JP4261817B2 - 液体洗浄剤組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異アルカリセルラーゼを含有する液体洗浄剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
襟袖等の皮脂汚れ及び下着の黄ばみ等の親油的な汚れ、食べこぼし汚れのひどい場合は、通常の洗濯では充分に汚れが取れなかったり、染みのまま残ったりする。このため、従来から洗剤組成物の通常使用濃度よりも高濃度な水溶液に衣料を浸漬することや、液体洗浄剤を直接塗布する、或いは温水による洗濯が行われている。
【０００３】
特に、顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な温水への浸漬洗浄においては、被洗浄物から離脱した汚れの一部が再び被洗浄物に沈着して洗浄効率を下げるという問題がある。この再沈着を防止するために、カルボキシメチルセルロース等のセルロース系の再汚染防止剤や、ポリエチレングリコール等のノニオン性高分子再汚染防止剤の配合検討が行われているが、十分な効果が得られず、液体洗浄剤に配合すると系の粘度上昇が見られるといった問題点がある。
【０００４】
また、特開平７−２１６０８４号公報にはアミノ酸ポリマー、特開平６−３３００８４号公報にはα−スルホ脂肪酸誘導体、特表平１０−５０５８７４号公報にはエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンリン酸のようなアミノ酢酸の誘導体やアクリル酸又はメタクリル酸のホモポリマー等が再汚染防止剤として開示されているが、十分な効果が得られていない。
【０００５】
一方、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等の酵素を洗浄補助剤として洗浄剤に配合することは古くから実施されており、中でもセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れを効果的に除去し、洗浄力を向上させることが見いだされている。しかしながら、衣料用洗剤液中で作用できるアルカリセルラーゼであっても、従来知られているもののほとんどは耐熱性が低く、衣料用洗剤に安定的に配合するには適しないものであった。
【０００６】
従って、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対して優れた洗浄力を持つ洗浄剤組成物、より具体的には高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯に適した液体洗浄剤組成物が望まれていた。
【０００７】
本発明は、再汚染防止効果に優れ、洗浄効率の高い液体洗浄剤組成物、特に顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な洗浄、温水洗浄、浸漬洗浄、或いはこれらの組み合わせ洗浄に適する液体洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、酵素を配合した洗浄剤組成物について検討した結果、特定の変異セルラーゼが高温で安定であると共に高活性であり、これを配合した組成物が、再汚染防止効果に優れ、高濃度な洗浄や温水洗浄等に適した液体洗浄剤組成物となり得ることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼを含有する液体洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（ａ）成分の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１１】
親アルカリセルラーゼである「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ」としてはＥｇｌ−２３７［バチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルス エスピー １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen, Microbiol, 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１２】
そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、２４２位のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の２４２位に相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものである。 斯かる他のアミノ酸残基としては、セリン残基が好ましい。
【００１３】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１４】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の２４２位に相当する位置を、前述したＥｇｌ−１１３９、Ｅｇｌ−６４、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂについて示せば、Ｅｇｌ−１１３９では２４２位、Ｅｇｌ−６４では２４２位、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂでは２２８位である。
【００１５】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼは、その酵素活性及び酵素特性が変化しない限り、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基以外に、例えば配列番号１の１０位のロイシン、１６位のイソロイシン、２２位のセリン、３３位のアスパラギン、３９位のフェニルアラニン、７６位のイソロイシン、１０９位のメチオニン、２６３位のフェニルアラニン、３０８位のスレオニン、４６２位のアスパラギン、４６６位のリジン、４６８位のバリン、５５２位のイソロイシン、５６４位のイソロイシン、６０８位のセリン等が他のアミノ酸残基に同時に置換していてもよい。
【００１６】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼにおいて、２個所以上の変異が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１７】
３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１８】
４重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１９】
５重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１７置換体でもよい。
【００２０】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００２１】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばバチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。
【００２２】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Takara製)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２３】
得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
【００２４】
斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２５】
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
【００２６】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、限外ろ過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。
【００２７】
斯くして得られた本発明の変異アルカリセルラーゼは、優れた耐熱性を有するとともに、洗浄力にも優れ、更に高い比活性を有する。
【００２８】
（ａ）成分の含有量は、液体洗浄剤組成物中０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．０００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２．０質量％が更に好ましい。そして、（ａ）成分は、作業性の点で予め液体に混合して用いるのが好ましく、斯かる観点から、更に０．１〜２０質量％、更に０．５〜１０質量％、特に１〜８質量％含有するのが好ましい。
【００２９】
本発明の液体洗浄剤組成物には、上記成分（ａ）に加えて、更に（ｂ）界面活性剤、（ｃ）ビルダー及び（ｄ）可溶化剤を含有するのが好ましい。
（ｂ）界面活性剤としては、従来から液体洗浄剤組成物に配合することが知られている界面活性剤を使用することができる。
洗浄性を高める上で界面活性剤として、再汚染防止性の点から陰イオン界面活性剤、皮脂汚れ洗浄性の点から非イオン界面活性剤を主界面活性剤として使用するのが好ましい。
【００３０】
陰イオン界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルキル鎖を持つ直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、アルキル硫酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル、アルファスルホ脂肪酸アルキル（例えばメチル）エステル、炭素数８〜２０の脂肪酸等のアルカリ金属塩が好ましい。
陰イオン界面活性剤の対イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属以外に、マグネシウム等のアルカリ土類金属及び／又はモノ、ジ、トリエタノールアミン等のアルカノールアミン等を使用するが、特にアルカノールアミンを用いることで液安定性が向上することから好適である。その場合、組成物中の陰イオン界面活性剤の含有量は好ましくは５〜５０質量％、特に１０〜５０質量％とするのが好ましい
【００３１】
非イオン界面活性剤としては、下記（１）〜（４）のようなものが使用できる。
（１）平均炭素数が８〜２０の直鎖１級アルコール又は直鎖２級アルコール由来のアルキル基又は分岐アルコール由来のアルキル基又はアルケニル基を有し、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと表記する）を平均で１〜２０モルを付加したポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエーテル。
【００３２】
（２）平均炭素数が８〜２０のアルキル基又はアルケニル基を有し、ＥＯを平均で１〜１５モル及びプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと表記する）を平均で１〜５モル付加したポリオキシアルキレンアルキル又はアルケニルエーテル。この場合、ＥＯ及びＰＯはランダム付加でもブロック付加でもいずれでもよい。
特に襟・袖口汚れに対する高洗浄力を得ることができる点から、次式（Ａ）のものが好ましい。
Ｒ1−Ｏ（ＥＯ）p（ＰＯ）q（ＥＯ）rＨ （Ａ）
〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２０の直鎖のアルキル基又はアルケニル基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ＰＯはオキシプロピレン基を示し、ｐ、ｑ及びｒは平均付加モル数を示し、ｐ＞０、ｑ＝１〜４、ｒ＞０、ｐ＋ｑ＋ｒ＝６〜１４、ｐ＋ｒ＝５〜１２であり、好ましくはｐ＋ｑ＋ｒ＝７〜１４、ｐ＋ｒ＝６〜１２、ｑ＝１〜２である。〕
【００３３】
（３）次の一般式（Ｂ）で表されるアルキル多糖界面活性剤。
Ｒ2−（ＯＲ3）eＧf （Ｂ）
〔式中、Ｒ2は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜１８のアルキル基、アルケニル基、又はアルキルフェニル基を示し、Ｒ3は炭素数２〜４のアルキレン基を示し、Ｇは炭素数５又は６の還元糖に由来する残基を示し、ｅは平均値０〜６の数、ｆは平均値１〜１０の数を示す。〕
【００３４】
（４）脂肪酸アルカノールアミド、ポリヒドロキシ脂肪酸アミド。
【００３５】
特に、油性汚れに対する洗浄力の点から、（１）及び／又は（２）のポリオキシアルキレンアルキルエーテルを含有するのが好ましく、（２）を含有するのがより好ましい。また、組成物中の非イオン界面活性剤の含有量は好ましくは５〜５０質量％、特に１０〜５０質量％であるのが好ましい。
また、酵素安定化の点から、非イオン界面活性剤／陰イオン界面活性剤の質量比は１００／０〜１００／１０であるのが好ましく、１００／１〜１００／１０がより好ましく、１００／１〜１００／５が更に好ましい。
【００３６】
更に被洗浄物などの柔軟性を向上させるためには、モノ長鎖アルキル４級アンモニウム塩等の陽イオン界面活性剤を、好ましくは組成物中０．５〜１０質量％、特に１〜５質量％含有するのが好ましい。
また、柔軟性向上効果の点から、長鎖アルキル基は、炭素数１２〜２２、特に１４〜２０のアルキル基である長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩が好ましい。
【００３７】
陽イオン界面活性剤の対イオンとしては、ハロゲンイオン、ＣＨ3ＳＯ4−、Ｃ2Ｈ5ＳＯ4−、ＣＨ3ＣＯＯ−又はＨＣＯＯ−が好ましい。更に柔軟性を高めるため、陽イオン界面活性剤を陰イオン界面活性剤に対して、陽イオン界面活性剤／陰イオン界面活性剤＝３／１〜１／２、更に２／１〜１／２、特に１．２／１〜１／１．２のモル比で配合するのが好ましい。
【００３８】
その他界面活性剤としては、液の安定性及び泥汚れ洗浄性の点から、両性界面活性剤を配合してもよい。
斯かる両性界面活性剤としては、アルキルカルボベタイン、アルキルスルホベタイン、アルキルアミドヒドロキシスルホベタイン、アルキルアミドアミン型ベタイン及びアルキルイミダゾリン型ベタインなどが好適である。
両性界面活性剤は、組成物中１〜２０質量％含有するのが好ましい。
【００３９】
（ｃ）成分のビルダーは、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、洗浄剤組成物に配合されると著しく洗剤性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものであり、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。斯かるビルダーとしては、水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
【００４０】
水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられ、中でも上記３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。
【００４１】
水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。
【００４２】
有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。
【００４３】
前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
本発明において、これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、特に前記水溶性無機化合物を含有することが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用することがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用することが更に好ましい。
【００４４】
洗浄性能の点から、ビルダーの合計量は液体洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
ここで、水溶性無機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるのが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。
【００４５】
本発明の衣料用洗濯前処理剤組成物は、低温安定性、塗布性の点から、（ｄ）可溶化剤を１〜３０質量％含有するのが好ましく、２〜１５質量％がより好ましく、３〜１０質量％が更に好ましい。
（ｄ）成分としては、エタノール、メタノール、プロパノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等の炭素数１〜４の低級アルコール、トルエンスルホン酸（塩）、キシレンスルホン酸（塩）、下記一般式（Ｃ）で示される化合物等が挙げられる。
Ｘ−（Ｐｈ）−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）h（ＣＨ2ＣＨＲ4Ｏ）iＹ （Ｃ）
〔式中、Ｘは水素原子、Ｃ1〜Ｃ4のアルキル基又はアルケニル基、水酸基又はハロゲン原子を示し、Ｙは水素原子、メチル基又はエチル基を示し、Ｐｈはフェニル基又はフェニレン基を示し、Ｒ4は水素原子、メチル基又はエチル基を示し、ｈは１〜６、好ましくは１〜３、ｉは０〜４、好ましくは０〜２、ｈ＋ｉは１〜１０、好ましくは１〜６の数を示す。〕
このうち、炭素数２〜３の低級アルコール、ｐ−トルエンスルホン酸（塩）がより好ましい。
【００４６】
本発明の液体洗浄剤組成物は、貯蔵安定性の点から、水を３〜５０質量％、特に５〜４０質量％含有するのが好ましい。
更に本発明の洗浄剤組成物には、従来より洗剤に配合することが知られている成分を配合することができる。このような成分として、二価金属イオン捕捉能を有する多価カルボン酸塩としてニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、イミノ二酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸塩及びトリエチレンテトラミン六酢酸塩等のアミノポリ酢酸塩、マロン酸、コハク酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等の塩；ポリアクリル酸塩、ポリマレイン酸塩、カルボキシメチルセルロース、平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、アクリル酸−マレイン酸共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−イソブチレン共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸―酢酸ビニル共重合体若しくはその塩、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマー等の再汚染防止剤又は分散剤０．０１〜１０質量％；ポリビニルピロリドン等の色移り防止剤０．０１〜１０質量％；ポリオキシアルキレンベンジルエーテル、ポリオキシアルキレンフェニルエーテル等の相調整剤又は洗浄力向上剤０．０１〜１０質量％；アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、その他のセルラーゼ等の酵素０．００１〜１０質量％；塩化カルシウム、硫酸カルシウム、ギ酸、ホウ酸（ホウ素化合物）等の酵素安定化剤０．００５〜１０質量％；過炭酸ナトリウム又は過硼酸ナトリウム等の漂白剤０．０１〜１０質量％；テトラアセチルエチレンジアミン、特開平６−３１６７００号公報において一般式（Ｉ−２）〜（Ｉ−７）で示される化合物等の漂白活性化剤０．０１〜１０質量％；チノパールＣＢＳ（チバスペシャリティケミカルス社製）やホワイテックスＳＡ（住友化学社製）等の蛍光染料０．００１〜１質量％；特開平１０−６０４８０号公報の請求項１記載のシリコーン等の柔軟基剤を０．１〜２質量％；ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤０．０１〜２質量％；シリコーン、シリカ等の調泡剤０．０１〜２質量％；水溶性色素；香料；抗菌防腐剤等を配合することができる。
【００４７】
斯くして得られる本発明の液体洗浄剤組成物は、２０℃で流動性をもつことが好ましい。ここで流動性は、内径３０ｍｍ、高さ５ｃｍで上部が開口している円筒形ガラス容器を用意し、低部から３ｃｍの高さまで組成物を入れ上部を密閉し、２０℃、鉛直状態で２４時間静置する。その後、上部を開放し、容器を９０度傾けた時、１分以内に内容物が流動してガラス容器の開口部に達する場合、組成物は流動性を持つと判断する。
【００４８】
本発明の液体洗浄剤組成物の２０℃における粘度は、取り扱いの容易さの点で１０〜４００ｍＰａ・ｓであるのが好ましく、３０〜３００ｍＰａ・ｓがより好ましく、５０〜２００ｍＰａ・ｓが更に好ましく、粘度調整剤によりこのような範囲になるように調製することが好ましい。
なお、これらの粘度は、Ｂ型粘度計（（株）東京計器製、ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ ＭＯＤＥＬ ＤＶＭ−Ｂ）を用い、ローター３又は４、回転数６０ｒ／ｍｉｎ、測定時間６０秒の条件で測定されたものである。
粘度調製剤としては、、減粘剤として（ｄ）成分の可溶化剤を用いることができ、増粘剤としては水溶性高分子、無機電解質を用いることができる。水溶性高分子としては、ポリマレイン酸、ポリイタコン酸、ビニルメチルエーテル−無水マレイン酸共重合物、ポリプロピレングリコール（分子量１００〜１０００）等が挙げられる。無機電解質としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
【００４９】
本発明の液体洗浄剤組成物が衣料用洗浄剤の場合、２０℃の０．１質量％水溶液のｐＨが６〜１１であることが洗浄性能の点で好ましく、ｐＨ７〜１１がより好ましく、ｐＨ７．５〜１１が更に好ましく、特にｐＨ１０〜１１が特に好ましい。また、２０℃の液体洗浄剤組成物のｐＨ（ＪＩＳ Ｋ ３３６２：１９９８に従って測定）が、６〜１１であることが保存性の点で好ましく、更にｐＨ７〜１１、更にｐＨ７．５〜１１が好ましく、特にｐＨ１０〜１１が特に好ましい。
【００５０】
ｐＨの調整に用いられるｐＨ調整剤は、上記ｐＨの範囲になるように添加すればよいが、洗浄性能や安定性の点で０．５〜３０質量％、好ましくは１〜２５質量％、より好ましくは３〜２０質量％含有するのが好ましい。
斯かるｐＨ調整剤としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メチルモノエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、３−アミノプロパノール等のアミン類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、珪酸ナトリウム、珪酸カリウム等のアルカリ金属珪酸塩、等が挙げられる。中でも、モノエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムから選ばれる１種以上が好ましい。
【００５１】
【実施例】
製造例１
（１）アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。
【００５２】
部位特異的変位Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕを導入するための変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（配列番号２）、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ（配列番号３）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ（配列番号５）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（配列番号６）、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ（配列番号７）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行った。
【００５３】
即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、タカラ製)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャムファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラ製）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。
【００５４】
（２）形質転換法
（１）で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いてChangらの方法（Chang and Cohen,Mol.Gen.Gent.,168,111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を５０ ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後 (６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｍｉｎ-1、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍ シュークロース、２０ｍＭ マレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ３（ディフコ製）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、シグマ製）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｍｉｎ-1)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、シグマ製）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬製）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ製）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ製）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（メルク製）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）によりプラスミドを回収、精製した。
【００５５】
（３）塩基配列の決定
（２）で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライド バイオシステム製）を用いて行なった。
【００５６】
実施例１〜１１
表１に示す液体洗浄剤組成物を調製した。比較例として、実施例に対応する、（ａ）成分を同活性量のケアザイム１０００Ｌに置き換えた組成物を調製した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ａ−１：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−２：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−３：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−４：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、１６位のイソロイシンをアスパラギンに、７６位のイソロイシンをヒスチジンに、２４２位のグルタミンをセリンに、４６６位のリシンをロイシンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ソフタノール５０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均５モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
ソフタノール７０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
ソフタノール１２０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均１２モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
Ｃ１２−１４、ＥＯ７：炭素数１２〜１４の１級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル
Ｃ１０−１４、ＥＯ５ＰＯ２ＥＯ３：炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均５モル、ＰＯを平均２モル、ＥＯを平均３モルの順にブロック付加させたもの
Ｃ１０−１４、ＥＯ８、ＰＯ２：炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均８モル、ＰＯを平均２モルランダム付加させたもの
ＥＳ：ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（炭素数１２／１４の直鎖アルキル、エチレンオキシド平均付加モル数３、ナトリウム塩）
ＬＡＳ：炭素数１０〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸
石鹸：ヤシ油脂肪酸塩
酵素：エバラーゼ１６．０Ｌ−ＥＸ（プロテアーゼ、ノボザイムズ社製）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバスペシャリティケミカルス社製）
【００５９】
得られた組成物を用いて以下の評価を行った。
（１）洗浄力評価
まず、表２に示した成分からなる油脂／カーボン汚れを木綿金布に染着させ、人工汚染布を調製した（６×６cm）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
次いで、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１６７ｍＬを１Ｌ容ビーカー（内径１０５ｍｍ）に入れ、洗浄剤組成物０．６７ｇを溶解させ、この中に前記人工汚染布５枚を入れ、４０℃で１時間漬け置きした。次いで４０℃の使用水（同上）８３３ｍＬを加え、全量をかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメーター）の試料カップに移し、回転速度１００ｍｉｎ-1にて１０分間攪拌した後、人工汚染布を流水下で濯いだ。
実施例とそれに対応する比較例との一対比較を行ったところ、実施例１〜１１は何れも比較例よりも明らかに勝っていた。
【００６２】
（２）洗浄剤組成物の再汚染防止性
得られた液体洗浄剤０．６７ｇを、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに溶解させる。次にこれに日本油化学協会選定のカーボンブラック（旭カーボン（株）製、旭洗浄用カーボンブラックが好適）０．２５ｇを添加し、２６±１．５ＫＨｚの超音波を５分間照射してカーボンブラックを均一に分散させる。次にこれを４０℃にてかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメータ：Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ）の試料カップに移し、６ｃｍ×６ｃｍの木綿の白布（日本油化学協会選定の標準品、洗濯科学協会が販売する＃２０２３布）５枚を入れて回転速度１００±５ｍｉｎ-1で１０分間撹拌する。次に木綿の白布を取り出し、含水率が２００質量％以下になるように軽く手で絞ってから、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに入れ、かき混ぜ式洗浄力試験機（回転速度１００±５ｍｉｎ-1）を用いて３分間濯ぎ、この濯ぎ操作を計２回行なう。風乾後、アイロン仕上げを行って、実施例とそれに対応する比較例との一対比較を行ったところ、実施例１〜１１は何れも比較例よりも明らかに勝っていた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の液体洗浄剤組成物は、再汚染防止効果に優れ、高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯にも適し、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対しても優れた洗浄力を発揮する。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異アルカリセルラーゼを含有する液体洗浄剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
襟袖等の皮脂汚れ及び下着の黄ばみ等の親油的な汚れ、食べこぼし汚れのひどい場合は、通常の洗濯では充分に汚れが取れなかったり、染みのまま残ったりする。このため、従来から洗剤組成物の通常使用濃度よりも高濃度な水溶液に衣料を浸漬することや、液体洗浄剤を直接塗布する、或いは温水による洗濯が行われている。
【０００３】
特に、顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な温水への浸漬洗浄においては、被洗浄物から離脱した汚れの一部が再び被洗浄物に沈着して洗浄効率を下げるという問題がある。この再沈着を防止するために、カルボキシメチルセルロース等のセルロース系の再汚染防止剤や、ポリエチレングリコール等のノニオン性高分子再汚染防止剤の配合検討が行われているが、十分な効果が得られず、液体洗浄剤に配合すると系の粘度上昇が見られるといった問題点がある。
【０００４】
また、特開平７−２１６０８４号公報にはアミノ酸ポリマー、特開平６−３３００８４号公報にはα−スルホ脂肪酸誘導体、特表平１０−５０５８７４号公報にはエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンリン酸のようなアミノ酢酸の誘導体やアクリル酸又はメタクリル酸のホモポリマー等が再汚染防止剤として開示されているが、十分な効果が得られていない。
【０００５】
一方、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等の酵素を洗浄補助剤として洗浄剤に配合することは古くから実施されており、中でもセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れを効果的に除去し、洗浄力を向上させることが見いだされている。しかしながら、衣料用洗剤液中で作用できるアルカリセルラーゼであっても、従来知られているもののほとんどは耐熱性が低く、衣料用洗剤に安定的に配合するには適しないものであった。
【０００６】
従って、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対して優れた洗浄力を持つ洗浄剤組成物、より具体的には高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯に適した液体洗浄剤組成物が望まれていた。
【０００７】
本発明は、再汚染防止効果に優れ、洗浄効率の高い液体洗浄剤組成物、特に顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な洗浄、温水洗浄、浸漬洗浄、或いはこれらの組み合わせ洗浄に適する液体洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、酵素を配合した洗浄剤組成物について検討した結果、特定の変異セルラーゼが高温で安定であると共に高活性であり、これを配合した組成物が、再汚染防止効果に優れ、高濃度な洗浄や温水洗浄等に適した液体洗浄剤組成物となり得ることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼを含有する液体洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（ａ）成分の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１１】
親アルカリセルラーゼである「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ」としてはＥｇｌ−２３７［バチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルス エスピー １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen, Microbiol, 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１２】
そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、２４２位のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の２４２位に相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものである。 斯かる他のアミノ酸残基としては、セリン残基が好ましい。
【００１３】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１４】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の２４２位に相当する位置を、前述したＥｇｌ−１１３９、Ｅｇｌ−６４、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂについて示せば、Ｅｇｌ−１１３９では２４２位、Ｅｇｌ−６４では２４２位、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂでは２２８位である。
【００１５】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼは、その酵素活性及び酵素特性が変化しない限り、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基以外に、例えば配列番号１の１０位のロイシン、１６位のイソロイシン、２２位のセリン、３３位のアスパラギン、３９位のフェニルアラニン、７６位のイソロイシン、１０９位のメチオニン、２６３位のフェニルアラニン、３０８位のスレオニン、４６２位のアスパラギン、４６６位のリジン、４６８位のバリン、５５２位のイソロイシン、５６４位のイソロイシン、６０８位のセリン等が他のアミノ酸残基に同時に置換していてもよい。
【００１６】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼにおいて、２個所以上の変異が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１７】
３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１８】
４重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１９】
５重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１７置換体でもよい。
【００２０】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００２１】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばバチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。
【００２２】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Takara製)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２３】
得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
【００２４】
斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２５】
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
【００２６】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、限外ろ過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。
【００２７】
斯くして得られた本発明の変異アルカリセルラーゼは、優れた耐熱性を有するとともに、洗浄力にも優れ、更に高い比活性を有する。
【００２８】
（ａ）成分の含有量は、液体洗浄剤組成物中０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．０００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２．０質量％が更に好ましい。そして、（ａ）成分は、作業性の点で予め液体に混合して用いるのが好ましく、斯かる観点から、更に０．１〜２０質量％、更に０．５〜１０質量％、特に１〜８質量％含有するのが好ましい。
【００２９】
本発明の液体洗浄剤組成物には、上記成分（ａ）に加えて、更に（ｂ）界面活性剤、（ｃ）ビルダー及び（ｄ）可溶化剤を含有するのが好ましい。
（ｂ）界面活性剤としては、従来から液体洗浄剤組成物に配合することが知られている界面活性剤を使用することができる。
洗浄性を高める上で界面活性剤として、再汚染防止性の点から陰イオン界面活性剤、皮脂汚れ洗浄性の点から非イオン界面活性剤を主界面活性剤として使用するのが好ましい。
【００３０】
陰イオン界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルキル鎖を持つ直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、アルキル硫酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル、アルファスルホ脂肪酸アルキル（例えばメチル）エステル、炭素数８〜２０の脂肪酸等のアルカリ金属塩が好ましい。
陰イオン界面活性剤の対イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属以外に、マグネシウム等のアルカリ土類金属及び／又はモノ、ジ、トリエタノールアミン等のアルカノールアミン等を使用するが、特にアルカノールアミンを用いることで液安定性が向上することから好適である。その場合、組成物中の陰イオン界面活性剤の含有量は好ましくは５〜５０質量％、特に１０〜５０質量％とするのが好ましい
【００３１】
非イオン界面活性剤としては、下記（１）〜（４）のようなものが使用できる。
（１）平均炭素数が８〜２０の直鎖１級アルコール又は直鎖２級アルコール由来のアルキル基又は分岐アルコール由来のアルキル基又はアルケニル基を有し、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと表記する）を平均で１〜２０モルを付加したポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエーテル。
【００３２】
（２）平均炭素数が８〜２０のアルキル基又はアルケニル基を有し、ＥＯを平均で１〜１５モル及びプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと表記する）を平均で１〜５モル付加したポリオキシアルキレンアルキル又はアルケニルエーテル。この場合、ＥＯ及びＰＯはランダム付加でもブロック付加でもいずれでもよい。
特に襟・袖口汚れに対する高洗浄力を得ることができる点から、次式（Ａ）のものが好ましい。
Ｒ1−Ｏ（ＥＯ）p（ＰＯ）q（ＥＯ）rＨ （Ａ）
〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２０の直鎖のアルキル基又はアルケニル基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ＰＯはオキシプロピレン基を示し、ｐ、ｑ及びｒは平均付加モル数を示し、ｐ＞０、ｑ＝１〜４、ｒ＞０、ｐ＋ｑ＋ｒ＝６〜１４、ｐ＋ｒ＝５〜１２であり、好ましくはｐ＋ｑ＋ｒ＝７〜１４、ｐ＋ｒ＝６〜１２、ｑ＝１〜２である。〕
【００３３】
（３）次の一般式（Ｂ）で表されるアルキル多糖界面活性剤。
Ｒ2−（ＯＲ3）eＧf （Ｂ）
〔式中、Ｒ2は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜１８のアルキル基、アルケニル基、又はアルキルフェニル基を示し、Ｒ3は炭素数２〜４のアルキレン基を示し、Ｇは炭素数５又は６の還元糖に由来する残基を示し、ｅは平均値０〜６の数、ｆは平均値１〜１０の数を示す。〕
【００３４】
（４）脂肪酸アルカノールアミド、ポリヒドロキシ脂肪酸アミド。
【００３５】
特に、油性汚れに対する洗浄力の点から、（１）及び／又は（２）のポリオキシアルキレンアルキルエーテルを含有するのが好ましく、（２）を含有するのがより好ましい。また、組成物中の非イオン界面活性剤の含有量は好ましくは５〜５０質量％、特に１０〜５０質量％であるのが好ましい。
また、酵素安定化の点から、非イオン界面活性剤／陰イオン界面活性剤の質量比は１００／０〜１００／１０であるのが好ましく、１００／１〜１００／１０がより好ましく、１００／１〜１００／５が更に好ましい。
【００３６】
更に被洗浄物などの柔軟性を向上させるためには、モノ長鎖アルキル４級アンモニウム塩等の陽イオン界面活性剤を、好ましくは組成物中０．５〜１０質量％、特に１〜５質量％含有するのが好ましい。
また、柔軟性向上効果の点から、長鎖アルキル基は、炭素数１２〜２２、特に１４〜２０のアルキル基である長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩が好ましい。
【００３７】
陽イオン界面活性剤の対イオンとしては、ハロゲンイオン、ＣＨ3ＳＯ4−、Ｃ2Ｈ5ＳＯ4−、ＣＨ3ＣＯＯ−又はＨＣＯＯ−が好ましい。更に柔軟性を高めるため、陽イオン界面活性剤を陰イオン界面活性剤に対して、陽イオン界面活性剤／陰イオン界面活性剤＝３／１〜１／２、更に２／１〜１／２、特に１．２／１〜１／１．２のモル比で配合するのが好ましい。
【００３８】
その他界面活性剤としては、液の安定性及び泥汚れ洗浄性の点から、両性界面活性剤を配合してもよい。
斯かる両性界面活性剤としては、アルキルカルボベタイン、アルキルスルホベタイン、アルキルアミドヒドロキシスルホベタイン、アルキルアミドアミン型ベタイン及びアルキルイミダゾリン型ベタインなどが好適である。
両性界面活性剤は、組成物中１〜２０質量％含有するのが好ましい。
【００３９】
（ｃ）成分のビルダーは、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、洗浄剤組成物に配合されると著しく洗剤性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものであり、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。斯かるビルダーとしては、水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
【００４０】
水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられ、中でも上記３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。
【００４１】
水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。
【００４２】
有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。
【００４３】
前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
本発明において、これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、特に前記水溶性無機化合物を含有することが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用することがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用することが更に好ましい。
【００４４】
洗浄性能の点から、ビルダーの合計量は液体洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
ここで、水溶性無機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、液体洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるのが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。
【００４５】
本発明の衣料用洗濯前処理剤組成物は、低温安定性、塗布性の点から、（ｄ）可溶化剤を１〜３０質量％含有するのが好ましく、２〜１５質量％がより好ましく、３〜１０質量％が更に好ましい。
（ｄ）成分としては、エタノール、メタノール、プロパノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等の炭素数１〜４の低級アルコール、トルエンスルホン酸（塩）、キシレンスルホン酸（塩）、下記一般式（Ｃ）で示される化合物等が挙げられる。
Ｘ−（Ｐｈ）−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）h（ＣＨ2ＣＨＲ4Ｏ）iＹ （Ｃ）
〔式中、Ｘは水素原子、Ｃ1〜Ｃ4のアルキル基又はアルケニル基、水酸基又はハロゲン原子を示し、Ｙは水素原子、メチル基又はエチル基を示し、Ｐｈはフェニル基又はフェニレン基を示し、Ｒ4は水素原子、メチル基又はエチル基を示し、ｈは１〜６、好ましくは１〜３、ｉは０〜４、好ましくは０〜２、ｈ＋ｉは１〜１０、好ましくは１〜６の数を示す。〕
このうち、炭素数２〜３の低級アルコール、ｐ−トルエンスルホン酸（塩）がより好ましい。
【００４６】
本発明の液体洗浄剤組成物は、貯蔵安定性の点から、水を３〜５０質量％、特に５〜４０質量％含有するのが好ましい。
更に本発明の洗浄剤組成物には、従来より洗剤に配合することが知られている成分を配合することができる。このような成分として、二価金属イオン捕捉能を有する多価カルボン酸塩としてニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、イミノ二酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸塩及びトリエチレンテトラミン六酢酸塩等のアミノポリ酢酸塩、マロン酸、コハク酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等の塩；ポリアクリル酸塩、ポリマレイン酸塩、カルボキシメチルセルロース、平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、アクリル酸−マレイン酸共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸−イソブチレン共重合体若しくはその塩、無水マレイン酸―酢酸ビニル共重合体若しくはその塩、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマー等の再汚染防止剤又は分散剤０．０１〜１０質量％；ポリビニルピロリドン等の色移り防止剤０．０１〜１０質量％；ポリオキシアルキレンベンジルエーテル、ポリオキシアルキレンフェニルエーテル等の相調整剤又は洗浄力向上剤０．０１〜１０質量％；アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、その他のセルラーゼ等の酵素０．００１〜１０質量％；塩化カルシウム、硫酸カルシウム、ギ酸、ホウ酸（ホウ素化合物）等の酵素安定化剤０．００５〜１０質量％；過炭酸ナトリウム又は過硼酸ナトリウム等の漂白剤０．０１〜１０質量％；テトラアセチルエチレンジアミン、特開平６−３１６７００号公報において一般式（Ｉ−２）〜（Ｉ−７）で示される化合物等の漂白活性化剤０．０１〜１０質量％；チノパールＣＢＳ（チバスペシャリティケミカルス社製）やホワイテックスＳＡ（住友化学社製）等の蛍光染料０．００１〜１質量％；特開平１０−６０４８０号公報の請求項１記載のシリコーン等の柔軟基剤を０．１〜２質量％；ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤０．０１〜２質量％；シリコーン、シリカ等の調泡剤０．０１〜２質量％；水溶性色素；香料；抗菌防腐剤等を配合することができる。
【００４７】
斯くして得られる本発明の液体洗浄剤組成物は、２０℃で流動性をもつことが好ましい。ここで流動性は、内径３０ｍｍ、高さ５ｃｍで上部が開口している円筒形ガラス容器を用意し、低部から３ｃｍの高さまで組成物を入れ上部を密閉し、２０℃、鉛直状態で２４時間静置する。その後、上部を開放し、容器を９０度傾けた時、１分以内に内容物が流動してガラス容器の開口部に達する場合、組成物は流動性を持つと判断する。
【００４８】
本発明の液体洗浄剤組成物の２０℃における粘度は、取り扱いの容易さの点で１０〜４００ｍＰａ・ｓであるのが好ましく、３０〜３００ｍＰａ・ｓがより好ましく、５０〜２００ｍＰａ・ｓが更に好ましく、粘度調整剤によりこのような範囲になるように調製することが好ましい。
なお、これらの粘度は、Ｂ型粘度計（（株）東京計器製、ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ ＭＯＤＥＬ ＤＶＭ−Ｂ）を用い、ローター３又は４、回転数６０ｒ／ｍｉｎ、測定時間６０秒の条件で測定されたものである。
粘度調製剤としては、、減粘剤として（ｄ）成分の可溶化剤を用いることができ、増粘剤としては水溶性高分子、無機電解質を用いることができる。水溶性高分子としては、ポリマレイン酸、ポリイタコン酸、ビニルメチルエーテル−無水マレイン酸共重合物、ポリプロピレングリコール（分子量１００〜１０００）等が挙げられる。無機電解質としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
【００４９】
本発明の液体洗浄剤組成物が衣料用洗浄剤の場合、２０℃の０．１質量％水溶液のｐＨが６〜１１であることが洗浄性能の点で好ましく、ｐＨ７〜１１がより好ましく、ｐＨ７．５〜１１が更に好ましく、特にｐＨ１０〜１１が特に好ましい。また、２０℃の液体洗浄剤組成物のｐＨ（ＪＩＳ Ｋ ３３６２：１９９８に従って測定）が、６〜１１であることが保存性の点で好ましく、更にｐＨ７〜１１、更にｐＨ７．５〜１１が好ましく、特にｐＨ１０〜１１が特に好ましい。
【００５０】
ｐＨの調整に用いられるｐＨ調整剤は、上記ｐＨの範囲になるように添加すればよいが、洗浄性能や安定性の点で０．５〜３０質量％、好ましくは１〜２５質量％、より好ましくは３〜２０質量％含有するのが好ましい。
斯かるｐＨ調整剤としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メチルモノエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、３−アミノプロパノール等のアミン類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、珪酸ナトリウム、珪酸カリウム等のアルカリ金属珪酸塩、等が挙げられる。中でも、モノエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムから選ばれる１種以上が好ましい。
【００５１】
【実施例】
製造例１
（１）アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。
【００５２】
部位特異的変位Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕを導入するための変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（配列番号２）、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ（配列番号３）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ（配列番号５）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（配列番号６）、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ（配列番号７）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行った。
【００５３】
即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、タカラ製)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャムファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラ製）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。
【００５４】
（２）形質転換法
（１）で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いてChangらの方法（Chang and Cohen,Mol.Gen.Gent.,168,111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を５０ ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後 (６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｍｉｎ-1、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍ シュークロース、２０ｍＭ マレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ３（ディフコ製）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、シグマ製）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｍｉｎ-1)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、シグマ製）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬製）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ製）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ製）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（メルク製）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）によりプラスミドを回収、精製した。
【００５５】
（３）塩基配列の決定
（２）で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライド バイオシステム製）を用いて行なった。
【００５６】
実施例１〜１１
表１に示す液体洗浄剤組成物を調製した。比較例として、実施例に対応する、（ａ）成分を同活性量のケアザイム１０００Ｌに置き換えた組成物を調製した。
【００５７】
【表１】
ａ−１：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−２：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−３：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ａ−４：配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、１６位のイソロイシンをアスパラギンに、７６位のイソロイシンをヒスチジンに、２４２位のグルタミンをセリンに、４６６位のリシンをロイシンに置換した変異アルカリセルラーゼ
ソフタノール５０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均５モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
ソフタノール７０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
ソフタノール１２０：炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均１２モル付加）アルキルエーテル（日本触媒化学工業製）
Ｃ１２−１４、ＥＯ７：炭素数１２〜１４の１級アルコール由来のポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル
Ｃ１０−１４、ＥＯ５ＰＯ２ＥＯ３：炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均５モル、ＰＯを平均２モル、ＥＯを平均３モルの順にブロック付加させたもの
Ｃ１０−１４、ＥＯ８、ＰＯ２：炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均８モル、ＰＯを平均２モルランダム付加させたもの
ＥＳ：ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（炭素数１２／１４の直鎖アルキル、エチレンオキシド平均付加モル数３、ナトリウム塩）
ＬＡＳ：炭素数１０〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸
石鹸：ヤシ油脂肪酸塩
酵素：エバラーゼ１６．０Ｌ−ＥＸ（プロテアーゼ、ノボザイムズ社製）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバスペシャリティケミカルス社製）
【００５９】
得られた組成物を用いて以下の評価を行った。
（１）洗浄力評価
まず、表２に示した成分からなる油脂／カーボン汚れを木綿金布に染着させ、人工汚染布を調製した（６×６cm）。
【００６０】
【表２】
次いで、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１６７ｍＬを１Ｌ容ビーカー（内径１０５ｍｍ）に入れ、洗浄剤組成物０．６７ｇを溶解させ、この中に前記人工汚染布５枚を入れ、４０℃で１時間漬け置きした。次いで４０℃の使用水（同上）８３３ｍＬを加え、全量をかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメーター）の試料カップに移し、回転速度１００ｍｉｎ-1にて１０分間攪拌した後、人工汚染布を流水下で濯いだ。
実施例とそれに対応する比較例との一対比較を行ったところ、実施例１〜１１は何れも比較例よりも明らかに勝っていた。
【００６２】
（２）洗浄剤組成物の再汚染防止性
得られた液体洗浄剤０．６７ｇを、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに溶解させる。次にこれに日本油化学協会選定のカーボンブラック（旭カーボン（株）製、旭洗浄用カーボンブラックが好適）０．２５ｇを添加し、２６±１．５ＫＨｚの超音波を５分間照射してカーボンブラックを均一に分散させる。次にこれを４０℃にてかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメータ：Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ）の試料カップに移し、６ｃｍ×６ｃｍの木綿の白布（日本油化学協会選定の標準品、洗濯科学協会が販売する＃２０２３布）５枚を入れて回転速度１００±５ｍｉｎ-1で１０分間撹拌する。次に木綿の白布を取り出し、含水率が２００質量％以下になるように軽く手で絞ってから、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに入れ、かき混ぜ式洗浄力試験機（回転速度１００±５ｍｉｎ-1）を用いて３分間濯ぎ、この濯ぎ操作を計２回行なう。風乾後、アイロン仕上げを行って、実施例とそれに対応する比較例との一対比較を行ったところ、実施例１〜１１は何れも比較例よりも明らかに勝っていた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の液体洗浄剤組成物は、再汚染防止効果に優れ、高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯にも適し、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対しても優れた洗浄力を発揮する。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
Claims (5)
- （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基をセリン残基に置換した変異アルカリセルラーゼを含有する液体洗浄剤組成物。
- 更に、配列番号１の１０位のロイシン、１６位のイソロイシン、２２位のセリン、３３位のアスパラギン、３９位のフェニルアラニン、７６位のイソロイシン、１０９位のメチオニン、２６３位のフェニルアラニン、３０８位のスレオニン、４６２位のアスパラギン、４６６位のリジン、４６８位のバリン、５５２位のイソロイシン、５６４位のイソロイシン、及び６０８位のセリンからなる群から選ばれる少なくとも一つを他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼである請求項１記載の液体洗浄剤組成物。
- 変異アルカリセルラーゼが、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）、及びＳｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒからなる群から選ばれる２重置換体である請求項１記載の液体洗浄剤組成物。
- 更に、（ｂ）界面活性剤及び（ｃ）ビルダーを含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の液体洗浄剤組成物。
- 非イオン界面活性剤を５〜５０質量％含有する請求項４記載の液体洗浄剤組成物。
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