MX2012009344A

MX2012009344A - Composiciones de limpieza que comprende variantes de amilasa con alta estabilidad en presencia de un agente quelante.

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Publication number: MX2012009344A
Application number: MX2012009344A
Authority: MX
Inventors: Allan Svendsen; Philip Frank Souter; Michelle Meek; Frank Winther Rasmussen; Lindsay Suzanne Bewick; Annette Helle Johansen; Mads Eskelund Bjoernvad; Michael Skjoet; Eskildsen Signe Larsen; Jens Oebro; Svend Kaasgaard; Lars Beier
Original assignee: Procter & Gamble
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2011-02-10
Publication date: 2012-09-07
Also published as: JP5823414B2; EP3730595A2; JP2013519757A; WO2011100410A2; PL3428260T3; DK3428260T3; DK2534233T3; EP3730595A3; BR112012019835A2; CA2787825C; CA2787825A1; PL2534233T3; HUE044193T2; US9493730B2; EP2534233A2; JP6234960B2; ES2734183T3; WO2011100410A3; EP2357220A1; EP2534233B1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de limpieza que comprenden variantes de una alfa-amilasa que tienen una estabilidad mejorada frente a los agentes quelantes con respecto a su enzima parental y a los procesos de limpieza que comprenden dichas composiciones.

Description

COMPOSICIÓN DE LIMPIEZA QUE COMPRENDE VARIANTES DE AMILASA CON ALTA ESTABILIDAD EN PRESENCIA DE UN AGENTE QUELANTE REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS Esta solicitud contiene una lista de secuencias legible por computadora. La forma legible por computadora está incorporada en la presente descripción como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones de limpieza que comprenden variantes de una alfa-amilasa que tienen una estabilidad frente a los agentes quelantes mayor que su enzima parental.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las alfa-amilasas (alfa-1 ,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos con enlaces ,4-glucosidicos lineales y ramificados.

Las primeras alfa-amilasas bacterianas que se usaron incluían una alfa-amilasa de B. licheniformis conocida, además, como enzima Terma-myl que se ha caracterizado ampliamente y para la cual se ha determinado la estructura cristalina. Las amilasas alcalinas, tales como la alfa-amilasa derivada de la esp. Bacillus tal como se describe en la patente núm. WO 95/26397, forman un grupo específico de alfa-amilasas útiles en detergentes. Muchas de estas amilasas bacterianas conocidas se han modificado para mejorar su fun-cionalidad en una aplicación determinada.

Termamyl y muchas alfa-amilasas altamente eficaces requieren calcio para la actividad. En la estructura cristalina de la enzima Termamyl se encontraron cuatro átomos de calcio unidos en la estructura de la alfa-amilasa coordinados por residuos de aminoácidos de carga negativa. En otras alfa-amilasas la cantidad de iones calcio unidos en la estructura podría ser diferente. Este requerimiento de calcio constituye una desventaja en aquellas aplicaciones en las cuales hay compuestos quelantes fuertes, por ejemplo, en detergentes y composiciones de limpieza.

Como se mencionó anteriormente, se conoce que varias enzimas dependen del calcio u otros iones metálicos, tales como magnesio o zinc tanto para la actividad como para la estabilidad y, por consiguiente, existe el desafío de desarrollar enzimas que sean estables y exhiban un desempeño adecuado en detergentes y composiciones de limpieza que contienen agentes quelantes. Los agentes quelantes se incorporan para reducir la dureza del agua durante el lava-do y para proteger los agentes blanqueadores que, además, pueden estar presentes. Además, los agentes quelantes tienen un efecto directo en la limpieza de algunas manchas. Algunas veces, la estabilidad de una enzima dependiente de calcio en un detergente puede mejorarse por medio de la adición de calcio al de- tergente, pero, frecuentemente, esto elimina el efecto de limpieza de manchas. Además, la adición de calcio en un detergente líquido puede presentar problemas con la formulación, es decir, la estabilidad física del detergente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, sería ventajoso suministrar composiciones y variantes de alfa-amilasas que sean estables frente a los agentes quelantes y que, preferentemente, mantengan o incrementen el rendimiento de lavado en comparación con la alfa-amilasa parental.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6; y comprende, además, un adicional de limpieza y, opcionalmente, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante de alfa-amilasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la SEQ ID NO: 6; y comprende, además, una susti- tución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, al menos un adicional de limpieza y comprende, opcionalmente, además, un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de los iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0; y un adicional de limpieza.

Otro aspecto se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y comprende, además, un adicional de limpieza y, opcionalmente, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 0.9 veces la concentración del citrato capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0; y un adicional de limpieza.

En un aspecto preferido la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental que comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y que comprende, además, una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo y adyacente a la posición, (¡i) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0.6.

En otro aspecto la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y que comprende, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y que comprende, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447 y 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo y adyacente a la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Las alfa-amilasas (alfa-1 ,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1 ) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos con enlaces 1 ,4-glucosídicos lineales y ramificados. Se conoce que las alfa-amilasas se derivan de una amplia selección de organismos que incluyen bacterias, tales como las bacterias de las especies del género Bacillus, por ejemplo, Bacillus licheniformis; de especies de hongos, tales como Aspergillus oryzae (amilasa TAKA) o Aspergillus ni-ger, de plantas tales como cebada y de mamíferos.

Enzima silvestre: El término alfa-amilasa "silvestre" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.

Los términos "enzima silvestre" y "enzima parental" se pueden usar indistintamente cuando la enzima parental no es una enzima vanante.

Enzima variante: El término "variante" se define en la presente descripción como un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa que com-prende una alteración, tal como una sustitución, inserción, y/o deleción, de uno o más (o uno o varios) residuos de aminoácidos en una o más (o una o varias) posiciones específicas de la alfa-amilasa parental o silvestre. Preferentemente, menos de 50 modificaciones, con mayor preferencia, menos de 30 modificaciones. La alfa-amilasa alterada se obtiene por medio de intervención humana por la modificación de la alfa-amilasa parental.

Enzima parental: El término alfa-amilasa "parental", como se usa en la presente descripción, se refiere a una alfa-amilasa en la cual se realizan modificaciones para producir las alfa-amilasas variantes de la presente invención. Este término se refiere, además, al polipéptido con el cual se compara una variante de la invención. El genitor puede ser un polipéptido de origen natural (silvestre) o una variante de este preparada por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la proteína parental puede ser una variante de un polipéptido de origen natural que se modificó o alteró en la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, la alfa-amilasa parental puede tener una o más (o una o varias) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Por lo tanto, la alfa-amilasa parental puede ser una variante de una alfa-amilasa parental. Un genitor puede ser, además, una variante alélica que es un polipéptido codificado por cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico.

Propiedad mejorada: El término "propiedad mejorada" se define en la presente descripción como una característica asociada con una variante que se mejora en comparación con la alfa-amilasa parental. Dichas propiedades mejoradas incluyen, pero no se limitan a, mayor actividad amilolítica, por ejemplo, cuando se mide en el ensayo EnzChek o el ensayo PNP-G7, tal como se describe en la sección de Ejemplos de la presente descripción, mayor rendimiento de lavado, tal como el desempeño relacionado con la suciedad, por ejemplo, desempeño relacionado con las suciedades que contienen almidón, eliminación de manchas, antidecoloración, estabilidad, por ejemplo, termoesta-bilidad, estabilidad del pH o estabilidad en presencia de aditivos que incluyen quelantes, estabilidad en formulaciones detergentes o composiciones lavavaji-llas en polvo, líquidas o en gel, perfil de actividad y desempeño dependiente de la temperatura alterado, actividad de pH, especificación del sustrato, especificación del producto y estabilidad química. El desempeño de lavado y/o desempeño de lavado de vajilla se puede medir tal como se describe más abajo en "Materiales y métodos" en la presente solicitud. Preferentemente, las variantes de la invención incluyen una combinación de propiedades mejoradas tales como una mayor estabilidad, un mejor desempeño de lavado, un mejor desempeño de lavado de vajilla y/o una mayor actividad en detergente. La estabilidad mejorada incluye tanto la estabilidad durante el almacenamiento en un producto detergente concentrado como la estabilidad en el detergente diluido durante el la- vado. La propiedad mejorada incluye un mejor desempeño de lavado o lavado de vajilla a temperatura baja.

En el contexto de la presente descripción, el término "actividad" se refiere a la actividad amilolítica medida por la cantidad de enlaces 1 ,4-alfa-D-glicosídicos hidrolizados en polisacáridos que contienen tres o más unidades D-glucosa con enlaces 1 ,4-alfa, por ejemplo, en almidón por unidad de tiempo y por unidad de proteina enzimática en condiciones especificadas, por ejemplo, la actividad obtenida en condiciones específicas por mi de una muestra de enzimas de g de una proteína enzimática. La actividad se puede medir, por ejemplo, en el ensayo EnzChek o en un ensayo PNP-G7 tal como se describe más abajo en "Materiales y métodos". En la presente solicitud, el término "actividad" se usa indistintamente con "actividad amilolítica". El término "actividad específica" se usa, frecuentemente, para describir la actividad máxima obtenida por mi (o g) de una proteína enzimática.

Estabilidad química mejorada: El término "estabilidad química mejorada" se define en la presente descripción como una enzima variante que exhibe retención de la actividad enzimática después de un periodo de incubación en presencia de una o varias sustancias químicas de origen natural o sintético que reducen la actividad enzimática de la enzima parental. La estabilidad química mejorada puede producir, además, variantes con mayor capacidad para catalizar una reacción en presencia de dichas sustancias químicas. En un aspecto particular de la invención, la estabilidad química mejorada es una estabilidad mejorada en un detergente, particularmente, en un detergente líquido.

La estabilidad mejorada del detergente es, particularmente, una mayor estabilidad de la actividad de alfa-amilasa cuando una variante de alfa-amilasa de la presente invención se mezcla en una formulación detergente líquida que comprende un agente quelante; el líquido incluye, además, geles o una pasta. La formulación detergente líquida puede referirse a un detergente concentrado que se añade durante un proceso de lavado automático o lavandería o un detergente diluido, tal como una solución de lavado, es decir, una solución acuosa en la cual se añade el detergente concentrado.

En la presente invención, los detergentes líquidos son particu-larmente útiles como detergentes líquidos para lavandería.

Estabilidad: El término "estabilidad" incluye la estabilidad en el almacenamiento y la estabilidad durante el uso, por ejemplo, durante un proceso de lavado y refleja la estabilidad de la amilasa como una función de tiempo, por ejemplo, cuánta actividad se retiene cuando la amilasa se man-tiene en solución, particularmente, en una solución detergente. Por ejemplo, la variante de alfa-amilasa puede tener una actividad residual, es decir, cuánta actividad se retiene, por encima del 70 % después de 18 horas a 31 °C. Muchos factores, por ejemplo, el pH, la temperatura, la composición del detergente, por ejemplo, la cantidad y el tipo de aditivo, surfactantes, etc. influyen en la estabilidad. La estabilidad de la amilasa se mide con el ensayo EnzCheck o el ensayo PNP-G7 descrito en "Materiales y métodos".

Estabilidad mejorada: El término "estabilidad mejorada" se define en la presente descripción como una enzima variante que muestra una estabilidad mejorada mayor que la estabilidad de la alfa-amilasa paren-tai, por ejemplo, al tener una actividad residual mayor que 70 % o una mejora de al menos 10 pp en la actividad residual con respecto al genitor después de 18 horas a pH 8 en presencia de (1 .5 p/v) DTPA a 31 °C cuando se mide en el ensayo EnzC heck tal como se describe en "Materiales y métodos". Los puntos porcentuales (pp) de mejora en la actividad residual de la variante con respecto a la del genitor se calculan como la diferencia entre la actividad residual de la variante y la correspondiente al genitor tal como se describe en "Materiales y métodos".

Aditivo: Los aditivos se pueden clasificar mediante la prueba descrita por M.K.Nagarajan y col., JAOCS, Vol. 61 , núm. 9 (septiembre de 1984), págs. 1475-1478 para determinar el nivel de aditivo mínimo requerido para reducir la dureza del agua a pH 8 de 2.0 mM (como CaC03) a 0.10 mM en una solución. El aditivo puede ser, particularmente, el agente quelante que forma complejos solubles en agua, por ejemplo, con iones calcio y magnesio.

Los agentes quelantes son sustancias químicas que forman moléculas con ciertos iones metálicos e inactivan los iones de modo que no puedan reaccionar con otros elementos; por lo tanto, son un agente aglutinante que elimina la actividad química por medio de la formación de quelatos. La quelación es la formación o presencia de dos o más enlaces separados entre un ligando y un solo átomo central. El ligando puede ser cualquier compuesto orgánico, un silicato o un fosfato. En el contexto de la presente descripción, el término "agentes quelantes" comprende quelantes, agentes quelantes, agentes formadores de complejos o agentes secuestrantes que forman complejos solubles en agua con iones metálicos tales como calcio y magnesio. El efecto de quelato describe la afinidad mejorada de los ligandos quelantes para un ion metálico en comparación con la afinidad de un conjunto de ligandos no quelantes similares para el mismo metal. Los agentes quelantes tienen capacidad aglutinante con iones metálicos, particularmente, iones calcio (Ca2+), y se han usado extensamente en detergentes y composiciones, generalmente, para lavado, por ejemplo, lavandería o lavado de vajilla. Sin embargo, los agentes quelantes demostraron su capacidad para inhibir la actividad enzimática. El término agente quelante se usa en la presente solicitud indistintamente con "agente formador de complejos" o "agente quelante" o "quelante".

Dado que la mayoría de las alfa-amilasas son sensibles al calcio en presencia de agentes quelantes; estos pueden dificultar la actividad enzimática. La sensibilidad de las alfa-amilasas al calcio se puede determinar me-diante la incubación de una alfa-amilasa determinada en presencia de un agente quelante fuerte y el análisis del impacto de esta incubación en la actividad de la alfa-amilasa considerada. Una alfa-amilasa sensible al calcio perderá una mayor parte o toda su actividad durante la incubación.

Caracterización de agentes quelantes: Como se mencionó, el efecto del quelato o el efecto quelante describen la mayor afinidad de los ligandos quelantes para un ion metálico en comparación con la afinidad de un conjunto de ligandos no quelantes similares para el mismo metal. Sin embargo, la fuerza de este efecto del quelato puede determinarse por diversos tipos de ensayos o métodos de medición y, de ese modo, diferenciar o clasificar los agentes quelantes de conformidad con su efecto (o fuerza) quelante.

En un ensayo preferido, los agentes quelantes pueden caracterizarse por su capacidad para reducir la concentración de iones calcio libres (Ca2+) de 2.0 mM a 0.10 mM o menos a pH 8.0, por ejemplo, mediante el uso de una prueba basada en el método descrito por M.K.Nagarajan y col., JA-OCS, Vol. 61 , núm. 9 (septiembre de 1984), págs. 1475-1478. Un ejemplo de caracterización de agentes con el método basado en Nagarajan y col. se describe en el Ejemplo 2a. Preferentemente, el agente quelante de conformidad con la invención abarca agentes quelantes capaces de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.1 mM o menos a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o preferentemente menor que 1 mM, cuando se mide en pH 8.0 a 21 °C.

Preferentemente, el agente quelante de conformidad con la invención abarca agentes quelantes capaces de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.1 mM a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 mM, cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM (ácido (4-(2-hidroxietil) piperazina-1 -propanosulfónico)) a pH 8 a 21 °C. En una modalidad preferida específica, el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.1 mM cuando se mide en clo-ruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM a pH 8 y 21 °C y con un electrodo selectivo de ion calcio para determinar la concentración de calcio libre tal como se describe en "Materiales y métodos". Por lo tanto, preferentemente, los agentes quelantes abarcan agentes quelantes capaces de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración me-ñor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9.0 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8.0 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7.0 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, me- ñor que 6.0 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5.0 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente menor que 4.0 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3.0 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, me-ñor que 2.0 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 .0 mM cuando se prueba á pH 8.0 y 21 CC tal como se describe en "Materiales y métodos".

En una modalidad especialmente preferida, los agentes quelantes son capaces de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM a pH 8 y 21 °C a una concentración de 9 mM a 0.5 mM, preferentemente, de 9 mM a 1 mM, preferentemente, de 8 mM a 1 mM, preferentemente, de 7 mM a 1 mM, preferentemente, de 6 mM a 1 mM, preferentemente, de 5 mM a 1 mM, preferentemente, de 4 mM a 1 mM, preferentemente, de 3 mM a 1 mM, preferente-mente, de 2 mM a 1 mM, preferentemente, de 9.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 8.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 7.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 6.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 5.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 4.0 mM a 1.5 mM, preferentemente, de 3.0 a 1.5 mM, preferentemente, de 2.5 mM a 1.0 mM, preferentemente, de 2.0 mM a 1.1 mM, prefe-rentemente, de 1.85 mM a 1.0 mM.

La reducción en la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM Ca2+ a 0.10 mM corresponde a la reducción de la dureza del agua de 200 ppm (como CaCÜ3 en la forma de Ca(HC03)2 en presencia de C02 ací- dico) a 10 ppm. El nivel mínimo de aditivo se calcula a partir de la sal sódica del quelante sobre la base del quelante 100 % seco.

El efecto quelante del agente quelante puede medirse, además, con respecto al citrato. A la concentración del citrato capaz de reducir la con-centración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM se asigna el valor de 1 y los resultados de los agentes quelantes se comparan con este valor. El agente quelante preferido de conformidad con la invención es capaz reducir la concentración de calcio libre de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración menor que 0.9, tal como menor que 0.8, tal como menor que 0.7, tal como menor que 0.6, tal como menor que 0.5, tal como menor que 0.4, tal como menor que 0.3, tal como menor que 0.2, tal como menor que 0.1 veces en comparación con la concentración del citrato cuando se mide a pH 8.0 y 21 °C. El agente quelante preferido de conformidad con la invención es capaz de reducir la concentración de calcio libre de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración menor que 0.9, tal como menor que 0.8, tal como menor que 0.7, tal como menor que 0.6, tal como menor que 0.5, tal como menor que 0.4, tal como menor que 0.3, tal como menor que 0.2, tal como menor que 0.1 veces en comparación con la concentración del citrato cuando se mide a pH 8.0 y 21 °C con un electrodo selectivo de ion calcio para determinar la concentración de calcio libre cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM a 21 °C y pH 8.0.

En una modalidad particularmente preferida, el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 1.0 a 0.1, tal como menor que 0.9 a 0.1 , tal como menor que 0.8 a 0.1 , tal como menor que 0.7 a 0.1 , tal como menor que 0.6 a 0.1 , tal como menor que 0.5 a 0.1, tal como menor que 0.4 a 0.1 , tal como menor que 0.35 a 0.1 , tal como menor que 0.3 a 0.1 veces en comparación con la concentración del citrato capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a pH 8.0 y 21 °C.

Otra modalidad de la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la alfa-amilasa variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212 y 213 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0; y un adicional de limpieza.

En una modalidad preferida de la invención, la composición de limpieza comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones en el intervalo de 193 a 213 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 0.9 veces la concentración del citrato capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8; y un adicional de limpieza.

Otra modalidad de la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la alfa-amilasa variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212 y 213 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

Por lo tanto, el agente quelante de conformidad con la invención es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración menor que la concentración del citrato necesaria para reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM en las mismas condiciones.

Alternativamente, la resistencia del complejo formado entre el agente quelante y los iones metálicos, tales como calcio y/o magnesio, se ex-presa como el valor K logarítmico (constante de equilibrio o unión o disociación o estabilidad). Esta constante se puede medir a un pH determinado, a una temperatura determinada y a una resistencia iónica determinada.

Como se mencionó anteriormente, la resistencia del complejo formado entre el agente quelante y los iones metálicos, por ejemplo, calcio y/o magnesio se puede expresar como el valor del logaritmo de K (constante de equilibrio o unión o disociación o estabilidad); la constante puede medirse por medio de calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés) tal como se describe en A. Nielsen y col., Anal. Biochem. Vol. 314, (2003), págs. 227-234 y a partir del valor de K, el logaritmo de K puede calcularse como el logaritmo del valor de K (base 10). El valor del logaritmo de K medido por este método dependerá de la temperatura, pH y resistencia ió-nica, de modo que al comparar valores del logaritmo de K es importante que estos se determinen en condiciones similares, preferentemente, en las mismas condiciones. Además, mediante la introducción de un estándar como referencia, tal como citrato, se pueden reducir los impactos de las variaciones en los experimentos. Preferentemente, el logaritmo de K se determina tal como se describe en "Materiales y métodos" de la presente solicitud; por lo tanto, en una modalidad de la invención el agente quelante en la composición de conformidad con la "invención tiene un logaritmo de K de al menos 3, tal como al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7, tal como al menos 8, tal como al menos 9, tal como al menos 10, tal como al menos 11, cuando el logaritmo de K se mide a pH 10 y 19 °C, tal como se describe en "Materiales y métodos". El valor del logaritmo de K del agente quelante en las composiciones de conformidad con la invención puede estar, además, dentro del rango de 3-11 , tal como 3-10, tal como 3-9, tal como 3-8, tal como 4-1 1 , tal como 5-11 tal como 6- 1 , tal como 4-10, tal como 5-10, tal como 4-9, tal como 5-9, tal como 4-8, particularmente, 5-8. Preferentemente, el logaritmo de K del agente quelante en la composición de conformidad con la invención es un factor de al menos 1 , tal como al menos 1.33, tal como al menos 1.67, tal como al menos 2, tal como al menos 2.33, tal como al menos 2.67, tal como al menos 3, tal como al menos 3.33, tal como al menos 3.67 veces el logaritmo de K del citrato determinado tal como se describe en el Ejemplo 2b. El agente quelante en las composiciones de conformidad con la invención puede estar, además, en el intervalo de un fac-tor de 1 a 3.67, tal como 1 -3.33, tal como 1-3.00, tal como 1 -2.67, tal como 1.33-3.67, tal como 1.33-3.33, tal como 1.33-3.00, tal como 1.33-2.67, tal como 1.67-3.67, tal como 1.67-3.33, tal como 1.67-3, particularmente, 1.67-2.67 veces el logaritmo de K del citrato determinado tal como se describe en "Materiales y métodos".

Los agentes quelantes útiles pueden ser, sin limitarse a, los siguientes: ácido N-(1 ,2-dicarboxi-etil)-D,L-aspártico (IDS), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-N-ácido monoacético (ASMA), ácido aspártico- ?,?-ácido diacético (ASDA), ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil) aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil) glutámico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil) glutámico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido a- alanina-N.N-diacético (a -ALDA), ácido serina-N.N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico-?,?- ácido diacético (ANDA), ácido sulfanílico-N, N-ácido diacético (SLDA), taurina-N, N-ácido diacético (TUDA), ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N-(hidroxietil)-etilidendiaminotriacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), aminotris(ácido metilenfosfónico) (ATMP).

El agente quelante preferido puede contener un grupo amino y puede ser, por ejemplo, un amino-policarboxilato o un fosfonato. Puede ser una molécula monomérica que comprende uno, dos o tres grupos amino (típicamente, grupos amino secundarios o terciarios) y puede contener dos, tres, cuatro o cinco grupos carboxilo o aun más grupos carboxilo. Los agentes quelantes pueden contener o no contener fósforo. Existen varias formas para agrupar agentes quelantes; una forma podría ser la siguiente: Agentes quelantes que son o se basan en grupos carboxilato tales como EDTA (etilendiaminatetraacetato), NTA (2,2',2"-n¡trilotriacetato), citrato, 2-hidroxipropan-1 ,2,3-tricarboxilato, DTPA (ácido dietilentriaminapen-taacético), MGDA (ácido metilglicinadiacético o ?,?'-bis(carboximetil)alanina), EGTA (ácido etilenglicol tetraacético), EDDS (ácido etilendiamina-A/,A/-d¡succínico), GLDA (ácido L-glutámico, ácido N,N-diacético), policarboxilatos tales como PAA [poli(ácido acrílico)], PAA/PMA [copoli(ácido acrílico/ácido maleico)] o mezclas de estos.

Los agentes quelantes que contienen fósforo pueden ser polifos-fatos o fosfonatos, tales como tripolifosfato de sodio (STP), HEDP (ácido 1-hidroxietiliden-1 ,1-difosfónico), EDTMP [ácido etilendiamina te- tra(metilenofosfónico)], EDTMPA (ácido etilendiaminatetrametilentetrafosfónico), DTPMP(dietilentriamina penta (ácido metilenofosfónico), DTMPA (dietilentriaminapenta(ácido metilenofosfónico)). Los agentes quelantes pueden contener nitrógeno, tal como en EDTA, NTA, DTPA, PDTA, GLDA, MGDA, EDDS, EDTMP, EDTMPA y DTPMP o ASMA, ASDA, ASMP, IDA, SMAS, SEAS, SMGL, SEGL, MIDA, a-ALDA, SEDA, ISDA, PHDA, ANDA, SLDA, TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP o mezclas de estos.

Por lo tanto, los agentes quelantes preferidos pueden ser, sin limitarse a, los siguientes: ácido etilen-diamina-tetraacético (EDTA), ácido dieti-lentriamina penta metilenofosfónico (DTMPA, DTPMP), ácido hidroxietano di-fosfónico (HEDP), ácido etilendiamina ?,?'-disuccínico (EDDS), ácido metil glicina di-acético (MGDA), ácido dietilentriamina penta acético (DTPA), ácido propilendiamina tetraacético (PDTA), N-óxido de la 2-hidroxipiridina (HPNO), ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido glutámico ácido ?,?-diacético (sal tetrasódica del ácido ?,?-dicarboximetil glutámico) (GLDA) y ácido nitrilotria-cético (NTA) o mezclas de estos. Los agentes quelantes pueden estar presentes en su forma ácida o como una sal, preferentemente, los agentes quelantes pueden estar presentes como una sal sódica, amónica o potásica.

El agente quelante puede estar presente en la composición en una cantidad de 0.0001 % en peso a 20 % en peso, preferentemente, de 0.01 a 10 % en peso, con mayor preferencia, de 0.1 a 5 % en peso.

Alfa-amilasa parental. La alfa-amilasa- parental puede ser, en principio, cualquier alfa-amilasa para la cual se desea preparar una variante que tenga estabilidad mejorada durante el almacenamiento o en el uso, por ejemplo, durante el lavado o en un proceso de hidrólisis del almidón. Por lo tanto, la estabilidad mejorada puede observarse como una pérdida reducida de la actividad amilolítica durante el almacenamiento o como una mayor ac-tividad y desempeño durante el uso. Las alfa-amilasas conocidas se derivan de una amplia selección de organismos que incluyen bacterias, tales como las bacterias de las especies del género Bacillus, por ejemplo, Bacillus licheniformis; de especies de hongos, tales como Aspergillus oryzae (TAKA ami-lasa) o Aspergillus niger, de plantas tales como cebada y de mamíferos. La alfa-amilasa parental puede ser, en principio, cualquiera de esas amilasas, independientemente del origen.

Se conoce que varias alfa-amilasas producidas por las esp. Bacillus son altamente idénticas en el nivel del aminoácido. Debido a la identidad considerable encontrada entre estas alfa-amilasas, se consideran como pertenecientes a la misma clase de alfa-amilasas, es decir, la clase de "alfa-amilasas del tipo de Termamyl".

En consecuencia, en el contexto de la presente descripción, el término "alfa-amilasa del tipo de Termamyl" está previsto para indicar una alfa-amilasa, particularmente, una alfa-amilasa de Bacillus que, en el nivel del ami-noácido, exhibe una identidad considerable, es decir, al menos 60 % con la alfa-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 20 (Termamyl™), en la presente descripción.

Alfa-amilasas del tipo de Termamyl La identidad de varias alfa-amilasas de Bacillus conocidas de encontrarse en el siguiente cuadro 1 : Cuadro 1 Por ejemplo, se ha determinado que la alfa-amilasa de B. liche-niformis que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 20 (distribuida comercialmente como Termamyl™) es aproximadamente 81 % homologa a la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 14 (BAN) y aproximadamente 65 % homologa a la alfa-amilasa de ß. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 16 (BSG). Además, las alfa-amilasas homologas incluyen SP722 y SP690 descritas en la patente núm. WO 95/26397 y representadas, además, en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, en la presente descripción. Otras amilasas son la alfa-amilasa AA560 derivada de la esp. Bacillus e indi- cada en la SEQ ID NO: 10 y las alfa-amilasas SP707 o núm. 707 derivadas de la esp. Bacillus indicadas en la SEQ ID NO: 8 y descritas por Tsukamoto y col., Biochemical and Biophvsical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31 . Otro homólogo es la alfa-amilasa KSM AP1378 descrita en la patente núm. WO 97/00324 (de KAO Corporation), SEQ ID NO: 18. Otro homólogo es SP.7-7 con la SEQ ID NO: 22. Otra amilasa parental adecuada es la K 38 SEQ ID NO: 2 o la amilasa de B. circulans con la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 24 descritas en la patente núm. WO 2005/001064.

Además, otras alfa-amilasas de interés incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en la patente núm. EP 0252666 (ATCC 2781 1 ) y las alfa-amilasas identificadas en las patentes núm. WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras alfa-amilasas del tipo Termamyl comerciales están comprendidas en los productos comercializados con los siguientes nombres comerciales: Optitherm™ y Takatherm™ (Solvay); Maxamyl™ (disponible de Gist-brocades/Genencor), Spezym AA™ y Spezyme Delta AA™ (disponibles de Genencor), y Keistase™ (disponible de Daiwa), Dex lo, GC 521 (disponible de Genencor) y Ultraphlow (de Enzyme Biosystems), Puras-tar™ ST 5000E, PURASTRA™ HPAM L, POWERASE™, Spezyme FRED, GC358, ClearFlow AA (de Danisco.) o la alfa-amilasa TS-23 (SEQ ID NO: 26 (Lin y col., J. App. Microbiol. 1997, 82, 325-334).

La alfa-amilasa que no es del tipo de Termamyl puede ser, por ejemplo, una alfa-amilasa fúngica, una alfa-amilasa de mamífero o de una planta o una alfa-amilasa bacteriana (diferente de una alfa-amilasa de tipo Termamyl). Los ejemplos específicos de tales alfa-amilasas incluyen la alfa-amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, la alfa-amilasa ácida de A. niger, la alfa-amilasa de Bacillus subtilis, la alfa-amilasa de páncreas porcino y una alfa-amilasa de cebada. Las estructuras de todas estas alfa-amilasas son conoci-das y marcadamente diferentes a la estructura de una alfa-amilasa de tipo Termamyl típica tal como se menciona en la presente descripción.

Las alfa-amilasas fúngicas mencionadas anteriormente, es decir, derivadas de A. niger y A. oryzae son altamente idénticas en el nivel del aminoácido y, generalmente, se consideran como pertenecientes a la misma familia de alfa-amilasas. La alfa-amilasa fúngica derivada de Aspergillus oryzae está disponible comercialmente con el nombre comercial de Fungamyl™.

Alfa-amilasas híbridas parentales La alfa-amilasa parental puede ser una alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos alfa-amilasas.

La alfa-amilasa híbrida parental puede ser una que, sobre la base de la homología de aminoácidos y/o reactividad inmunológica cruzada y/o hibridación de ADN (tal como se definió anteriormente) puede determinarse como perteneciente a la familia de alfa-amilasas del tipo Termamyl. En este caso, la alfa-amilasa híbrida está compuesta, típicamente, por al menos una parte de una alfa-amilasa de tipo Termamyl y parte(s) de una o más alfa-amilasas distintas seleccionadas de las alfa-amilasas de tipo Termamyl o al- fa-amilasas que no corresponden al tipo de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o de mamífero.

Por lo tanto, la alfa-amilasa híbrida parental puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que se derivan de al menos dos alfa-amilasas de tipo Termamyl o de al menos una alfa-amilasa de tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa bacteriana que no corresponde al tipo de Termamyl o de al menos una alfa-amilasa de tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa fúngica. La alfa-amilasa de tipo Termamyl a partir de la cual se deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede ser cualquiera de esas alfa-amilasas de tipo Termamyl mencionadas en la presente descripción.

En una modalidad, la alfa-amilasa de tipo Termamyl parental es una alfa-amilasa de tipo Termamyl híbrida idéntica a la alfa-amilasa de Baci-llus licheniformis indicada en la SEQ ID NO: 20, excepto que los 35 residuos de aminoácidos N-terminal (de la proteína madura) se reemplazan por los 33 residuos de aminoácidos N-terminal de la proteína madura de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens indicada en la SEQ ID NO: 14; ese híbrido puede tener, además, las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (con el uso de la numeración en la SEQ ID NO: 6) mencionada como LE174. En otra modalidad LE174 compren-de, además, las mutaciones G48A, T49I, G107A, 1201 F mencionadas como LE399. En una modalidad, el genitor es la SEQ ID NO: 16 con las mutaciones 1181 * + G182* + N195F.

En un aspecto preferido de la invención, la alfa-amilasa parental es una alfa-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 18, 20, 22, 24 o 26 de la presente descripción. En otro aspecto preferido, la alfa-amilasa parental es una alfa-amilasa que ex-hibe 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, pre-ferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, especialmente, preferentemente, al menos 91 %, especialmente, preferentemente, al menos 92 %, especialmente, preferentemente, al menos 93 %, especialmente, preferentemente, al menos 94 %, especialmente, con mayor preferencia, al menos 95 % de homología, con ma-yor preferencia, al menos 96 %, con mayor preferencia, al menos 97 %, con mayor preferencia, al menos 98 %, con mayor preferencia, al menos 99 % del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26.

En un aspecto, las alfa-amilasas parentales tienen una secuencia de aminoácidos que difiere (p. ej., por deleción, inserción o sustitución) en uno o varios aminoácidos, preferentemente, en diez aminoácidos, con mayor preferencia, en nueve, ocho, siete, seis, preferentemente, en cinco aminoácidos, con mayor preferencia, en cuatro aminoácidos, aún con mayor preferencia, en tres ami- noácidos, con la máxima preferencia, en dos aminoácidos y aún con la máxima preferencia en un aminoácido del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26.

La alfa-amilasa parental puede ser una alfa-amilasa que exhibe una reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo contra una alfa-amilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa parental es una amilasa en donde el anticuerpo contra la alfa-amilasa parental exhibe una afinidad o avidez para una alfa-amilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 en una técnica de ensayo competitivo, por ejemplo, ELISA o BiaCore, respectivamente, o que exhibe una afinidad o avidez comparable con la de la alfa-amilasa parental, y en donde el anticuerpo contra la alfa-amilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 exhibe en esa técnica de ensayo competitivo una afinidad o avidez para la alfa-amilasa parental comparable con la afinidad o avidez para la alfa-amilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26. En otras modalidades, la alfa-amilasa parental es una amilasa que tiene una afinidad o avidez que es al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 100 %, preferente- mente, al menos 110 %, preferentemente, al menos 120 %, especialmente, preferentemente, al menos 125 % de la afinidad o avidez de la alfa-amilasa que tiene una de las secuencias de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24 o 26.

La alfa-amilasa parental puede ser, además, una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN que se híbrida a la secuencia de ADN que codifica las alfa-amilasas especificadas anteriormente, aparentemente, de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 o 25 de la presente solicitud. Por lo tanto, una modalidad se refiere a una alfa-amilasa variante de una alfa-amilasa parental, en donde la alfa-amilasa parental: (A) se deriva de una cepa de B. licheniformis, esp. Bacillus o KSM AP1378; (B) se selecciona del grupo que tiene las secuencias de aminoácidos tal como se indican en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22; (C) tiene una identidad de secuencias con una de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 de al menos 70 %, preferentemente, al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 90 %, aún con mayor preferencia, al menos 95 %, aún con mayor preferencia, al menos 97 % y aún con mayor preferencia, al menos 99 % o (D) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que se híbrida en condiciones de rigurosidad baja, preferentemen- te, media, preferentemente alta, con la secuencia de ácido nucleico de una de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 o 25.

En un aspecto, el polipeptido parental que tiene actividad amilolí-tica mejorada es (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad con el polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad al menos bajas con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23 o 25; (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23 o 25, o (¡ii) una cadena complementaria de longitud completa de (i) o (ii); o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60 % de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 o 25.

Cuando se hace referencia a una variante específica de una alfa-amílasa parental, en una forma convencional, con referencia a la modificación (p. ej., deleción o sustitución) de residuos de aminoácidos específicos en la secuen-cía de aminoácidos de una alfa-amilasa específica, debe entenderse que comprende las variantes de otra alfa-amilasa modificada en la o las posiciones equivalentes (según se determina a partir del mejor alineamiento posible de secuencias de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos respectivas).

En un aspecto particular de la invención, la alfa-amilasa paren-tai es una variante de una alfa-amilasa de origen natural (silvestre) preparada por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la alfa-amilasa parental puede ser una variante de una alfa-amilasa de origen natural que se modificó o alteró en la secuencia de aminoácidos.

La alfa-amilasa parental puede ser una alfa-amilasa parental prácticamente homologa que puede, tener una o más (varias) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Preferentemente, estos cambios son menores, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras tal como se describe más abajo y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegado tridimensional o la actividad de la proteína o polipéptido; deleciones menores, típicamente, de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxi terminal menores, tal como un residuo de metionina amino terminal, un péptido enlazante pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos o una extensión pequeña que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad), tal como una sección de polihistidina, o proteína A (Nilsson y col., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson y col., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. Ver, además, generalmente, Ford y col., 1991 , Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Si bien los cambios descritos anteriormente son, preferentemen-te, cambios menores, dichos cambios pueden ser, además, sustanciales, tal como la fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más como extensiones amino o carboxi terminales.

Cuando se hace referencia a una variante específica de una alfa-amilasa parental (variante de la invención), en una forma convencional, como referencia a la modificación (p. ej., deleción o sustitución) de residuos de aminoácidos específicos en la secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa es-pecífica parental, debe entenderse que comprende las variantes de otra alfa-amilasa parental modificada en la o las posiciones equivalentes (según se determina a partir del mejor alineamiento posible de secuencias de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos respectivas).

Homología (identidad de secuencias) La homología se puede determinar como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina con el uso del algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implemento en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y col., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente, la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización de interrupción de 10, penalización de extensión de interrupción de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (EMBOSS versión de BLO-SUM62). El resultado de Needle, denominado "identidad más larga" (obtenida por medio de la opción nobrief (extendida)) se usa como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Cantidad total de espacios en el alineamiento) Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina con el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implemento en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y col., 2000, supra), preferentemente, la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización de interrupción de 10, penalización de extensión de interrupción de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle, denominado "identidad más larga" (obtenida por medio de la opción nobrief (extendida)) se usa como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(longitud del alineamiento - cantidad total de espacios en el alineamiento).

La homología o identidad de secuencia se puede determinar, además, como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la industria, tal como GAP provisto en el paquete de pro- gramas GCG. Por lo tanto, Gap GCGv8 puede usarse con la matriz de puntuación predeterminada para la identidad y los siguientes parámetros predeterminados: penalización de creación de interrupción de 5.0 y penalización de extensión de interrupción de 0.3, respectivamente, para la comparación de secuencias de ácido nucleico y penalización de creación de interrupción de 3.0 y penalización de extensión de interrupción de 0.1 , respectivamente, para la comparación de secuencias de proteínas. GAP usa el método de Ne-edleman y Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48, págs. 443-453 para hacer alineamientos y para calcular la identidad.

Para identificar posiciones equivalentes/correspondientes entre otras alfa-amilasas, puede usarse un alineamiento estructural, por ejemplo, entre Termamyl y una alfa-amilasa. Un método para obtener ese alineamiento estructural consiste en usar el programa Pile Up del paquete GCG con valores predeterminados de penalizaciones de interrupción, es decir, una penalización de creación de interrupción de 3.0 y una penalización de extensión de interrupción de 0.1. Otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis de grupos hidrófobos (Gaboriaud y col., (1987), FEBS LETTERS 224, págs. 149-155) y reconocimiento del plegamiento inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, núm. 1 , págs. 142-149 (1998). Las propiedades de las alfa-amilasas, es decir, la reactividad inmunológica cruzada, se pueden ensayar con un anticuerpo contra o reactivo con al menos un epítopo de la alfa-amilasa de tipo Termamyl relevante. El anticuerpo que puede ser monoclonal o policlonal se puede producir por métodos conocidos en la industria, por ejemplo, tal como describen Hudson y col., Practical Immunology, tercera edición (1989), Black-well Scientific Publications. La reactividad inmunológica cruzada se puede determinar con ensayos conocidos en la industria; los ejemplos de estos son el ensayo de transferencia (de tipo) Western o inmunodifusión radial, por ejemplo, tal como describen Hudson y col., 1989.

Hibridación En un aspecto, el polipéptido parental que tiene actividad amilolíti-ca está codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad muy bajas, preferentemente, condiciones de rigurosidad baja, con ma-yor preferencia, condiciones de rigurosidad media, con mayor preferencia, condiciones de rigurosidad media-alta, aún con mayor preferencia, condiciones de rigurosidad alta y, con la máxima preferencia, condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 o 25; (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 , (¡ii) una subsecuencia de (i) o (ii) o (iv) una cadena complementaria de longitud total de (i), (ii) o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.° edición, Cold Spring Harbor, New York). La subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptidico que tiene actividad amilolítica. En un aspecto, la cadena complementaria es la cadena complementaria de longitud total de la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 o 25.

Una sonda de oligonucleótidos usada en la caracterización de la alfa-amilasa de conformidad con la propiedad deseada que puede ser la actividad de la alfa-amilasa puede prepararse adecuadamente sobre la base de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos total o parcial de la alfa-amilasa en cuestión.

Las condiciones adecuadas para probar la hibridación implican remojar previamente en SSC 5x(citrato de sodio estándar, SSC 1 x corresponde a 0.1650 M NaCI) e hibridar previamente durante 1 hora a -40 °C en una solución de formamida al 20 %, solución Denhardt 5x, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8 y 50 mg de ADN de timo de ternero sonicado desnaturalizado seguido de la hibridación en la misma solución suplementada con ATP (trifosfato de adenosina) 100 mM durante 18 horas a -40 °C, seguido de un tres lavados del filtro en SSC 2x, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0.2 % a 40 °C durante 30 minutos (rigurosidad baja), preferentemente, a 50 °C (rigurosidad media), con mayor preferencia, a 65 °C (rigurosidad alta), aún con mayor preferencia, a -75 °C (rigurosidad muy alta). Más detalles sobre el método de hibridación pueden encontrarse en Sambrook y col., Molecular Cloning: A La-boratory Manual, 2.° edición, Cold Spring Harbor, 1989.

En el contexto de la presente invención, "derivado de" está pre-visto para indicar una alfa-amilasa producida o que se puede producir por medio de una cepa del organismo en cuestión, pero, además, una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esa cepa y producida en un organismo huésped transformado con esa secuencia de ADN. Por último, el término está previsto para indicar una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc que tiene las características de identificación de la alfa-amilasa en cuestión. El término está previsto, además, para indicar que la alfa-amilasa parental puede ser una variante de una alfa-amilasa de origen natural, es decir, una variante que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, deleción) de uno o más residuos de aminoácidos de la alfa-amilasa de origen natural.

Métodos para preparar variantes de alfa-amilasa En la industria se conocen varios métodos para introducir muta-ciones en los genes. Después de una tratar brevemente las secuencias de ADN que codifican alfa-amilasa, se considerarán los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia codificante de alfa-amilasa.

Clonación de una alfa-amilasa codificante de la secuencia de ADN La secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa parental se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que produce la alfa-amilasa en cuestión por medio de varios métodos muy conocidos en la industria. Primero debería construirse una genoteca de ADN genómico y/o ADNc con ADN cromosómico o ARN mensajero a partir del organismo que produce la alfa-amilasa que se analizará. Después, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos homologas marcadas y se pueden usar para identificar clones que codifican la alfa-amilasa a partir de una genoteca genómica preparada del organismo en cuestión. Alter- nativamente, podría usarse una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homologas a un gen de alfa-amilasa conocido como una sonda para identificar clones que codifican alfa-amilasa en condiciones de hibridación y lavado de rigurosidad más baja.

Aún otro método para identificar clones que codifican la alfa-amilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genomico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar las bacterias alfa-amilasa negativas con la genoteca de ADN genomico resultante y, después, colocar las bacterias transformadas sobre placas de agar que contienen un sustrato pa-ra la alfa-amilasa y, de ese modo, permitir la identificación de clones que expresan la alfa-amilasa.

Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede prepararse sintéticamente por medio de métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosforoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Ca-ruthers, ( 981) Tetrahedron Letters 22: 1859 o el método descrito por Matthes y col. (1984), EMBO J. 3 801-805. En el método de fosforoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, hibridan, ligan y clonan en vectores apropiados.

Por último, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto, ge-nómico y sintético, de origen mixto, sintético y de ADNc, o de origen mixto, genomico y de ADNc, preparado por fragmentos de ligación de origen sintético, genomico o ADNc (según corresponda, los fragmentos corresponden a varias partes de la secuencia de ADN completa), de conformidad con técnicas están- dar. La secuencia de ADN puede prepararse, además, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE. UU. núm. 4,683,202 o en R.K. Saiki y col. (1988), Science Vol. 239 núm. 4839 págs. 487-491.

Mutaqénesis dirigida al sitio Una vez que se aisló una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa y que se identificaron los sitios deseables para la mutación pueden introducirse mutaciones con oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes se insertan durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, una interrupción de una sola cadena de ADN que une la secuencia codificante de alfa-amilasa se crea en un vector que porta el gen de alfa-amilasa. Después, el nucleótido sintético que comprende la mutación deseada se hibrida a una porción homologa del ADN monocatenario. La interrupción restante se rellena con ADN-polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo se liga con ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morí-naga y col. 1984 Biotechnology 2, págs. 636-639. La patente de los EE. UU. núm. 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante alteraciones menores en el cásete. Sin embargo, el método de Morinaga puede usarse para introducir una variedad aún mayor de mutaciones en cualquier momento ya que se puede introducir una multitud de oligonucleótidos de diversas longitudes.

Otro método para introducir mutaciones en las secuencias de ADN que codifican alfa-amilasa se describen en Nelson y Long (1989). Este método consiste en generar en 3 etapas un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida mediante el uso de una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los iniciadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado por PCR se puede aislar un fragmento de ADN que contiene la mutación mediante la escisión con endonucleasas de restricción y la reinserción en un plásmido de expresión.

Mutaqénesis aleatoria La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente como una mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región en al menos tres partes del gen que se traduce a la secuencia de aminoácidos ilustrada en cuestión o dentro del gen completo.

La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa parental se puede realizar convenientemente mediante el uso de cualquier método conocido en la industria.

Con respecto a lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una alfa-amilasa parental, por ejemplo, en donde la variante exhibe una afinidad por el almidón alterada con respecto al genitor; el método comprende: (a) exponer una secuencia de ADN que codifica la alfa-amilasa parental a mutagénesis aleatoria, (b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la etapa (a) en una célula huésped, y (c) analizar para detectar células huésped que expresan una variante de alfa-amilasa que tiene una afinidad por el almidón alterada con respecto a la alfa-amilasa parental.

La etapa (a) del método anterior de la invención se realiza, preferentemente, con iniciadores dopados. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede realizar mediante el uso de un agente de mutagenización físico o químico adecuado, un oligonucleótido adecuado o por la exposición de la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede realizarse mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes de mutagenización. El agente de mutagenización puede ser, por ejemplo, un agente que induce transiciones, transversiones, inversiones, mezclado, deleciones, y/o inserciones.

Los ejemplos de un agente de mutagenización físico o químico adecuado para el propósito de la presente incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilami-na, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos de nucleótidos. Cuando se usan esos agentes, la mutagénesis se rea-liza, típicamente, mediante la incubación de la secuencia de ADN que codifica la enzima parental que se mutagenizará en presencia del agente de mutagenización elegido en condiciones adecuadas para que se produzca la mutagénesis y la selección del ADN mutado que tiene las propiedades deseadas. Cuando se realiza la mutagénesis mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido se puede dopar o cargar con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que se modificarán. El dopaje o carga se puede realizar de manera que se eviten los codones para los aminoáci-dos indeseados. El oligonucleótido dopado o cargado puede incorporarse en el ADN que codifica la enzima alfa-amilasa por cualquier técnica conocida, por ejemplo, por PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa que se considere apropiada. Preferentemente, para el dopaje se usa "dopaje aleatorio constante" en el cual se predefine el porcentaje de tipo silvestre y mutación en cada posi-ción. Además, el dopaje puede estar dirigido a la introducción preferida de ciertos nucleótidos y, de ese modo, a la introducción preferida de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje se puede realizar, por ejemplo, para permitir la introducción de 90 % del tipo silvestre y 10 % de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional para elegir un esquema de dopaje, se basa en la genética como también las limitaciones estructurales de la protei-na. El esquema de dopaje se puede realizar mediante el uso del programa DO-PE que, entre otras cosas, asegura que se evite la introducción de codones de terminación. Cuando se usa mutagénesis generada por PCR un gen tratado químicamente o no tratado que codifica una alfa-amilasa parental se expone a PCR en condiciones que aumentan la incorporación incorrecta de nucleótidos (Deshler 1992, Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 9(4), págs. 103-106; Leung y col., 1989 Technique, vol. 1 , págs. 1 1-15). A mutator strain of E. coli (Fowler y col., 1974, Molec. Gen. Genet., 133, págs. 179-191 ), S. cerevi- seae o cualquier otro organismo microbiano que puede usarse para la mutagé-nesis aleatoria del ADN que codifica la alfa-amilasa, por ejemplo, mediante la transformación de un plásmido que contiene la glicosidasa parental en la cepa mutadora, el crecimiento de la cepa mutadora con el plásmido y el aislamiento del plásmido mutado a partir de la cepa muíante. El plásmido mutado se puede transformar, posteriormente, en el organismo de expresión. La secuencia de ADN que se mutagenizará puede estar convenientemente presente en una ge-noteca de ADNc o genómica preparada a partir de un organismo que expresa la alfa-amilasa parental. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar pre-senté en un vector adecuado, tal como un plásmido o un bacteriófago que, como tal, puede incubarse con o de cualquier otra forma exponerse al agente de mutagenización. El ADN que se mutagenizará puede estar presente, además, en una célula huésped ya sea mediante la integración en el genoma de esa célula o por estar presente en un vector alojado en la célula. Por último, el ADN que se mutagenizará puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que se expondrá a mutagénesis aleatoria es, preferentemente, una secuencia de ADN genómico o ADNc. En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la etapa b) de expresión o la etapa c) de análisis. Dicha amplificación puede realizarse de con-formidad con métodos conocidos en la industria; el método preferido en la presente descripción es una amplificación generada por PCR con iniciadores de oligónucleótidos preparados sobre la base de la secuencia de ADN o aminoácidos de la enzima parental. Después de la incubación con el agente de mutage- nización o la exposición a este agente, el ADN mutado se expresa mediante el cultivo de una célula huésped adecuada que contiene la secuencia de ADN en condiciones que permiten que se realice la expresión. La célula huésped usada para este propósito puede ser una célula que se transformó con la secuencia de ADN mutada, opcionaimente presente en un vector o una célula contenida en la secuencia de ADN que codifica la enzima parental durante el tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos de células huésped adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas, tales como Bacillus subtílis, Bacillus licheniformis, Ba-cillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lau-tus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Strep-tomyces murínus; y bacterias gram negativas, tal como E. coli. La secuencia de ADN mutada puede comprender, además, una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria puede localizarse favorablemente en una parte de la alfa-amilasa parental en cuestión. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, cuando ciertas regiones de la enzima se han identificado como de importancia especial para una propiedad determinada de la enzima y, cuando se modifican, se espera que produzcan una variante con propiedades mejoradas. Dichas regiones pueden identificarse, normalmente, cuando se conoce la estructura terciaria de la enzima parental y se ha relacionado con la función de la enzima.

La mutagénesis aleatoria localizada o específica de una región se realiza convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generada por PCR tal como se describió anteriormente o por cualquier otra técnica adecuada conocida en la industria. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que se modificará puede aislarse, por ejemplo, mediante la inserción en un vector adecuado, y esa parte puede exponerse, posteriormente, a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis considerados anteriormente.

Métodos alternativos para proveer variantes de alfa-amilasa Los métodos alternativos para proveer variantes de la invención incluyen el método de reordenamiento de genes conocido en la industria que incluye los métodos descrito, por ejemplo, en la patente núm. WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y patente núm. WO 96/00343 (de Novo Nor-disk A/S).

Expresión de variantes de alfa-amilasa De conformidad con la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos descritos anteriormente o por cualquier método alternativo conocido en la industria puede expresarse en forma de enzima con un vector de expresión que, típicamente, incluye se-cuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ri-bosoma, señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

El vector de expresión recombinante que contiene la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que, convenientemente, puede exponerse a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá, frecuentemente, de la célula huésped en la cual se introducirá. Por lo tanto, el vector puede ser un vector que se replica de manera autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica cuya replicación es independiente de la re-plicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Altérnativamente, el vector puede ser un vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el o los cromosomas en el o en los cuales se integró.

En el vector, la secuencia de ADN debería estar conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad de transcripción en la célula huésped elegida y puede derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heteró-logas a la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en una célula bacteriana, son el promotor del ope-rón lac de E. coli, los promotores dagA de los genes de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearother-rnophilus {amyM), los promotores de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefa- ciens {amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son los derivados del gen que codifica la amilasa de A. oryzae TAKA, la proteina-sa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de A. niger, la alfa-amilasa estable del ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.

El vector de expresión de la invención puede comprender, además, un terminador de transcripción adecuado y, en las eucariotas, secuencias de poliadenilación conectadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica la variante de alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor.

El vector puede comprender, además, una secuencia de ADN que permite la replicación del vector en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plás-midos pUC19, pACYC177, pUB1 10, pE194, pAMB1 y plJ702.

El vector puede comprender, además, un marcador selecciona-ble, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped tal como los genes dal de ß. subtilis o B. licheniformis o uno que confiere resistencia a antibióticos, tal como resistencia a la ampicilina, ca-namicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que origina la resistencia a la higromicina o la selección puede obtenerse mediante cotransformación, por ejemplo, tal como se describe en la patente núm. WO 91/17243.

Mientras que en ciertos aspectos la expresión intracelular pue-de ser ventajosa, por ejemplo, cuando se usan ciertas bacterias como células huésped, generalmente, se prefiere que la expresión sea extracelular. Generalmente, las alfa-amilasas de Bacillus mencionadas en la presente descripción comprenden una región previa que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta región previa puede reemplazarse por una región previa o secuencia señal diferente que se obtiene convenientemente mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las regiones previas respectivas.

Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación son muy conocidos para las personas experimentadas en la industria (comparar, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

Una célula, que comprende un constructo de ADN o un vector de expresión, tal como se definió anteriormente, se usa favorablemente como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa para usar en la invención. La célula puede transformarse con el constructo de ADN de la presente descripción que codifica la variante mediante la integración conveniente del constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Generalmente, se considera que esta integración es una ventaja ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga establemente en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede realizarse de conformidad con métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula se puede transformar con un vector de expresión tal como se describió anteriormente con respecto a los distintos tipos de células huésped.

La célula puede ser una célula de un organismo mayor tal como un mamífero o un insecto, pero, preferentemente, es una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana o fúngica (que incluye levadura).

Los ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram positivas, tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Ba-cillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus o bacterias gram negativas tal como E. coli. La transformación de las bacterias puede realizarse, por ejemplo, mediante transformación de protoplastos o con el uso de células competentes en una forma conocida.

El organismo de levadura puede seleccionarse, favorablemente, a partir de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. Favorablemente, el hongo filamentoso puede pertenecer a una especie de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus ory- zae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden transformarse por un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular en una forma conocida. Un procedimiento adecuado para transformar células huésped de Aspergillus se describe en la patente núm. EP 238 023.

Un método adecuado para producir una variante de alfa-amilasa para usar en la invención comprende el cultivo de una célula huésped tal como se describió anteriormente en condiciones que conducen a la producción de la variante y la recuperación de la variante a partir de las célu-las y/o el medio de cultivo.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para generar el crecimiento de la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de alfa-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden pre-pararse de conformidad con recetas publicadas (p. ej., tal como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).

La variante de alfa-amilasa secretada de las células huésped puede recuperarse convenientemente a partir del medio de cultivo por procedimientos muy conocidos que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración y precipitar los componentes proteicos del medio con el uso de una sal tal como sulfato de amonio, seguido de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad o lo similar.

Convenciones para la designación de variantes Con el sistema de numeración que se origina de la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa descrita en la SEQ ID NO: 6 alineada con la secuencia de aminoácidos de otras alfa-amilasas se puede indicar la posi-ción de un residuo de aminoácido en una alfa-amilasa en regiones de homo-logia estructural.

Cuando se describen las diversas variantes de alfa-amilasa de la presente invención, la nomenclatura descrita más abajo se adapta para facilitar la referencia. En todos los casos, se usa la letra única de IUPAC aceptada o la abreviatura de tres letras del nombre del aminoácido.

En la presente descripción y reivindicaciones se usan los códigos convencionales de una letra y tres letras para residuos de aminoácidos. Para facilitar la referencia, las variantes de alfa-amilasa de la invención se describen mediante la siguiente nomenclatura: Aminoácido(s) original(es): posición(es): aminoácido(s) sustituido(s) De conformidad con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de alanina por asparagina en la posición 30 se muestra como: Ala30Asn o A30N una deleción de alanina en la misma posición se muestra como: Ala30* o A30* y la inserción de un residuo de aminoácido adicional después de la posición 30, tal como lisina, se muestra como: Ala30AlaLys o A30AK Una deleción de un tramo consecutivo de residuos de aminoácidos, tal como los residuos de aminoácidos 30-33 se indica como (30-33)* o ?(?30-?33). La deleción de un solo residuo de aminoácido puede describirse simplemente como 30*.

Cuando una alfa-amilasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras alfa-amilasas y se hace una inserción en esa posición, esto se indica como: *36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.

Las mutaciones múltiples se pueden separar por signos de más o con un espacio, es decir: Ala30Asn + Glu34Ser o A30N+E34S Ala30Asn Glu34Ser o A30N E34S que representan mutaciones en las posiciones 30 y 34 por la sustitución de alanina y ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente.

Alternativamente, mutaciones múltiples se pueden separar por comas o punto y coma, es decir: Ala30Asn, Glu34Ser o A30N, E34S Varias mutaciones aún más simplificadas pueden separarse por un espacio, por ejemplo, Ala30Asn Glu34Ser o A30N E34S Alternativamente, las mutaciones múltiples se pueden separar por comas o punto y coma.

Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden insertarse en una posición determinada, esto se indica como A30N,E o A30N o A30E Alternativamente, uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden insertarse en una posición determinada y esto se indica como: A30 [N, E] o A30 [N E], alternativamente, A30 {N, E} o A30 {N E} Para simplificar, el aminoácido alternativo que podría sustituirse en una posición determinada puede indicarse como: 5 A30 N, E, H, L o V Además, cuando una posición adecuada para modificación se identifica en la presente descripción sin que se sugiera alguna modificación específica, se entenderá que cualquier residuo de aminoácido puede sustituirl o se por el residuo de aminoácido presente en la posición. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, se entenderá que la alanina puede eliminarse o sustituirse por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de: 15 R,N,DAC,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

Además, "A30X" significa cualquiera de las siguientes sustituciones: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y o A30 V; o en forma resumida: n A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

O, por ejemplo, A30 [R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V] Aquel con experiencia en la industria conoce que el uso de la numeración, por ejemplo, de conformidad con la SEQ ID NO: 6, significa usar la SEQ ID NO: 6 no para demostrar que el genitor es, necesariamente, la SEQ ID NO: 6, sino simplemente que las posiciones que se alterarán se definen de conformidad con la SEQ ID NO: 6. Por lo tanto, otra forma para describir las sustituciones especificas consiste en indicar el aminoácido que se alterará con una X. Por lo tanto, X30N significa que cualquier aminoácido presente en la posición 30 podría sustituirse con N lo que indica que una al-fa-amilasa diferente puede usarse como alfa-amilasa parental.

Por lo tanto, la nomenclatura "X30N" o "X30V" significa que cualquier aminoácido que podría estar en la posición 30 en la alfa-amilasa parental se sustituye por una asparagina o una valina.

Características de los residuos de aminoácidos Aminoácidos cargados: Asp, Glu, Arg, Lys, His Aminoácidos de carga negativa (con el residuo de mayor neqatividad): Asp, Glu Aminoácidos de carga positiva (con el residuo de mayor positividad primero): Arg, Lys, His Aminoácidos neutros: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Residuos de aminoácidos hidrófobos (con el residuo de mayor hidrofo- bicidad último): Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp, Aminoácidos hidrófilos (con el residuo de mayor hidrofilicidad último): Thr, Ser, Cys, Gln, Asn Esta nomenclatura es particularmente relevante para las modificaciones que implican sustituir, insertar o eliminar residuos de aminoácidos que tienen propiedades comunes específicas. Dichas modificaciones se mencionan como modificación(es) de aminoácidos conservadora(s). Los ejemplos de modificaciones conservadoras se encuentran dentro del grupo de aminoá- cidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acidicos (ácido glutá-mico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las modificaciones de aminoácidos que, generalmente, no alteran la actividad específica son conocidas en la industria y se describen, por ejemplo, en H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Aca-demic Press, New York. Los intercambios que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly además de los inversos (Taylor, 1986, Journal of Theoretical Biology 1 19: 205-218.

Variantes útiles en la invención Las variantes preferidas comprenden la o las alteraciones en uno o más o en uno o varios residuos de aminoácidos en la región 193 a 213 de la alfa-amilasa parental. En una modalidad particularmente preferida, la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y, además, una alteración en uno o más o uno o varios residuos de aminoácidos en la región 193 a 213, en donde la numeración corresponde al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6, es decir, con la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. Los inventores han encontrado que dichas alteraciones proveen variantes que tienen una mayor estabilidad en composiciones que comprenden un agente quelante, particularmente cuando los agentes quelantes son capaces de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9.0 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8.0 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7.0 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6.0 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5.0 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4.0 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3.0 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2.0 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1.0 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe más abajo en "Materiales y métodos".

Un primer aspecto de la invención se refiere a una composición de limpieza que comprende una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones en el intervalo de 193 a 213 con la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6 y, opcionalmente, comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, y un adicional de limpieza.

Un segundo aspecto provee una composición que comprende una vanante de una alfa-amilasa parental, en donde la alfa-amilasa variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 y 22 y, comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6 y, opcionalmente, comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0; y un adicional de limpieza.

Otro aspecto provee una composición de limpieza que comprende una variante que comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6), en donde esa composición comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM puede reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

Otro aspecto provee una composición de limpieza que comprende una variante que comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6) y en donde la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, preferentemente, la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO.22 y en donde esa composición comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0; y un adicional de limpieza.

Un tercer aspecto se refiere a una composición de limpieza, en donde el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM a 21 °C y pH 8.0.

Un cuarto aspecto se refiere a una composición de limpieza, en donde el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide en el ensayo descrito en "Materiales y métodos".

Por lo tanto, en un aspecto preferido de la invención la variante comprende al menos una sustitución en una o más posiciones en el intervalo que corresponde a las posiciones 193 a 213 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. Los términos "con el uso de la numeración de conformidad con" o "que corresponde a" se refieren al sistema de numeración usado en la presente solicitud y las dos expresiones se usan indistintamente en la solicitud. Por lo tanto, la posición 195 es el aminoácido que corresponde a la posición 195 en la SEQ ID NO:6. Por lo tanto, se entenderá que comprende las variantes de otras alfa-amilasas parentales modificadas en la o las posiciones equivalentes (tal como se determina a partir del alineamiento de secuencias de aminoácidos más probable entre las secuencias de aminoácidos respectivas). Cuando hay deleciones, el conteo se realiza como si no hubiera deleciones presentes.

En una modalidad particularmente preferida la composición > comprende una variante y esa variante comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6).

En una modalidad particularmente preferida la composición comprende una variante y esa variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y, además, una alteración en una o más o en una o varias posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 234 y una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235,.244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6).

En un aspecto de la presente invención la composición de limpieza comprende una variante de una alfa-amilasa parental que comprende al me-nos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y, además, comprende una sustitución en una o más o en una o varias posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemen-te, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, preferentemen-te, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, y en donde la variante tiene al menos 70 % de actividad residual, preferentemente, al menos 75 % de actividad residual, preferentemente, al menos 80 % de actividad residual, preferentemente, al menos 85 % de actividad residual, preferentemente, al menos 90 % de actividad residual, preferentemente, al menos 95 % de actividad residual, preferentemente, al menos 100 % de actividad residual, preferentemente, al menos 105 % de actividad residual, preferentemente, al menos 110 % de actividad residual o tiene una actividad residual que es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pp mayores en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa parental, cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 y 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 (ver detalles en "Material y métodos") en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe más abajo.

La composición de conformidad con la invención comprende, preferentemente, una alfa-amilasa, en donde la alfa-amilasa parental está modificada por al menos una de las siguientes sustituciones: 193 es [G,A,S,T o M]¡ la posición 195 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 197 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 198 es [Q o N]¡ la posición 200 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 203 es [F,W,Y,L,l o V]; la posición 206 es (F,W,Y,N,L,I,V o H]; la posición 210 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 212 es [F,W,Y,L,I o V] o la posición 213 es [G,A,S,T o M], en donde las posiciones corresponden a la posición del poli-péptido maduro con la SEQ ID NO: 6 y, comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos".

La composición de conformidad con la invención comprende, preferentemente, una variante de alfa-amilasa, en donde la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184, y en donde la alfa-amilasa parental está modificada, además, por al menos una de las siguientes sustituciones: 193 es [G.A.S.T o M]; la posición 195 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 197 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 198 es [Q o N]; la posición 200 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 203 es [F,W,Y,L,I o V]¡ la posición 206 es [F,W,Y,N,L,I o V, H]; la posición 210 es [F,W,Y,L,I o V]¡ la posición 212 es [F,W,Y,L,I o V] o la posición 213 es [G,A,S,T o M], en donde las posiciones corresponden a la posi-ción del polipéptido maduro con la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos".

Particularmente, la invención se refiere a una composición que comprende una alfa-amilasa, en donde la secuencia de aminoácidos está modificada por al menos una de las siguientes sustituciones: 193 es T; la posición 195 es F o Y; la posición 197 es F o L; la posición 198 es N; la posición 200 es F; la posición 203 es F; la posición 206 es F, L o Y; la posición 210 es Y; la posición 212 es V; la posición 213 es A, en donde las posiciones corresponden a la posición del polipéptido maduro con la SEQ ID NO: 6 y, comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos".

En otro aspecto, la composición comprende una variante de alfa-amilasa, en donde esa variante comprende una sustitución en dos o más o en varias posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 y, comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en la sección "Materiales y métodos".

En otro aspecto la composición comprende una variante de al-fa-amilasa, en donde la variante comprende al menos dos o más o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y com-prende, además, una sustitución en dos o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 y comprende, además, al menos un agente que- lante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos" y en donde la variante tiene al menos 70 % de actividad residual, preferentemente, al menos 75 % de actividad residual, preferentemente, al menos 80 % de actividad residual, preferentemente, al menos 85 % de actividad residual, preferentemente, al menos 90 % de actividad residual, preferentemente, al menos 95 % de actividad residual, preferentemente, al menos 100 % de actividad residual, preferentemente, al menos 105 % de actividad residual, preferentemente, al menos 110 % de actividad residual o tiene una actividad residual que es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pp mayores en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa parental, cuando se determina la actividad residual después de 18 horas a pH 8 y 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 (ver detalles en "Materiales y métodos) en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe más aba¬ jo En modalidades preferidas al menos dos deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 se seleccionan del grupo que consiste en 181*+182*; 181*+183*, 182*+ 183*; 18G+184*, 182*+184* y 183*+184*.

En otro aspecto la composición comprende una variante de al-fa-amilasa, en donde la variante comprende al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en dos o más posiciones seleccionadas del gru-po que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 y una alteración en una o más o en varias posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 1 18, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6), y comprende, además, al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos".

En un aspecto de la invención la composición comprende al menos un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz.de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0 y una o más o varias de las siguien-tes variantes de amilasa; SP722 +R181*G182* N195F; SP722+G182* D183* N195F; SP722+D183* G184* N195F; SP722+R181* G182* N195F M202L; SP722+G182 D183* N195F M202L; SP722+D183* G184* N195F M202L; SP722 + D183* G184* N195F V206L Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206Y Y243F; SP722+R181* G182* L118K N195F R458K; SP722+G182* D183* L1 18K N195F H458K; SP722+D183* G184* L1 18K N195F H458K; SP722 + D183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L AA560+R181 * G182* N195F; AA560+G182* D183* N195F; AA560+D183* G184* N195F; AA560+ D183* G184* I206Y; AA560+ D183* G184* Y243F; AA560+ D183* G184* V206L, Y243F; AA560+ D183* G184* N195F V206L; AA560+D183* G184* N195F Y243F; AA560+D183* G184* N195F V206L Y243F; AA560+D183* G184* N195F V206Y Y243F; AA560+R181 * G182* N195F M202L; AA560+G182* D183* N195F M202L; AA560+D183* G184* N195F M202L; AA560+R181 * G182* R1 18K N195F R320K R458K; AA560+G182* D183* R118K N195F R320K R458K; AA560+D183* G184* R1 18K N195F R320K R458K; AA560+D183* G184* R1 18K N195F I206L R320K R458K; AA560+D183* G184* R1 18K N195F I206Y R320K R458K; AA560+D183* G184* R118K N195F Y243F R320K R458K; AA560+D183* G184* R1 18K N195F I206L Y243F R320K R458K.

SP707+ R181* G182* N195F; SP707+ G182* H183* N195F; SP707+H183* G184* N195F; SP707+H183* G184* I206Y; SP707+H183* G184* N195F I206Y; SP707+H183* G184* N195F Y243F; SP707+ H183* G184* I206Y Y243F; SP707+ H183* G184* N195F I206L Y243F; SP707+ H183* G184* N195F I206Y Y243F; SP707+ R181 * G182* N195F M202L; SP707+ G182* H183* N195F M202L; SP707+H183* G184* N195F M202L; SP707+R181 * G182* R1 18K N195F R320K R458K; SP707+G182* H183* R1 18K N195F R320K R458K; SP707+H183* G184* R1 18K N195F R320K R458K; SP690 +R181 * G182* N195F; SP690 +G182* T183* N195F; SP690 +T183* G184* N195F; SP690+H183* G184* V206Y; SP690+H183* G184* N195F V206Y; SP690+H183* G184* N195F Y243F; SP690+ H183* G184* V206Y Y243F; SP690+ H183* G184* N195F V206L Y243F; SP690+ H183* G184* N195F V206Y Y243F; SP690 +R181 * G182* N195F M202L; SP690+G182* T183* N195F M202L; SP690 +T183* G184* N195F M202L; SP690 +R181 * G182* R118K N195F R320K R458K; SP690 +G182* T183* R1 18K N195F R320K R458K; SP690 +T183* G184* R118K N195F R320K R458K.

Otra modalidad de la invención se refiere a una composición de limpieza, en donde la actividad residual de la variante es al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 %, tal como al menos 105 %, tal como al menos 1 10 %, tal como al menos 115 % de actividad residual en comparación con la alfa-amilasa parental en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos" y cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 a 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 descritos en "Materiales y métodos".

Otra modalidad de la invención se refiere a una composición de limpieza, en donde la actividad residual de la variante es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pp mayores en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa parental en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM < o, preferentemente, menor que 1 mM es capaz de reducir la concentra-ción de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos" y cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 y a 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 descritos en "Materiales y métodos". La mejora en puntos porcentuales (pp, por sus siglas en inglés) en la actividad residual de la variante con respecto al genitor se calcula como la diferencia entre la actividad residual de la variante y la correspondiente al genitor.

Por lo tanto, en un aspecto particular de la invención la composición comprende un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en: agentes quelantes que contienen fósforo, que no contienen fósforo, que contienen carboxilato, que contienen nitrógeno o que no contienen nitrógeno; los agentes quelantes preferidos son EDTA, MGDA, EGTA, DTPA, DTPMP y HEDP y mezclas de estos.

En un aspecto preferido de la invención la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212 y 213, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En un aspecto particularmente preferido de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. En modalidades preferidas al menos dos deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 se seleccionan del grupo que consiste en 181 *+182*; 181*+183*, 182*+ 183*; 181*+184*, 182*+184* y 183*+184*.

En otro aspecto preferido de la invención la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que con-siste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y comprende, además, una sustitución en una o más o en una o varias posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 1 16, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto preferido de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 18, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 359, 418, 431 , 434, 447, 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la variante comprende una sustitución en dos o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 1 16, 1 18, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 235, 243, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434 y 447 y 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del poli-péptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones in la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en dos o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 235, 243, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447 y 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

Preferentemente, las variantes que comprenden alteraciones en una o más de las posiciones identificadas anteriormente tienen una mayor estabilidad en composiciones que comprenden un agente quelante, tal como un detergente, preferentemente, en un detergente liquido en comparación con la alfa-amilasa parental.

Por lo tanto, las variantes de conformidad con la invención tienen, en una modalidad preferida, una mayor estabilidad con respecto a su amilasa parental en presencia de uno o más agentes quelantes. En un aspecto preferido las variantes de conformidad con la invención tienen una ma-yor estabilidad con respecto a su amilasa parental en presencia de uno o más agentes quelantes y una concentración de calcio baja. En un aspecto preferido las variantes de conformidad con la invención tienen una mayor estabilidad con respecto a su amilasa parental en presencia de un agente que- lante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

En un aspecto particular la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 338, 359, 418, 431 , 434, 447 y 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 y en donde la variante tiene, además, al menos 60 %, tal como al menos 65 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 % de actividad residual en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe más abajo y cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8, a 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 descritos en "Materiales y métodos". En modalidades preferidas al menos dos deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 se seleccionan del grupo que consiste en 181*+182*; 181*+183*. 182*+ 183*; 181*+184*. 182*+184* y 183*+184*.

En otro aspecto particular la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151, 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447 y 458, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 y en donde la variante tiene, además, al menos 60 %, tal como al menos 65 % tal como al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 % de actividad residual o tiene una actividad residual que es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pp mayores en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa parental en presencia de un agente quelante, en donde ese agente que-lante a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, . preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 mM es capaz de reducir la concentra-ción de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y, métodos" y cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 en presencia de DTPA a 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 descritos en "Materiales y métodos".

Las variantes de conformidad con la invención tienen el beneficio de ser más estables frente a los agentes quelantes fuertes en relación con su alfa-amilasa parental; sin embargo, al mismo tiempo han mantenido las propiedades de desempeño de la alfa-amilasa parental, tal como el desempeño de lavado o de lavado de vajilla. En una modalidad preferida las variantes de con-formidad con la invención tienen el beneficio de ser más estables frente a los agentes quelantes, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM, a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos". Estos agentes quelantes preferidos pueden seleccionarse, pero no se limitan a, EDTA, MGDA, EGTA, DTPA, DTPMP, HEDP y mezclas de estos.

Por lo tanto, las variantes útiles en la invención tienen una mayor estabilidad en presencia de iones metálicos de unión a agentes quelantes, particularmente, iones calcio en comparación con su alfa-amilasa parental. En los detergentes es común incluir agentes quelantes debido al efecto benéfico en el proceso de lavado, pero la mayor estabilidad puede ser aparente, además, en condiciones en las cuales está presente el material vegetal que inclu-ye agentes quelantes naturales, tales como fitato o citrato. Particularmente, un agente quelante fuerte competirá con las alfa-amilasas sensibles al calcio por los iones calcio y, en cierta medida, será capaz de privar a la alfa-amilasa de los iones calcio unidos en su estructura con la consecuencia de que se reduce la estabilidad o actividad de la alfa-amilasa.

Por lo tanto, las variantes de la invención tienen una mayor estabilidad y/o actividad en presencia de agentes quelantes, tales como EDTA, MGDA, EGTA, DTPA, DTPMP, HEDP y mezclas de estos, en comparación con su alfa-amilasa parental.

Además de la mayor estabilidad frente a agentes quelantes en relación con la alfa-amilasa parental las variantes de la presente invención conservan el rendimiento de lavado o tienen un rendimiento de lavado mejorado cuando se comparan con la alfa-amilasa parental. El desempeño de la- vado mejorado puede medirse en AMSA o en una prueba de desempeño de lavado con vasos, tal como se describe en "Materiales y métodos".

Por lo tanto, en una modalidad particular de la invención la variante tiene al menos 70 % de actividad residual, preferentemente, al menos 75 % de actividad residual, preferentemente, al menos 80 % de actividad residual, preferentemente, al menos 85 % de actividad residual, preferentemente, al menos 90 % de actividad residual, preferentemente, al menos 95 % de actividad residual o tiene una actividad residual que es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pp mayores en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa parental, cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 y 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 (descritos en "Materiales y métodos") en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM puede reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0 tal como se describe más abajo y en donde la variante exhibe, además, al menos 40 %, tal como al menos 50 %, tal como al menos 55 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 65 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 % de mejora en el des-empeño de lavado en comparación con la alfa-amilasa parental cuando se mide en AMSA o en una prueba del desempeño de lavado con vasos tal como se describe en "Materiales y métodos".

En un aspecto preferido de la invención la composición comprende una variante que tiene al menos 60 %, tal como al menos 65 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 100 % de actividad residual en comparación con la alfa-amilasa parental en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM, preferentemente, menor que 9.5 mM, preferentemente, menor que 9 mM, preferentemente, menor que 8.5 mM, preferentemente, menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7.5 mM, preferentemen-te, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6.5 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferentemente, menor que 5.5 mM, preferentemente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4.5 mM, preferentemente, menor que 4 mM, preferentemente, menor que 3.5 mM, preferentemente, menor que 3 mM, preferentemente, menor que 2.5 mM, preferentemente, menor que 2 mM, preferentemente, menor que 1.5 mM o, preferentemente, menor que 1 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en el Ejemplo 2a y cuando la actividad residual se determina después de 18 horas a pH 8 y 31 °C tal como se describe en los ensayos EnzChek o PNP-G7 descritos en "Materiales y métodos".

Por lo tanto, en un aspecto particular de la invención la composición comprende un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en: agentes quelantes que contienen fósforo, que no contienen fósforo, que contie- nen nitrógeno o que no contienen nitrógeno; los agentes quelantes preferidos son EDTA, MGDA, EGTA, DTPA, DTPMP, HEDP y mezclas de estos.

En un aspecto preferido las variantes de conformidad con la invención tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al me-nos 98 %, preferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto de la presente invención, las variantes de una alfa-amilasa parental comprenden una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, prefe-rentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferente-mente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, preferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto de la presente invención las variantes de una alfa-amilasa parental comprenden al menos una, al menos dos o al menos tres de-leciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprenden, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, pre-ferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, pre-ferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto de la presente invención, la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212 213 y 243, con el uso de la numeración de con-formidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferente-mente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, preferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO:6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto de la invención la variante comprende una sustitución en una o más posiciones 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 o 243 y una sustitución en una o más posiciones 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemen-te, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, preferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 84 y comprende, además, una sustitución en una o más posiciones 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 o 243 y una sustitución en una o más posiciones 1 16, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 con el USO de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6, y en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, preferentemente, al menos 80 %, preferente-mente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 %, preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, preferentemente, al menos 91 %, preferentemente, al menos 92 %, preferentemente, al menos 93 %, preferentemente, al menos 94 %, preferentemente, al menos 95 %, preferentemente, al menos 96 %, preferentemente, al menos 97 %, preferentemente, al menos 98 %, pre-ferentemente, al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental que puede ser cualquiera de las secuencias con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto, la cantidad de sustituciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención es menor que 10 sustituciones, tal como menor que 9 sustituciones, tal como menor que 8 sustituciones, tal como menor que 7 sustituciones, tal como menor que 6 sustituciones, tal como menor que 5 sustituciones, tal como menor que 4 sustituciones, tal como menor que 3 sustituciones, tal como menor que 2 sustituciones y/o en donde la cantidad de deleciones es menor que 0 deleciones, tal como menor que 9 deleciones, tal como menor que 8 deleciones, tal como menor que 7 deleciones, tal como menor que 6 deleciones, tal como menor que 5 deleciones, tal como menor que 4 deleciones, tal como menor que 3 deleciones, tal como menor que 2 deleciones, tal como menor que 1 deleción o la variante puede no comprender deleciones y/o en donde la cantidad de inserciones es menor que 10 inserciones, tal como menor que 9 inserciones, tal como menor que 8 inserciones, tal como menor que 7 inserciones, tal como menor que 6 inserciones, tal como menor que 5 inserciones, tal como menor que 4 inserciones, tal como menor que 3 inserciones, tal como menor que 2 inserciones, tal como menor que 1 inserción o la variante puede no comprender inserciones en comparación con la alfa-amilasa parental que puede ser de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 193. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 193 con [G, A, T o M] del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad específica, la vanante comprende la sustitución S193T del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución S193T, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18, o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 195, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 195 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 195, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución N195F, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y como una sustitución en la posición 195. En otro aspecto la variante comprende la sustitución N195Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 195, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 195 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 195, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución N195F, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y como una sustitución en la posición 195. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución N195Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 197, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 197 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 197, en aún otro as-pecto preferido, la variante comprende la sustitución N197F, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende L como una sustitución en la posición 197. En otro aspec-to la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres delecio-nes en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución N197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferen-temente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 197, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 197 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 197, en aún otro aspecto preferí-do, la variante comprende la sustitución N197F, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende L como una sustitución en la posición 197. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución N197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende una sustitución en la posición 198, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 198 con [Q, N, D, E, R, K o H], en otro aspecto preferido, la variante comprende N en la posición 198, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y198N, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18, 20 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoá-cidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 198, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 198 con [Q, N, D, E, R, K o H], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 198, en aún otro aspecto preferido, la variante com- prende la sustitución Y198N, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 200, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 200 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 200, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y200F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 200, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 200 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 200, en aún otro aspecto preferido, la variante compren-de la sustitución Y200F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 203, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 203 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 203, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y203F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 203, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 203 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 203, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y203F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 206, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 206 con [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D o E], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 206, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende Y en la posición 206, en aún otro aspecto la variante comprende L en la posición 206, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En una modalidad específica, la variante comprende la sustitución V206Y del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende la sustitución I206Y del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En una modalidad específica la variante comprende la sustitución V206F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende la sustitución I206F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En una modalidad específica la variante comprende la sustitución V206L del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende la sustitución I206L del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En una modalidad específica la variante comprende la sustitu-ción V206H del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende la sustitución I206H del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En un aspecto la vanante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 206, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 206 con [F.W.Y.N.L.I.V.H.Q.D o E], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 206, en otro aspecto preferido, la variante comprende Y en la posición 206.

En una modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución V206Y del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución I206Y del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En una modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución V206L del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución I206L del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En una modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución V206H del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otra modalidad específica la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, la sustitución I206H del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10 En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 210, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 210 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende Y en la posición 210, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución H210Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 210, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 210 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende Y en la posición 210, en aún otro aspecto preferi-do, la variante comprende la sustitución H210Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 212, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 212 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende V en la posición 212, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución E212V, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 212, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 212 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende V en la posición 212, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución E212V, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 2 3, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 213 con [G, A, S, T o M], en otro aspecto preferido, la variante comprende A en la posición 213, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución V213A, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 213, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 213 con [G, A, S, T o M], en otro aspecto preferido, la variante comprende A en la posición 213, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución V213A, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en la posición 243, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 243 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende F en la posición 243, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En un aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoá-cidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en la posición 243, en un aspecto preferido la variante comprende una sustitución en la posición 243 con [F, W, Y, L, I o V], en otro aspecto preferido, la variante comprende A en la posición 243, en aún otro aspecto preferido, la variante comprende la sustitución Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 193 y 195. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posi-ciones 193 y 195 con [F, W, Y, L, I, V, N, G, A, T, M o Q]. En otro aspecto la variante comprende T y F como sustituciones en las posiciones 193 y 195, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195F del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende T y Y como sustituciones en las posiciones 193 y 195, respectiva-mente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de ami- noácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 193 y 195. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 193 y 195 con [F, W, Y, L, I, V, N, G, A, T, M o Q]. En otro aspecto la variante comprende T y F como sustituciones en las posiciones 193 y 195, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195F del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende T y Y como sustituciones en las posiciones 193 y 195, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende una sustitución en las posiciones 195 y 198 con el uso de la numeración de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 195 y 198 con [F, W, Y, L, I, V, N o Q]. En otro aspecto la variante comprende F y N como sustituciones en las posiciones 195 y 198, respectiva-mente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + Y198N, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y y N como sustituciones en las posiciones 195 y 198, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + Y198N, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una sustitución en las posiciones 195 y 198 con el uso de la numeración de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195 y 198 con [F, W, Y, L, I, V, N o Q]. En otro aspecto la variante comprende F y N como sustituciones en las posiciones 195 y 198, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la re-gión de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + Y198N, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y y N como sustituciones en las posiciones 195 y 198, respéctivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + Y198N, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende una sustitución en las posiciones 195 y 206 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 195 y 206 con [F, W, Y, V, I, L, C, N, S, T, D, E o H]. En otro aspecto la variante comprende F y L como sustituciones en las posiciones 195 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + V206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206[F, Y, L o H] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y y L como sustituciones en 195 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206 [F, Y, L, H, N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de ami-noácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 95 y 206 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195 y 206 con [F, W, Y, V, I, L, C, N, S, T, D, E o H]. En otro aspecto la variante comprende F y L como sustituciones en las posiciones 195 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206[F o Y] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12 En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + I206 [F, Y, L, H o N] del poli-péptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y y L como sustituciones en las posiciones 195 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + I206F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende sustituciones en las posiciones 195 y 210 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 195 y 210 con [F, W, Y, V, I, L, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F y Y como sustituciones en las posiciones 195 y 210, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + H210Y, en donde el genitor es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y como sustitución en las posiciones 95 y 210. En otro as-pecto la variante comprende las sustituciones N195Y + H210Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195 y 210 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195 y 210 con [F, W, Y, V, I, L, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F y Y como sustituciones en las posiciones 195 y 210, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + H210Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y como sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 195 y 210. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + H210Y, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 198 y 206 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 198 y 206 con [N, Q, L, I, F, Y, C, N, S, T, D, E o H]. En otro aspecto la variante comprende N y [F o Y] como sustituciones en las posiciones 198 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones Y198N + V206 [F, Y, L, H o N] del polipép-tido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones Y198N + I206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de ami-noácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 198 y 206 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la re- gión de aminoácidos de 181 , 182, 83 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 198 y 206 con [N, Q, L, I, F, Y, C, N, S, T, D, E o H]. En otro aspecto la variante comprende N y [F o Y] como sustituciones en las posiciones 198 y 206, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones Y198N + V206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 81, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones Y198N + I206 [F, Y, L, H o N] del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 206 y 213 con el uso de la numeración de conformidad con las SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la vanante comprende una sustitución en las posiciones 206 y 213 con [D, E, L, I, V, F, Y, W, G, A, S, T o M]. En otro aspecto la variante comprende [F o Y] y A como sustituciones en las posiciones 206 y 210, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V206F o Y+V213A del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones I206 [F, Y, L, H o N] + V213A del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 206 y 213 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 206 y 213 con [D, E, L, I, V, F, Y, W, G, A, S, T o M]. En otro aspecto la variante comprende [F o Y] y A como sustituciones en las posiciones 206 y 210, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones V206 [F, Y, L, H o N], V213A del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones I206 [F, Y, L, H o N] + V213A del polipép-tido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 195 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 195 y 243 con [F, W, Y, L, I o V]. En otro aspecto la va-ríante comprende F como sustituciones en las posiciones 195 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y y F como sustituciones en las posiciones 195 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la vanante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 195 y 243. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de-leciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195 y 243 con [F, W, Y, L, I o V]. En otro aspecto la variante comprende F como sustituciones en las posiciones 195 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende Y y F como sustituciones en las posiciones 195 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 82, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + Y243F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 206 y 243 con [H, D, E, N, F, W, Y, L, I o V. En otro aspecto la variante comprende L y F como sustituciones en las posiciones 206 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V206 [F, Y, L, H o N] + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO. 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V206 [F, Y, L, H o N] + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 206 y 243 con [H, D, E, N, F, W, Y, L, I o V]. En otro aspecto la variante comprende L y F como sustituciones en las posiciones 206 y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones V206 [F, Y, L, H o N] + Y243F del polipéptido madu- ro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones V206 [F, Y, L, H o N] + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende una sustitución en las posiciones 193, 195, y 197 con [F, W, Y, L, I o V]. En otro aspecto la variante comprende T y F como sustituciones en las po-siciones que corresponden a las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195F + N197F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, F y L como sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195F + N 197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, Y y F como sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195Y + N197F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los poli-péptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, Y y L como sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S193T + N195Y + N197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 18 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la va-ríante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197 con [F, W, Y, L, I o V]. En otro aspecto la variante comprende T y F como sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195F + N197F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO. 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, F y L como sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195F + N197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, Y y F como sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195Y + N197F, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO:6, 8, 10 o 12. En otro aspecto la variante comprende T, Y y L como sustituciones en las posiciones 193, 195, y 197, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones S193T + N195Y + N197L, en donde la alfa-amilasa parental es cualquiera de los polipéptidos maduros con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 22, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10 o 12.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, Y y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante com-prende las sustituciones N195F + V206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, Y y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206Y+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, L y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + V206L + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206L + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, L y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206L + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206L+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental compren-de sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, N y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante com-prende las sustituciones N195F + V206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, N y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206N+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, H y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante com- prende las sustituciones N195F + V206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, H y F como sustituciones en las posicio-nes 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206H+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental cómprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, F y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante com-prende las sustituciones N195F + V206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195F + I206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, F y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + V206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N195Y + I206F+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243, con el uso de la numeración de conformi-dad con la SEQ ID NO. 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, Y y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + I206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, Y y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206Y + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de ami- noácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N 195Y + I206Y+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243, con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, L y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206L + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + I206L+ Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, L y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206L + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + I206L + Y243F del polipép-tido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243, con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, N y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184 y compren-de, además, las sustituciones N195F + I206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO. 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, N y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206N + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de ami-noácidos de 181, 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + I206N+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243, con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 81 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, H y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + I206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO. 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, H y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206H + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + I206H+Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En otro aspecto la variante de una alfa-amilasa parental com-prende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243, con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243 con [D, E, L, I, F, V, Y, C, N, S, T o H]. En otro aspecto la variante comprende F, F y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195F + V206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las susti- tuciones N195F + I206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10. En otro aspecto la variante comprende Y, F y F como sustituciones en las posiciones 195, 206, y 243, respectivamente. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la re-gión de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + V206F + Y243F del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6 o 12. En otro aspecto la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, las sustituciones N195Y + I206F + Y243F del polipép-tido maduro de las SEQ ID NO: 8 o 10.

En un aspecto de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y una o más de las siguientes sustituciones N195 [F o Y], N197 [F o L], Y198N, Y200F, Y203F, I206 [H,L,N,F o Y], H210Y, E212 [V o G], V213A y una sustitución en una o más posiciones M116T, Q129L, G133E, E134Y, K142R, P146S, G147E, G149R, N151 R, Y152H, Q169E, N174R, A186R, Y243F, S244Q, G303V, R320N, R359I, N418D, A447V de la secuencia del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferente-mente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 % preferentemente, al menos 85 %, preferen- temente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, especialmente, preferentemente, al menos 91 %, especialmente, preferentemente, al menos 92 %, especialmente, preferen-temente, al menos 93 %, especialmente, preferentemente, al menos 94 %, aún especialmente, más preferentemente, al menos 95 % de homología, con mayor preferencia, al menos 96 %, con mayor preferencia, al menos 97 %, con mayor preferencia, al menos 98 %, con mayor preferencia, al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y una o más de las siguientes sustituciones N195 [F o Y], N197 [F o L], Y198N, Y200F, Y203F, I206 [F, Y, L, H o N], H210Y, E212 [V o G], V2 3A o Y243F y una sustitución en una o más posiciones M116T, Q129L, G133E, E134Y, P146S, G147E, G149R, T151 R, Y152H, Q169E, N174R, G186R, S244Q, G303V, R320N, R359I, N418D, A447V de la secuencia del polipéptído maduro de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 % preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, especialmente, preferentemente, al menos 91 %, especialmente, preferentemente, al menos 92 %, especialmente, preferentemente, al menos 93 %, especialmente, preferentemente, al menos 94 %, más especialmente, con mayor preferencia, al menos 95 % de homología, con mayor preferencia, al menos 96 %, con mayor preferencia, al menos 97 %, con mayor preferencia, al menos 98 %, con mayor preferencia, al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

En un aspecto de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y una o más de las siguientes sustituciones N195 [F o Y], N197 [F o L], Y198N, Y200F, Y203F, V206 [F, Y, L, H o N], H210Y, E212 [V o G], V213A o Y243F y una sustitución en una o más posiciones I1 16T, Q129L, G133E, E134Y, K142R, P146S, G147E, G149R, N151 R, Y152H, Q169E, Q174R, A186R, S244Q, G303V, K320N, R359I, N418D, A447V de la secuencia del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 % preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, especialmente, preferentemente, al menos 91 %, especialmente, preferentemente, al menos 92 %, especialmente, preferentemente, al menos 93 %, especialmente, preferentemente, al menos 94 %, más especialmente, con mayor preferencia, al menos 95 % de homo-logia, con mayor preferencia, al menos 96 %, con mayor preferencia, al menos 97 %, con mayor preferencia, al menos 98 %, con mayor preferencia, al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En un aspecto de la invención la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y una o más de las siguientes sustituciones N195 [F o Y], N197 [F o L], Y198N, Y200F, Y203F, V206 [F, Y, L, H O N], H210Y, E212 [V o G], V213A o Y243F y una sustitución en una o más posiciones I 116T, Q129L, G133E, E134Y, K142R, P146S, G147E, G149R, N151 R, Y152H, Q169E, Q174R, A186R, S244Q, G303V, K320N, R359I, N418D, A447V de la secuencia del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente, al menos 65 %, preferentemente, al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 % preferentemente, al menos 80 %, preferentemente, al menos 81 %, preferentemente, al menos 82 %, preferentemente, al menos 83 %, preferentemente, al menos 84 % preferentemente, al menos 85 %, preferentemente, al menos 86 %, preferentemente, al menos 87 %, preferentemente, al menos 88 %, preferentemente, al menos 89 %, especialmente, preferentemente, al menos 90 %, especialmente, preferentemen- te, al menos 91 %, especialmente, preferentemente, al menos 92 %, especialmente, preferentemente, al menos 93 %, especialmente, preferentemente, al menos 94 %, más especialmente, con mayor preferencia, al menos 95 % de homología, con mayor preferencia, al menos 96 %, con mayor preferencia, al menos 97 %, con mayor preferencia, al menos 98 %, con mayor preferencia, al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden variantes de una alfa-amilasa parental que comprenden una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 y comprenden, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 1 6, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 359, 418, 431 , 434, 447 y 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo de la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a variantes de una alfa-amilasa parental que comprenden al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y comprenden, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431, 434, 447 y 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo y adyacente a la posición, (¡i) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

Preferentemente, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos 70 %, preferentemente, al menos 75 %, con mayor preferencia, al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos 85 %, aún con mayor preferencia, al menos 90 %, con la máxima preferencia, al menos 95 % y aún con la máxima preferencia, al menos aproximadamente 97 % con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 14, 16, 18 o 20.

Preferentemente, las variantes que comprenden alteraciones en una o más de las posiciones identificadas anteriormente tienen una mayor estabilidad en detergentes, preferentemente, en detergentes líquidos en comparación con la alfa-amilasa parental.

Los inventores han encontrado que estas variantes tienen una mayor estabilidad con respecto a la alfa-amilasa parental en composiciones que comprenden un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM puede reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0, tal como se describe en "Materiales y métodos".

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método para preparar un polipéptido; el método comprende: (a) proveer una secuencia de aminoácidos de un polipéptido parental que tiene actividad de amilasa; (b) seleccionar uno o más aminoácidos que ocupan una o más posiciones que corresponden a las posiciones 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y, además, seleccionar una o más posiciones que corresponden a las posiciones 1 6, 118, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6; (c) modificar la secuencia mediante la sustitución o deleción del residuo de aminoácido seleccionado o la inserción de uno o más residuos de aminoácidos corriente abajo y adyacentes al residuo de aminoácido seleccionado; (d) producir un polipéptido variante que tiene la secuencia modificada; (e) probar el polipéptido variante para determinar la actividad de amilasa y la estabilidad; y (f) seleccionar un polipéptido variante que tiene actividad de amilasa y una mayor estabilidad con respecto al polipéptido parental en presencia de un agente quelante, en donde ese agente quelante a una concentración menor que 10 mM puede reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0.

Preferentemente, las variantes comprenden alteraciones en tres posiciones, con mayor preferencia, en cuatro posiciones, aún con mayor preferencia, en cinco posiciones y, con la máxima preferencia, en seis posiciones, en una modalidad particularmente preferida, la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y, además, una o más sustituciones en una o más posiciones que corresponden a las posiciones en la alfa-amilasa parental seleccionada del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6).

Por lo tanto, un aspecto preferido se refiere a una variante de una alfa-amilasa parental que comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y comprende, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 1 16, 1 18, 129, 133, 134, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo y adyacente a la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

En una modalidad preferida la alfa-amilasa variante tiene una o más (varias) deleciones y/o sustituciones y/o inserciones de aminoácidos. En una modalidad particularmente preferida las alfa-amilasas variantes incluyen una alfa-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 6 de la presente descripción y que comprende, además, la siguiente alteración: D183*+G184* (deleción en las posiciones 183 y 184); esta variante muestra un desempeño adecuado en detergentes y tiene una mayor estabilidad en presencia de agentes quelantes.

En una modalidad preferida la alfa-amilasa variante comprende SP707 (SEQ ID NO: 8) que incluye cualquiera de SP707+R181 * G182*. SP707+G182* H183\ SP707+H183* G184-*.

En otra modalidad preferida la alfa-amilasa variante comprende SP722 (SEQ ID NO: 6) que incluye cualquiera de SP722+R181 * G182*, SP722+G182* D183*. SP722+D183* G184*.

En aún otra modalidad preferida la alfa-amilasa variante comprende AA560 (SEQ ID NO: 10) que incluye cualquiera de AA560+R181 * G 82*. AA560+G182* D183*, AA560+D183* G184*.

En otra modalidad preferida la alfa-amilasa parental comprende SP690 (SEQ ID NO: 12) que incluye cualquiera de SP690 + R181 * G182*; SP690 + G182* T183*; SP690 + T183* G184*.

"SP722+R181* G182* significa que la alfa-amilasa SP722 de la esp. Bacillus se mutó por medio de deleciones en las posiciones R181 y G182, en donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO: 6.

Por lo tanto, en un aspecto de la invención la alfa-amilasa variante comprende cualquiera de los siguientes: SP722, SP690, SP707 o AA560 que incluyen cualquiera de: SP722 + R181 *G182*, SP722+G182*+ D183*. SP722 + D183*+ G184*; SP722 + R181 *G182* N195F; SP722 + G182* D183* N195F; SP722 + D183* G184* N195F; SP722 + R181 *G182* M202L; SP722 + G182* D183* M202L; SP722 + D183* G184* M202L; SP722 + R181 * G182* N195F M202L; SP722 + G182 D183* N195F M202L SP722 + D183* G184* N195F M202L; SP722 + D183* G184* N195F V206L Y243F; SP722 + D 83* G184* N195F V206Y Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206F Y243F; SP722 + R181* G182* R181 Q; SP722 + G182* D183* R181 Q; SP722+D183* G184* R181 Q; SP722+R181* G182* L1 18K N195F H458K; SP722+G182* D183* L118K N195F H458K; SP722+D183* G184* L1 18K N195F H458K; SP722 + D183* G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L; AA560 + R181* G182*; AA560 + G182* D183*; AA560 + D183* G184*; AA560 + R181* G 82* N195F; AA560 + G182* D 83* N195F; AA560 + D 83* G184* N195F; AA560+ D 83* G184* I206Y; AA560+ D183* G184* Y243F; AA560+ D183* G 84* I206L Y243F; AA560+ D183* G184* N195F I206L; AA560+D 83* G184* N195F Y243F; AA560+D183* G184* N195F I206L, Y243F; AA560+D183* G184* N195F I206Y Y243F; AA560+D183* G184* N195F I206F; AA560 + R181* G182* M202L; AA560 + G182* D183* M202L; AA560 + D183* G184* M202L; AA560 + R181* G182* N195F M202L; AA560 + G182* D183* N195F M202L; AA560 + D183* G184* N195F M202L; AA560 + R181* G182* R1 8K N195F R320K T458K; AA560 + G182* D183* R1 18K N195F R320K T458K; AA560 + D183* G184* R118K N195F R320K T458K; AA560 + D183* G184* R1 18K N195F I206L R320K R458K; AA560 + D183* G184* R118K N195F I206Y R320K R458K; AA560 + D183* G184* R1 18K N195F Y243F R320K R458K; AA560 + D183* G184* R1 18K N195F I206L Y243F R320K R458K.

SP707+R18Í* G182*, SP707+G182* H183*, SP707+H183* G184*; SP707+ R181* G182* N195F; SP707+ G182* H183* N195F; SP707+H183* G184* N195F I206L, Y243F; SP707+H183* G184* N195F I206Y Y243F; SP707+H183* G184* N195F I206F Y243F; SP707+H183* G184* N195F; SP707+ R181* G182* M202L; SP707+ G182* H183* M202L; SP707+D183* G184* M202L; SP707+ R181 * G182* N195F M202L; SP707+ G182* H183* N195F M202L; SP707+H183* G184* N195F M202L; SP707+R181* G182* R181 Q; SP707+G182* H183* R181 Q; SP707+H183* G184* R181Q; SP707+R181 * G182* R1 18K N195F R320K R458K; SP707+G182* H183* R1 18K N195F R320K R458K; SP707 + H183* G184* R1 18K N195F R320K R458K; SP690 +R181* G182*, SP690 +G182* T183*, SP690 +T183* G184*; SP690 +R181 * G182* N195F; SP690 +G182* T183* N195F; SP690 +T183* G184* N195F; SP690+T183* G184* N195F V206L, Y243F; SP690+T183* G184* N195F V206Y Y243F; SP690+T183* G184* N195F V206F Y243F; SP690 +R181* G182* M202L; SP690 +G182* T183* M202L; SP690 +T183* G184* M202L; SP690 + R181 * G182* N195F M202L; SP690 + G182* T183* N195F M202L; SP690 +T183* G184* N195F M202L; SP690 + R181 * G182* R1 8K N195F R320K R458K; SP690 + G182* T183* R1 18K N195F R320K R458K; SP690 + T183* G184* R1 18K N195F R320K R458K.

"SP722 + R181 * G182* N195F" significa que la alfa-amilasa SP722 de la esp. Bacillus. se mutó de la siguiente manera: deleciones en las posiciones R181 y G182 y una sustitución de Asn (N) a Phe (F) en la posición 195, en donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO: 6 (contado como si las posiciones eliminadas estuvieran aún presentes, es decir, la numeración no se reduce en dos cuando se eliminan dos posiciones).

En una modalidad particularmente preferida de la invención las alteraciones se seleccionan de las siguientes sustituciones: XI QSA.CE.F.G.H.I.K.L.M.N.P.Q.R.S.T.V.W.X.Y, preferentemente, S193T; X195A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferente- mente, N195 [F o Y]¡ X197A,C,D,E,F,G,H,I,K,L, N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferentemente, N197 [F o L]¡ X198A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferentemente, Y198N; X200A,C,D,E,F1G,H,I,L, ,N,P,Q,R,S,T,V,W,X1Y, preferentemente, Y200F; X203A,C,D,E,F1G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,X,Y, preferentemente, Y203F.

X206A,C,D,E,F,G,H,I,K,L, N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferentemente, V206 [F, Y, L, H o N]¡ X210A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferentemente, H210Y; X212A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,X,Y, preferentemente, E212 [V o G]; y X213A,C1D,E1F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,X,Y, preferentemente, V213A; X243A,C,D,E,F,G,I,K,L)M,N,P,Q,R,S,T>V,W,Y, preferentemente, Y243F.

En otra modalidad preferida las variantes comprenden alteraciones en tres posiciones, con mayor preferencia, en cuatro posiciones, con mayor preferencia, en cinco posiciones y, con mayor preferencia, en seis posiciones, en una modalidad particularmente preferida la variante comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 84 y, además, una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 243, 244, 303, 320, 359, 418, 447 (con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6).

Por lo tanto, en una modalidad particularmente preferida de la invención las alteraciones se seleccionan de las siguientes sustituciones: X1 16A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, N116T X1 18A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, R1 18K X129A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y, preferentemente, Q129L X133A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, G133E X134A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, D 34Y X^A.C.D.E.F.H.I. .L.M.N.P.Q.R.S.T.V.W.Y, preferentemente, K142R X146A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, P146S X^yA.CD.E.F.G.H.I.K.L.M.N.P.Q.R.S.T.W.Y, preferentemente, G147E X149A,C,D,E,F,G,I,K,L, ,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, G149R X151A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, T151 R X152A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, Y152H X169A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, Q169E X174C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V1W,Y, preferentemente, Q174R X186A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y, preferentemente, A186R X235A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q1R,S,T,V,W,Y, preferentemente, I235N X243A,C,D,E,F,G1I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, Y243F X244A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V1W,Y, preferentemente, S244Q XSOSA.C.D.E.F.G.H.I.K.L.M.P.Q.R.S.T.V.W.Y, preferentemente, G303V X320AIC,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, K320N X339A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, S339P X359C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, R359I X418A,C,D,E1F,G,H,I,K,L,M1P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, N418D X431A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, S431T X434A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, P434T X447A,C,E,F,G,H,I,K,L,JVI,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, A447V X458A,C,D,E,F,G,H,I,K,L, ,P,Q,R,S,T,V,W,Y, preferentemente, R458K En una modalidad particularmente preferida la variante comprende, además, al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184.

En una modalidad preferida, la cantidad de sustituciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención es, preferentemente, de 17 sustituciones, con mayor preferencia, 16 sustituciones, con mayor preferencia, 15 sustituciones, con mayor preferencia 14 sustituciones, con mayor preferencia, 13 sustituciones, con mayor preferencia, 12 sustituciones, con mayor preferencia, 11 sustituciones, con mayor preferencia, 10 sustituciones, con mayor preferencia, 9 sustituciones, con mayor preferencia, 8 sustituciones, con mayor preferencia, 7 sustituciones, con mayor preferencia, 6 sustituciones, con mayor preferencia, 5 sustituciones, con mayor preferencia, 4 sustituciones, aún con mayor preferencia, 3 sustituciones y, con la máxima preferencia, 2 sustituciones. En otra modalidad preferida, la cantidad de sustituciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención consiste, preferentemente, en 17 sustituciones, con mayor preferencia, 16 sustituciones, con mayor preferencia, 15 sustituciones, con mayor preferencia, 14 sustituciones, con mayor preferencia, 13 sustituciones, con mayor preferencia, 12 sustituciones, con mayor preferencia, 11 sustituciones, con mayor preferencia, 10 sustituciones, con mayor preferencia, 9 sustituciones, con mayor preferencia, 8 sustituciones, con mayor preferencia, 7 sustituciones, con mayor preferencia, 6 sustituciones, con mayor preferencia, 5 sustituciones, con mayor preferencia, 4 sustituciones, aún con mayor preferencia, 3 sustituciones y, con la máxima preferencia, 2 sustituciones.

En una modalidad particularmente preferida las variantes de conformidad con la presente invención comprenden una combinación de alteraciones diferentes. Por lo tanto, en una modalidad preferida la variante de conformidad con la presente invención comprende al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184, preferentemente, una deleción en las posiciones 183 y 184 y comprende, además, una de las siguientes combinaciones de alteraciones por sustituciones en las posiciones 186 y 195; sustituciones en las posiciones 174 y 212; sustituciones en las posiciones 206 y 212; sustituciones en las posiciones 206, 212 y 304; sustituciones en las posiciones 206, 212, 304 y 447; sustituciones en las posiciones 116 y 133; sustituciones en las posiciones 235 y 339; sustituciones en las posiciones 193 y 206; sustituciones en las posiciones 116, 133 y 142; sustituciones en las posiciones 116, 133, 142 y 198; sustituciones en las posi- dones 116, 133, 142, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 133 y 195; sustituciones en las posiciones 133, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 33, 195, 198 y 200; sustituciones en las posiciones 116 y 195; sustituciones en las posiciones 116, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 142 y 146; susti-tuciones en las posiciones 142, 146 y 149; sustituciones en las posiciones 142, 146, 149 y 195; sustituciones en las posiciones 142, 146, 149, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 142, 146, 149, 195, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 151 y 210; sustituciones en las posiciones 151 , 210 y 320; sustituciones en las posiciones 186, 195, 212 y 213; sustituciones en las posiciones 151 , 210, 320 y 359; sustituciones en las posiciones 151 , 210, 320, 359 y 418; sustituciones en las posiciones 147 y 149; sustituciones en las posiciones 147, 149 y 169; sustituciones en las posiciones 147, 149, 169 y 198; sustituciones en las posiciones 147, 149, 169, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 147, 149, 169, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 133 y 149; sustitucio-nes en las posiciones 33, 149 y 195; sustituciones en las posiciones 133, 149, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 133, 149, 195, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 147 y 152; sustituciones en las posiciones 147, 152 y 169; sustituciones en las posiciones 147, 152, 169 y 198; sustituciones en las posiciones 147, 152, 169, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 195 y 206; sustituciones en las posiciones 195 y 243; sustituciones en las posiciones 195 y 210; sustituciones en las posiciones 206 y 210; sustituciones en las posiciones 186 y 195; sustituciones en las posiciones 195 y 206; sustituciones en las posiciones 195, 206 y 243; sustituciones en las posiciones 206 y 243; sustituciones en las posiciones 133 y 149; sustituciones en las posiciones 133, 149 y 198; sustituciones en las posiciones 133, 149, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 1 16 y 133; sustituciones en las posiciones 1 16, 133 y 147; sustituciones en las posiciones 1 16, 133, 147 y 152; sustituciones en las posiciones 116, 133, 147, 152 y 198; sustituciones en las posiciones 1 16, 133, 147, 152, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 1 16, 133, 147, 152, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 147 y 149; sustituciones en las posiciones 147, 149 y 195; sustituciones en las posiciones 147, 149, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 147, 149, 195, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 133 y 142; sustituciones en las posiciones 133, 142 y 195; sustituciones en las posiciones 133, 142, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 133 y 149; sustituciones en las posiciones 133, 149 y 152; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152 y 195; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152, 195, 198 y 206; sustituciones en las posiciones 116 y 129; sustituciones en las posiciones 1 16, 129 y 142; sustituciones en las posiciones 1 16, 129, 142 y 195; sustituciones en las posiciones 1 16, 129, 142, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 1 16, 129, 142, 195, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 1 16, 129, 142, 195, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 133 y 149; sustituciones en las posiciones 133, 149 y 152; susti-tuciones en las posiciones 133, 149, 152 y 195; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152, 195 y 198; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152, 195, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 133, 149, 152, 195, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 1 16 y 133; sustituciones en las posiciones 116, 133 y 149; sustituciones en las posiciones 116, 133, 149 y 198; sustituciones en las posiciones 116, 133, 149, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 116, 133, 149, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 195 y 198; sustituciones en las posiciones 195, 198 y 203; sustituciones en las posiciones 195, 198, 203 y 206; sustituciones en las posiciones 133, 149, 195, 203 y 206.

En otra modalidad especialmente preferida, las variantes de conformidad con la presente invención comprenden una combinación de alteraciones diferentes. Por lo tanto, en una modalidad preferida la variante de conformidad con la presente invención comprende al menos una, al menos dos o al me-nos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181, 182, 183 o 184, preferentemente, una deleción en las posiciones 183 y 184 y comprende, además, una de las siguientes combinaciones de alteraciones por sustituciones en las posiciones 186 con [R, T, K, H, E, D, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 174 con [R, K, H, E, D, Q o N] y 212 con [F, W, Y, L, I o VJ; sustituciones en las posiciones 206 con [D, E, F, W, Y, L, I, V, N, Q o H] y 212 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H], 212 con [F, W, Y, L, I o V] y 304 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H], 212 con [F, W, Y, L, I o V], 304 con [F, W, Y, L, I o V] y 447 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M] y 133 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 235 con [N o L] y 339 con [P); sustituciones en las posiciones 193 con (G, A, T o M] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D] y 142 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posi- dones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 142 con [R, K, H, Q o N] y 198 con [Q o N]¡ sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 142 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N] con [Q o N] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 186 con [R, T, K, H, E, D, Q o N], 195, con [F, W, Y, L. I o V ], 212 con [F, W, Y, L, I o V ] y 213; con [A]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 200 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 142 con [R, K, H, Q o N] y 146 con [G, A, S, T o M]¡ sustituciones en las posiciones 142 con [R, K, H, Q o N], 146 con [G, A, S, T o M] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 142 con [R, K, H, Q o N], 146 con [G, A, S, T o M], 149 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 142 con [R, K, H, Q o N], 146 con [G, A, S, T o M], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 142 con [R, K, H, Q o N], 146 con [G, A, S, T o M], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 151 y 210 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 151 , 210 con [F, W, Y, L, I o V] y 320 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 151 , 210 con [F, W, Y, L, I o V], 320 con [Q o N] y 359 con [F, W, Y, L, I o V]¡ sustituciones en las posiciones 151 , 210 con [F, W, Y, L, I o V], 320 con [Q o N], 359 con [F, W, Y, L, I o V] y 418 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 169 con [E o D]¡ sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 169 con [E o D] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 169 con [E o D], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 169 con [E o D], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N], sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]¡ sustituciones en las po-siciones 147 con [E o D] y 152 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N] y 169 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N], 169 con [E o D] y 198 con [Q o N]¡ sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N], 169 con [E o D], 198 con [Q o N] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; susti-tuciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 243 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 210 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H] y 210 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 186 con [R, K, H, E, D, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V], 206 y 243 con [F, W, Y, L, I o V]¡ sustitu-dones en las posiciones 206 y 243 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]¡ sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N] y 206; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M] y 133 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D] y 147 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 147 con [E o D] y 152 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 16 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 33 con [E o D], 147 con [E o D], 152 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 147 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 95 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 206; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 142 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 142 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 142 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 152 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N), 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 206; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M] y 129 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 129 con [F, W, Y, L, I o V] y 142 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 129 con [F, W, Y, L, I o V], 142 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 129 con [F, W, Y, L, I o V], 142 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 1 16 con [G, A, S, T o M], 129 con [F, W, Y, L, I o V], 142 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 129 con [F, W, Y, L, I o V], 142 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N] y 152 con [R, K, H, Q o N]¡ sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N] y 195 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustitucio-nes en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 152 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206; sustituciones en las posiciones 1 16 con [G, A, S, T o M] y 133 con [E o D]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D] y 149 con [R, K, H, Q o N]; sustituciones en las posiciones 1 16 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N) con [R, K, H, Q o N] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 116 con [G, A, S, T o M], 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o V]; sustitucio-nes en las posiciones 116 con [G, A, S. T o ], 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V] y 198 con [Q o N]; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N] y 203 con [F, W, Y, L, I o VJ; sustituciones en las posiciones 195 con [F, W, Y, L, I o V], 198 con [Q o N], 203 con [F, W, Y, L, I o V] y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H]; sustituciones en las posiciones 133 con [E o D], 149 con [R, K, H, Q o N], 195 con [F, W, Y, L, I o V], 203 con [F, W, Y, L, I o V], y 206 con [F, W, Y, L, I, V, N, Q o H].

Las variantes particularmente útiles en la invención incluyen (con el uso de la numeración de la SEQ ID NO: 6): D183* G184* N195L; D183* G184* N197F; D183* G184* N197L; D183* G184* Y243F; D183* G184* N195F, D183* G184* N277F; D183* G184* S431T; D183* G184* P434T; D183* G184* I235N S339P; D183* G184* L351 F; D183* G184* A186R, N195F; D183* G184* H210Y; D183* G184* V206Y; D183* G184* V206L; D183* G184* V206F; D183* G184* V213A Q174R; D183* G184* E212V; D183* G184* V206F E212G G304V A447V; N116T G133E K142R D183* G184* Y198N V206Y; G133E D183* G184* N195Y Y198N Y200F; D183* G184* A186D N195F E212V V213A; N116T D183* G184* N195Y Y198N; K142R P146S G149K D183* G184* N195Y Y198N V206I; D134Y D183* G184*; T151 R D183* G184* H210Y K320N R359I N418D Q490H; G147E G149R Q169E D183* G184* Y198N Y203F V206Y; G133E G149R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; G147E Y152H Q169E D183* G184* Y198N V206Y; D183* G184* N195F V206Y; D183* G184* N195F V206L; D183* G184* N195F V206F; D183* G184* V206L Y243F; D183* G184* V206F Y243F; D183* G184* N195F Y243F; D183* G184* N195F H210Y; D183* G184* V206Y H210Y; D183* G184* V213A; D183* G184* S193T; D183* G184* A186T N195F; D183* G184* N195F V206Y Y243F; D183* G184* N195F V206L Y243F; D183* G184* N195F V206Y Y243F; D183* G184* N195F V206F Y243F; D183* G184* V206Y Y243F; D183* G184* N195Y; G133D G149R D183* G184* Y198N V206Y; N1 16T G133E G147E Y152H D183* G184* Y198N Y203F V206Y; G147E G149R D183* G184* N195F Y198N V206Y, G133E K142R D183* G184* N195F Y198N; G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N V206Y; N116T Q129L K142R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; N116T G133E G149R G182* D183* Y198N Y203F V206Y; D183* G184* S193T V206L, D183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L En una modalidad preferida las variantes útiles en la invención incluyen: SP722SP722 + D183* G184* N195L; SP722SP722 + D183* G184* N197F; SP722SP722 + D183* G184* N197L; SP722SP722 + D183* G184* Y243F; SP722SP722 + D183* G184* N195F, SP722SP722 + D183* G184* N277F; SP722 + D183* G184* S431T; SP722 + D183* G184* P434T; SP722 + D183* G184* I235N S339P; SP722 + D183* G184* L351 F; SP722 + D183* G184* A186D N195F E212V V213A; SP722 + D183* G184* A186R, N195F; SP722 + D183* G184* H210Y; SP722 + D183* G184* V206Y; SP722 + D183* G184* V206L, SP722 + D183* G184* V206F; SP722 + D183* G184* V213A Q174R; SP722 + D183* G184* E212V; SP722 + D183* G184* V206Y E212G G304V A447V; SP722 + N1 16T G133E K142R D183* G184* Y198N V206Y; SP722 + G133E D183* G184* N195Y Y198N Y200F; SP722 + N1 16T D183* G184* N195Y Y198N; SP722 + K142R P146S G149K D183* G184* N195Y Y198N V206I; SP722 + D134Y D183* G184*; SP722 + T151 R D183* G184* H210Y K320N R359I N418D; SP722 + G147E G149R Q169E D183* G184* Y198N Y203F V206Y; SP722 + G133E G149R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP722 + G147E Y152H Q169E D183* G184* Y198N V206Y; SP722 + D183* G184* N195F V206Y; SP722 + D183* G184* N195F V206F; SP722 + D183* G184* N195F V206L; SP722 + D183* G184* I206L Y243F; SP722 + D183* G184* I206F Y243F; SP722 + D183* G184* N195F Y243F; SP722 + D183* G184* N195F H210Y; SP722 + D183* G184* V206Y H210Y; SP722 + D183* G184* V213A; SP722 + D183* G184* S193T; SP722 + D183* G184* A186T N195F; SP722 + D183* G184* N195F V206Y Y243F; SP722 + D183* G184* V206Y Y243F; SP722 + D183* G184* N195Y; SP722 + G133D G149R D183* G184* Y198N V206Y; SP722 + N1 16T G133E G147E Y152H D183* G184* Y198N Y203F V206Y; SP722 + G147E G149R D183* G184* N195F Y198N V206Y; SP722 + G133E K142R D183* G184* N195F Y198N; SP722 + G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N V206Y; SP722 + N1 16T Q129L K142R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP722 + G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP722 + N 116T G133E G149R G182* D183* Y198N Y203F V206Y; SP722 + D183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L.

En una modalidad preferida las variantes se seleccionan de las siguientes: SP722 + D183* G184* N195F V206L Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206Y Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206N Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206F Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206H; SP722 + D183* G184* N195F V206Y; SP722 + D183* G184* V206F Y243F; SP722 + D183* G184* N195F V206L H210Y; SP722 + D183* G184* S193T V206L; SP722 + D183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L.

En otra modalidad preferida las variantes de conformidad con la invención incluyen: SP707 + H183* G184* N195L; SP707 + H183* G184* N197F; SP707 + H183* G184* N197L; SP707 + H183* G184* Y243F; SP707 + H183* G184* N195F, SP707 + H183* G184* N277F; SP707 + H183* G184* A186D N195F E212V V213A; SP707 + H183* G184* S431T; SP707 + H183* G184* A434T; SP707 + H183* G184* I235N A339P; SP707 + H183* G184* L351 F, SP707 + H183* G184* A186R N195F; SP707 + H183* G184* H210Y; SP707 + H183* G184* I206Y; SP707 + H183* G184* I206L, SP707 + H183* G184* I206F; SP707 + H183* G184* V213A Q174R; SP707 + H183* G184* E212V; SP707 + H183* G184* I206Y E212G G304V A447V; SP707 + M116T G133E H183* G184* Y198N I206Y; SP707 + G133E H183* G184* N195Y Y198N Y200F; SP707 + M116T H183* G184* N195Y Y198N; SP707 + P146S G149K H183* G184* N195Y Y198N V206I; SP707 + E134Y H183* G184*; SP707+ T151 R H183* G184* H210Y R320N R359I N418D; SP707 + G147E G149R Q169E H183* G184* Y198N Y203F I206Y; SP707 + G133E G149R H183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; SP707 + G147E Q169E H183* G184* Y198N I206Y; SP707 + H183* G184* N195F I206Y; SP707 + H183* G184* N195F I206L; SP707 + H183* G184* N195F I206F; SP707 + H183* G184* N195F Y243F; SP707 + H183* G184* N195F H210Y; SP707 + H183* G184* I206Y H210Y; SP707 + H183* G184* V213A; SP707 + H183* G184* S193T; SP707 + H183* G184* A186T N195F; SP707 + H183* G184* N195F I206Y Y243F; SP707 + H183* G184* N195F I206F Y243F; SP707 + H183* G184* N195F I206L Y243F; SP707 + H183* G184* N195F I206Y Y243F SP707 + H183* G184* I206Y Y243F; SP707 + H183* G184* I206L Y243F; SP707 + H183* G184* I206F Y243F; SP707; SP707 + H183* G184* N195Y; SP707 + G133D G149R H183* G184* Y198N I206Y; SP707 + M116T G133E G147E H183* G184* Y198N Y203F I206Y; SP707 + G147E G149R H183* G184* N195F Y198N I206Y; SP707 + G133E H183* G184* N195F Y198N; SP707 + G133E G149R H183* G184* N195Y Y198N I206Y; SP707 + M1 Í6T Q129L H183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; SP707 + G133E G149R H183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; SP707 + M116T G133E G149R G182* H183* Y198N Y203F I206Y; SP707+D183* G184* R 18K N195F R320K R458K; SP707+D183* G184* R118K N195F I206L R320K R458K; SP707+D183* G184* R118K N195F I206Y R320K R458K; SP707+D183* G184* R118K N195F Y243F R320K R458K; SP707+D183* G184* R118K N195F I206L Y243F R320K R458K.

En una modalidad preferida las variantes de conformidad con la invención incluyen: AA560 + D183* G184* N195L; AA560 + D183* G184* N197F; AA560 + D183* G184* N197L; AA560 + D183* G184* Y243F; AA560 + D183* G184* N195F, AA560 + D183* G184* N277F; AA560 + D183* G184* S431T; AA560 + D183* G184* A434T; AA560 + D183* G184* I235N A339P; AA560 + D183* G184* L351 F; D183* G184* G186D N195F E212V V213A AA560 + D183* G184* G186R, N195F; AA560 + D183* G184* H210Y; AA560 + D183* G184* I206Y; AA560 + D183* G184* I206L; AA560 + D183* G184* I206F; AA560 + D183* G184* V213A Q174R; AA560 + D183* G184* E212V; AA560 + D183* G184* I206Y E212G G304V A447V; AA560 + M1 16T G133E K142R D183* G184* Y198N I206Y; AA560 + G133E D183* G184* N195Y Y198N Y200F; AA560 + M116T D183* G184* N195Y Y198N; AA560 + K142R P146S G149K D183* G184* N195Y Y198N I206I; AA560 + E134Y D183* G184*; AA560 + T151 R D183* G184* H210Y R320N R359I N418D; AA560 + G147E G149R Q169E D183* G184* Y198N Y203F I206Y; AA560 + G133E G149R D183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; AA560 + G147E Y152H Q169E D183* G184* Y198N I206Y; AA560 + D183* G184* N195F I206Y; AA560 + D183* G184* N195F I206L; AA560 + D183* G184* N195F I206F; AA560 + D183* G184* I206L Y243F; AA560 + D183* G184* I206F Y243F; AA560 + D183* G184* N195F Y243F; AA560 + D183* G184* N195F H210Y; AA560 + D183* G184* I206Y H210Y; AA560 + D183* G184* V213A; AA560 + D183* G184* S193T; AA560 + D183* G184* G186T N195F; AA560 + D183* G184* N195F I206Y Y243F, AA560 + D183* G184* N195F I206L Y243F; AA560 + D183* G184* N195F I206Y Y243F AA560 + D183* G184* I206Y Y243F; AA560 + D183* G184* I206L Y243F; AA560 + D183* G184* N195Y; AA560 + G133D G149R D183* G184* Y198N I206Y; AA560 + M116T G133E G147E Y152H D183* G184* Y198N Y203F I206Y; AA560 + G147E G149R D183* G184* N195F Y198N I206Y; AA560 + G133E K142R D183* G184* N195F Y198N; AA560 + G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N I206Y; AA560 + M116T Q129L K142R D183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; AA560 + G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N Y203F I206Y; AA560 + M116T G133E G149R G182* D183* Y198N Y203F I206Y; AA560+D183* G184* R118K N195F R320K R458K; AA560+D183* G184* R118K N195F I206L R320K R458K; AA560+D183* G184* R118K N195F I206Y R320K R458K; AA560+D183* G184* R118K N195F Y243F R320K R458K; AA560+D183* G184* R118K N195F I206L Y243F R320K R458K.

En una modalidad preferida las variantes de conformidad con la invención incluyen: SP690 + T183* G184* N195L; SP690 + T183* G184* N197F; SP690 + T183* G184* N197L; SP690 + T183* G 84* Y243F; SP690 + T183* G184* N195F, SP690 + T183* G184* N277F; SP690 + T183* G184* S431T; SP690 + T183* G184* P434T; SP690 + T183* G184* I235N A339P; SP690 + T183* G184* L351 F; SP690 + T183* G184* A186D N195F E212V V213A; SP690 + T183* G184* A186R N195F; SP690 + T183* G184* H210Y; SP690 + T183* G184* V206Y; SP690 + T183* G184* V206L, SP690 + T183* G184* V206F; SP690 + T183* G184* V213A Q174R; SP690 + T183* G184* E212V; SP690 + T183* G184* V206Y E212G G304V A447V; SP690 + N1 16T G133E K142R T183* G184* Y198N V206Y; SP690 + G133E T183* G184* N195Y Y198N Y200F; SP690 + N1 16T T183* G184* N195Y Y198N; SP690 + K142R P146S G149K T183* G184* N 195Y Y198N V206I; SP690 + E134Y T183* G184*; SP690 + N151 R T183* G184* H210Y K320N R359I N418D; SP690 + G147E G149R Q169E T183* G184* Y198N Y203F V206Y; SP690 + G133E G149R T183* G 84* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP690 + G147E Y152H Q169E T183* G184* Y198N V206Y; SP690 + T183* G184* N195F V206Y; SP690 + T183* G184* N195F V206F; SP690 + T183* G184* N195F V206L; SP690 + T183* G184* I206L Y243F; SP690 + T183* G184* I206F Y243F; SP690 + T183* G184* N195F Y243F; SP690 + T183* G184* N195F H210Y; SP690 + T183* G184* V206Y H210Y; SP690 + T183* G184* V213A; SP690 + T183* G184* S193T; SP690 + T183* G184* A186T N195F; SP690 + T183* G184* N195F V206Y Y243F; SP690 + T183* G184* V206Y Y243F; SP690 + T183* G184* N195Y; SP690 + G133D G149R T183* G184* Y198N V206Y; SP690 + N116T G133E G147E Y152H T183* G184* Y198N Y203F V206Y; SP690 + G147E G149R T183* G184* N195F Y198N V206Y; SP690 + G133E K142R T183* G184* N195F Y198N; SP690 + G133E G149R Y152H T183* G184* N195Y Y198N V206Y; SP690 + N1 16T Q129L K142R T183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP690 + G133E G149R Y152H T183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y; SP690 + N1 16T G133E G149R G182* T183* Y198N Y203F V206Y, SP690 + T183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L, SP690+T183* G184* R118K N195F R320K R458K; SP690+T183* G184* N118K N195F V206L R320K R458K; SP690+T183* G184* N1 18K N195F V206Y R320K R458K; SP690+T183* G184* N1 18K N195F Y243F R320K R458K; SP690+T183* G184* N118K N195F V206L Y243F R320K R458K; SP690 + T183* G184* N195F V206L Y243F; SP690 + T183* G184* N195F V206Y Y243F; SP690 + T183* G184* N195F V206N Y243F; SP690 + T183* G184* N195F V206F Y243F; SP690 + T183* G184* N195F V206H; SP690 + T183* G184* N195F V206Y; SP690 + T183* G184* V206F Y243F; SP690 + T183* G184* N195F V206L H210Y; SP690 + T183* G184* S193T V206L; SP690 + T183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L.

Composiciones limpiadoras La presente invención se refiere, preferentemente, a productos y/o métodos relacionados y/o uso de las composiciones reivindicadas destinadas al cuidado del aire, cuidado del automóvil, lavado de vajilla, acondicionamiento de telas (que incluye suavizado), detergencia para lavandería, aditivo y/o cuidado de la lavandería y enjuague, limpieza y/o tratamiento de superficies duras y otro tipo de limpieza para uso institucional o de consumo. De conformidad con la invención, las variantes de alfa-amilasa anteriores puede ser, típicamente, un componente en una composición de limpieza, tal como una composición deter-gente, por ejemplo, una composición detergente para lavandería o una composición detergente para el lavado de vajilla. Especialmente se prefiere una composición detergente líquida para lavandería.

Dichas composiciones de limpieza comprenden un adicional de limpieza/detergente que no es un agente quelante, tal como se definió anterior-mente, preferentemente, que comprende una mezcla de componentes. Típicamente, el adicional de limpieza estará presente en la composición en una cantidad de 0.001 a 99.9 % en peso, más típicamente de 0.01 a 80 % en peso del adicional de limpieza. Los adicionales de limpieza adecuados comprenden: sur-factantes, aditivos, blanqueadores, catalizadores de blanqueador, colorantes, re-forzadores de blanqueador, agentes de transferencia de tintes, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, abrillantadores ópticos, fotoactivadores, fluorescedores, agentes tonalizadores de telas, acondicionadores de telas, perácidos preforma-dos, agentes poliméricos dispersantes, agentes de remoción/antiredepósito de suciedad de arcilla, sales de carga, hidrótropos, abrillantadores, reductores de espuma, agentes elastizantes de estructuras, suavizantes de telas, surfactantes hidrolizables, conservantes, antioxidantes, agentes antiencogimiento, germicidas, fungicidas, agentes antideslustre, anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes de solubilización, portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, tintes, perfumes y agentes de control del pH. Por ejemplo, estos pueden incluir: ingredientes de blanqueo, tales como reforzadores de blanqueadores de imina, fuentes de peróxido de hidrógeno, tales como percarbonato y/o perborato, especialmente, percarbonato recubierto con material tal como carbonato y/o sal de sulfato, sal de silicato, borosilicato y cualquier mezcla de estos; perácido preformado que incluye perácido preformado en forma encapsulada; catalizadores de metales de transición; reductores o sistemas reductores de espuma, tales como reductores de espuma a base de silicona y/o reductores de espuma a base de ácido graso; suavizantes de telas, tales como compuestos de arcilla, silicona y/o amonio cuaternario; floculantes, tales como óxido de polietileno; inhibidores de transferencia de colorantes, tales como polivinilpirrolidona, poli 4-vinilpiridina N-óxido o copolí-mero de vinilpirrolidona y vinilimidazol; componentes para preservar la integridad de la tela tales como los oligómeros producidos por condensación de imidazol y epicloridrina; dispersantes de manchas y auxiliares antiredepósito de manchas tales como poliaminas alcoxiladas y polímeros de etileneimina etoxilados; componentes antiredepósito como los poliésteres; polímeros de carboxilato, tales como polímeros de ácido maleico o copolímeros de ácido maleico y acrílico; perfumes, tales como microcápsulas de perfume, agentes encapsulados con almidón, perfume rociable; anillos de jabón; partículas estéticas; tintes; cargas, tales como sulfato de sodio, si bien se prefiere que la composición esté prácticamente libre de cargas; sal de silicato, tal como silicato de sodio que incluye silicato de sodio o metasilicato de sodio 1.6R y 2.0R; copoliésteres de ácidos dicarboxilicos y dioles; polímeros celulósicos, tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietoxicelulosa u otra alquil o alquilalcoxicelulosa; solventes, tales como 1,2-propanodiol, monoetanolamina; dietilenglicol, etanol y cualquier mezcla de estos; hidrótropos, tales cumenosulfonato de sodio, xilenosulfonato de sodio, tolueno-sulfonato de sodio y cualquier mezcla; ácidos orgánicos, tal como ácido cítrico; y cualquier combinación de estos.

En otro aspecto preferido la composición comprende uno o más surfactantes que pueden ser surfactantes no iónicos que incluyen los semi-polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos y/o anfoliticos y/o se-mipolares noiónicos y/o mezclas de estos. Los surfactantes están presentes, típicamente, en un nivel de 0.1 % a 60 % en peso o de 0.5 a 50 % en peso o de 1 a 40 % en peso de la composición.

Cuando se incluye, la composición de limpieza contiene, usualmente, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % de un sur-factante aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquilsulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfo- nato secundario, éster metílico de ácidos grasos alfa-sulfo sustituidos, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.

Cuando se incluye, el agente de limpieza contiene, usualmente, de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 40 % de un surfactante no ió-nico, tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonil-fenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoe-tanolamida de ácido graso, amida del ácido polihidroxialquil graso o derivados N-acil N-alquil de glucosamina ("glucamidas").

La composición de limpieza puede comprender una o más de otras enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica, por ejemplo, otra alfa-amilasa, glucoamilasa, amilasa malto-génica, CGTasa y/o una celulasa, mananasa (tal como MANNAWAY™ de Novozymes, Dinamarca), pectinasa, pectato liasa, cutinasa y/o laccasa.

Generalmente, las propiedades de la(s) enzima(s) elegidas de-ben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) deben estar presentes en cantidades eficaces.

Proteasas: Las proteasas adecuadas incluyen metaloproteasas y/o serina proteasas que incluyen serina proteasas microbianas neutras o alcalinas, tales como subtilisinas (EC 3.4.21.62). Las proteasas adecuadas incluyen las proteasas de origen animal, vegetal o microbiano. En un aspecto, dicha proteasa adecuada puede ser de origen microbial. Las proteasas adecuadas incluyen mutantes modificados químicamente o genéticamente de las proteasas adecuadas mencionadas anteriormente. En un aspecto, la proteasa adecuada puede ser una serina proteasa, tal como una proteasa microbial alcalina y/o una proteasa de tipo tripsina. Algunos ejemplos de proteasas neutras o alcalinas adecuadas incluyen: (a) subtilisinas (EC 3.4.21.62) que incluyen aquellas derivadas de bacilos, tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii descritos en las patentes de los EE. UU. núms. 6,312,936 B1 , 5,679,630, 4,760,025 y 7,262,042 y en la patente núm. WO 09/021867. (b) proteasas de tipo tripsina o quimotripsina tales como la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) que incluyen la proteasa Fusarium descrita en la patente núm. WO 89/06270 y las proteasas quimotripsina derivadas de Cellumonas descritas en las patentes núm. WO 05/052161 y WO 05/052146. (c) metaloproteasas que incluyen las derivadas de Bacillus amyloliquefaciens descritas en la patente núm. WO 07/044993A2.

Las proteasas preferidas incluyen las derivadas de Bacillus gibsonii o Bacillus Lentus.

Las enzimas proteasas adecuadas comercialmente disponibles incluyen las comercializadas con los nombres comerciales de Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Li- quanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® y Esperase® de Novozymes A/S (Dinamarca), aquellas comercializadas con los nombres comerciales de Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® y Pu-rafect OXP® de Genencor International, aquellas comercializadas con los nombres comerciales de Opticlean® y Optimase® de Solvay Enzymes, aquellas comercializadas por Henkel/ Kemira, a saber, BLAP (secuencia mostrada en la Figura 29 de la patente de los EE. UU. núm. 5,352,604 con las siguientes mutaciones S99D + S101 R + S103A + V104I + G159S, men-cionada de aquí en adelante como BLAP), BLAP R (BLAP con S3T + V4I + V199M + V205I + L217D), BLAP X (BLAP con S3T + V4I + V205I) y BLAP F49 (BLAP con S3T + V4I + A194P + V199M + V205I + L217D) - todas de Henkel/Kemira; y KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus con mutaciones A230V + S256G + S259N) de Kao.

Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces), p. ej., de H. lanuginosa (T. lanuginosus) tal como se describen en las patentes núm. EP 258 068 y EP 305 216, o de H. inso-lens tal como se describen en la patente núm. WO 96/13580, una Pseudo-monas lipasa, p. ej., de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (patente núm. EP 331 376), P. cepacia (patente núm. EP 218 272), P. stutzeri (patente núm. GB 1 ,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas esp. cepa SD 705 (pa- tentes núm. WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (patente núm. WO 96/12012), una Bacillus lipasa, p. ej., de B. subtilis (Dartois y col. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1 131 , 253-360), 8. stearothermophilus (patente núm. JP 64/744992) o 8. pumilus (patente núm. WO 91/16422).

La lipasa puede ser una "lipasa de primer ciclo", tal como las descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,939,702 B1 y 2009/0217464. En un aspecto la lipasa es una lipasa de primer lavado, preferentemente, una variante de la lipasa silvestre de Thermomyces lanuginosus que comprende las mutaciones T231 y N233R. La secuencia silvestre son los aminoácidos 269 (aminoáci-dos 23 - 291) del número de acceso de Swissprot 059952 (derivado de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)). Las lipasas preferidas pueden incluir aquellas comercializadas con los nombres comerciales de Lipex®, Lipolex® y Lipoclean®. Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacillus, Pseu-domonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej., las celulasas fúngi-cas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en la patente de los EE. UU. núm. 4,435,307, 5,648,263, 5,691,178, 5,776,757 y la patente núm. WO 89/09259.

Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej., las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusa-rium oxysporum descritas en la patente de los EE. UU. núm. 4,435,307, 5,648,263, 5,691 ,178, 5,776,757 y la patente núm. WO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en las patentes europeas núm. EP 0 495 257, EP 0 531 372, y en las patentes núm. WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa tales como aquellas descritas en las patentes núm. WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471 , WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.

Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CELLUZY-ME®, y CAREZYME® (Novozymes A S), CLAZINASE®, y PURADAX HA® (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Peroxidasas/oxidasas. Las peroxidasas/oxidasas adecuadas in-cluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Los ejemplos de peroxida-sas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej., de C. cinereus, y variantes de esta, como las descritas en las patentes núm. WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.

Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARD- ZYME® (Novozymes A/S).

Otras enzimas: Otras enzimas preferidas incluyen pectato lia-sas comercializadas con los nombres comerciales de Pectawash®, Pecta- way® y mananasas comercializadas con los nombres comerciales de Man-naway® (todas de Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), y Purabrite® (Genencor International Inc., Palo Alto, California).

La(s) enzima(s) detergente(s) pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas o por la adición de un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado puede formularse, por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones aditivas detergentes preferidas son los granulados, particularmente, los granulados no dispersables, y los líquidos, particularmente, los líquidos estabilizados o suspensiones.

Los granulados no dispersables pueden producirse, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los EE. UU. núms. 4,106,991 y 4,661 ,452 y pueden recubrirse, opcionalmente, por métodos conocidos en la industria. Los ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son los productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1000 a 20.000; nonil fenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para aplicar por medio de técnicas de lecho fluidizado se proveen en la patente británica núm. GB 1483591. Las preparaciones de enzimas liquidas pueden, por ejemplo, esta- bilizarse por medio de añadir un poliol tal como un propilenglicol, una azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito en la patente europea núm. EP 238,216.

La composición puede comprender un agente tonalizador de telas. Los agentes tonalizadores de telas adecuados incluyen tintes, conjugados de tinte y arcilla y pigmentos que satisfacen, preferentemente, los requisitos del Método de prueba 1 descrito más abajo en la presente descripción. Los colorantes apropiados incluyen colorantes de moléculas pequeñas y colorantes poliméricos. Los colorantes de moléculas pequeñas apropiados incluyen colorantes de moléculas pequeñas seleccionados del grupo que comprende colorantes que entran en las clasificaciones de índice de color (C.I., por sus siglas en inglés) azul directo, rojo directo, violeta directo, azul ácido, rojo ácido, violeta ácido, azul básico, violeta básico y rojo básico, o mezclas de estos, por ejemplo: (1) Colorantes trisazo azul directo de la fórmula en donde al menos dos de los anillos de naftilo A, B y C están sustituidos con un grupo sultanato; el anillo C puede es- tar sustituido en la posición 5 por NH2 o un grupo NHPh, X es un anillo de bencilo o naftilo sustituido con hasta 2 grupos sulfonato y puede estar sustituido en la posición 2 con un grupo OH y puede, además, estar sustituido con NH2 o un grupo NHPh. (2) Colorantes bis-azo violeta directo de la fórmula: en donde Z es H o fenilo, el anillo A se sustituye, preferentemente, por un grupo metilo y metoxi en las posiciones indicadas con flechas, el anillo A puede ser, además, un anillo naftilo, el grupo Y es un anillo bencilo o naftilo, que se sustituye por un grupo sulfato y puede ser mono o disustituido por grupos metilo. (3) Colorantes azul o rojo ácido de la fórmula en donde por lo menos una de X e Y debe ser un grupo aromático. En un aspecto, ambos grupos aromáticos pueden ser un grupo bencilo o naftilo sustituido, que puede sustituirse por grupos no solubilizantes en agua, tales como grupos alquilo o alquiloxi o ariloxi, X e Y no pueden sustituirse por grupos solubilizantes en agua, tales como sulfonatos o car- boxilatos. En otro aspecto, X es un grupo bencilo nitro sustituido, e Y es un grupo bencilo (4) Colorantes rojo ácido de la estructura en donde B es un grupo naftilo o bencilo que puede sustituirse por grupos no solubilizantes en agua, tales como grupos alquilo o alquiloxi o ariloxi, B no puede sustituirse por grupos solubilizantes en agua, tales como sulfonatos o carboxilatos. (5) Colorantes dis-azo de la estructura en donde X y Y, independientemente uno del otro, son cada uno hidrógeno, alquilo de CrC4 o alcoxi de Ci-C4D Ra es hidrógeno o arilo, Z es alquilo de CrC4; alcoxi de CrC4¡ halógeno; hidroxilo o carboxilo; n es 1 o 2 y m es 0, 1 o 2; además de las sales correspondientes y mezclas de estos. (6) Colorantes trifenilmetano de las siguientes estructuras ??? y mezclas de estos. En otro aspecto, los colorantes de moléculas pequeñas apropiados incluyen colorantes de moléculas pequeñas seleccionados del gru-po que consiste en los números de índice de color (Society of Dyers and Colou-rists, Bradford, Reino Unido) violeta directo 9, violeta directo 35, violeta directo 48, violeta directo 51, violeta directo 66, violeta directo 99, azul directo 1 , azul directo 71 , azul directo 80, azul directo 279, rojo ácido 17, rojo ácido 73, rojo ácido 88, rojo ácido 150, violeta ácido 15, violeta ácido 17, violeta ácido 24, vio-leta ácido 43, rojo ácido 52, violeta ácido 49, azul ácido 15, azul ácido 17, azul ácido 25, azul ácido 29, azul ácido 40, azul ácido 45, azul ácido 75, azul ácido 80, azul ácido 83, azul ácido 90 y azul ácido 113, negro ácido 1 , violeta básico 1, violeta básico 3, violeta básico 4, violeta básico 10, violeta básico 35, azul básico 3, azul básico 16, azul básico 22, azul básico 47, azul básico 66, azul básico 75, azul básico 159 y mezclas de estos. En otro aspecto, los colorantes de moléculas pequeñas adecuados incluyen los colorantes de moléculas pequeñas seleccionados del grupo que consiste en los números de índice de color (Society of Dyers and Colourists, Bradford, Reino Unido) violeta ácido 17, viole- ta ácido 43, rojo ácido 52, rojo ácido 73, rojo ácido 88, rojo ácido 150, azul ácido 25, azul ácido 29, azul ácido 45, azul ácido 113, negro ácido 1 , azul directo 1 , azul directo 71 , violeta directo 51 y mezclas de estos. En otro aspecto, los colorantes de moléculas pequeñas adecuados incluyen colorantes de moléculas pequeñas seleccionados del grupo consistente de los números del índice de color (Society of Dyers and Colourists, Bradford, Gran Bretaña) violeta ácido 17, azul directo 71 , violeta directo 51 , azul directo 1, rojo ácido 88, rojo ácido 150, azul ácido 29, azul ácido 113 o mezclas de estos.

Tintes polimericos adecuados incluyen tintes poliméricos seleccionados del grupo que comprende polímeros que contienen cromógenos conjugados (conjugados tinte-polímero), y polímeros con cromógenos copolimeri-zados dentro de la cadena principal del polímero, y mezclas de estos.

En otro aspecto, los colorantes poliméricos apropiados incluyen colorantes poliméricos seleccionados del grupo que comprende colorantes sustantivos de telas distribuidos con el nombre comercial Liquitint® (Milliken, Spartanburg, Carolina del Sur, EE. UU.), conjugados de colorante y polímero formados a partir de por lo menos un colorante reactivo y un polímero seleccionado del grupo formado por polímeros que comprenden una entidad seleccionada del grupo formado por una entidad hidroxilo, una entidad amino primaria y una entidad amino secundaria, una entidad tiol y mezclas de estos. En aun otro aspecto, los tintes poliméricos adecuados incluyen tintes poliméricos seleccionados del grupo que consiste en Liquitint® (Milliken, Spartanburg, Carolina del Sur, EE. UU.) violeta CT, carboximetilcelulosa (CMC) conjugada con un tinte azul reactivo, violeta reactivo o rojo reactivo, tal como CMC conjugada con C.l. El azul reactivo 19, vendido por Megazyme, Wickiow, Irlanda, bajo el nombre de producto AZO-CM-CELLULOSE, código del producto S-ACMC, colorantes poliméricos de trifenil-metano alcoxilado, colorantes poliméricos de tiofeno alcoxilado, y mezclas de estos.

Los conjugados apropiados de colorante y arcilla incluyen conjugados de colorante y arcilla seleccionados del grupo que comprende por lo menos un colorante catiónico/básico y una arcilla esmectita, y mezclas de estos. En otro aspecto, los conjugados de arcilla de tinte incluyen arcillas de tinte seleccionadas del grupo que consiste en uno de los tintes catióni-cos/básicos seleccionados del grupo que consiste en C.l. amarillo básico 1 a 108, C.l. naranja básico 1 a 69, C.l. rojo básico 1 a 118, C.l. violeta básico 1 a 51 , C.l. azul básico 1 a 164, C.l. verde básico 1 a 14, C.l. marrón básico 1 a 23, Cl negro básico 1 a 11 , y una arcilla seleccionada del grupo que con-siste en arcilla montmorillonita, arcilla hectorita, arcilla saponita y mezclas de estos. En todavía otro aspecto, conjugados de arcilla de tinte seleccionados del grupo consistente de: azul básico montmorillonita B7 C.l. 42595 conjugado, azul básico montmorillonita B9 C.l. 52015 conjugado, violeta básico montmorillonita V3 C.l. 42555 conjugado, verde básico montmorillonita G1 C.l. 42040 conjugado, rojo básico montmorillonita R1 C.l. 45160 conjugado, montmorillonita C.l. conjugado de negro básico 2, azul básico hectorita B7 C.l. 42595 conjugado, azul básico hectorita B9 C.l. 52015 conjugado, violeta básico hectorita V3 C.l. 42555 conjugado, verde básico hectorita G1 C.l. 42040 conjugado, rojo básico hectorita R1 C.l. 45160 conjugado, hectorita C.l. conjugado de negro básico 2, azul básico saponita B7 C.l. 42595 conjugado, azul básico saponita B9 C.l. 52015 conjugado, violeta básico saponita V3 C.l. 42555 conjugado, verde básico saponita G1 C.l. 42040 conjugado, rojo básico saponita R1 C.l. 45160 conjugado, saponita C.l. negro básico 2 conjugado y mezclas de estos.

. Los pigmentos apropiados incluyen pigmentos seleccionados del grupo que comprende flavantrona, indantrona, indantrona clorinada que contiene entre 1 y 4 átomos de cloro, pirantrona, dicloropirantrona, monobromodicloropi-rantrona, dibromodicloropirantrona, tetrabromopirantrona, diimida de ácido perile-no-3,4,9,10-tetracarboxílico, en donde los grupos imida pueden estar no sustituidos o sustituidos por alquilo de C1-C3 o un radical fenilo o heterocíclico, y en donde los radicales fenilo y heterociclicos también pueden incluir sustituyentes que no confieren solubilidad en agua, amidas de ácido antrapirimidinocarboxílico, violantrona, isoviolantrona, pigmentos de dioxazina, ftalocianina de cobre que puede contener hasta 2 átomos de cloro por molécula, ftalocianina de policloro-cobre o ftalocianina de polibromocloro-cobre que contiene hasta 14 átomos de bromo por molécula, y mezclas de estos.

En otro aspecto, los pigmentos adecuados incluyen pigmentos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en azul ultramar (C.l. pigmento azul 29), violeta ultramar (C.l. pigmento violeta 15) y mezclas de estos.

Los agentes tonalizadores de telas antes mencionados pueden usarse en combinación (puede usarse cualquier mezcla de agentes tonaliza- dores de telas). Los agentes tonalizadores de telas apropiados pueden adquirirse a través de Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.; Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suiza; BASF, Ludwigshafen, Alemania; Dayglo Color Corporation, Mumbai, India; Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, EE. UU.; Dystar, Frankfurt, Alemania; Lanxess, Leverkusen, Alemania; Megazyme, Wicklow, Irlanda; Clariant, Muttenz, Suiza; Avecia, Manches-ter, Reino Unido; o pueden elaborarse de acuerdo con los ejemplos incluidos en la presente. Los agentes tonalizadores adecuados se describen con mayor detalle en la patente de los EE. UU. núm. 7,208,459 B2.

Método de Prueba 1 A continuación, se incluye un protocolo para definir si un mate-rial colorante o pigmento es un agente tonalizador de telas a los fines de la invención: Se llenan dos recipientes Tergot-o-meter con 800 mi de agua potable de Newcastle upon Tyne, Reino Unido (dureza total -12 granos por galón americano distribuida por Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, Reino Unido). 2) Se introducen los recipientes en el Tergot-o-meter con una temperatura de agua controlada de 30 °C y una agitación configurada en 40 rpm durante todo el experimento. 3) Se agregan 4.8 g de detergente IEC-B (IEC 60456 detergente base de referencia para lavadora automática de tipo B), provisto por wfk, Brüggen-Bracht, Alemania, en cada recipiente. ) Después de dos minutos se agrega 2.0 mg de colorante activo al primer recipiente.

) Después de un minuto, se agrega 50 g de tela de algodón plana (suministrada por Warwick Equest, Consett, County Durham, Reino Unido), cortada en muestras de 5 cm x 5 cm, para cada recipiente.

) Después de 10 minutos se drenan los recipientes y se llenan nuevamente con agua fría (16 °C) que tiene una dureza de agua de 14.4 grados Clark con una relación molar calcio a magnesio de 3:1.

) Después de enjuagar durante 2 minutos, se retira la tela. ) Se repiten las etapas 3-7 para tres ciclos adicionales y se usan los mismos tratamientos.

) Las telas se retiran y se secan bajo techo por 12 horas. 0) Se analiza las muestras mediante un espectrómetro Hunter Miniscan equipado con iluminador D65 y filtro de recorte UVA, para obtener valores de Hunter a (eje rojo-verde) y Hunter b (eje amarillo-azul). 1 ) Se promedia los valores de Hunter a y Hunter b para cada serie de telas. Si las telas tratadas con el colorante evaluado muestran una diferencia de tono promedio mayor que 0.2 unidades, ya sea en el eje a o el eje b, se lo considera un agente tonalizador de telas a los fines de la invención.

La composición de limpieza puede contener, además, aditivos, tales como aditivos basados en carbonato, bicarbonato o silicatos que pueden ser zeolitas, tales como zeolita A, zeolita MAP (aluminio máximo tipo P). Las zeolitas, útiles en lavandería tienen, preferentemente, la fórmula ?3? 2(???2)?2(d??2)?2·27?2? y el tamaño de partícula es, usualmente, de 1-10 pm para la zeolita A y de 0.7-2 pm para la zeolita MAP. Otros aditivos son metasilicato de sodio (Na2Si03 · DH20 o Na2Si205 · n H20) y álcalis fuertes, preferentemente, usados en el lavado de vajilla. En modalidades preferidas, la cantidad de aditivo detergente puede ser mayor que 5 %, mayor que 10 %, mayor que 20 %, mayor que 30 %, mayor que 40 % o mayor que 50 %, y puede ser menor que 80 %, 65 %. En un detergente lavavajillas, el nivel de aditivo es, típicamente, 40-65 %, particularmente, 50-65 % o incluso 75-90 %.

La composición puede comprender un encapsulado. En un aspecto el encapsulado comprende un núcleo y una lámina que tiene una super-ficie interna y una superficie externa; esa lámina encapsula a ese núcleo.

En un aspecto de ese encapsulado, ese núcleo puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en perfumes; abrillantadores; tintes; repelentes de insectos; siliconas; ceras; saborizantes; vitaminas; agentes para suavizar telas; agentes para el cuidado de la piel, en un aspecto, parafinas; enzimas; agentes antibacterianos; blanqueadores; agentes de sensación en la piel; y mezclas de estos, y esa lámina puede comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenos; poliamidas; poliesti-renos; polüsoprenos; policarbonatos; poliésteres; poliacrilatos; aminoplastos; en un aspecto ese aminoplasto puede comprender una poliurea, poliuretano y/o poliurea-uretano; en un aspecto esa poliurea puede comprender polioxi-metilenurea y/o melamina formaldehído; poliolefinas; polisacáridos, en un aspecto ese polisacárido puede comprender alginato y/o quitosana; gelatina; goma laca; resinas epoxi; polímeros de vinilo; inorgánicos insolubles en agua, silicona; y mezclas de estos.

En un aspecto del encapsulado, el núcleo puede comprender perfume.

En un aspecto del encapsulado, la cubierta puede comprender formaldehído de melamina y/o formaldehído de melamina reticulado.

En un aspecto los encapsulados adecuados pueden comprender un material de núcleo y una cubierta; se describe esa lámina que rodea al menos parcialmente a ese material de núcleo. Al menos 75 %, 85 % o incluso 90 % de esos encapsulados pueden tener una resistencia a la fractura de aproximadamente 0.2 MPa a aproximadamente 10 MPa, de aproximadamente 0.4 MPa a aproximadamente 5 MPa, de aproximadamente 0.6 MPa a aproximadamente 3.5 MPa o incluso de aproximadamente 0.7 MPa a aproximadamente 3 MPa; y una fuga del agente benéfico de 0 % a aproximadamente 30 %, de 0 % a aproximadamente 20 % o incluso de 0 % a aproximadamente 5 %.

En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o incluso 90 % de esos encapsulados puede tener un tamaño de partícula de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 80 micrómetros, de aproximadamente 5 micrómetros a 60 micrómetros, de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros o incluso de aproximadamente 15 micrómetros a aproximadamente 40 micrómetros.

En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o incluso 90 % de esos encapsulados puede tener un grosor de pared de partícula de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 180 nm o incluso de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 160 nm.

En un aspecto, el material de núcleo de esos encapsulados puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en una materia prima de perfume y/u, opcionalmente, un material seleccionado del grupo que consiste en aceite vegetal que incluye aceites vegetales puros y/o mezclados que incluyen aceite de ricino, aceite de nuez de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de uva, aceite de semilla de colza, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de palma, aceite de linaza, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de nuez de coco, aceite de palmiste, aceite de ricino, aceite de limón y mezclas de estos; ésteres de aceites vegetales, ésteres que incluyen adipato de dibutilo, ftalato de dibutilo, bencil butil adipato, bencil octil adipato, fosfato de tri-cresilo, fosfato de trioctilo y mezclas de estos; hidrocarburos de cadena lineal o ramificada, que incluyen aquellos hidrocarburos de cadena lineal o ramificada que tienen un punto de ebullición mayor que aproximadamente 80 °C; terfenilos parcialmente hidrogenados, ftalatos de dialquilo, bifenilos de alquilo que incluyen monoisopropilbifenilo, naftaleno alquilado que incluye dipropilnaftaleno, alcoholes de petróleo que incluyen kerosene, aceite mineral y mezclas de estos; solventes aromáticos que incluyen benceno, tolueno y mezclas de estos; aceites de silico-na; y mezclas de estos.

En un aspecto, el material de pared de esos encapsulados pue-de comprender una resina adecuada que incluye el producto de reacción de un aldehido y una amina, los aldehidos adecuados incluyen formaldehído. Las aminas apropiadas incluyen melamina, urea, benzoguanamina, glicoluril, y mezclas de estos. Las melaminas apropiadas incluyen melamina de meti-lol, melamina de metilol metilado, melamina ¡mino y mezclas de estos. Las ureas adecuadas incluyen urea dimetilol, úrea de dimetilol metilado, urea-resorcinol, y mezclas de estas.

En un aspecto, los depuradores de formaldehído adecuados pueden usarse con los encapsulados, por ejemplo, en una suspensión de cápsula y/o añadirse en un producto de consumo antes, durante o después de añadir los encapsulados en ese producto de consumo.

Las cápsulas adecuadas pueden elaborarse según las enseñanzas de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2008/0305982 A1 ; y/o la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2009/0247449 A1. Alternativamente, las cápsulas adecuadas pueden adquirirse de Appleton Papers Inc. of Appleton, Wisconsin EE. UU.

Además, los materiales para preparar los encapsulados mencionados anteriormente pueden obtenerse de Solutia Inc. (St Louis, Missouri EE. UU.), Cytec Industries (West Paterson, New Jersey, EE. UU.), sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri EE. UU.), CP Kelco Corp. de San Diego, California, EE. UU.; BASF AG de Ludwigshafen, Alemania; Rhodia Corp. de Cranbury, Nueva Jersey, EE. UU; Hercules Corp. de Wilmington, Delaware, Estados Unidos; Agrium Inc. de Calgary, Alberta, Canadá, ISP de New Jersey, EE. UU., Akzo Nobel de Chicago, IL, EE. UU.; Stroever Shellac Bremen de Bremen, Alemania; Dow Chemical Company de Midland, MI, EE. UU.; Bayer AG de Leverkusen, Alemania; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, EE. UU.

En un aspecto la composición puede comprender un estabilizador de enzimas seleccionado del grupo que consiste en (a) sales inorgánicas seleccionadas del grupo que consiste en sales de calcio, sales de magnesio y mezclas de estos; (b) carbohidratos seleccionados del grupo que consiste en oligosacáridos, polisacáridos y mezclas de estos; (c) inhibidores de proteasa reversibles de masa seleccionados del grupo que consiste en ácido fenilborónico y derivados de estos; y (d) mezclas de estos.

En otra modalidad, la composición comprende: (1) inhibidores de proteasa reversibles tal como un compuesto que contiene boro; (2) 1-2 propanodiol; (3) formiato de calcio y/o formiato de sodio; y (4) cualquier combinación de estos.

En un aspecto la composición puede comprender un agente estruc-turante del grupo que consiste en diglicéridos y triglicéridos, diestearato de etilen-glicol, celulosa microcristalina, materiales a base de celulosa, microfibra de celulosa, biopolímeros, goma xantana, goma gelana y mezclas de estos.

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos son carboximetilcelulosa, pol¡(vinil-pirrolidona), poli (etilenglicol), poli(alcohol vinilico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxi- latos tal como poliacrilatos, copolímeros de maleico/ácido acrílico y copolí- 5 meros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.

El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H202, tal como perborato o percarbonato, que puede combinarse con un activador de blanqueador formador de peráci- do tal como tetraacetiletilendíamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Altérnal o tivamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácídos, por ejemplo, del tipo de amida, ¡mida o sulfona.

. Generalmente, cuando se usa un agente blanqueador, las composiciones de la presente invención pueden comprender de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50 % o incluso de aproximadamente 15 0.1 % a aproximadamente 25 % del agente blanqueador en peso de la composición limpiadora.

Las variantes de enzimas de la invención se pueden estabilizar con agentes estabilizantes convencionales y/o inhibidores de proteasa, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol sacaro-20 so, sales tales como cloruro de sodio y cloruro de potasio, ácido láctico, ácido fórmico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático o un derivado del ácido fenil borónico, tal como ácido 4- formilfenil borónico o un aldehido peptídico tal como aldehidos di, tri o tetrapep- tídicos o aldehidos análogos (ya sea de la forma B1-B0-R, en donde R es H, CH3, CX3, CHX2 o CH2X (X=halógeno), B0 es un residuo aminoacídico sencillo (preferentemente, con una cadena lateral aromática o alifática opcionalmente sustituida); y B1 consiste en uno o más residuos aminoacidicos (preferentemen-te, uno, dos o tres), que opcionalmente comprenden un grupo de protección N-terminal o tal como se describió en las patentes núm. WO09118375 y W098/ 3459) o un inhibidor de proteasa del tipo de proteína tal como RASI, BASI, WASI (inhibidores de alfa-amilasa/subtilisina bifuncionales del arroz, cebada y trigo) o CI2 o SSI. La composición se puede formular tal como se des-cribe, por ejemplo, en la patente núm. WO 92/19709 y patente núm. WO 92/19708 o en la patente de los EE. UU. núm. 6472364. En algunas modalidades, las enzimas usadas en la presente descripción se estabilizan por medio de la presencia de fuentes de iones zinc (II), calcio (II) y/o magnesio (II) solubles en agua en las composiciones terminadas que proveen dichos iones a las enzimas además de otros iones metálicos (p. ej., bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estaño (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) y oxova-nadio (IV)).

La composición puede contener, además, otros ingredientes detergentes convencionales, por ejemplo, acondicionadores de telas que inclu-yen arcillas, reforzadores de espuma, reductores de espuma, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes antiredepósito de suciedad, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de deslustre, solventes orgánicos tales como etanol o perfumes. Además, el detergente podría contener un eliminador de manchas o un reforzador que se añade al lavado para aumentar el nivel de limpieza general; algunos de estos aditivos pueden usarse, además, como agente de pretratamiento aplicado a la tela antes de la etapa de lavado.

Actualmente se contempla que en las composiciones detergentes cualquier enzima, particularmente la enzima de la invención puede añadirse en una cantidad que corresponde a 0.001-100 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, preferentemente, 0.005-5 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, con mayor preferencia, 0.01-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado y, particularmente, 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado. Sin embargo, las composiciones de la presente invención comprenden al menos 0.0001 a aproximadamente 0.1 % por ciento en peso de proteína de enzima pura, tal como de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 0.01 %, de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.01 % o de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.01 %. Sin embargo, cuando se usa una enzima formulada la composición detergente comprende de aproximadamente 0.02 % a aproximadamente 20 % por ciento en peso, tal como de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 15 % en peso o de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20 % o de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 5 % o de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 3 %.

Las variantes de alfa-amilasa útiles en la presente invención pueden incorporarse, adicionalmente, en las formulaciones detergentes des- critas en la patente núm. WO 97/07202 incorporada en la presente descripción como referencia.

La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, en forma de barra, tableta, polvo, grá-nulo, pasta, gel o líquido. La composición puede ser un agente de lavado "de gran rendimiento" multipropósito en polvo, multipropósito en pasta, de tipo líquido de gran rendimiento, un líquido para telas finas, un agente para el lavado manual de vajilla, un agente de bajo rendimiento para el lavado de vajilla, un agente de alta espuma, un agente para el lavado automático de vajilla, una tableta, un agente granular para el lavado de vajilla, un liquido para el lavado de vajilla, un agente auxiliar de enjuague. La composición puede estar, además, en envases de dosis unitarias que incluyen aquellos conocidos en la industria y los que son solubles en agua, insolubles en agua y/o permeables al agua. Un detergente liquido puede ser acuoso, típicamente, contiene hasta 70 % de agua y 0-30 % de solvente orgánico o no acuoso o una solución que contiene más de 0.5 g/l de la composición detergente.

La composición de la invención puede formularse, por ejemplo, como una composición detergente para lavado manual o automático que incluye una composición aditiva para lavandería adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante de telas que se añade en el enjuague o puede formularse como una composición detergente para usar en operaciones generales de limpieza de superficies duras en el hogar o formularse para operaciones de lavado manual o automático de vajilla. El detergente puede ser estar en forma granulada o en polvo o puede estar en forma de un líquido, gel o pasta o en la forma de un producto de dosis unitaria tal como una tableta o bolsita que incluye bolsitas de compartimentos múltiples o el detergente puede estar en la forma de un lienzo.

Ejemplo de composición detergente para lavandería Las siguientes composiciones son composiciones detergentes líquidas para lavandería particularmente adecuadas para máquinas lavadoras automáticas de carga superior (1 y 2) y máquinas lavadoras de carga frontal (3), respectivamente.

El copolimero de injerto aleatorio es un copolimero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es aproximadamente 6000 y la relación de peso del óxido de polietileno a acetato de polivinilo es aproximadamente 40 a 60 y no mayor que 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno.

Polietilenimina (MW = 600) con 20 grupos de etoxilato por -NH.

El polímero anfifilico limpiador de grasa alcoxilado es una polietilenimina (MW = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH Ejemplos de detergentes para máquinas lavaplatos Los siguientes ejemplos de detergentes para máquinas lavapla- 4 - 8 están en forma de geles. 1 Comercializado con el nombre comercial Polytergent® SLF-18 por BASF, Ludwigshafen, Alemania. 2 Comercializado por Novozymes A/S, Dinamarca. 3 Proteasa encapsulada de esta invención 4 Comercializado por Genencor International, California, EE. UU. Los globulillos de proteasa adecuados se comercializan con los nombres comerciales FN3® y Properase®. 6 Comercializado por Aleo Chemical, Tennessee, EE. UU.

^ Un polímero de este tipo adecuado es el que se vende con el nombre comercial Aqualic TL de Nippon Shokubai, Japón. 8 Comercializado por Arch Chemicals Incorporated, Smyrna, Georgia, EE. UU.

Comercializado por Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania, EE. UU.

El silicato 2.0R es suministrado por PQ Corporation, Malvern, PA. EE. UU.

El carbonato de sodio es suministrado por Solvay, Houston, Texas, EE. UU.

El percarbonato sódico (2Na2C03.3H202) es suministrado por Solvay, Houston, Texas, EE. UU.

El difosfonato de hidroxietano (HEDP) es distribuido por Dow Chemical, Midland, Michigan, EE. UU.

Composiciones detergentes lavavajillas La enzima de la invención puede usarse, además, en composiciones detergentes para el lavado de vajilla que incluyen las siguientes: 1) Composición en polvo para máquina lavaplatos automática 2) Composición en polvo para máquina lavaplatos automática ) Composición en polvo para máquina lavaplatos automática ) Composición en polvo para máquina lavaplatos automática 5) Composición en polvo para máquina lavaplatos automática 6) Composición para lavaplatos en polvo y liquida con sistema surfactante de limpieza ) Composición líquida no acuosa para máquina lavaplatos automática ) Composición líquida tixotrópica para máquina lavaplatos automática 0) Composición liquida para máquina lavaplatos automática 1 1 ) Composición liquida para máquina lavaplatos automática que contiene partículas de blanqueador protegidas 12) Composiciones para máquina lavaplatos automática tal como se describe en 1 ), 2), 3), 4), 6) y 10), en donde el perborato se reemplaza por percarbonato. 13) Composiciones para máquina lavaplatos automática tal como se describen en 1) - 6) que contienen, adicionalmente, un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, por ejemplo, uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature, 369, 1994, págs. 637-639.

La presente invención está dirigida, además, a métodos para usar composiciones que comprenden las variantes de alfa-amilasa para limpieza.

Las alfa-amilasa variantes se incorporan, preferentemente, en y/o se usan junto con composiciones detergentes, por ejemplo, composiciones detergentes para lavandería, por ejemplo, composiciones detergentes para lavandería casera, especialmente, composiciones detergentes líquidas para lavande- ría. Particularmente, el detergente comprende al menos un agente quelante y la composición detergente comprende, típicamente, auxiliares/ingredientes detergentes convencionales, tales como surfactantes (aníónico, catiónico, no iónico, zwitteriónico, anfotérico), aditivos, blanqueadores, polímeros, otras enzimas y otros ingredientes, por ejemplo, tal como se describen en las patentes núm. WO 2007/130562 y WO2007/149806 incorporadas en su totalidad en la presente descripción como referencia. Por lo tanto, en un aspecto útil de la presente invención se provee un método de limpieza que comprende añadir a un proceso de limpieza una composición de conformidad con la invención. En modalidades pre-feridas, ese proceso de limpieza se selecciona del grupo que consiste en al menos una etapa de limpieza en un proceso de lavandería, lavado de vajilla, proceso de limpieza institucional o industrial.

Debido a su actividad a valores alcalinos, las a-amilasas de la invención son muy adecuadas para usar en varios procesos industriales, particu-larmente, la enzima se aplica potencialmente como un componente en composiciones detergentes para lavado, lavado de vajilla y limpieza de superficies duras, pero puede ser útil, además, en la producción de edulcorantes y etanol a partir de almidón. Las condiciones para los procesos convencionales de conversión de almidón y licuación de gases y/o sacarificación se describen, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm. 3,912,590 y en las publicaciones de patentes europeas núms. 252,730 y 63,909.

Material y métodos Enzimas: SP722: La SEQ ID NO: 6, disponible de Novozymes, y descrita en la patente núm. WO 95/26397.

SP707 o núm. 707: SEQ ID NO: 8 AA560: SEQ ID NO: 10 Métodos generales de biología molecular: A menos que se mencione de cualquier otra forma, las manipulaciones y transformaciones del ADN se realizaron con métodos estándar de biología molecular (Sambrook y col. (1989); Ausubel y col. (1995); Harwood y Cutting (1990).

Fermentación de alfa-amilasas y variantes La fermentación puede realizarse por métodos muy conocidos en la industria o de la siguiente manera. Una cepa de B. subtilis que contiene el plásmido de expresión relevante se siembra en estrías en una placa de LB-agar con un antibiótico relevante y se cultiva de la noche a la mañana a 37 °C. Las colonias se transfirieren a 100 mi de medio BPX suplementado con un antibiótico relevante (por ejemplo, 10 mg/l de cloranfenicol) en un matraz de agitación de 500 mi.

Composición del medio BPX: Almidón de papa 100 g/l Harina de cebada 50 g/l BAN 5000 SKB 0.1 g/l Caseinato de sodio 10 g/i Harina de frijol de soja 20 g/i Na2HP04, 12 H20 9 g/i Agente antiespumante 0.1 g/" El cultivo se agita a 37 "C a 270 rpm por 4 a 5 días.

Las células y residuos de células se eliminan del caldo de fermentación por centrifugación a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado se concentra y se lava en un filtro UF (membrana con un corte de 10,000) y el amortiguador se cambia a acetato 20 mM pH 5.5, por ejemplo, mediante diáli-sis o filtración en gel. El filtrado de UF se aplica en S-sepharose F.F. (General Electric, intercambio de cationes, matriz, agarosa reticulada, grupo funcional: -OCH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO3) y se realiza la elución en etapas con 0.2 M NaCI en el mismo amortiguador. El eluido se dializa contra Tris 10 mM (2-amino-2-hidroximetil-propano-1 ,3-diol), pH 9.0 y se aplica sobre Q-sepharose F.F. (General Electric, intercambio de aniones, matriz: agarosa reticulada, grupo funcional: -OCHzCHOHC^OC^CHOHC^ ^CHsh) y se eluye con un gradiente lineal de 0-0.3 M NaCI sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones, que contienen la actividad (medida con el ensayo EnzCheck), se agrupan, el pH se ajusta hasta 7.5 y el color restante se elimina mediante trata-miento con 0.5 % p/vol. de carbón activo en 5 minutos. Además, puede ser ventajoso añadir una etapa adicional de intercambio de amortiguador, por ejemplo, mediante diálisis o filtración de gel a un sistema de amortiguador que no afecta el resultado de lavado propiamente dicho, por ejemplo, a un amortiguador EPPS, un amortiguador de glicina, un amortiguador de acetato o lo similar, preferentemente, con una pequeña concentración de calcio (p. ej., 0.1 mM) para estabilizar la amilasa durante el almacenamiento y aproxima-damente 0.01 % de Tritón X-100 para reducir el riesgo de adsorción de protei-na de enzima a los recipientes y pipetas.

Detergente modelo Composición del detergente modelo A: Composición del detergente modelo B: Ensayo para medir iones calcio libres.

El siguiente ensayo puede usarse para medir iones calcio libres en solución y, por lo tanto, para determinar la capacidad de los agentes quelantes (quelantes) para reducir la concentración de iones calcio libres (Ca2+), por ejemplo, de 2.0 mM a 0.10 mM a pH 8.

Principio del ensayo: Se añaden diversas cantidades de quelantes en una solución de Ca2+ 2.0 mM y la concentración de Ca2+ libre se determina mediante el uso de un electrodo selectivo de ion calcio a pH y temperatura fija. La con- centración de quelante necesaria para reducir la concentración de calcio libre de 2.0 mM a 0.10 mM puede determinarse a partir de un gráfico de la concentración de calcio libre medida en función de la concentración de quelante. En el ensayo de la presente, la concentración de quelante necesaria para reducir la concentración de calcio libre de 2.0 mM a 0.10 mM se mide a pH 8, a 21 °C, en cloruro de potasio y EPPS 49 mM.

SOLUCIONES: Solución electrolítica: Cloruro de potasio 4 M en agua ultrapura (agua Milli-Q).

Amortiguador pH 8: EPPS 50 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-propanosulfónico) ajustado a pH 8.0 con el uso de cantidades mínimas de hidróxido de sodio 1 N.

Solución de materia prima de calcio: Ca2+ 25 mM en amortiguador pH 8 elaborado con CaCI2-2H2O.

Solución de materia prima quelante: quelante 15 mM (sobre una base de quelante 100 % seco) en amortiguador pH 8, reajustado a pH 8.0 con el uso de cantidades mínimas de NaOH 1 M o HC1 1 M.

Para preparar todos los amortiguadores y soluciones se usa agua ultrapura (agua Milli Q).

EQUIPO: Electrodo selectivo de ion calcio de Thermo Scientific (cat. núm. 9720BNWP) calibrado contra una solución estándar de cloruro de calcio. El electrodo se calibra tal como se describió en las guias del electrodo.

PROCEDIMIENTO: Se prepara una serie de frascos, cada uno con un contenido de 4 mi de la solución de materia prima de calcio (concentración final de 2.0 mM), 1 mi de solución de electrólitos (concentración final de 80 mM de cloruro de potasio), solución de materia prima quelante en varias cantidades (0 - 45 mi) y amortiguador pH 8 para ajustar el volumen total a 50 mi. La concentración final de EPPS en el ensayo es de 49 mM.

Después del mezclado, la concentración de Ca2+ libre se mide por medio del electrodo de calcio. La concentración de calcio libre debería determi-narse a una cantidad suficiente de concentraciones de quelante diferentes para cada quelante probado para asegurar que el conjunto de datos abarque todo el intervalo, desde iones calcio libres 2.0 mM hasta un valor menor que 0.10 mM o que la concentración de quelante final en el ensayo sea mayor que 10.0 mM. Una cantidad adecuada de puntos de datos es de 8 o más. La concentración de quelante necesaria para reducir los iones calcio libres 2.0 mM a 0. 0 mM se obtiene a partir de una gráfica de la concentración de iones calcio libres medida en función de la concentración de quelante por interpolación.

Las soluciones se equilibran hasta la temperatura deseada que en el ensayo de la presente descripción es de 21 °C.

Determinación de loqK Los agentes quelantes pueden caracterizarse, además, por la constante de unión del agente quelante (quelante) y iones calcio. Esta constante puede determinarse por medio de ITC (calorimetría de titulación isotér- mica) tal como describen AD Nielsen, CC Fuglsang y P Westh, Analytical Bio-chemistry Vol. 314 (2003) páginas 227-234 y T Wiseman, S Williston, JF Brandts y L-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 (1989) páginas 131-137.

Todas las botellas de plástico y la cristalería usada se levan con una solución de EDTA al 1 % (p/p) y, posteriormente, se enjuagan bien en agua ultrapura tratada Chelex 100 (agua Milli-Q). Las soluciones se almacenan en botellas plásticas y se mantienen a 5 °C hasta el uso.

AMORTIGUADORES: HEPES 20 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico), pH 8 preparado con agua ultrapura (agua Milli-Q) Glicina 20 mM, pH 10 preparada con agua ultrapura (agua Milli-Q) SOLUCIONES: 125 µ? de quelante en HEPES 20 mM, pH 8 o 125 µ? de quelante en glicina 20 mM, pH 10 - CaCI2 4 mM en HEPES 20 mM, pH 8 o CaCI2 4 mM en glicina 20 mM, pH 10 Agua ultrapura (agua Milli-Q) Todos los amortiguadores se pasan a través de columnas Chelex 100 (Sigma Aldrich C-7901 , matriz: poliestireno reticulado al 1 %, grupo activo de la matriz: ácido iminódiacético (forma sódica), unión de la matriz: a través del grupo metilo a anillos aromáticos) para eliminar los iones calcio. Todas las soluciones se desgasifican mediante agitación en vacio antes de los experimentos.

INSTRUMENTO: MCS-ITC (MicroCal Inc., Northampton, MA, EE. UU.) PROCEDIMIENTO La célula de referencia se llena con agua ultrapura (agua Milli-Q). La célula de muestra se llena con la solución quelante al pH seleccionado y la jeringa se llena con la solución de calcio al pH seleccionado. Las soluciones se equilibran hasta la temperatura deseada, por ejemplo, 19 °C.

Después, la solución quelante en la célula de muestra se titula con 30-40 alícuotas de 8 µ? de la solución de calcio.

Las señales obtenidas a partir del ITC se integran, después, con el programa Origin suministrado por MicroCal Inc. Para obtener las isotermas de unión se realizan rutinas de regresión con el mismo paquete de software. Después, estos datos se incorporan en un modelo con el uso de las rutinas incorporadas en el software Origin. Actualmente, se prefiere usar el modelo "OneSites" que provee la mejor incorporación para la mayoría de los agentes quelantes usados comúnmente, es decir, los residuales se distribuyen en forma pareja alrededor de cero. A partir del valor de K se calcula el log K como el logaritmo (base 10) del valor K.

Ensayos para determinar el desempeño de lavado Para evaluar el desempeño de lavado de las variantes de alfa-amilasa en una composición detergente se pueden realizar experimentos de lavado. Las enzimas se prueban con el ensayo automático de estrés mecánico (AMSA, por sus siglas en inglés) o la prueba de desempeño con el uso de vasos. Con el AMSA se puede analizar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes que tienen enzimas de volumen reducido. La placa del AMSA tiene una cantidad de ranuras para soluciones de prueba y una tapa que aprieta firmemente la muestra de tela que se va a la- var contra todas las aberturas de la ranura. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de prueba, la tela y la tapa se agitan vigorosamente para poner la solución de prueba en contacto con la tela y aplicar estrés mecánico en una forma oscilante periódica y regular. Para una mayor descripción, ver la patente núm. WO 02/42740, especialmente, el párrafo "Modalidades especiales del método" en las páginas 23-24.

Descripción general del desempeño de lavado: Se prepara una solución de prueba que comprende agua (15°dH), 0.8 g/l de detergente, por ejemplo, el detergente modelo A o B tal como se describió anteriormente o HCO3- 50 mM y la enzima de la invención, por ejemplo, a una concentración de 0, 0.2, 0.4, 0.8 y/o 1.2 mg de proteína de enzima/L. Se añaden las telas manchadas con almidón (p. ej., CS-28 del Cen- ter For Test materials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Bajos) y se lavan por 30 minutos a 20 °C. Después de un enjuague profundo bajo - -agua-corriente y el secado en la oscuridad, se miden los valores de intensidad o reflectancia de la luz de las telas manchadas como una medida del desempeño de lavado. La prueba con 0 mg de proteína de enzima/l se usa como preforma para obtener un valor de remisión delta. Preferentemente, la acción mecánica se aplica durante la etapa de lavado- por ejemplo, en forma de agitación, rotación o agitación de la solución de lavado con la tela.

Los experimentos de desempeño de lavado con AMSA pueden realizarse en las condiciones de experimentación especificadas más abajo: Detergente Detergente modelo A o B Dosificación del detergente 0.8 g 1 Volumen de la solución de prueba 160 micro L PH como es Tiempo de lavado 30 minutos Temperatura 20 °C Dureza del agua 15°dH Concentración enzimática en la solución de prueba 0; 0.2; 0.4; 0.8; 1.2 mg/l Material de prueba CS-28 (almidón de arroz en algodón) La dureza del agua se ajustó a 15 °dH mediante la adición de CaCI2, MgCI2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+:HC03" = 4:1 :7.5, base molar) al sistema de prueba. Después del lavado, las telas se lavaron en agua del grifo y se secaron en la oscuridad.

El desempeño de la variante de enzima se mide como el brillo del color de la tela lavada con esa amilasa específica. El brillo puede expresarse, además, como la intensidad de la luz reflejada a partir de la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada la in-tensidad de la luz reflejada es más baja que la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede usarse para medir el desempeño de lavado de una amilasa.

Las mediciones de color se realizan con un escáner profesional de cama plana (Kodak ¡Qsmart, Kodak) que se usa para capturar una imagen de la tela lavada.

Para extraer un valor para la intensidad de la luz de las imágenes escaneadas, los valores de pixeles de 24 bits de la imagen se convierten en valores para rojo (r), verde (g) y azul (b) conocidos, además, como valores RGB. El valor de la intensidad (Int) se calcula al sumar los valores RGB juntos como vectores y tomar, después, la longitud del vector resultante: Telas: La muestra de telas CS-28 (almidón de arroz en algodón) se puede obtener de Center For Test materials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos.

La prueba de desempeño de lavado con vasos es un ensayo realizado en un modelo en escala pequeña de una máquina lavadora de carga superior usada para evaluar el desempeño de lavado de las amilasas. La prueba de desempeño de lavado en vaso que se realiza con vasos de 250 mi y un agitador de paleta que provee movimiento de rotación oscilante, 180° en cada dirección, con una frecuencia de 80 por minuto comprende las siguientes etapas: se proveen 100 mi de solución de lavado (6 °C, 15 °dH, pH 8.0) que contiene NaHC03 50 mM y 0.4 mg/l de enzima; se añaden dos muestras de CS-28 (5x5 cm) y dos muestras de EMPA 162 (5x5 cm) en la solución de lavado para comenzar el lavado; se configura la velocidad de agitación en 80 rpm; se detiene la agitación después de 60 minutos, se enjuagan las muestras en agua potable fría del grifo; se secan las muestras enjuagadas, en la oscuridad durante la noche; y se evalúa el desempeño de lavado mediante la medición de la remisión de la luz incidente a 460 nm con el uso de Color Eye tal como se describe más abajo.

Equipo y material Baño maría (5 °C) con circulación; vasos de vidrio (250 mi); un brazo rotativo por vaso con una capacidad de 100 mi de solución de lavado; muestras de prueba: CS-28 (almidón de arroz sobre algodón) de Center for Test materials BV, Vlaardingen, Países Bajos y EMPA 162 (almidón de arroz sobre algodón/poliéster) de EMPA Test materials AG, St. Gallen, Suiza, las muestras se cortan en tamaños de 5 x 5 cm.

Solución de lavado: Amortiguador NaHC03 50 mM, pH 8.0, du-reza del agua: 5 °dH, relación calcio:magnesio 4:1.

Solución de materia prima de amilasa: 1 mg de proteína de enzima por mi. Se usa una solución de 0.1 % (p/v) de Tritón X-100 y CaC 0.1 mM en agua ultrapura (agua MilliQ) para diluir la amilasa (amortiguador de dilución de la amilasa).

Medición del Color Eye El desempeño de lavado se expresa como un valor de remisión delta (ARem). Las evaluaciones de reflectancia de la luz de las muestras se realizaron con el uso de un espectrofotómetro de reflectancia Macbeth Color Eye 7000 con una abertura ovalada muy pequeña, es decir, 0.7 cm2 (-0.7 x 1.0 cm). Las mediciones se realizaron sin UV en la luz incidente y se obtuvo la remisión a 460 nm. La muestra a medir se colocó sobre la parte superior de otra muestra del mismo tipo antes de la medición para reducir el reflejo del émbolo que empuja la muestra hacia arriba contra la abertura de medición. Para calcular los valores de remisión delta para las muestras individuales se restó el valor de remisión de la muestra lavada sin adición de amilasa (control) del valor de remisión de la muestra lavada con amilasa.

Ensayos para la medición de la actividad amilolítica (actividad de alfa-amilasa) Ensayo EnzChek La actividad de amilasa o amilasa residual puede determinarse por medio del siguiente ensayo EnzCheck. El sustrato es un derivado de almidón de maíz, almidón DQ™ (conjugado de almidón de maíz BODIPY FL) que es un almidón de maíz marcado con tinte BODIPY® FL (ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico) hasta un nivel en el que se reduce la fluorescencia. Se disuelve un frasco que contiene aprox. 1 mg de sustrato liofilizado en 100 µ? de acetato de sodio 50 mM pH 4.0. El frasco se agita en vórtice durante 20 segundos y se deja a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezclado ocasional hasta que se disuelve. Después, se añade 950 pl de acetato de sodio 10 mM, 0.01 % (p/V) de Tritón X100 ((éter de polietilenglicol p-(1 ,1 ,3,3-tetrametilbutil)-fenílico (C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10)), pH 5.0, se agita bien en vórtice y se almacena a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que está listo para usar. A partir de 1 mi de esta solución se preparó la solución de trabajo del sustrato mediante el mezclado con 5 mi de HEPES 50 mM, 0.01 % (p/V) de Tritón X100, CaCI2 1 mM, pH 7.0.

El detergente que contiene enzimas se diluye hasta una concentración de 15 ng de proteína de enzima/ml (dilución de 6826.7 veces) en HEPES 50 mM, 0.01 % de Tritón X100, CaCI2 1 mM, pH 7.0.

Para el ensayo se mezcla 25 µ? de la solución de trabajo del sustrato durante 10 segundos con 25 pl de la enzima diluida en una placa de microtitulación de 384 pocilios negra. Se mide la intensidad de fluorescencia (excitación: 485 nm, emisión: 555 nm) una vez cada dos minutos durante 30 minutos en cada pocilio a 25 °C y se calcula la Vmáx como la pendiente del trazado de la intensidad de fluorescencia contra el tiempo. El trazado debería ser lineal y el ensayo de actividad residual debe ajustarse de modo que la solución de enzimas de referencia diluida esté dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

En unos pocos casos hay una interferencia significativa del detergente sin amilasa en el ensayo. En esos casos se pueden usar ensayos de ami-lasa alternativos. La interferencia de un detergente en un ensayo de amilasa se puede probar mediante la adición de una cantidad conocida de amilasa al detergente en dos niveles y, después, la medición de la actividad de las dos muestras. Si la diferencia en las actividades medidas corresponde a las diferencias en los niveles entre las amilasas añadidas, el ensayo puede usarse para determinar la actividad residual de la amilasa después del almacenamiento.

Ensayo PNP-G7 La actividad de la alfa-amilasa puede determinarse por medio de un método que usa el sustrato PNP-G7. PNP-G7 es la abreviatura de 4,6-etiliden(G7)-p-nitrofenil(Gi)-a,D-maltoheptaosida, un oligosacárido bloqueado que puede escindirse por la acción de una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el estuche digiere el sustrato hidrolizado aún más para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y, por lo tanto, puede medirse por medio de espectrometría visible a ?=405 nm (400-420 nm.). Los estuches que contienen sustrato PNP-G7 y alfa-glucosidasa son fabricados por Roche/Hitachi (cat. núm. 1876473).

REACTIVOS: El sustrato G7-PNP de este estuche contiene 4,6-etiliden-G7-PNP 22 mM y HEPES 52.4 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinil]-etanosulfónico), pH 7.0).

El reactivo alfa-glucosidasa contiene HEPES 52.4 mM, NaCI 687 mM, MgCI2 12.6 mM, CaCI2 0.075 mM, > 4 kU/L de alfa-glucosidasa).

La solución de trabajo del sustrato se prepara por medio del mezclado de 1 mi del reactivo de alfa-glucosidasa con 0.2 mi del sustrato G7-PNP. Esta solución de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes del uso.

Amortiguador de dilución: EPPS 50 mM, 0.01 % (p/v) de Tritón X100 (éter de polietilenglicol p-(1 , 1 ,3,3-tetrametilbutil)-feníl¡co (C14H220(C2H40)n (n = 9-10))), CaCI2 1 mM, pH 7.0.

PROCEDIMIENTO: La muestra de amilasa que se analizará se diluyó en amortiguador de dilución para asegurar que el pH en la muestra diluida sea 7. El ensayo se realizó mediante la transferencia de 20 µ? de muestras de enzimas diluidas a una placa de microtitulación de 96 pocilios y la adición de 80 µ? de solución de trabajo de sustrato. La solución se mezcló y preincubó 1 minuto a temperatura ambiente y la absorción se midió cada 20 s durante 5 minutos a OD 405 nm.

La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto de condiciones dado. La muestra de amilasa debería diluirse hasta un nivel en el cual la pendiente sea menor que 0.4 unidades de absorbancia por minuto.

Determinación de los puntos porcentuales (pp) La mejora en puntos porcentuales (pp) en la actividad residual (estabilidad) de la variante con respecto al genitor se calcula como la diferencia entre la actividad residual de la variante y la actividad residual del genitor, es decir, la actividad residual de la variante menos la actividad residual del genitor.

Ejemplos Ejemplo 1 : Preparación de variantes Las variantes de amilasa de la SEQ ID NO: 6 SP722 se prepararon por medio de procedimientos estándar; en síntesis: se introdujeron muta- ciones aleatorias y/o dirigidas al sitio en el gen, se transformaron células huésped de Bacillus subtilis con los genes mutados, se fermentaron las células huésped transformadas (p. ej., tal como se describe en el Ejemplo 1 de la patente núm. WO 2004/111220) y se purificó la amilasa a partir del caldo de fer-mentación. La amilasa de referencia (SEQ ID NO: 6) se produjo en forma re-combinante en Bacillus subtilis en forma similar.

Ejemplo 2. Caracterización de agentes quelantes Ejemplo 2a Medida de iones calcio libres Los agentes quelantes (quelantes) se pueden clasificar por medio de su capacidad para reducir la concentración de iones calcio libres (Ca2+) de 2.0 mM a 0.10 mM a pH 8 desarrollados a partir de un método descrito por M.K.Nagarajan y col., JAOCS, Vol. 61 , núm. 9 (septiembre de 1984), págs. 1475-1478. Se usó el ensayo descrito anteriormente en "Materiales y métodos" para medir iones calcio libres.

En consecuencia, la concentración de quelante necesaria para reducir la dureza de agua de 2.0 mM a 0.10 mM se determinó tal como se describió anteriormente. El experimento se realizó con el amortiguador de pH 8 a 21 °C.

Las concentraciones finales del quelante usado y la concentración de Ca2+ libre medida se indican en el cuadro I más abajo.

Cuadro I La concentración del Ca2+ libre se determinó en una mezcla de Ca2+ 2.0 mM y varias cantidades de agente quelante a pH 8.

A partir de estos datos se determinó la concentración de agente quelante necesaria para reducir la concentración de Ca2+ libre de 2.0 mM a menos de 0.10 mM por medio de interpolación y los resultados se presentan en el cuadro II.

Se caracterizaron varios quelantes con el uso de este ensayo y las concentraciones de quelante necesarias para reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a pH 8.0 en amortiguador HEPES 49 mM y cloruro de potasio 80 mM y se muestran en el cuadro II.

Cuadro II Ejemplo 2b.

Determinación de loq K Alternativamente, los agentes quelantes pueden caracterizarse por la constante de unión del agente quelante (quelante) y iones calcio. Esta constante puede determinarse por medio de ITC (calorimetría de titulación isotérmica) tal como describen AD Nielsen, CC Fuglsang y P Westh, Analyti-cal Biochemistry Vol. 314 (2003) páginas 227-234 y T Wiseman, S Williston, JF Brandts y L-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 (1989) páginas 131-137. Se describe el procedimiento para determinar el log K.

Con el uso de este procedimiento se determinaron los siguientes valores de log K a pH 10 (ver el cuadro III): Cuadro III Ejemplo 3. Actividad residual después de la incubación con agente quelante Ensayo EnzChek La actividad de amilasa o actividad de amilasa residual en la presente invención se determina mediante el ensayo EnzCheck tal como se describió anteriormente. Generalmente, la actividad de amilasa residual en el detergente modelo B se determinó después de la incubación a 31 °C durante 18 horas, después, la actividad se comparó con la actividad de una referencia incubada a 4 °C durante 18 horas tal como se describió anteriormente.

Prueba de la estabilidad de las variantes de amilasa en detergente con quelante Para determinar la estabilidad de la amilasa en detergente, las enzimas de prueba se ajustaron a una concentración de 0.6 mg/ml de proteína de enzima mediante dilución en HEPES 20 mM, 0.1 % (p/V) de Tritón X100, pH 8.0. Si la concentración inicial de amilasa es demasiado baja, puede concentrarse, por ultrafiltración (UF) con el uso de una membrana UF con un corte de 10 kDa.

Se transfirió 25 µ? de la solución de amilasa y 125 µ? de detergente (detergente modelo B) a una placa de microtitulaion de 96 pocilios en 4 réplicas. Se colocó un imán pequeño (5 x 2 mm) en cada pocilio y la combinación se mezcló por 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador magnético. Se prepararon dos placas idénticas. Una de las placas se incubó a 4 °C durante 18 horas (muestra de referencia) y la otra placa se incubó a 31 °C durante 18 horas (muestra a 31 °C).

Inmediatamente después de la incubación se analizaron las muestras sobre las placas para determinar la actividad de la amilasa tal co-mo se describe en el ensayo EnzCheck para determinar la actividad de la amilasa residual en detergentes. Debería notarse que para reducir la interferencia de otros ingredientes detergentes distintos a la enzima en el ensayo, tanto la referencia como la muestra a 31 °C se diluyeron hasta la misma concentración de proteínas. La actividad de las muestras de referencia y las muestras a 31 °C se determinó en la misma placa de 384 pocilios. Se aseguró que la amilasa de referencia estuviera incluida en todas las placas de mi-crotitulacíón de la prueba. La actividad residual se calculó como 100 * Vmáx(muestra a 31 °C) / VmáX(muestra de referencia).

El resultado se muestra en el cuadro IV con el uso de SP722 o SP722 + D183* G184* como la amilasa de referencia (parental). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la actividad residual de la variante con respecto a la amilasa parental se calcula como la diferencia entre el porcentaje de actividad residual de la amilasa variante y la amilasa parental.

Cuadro IV Actividad Mejora en pp en la actividad residual (%) residual con respecto a la amilasa parental Los resultados muestran claramente que las vanantes de la in-vención son considerablemente más resistentes a la presencia de agentes que-lantes fuertes que la alfa-amilasa de referencia. En pocos casos la actividad residual es mayor que 100 lo que refleja la varianza analítica del ensayo.

Los resultados muestran que las variantes de la invención, también a pH 8.0, tienen una mayor estabilidad en comparación con la alfa-amilasa de referencia que puede ser la SEQ ID NO: 6 SP722 o la SEQ ID NO: 6 + D183* G184* que es la SEQ ID NO: 6 de la cual se eliminó el aminoácido 183 y 184.

Ejemplo 4: Actividad residual después de la incubación con agente quelante a pH8 v pH10 En este ejemplo, el ensayo de PNP-G7 descrito anteriormente se usa para determinar la actividad de amilasa residual después de la incubación en presencia del agente quelante DTPA, pero el principio es el mismo que se aplicó anteriormente para determinar la actividad con el uso del ensayo Enz-Check. Generalmente, la actividad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en un amortiguador que contiene un agente quelante a pH 8 y 49 °C o pH 10 y 42 °C durante 1 hora y la actividad se compara, des- pués, con la actividad de una referencia incubada a 4 °C durante 1 hora tal como se describió anteriormente en "Materiales y métodos".

Prueba de la estabilidad de variantes de amilasa después de la incubación con un agente quelante a pH 8 y pH 10 en amortiguador Principio: Las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 8.0 con una concentración final de 1.5 % de DTPA a 49 °C durante 1 hora y las muestras de referencia se incubaron a 4 °C durante 1 h. Además, las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 10.0 con una concentración final de 1.5 % de DTPA a 42 °C durante 1 hora y las muestras de referencia correspondientes se incubaron a 4 °C durante 1 h. Después de la incubación se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

Reactivos: Amortiguador pH 8 con DTPA: EPPS 50 mM, 0.01 % de Tritón X100, 1.875 % de DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 8.0 Amortiguador pH 10 con DTPA: EPPS 50 mM, 0.01 % de Tritón X100, 1.875 % de DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 10.0 Soluciones de amilasa: 0.25 y 0.5 mg de proteína de amilasa activa/ mi en EPPS 5 mM, 0.01 % de Tritón X-100, pH 8.0 Procedimiento: Se transfirió 160 µ? de amortiguador (amortiguador pH 8 con DTPA o amortiguador pH 10 con DTPA) y 40 µ? de las soluciones de amilasa a una placa de microtitulación de 96 pocilios por PCR en duplicado y el conteni-do se mezcló durante 1 minuto (PCR: Reacción en cadena de la polimerasa). La concentración final de DTPA en cada pocilio fue de 1.5 %. Se transfirió 20 µ? de cada pocilio a una nueva placa de microtitulación por PCR (PCR MTP) que se colocó a 4 °C (muestra de referencia). La PCR MTP se incubó en la máquina para PCR durante 1 hora a 49 °C cuando el amortiguador tenía un pH 8.0 (muestras de pH 8, 49 °C) y durante 1 h a 42 °C cuando el amortiguador tenía un pH 10.0 (muestras de pH 0, 42 °C).

Inmediatamente después de la incubación, las muestras en las placas de PCR se diluyeron diez veces en amortiguador de dilución y se analizaron para determinar la actividad de la amilasa, tal como se describe en el ensayo PNP-G7. Debería notarse que para reducir la interferencia de otros agentes quelantes, aquí DTPA, en el ensayo, tanto las muestras de referencia como las muestras a pH 8, 49° C/pH 10, 42 °C se diluyeron hasta la misma concentración antes de analizarlas para determinar la actividad residual. La actividad de las muestras de referencia y las muestras a pH 8, 49 °C o pH 10, 42 °C se determinó en la misma placa de 96 pocilios. Se aseguró que la amilasa parental estuviera incluida en todas las placas de microtitulación de la prueba. La actividad residual se calculó como 100*Vmáx(müestra pH 8, 42 °C o pH 10, 49 °C) / Vmáx(muestra de referencia) y los resultados se muestran en el cuadro V. La mejora en puntos porcentuales (pp) se calcula como la actividad residual de la variante menos la actividad residual de la amilasa parental.

Cuadro V pH 8, 49 °C pH 10, 42 °C Actividad Mejora en pp de la variante Actividad Mejora en pp de la residual con respecto a la amilasa residual (%) variante con respecto a la (%) parental amilasa parental Enzima SP722 SP722+ SP722 SP722+ D183* D183* 184* 184* SP722 (parental) 1 SP722 + D183* G184* 20 20 0 (parental) SP722 + D183* G184* 97 96 77 93 85 73 N195F V206L Y243F SP722 + D183* G184* 97 96 77 100 92 80 N195F V206Y Y243F SP722 + D183* G184* 96 95 75 92 84 64 N195F V206N Y243F SP722 + D183* G184* 101 100 80 97 89 69 N195F V206F Y243F SP722 + D183* G184* 92 92 72 88 80 60 N195F V206H SP722 + D183* G184* 95 94 74 96 88 68 N195F V206Y SP722 + D183* G184* 87 86 66 89 81 61 V206F Y243F SP722 + D183* G184* 98 97 77 96 88 68 N195F V206L H210Y SP722 + D183* G 84* 79 78 58 73 65 45 S193T V206L SP722 + D183* G184* 90 89 69 83 75 55 G133E G149R N195Y Y203F V206L Los resultados muestran claramente que las variantes de la invención son altamente estables y tienen una actividad residual alta después de la incubación a pH 8 49 °C y pH 10 42 °C durante 1 hora, tanto cuando se comparan con las actividades residuales de las variantes y la parental como cuando se observa la mejora en puntos porcentuales de las vanantes. En comparación, la amilasa SP722 + D183* G184* tiene 20 % de actividad residual y SP722 tiene una actividad residual menor.

Ejemplo 5. Actividad residual después de la incubación en amortiguador con 1 .5 % (p/v) de DTPA a pH 8 y pH 10 En este ejemplo se usa el ensayo de PNP-G7 descrito anteriormente para determinar la actividad de la amilasa residual de las variantes de SP722 después de la incubación en presencia del agente quelante DTPA. Ge-neralmente, la actividad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en un amortiguador que contenía un agente quelante a pH 8 o pH 10 a las temperaturas y tiempos de incubación indicados y, después, la actividad se comparó con la actividad de una referencia incubada a 4 °C tal como se describió anteriormente en Materiales y métodos.

Prueba de la estabilidad de variantes de amilasa después de la incubación con un agente quelante a pH 8 y pH 10 en amortiguador PRINCIPIO: Las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 8.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de DTPA a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de referencia se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Además, las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 10.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de DTPA a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de refe- rencia correspondientes se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Después de la incubación se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

REACTIVOS: Amortiguador pH 8 con DTPA: EPPS 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 8.0 Amortiguador pH 10 con DTPA: Glicina 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) de DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 10.0 Soluciones de amilasa: 0.25 y 0.5 mg de proteína de amilasa activa/ mi en EPPS 5 mM, 0.01 % de Tritón X-100, pH 8.0 PROCEDIMIENTO: Se transfirió 160 µ? de amortiguador (amortiguador pH 8 con DTPA o amortiguador de pH 10 con DTPA) y 40 µ? de las soluciones de amilasa a una placa de microtitulación de 96 pocilios por PCR en duplicado y el contenido se mezcló durante 1 minuto (PCR: Reacción en cadena de la polimerasa). La concentración final de DTPA en cada pocilio fue de 1.5 % (p/v). Se transfirió 20 µ? de cada pocilio a una placa de microtitulación (MTP) que se colocó a 4 °C (muestra de referencia). La MTP PCR (muestra con estrés) se incubó en la máquina de PCR tal como se indica en el cuadro incluido más abajo.

Inmediatamente después de la incubación, las muestras en las placas de PCR se diluyeron diez veces en amortiguador de dilución y se analizaron para determinar la actividad de la amilasa, tal como se describe en el ensayo PNP-G7. Debería notarse que para reducir la interferencia del agente quelante, aquí DTPA, en el ensayo, tanto la muestra de referencia como la muestra con estrés se diluyeron hasta la misma concentración antes de analizarlas para de-terminar la actividad residual. La actividad de la muestra de referencia y la muestra con estrés se determinó en la misma placa de 96 pocilios. Se aseguró que la amilasa parental estuviera incluida en todas las placas de microtitulación de la prueba. La actividad residual se calculó como 100*Vmáx(muestra con estrés) / Vmáx(muestra de referencia). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la estabi-lidad de las variantes con respecto a la amilasa parental se calcula como la actividad residual de la variante menos la actividad residual de la amilasa parental. Los resultados se muestran en el cuadro 5.1 Cuadro 5.1 : Variantes SP722 con quelante de DTPA A partir de las actividades residuales se muestra claramente que las variantes de SP722 son más estables en presencia de DTPA que se refleja, además, en las mejoras en puntos porcentuales en la estabilidad de la variante en comparación con enzima la parental.

Ejemplo 6: Actividad residual después de la incubación con HEDP a pH 10 En este ejemplo, el ensayo de PNP-G7 descrito anteriormente se usa para determinar la actividad de la amilasa residual después de la incubación en presencia del agente quelante HEDP. Generalmente, la actividad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en un amortiguador que contenía un agente quelante a pH 10 a las temperaturas y tiempos de incubación indicados y, después, la actividad se comparó con la actividad de una referencia incubada a 4 °C tal como se describió anteriormente en Materiales y métodos.

Prueba de la estabilidad de variantes de amilasa después de la incubación con un agente quelante a pH 10 en amortiguador PRINCIPIO: Las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 10.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de HEDP a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de referencia se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Después de la incubación se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

REACTIVOS: Amortiguador pH 10 con HEDP: Glicina 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) HEDP (ácido 1-hidroxietilidendifosfónico, núm. de cas 2809-21-4), pH 10.0 Soluciones de amilasa: 0.25 y 0.5 mg de proteína de amilasa activa/ mi en EPPS 5 mM, 0 (p/v).01 % de Tritón X-100, pH 8.0 PROCEDIMIENTO: Se transfirió 160 µ? de amortiguador (amortiguador pH 10 con HEDP) y 40 µ? de las soluciones de amilasa a una placa de microtitulación de 96 pocilios por PCR en duplicado y el contenido se mezcló durante 1 minuto (PCR: Reacción en cadena de la polimerasa). La concentración final de HEDP en cada pocilio fue de 1.5 % (p/v). Se transfirió 20 pl de cada pocilio a una placa de microtitulación (MTP) que se colocó a 4 °C (muestra de referencia). La MTP PCR (muestra con estrés) se incubó en la máquina de PCR tal como se indica en el cuadro 6.1 incluido más abajo. La actividad residual se calculó como 100*Vmáx(muestra con estrés) / Vmáx(muestra de referencia). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la estabilidad de las variantes con respecto a la amilasa parental se calcula como la actividad residual de la variante menos la actividad residual de la amilasa parental.

Cuadro 6.1 : SP722 y variante de esta con HEDP Los resultados muestran claramente que la variante es más estable cuando se incuba en presencia de HEDP en comparación con la enzima parental.

Ejemplo 7: Estabilidad de SP722+D183* G184* y variantes de esta con 1.5 % (p/v) de HEDP En este ejemplo, el ensayo de PNP-G7 descrito anteriormente se usa para determinar la actividad de la amilasa residual después de la incubación en presencia del agente quelante HEDP. Generalmente, la activi-dad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en un amortiguador que contenía un agente quelante a pH 8 o pH 10 a las temperaturas y tiempos de incubación indicados y, después, la actividad se comparó con la actividad de una referencia incubada a 4 °C tal como se describió anteriormente en Materiales y métodos.

Prueba de la estabilidad de variantes de amilasa después de la incubación con un agente quelante a pH 8 y pH 10 en amortiguador PRINCIPIO: Las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 8.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de HEDP a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de referencia se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Además, las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 10.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de HEDP a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de refe-rencia correspondientes se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Después de la incubación se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

REACTIVOS: Amortiguador pH 8 con HEDP: EPPS 50 mM, 0.01 % (p/v) Tri-ton X100, 1.875 % (p/v) DE HEDP (ácido 1-hidroxietilidendifosfónico, núm. de cas 2809-21-4), pH 8.0 Amortiguador pH 10 con HEDP: Glicina 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) HEDP (ácido 1-hidroxietilidendifosfónico, núm. de cas 2809-21-4), pH 10.0 Soluciones de amilasa: 0.25 y 0.5 mg de proteína de amilasa activa/ mi en EPPS 5 mM, 0 (p/v).01 % de Tritón X-100, pH 8.0 PROCEDIMIENTO: Se transfirió 160 µ? de amortiguador (amortiguador pH 8 con HEDP o amortiguador pH 10 con HEDP) y 40 µ? de las soluciones de amilasa a una placa de microtitulación de 96 pocilios por PCR en duplicado y el con-tenido se mezcló durante 1 minuto (PCR: Reacción en cadena de la polime-rasa). La concentración final de HEDP en cada pocilio fue de 1.5 % (p/v). Se transfirió 20 µ? de cada pocilio a una placa de microtitulación (MTP) que se colocó a 4 °C (muestra de referencia). La MTP PCR (muestra con estrés) se incubó en la máquina de PCR tal como se indica en el cuadro 7.1 incluido más abajo. La actividad residual se calculó como 100*Vmáx(muestra con estrés) / Vmáx(muestra de referencia). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la estabilidad de las variantes con respecto a la amilasa parental se calcula como la actividad residual de la variante menos la actividad residual de la amilasa parental.

Cuadro 7.1: Variantes SP722+D183* G184* con HEDP Los resultados muestran claramente que las variantes de SP722+D183* G184* son mucho más estables cuando se incuban en presencia de HEDP como agente quelante.

Ejemplo 8: Estabilidad de variantes AA560 en presencia de 1.5 % (p/v) de DTPA o 1.5 % (p/v) de HEDP En este ejemplo se usa el ensayo PNP-G7 descrito anteriormente para determinar la actividad de la amilasa residual después de la incubación en presencia del agente quelante DTPA o HEDP. Generalmente, la actividad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en un amortiguador que contenía un agente quelante a pH 8 o pH 10 a las tempe-raturas y tiempos de incubación indicados y, después, la actividad se comparó con la actividad de una referencia incubada a 4 °C tal como se describió anteriormente en Materiales y métodos.

Prueba de la estabilidad de variantes de amilasa después de la incubación con un agente quelante a pH 8 y pH 10 en amortiguador PRINCIPIO: Las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 8.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de DTPA o HEDP a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de referencia se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Además, las muestras de enzimas se incubaron en amortiguador pH 10.0 con 1.5 % (p/v) de concentración final de DTPA o HEDP a la temperatura y tiempo de incubación indicados y las muestras de referencia correspondientes se incubaron a 4 °C en el mismo tiempo de incubación. Después de la incubación se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

REACTIVOS: Amortiguador pH 8 con DTPA: EPPS 50 mM, 0.01 % (p/v) Tri-ton X100, 1.875 % (p/v) DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 8.0 Amortiguador pH 10 con DTPA: Glicina 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) de DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético, núm. de cas 67-43-6), pH 10.0 Amortiguador pH 8 con HEDP: EPPS 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) DE HEDP (ácido 1-hidroxietilidendifosfónico, núm. de cas 2809-21-4), pH 8.0 Amortiguador pH 10 con HEDP: Glicina 50 mM, 0.01 % (p/v) Tritón X100, 1.875 % (p/v) HEDP (ácido 1-hidroxietilidendifosfónico, núm. de cas 2809-21-4), pH 10.0 Soluciones de amilasa: 0.25 y 0.5 mg de proteína de amilasa activa/ mi en EPPS 5 mM, 0 (p/v).01 % de Tritón X-100, pH 8.0 PROCEDIMIENTO: Se transfirió 160 µ? de amortiguador (amortiguador pH 8 con DTPA o HEDP o amortiguador pH 10 con DTPA o HEDP) y 40 µ? de las soluciones de amilasa a una placa de microtitulación de 96 pocilios por PCR en duplicado y el contenido se mezcló durante 1 minuto (PCR: Reacción en cadena de la polimerasa). La concentración final de DTPA o HEDP en cada pocilio fue de 1.5 % (p/v). Se transfirió 20 pl de cada pocilio a una placa de microtitulación (MTP) que se colocó a 4 °C (muestra de referencia). La MTP PCR (muestra con estrés) se incubó en la máquina de PCR tal como se indica en los cuadros 8.1 y 8.2 incluidos más abajo. La actividad residual se calculó como 100*Vmáx(muestra con estrés) / Vmax(muestra de referencia). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la estabilidad de las variantes con respecto a la amilasa parental se calcula como la actividad residual de la variante menos la actividad residual de la amilasa parental.

Cuadro 8.1 : Variantes de AA560 con DTPA Cuadro 8.2: Variantes de AA560 con HEDP pH 8, 50 "C, 210 minutos, pH 10, 42 °C, 60 minutos, 1.5 % de HEDP 1.5 % de HEDP Enzima Actividad Mejora en pp Actividad Mejora en pp residual (%) con respecto a residual (%) con respecto la enzima a la enzima parental parental Ejemplo 9: Actividad residual después de la incubación en detergente con agente quelante En este ejemplo se usa el ensayo PNP-G7 para determinar la actividad de la amilasa residual después de la incubación en el detergente en presencia de agentes quelantes, tal como se describe en el Ejemplo 5.

Generalmente, la actividad de la amilasa residual se determinó después de la incubación en el detergente C que contiene agentes quelantes DTPMP y HEDP a pH 8.2 después de 3 semanas y 6 semanas a 30 °C.

Después, la actividad residual de la amilasa se compara con la actividad de la amilasa en el detergente recién preparado en el día cero (antes de la incubación) tal como se describe más abajo.

Cuadro IX comercializado con el nombre comercial de Purafect Prime® por Genencor International, Palo Alto. Esto se expresa como el % de detergente que es enzima proteasa activa (es decir, este % en el producto asume el 100 % de la actividad de la enzima).

Prueba de estabilidad de las variantes de amilasa después de la incubación en el detergente C con agentes quelantes a pH 8.2 MÉTODO: Se prepararon muestras del detergente C, pH 8.2, cada una de las cuales contenía una variante de amilasa de la invención o la SEQ ID NO: 6 (SP722) con las siguientes dos deleciones D183* + G184* (mencionada además como SP722 + D183* + G184*). Se determinó la actividad de la enzima residual inicial de cada muestra detergente antes de la incubación (muestras de referencia).

La actividad de la enzima residual para cada muestra se deter-minó después de la incubación a 30 °C por 3 semanas y 6 semanas y se comparó con la muestra de referencia correspondiente. Se determinó la actividad residual con el uso del ensayo de actividad de amilasa PNP-G7.

Soluciones de amilasa: 13.77 mg de proteína de amilasa activa en 100 g del detergente C, pH 8.2 Procedimiento: El detergente C, 5 g pH 8.2 que contenía la amilasa se colocó en duplicado en un frasco de vidrio de 7 mi con una tapa hermética al aire. Se determinó la actividad de la enzima residual para las muestras iniciales, en duplicado, antes de la incubación.

Las muestras se colocaron en un incubador por 3 semanas y 6 semanas a 30 °C. Inmediatamente después de la incubación las muestras se analizaron para determinar la actividad de la amilasa residual, tal como se describe en el ensayo PNP-G7. En esta prueba, la actividad residual del 100 % equivale a la no pérdida de actividad de amilasa en comparación con la actividad de la enzima residual inicial antes de la incubación (muestra de referencia). La mejora en puntos porcentuales (pp) en la actividad residual (estabilidad) de la variante con respecto a la enzima parental se calcula como la diferencia entre la actividad resi-dual de la variante y la actividad residual de la enzima parental.

Cuadro X Los resultados muestran claramente que las variantes de la invención son altamente estables y tienen una mayor actividad residual después de la incubación en el detergente C a pH 8.2, durante 3 semanas y 6 semanas a 30 °C. En comparación, la amilasa SP722 + D183* G184* tiene una actividad residual del 19 % después de 3 semanas y del 3 % después de 6 semanas.

En la presente descripción se citan varias referencias; las descripciones de estas se incorporan como referencia en su totalidad.

La invención descrita y reivindicada en la presente descripción no está limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas en la pre- senté descripción, ya que estas modalidades están previstas como ejemplos de diversos aspectos de la invención. Se prevé que cualquier modalidad equivalente está comprendida dentro del alcance de esta invención. Claramente, varias modificaciones de la invención, además de aquellas que se muestran y describen en la presente descripción, serán evidentes para aquellos con experiencia en la industria a partir de la descripción anterior.

Se pretende, además, que estas modificaciones queden dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto prevalecerá la presente descripción incluidas las definiciones.

Las dimensiones y los valores descritos en la presente descripción no deben interpretarse como estrictamente limitados a los valores numéricos exactos mencionados. En lugar de eso, a menos que se especifique de cualquier otra forma, cada una de esas dimensiones significará tanto el valor mencionado como también un intervalo funcionalmente equivalente que abarca ese valor. Por ejemplo, una dimensión descrita como "40 mm" se refiere a "aproximadamente 40 mm".

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una composición limpiadora que comprende: (a) una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6; y (b) un adicional de limpieza, pre-ferentemente, en una cantidad de 0.01 a 99.9 % en peso; y opcionalmente (c) al menos un agente quelante, en donde el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , ca-racterizada además porque comprende un agente quelante, en donde: (a) el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide en cloruro de potasio 80 mM y EPPS 49 mM a 21 °C y pH 8.0; y/o (b) el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la con-centración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM; y/o (c) el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 8 mM, preferentemente, menor que 7 mM, preferentemente, menor que 6 mM, preferen- temente, menor que 5 mM, preferentemente, menor que 4 mM; y/o (d) el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 0.9 veces la concentración de citrato capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8; y/o (e) el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 0.7 veces, tal como menor que 0.5 veces, tal como menor que 0.3 veces la concentración de citrato capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM.

3. Una composición limpiadora que comprende: (a) una variante. de una alfa-amilasa parental, en donde la variante comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y 243 con el uso de la numera-ción de conformidad con la SEQ ID NO: 6; y (b) un adicional de limpieza, preferentemente, en una cantidad de 0.01 a 99.9 % en peso; y opcionalmente (c) al menos un agente quelante, en donde el agente quelante es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a una concentración del agente quelante menor que 0.9 veces la concentración de citrato capaz de reducir los iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM cuando se mide a 21 °C y pH 8.0.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada además porque: (a) la variante comprende al menos dos sustituciones en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 195, 193, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 o 243 con el uso de la numeración de conformidad con la SEQ ID NO: 6; y/o (b) la secuencia de alfa-amilasa parental está modificada por al menos una de las siguientes sustituciones: 193 es [G,A,S,T o M]; la posición 195 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 197 es [F,W,Y,L,I o V]; la posición 198 es [Q o N]; la posición 200 es [F.W.Y.L.I o V]; la posición 203 es [F,W,Y,L,I o V]¡ la posición 206 es [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D o E]; la posición 210 es [F.W.Y.L.I o V]; la posición 212 es [F,W,Y,L,I o V] o la posición 213 es [G.A.S.T o M]; o 243 es [F,W,Y,L,I o V]; y/o (c) la secuencia de alfa-amilasa parental está modificada por al menos una de las siguientes sustituciones: 193 es T; la posición 195 es F o Y; la posición 197 es F o L; la posición 198 es N; la posición 200 es F; la posición 203 es F; la posición 206 es Y; la posición 210 es Y; la posición 212 es V o la posición 213 es A; o la posición 243 es F y/o la variante comprende, además, al menos una, al menos dos o al menos tres deleciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 (con el uso de la SEQ ID NO: 6 para la numeración); y/o (d) la variante comprende una sustitución en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 193, 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213 y una sustitución en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 116, 118, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151, 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6; y/o (e) la variante tiene al menos 60 % de actividad residual después de 18 horas a pH 8 y 31 °C en presencia de un agente quelante, en donde el agen- te quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0; y/o (f) la variante tiene al menos 70 % de actividad residual después de 18 horas a pH 8 y 31 °C en presencia de un agente quelante, en donde el agen-te quelante a una concentración menor que 10 mM puede reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0 y en donde la actividad residual se mide; y/o (g) la variante tiene un desempeño de lavado mejorado en comparación con la alfa-amilasa parental cuando se mide en AMSA.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en: EDTA, MGDA, EGTA, DTPA, DTPMP, HEDP y mezclas de estos.

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindi-caciones precedentes, caracterizada además porque la variante de una alfa-amilasa parental comprende una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y comprende, además, una alteración en una o más posiciones que corresponden a las posiciones selecciona-das del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6; en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente co- rriente abajo y adyacente a la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene la se-cuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la variante de una alfa-amilasa parental comprende al menos una, al menos dos o al menos tres de-leciones en la región de aminoácidos de 181 , 182, 183 o 184 y comprende, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 195, 197, 198, 200, 203, 206, 210, 212, 213, 243 y comprende, además, una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 116, 118, 129, 133, 142, 146, 147, 149, 151 , 152, 169, 174, 186, 235, 244, 303, 320, 339, 359, 418, 431 , 434, 447, 458, en donde (a) la o las alteraciones son, independientemente, (i) una inserción de un aminoácido inmediatamente corriente abajo y adyacente a la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la en-zima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la variante tiene una estabilidad mejorada en comparación con la alfa-amilasa parental o con la SEQ ID NO: 6 en una composición que comprende un agente quelante, en donde el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0, preferentemente, en donde la variante tiene al menos 60 % de actividad residual después de 18 horas a pH 8 en presencia de un agente quelante, en donde el agente quelante a una concentración menor que 10 mM es capaz de reducir la concentración de iones calcio libres de 2.0 mM a 0.10 mM a 21 °C y pH 8.0, en donde la actividad residual se mide.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivin-dicaciones precedentes, caracterizada además porque la variante que tiene actividad amilolítica tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 %, con mayor preferencia, al menos 65 %, con mayor preferencia, al menos 70 %, con mayor preferencia, al menos 75 %, con mayor preferencia, al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos 85 %, aún con mayor preferencia, al menos 90 % y, con la máxima preferencia, al menos 95 % de identidad con el polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 o 20.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el polipéptido parental que tiene actividad amilolítica está codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad al menos baja, con mayor preferencia, condiciones de rigurosidad al menos media, aún con mayor preferencia, condiciones de rigurosidad al menos media-alta y, con la máxima preferencia, condiciones de rigurosidad al menos alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 17, 19 (ii) la secuencia de ADN genómico comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 , 17, 19 o (iii) una cadena complementaria de longitud completa de (i) o (ii).

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la amilasa es una variante de una alfa-amilasa parental, en donde la alfa-amilasa parental es la amilasa de la SEQ ID NO:6 y la variante comprende las deleciones D183* y G184* y uno de los siguientes conjuntos de mutaciones: (a) N195F + H2 0Y; (b) N195F +V206L.H.Y; (c) N195F +V206L+H210Y; (d) N195F +V206Y +Y243F; (e) NS18056 - cuando se obtienen mutaciones (f) S193T +V206L; (g) G133E+G149R+N195Y +Y203F +V206L; (h) I206L.Y; (i) Y243F (j) N195F+V206L+Y243F; (k) N195F; o (I) V206F+Y243F.

12. La composición de conformidad con cualquiera de las rei-vindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en: DTPA, HEDP, MGDA, DTPMP y mezclas de estos.

13. La composición de conformidad con cualquiera de, las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el adicional de limpieza comprende uno o más de: una microcápsula de perfume, un agente tonalizador de telas, una proteasa, un polímero de polietilenimina, una lipasa y cualquier mezcla de estos.

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la composición es una composición detergente líquida para lavandería.

15. Un método para lavandería que comprende lavar una pren-da con una composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, preferentemente, a una temperatura de 30 °C o menor o, con mayor preferencia, a una temperatura de 20 °C o menor.