即，表明通过添加氯化钠可以促进碱性纤维素酶对纤维素的吸附。

接着，使用添加了5%量的氯化钠的洗涤液，按照上述的“4）防止再污染能力的评价”，评价在氯化钠存在下的635纤维素酶的防止再污染能力。使用上述组成B的洗涤液和1000mU的635纤维素酶。作为碳黑使用Asahi清洁用碳黑。作为对照实验，在洗涤液中没有添加氯化钠的情况下和在洗涤液中没有添加纤维素酶的情况下都同样地进行评价。

其结果，在添加了氯化钠的情况下，没有添加纤维素酶的洗涤液的防止再污染率为47%，添加纤维素酶的洗涤液的防止再污染率为30%，确认在纤维素酶的存在下防止再污染率降低。另一方面，在没有添加氯化钠的情况下，没有添加纤维素酶的洗涤液的防止再污染率为72%，添加纤维素酶的洗涤液的防止再污染率为82%，确认在纤维素酶存在下防止再污染率反而上升。综合考虑上述实验结果，在氯化钠的存在下，与其说碱性纤维素酶对纤维素的吸附被促进，倒不如说表现出再污染促进效果。

碱性纤维素酶通过其内部的纤维素结合区域（CBM）吸附于纤维素上。因此，如果使碱性纤维素酶的纤维素结合区域中的纤维素结合性降低，则变得难以吸附于纤维素，因此在例如促进纤维素吸附的条件下都可以发挥更高的防止再污染效果（参照图1B）。

635纤维素酶或S237纤维素酶的纤维素结合区域（CBM）由属于CBM17族和CBM28族的2种CMB组成。对于这些CBM17和CBM28族成员所含的与纤维素结合直接相关的氨基酸残基，已经有报道（Biochem.J.,361,35,2002）。例如，在S237纤维素酶的CBM17中，序列号2所示的氨基酸序列中的419位的天冬酰胺、421位的天冬氨酸、454位的色氨酸、458位的精氨酸、495位的谷酰胺、501位的色氨酸、503位的天冬酰胺、551位的天冬酰胺、CBM28中的605位的丙氨酸、607位的谷氨酸、641位的丙氨酸、645位的精氨酸、684位的谷酰胺、691位的色氨酸、693位的谷酰胺和740位的异亮氨酸与纤维素结合相关。因此，通过将这些的氨基酸残基取代为其它的氨基酸残基，从而可以削弱碱性纤维素酶对纤维素的结合。进一步，与这些氨基酸残基相邻的氨基酸残基（特别是其前后的氨基酸残基）即使不直接也与纤维素结合相关。因此，通过使上述与纤维素结合直接相关的氨基酸残基相邻的氨基酸残基取代或缺失，或者在该残基进一步相邻的位置插入氨基酸残基，都可以削弱对纤维素的结合性。基于这样的探讨，将能作为用于削弱碱性纤维素酶对纤维素的结合性的取代对象的44个氨基酸残基一并表示于表6中。

表6：

表6的“S237”的列中示出了S237纤维素酶的纤维素结合区域内能作为取代对象的44个氨基酸残基。此外，在表6中，对于S237纤维素酶表现出高的氨基酸序列同一性的其它碱性纤维素酶的来自芽孢杆菌DSM12648株的碱性纤维素酶（DSM12648纤维素酶，序列号4）、来自芽孢杆菌1139株的碱性纤维素酶（1139纤维素酶，序列号6）、来自芽孢杆菌KSM-64株的碱性纤维素酶（内切-1,4-β-葡聚糖酶）（64纤维素酶，序列号8）、来自芽孢杆菌KSM-635株的碱性纤维素酶（KSM-635纤维素酶，序列号10）以及来自芽孢杆菌N-4株的碱性纤维素酶（内切葡聚糖酶）（N4纤维素酶，序列号12），分别示出了在制作这些氨基酸序列和S237纤维素酶的氨基酸序列的比对时相对于S237纤维素酶的上述44个氨基酸残基被比对（即，相当于这些残基的位置）的氨基酸残基。另外，各氨基酸残基的位置以各个序列号所示的碱性纤维素酶的氨基酸序列中的氨基酸残基的编号来表示。

在下述实施例5~6中，进行将这样的与纤维素结合相关的氨基酸残基中的多个氨基酸残基（表6中，带下划线的氨基酸残基，即，419位、421位、454位、501位）取代为别的氨基酸残基的突变S237纤维素酶的制作。

[实施例1]突变S237纤维素酶的制作-1

如下所述，通过在S237纤维素酶基因中导入核苷酸突变，并使其重组表达，从而制作将S237纤维素酶（序列号2）的58位的谷酰胺取代为精氨酸的突变S237纤维素酶（S237-Q58R）。

将用通常方法从芽孢杆菌KSM-S237株（FERM BP-7875）中提取的基因组DNA作为模板，使用由上述表2-3所示的引物237UB1和Q58R-RV组成的引物对和由引物Q58R-FW和S237RV组成的引物对，按照上述“1）DNA片段的扩增”来进行PCR扩增。其结果，得到0.7kb的DNA扩增片段和2.5kb的DNA扩增片段，其中，0.7kb的DNA扩增片段在3’末端附近包含在S237纤维素酶基因（序列号1）上对应于58位的氨基酸残基的位置导入的核苷酸突变、并且主要包含从其突变位置开始的上游侧的区域；2.5kb的DNA扩增片段在5’末端附近包含该核苷酸突变、并且主要包含从其突变位置开始的下游侧的区域。使用的引物Q58R-RV的碱基序列是基于S237纤维素酶基因的碱基序列设计成包含S237纤维素酶的58位的谷酰胺取代为精氨酸的核苷酸突变的碱基序列。引物Q58R-FW的碱基序列是引物Q58R-RV的互补序列。

接着，将得到的2个片段混合作为模板，按照上述“1）DNA片段的扩增”，使用表1所示的由237UB1和S237RV组成的引物对，进行SOE（重叠延伸拼接技术，Splicing by overlap extension）-PCR（HortonR.M.et al.,Gene(1989)77(1),p.61-68），得到通过互补序列将这2个片段连接的3.2kb的DNA片段。

将得到的3.2kb的DNA片段（突变S237纤维素酶基因）插入穿梭载体pHY300PLK的SmaI限制酶切位点，构建重组质粒pHY-S237_Q58R。质粒中所插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列通过使用3100DNA定序器（Applied Biosystems）进行序列确定来确认。接着，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法，将重组质粒pHY-S237_Q58R导入枯草杆菌，培养得到的转化体。通过与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法，从得到的培养物中分离精制重组生成的蛋白质，进行定量。该重组蛋白质是S237纤维素酶的氨基酸序列（序列号2）的58位的谷酰胺被取代为精氨酸的突变S237纤维素酶（以下，也称为S237_Q58R）。将包含得到的突变S237纤维素酶的酶样品用于后述的试验例1中的防止再污染能力评价。

[实施例2]突变S237纤维素酶的制作-2

用与实施例1记载的同样的方法来制作将S237纤维素酶（序列号2）的242位的谷酰胺取代为丝氨酸的突变S237纤维素酶S237_Q242S。即，使用上述表2-3所示的由237UB1和Q242S-RV组成的引物对和由Q242S-FW和S237RV组成的引物对，将包含目标核苷酸突变的S237纤维素酶基因（序列号1）的上游侧区域（从突变位置附近开始的上游侧的区域）和包含目标核苷酸突变的S237纤维素酶基因（序列号1）的下游侧区域（从突变位置附近开始的下游侧的区域）进行PCR扩增，将得到的2个DNA片段作为模板来扩增包含目标突变S237纤维素酶基因的3.2kb的DNA片段，将其插入穿梭载体pHY300PLK来构建重组质粒pHY-S237_Q242S，确认质粒中插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法将该重组质粒导入枯草杆菌，培养得到的转化体，从得到的培养物中分离精制重组蛋白质（即，突变S237纤维素酶S237_Q242S），进行定量。

对于该突变S237纤维素酶S237_Q242S，进一步用基本上与实施例1记载的同样的方法制作将58位的谷酰胺取代为精氨酸或谷氨酸的2种的S237纤维素酶双重突变体（分别为QS_Q58R和QS_Q58E）。首先，将上述制作的pHY-S237_Q242S作为模板DNA，使用上述表2-3所示的用于导入目标突变的各2组引物对，将在3’末端附近包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的上游侧区域（从突变位置附近开始的上游侧的区域）和包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的下游侧区域（从突变位置附件开始的下游侧的区域）进行PCR扩增，将得到的2个DNA片段作为模板来扩增包含目标突变S237纤维素酶基因的DNA片段。将其插入穿梭载体pHY300PLK中来构建重组质粒，确认质粒中插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法将该重组质粒导入枯草杆菌，培养得到的转化体，用与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法从得到的培养物中分离精制重组蛋白质（突变S237纤维素酶），进行定量。将包含得到的各突变S237纤维素酶的酶样品用于后述的试验例2~3中的防止再污染能力评价和稳定性评价。

[实施例3]突变S237纤维素酶的制作-3

如下所述，通过在S237纤维素酶基因中导入核苷酸突变，并使其重组表达，从而制作将S237纤维素酶（序列号2）的193位的丝氨酸取代为精氨酸的突变S237纤维素酶。

将用通常方法从芽孢杆菌KSM-S237株（FERM BP-7875）中提取的基因组DNA作为模板，使用由上述表2-1所示的引物237UB1和S193R-RV组成的引物对和由引物S193R-FW和S237RV组成的引物对，按照上述“1）DNA片段的扩增”来进行PCR扩增。其结果，得到0.7kb的DNA扩增片段和2.5kb的DNA扩增片段，其中，0.7kb的DNA扩增片段在3’末端附近包含在S237纤维素酶基因（序列号1）上对应于193位的氨基酸残基的位置所导入的核苷酸突变、并且主要包含从其突变位置开始的上游侧的区域；2.5kb的DNA扩增片段在5’末端附近包含该核苷酸突变、并且主要包含从其突变位置开始的下游侧的区域。使用的引物S193R-RV的碱基序列是基于S237纤维素酶基因的碱基序列而设计成包含将S237纤维素酶的193位的丝氨酸取代为精氨酸的核苷酸突变的碱基序列。引物S193R-FW的碱基序列是引物S193R-RV的互补序列。

接着，将得到的2个片段混合作为模板，按照上述“1）DNA片段的扩增”，使用表1所示的由237UB1和S237RV组成的引物对，进行SOE（重叠延伸拼接技术，Splicing by overlap extension）-PCR（HortonR.M.et al.,Gene(1989)77(1),p.61-68），得到通过互补序列将这2个片段连接的3.2kb的DNA片段。

将得到的3.2kb的DNA片段（突变S237纤维素酶基因）插入穿梭载体pHY300PLK的SmaI限制酶切位点，构建重组质粒pHY-S237(S193R)。质粒中所插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列通过使用3100DNA定序器（Applied Biosystems）进行序列确定来确认。接着，采用根据上述“2）对枯草杆菌的基因导入”的方法，将重组质粒pHY-S237(S193R)导入枯草杆菌，培养得到的转化体。通过与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法，从得到的培养物中分离精制重组生成的蛋白质，进行定量。该重组蛋白质是S237纤维素酶的氨基酸序列（序列号2）的193位的丝氨酸被取代为精氨酸的突变S237纤维素酶（以下，也称为S237_S193R）。将包含由此得到的突变S237纤维素酶S237_S193R的酶样品用于后述的试验例4中的防止再污染能力评价。

[实施例4]突变S237纤维素酶的制作-4

对于实施例2记载的突变S237纤维素酶S237_Q242S，进一步制作将上述选出的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基的突变S237纤维素酶。具体来说，用基本上与实施例3记载的同样的方法制作将突变S237纤维素酶S237_Q242S的氨基酸序列的71位的谷酰胺取代为谷氨酸的S237纤维素酶双重突变体（QS_Q71E）。首先，将上述制作的pHY-S237(Q242S)作为模板DNA，使用上述表2-1所示的用于导入目标突变的各2组引物对，将在3’末端附近包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的上游侧区域（从突变位置附近开始的上游侧的区域）和包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的下游侧区域（从突变位置附件开始的下游侧的区域）进行PCR扩增，将得到的2个DNA片段作为模板来扩增包含目标突变S237纤维素酶基因的DNA片段。将其插入穿梭载体pHY300PLK中来构建重组质粒，确认质粒中所插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法将该重组质粒导入枯草杆菌中，培养得到的转化体，用与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法从得到的培养物中分离精制重组蛋白质（突变S237纤维素酶），进行定量。将包含得到的各突变S237纤维素酶的酶样品用于后述的试验例5中的防止再污染能力评价。

[实施例5]突变S237纤维素酶的制作-5

通过在S237纤维素酶基因中导入引起目标氨基酸取代的核苷酸突变，并使其重组表达，从而制作与纤维素结合相关的氨基酸残基被取代了的3种的突变S237纤维素酶。具体来说，制作将S237纤维素酶（序列号2）的421位的天冬氨酸取代为丙氨酸、454位的色氨酸取代为酪氨酸、501位的色氨酸取代为酪氨酸的突变S237纤维素酶（分别为S237_D421A、S237_W454Y、S237_W501Y）。

使用用于导入目标突变的各2组的引物对（参照表2-2），将包含目标核苷酸突变的S237纤维素酶基因的上游侧区域（从突变位置附近开始的上游侧的区域）和包含目标核苷酸突变的S237纤维素酶基因的下游侧区域（从突变位置附近开始的下游侧的区域）进行PCR扩增，将得到的2个DNA片段作为模板来扩增包含目标突变S237纤维素酶基因的DNA片段，将其插入穿梭载体pHY300PLK中来构建重组质粒，确认质粒中所插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法将该重组质粒导入枯草杆菌中，培养得到的转化体，用与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法从得到的培养物中分离精制重组蛋白质（即，各突变S237纤维素酶），进行定量。将包含得到的各突变S237纤维素酶的酶样品用于后述的试验例6中的防止再污染能力评价。

[实施例6]突变S237纤维素酶的制作-6

对于实施例2记载的突变S237纤维素酶S237_Q242S，进一步制作已经取代与纤维素酶结合相关的氨基酸残基的突变S237纤维素酶。具体来说，用基本上与实施例5记载的同样的方法制作将突变S237纤维素酶S237_Q242S的氨基酸序列的419位的天冬酰胺取代为丙氨酸的S237纤维素酶双重突变体（QS_N419A）。具体而言，将上述制作的pHY-S237(Q242S)作为模板DNA，使用用于导入目标突变的各2组引物对（参照表2-2），将包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的上游侧区域（从突变位置附近开始的上游侧的区域）和包含目标核苷酸突变的突变S237纤维素酶S237_Q242S基因的下游侧区域（从突变位置附近开始的下游侧的区域）进行PCR扩增，将得到的2个DNA片段作为模板来扩增包含目标突变S237纤维素酶基因的DNA片段。将其插入穿梭载体pHY300PLK中来构建重组质粒，确认质粒中所插入的突变S237纤维素酶基因的碱基序列，采用根据上述“2）基因导入枯草杆菌”的方法将该重组质粒导入枯草杆菌中，培养得到的转化体，用与上述“5）1.S237纤维素酶的重组生产”同样的方法从得到的培养物中分离精制重组蛋白质（即，各突变S237纤维素酶），进行定量。将包含得到的各突变S237纤维素酶的酶样品用于后述的试验例7中的防止再污染能力评价。

[试验例1]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-1

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例1中制作的突变S237纤维素酶S237_Q58R的防止再污染能力。另外，在评价时，投入50g棉针织白布[将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤的布]，调节相对于溶液的布量（浴比）为10L/kg。使用上述洗剂组合物B，对于S237_Q58R使用相当于野生型S237纤维素酶活性为52.8mU的蛋白质量的酶量。将得到的结果表示于表7中。突变S237纤维素酶S237_Q58R与S237纤维素酶比较，确认防止再污染能力提高。

表7：

[试验例2]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-2

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例2中的将S237_Q242S作为亲本纤维素酶而制作的突变S237纤维素酶QS_Q58R和QS_Q58E的防止再污染能力。另外，在评价时，设想皮脂污垢成分共存，添加3块6cm×6cm的污染布wfk10D（Wfk Testgewebe GmbH（D-41379，Gemany））。使用上述组成C的洗涤剂，对于各突变S237纤维素酶使用相当于S237_Q242S纤维素酶活性为52.8mU的蛋白质量的酶量。在本评价中，将S237_Q242S用作对照酶。将得到的结果表示于表8中。在使用评价的突变S237纤维素酶的情况下，确认与对照酶（S237_Q242S）相比，都得到高的防止再污染效果，并通过突变导入提高了防止再污染能力。

表8：

[试验例3]突变S237纤维素酶在液体洗涤剂中的稳定性试验

评价在添加了各种碱性蛋白酶的上述组成E的洗涤剂中保存实施例3中的将S237_Q242S作为亲本纤维素酶制作得到的突变S237纤维素酶QS_Q58R时的稳定性。

作为碱性蛋白酶，使用碱性蛋白酶KP43（日本特许第3479509号）、Kannase^TM（Novozymes）和Properase^TM（Danisco）。这些3种碱性蛋白酶都是适合配合于洗涤剂中的类枯草菌素碱性蛋白酶。

在450μL组成E的洗涤剂中添加作为蛋白质量为0.012g（KP43时相当于添加29U/L的蛋白质质量）460U/L纤维素酶（S237QS或S237QS_Q58R）和前述的3种碱性蛋白酶，制备样品的液量为500μL之后，在40℃下保存，测定经过24小时后的洗涤剂中的纤维素酶残留活性。

纤维素酶活性通过使用实施例1中记载的对硝基苯基-β-D-纤维三糖苷的方法进行测定，用下式算出纤维素酶残留活性。

纤维素酶残留活性（%）=（保存24小时后的纤维素酶活性／刚制备后的纤维素酶活性）×100

将实验结果表示于图4中。将40℃下保存了24小时后的S237QS的残留活性值作为100来表示QS_Q58R的相对残留活性，在添加了3种蛋白酶的体系中，与S237QS相比QS_Q58R都表现出高的残留活性。由此，确认通过将S237纤维素酶的第58位的谷酰胺取代为精氨酸，可以提高防止再污染能力和蛋白酶耐性。

[试验例4]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-3

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例3中制作的突变S237纤维素酶S237_S193R的防止再污染能力。另外，在评价时，投入50g棉针织白布[将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤的布]，调节相对于溶液的布量（浴比）为10L/kg。使用上述组成F的洗涤剂，对于S237_S193R使用相当于野生型S237纤维素酶活性为52.8mU的蛋白质质量的酶量。碳黑使用Asahi清洁用碳黑，使用水的硬度为12°DH。将得到的结果表示于表9中。同时，也表示实施例2中求得的溶剂可及性的值。对于S237_S193R，与对照酶（S237_Q242S）相比，确认得到高的防止再污染效果，并通过突变导入提高了防止再污染能力。

表9：

[试验例5]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-4

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例4中将S237_Q242S为基础制作的突变S237纤维素酶QS_Q71E的防止再污染能力。

使用上述组成C的洗涤剂，对于QS_Q71E使用相当于野生型S237纤维素酶活性为52.8mU的酶量。在本评价中，将S237_Q242S用作对照酶。碳黑使用Asahi清洁用碳黑，使用水的硬度为4°DH。另外，在评价时，设想皮脂污垢成分共存，添加3块6cm×6cm的污染布wfk10D（Wfk Testgewebe GmbH（D-41379，Gemany））。将得到的结果表示于表10中。同时，也表示上述“6）S237纤维素酶的立体结构建模”中求得的残基溶剂可及性的值。对于QS_Q71E，与对照酶（S237_Q242S）相比，确认得到高的防止再污染效果，并通过突变导入提高了防止再污染能力。由本试验例和上述试验例4证实，通过由上述选出的不带电氨基酸残基取代为带电氨基酸残基，从而可以提高突变S237纤维素酶的防止再污染能力。如上述所推测的，这样的氨基酸置换通过通过进一步提高酶表面的亲水性而使疏水性的碳黑之间产生高的排斥，从而带来更高的防止再污染效果。

表10：

[试验例6]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-5

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例5中制作的突变S237纤维素酶S237_D421A、S237_W454Y和S237_W501Y的防止再污染能力。另外，在评价时，投入50g棉针织白布[将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤的布]，调节相对于溶液的布量（浴比）为10L/kg。使用上述组合物B的洗涤剂，对于各突变S237纤维素酶使用相当于野生型S237纤维素酶活性为52.8mU的酶量。在本评价中，将野生型S237纤维素酶用作对照酶。作为碳黑使用Asahi清洁用碳黑，使用水的硬度为12°DH。将得到的结果表示于表11中。对于突变S237纤维素酶，确认与S237纤维素酶相比都提高了防止再污染能力。因此，证实了通过将碱性纤维素酶的纤维素结合区域中与纤维素结合相关的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，从而可以提高突变S237纤维素酶的防止再污染能力。如上述推测的，这样的氨基酸取代使碱性纤维素酶的纤维素结合性降低，其结果带来了更高的防止再污染效果。

表11：

[试验例7]突变S237纤维素酶的防止再污染能力评价-6

按照上述的“4）防止再污染能力的评价”来评价实施例6中将S237_Q242S作为基础制作的突变S237纤维素酶QS_N419A的防止再污染能力。另外，在评价时，投入50g棉针织白布[将带浆漂白布（谷头商店供给）洗涤之后，充分洗涤的布]，调节相对于溶液的布量（浴比）为11L/kg。使用上述组成C的洗涤剂，对于QS_N419A使用相当于野生型S237纤维素酶活性为52.8mU的酶量。在本评价中，将S237_Q242S用作对照酶。作为碳黑使用Asahi清洁用碳黑，使用水的硬度为4°DH。另外，在评价时，设想皮脂污垢成分共存，添加3块6cm×6cm的污染布wfk10D（Wfk Testgewebe GmbH（D-41379，Gemany））。将得到的结果表示于表12中。与对照酶（S237_Q242S）相比，QS_N419A确认得到高的防止再污染效果，并通过突变导入而提高了防止再污染能力。即，证实了通过将碱性纤维素酶的纤维素结合区域中与纤维素结合相关的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，从而可以提高突变S237纤维素酶的防止再污染能力。如上述推测的，这样的氨基酸取代使碱性纤维素酶的纤维素结合性降低，其结果带来了更高的防止再污染效果。

表12：

Claims (13)

1.一种突变碱性纤维素酶，其中，

所述突变碱性纤维素酶由在序列号2所示的氨基酸序列的242位的谷酰胺残基被取代为丝氨酸残基的有突变的碱性纤维素酶的氨基酸序列中，序列号2所示的氨基酸序列的58位的氨基酸残基被取代为精氨酸或谷氨酸的氨基酸序列组成。

2.如权利要求1所述的突变碱性纤维素酶，其中，

由序列号2所示的氨基酸序列的1～30位的氨基酸残基或相当于该氨基酸残基的氨基酸残基组成的信号序列缺失。

3.一种基因，其中，

所述基因编码权利要求1或2所述的突变碱性纤维素酶。

4.一种重组载体，其中，

所述重组载体含有权利要求3所述的基因。

5.一种转化体，其中，

所述转化体包含权利要求4所述的重组载体。

6.如权利要求5所述的转化体，其中，

所述转化体为微生物。

7.一种再污染防止剂，其中，

所述再污染防止剂包含权利要求1或2所述的突变碱性纤维素酶。

8.一种酶组合物，其中，

所述酶组合物包含权利要求1或2所述的突变碱性纤维素酶。

9.如权利要求8所述的酶组合物，其中，

所述酶组合物进一步包含选自蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、α-淀粉酶、糖化酶、角质酶、还原酶、氧化酶、普鲁兰酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶和转谷氨酰胺酶以及它们的混合物中的至少1种酶。

10.一种洗涤剂组合物，其中，

所述洗涤剂组合物包含权利要求1或2所述的突变碱性纤维素酶、权利要求7所述的再污染防止剂、或者权利要求8或权利要求9所述的酶组合物。

11.一种突变碱性纤维素酶的制造方法，其中，

所述制造方法包括使突变碱性纤维素酶从权利要求3所述的基因表达。

12.一种提高碱性纤维素酶的防止再污染能力的方法，其特征在于，

在由序列号2所示的氨基酸序列的242位的谷酰胺残基被取代为丝氨酸残基的有突变的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，将序列号2所示的氨基酸序列的58位的谷酰胺残基取代为谷氨酸或精氨酸。

13.一种提高碱性纤维素酶的防止再污染能力和蛋白酶耐性的方法，其特征在于，

在由序列号2所示的氨基酸序列的242位的谷酰胺残基被取代为丝氨酸残基的有突变的氨基酸序列组成的碱性纤维素酶中，将序列号2所示的氨基酸序列的58位的谷酰胺残基取代为精氨酸。