JP5823414B2 - キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 - Google Patents

キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP5823414B2
JP5823414B2 JP2012552988A JP2012552988A JP5823414B2 JP 5823414 B2 JP5823414 B2 JP 5823414B2 JP 2012552988 A JP2012552988 A JP 2012552988A JP 2012552988 A JP2012552988 A JP 2012552988A JP 5823414 B2 JP5823414 B2 JP 5823414B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
position
preferably
substitution
amylase
seq id
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2012552988A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013519757A (ja
Inventor
ミッチェル、ミーク
フィリップ、フランク、スーター
リンゼイ、スザンヌ、ビュイック
アラン、スベンセン
アネッテ、ヘレ、ヨハンセン
マッズ、エスケルンド、ビヨルンバド
フランク、ウィンター、ラスムッセン
ミヒャエル、スキョート
エスキルセン、サイン、ラルセン
イェンス、エーブロ
スベン、カースガールド
ラルス、バイアー
Original Assignee
ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー
ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP10153223A priority Critical patent/EP2357220A1/en
Priority to EP10153223.2 priority
Application filed by ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー, ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー filed Critical ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー
Priority to PCT/US2011/024321 priority patent/WO2011100410A2/en
Publication of JP2013519757A publication Critical patent/JP2013519757A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5823414B2 publication Critical patent/JP5823414B2/ja
Application status is Active legal-status Critical
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C11ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11DDETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16Organic compounds
    • C11D3/38Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386Preparations containing enzymes, e.g. protease, amylase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C11ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11DDETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16Organic compounds
    • C11D3/26Organic compounds containing nitrogen
    • C11D3/33Amino carboxylic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C11ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11DDETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16Organic compounds
    • C11D3/36Organic compounds containing phosphorus
    • C11D3/361Phosphonates, phosphinates, phosphonites
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405Glucanases
    • C12N9/2408Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411Amylases
    • C12N9/2414Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001Alpha-amylase (3.2.1.1)

Description

配列リストの参照
本明細書は、コンピュータ可読形態での配列リストを含む。本コンピュータ可読形態は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、親酵素と比較して、キレート剤への改善された安定性を有するアルファ−アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物に関する。

アルファ−アミラーゼ(アルファ−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.1)は、デンプン並びに他の線状及び分枝上1,4−グルコシドオリゴ及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。

最初に使用された細菌アルファ−アミラーゼのうちの1つは、広く特徴付けられたターマミルとしても既知のバチルス・リケニフォルミス由来のアルファ−アミラーゼであり、この酵素のための結晶構造が判定されていた。国際特許第95/26397号に開示のバチルス種に由来するアルファ−アミラーゼ等のアルカリ性アミラーゼは、洗剤における用途が見出されたアルファ−アミラーゼの特定の一群を形成する。これらの既知の細菌アミラーゼのうちの多くは、特定の用途におけるそれらの機能性を改善するように修飾されている。

ターマミル及び多くの高度に有効なアルファ−アミラーゼは、活性のためにカルシウムを必要とした。ターマミルの結晶構造は、4個のカルシウム原子が陰性荷電アミノ酸残基によって配位されるアルファ−アミラーゼ構造で結合されたことが見出された。他のアルファ−アミラーゼでは、この構造で結合されるカルシウムイオンの量は異なり得る。このカルシウム要件は、洗剤及び洗浄組成物中等で強力なキレート化合物が存在する用途において不利である。

上述のように、いくつかの酵素が、活性及び安定性の両方において、カルシウム又はマグネシウム又は亜鉛等の他の金属イオンに依存していることは周知であり、したがって、キレート剤を含有する洗剤及び洗浄組成物中で安定しており、良好な性能を示す酵素を開発することが課題である。キレート剤は、洗浄中に水の硬度を低減させ、また存在し得る漂白剤を保護するために組み込まれ、キレート剤は、ある染みの除去に直接的な影響を与える。洗剤中のカルシウム依存性酵素の安定度は、場合によっては、洗剤にカルシウムを添加することによって改善され得るが、これは、多くの場合、染み抜き効果を破壊する。更に、液体洗剤へのカルシウムの添加は、製剤に関連する問題、すなわち、洗剤の物理的安定性の問題を提示し得る。

したがって、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤に対して安定しており、好ましくは洗浄性能を保持したか、あるいは増加させたアルファ−アミラーゼの組成物及び変異体を提供することが有益であろう。

したがって、第1の態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、洗浄補助剤及び任意で少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

更なる態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6に少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含み、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、任意で、少なくとも1つの洗浄補助剤を更に含み、キレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

別の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243を含む群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、洗浄補助剤と、任意で、少なくとも1つのキレート剤であって、前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

好ましい態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を更に含み、
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。

別の態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。

定義
アルファ−アミラーゼ(アルファ−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.1)は、デンプン並びに他の線状及び分枝状1,4−グルコシドオリゴ及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。バチルス属種、例えば、バチルス・リケニフォルミス等由来、アスペルギルス・オリザエ(TAKA−アミラーゼ)又は黒色アスペルギルス等の菌類の種由来、大麦等の植物由来、及び哺乳動物由来等の細菌を含む広範囲の選択の生物に由来するアルファ−アミラーゼが既知である。

野生型酵素:「野生型」アルファ−アミラーゼという用語は、自然界に見られる細菌、酵母菌又は糸状菌等の自然発生微生物によって発現されるアルファ−アミラーゼを意味する。「野生型酵素」及び「親酵素」という用語は、親酵素が変異酵素ではない場合、同義に使用され得る。

変異酵素:「変異体」という用語は、本明細書において、親又は野生型アルファ−アミラーゼの1つ以上(又は1つ若しくはいくつか)の特定位置で、1つ以上(又は1つ若しくはいくつか)のアミノ酸残基の置換、挿入、及び/又は欠失等の変更を含むアルファ−アミラーゼ活性を有するポリペプチドと定義される。好ましくは、50未満の修飾であり、30未満の修飾がより好ましい。変更したアルファ−アミラーゼは、人間の介入を経て親アルファ−アミラーゼの修飾によって得られる。

親酵素:本明細書で使用される「親」アルファ−アミラーゼという用語は、本発明の変異体アルファ−アミラーゼを産生するために修飾が行なわれるアルファ−アミラーゼを意味する。この用語は、本発明の変異体が比較されるポリペプチドも指す。親は、自然発生(野生型)ポリペプチドであり得るか、又は更には任意の好適な手段によって調製されるその変異体であり得る。例えば、親タンパク質は、アミノ酸配列において修飾又は変更された自然発生ポリペプチドの変異体であり得る。したがって、親アルファ−アミラーゼは、1つ以上(又は1つ若しくはいくつか)のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有してもよい。したがって、親アルファ−アミラーゼは、親アルファ−アミラーゼの変異体であり得る。親は、同一の染色体座を占有する遺伝子の2つ以上の代替形態のうちのいずれかによってコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。

改善された性質:「改善された性質」という用語は、本明細書において、親アルファ−アミラーゼと比較して改善された変異体と関連した特性と定義される。そのような改善された性質には、例えば、EnzChekアッセイ又は本明細書の実施例の項に記載のPNP−G7アッセイにおいて測定される際の増加したデンプン分解活性、土壌性能等の増加した洗浄性能、例えば、土壌を含有するデンプンに対する性能、染み除去、抗灰色化、安定性、例えば、耐熱性、pH安定性、あるいはキレート化物を含むビルダーの存在下における安定性、粉末、液体若しくはゲル洗剤製剤又は食器洗浄組成物における安定性、変化した温度依存性性能及び活性プロファイル、pH活性、基質特異性、生成物特異性、並びに化学安定性が含まれるが、これらに限定されない。洗浄性能及び/又は食器洗浄性能は、本明細書の以下の「材料及び方法」に記載されるように測定され得る。好ましくは、本発明の変異体は、洗剤における改善された安定性、改善された洗浄性能、改善された食器洗浄性能及び/又は改善された活性等の改善された性質の組み合わせを含む。改善された安定性には、濃縮洗剤製品の保管中の安定性及び希釈洗剤の洗浄中の安定性の両方が含まれる。改善された性質には、低温度で、改善された洗浄又は食器洗浄性能が含まれる。

活性:本文脈において、「活性」という用語は、例えば、特定の条件でのデンプン中の単位時間当たり及び単位当たりの酵素タンパク質として、3つ以上の1,4−アルファ結合したD−グルコース単位を含有する多糖類に加水分解される1,4−アルファ−D−グリコシド結合の数によって測定されるデンプン分解活性、例えば、1gの酵素タンパク質の1mLの酵素試料当たりの特定の条件で得られる活性である。活性は、例えば、EnzChekアッセイ又は以下の「材料及び方法」に記載のPNP−G7アッセイにおいて測定され得る。本明細書において、「活性」という用語は、「デンプン分解活性」と同義に使用される。「比活性」という用語は、多くの場合、1mL(又は1g)の酵素タンパク質当たり得られる最大活性を説明するために使用される。

改善された化学安定性:「改善された化学安定性」という用語は、本明細書において、親酵素の酵素活性を低減させる自然発生又は合成のいずれかの1つ又は複数の化学物質の存在下におけるある期間のインキュベーション後に、酵素活性の保持を示す変異酵素と定義される。改善された化学安定性はまた、かかる化学物質の存在下における反応をより良好に触媒することが可能な変異体をもたらすことができる。本発明の特定の態様において、改善された化学安定性は、洗剤、特に液体洗剤中での改善された安定性である。改善された洗剤安定性は、具体的には、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体がキレート剤を含む液体洗剤製剤に混合されるときの、アルファ−アミラーゼ活性の改善された安定性であり、この液体には、ゲル又はペーストも含まれる。液体洗剤製剤は、洗濯若しくは自動食器洗浄プロセス中に添加される濃縮洗剤、又は洗浄液、すなわち、濃縮洗剤が添加される水溶液等の希釈洗剤を指し得る。

本発明において、液体洗剤は液体洗濯洗剤として特に有用である。

安定性:「安定性」という用語は、保管安定性及び使用中、例えば、洗浄プロセス中の安定性を含み、時間の関数としてのアミラーゼの安定性、例えば、アミラーゼが溶液、具体的には、洗剤溶液中に維持されるとき、どれくらいの活性が保持されるか、を示す。例えば、アルファ−アミラーゼ変異体は、31℃で18時間後に70%を超える残存活性、すなわち、活性が保持される量を有し得る。安定性は、多くの要因、例えば、pH、温度、洗剤組成物、例えば、ビルダー、界面活性剤等の量及び種類に影響される。アミラーゼの安定性は、EnzCheckアッセイ又は「材料及び方法」に記載のPNP−G7アッセイのいずれかを用いて測定される。

改善された安定性:「改善された安定性」という用語は、本明細書において、例えば、「材料及び方法」に記載のEnzCheckアッセイにおいて測定されるとき、(1.5w/v)DTPAの存在下、31℃、pH 8で18時間後、親と比較して、70%を超える残存活性を有するか、あるいは残存活性において少なくとも10ppの改善を有することによって、親アルファ−アミラーゼの安定性よりも高い増加した安定性を示す変異酵素と定義される。親と比較した変異体の残存活性における百分率点(pp)改善は、「材料及び方法」に記載の変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。

ビルダー:ビルダーは、溶液中で水の硬度をpH 8で2.0mM(CaCOとして)から0.10mMに低下させるのに必要とされる最低ビルダーレベルを決定するように、M.K.Nagarajan et al.,JAOCS,Vol.61,no.9(1984年9月),pp.1475〜1478によって説明される試験によって分類され得る。ビルダーは、特に、例えば、カルシウム及びマグネシウムイオンで水溶性錯体を形成するキレート剤であり得る。

キレート剤又はキレート化剤は、他の素子と反応できないようにイオンを不活性化するある特定の金属イオンで分子を形成する化学物質、したがって、キレートを形成することによって化学活性を抑制する結合剤である。キレート化は、配位子と単一中心原子との間の2つ以上の別個の結合の形成又は存在である。配位子は、任意の有機化合物、ケイ酸塩又はリン酸塩であり得る。本文脈において、「キレート剤」という用語には、キレート化物、キレート剤、キレート剤、錯化剤、又はカルシウム及びマグネシウム等の金属イオンで水溶性錯体を形成する金属イオン封鎖剤が含まれる。キレート効果は、同一の金属への類似した非キレート配位子の収集物の親和性と比較して、金属イオンへの強化されたキレート配位子の親和性を説明する。金属イオン、具体的には、カルシウム(Ca2+)イオンを伴う結合能力を有するキレート剤は、一般に洗濯又は食器洗浄等の洗浄のための洗剤及び組成物において広く使用されている。しかしながら、キレート剤は、それ自身が酵素活性を阻害することを示している。キレート剤という用語は、本明細書において、「錯化剤」又は「キレート剤」又は「キレート化物」と同義に使用される。

ほとんどのアルファ−アミラーゼがカルシウムに感受性であるため、キレート剤の存在は、酵素活性を低下させ得る。アルファ−アミラーゼのカルシウム感受性は、強力なキレート剤の存在下で所与のアルファ−アミラーゼをインキュベートし、問題のアルファ−アミラーゼの活性へのこのインキュベーションの影響を分析することによって決定され得る。カルシウム感受性のアルファ−アミラーゼは、インキュベーション中にその活性のうちの大部分又はすべてを失う。

キレート剤の特徴付け:上述のように、キレート効果又はキレート化効果は、同一の金属への類似した非キレート配位子の収集物の親和性と比較して、金属イオンへの強化されたキレート配位子の親和性を説明する。しかしながら、このキレート効果の強度は、種々の種類のアッセイ又は測定方法によって決定され得、それによって、それらのキレート化効果(若しくは強度)に従ってキレート剤を区別又はランク付けする。

好ましいアッセイにおいて、キレート剤は、例えば、M.K.Nagarajan et al.,JAOCS,Vol.61,no.9(1984年9月),pp.1475〜1478によって説明される方法に基づいた試験を用いることによって、pH 8.0で遊離カルシウムイオン(Ca2+)の濃度を2.0mMから0.10mM以下に減少させるそれらの能力を特徴とし得る。Nagarajanらに基づく方法を用いたキレート剤の特徴付けの例は、実施例2aに記載されている。好ましくは、本発明によるキレート剤は、pH 8.0及び21℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.1mM以下に減少させることができる、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度のキレート剤を包含する。

好ましくは、本発明によるキレート剤は、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS((4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸))中で、pH 8及び21℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.1mMに減少させることができる、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度のキレート剤を包含する。特定の好ましい実施形態では、キレート剤は、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、pH 8及び21℃で測定されるとき、並びに「材料及び方法」に記載されるように、遊離カルシウム濃度の決定のためにカルシウムイオン選択性電極を用いて、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.1mMに減少させることができる。したがって、好ましくは、キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるようにpH 8.0及び21℃で試験されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9.0mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8.0mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7.0mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6.0mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5.0mM未満、好ましくは4.5mM未満、4.0mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3.0mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2.0mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1.0mM未満の濃度のキレート剤を包含する。

特に好ましい実施形態では、キレート剤は、9mM〜0.5mM、好ましくは9mM〜1mM、好ましくは8mM〜1mM、好ましくは7mM〜1mM、好ましくは6mM〜1mM、好ましくは5mM〜1mM、好ましくは4mM〜1mM、好ましくは3mM〜1mM、好ましくは2mM〜1mM、好ましくは9.0mM〜1.5mM、好ましくは8.0mM〜1.5mM、好ましくは7.0mM〜1.5mM、好ましくは6.0mM〜1.5mM、好ましくは5.0mM〜1.5mM、好ましくは4.0mM〜1.5mM、好ましくは3.0〜1.5mM、好ましくは2.5mM〜1.0mM、好ましくは2.0mM〜1.1mM、好ましくは1.85mM〜1.0mMの濃度で、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、pH 8及び21℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

2.0mMCa2+から0.10mMへの遊離カルシウムイオン濃度の減少は、200ppm(酸性COの存在下で、Ca(HCOの形態のCaCOとして)から10ppmに水の硬度を減少させることに相当する。最低ビルダーレベルは、キレート化物のナトリウム塩から、及び100%乾燥したキレート化物基礎原料上で計算される。

キレート剤のキレート化効果を、クエン酸塩と比較して測定することもできる。遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度は、値1と指定され、キレート剤の結果は、この値と比較される。本発明による好ましいキレート剤は、pH 8.0及び21℃で測定されるとき、クエン酸塩の濃度よりも0.9倍未満、例えば0.8倍未満、例えば0.7倍未満、例えば0.6倍未満、例えば0.5倍未満、例えば0.4倍未満、例えば0.3倍未満、例えば0.2倍未満、例えば0.1倍未満の低い濃度で、遊離カルシウム濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。本発明による好ましいキレート剤は、pH 8.0及び21℃で測定されるとき、遊離カルシウム濃度の決定のために、カルシウムイオン選択性電極を用いて、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、クエン酸塩の濃度よりも0.9倍未満、例えば0.8倍未満、例えば0.7倍未満、例えば0.6倍未満、例えば0.5倍未満、例えば0.4倍未満、例えば0.3倍未満、例えば0.2倍未満、例えば0.1倍未満の低い濃度で、遊離カルシウム濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

特に好ましい実施形態では、キレート剤は、pH 8.0及び21℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度よりも1.0〜0.1倍未満、例えば0.9〜0.1倍未満、例えば0.8〜0.1倍未満、例えば0.7〜0.1倍未満、例えば0.6〜0.1倍未満、例えば0.5〜0.1倍未満、例えば0.4〜0.1倍未満、例えば0.35〜0.1倍未満、例えば0.3〜0.1倍未満の低いキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明の更なる実施形態は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212及び213からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

本発明の好ましい実施形態において、洗浄組成物は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193〜213の範囲の1つ以上の位置での置換を含み、少なくとも1つのキレート剤であって、前記キレート剤が、21℃及びpH 8で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

本発明の更なる実施形態は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号6に少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含み、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212及び213からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤を更に含む。

したがって、本発明によるキレート剤は、同一の条件で遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なクエン酸塩の濃度よりも低い濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

あるいは、キレート剤とカルシウム及び/又はマグネシウム等の金属イオンとの間に形成される錯体の強度は、log K値(平衡又は結合又は解離又は安定度定数)で表される。この定数を、所与のpH、所与の温度及び所与のイオン強度で測定することができる。

上述のように、キレート剤と金属イオン、例えば、カルシウム及び/又はマグネシウムとの間に形成される錯体の強度を、log K値(平衡又は結合又は解離又は安定度定数)で表すことができ、定数を、A.Nielsen et al.,Anal.Biochem.Vol.314,(2003),pp 227〜234に記載の等温滴定熱量計(ITC)によって、K値から測定することができ、log Kを、K値の対数(10を底とする)として計算することができる。この方法で測定されるlog K値は、温度、pH、イオン強度に依存するため、log K値と比較するとき、それらが同様、好ましくは同一の条件で決定されることが重要である。更に、クエン酸塩等の参照として標準物質を導入することによって、実験における変化からの影響は減少し得る。好ましくは、log Kは、本明細書の「材料及び方法」に記載されるように決定され、したがって、本発明の一実施形態において、本発明による組成物中のキレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、log KがpH 10及び19℃で測定されるとき、少なくとも3、例えば少なくとも4、例えば少なくとも5、例えば少なくとも6、例えば少なくとも7、例えば少なくとも8、例えば少なくとも9、例えば少なくとも10、例えば少なくとも11のlog Kを有する。本発明による組成物中のキレート剤のlog K値は、3〜11、例えば3〜10、例えば3〜9、例えば3〜8、例えば4〜11、例えば5〜11、例えば6〜11、例えば4〜10、例えば5〜10、例えば4〜9、例えば5〜9、例えば4〜8、特に5〜8の範囲でもあり得る。好ましくは、本発明による組成物中のキレート剤のlog Kは、実施例2bに記載されるように決定されるクエン酸塩のlog Kの少なくとも1倍、例えば少なくとも1.33倍、例えば少なくとも1.67倍、例えば少なくとも2倍、例えば少なくとも2.33倍、例えば少なくとも2.67倍、例えば少なくとも3倍、例えば少なくとも3.33倍、例えば少なくとも3.67倍の因数である。本発明による組成物中のキレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように決定されるクエン酸塩のlog Kの1〜3.67倍、例えば1〜3.33倍、例えば1〜3.00倍、例えば1〜2.67倍、例えば1.33〜3.67倍、例えば1.33〜3.33倍、例えば1.33〜3.00倍、例えば1.33〜2.67倍、例えば1.67〜3.67倍、例えば1.67〜3.33倍、例えば1.67〜3倍、具体的には、1.67〜2.67倍の因数の範囲であり得る。

有用なキレート剤は、以下:N−(1,2−ジカルボキシ−エチル)−D,L−アスパラギン酸(IDS)、N−(2−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(EDG)、アスパラギン酸−N−一酢酸(ASMA)、アスパラギン酸−N,N−アセト酢酸(ASDA)、アスパラギン酸−N−モノプロピオン酸(ASMP)、イミノジコハク酸(IDA)、N−(2−スルホメチル)アスパラギン酸(SMAS)、N−(2−スルホエチル)アスパラギン酸(SEAS)、N−(2−スルホメチル)グルタミン酸(SMGL)、N−(2−スルホエチル)グルタミン酸(SEGL)、N−メチルイミノ二酢酸(MIDA)、α−アラニン−N,N−アセト酢酸(α−ALDA)、セリン−N,N−アセト酢酸(SEDA)、イソセリン−N,N−アセト酢酸(ISDA)、フェニルアラニン−N,N−アセト酢酸(PHDA)、アントラニル酸−N,N−アセト酢酸(ANDA)、スルファニル酸−N、N−アセト酢酸(SLDA)、タウリン−N、N−アセト酢酸(TUDA)、スルホメチル−N,N−アセト酢酸(SMDA)、N−(ヒドロキシエチル)−エチレンジアミントリアセテート(HEDTA)、ジエタノールグリシン(DEG)、アミノトリス(メチレンホスホン酸)(ATMP)であり得るが、これらに限定されない。

好ましいキレート剤は、アミノ基を含有し得、例えば、アミノポリカルボン酸塩又はホスホン酸塩であり得る。これは、1つ、2つ又は3つのアミノ基(典型的には、二級又は三級アミノ基)を含む単量体分子であり得、これは、2つ、3つ、4つ若しくは5つのカルボキシル基又は更にはそれ以上のカルボキシル基を含有し得る。キレート剤は、リンを含有する場合もあり、リンを含有しない場合もある。キレート剤を分類する方法が多く存在し、1つの方法は、以下の通りである:
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、NTA(2,2’,2”−ニトリロトリアセテート)、クエン酸塩、2−ヒドロキシプロパン−1,2,3−トリカルボキシレート、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)、MGDA(メチルグリシンアセト酢酸又はN,N’−ビス(カルボキシメチル)アラニン)、EGTA(エチレングリコール四酢酸)、EDDS(エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸)、GLDA(L−グルタミン酸、N,N−アセト酢酸)、PAA[ポリ(アクリル酸)]等のポリカルボン酸塩、PAA/PMA[コポリ(アクリル酸/マレイン酸)]、又はこれらの混合物様のカルボキシレート基であるキレート剤であるか、あるいはそれに基づくキレート剤であり得る。

リンを含有するキレート剤は、トリポリリン酸ナトリウム(STP)、HEDP(1−ヒドロキシエチリデン−1,1−ジホスホン酸)、EDTMP[エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸]、EDTMPA(エチレンジアミンテトラメチレンテトラホスホン酸)、DTPMP(ジエチレントリアミンペンタ(メチレンホスホン酸)、DTMPA(ジエチレントリアミンペンタ(メチレンホスホン酸))等のポリリン酸塩又はホスホン酸塩であり得る。EDTA、NTA、DTPA、PDTA、GLDA、MGDA、EDDS、EDTMP、EDTMPA、及びDTPMP又はASMA、ASDA、ASMP、IDA、SMAS、SEAS、SMGL、SEGL、MIDA、α−ALDA、SEDA、ISDA、PHDA、ANDA、SLDA、TUDA、SMDA、HEDTA、DEG、ATMP、又はこれらの混合物等のキレート剤は、窒素を含有し得る。

したがって、好ましいキレート剤は、以下:エチレン−ジアミン−テトラ−酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸(DTMPA、DTPMP)、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸(HEDP)、エチレンジアミンN,N’−ジコハク酸(EDDS)、メチルグリシン二酢酸(MGDA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、プロピレンジアミン四酢酸(PDTA)、2−ヒドロキシピリジン−N−オキシド(HPNO)、メチルグリシンアセト酢酸(MGDA)、グルタミン酸N,N−アセト酢酸(N,N−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリウム塩(GLDA)、及びニトリロ三酢酸(NTA)、又はこれらの混合物であり得るが、これらに限定されない。キレート剤は、それらの酸形態又は塩中に存在し得、好ましくは、キレート剤は、ナトリウム、アンモニウム又はカリウム塩として存在し得る。

キレート剤は、0.0001重量%〜20重量%、好ましくは0.01〜10重量%、より好ましくは0.1〜5重量%の量の組成物中に存在し得る。

親アルファ−アミラーゼ:親アルファ−アミラーゼは、原則として、保管中若しくは使用中、例えば、洗浄中又はデンプン加水分解プロセスにおいて、改善された安定性を有する変異体を調製するのに所望される、任意のアルファ−アミラーゼであり得る。したがって、改善された安定性は、保管中のデンプン分解活性の減少した損失として、又は使用中の増加した活性及び性能として観察され得る。既知のアルファ−アミラーゼは、バチルス属種、例えば、バチルス・リケニフォルミス由来、アスペルギルス・オリザエ(TAKA−アミラーゼ)又は黒色アスペルギルス等の菌類の種由来、大麦等の植物由来、及び哺乳動物由来等の細菌を含む広範囲の選択の生物に由来する。親アルファ−アミラーゼは、原則として、起源に関係しない任意のそのようなアルファ−アミラーゼであり得る。

バチルス種によって産生されるいくつかのアルファ−アミラーゼが、アミノ酸レベルにおいて高度に同一であることが周知である。相当の同一性がこれらのアルファ−アミラーゼ間で見出されるため、それらは、アルファ−アミラーゼの同一のクラス、すなわち、「ターマミル様アルファ−アミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。

したがって、本文脈において、「ターマミル様の」アルファ−アミラーゼという用語は、アルファ−アミラーゼ、具体的には、アミノ酸レベルで、本明細書において配列番号20に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ(ターマミル(商標))に対して相当の、すなわち、少なくとも60%の同一性を呈するバチルスアルファ−アミラーゼを示すよう意図される。

ターマミル様アルファ−アミラーゼ
いくつかの既知のバチルスアルファ−アミラーゼの同一性を、以下の表1で求めることができる。

例えば、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ(ターマミル(商標)として市販されている)は、配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼ(BAN)と約81%の相同性であり、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・ステアロサーモフィルスアルファ−アミラーゼ(BSG)と約65%の相同性であると見出された。更なる相同のアルファ−アミラーゼは、それぞれ、国際特許第95/26397号に開示され、本明細書において配列番号6及び配列番号12に更に示される、SP722+SP690を含む。他のアミラーゼは、バチルス種に由来し、配列番号10に示されるAA560アルファ−アミラーゼ、及びバチルス種に由来し、配列番号8に示され、Biochemical and Biophysical Research Communications,151(1988),pp.25〜31によって説明されるSP707又は#707アルファ−アミラーゼである。更なる相同体は、配列番号18を有する国際特許第97/00324号(KAO Corporation)に開示のKSM AP1378アルファ−アミラーゼである。更に別の相同体は、配列番号22を有するSP.7〜7である。別の好適な親アミラーゼは、配列番号2を有するK38、又は国際特許第2005/001064号に記載の配列番号4及び配列番号24を有するバチルス・サーキュランスアミラーゼである。

更に更なる興味深いアルファ−アミラーゼは、欧州特許第0252666号(ATCC27811)に記載のバチルス・リケニフォルミス株によって産生されるアルファ−アミラーゼ、並びに国際特許第91/00353号及び国際特許第94/18314号において特定されるアルファ−アミラーゼを含む。他の市販のターマミル様アルファ−アミラーゼは、以下の商標名下で販売されている製品中に含まれている:Optitherm(商標)及びTakatherm(商標)(Solvay)、Maxamyl(商標)(Gist−brocades/Genencorから入手可能)、Spezym AA(商標)、及びSpezyme Delta AA(商標)(Genencorから入手可能)、並びにKeistase(商標)(Daiwaから入手可能)、Dex lo、GC521(Genencorから入手可能)、並びにUltraphlow(Enzyme Biosystemsから入手可能)、Purastar(商標)ST5000E、PURASTRA(商標)HPAM L、POWERASE(商標)、Spezyme FRED、GC358、ClearFlow AA(Daniscoから入手可能)、又はアルファ−アミラーゼTS−23(配列番号26(Lin et al,J.App.Microbiol.1997,82,325〜334)。

非ターマミル様アルファ−アミラーゼは、例えば、真菌アルファ−アミラーゼ、哺乳類若しくは植物アルファ−アミラーゼ、又は細菌アルファ−アミラーゼであり得る(ターマミル様アルファ−アミラーゼとは異なる)。そのようなアルファ−アミラーゼの具体例には、アスペルギルス・オリザエTAKAアルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸アルファ−アミラーゼ、バチルス・ズブチルスアルファ−アミラーゼ、ブタ膵臓アルファ−アミラーゼ、及び大麦アルファ−アミラーゼが挙げられる。これらのアルファ−アミラーゼのすべては、本明細書に参照されるような典型的なターマミル様アルファ−アミラーゼの構造とは著しく異なる構造を解明した。

上述の、すなわち、黒色アスペルギルス及びアスペルギルスオリーゼに由来する真菌アルファ−アミラーゼは、アミノ酸レベルにおいて高度に同一であり、概して、同一のアルファ−アミラーゼのファミリーに属すると考えられる。アスペルギルス・オリザエに由来する真菌アルファ−アミラーゼは、Fungamyl(商標)の商標名下で市販されている。

親ハイブリッドアルファ−アミラーゼ
親アルファ−アミラーゼは、ハイブリッドアルファ−アミラーゼ、すなわち、少なくとも2つのアルファ−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含むアルファ−アミラーゼであり得る。

親ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、アミノ酸相同性及び/又は免疫学的交差反応性及び/又はDNAハイブリダイゼーション(上で定義される)に基づいて、ターマミル様アルファ−アミラーゼファミリーに属すると決定することができる親ハイブリッドアルファ−アミラーゼであり得る。この場合、ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、典型的には、ターマミル様アルファ−アミラーゼの少なくとも一部分、及び微生物(細菌若しくは真菌)及び/又は哺乳類由来のターマミル様アルファ−アミラーゼ又は非ターマミル様アルファ−アミラーゼから選択される1つ以上の他のアルファ−アミラーゼの(1つ又は複数の)部分からなる。

したがって、親ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、少なくとも2つのターマミル様アルファ−アミラーゼ由来、又は少なくとも1つのターマミル様及び少なくとも1つの非ターマミル様の細菌アルファ−アミラーゼ由来、又は少なくとも1つのターマミル様及び少なくとも1つの真菌アルファ−アミラーゼ由来の部分アミノ酸配列の組み合わせを含み得る。部分アミノ酸配列が由来するターマミル様アルファ−アミラーゼは、本明細書に参照されるターマミル様アルファ−アミラーゼのうちのいずれかであり得る。

一実施形態では、親ターマミル様アルファ−アミラーゼは、(成熟タンパク質の)35個のN末端アミノ酸残基が、配列番号14に示されるバチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼの成熟タンパク質の33個のN末端アミノ酸残基に置換されることを除いて、配列番号20に示されるバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様アルファ−アミラーゼであり、前記ハイブリッドは、(配列番号6の番号付けを用いて)以下の変異:LE174と称されるH156Y+A181T+N190F+A209V+Q264Sを更に有し得る。別の実施形態において、LE174は、LE399と称される変異G48A、T49I、G107A、I201Fを更に含む。一実施形態では、親は、変異I181+G182+N195Fを伴う配列番号16である。

本発明の好ましい態様において、親アルファ−アミラーゼは、本明細書において、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26に示されるアミノ酸配列を有するアルファ−アミラーゼである。別の好ましい態様では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26の成熟ポリペプチドの60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも91%、特に好ましくは少なくとも92%、特に好ましくは少なくとも93%、特に好ましくは少なくとも94%、更に特により好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の相同性を示すアルファ−アミラーゼである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26の成熟ポリペプチド由来の1つ又はいくつかのアミノ酸、好ましくは10個のアミノ酸、より好ましくは9個、8個、7個、6個、好ましくは5個のアミノ酸、より好ましくは4個のアミノ酸、更により好ましくは3個のアミノ酸、最も好ましくは2個のアミノ酸、及び更に最も好ましくは1個のアミノ酸による、例えば、欠失、挿入又は置換によって異なるアミノ酸配列を有する。

親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24及び26からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの1つを有するアルファ−アミラーゼに対して産生される抗体との免疫学的交差反応性を示すアルファ−アミラーゼであり得る。好ましい実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、親アルファ−アミラーゼに対して産生される抗体が例えば、それぞれ、ELISA又はBiaCore等の競合アッセイ技法において、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26に示されるアミノ酸配列のうちの1つを有するアルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力を示すか、あるいは親アルファ−アミラーゼの親和性又は結合力に匹敵する親和性又は結合力を示し、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26に示されるアミノ酸配列のうちの1つを有する、アルファ−アミラーゼに対して産生される抗体が、前記競合アッセイ技法において、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26に示されるアミノ酸配列のうちの1つを有するアルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力に匹敵する親アルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力を示すものである。更なる実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24又は26に示されるアミノ酸配列のうちの1つを有するアルファ−アミラーゼの親和性又は結合力の少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、好ましくは少なくとも110%、好ましくは少なくとも120%、特に好ましくは少なくとも125%である親和性又は結合力を有するものである。

親アルファ−アミラーゼは、本明細書の配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25から明らかな上述の特定のアルファ−アミラーゼをコードするDNA配列にハイブリダイズするDNA配列によってコードされるアルファ−アミラーゼでもあり得る。したがって、一実施形態は、親アルファ−アミラーゼが以下の場合、親アルファ−アミラーゼの変異体アルファ−アミラーゼに関する:
(A)バチルス・リケニフォルミス、バチルス種、又はKSM AP1378の株に由来するか、
(B)配列番号6、8、10、12、18又は22に示されるアミノ酸配列を有する群から選択されるか、
(C)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26のうちの1つに対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも97%、及び更により好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するか、
(D)低い、好ましくは中程度、好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25のうちの1つの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。

一態様では、デンプン分解増強活性を有する親ポリペプチドは、(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26の成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23若しくは25の成熟ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23若しくは25の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列、又は(iii)(i)若しくは(ii)の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは(c)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。

特定の親アルファ−アミラーゼの変異体が、従来の様式で、特定のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾(例えば、欠失又は置換)への参照によって参照されるとき、(それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような)(1つ又は複数の)同等の位置で修飾される別のアルファ−アミラーゼの変異体が、それによって包含されることを理解されたい。

本発明の特定の態様において、親アルファ−アミラーゼは、任意の好適な手段によって調製される自然発生(野生型)の変異体である。例えば、親アルファ−アミラーゼは、アミノ酸配列において修飾又は変更された自然発生アルファ−アミラーゼの変異体であり得る。

親アルファ−アミラーゼは、1つ以上の(いくつかの)アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有し得る実質的に相同性の親アルファ−アミラーゼであり得る。これらの変化は、軽度のもの、すなわち、以下で示されるような保守的なアミノ酸置換、及びタンパク質又はポリペプチドの三次元折り畳み又は活性に著しく影響を及ぼさない他の置換;小さい欠失、典型的には、1〜約30個のアミノ酸の欠失;並びに小さいアミノ若しくはカルボキシ末端伸長等のアミノ末端メチオニン残基、最大約20〜25個の残基の小さいリンカーペプチド、又はポリヒスチジン路若しくはタンパク質A等の精製を促進する小さい伸長(親和性タグ)(Nilsson et al.,1985,EMBO J.4:1075、Nilsson et al.,1991,Methods Enzymol.198:3)が好ましい。概して、Ford et al.,1991,Protein Expression and Purification 2:95〜107も参照されたい。

上記の変更は軽度のものであるのが好ましいが、かかる変更は、アミノ末端又はカルボキシル末端の伸長として最大300個以上のアミノ酸の大きなポリペプチドの融合などの実質的な性質のものであってもよい。

特定の親アルファ−アミラーゼの変異体(本発明の変異体)が、従来の様式で、特定の親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾(例えば、欠失又は置換)への参照によって参照されるとき、(それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような)(1つ又は複数の)同等の位置で修飾される別の親アルファ−アミラーゼの変異体が、それによって包含されることを理解されたい。

相同性(配列同一性)
相同性は、第2の配列からの第1の配列の誘導を示す2つの配列間の同一性の程度として決定され得る。本発明のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276〜277)のNeedleプログラムにおいて実施されるようなNeedleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443〜453)、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが10、ギャップ伸長ペナルティが0.5、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性(longest identity)」と表示されたNeedleの出力(−nobriefオプションを用いて得られる)を同一率として用い、これは以下のように計算される。
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)

本発明のために、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000、上記参照)のNeedleプログラムにおいて実施されるようなNeedleman−Wunschアルゴリズ(Needleman and Wunsch,1970、上記参照)、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが10、ギャップ伸長ペナルティが0.5、及びEDNAFULL(EMBOSSバージョンNCBI NUC4.4)置換マトリックスである。「最長同一性(longest identity)」と表示されたNeedleの出力(−nobriefオプションを用いて得られる)を同一率として用い、これは以下のように計算される。
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数)

相同性又は配列同一性は、第2の配列からの第1の配列の誘導を示す2つの配列間の同一性の程度としても決定され得る。相同性は、GCGプログラムパッケージに提供されるギャップ等の当該技術分野において既知のコンピュータプログラムの手段によって好適に決定され得る。したがって、ギャップGCGv8は、同一性のためのデフォルトスコアリングマトリックス、及び以下のデフォルトパラメータ:それぞれ、核酸配列比較のための5.0のギャップ作成ペナルティ及び0.3のギャップ伸長ペナルティ、並びにそれぞれ、タンパク質配列比較のための3.0のギャップ作成ペナルティ及び0.1のギャップ伸長ペナルティと使用され得る。ギャップは、アライメントを作製し、同一性を計算するために、Needleman and Wunsch,(1970),J.Mol.Biol.48,p.443〜453の方法を使用する。

例えば、ターマミルとアルファ−アミラーゼとの間の構造アライメントは、他のアルファ−アミラーゼにおける同等の/対応する位置を同定するために使用され得る。前記構造アライメントを得る1つの方法は、ギャップペナルティのデフォルト値、すなわち、3.0のギャップ作成ペナルティ及び0.1のギャップ伸長ペナルティを用いて、GCGパッケージのパイルアッププログラムを使用することである。他の構造アライメント方法には、疎水性クラスター分析(Gaboriaud et al.,(1987),FEBS LETTERS 224,pp.149〜155)及びリバーススレッディング(Huber,T;Torda,AE,PROTEIN SCIENCE Vol.7,No.1 pp.142〜149(1998)が含まれる。アルファ−アミラーゼの性質、すなわち、免疫学的交差反応は、関連したターマミル様アルファ−アミラーゼの少なくとも1つのエピトープに対して産生されるか、あるいはそれと反応する抗体を用いてアッセイされ得る。単クローン性又は多クローン性のいずれかであり得る抗体は、当該技術分野において既知の方法、例えば、Hudson et al.,Practical Immunology,Third edition(1989),Blackwell Scientific Publicationsによって説明される方法によって産生され得る。免疫学的交差反応性は、当該技術分野において既知のアッセイを用いて決定され得、その例には、例えば、Hudson et al.,1989によって説明されるようなウエスタンブロット法又は放射状免疫拡散アッセイがある。

ハイブリダイゼーション
一態様では、デンプン分解活性を有する親ポリペプチドは、非常に低いストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25の成熟ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列、(iii)(i)若しくは(ii)の部分配列、又は(iv)(i),(ii)、若しくは(iii)の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる(J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。部分配列は、デンプン分解活性を有するポリペプチド断片をコードする。一態様では、相補鎖は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25の成熟ポリペプチドコード配列の全長相補鎖である。

アルファ−アミラーゼ活性であり得る所望の性質によるアルファ−アミラーゼの特徴付けにおいて使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、問題のアルファ−アミラーゼの全又は部分ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて好適に調製され得る。

ハイブリダイゼーションを試験するための好適な条件は、5×SSC(標準のクエン酸ナトリウム、1×SSCは0.1650MのNaClに相当する)中に予め浸す工程と、20%のホルムアミド、5×デンハート液、50mMのリン酸ナトリウム、pH 6.8、及び50mgの変性超音波処理仔ウシ胸腺DNAの溶液中で、約40℃で1時間予めハイブリダイズし、その後、100mMのATP(アデノシン三リン酸)で補充される同一の溶液中で、約40℃で18時間ハイブリダイズし、その後、40℃(低ストリンジェンシー)、好ましくは50℃(中程度のストリンジェンシー)、より好ましくは65℃(高ストリンジェンシー)、更により好ましくは約75℃(非常に高いストリンジェンシー)で30分間、2×SSC、0.2%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中でフィルタを3回洗浄する工程と、を伴う。ハイブリダイゼーション方法についての更なる詳細は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor,1989で見出すことができる。

本文脈において、「由来する」は、問題の生物の株によって産生されるか、あるいは産生可能であるアルファ−アミラーゼを表すだけでなく、そのような株から単離されるDNA配列によってコードされ、前記DNA配列で形質転換される宿主生物中に産生されるアルファ−アミラーゼも表すよう意図される。最後に、本用語は、合成及び/又はcDNA起源のDNA配列によってコードされ、問題のアルファ−アミラーゼの同定特性を有するアルファ−アミラーゼを表すよう意図される。本用語は、親アルファ−アミラーゼが、自然発生アルファ−アミラーゼの変異体、すなわち、自然発生アルファ−アミラーゼの1つ以上のアミノ酸残基の修飾(挿入、置換、欠失)の結果である変異体であり得ることも表すよう意図される。

アルファ−アミラーゼ変異体を調製するための方法
変異を遺伝子に導入するためのいくつかの方法が、当該技術分野において既知である。アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニングを手短に議論した後、アルファ−アミラーゼをコードする配列内の特定の位置での変異を発生させるための方法を議論する。

アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニング
親アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列は、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて、問題のアルファ−アミラーゼを産生する任意の細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリは、研究されるアルファ−アミラーゼを産生する生物由来の染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築されるべきである。次に、アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列が既知の場合、相同性の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成及び使用して、問題の生物から調製されるゲノムライブラリ由来のアルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定し得る。あるいは、既知のアルファ−アミラーゼ遺伝子と相同の配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブをプローブとして使用し、ハイブリダイゼーション及び比較的低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。

アルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定するための更に別の方法は、ゲノムDNAの断片をプラスミド等の発現ベクターに挿入する工程と、アルファ−アミラーゼ陰性細菌を結果として生じるゲノムDNAライブラリで形質転換する工程と、その後、形質転換した細菌をアルファ−アミラーゼの基質を含有する寒天上にプレーティングし、それによって、アルファ−アミラーゼを発現するクローンを同定する工程と、を伴う。

あるいは、酵素をコードするDNA配列は、確立された標準の方法、例えば、S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,(1981)Tetrahedron Letters 22:1859によって説明されるホスホロアミダイト法、又はMatthes et al.(1984),EMBO J.3 801〜805によって説明される方法を用いて合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクター中でクローンされる。

最後に、DNA配列は、標準の技法に従って、合成、ゲノム、若しくはcDNA起源の連結断片(必要に応じて、全DNA配列の種々の部分に対応する断片)によって調製される、ゲノム及び合成起源の混合、合成及びcDNA起源の混合、又はゲノム及びcDNA起源の混合であり得る。DNA配列は、例えば、米国特許第4,683,202号又はR.K.Saiki et al.(1988),Science Vol.239 no.4839 pp.487〜491に記載の特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によっても調製され得る。

部位特異的変異誘発
アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、変異の望ましい部位が同定された時点で、変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有し、変異体ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特定の方法では、アルファ−アミラーゼをコードする配列を架橋するDNAの一本鎖ギャップは、アルファ−アミラーゼ遺伝子を担持するベクター中に作成される。次に、所望の変異を担持する合成ヌクレオチドは、一本鎖DNAの相同部分にアニールされる。残りのギャップは、その後、DNAポリメラーゼI(クレノウ断片)で充填され、構築は、T4リガーゼを用いて連結される。この方法の具体例は、Morinaga et al.1984 Biotechnology 2,pp 636〜639に記載されている。米国特許第4,760,025号は、カセットの比較的重要でない変更を行なうことによる、複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るため、更に多種多様の変異がMorinaga法によっていずれか1回で導入され得る。

変異をアルファ−アミラーゼをコードするDNA配列に導入するための別の方法は、Nelson and Long(1989)に記載されている。これは、PCR反応におけるプライマーのうちの1つとして、化学的に合成されたDNA鎖を用いることによって導入される所望の変異を含有するPCR断片の3段階生成を伴う。変異を担持するDNA断片は、制限エンドヌクレアーゼを用いてPCRによって生成された断片から切断によって単離され、発現プラスミドに再挿入され得る。

ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、示される問題のアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3つの部分において、あるいは全体の遺伝子内で、局所的ランダム変異誘発又は領域特異的ランダム変異誘発のいずれかとして好適に行なわれる。

親アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列のランダム変異誘発は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて好都合に行なわれ得る。

上述との関連で、本発明の更なる態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を生成するための方法に関し、例えば、変異体は、親と比較して変化したデンプン親和性を呈し、本方法は、
(a)親アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列をランダム変異誘発に供する工程と、
(b)工程(a)で得られた変異DNA配列を宿主細胞で発現させる工程と、
(c)親アルファ−アミラーゼと比較して変化したデンプン親和性を有するアルファ−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、を含む。

本発明の上述の方法の工程(a)は、好ましくは、ドープされたプライマーを用いて行なわれる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤を用いて、好適なオリゴヌクレオチドを用いて、又はDNA配列をPCRによって発生した変異誘発に供することによって行なわれ得る。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤の任意の組み合わせを用いて行なわれ得る。変異誘発剤は、例えば、トランジション、トランスバージョン、反転、スクランブリング、欠失、及び/又は挿入を含む変異誘発剤であり得る。

本目的に好適な物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外線(UV)照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸塩(EMS)、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。そのような作用物質が使用されるとき、変異誘発は、典型的には、最適な変異誘発剤の存在下において、変異誘発を発生させるのに好適な条件下で、変異誘発される親酵素をコードするDNA配列をインキュベートすることによって、所望の性質を有する変異DNAを選択することによって行なわれる。オリゴヌクレオチドを用いて変異誘発が行なれるとき、オリゴヌクレオチドは、変化する位置でのオリゴヌクレオチドの合成中に3つの非親ヌクレオチドでドープ又はスパイクされ得る。不必要なアミノ酸のコドンが回避されるように、ドーピング又はスパイキングが行なわれ得る。ドープ又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、任意の公開された技法によって、例えば、PCR、LCR又は適切であると見なされる任意のDNAポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、アルファ−アミラーゼ酵素をコードするDNAに組み込まれ得る。好ましくは、ドーピングは、それぞれの位置において、野生型及び変異の割合が予め定義される「一定のランダムドーピング」を用いて実行される。更に、ドーピングは、ある特定のヌクレオチドの導入の選好、及びそれによって、1つ以上の特定のアミノ酸残基の導入の選好に対して行なわれ得る。ドーピングは、例えば、それぞれの位置において、90%の野生型及び10%の変異の導入を可能にするように行なわれ得る。ドーピングスキームの選択における更に考慮すべき事項は、遺伝子、並びにタンパク質構造上の制約に基づいている。ドーピングスキームは、とりわけ、停止コドンの導入が回避されることを確実にするDOPEプログラムを用いて作製され得る。PCRによって発生した変異誘発が使用されるとき、親アルファ−アミラーゼをコードする化学的に処理された遺伝子又は処理されていない遺伝子のいずれかが、ヌクレオチドの誤組み込みを増加させる条件下でPCRに供される(Deshler 1992,Genetic Analysis:Biomolecular Engineering,9(4),pp 103〜106;Leung et al.,1989 Technique,Vol.1,pp.11〜15)。大腸菌(Fowler et al.,1974,Molec.Gen.Genet.,133,pp.179〜191)、サッカロミセスセレビシエ、又は任意の他の微生物の変異誘発因子株は、例えば、親グリコシダーゼを含有するプラスミドを変異誘発因子株に形質転換し、プラスミドを有する変異誘発因子株を成長させ、変異プラスミドを変異誘発因子株から単離することによって、アルファ−アミラーゼをコードするDNAのランダム変異誘発に使用され得る。変異プラスミドは、その後、発現生物に形質転換され得る。変異誘発されるDNA配列は、親アルファ−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリ中に好都合に存在し得る。あるいは、DNA配列は、それ自体が変異誘発剤とインキュベートされるか、あるいはさもなければそれに曝露され得るプラスミド又はバクテリオファージ等の好適なベクター上に存在し得る。変異誘発されるDNAは、前記細胞のゲノムに統合されるか、あるいは細胞内に宿されるベクター上に存在するかのいずれかによって、宿主細胞中にも存在し得る。最後に、変異誘発されるDNAは、単離した形態であり得る。ランダム変異誘発に供されるDNA配列は、好ましくは、cDNA又はゲノムDNA配列であることを理解されたい。場合によっては、発現工程b)又はスクリーニング工程c)を行なう前に変異DNA配列を増幅するのが好都合であり得る。そのような増幅は、当該技術分野において既知の方法に従って行なわれ得、現在好ましい方法は、親酵素のDNA又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、PCRによって発生する増幅である。変異誘発剤とのインキュベーション又はそれへの曝露の後、変異DNAは、発現を発生させる条件下でDNA配列を担持する好適な宿主細胞を培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞は、任意でベクター上に存在する、変異DNA配列で形質転換された宿主細胞、又は変異誘発処理中に親酵素をコードするDNA配列を担持した宿主細胞であり得る。好適な宿主細胞の例には、以下:バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ロータス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンジエンシス、ストレプトマイセス・リビダンス、又はストレプトマイセス・ムリヌス等のグラム陽性細菌、及び大腸菌等のグラム陰性細菌がある。変異DNA配列は、変異DNA配列の発現を可能にする機能をコードするDNA配列を更に含み得る。

局所的ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、問題の親アルファ−アミラーゼの一部分に有利に局所化され得る。これは、例えば、酵素のある特定の領域が酵素の所与の性質にとって特に重要であると同定されたとき、及び改善された性質を有する変異体をもたらすよう修飾されることが予想されるときに有利であり得る。そのような領域は、通常、親酵素の三級構造が解明され、酵素の機能に関連したときに同定され得る。

局所的又は領域特異的ランダム変異誘発は、上述のPCRによって発生した変異誘発技法、又は当該技術分野において既知の任意の他の好適な技法を用いて好都合に行なわれる。あるいは、修飾されるDNA配列の一部分をコードするDNA配列は、例えば、好適なベクターへの挿入によって単離され得、前記一部分は、その後、上述の変異誘発方法のうちのいずれかを用いて変異誘発に供され得る。

アルファ−アミラーゼ変異体をもたらす代替方法
本発明の変異体をもたらす代替方法には、例えば、国際特許第95/22625号(Affymax Technologies N.V.)及び国際特許第96/00343号(Novo Nordisk A/S)に記載の方法を含む、当該技術分野において既知の遺伝子シャフリング法が含まれる。

アルファ−アミラーゼ変異体の発現
本発明に従って、上述の方法、又は当該技術分野において既知の任意の代替方法によって産生される変異体をコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意で、制御因子遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて、酵素形態で発現され得る。

本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を担持する組み換え発現ベクターは、組み換えDNA手順に好都合に供され得る任意のベクターであり得、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。したがって、本ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、バクテリオファージ又は染色体外素子、ミニ染色体若しくは人工染色体であり得、その複製は、染色体複製から独立している。あるいは、本ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、宿主細胞ゲノムに統合され、それが統合された(1つ又は複数の)染色体とともに複製されるベクターであり得る。

本ベクターにおいて、DNA配列は、好適なプロモーター配列に操作可能に結合されるべきである。プロモーターは、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であり得、宿主細胞に相同又は非相同のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。特に細菌宿主において本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列の転写を指向するのに好適なプロモーターの例には、大腸菌の乳糖オペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼ(amyQ)のプロモーター、バチルス・ズブチルスxylA及びxylB遺伝子のプロモーター等がある。真菌宿主における転写について、有用なプロモーターの例には、アスペルギルスオリーゼTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、黒色アスペルギルス中性アルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸安定性アルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルスオリーゼアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルスオリーゼトリオースリン酸イソメラーゼ、又はアスペルギルスニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターがある。

本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物において、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能に結合されるポリアデニル化配列も含み得る。終止及びポリアデニル化配列は、好適にプロモーターと同一の供給源に由来する。

ベクターは、ベクターを問題の宿主細胞中で複製することができるDNA配列を更に含み得る。そのような配列の例には、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、及びpIJ702の複製の起源がある。

ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、バチルス・サブティリス又はバチルス・リケニフォルミス由来のdal遺伝子等の宿主細胞における欠陥を補完する産物の遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を与える産物の遺伝子も含み得る。更に、ベクターは、ハイグロマイシン抵抗を引き起こすマーカーである、amdS、argB、niaD及びsC等のアスペルギルス選択マーカーを含み得るか、あるいは選択は、例えば、国際特許第91/17243号に記載の同時形質転換によって達成され得る。

例えば、宿主細胞としてある特定の細菌を用いるとき、細胞内発現がある点において有利であり得る一方で、発現が細胞外であることが概して好ましい。概して、本明細書において言及されるバチルスアルファ−アミラーゼは、培養培地への発現したプロテアーゼの分泌を可能にする事前領域を含む。所望の場合、この事前領域は、異なる事前領域、又はそれぞれの事前領域をコードするDNA配列の置換によって好都合に達成されるシグナル配列によって置換され得る。

それぞれ、アルファ−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の素子をコードする本発明のDNA構築物を連結し、それらを複製に必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される手順は、当業者に周知である(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor,1989を参照のこと)。

上で定義されるDNA構築物又は発現ベクターのいずれかを含む細胞は、本発明で用いるアルファ−アミラーゼ変異体の組み換え産出における宿主細胞として有利に使用される。細胞は、(1つ以上の複製物中の)DNA構築物を宿主染色体に好都合に統合することによって、本明細書の変異体をコードするDNA構築物で形質転換され得る。この統合は、DNA配列が細胞中に安定して維持される可能性が高いため、概して、有利な点であると考えられる。宿主染色体へのDNA構築物の統合は、従来の方法に従って、例えば、相同又は異種組み換えによって行なわれ得る。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連した上述の発現ベクターで形質転換され得る。

細胞は、哺乳動物又は昆虫等の高等生物の細胞であり得るが、好ましくは、微生物細胞、例えば、細菌又は真菌(酵母菌を含む)細胞である。

好適な細菌の例には、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ロータス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンジエンシス、又はストレプトマイセス・リビダンス若しくはストレプトマイセス・ムリヌス等のグラム陽性細菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性細菌がある。細菌の形質転換は、例えば、それ自体既知の方法において、プロトプラスト形質転換によって、又はコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。

酵母生物は、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセス種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエから好都合に選択され得る。糸状菌は、アスペルギルス種、例えば、アスペルギルス・オリザエ又は黒色アスペルギルスに有利に属し得る。真菌性細胞は、それ自体既知の方法において、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、その後、細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換に好適な手順は、欧州特許第238 023号に記載されている。

本発明において用いられるアルファ−アミラーゼ変異体を産生する好適な方法は、変異体の産出に寄与する条件下で、上述のように宿主細胞を培養する工程と、変異体を細胞及び/又は培養培地から回収する工程と、を含む。

細胞を培養するのに使用される培地は、問題の宿主細胞を成長させ、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体の発現を得るのに好適な任意の従来の培地であり得る。好適な培地は、商業供給者から入手可能であるか、あるいは(例えば、catalogues of the American Type Culture Collectionのカタログに記載されるような)公開されたレシピに従って調製され得る。

宿主細胞から分泌されるアルファ−アミラーゼ変異体は、遠心分離又は濾過によって細胞を培地から分離する工程と、硫酸アンモニウム等の塩を用いて培地のタンパク性成分を沈殿させ、その後、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、又は同等物等のクロマトグラフ手順を使用する工程と、を含む、周知の手順によって培養培地から好都合に回収され得る。

変異体指定の取り決め
いくつかの他のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と整列した配列番号6に開示のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列に由来する番号付けシステムを用いて、構造相同性の領域中のアルファ−アミラーゼにおけるアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。

本発明の種々のアルファ−アミラーゼ変異体を説明する際、参照を簡略化するために、以下に記載の命名法を適応する。いずれのケースでも、IUPACによる1文字又は3文字の正式なアミノ酸略称を採用する。

本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の1文字及び3文字のコードが使用される。参照を簡略化するために、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体は、以下の命名法を用いて説明される:
(1つ又は複数の)最初のアミノ酸:(1つ又は複数の)位置:(1つ又は複数の)置換アミノ酸
この命名法に従って、例えば、30位におけるアラニンのアスパラギンへの置換は、以下のように示され:
Ala30Asn又はA30N
同一の位置におけるアラニンの欠失は、以下のように示され:
Ala30又はA30
リジン等の30位以降の更なるアミノ酸残基の挿入は、以下のように示される:
Ala30AlaLys又はA30AK
アミノ酸残基30〜33等の連続した一続きのアミノ酸残基の欠失は、(30〜33)又はΔ(A30〜N33)と示される。単一のアミノ酸残基の欠失は、簡潔に、30と開示され得る。

特定のアルファ−アミラーゼが他のアルファ−アミラーゼと比較して「欠失」を含有し、そのような位置においてが挿入行なわれる場合、これは、以下のように示され:
36Asp又は36D
これは、36位におけるアスパラギン酸の挿入についてである。

複数の変異は、プラス記号又はスペースで分けられ得、すなわち、
Ala30Asn+Glu34Ser又はA30N+E34S
Ala30Asn Glu34Ser又はA3ON E34S
それぞれ、アラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンに置換する30位及び34位における変異を表している。

あるいは、複数の変異は、コンマ又はセミコロンで分けられ得、すなわち、以下の通りである:
Ala30Asn,Glu34Ser又はA30N,E34S
更により簡潔化された複数の変異は、スペースによって分けられ得、例えば、以下の通りである:
Ala30Asn Glu34Ser又はA30N E34S
あるいは、複数の変異は、コンマ又はセミコロンで分けられ得る。

1つ以上の代替のアミノ酸残基が所与の位置に挿入されるとき、それは、以下のように示される:
A30N、E又は
A30N若しくはA30E
あるいは、1つ以上の代替のアミノ酸残基が所与の位置に挿入され得、それは、以下のように示される:
A30[N,E]又はA30[N E]、あるいは、A30{N,E}又はA30{N E}
簡潔化のため、ある特定の位置で置換され得る代替のアミノ酸は、以下のように示され得る:
A30 N、E、H、L又はV
更に、修飾に好適な位置が、任意の特定の修飾が示唆されることなく、本明細書において同定されるとき、任意のアミノ酸残基が、その位置に存在するアミノ酸残基に置換され得ることを理解されたい。したがって、例えば、30位におけるアラニンの修飾が言及されるが、特定されないとき、アラニンが、任意の他のアミノ酸すなわち、以下のうちのいずれかに欠失又は置換され得ることを理解されたい:
R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V
更に、「A30X」とは、以下の置換のうちの任意の1つを意味する:
A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y、若しくはA30V、又は短縮して、A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V
あるいは例えば、A30[R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V]
当業者は、例えば、配列番号6による番号付けを用いることは、計数のために配列番号6を用いて、親が必ず配列番号6であることを意味するのではなく、単に変更される位置が配列番号6に従って定義されることを意味すると理解するであろう。したがって、特定の置換を説明する別の方法は、変更されるアミノ酸をXで示すことである。したがって、X30Nは、異なるアルファ−アミラーゼが親アルファ−アミラーゼとして使用され得ることを反映して、30位に存在する任意のアミノ酸がNで置換され得ることを意味する。

したがって、命名法「X30N」又は「X30V」は、親アルファ−アミラーゼの30位に存在し得る任意のアミノ酸がアスパラギン又はバリンによって置換されることを意味する。

アミノ酸残基の特性
荷電アミノ酸:
Asp、Glu、Arg、Lys、His
陰性荷電アミノ酸(最も陰性の残基の順に):
Asp、Glu
陽性荷電アミノ酸(最も陽性の残基の順に):
Arg、Lys、His
中性アミノ酸:
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro
疎水性アミノ酸残基(最も疎水性の残基を最後に記載):
Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp、
親水性アミノ酸(最も親水性の残基を最後に記載):
Thr、Ser、Cys、Gln、Asn
この命名法は、特定の共通の性質を有するアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失を伴う修飾に特に関連している。そのような修飾は、(1つ又は複数の)保守的なアミノ酸修飾と称される。保守的な修飾の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、並びに小アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン)の群の範囲内にある。概して比活性を変更しないアミノ酸修飾は、当該技術分野において既知であり、例えば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。最も一般に発生する交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Gly、並びにこれらの逆である(Taylor,1986,Journal of Theoretical Biology 119:205〜218)。

本発明において有用な変異体
好ましい変異体は、親アルファ−アミラーゼの領域193〜213中の1つ以上、又は1つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における(1つ又は複数の)変更を含む。特に好ましい実施形態では、変異体は、181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失、及び更に領域193〜213中の1つ以上又は1つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における変更を含み、番号付けは、すなわち、配列番号6による番号付けを用いて、配列番号6の成熟ポリペプチドに相当する。本発明者は、そのような変更が、具体的には、以下の「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9.0mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8.0mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7.0mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6.0mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5.0mM未満、好ましくは4.5mM未満、4.0mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3.0mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2.0mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1.0mM未満の濃度のキレート剤が遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるとき、キレート剤を含む組成物において増加した安定性を有する変異体をもたらすことを見出した。

本発明の第1の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193〜213の範囲の1つ以上の位置での置換を含み、任意で少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

第2の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む組成物を提供し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10、12、18、及び22と少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%同一のアミノ酸配列を含み、配列番号6による番号付けを用いて、195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243を含む群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、任意で、少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

更なる態様は、(配列番号6による番号付けを用いて)195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243を含む群から選択される1つ以上の位置での置換を含む変異体を含む洗浄組成物を提供し、前記組成物は、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

更なる態様は、(配列番号6による番号付けを用いて)195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243を含む群から選択される1つ以上の位置での置換を含む変異体を含む洗浄組成物を提供し、変異体は、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24及び26からなる群からのアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号18、及び配列番号22を含み、前記組成物は、少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。

第3の態様は、洗浄組成物に関し、10mM未満の濃度のキレート剤は、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

第4の態様は、洗浄組成物に関し、10mM未満の濃度のキレート剤は、「材料及び方法」に記載のアッセイで測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

したがって、本発明の好ましい態様において、変異体は、配列番号6の成熟ポリペプチドの193〜213位に相当する範囲内の1つ以上の位置での少なくとも1つの置換を含む。「による番号付けを用いて」又は「に相当する」という用語は、本明細書において使用される番号付けシステムを指し、2つの表現は、本明細書において同義に使用される。したがって、195位は、配列番号6における195位に相当するアミノ酸である。したがって、(それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような)(1つ又は複数の)同等の位置において修飾される他の親アルファ−アミラーゼの変異体は、それによって包含されることを理解されたい。欠失が存在するとき、欠失が存在しないかのように計数される。

特に好ましい実施形態では、組成物は、変異体を含み、その変異体は、(配列番号6による番号付けを用いて)193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更、並びに116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を含む。

特に好ましい実施形態では、組成物は、変異体を含み、その変異体は、(配列番号6による番号付けを用いて)181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失、並びに193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び234からなる群から選択される位置に相当する1つ以上又は1つ若しくはいくつかの位置での更なる変更、並びに116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を含む。

本発明の一態様では、洗浄組成物は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上又は1つ若しくはいくつかの位置での置換を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18、又は22を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有し、変異体は、残存活性が、EnzChek又はPNP−G7アッセイ(詳細については「材料及び方法」を参照のこと)に記載されるように、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、少なくとも70%の残存活性、好ましくは少なくとも75%の残存活性、好ましくは少なくとも80%の残存活性、好ましくは少なくとも85%の残存活性、好ましくは少なくとも90%の残存活性、好ましくは少なくとも95%の残存活性、好ましくは少なくとも100%の残存活性、好ましくは少なくとも105%の残存活性、好ましくは少なくとも110%の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pp改善された残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、以下に説明されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明による組成物は、好ましくは、アルファ−アミラーゼを含み、親アルファ−アミラーゼは、193が、[G、A、S、T又はM]であるか、195位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、197位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、198位が、[Q又はN]であるか、200位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、203位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、206位が、[F、W、Y、N、L、I、V又はH]であるか、210位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、212位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、又は213位が[G、A、S、T又はM]である置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、位置は、配列番号6を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明による組成物は、好ましくは、181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含むアルファ−アミラーゼ変異体変異体を含み、親アルファ−アミラーゼは、193が、[G、A、S、T又はM]であるか、195位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、197位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、198位が、[Q又はN]であるか、200位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、203位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、206位が、[F、W、Y、N、L、I又はV、H]であるか、210位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、212位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、又は213位が[G、A、S、T又はM]であるかの置換のうちの少なくとも1つによって更に修飾され、位置は、配列番号6を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

具体的には、本発明は、アルファ−アミラーゼ含む組成物に関し、アミノ酸配列は、193がTであるか、195位がF又はYであるか、197位がF又はLであるか、198位がNであるか、200位がFであるか、203位がFであるか、206位がF、L又はYであるか、210位がYであるか、212位がVであるか、213位がAである置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、位置は、配列番号6を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

更なる態様において、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体は、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される2つ以上又は2つ若しくはいくつかの位置での置換を含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」の項で記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

更に更なる態様では、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、変異体は、181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも2つ以上、又は少なくとも3つ以上の欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される2つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、変異体は、残存活性が、EnzChek又はPNP−G7アッセイ(詳細については「材料及び方法」を参照のこと)に記載されるように、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、少なくとも70%の残存活性、好ましくは少なくとも75%の残存活性、好ましくは少なくとも80%の残存活性、好ましくは少なくとも85%の残存活性、好ましくは少なくとも90%の残存活性、好ましくは少なくとも95%の残存活性、好ましくは少なくとも100%の残存活性、好ましくは少なくとも105%の残存活性、好ましくは少なくとも110%の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pp改善された残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、以下に説明されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

好ましい実施形態では、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも2つの欠失は、181+182、181+183、182+183、181+184、182+184、及び183+184からなる群から選択される。

更に更なる態様では、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、変異体は、(配列番号6による番号付けを用いて)181、182、183、又は184のアミノ酸領域において少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される2つ以上の位置での置換であって、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する、置換と、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される位置に相当する1つ以上又は1つ若しくはいくつかの位置での変更と、を更に含み、少なくとも1つのキレート剤を更に含み、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明の一態様では、組成物は、少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、以下のアミラーゼ変異体のうちの1つ以上又は1つ若しくはいくつかを含む:SP722+R181G182 N195F;SP722+G182 D183 N195F;SP722+D183 G184 N195F;SP722+R181 G182 N195F M202L;SP722+G182 D183 N195F M202L;SP722+D183 G184 N195F M202L;SP722+D183 G184 N195F V206L Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206Y Y243F;SP722+R181 G182** L118K N195F R458K;SP722+G182 D183 L118K N195F H458K;SP722+D183 G184 L118K N195F H458K;SP722+D183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L。

AA560+R181 G182 N195F;AA560+G182 D183 N195F;AA560+D183 G184 N195F;AA560+ D183 G184 I206Y;AA560+ D183 G184 Y243F;AA560+ D183 G184 V206L、Y243F;AA560+ D183 G184 N195F V206L;AA560+D183 G184 N195F Y243F;AA560+D183 G184 N195F V206L Y243F;AA560+D183 G184 N195F V206Y Y243F;AA560+R181 G182 N195F M202L;AA560+G182 D183 N195F M202L;AA560+D183 G184 N195F M202L;AA560+R181 G182 R118K N195F R320K R458K;AA560+G182 D183 R118K N195F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206Y R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F Y243F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L Y243F R320K R458K。

SP707+ R181 G182 N195F;SP707+ G182 H183 N195F;SP707+H183 G184 N195F;SP707+H183 G184 I206Y;SP707+H183 G184 N195F I206Y;SP707+H183 G184 N195F Y243F;SP707+ H183 G184 I206Y Y243F;SP707+ H183 G184 N195F I206L Y243F;SP707+ H183 G184 N195F I206Y Y243F;SP707+ R181 G182 N195F M202L;SP707+ G182 H183 N195F M202L;SP707+H183 G184 N195F M202L;SP707+R181 G182 R118K N195F R320K R458K;SP707+G182 H183 R118K N195F R320K R458K;SP707+H183 G184 R118K N195F R320K R458K;
SP690+R181 G182 N195F;SP690+G182 T183 N195F;SP690+T183 G184 N195F;SP690+H183 G184 V206Y;SP690+H183 G184 N195F V206Y;SP690+H183 G184 N195F Y243F;SP690+ H183 G184 V206Y Y243F;SP690+H183 G184 N195F V206L Y243F;SP690+H183 G184 N195F V206Y Y243F;SP690+R181 G182 N195F M202L;SP690+G182 T183 N195F M202L;SP690+T183 G184 N195F M202L;SP690+R181 G182 R118K N195F R320K R458K;SP690+G182 T183 R118K N195F R320K R458K;SP690+T183 G184 R118K N195F R320K R458K。

本発明の別の実施形態は、洗浄組成物に関し、変異体残存活性は、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%、例えば少なくとも105%、例えば少なくとも110%、例えば少なくとも115%の残存活性であり、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のEnzChek又はPNP−G7アッセイに記載されるように、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明の更なる実施形態は、洗浄組成物に関し、変異体の残存活性は、親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pp改善されており、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のEnzChek又はPNP−G7アッセイに記載されるように、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。親と比較した変異体の残存活性における百分率点(pp)改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。

したがって、本発明の特定の態様において、組成物は、リン含有、非リン含有、カルボン酸塩含有、窒素含有又は非窒素含有キレート剤からなる群から選択されるキレート剤を含み、好ましいキレート剤は、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP及びHEDP、並びにこれらの混合物である。

本発明の好ましい態様において、変異体は、193、195、197、198、200、203、206、210、212及び213からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。

本発明の特に好ましい態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。好ましい実施形態において、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも2つの欠失は、181+182、181+183、182+183、181+184、182+184及び183+184からなる群から選択される。

本発明の別の好ましい態様では、変異体は、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243及びからなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上又は1つ若しくはいくつかの位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。

本発明の更に好ましい態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。

更なる態様において、変異体は、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、235、243、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される2つ以上の位置での置換を含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。

更に更なる態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、235、243、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される2つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当する。

好ましくは、上で同定される位置のうちの1つ以上での変更を含む変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較して、洗剤等のキレート剤を含む組成物、好ましくは液体洗剤における増加した安定性を有する。

したがって、本発明による変異体は、好ましい実施形態において、1つ以上のキレート剤の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。好ましい態様において、本発明による変異体は、1つ以上のキレート剤及び低カルシウム濃度の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。更に好ましい態様では、本発明による変異体は、キレート剤の存在下でその親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

特定の態様において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換と、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、338、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される1つ以上の位置での置換と、を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当し、変異体は、キレート剤の存在下で、少なくとも60%、例えば少なくとも65%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%の残存活性を更に有し、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度の前記キレート剤は、以下に記載されるように21℃及びpH 8.0で、残存活性が、「材料及び方法」に記載のEnzChekアッセイ又はPNP−G7アッセイに記載されるように、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。好ましい実施形態では、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも2つの欠失は、181+182、181+183、182+183、181+184、182+184及び183+184からなる群から選択される。

別の特定の態様において、変異体は、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号6の成熟ポリペプチドの位置に相当し、変異体は、少なくとも60%、例えば少なくとも65%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%の残存活性を更に有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pp改善された残存活性を有し、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のEnzChekアッセイ又はPNP−G7アッセイに記載されるように、DTPAの存在下で、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

本発明による変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、強力なキレート剤に対してより安定するという利点を有するが、同時に、それらは、洗浄性能又は食器洗浄性能等の親アルファ−アミラーゼの性能性質を維持している。好ましい実施形態において、本発明による変異体は、キレート剤に対してより安定するという利点を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。これらの好ましいキレート剤は、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP、HEDP及びこれらの混合物から選択され得るが、それらに制限されない。

したがって、本発明において有用な変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、金属イオン、具体的には、カルシウムイオンに結合するキレート剤の存在下で、増加した安定性を有する。洗濯プロセスの有益な効果のため、通常、洗剤にキレート剤を包含するが、増加した安定性は、フィチン酸塩又はクエン酸塩等の天然キレート剤を含む植物原料が存在する条件においても明らかであり得る。具体的には、強力なキレート剤は、カルシウムイオンのために、カルシウム感受性のアルファ−アミラーゼと競合し、アルファ−アミラーゼの安定性又は活性が減少するという結果を伴って、それらの構造において結合されるカルシウムイオンのために、アルファ−アミラーゼをある程度欠乏させることができる。

したがって、本発明の変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP、HEDP及びこれらの混合物等のキレート剤の存在下で、改善された安定性及び/又は活性を有する。

親アルファ−アミラーゼと比較した、キレート剤に対して増加した安定性に加えて、本発明の変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較したとき、保持又は改善された洗浄性能を有する。改善された洗浄性能は、「材料及び方法」に記載されるようにビーカーを用いて、AMSA又は洗浄性能試験において測定され得る。

したがって、本発明の特定の実施形態では、変異体は、残存活性が、キレート剤の存在下で、(「材料及び方法」に記載の)EnzChek又はPNP−G7アッセイに記載されるように、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、少なくとも70%の残存活性、好ましくは少なくとも75%の残存活性、好ましくは少なくとも80%の残存活性、好ましくは少なくとも85%の残存活性、好ましくは少なくとも90%の残存活性、好ましくは少なくとも95%の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼ残存活性と比較して、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pp改善された残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、以下に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、変異体は、「材料及び方法」に記載されるようにビーカーを用いて、AMSA又は洗浄性能試験において測定されるとき、親アルファ−アミラーゼと比較して、少なくとも40%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも55%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも65%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%の改善された洗浄性能を更に有する。

本発明の好ましい態様において、組成物は、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも60%、例えば少なくとも65%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも100%の残存活性を有する変異体を含み、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5mM未満、好ましくは4.5mM未満、4mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1mM未満の濃度の前記キレート剤は、実施例2aに記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のEnzChek又はPNP−G7アッセイに記載されるように、pH 8及び31℃で18時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

したがって、本発明の特定の態様において、組成物は、リン含有、非リン含有、窒素含有、又は非窒素含有キレート剤からなる群から選択されるキレート剤を含み、好ましくは、キレート剤は、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP、HEDP及びこれらの混合物である。

好ましい態様において、本発明による変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の更なる一態様では、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を更に含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12に示されるアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の別の態様において、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、1つ以上の193、195、197、198、200、203、206、210、212、213又は243位での置換、及び1つ以上の116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458位での置換を含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の別の態様において、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、1つ以上の193、195、197、198、200、203、206、210、212、213又は243位での置換、及び1つ以上の116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458位での置換を更に含み、変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

一態様では、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼと比較して、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、10置換未満、例えば9置換未満、例えば8置換未満、例えば7置換未満、例えば6置換未満、例えば5置換未満、例えば4置換未満、例えば3置換未満、例えば2置換未満であり、並びに/あるいは欠失の数は、10欠失未満、例えば9欠失未満、例えば8欠失未満、例えば7欠失未満、例えば6欠失未満、例えば5欠失未満、例えば4欠失未満、例えば3欠失未満、例えば2欠失未満、例えば1欠失未満であるか、あるいは変異体は、欠失を含まない場合もあり、並びに/あるいは挿入の数は、10挿入未満、例えば9挿入未満、例えば8挿入未満、例えば7挿入未満、例えば6挿入未満、例えば5挿入未満、例えば4挿入未満、例えば3挿入未満、例えば2挿入未満、例えば1挿入未満であるか、あるいは変異体は、挿入を含まない場合もある。

一態様では、変異体は、193位に相当する位置での置換を含む。別の態様では、変異体は、配列番号6の成熟ポリペプチドの[G、A、T又はM]を有する193位に相当する位置での置換を含む。特定の一実施形態において、変異体は、配列番号6の成熟ポリペプチドの置換S193Tを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換S193Tを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、195位での置換を含み、好ましい態様では、変異体は、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、195位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換N195Fを含み、親は、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位での置換としてYを含む。別の態様では、変異体は、置換N195Yを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、195位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換N195Fを含み、親は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位での置換としてYを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195Yを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、197位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、197位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、197位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換N197Fを含み、親は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、197位での置換としてLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N197Lを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、197位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、197位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、197位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換N197Fを含み、親は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、197位での置換としてLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N197Lを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、198位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、198位での、[Q、N、D、E、R、K又はH]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、198位でNを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y198Nを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18、20又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、198位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、198位での、[Q、N、D、E、R、K又はH]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、198位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y198Nを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、200位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、200位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、200位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y200Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、200位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、200位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、200位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y200Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、203位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、203位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y203Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、203位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、203位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y203Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、206位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、206位での、[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D又はE]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、206位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、206位でYを含み、更に別の態様では、変異体は、206位でLを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

特定の一実施形態において、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Yを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Yを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Fを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Fを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Lを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Lを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Hを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Hを含む。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、206位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、206位での、[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D又はE]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、206位でFを含み、別の好ましい態様では、変異体は、206位でYを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Yを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Yを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Lを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Lを含む。

特定の一実施形態において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206Hを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206Hを含む。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、210位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、210位でYを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換H210Yを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、210位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、210位でYを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換H210Yを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、212位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、212位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、212位でVを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換E212Vを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、212位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、212位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、212位でのVを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換E212Vを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、213位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、213位での、[G、A、S、T又はM]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、213位でAを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換V213Aを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、213位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、213位での、[G、A、S、T又はM]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、213位でAを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換V213Aを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、243位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、243位でFを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y243Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、243位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、243位でAを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Y243Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、変異体は、193位及び195位での置換を含む。別の態様では、変異体は、193位及び195位での、[F、W、Y、L、I、V、N、G、A、T、M又はQ]での置換を含む。別の態様では、変異体は、193位及び195位での置換として、それぞれ、T及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6の成熟ポリペプチドの置換S193T+N195Fを含む。別の態様では、変異体は、193位及び195位での置換として、それぞれ、T及びYを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6の成熟ポリペプチドの置換S193T+N195Yを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193位及び195位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193位及び195位での、[F、W、Y、L、I、V、N、G、A、T、M又はQ]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、193位及び195位での置換として、それぞれ、T及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6の成熟ポリペプチドの置換S193T+N195Fを更に含む。別の態様では、変異体は、193位及び195位での置換として、それぞれ、T及びYを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6の成熟ポリペプチドの置換S193T+N195Yを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6の番号付けを用いて、195位及び198位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び198位での、[F、W、Y、L、I、V、N又はQ]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び198位での置換として、それぞれ、F及びNを含む。別の態様では、変異体は、置換N195F+Y198Nを含み、親は、配列番号6、8、10、又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び198位での置換として、それぞれ、Y及びNを含む。別の態様では、変異体は、置換N195Y+Y198Nを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6の番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び198位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び198位での、[F、W、Y、L、I、V、N又はQ]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位及び198位での置換として、それぞれ、F及びNを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195F+Y198Nを更に含み、親は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び198位での置換として、それぞれ、Y及びNを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195Y+Y198Nを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位及び206位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び206位での、[F、W、Y、V、I、L、C、N、S、T、D、E又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び206位での置換として、それぞれ、F及びLを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206[F、Y、L、H又はN]を含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F及びI206[F、Y、L又はH]を含む。別の態様では、変異体は、195及び206での置換として、それぞれ、Y及びLを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206[F、Y、L、H又はN]を含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206[F、Y、L、H、N]を含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び206位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び206位での、[F、W、Y、V、I、L、C、N、S、T、D、E又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位及び206位での置換として、それぞれ、F及びLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F及びV206[F又はY]を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206[F、Y、L、H又はN]を更に含む。別の態様では、変異体は、195位及び206位での置換として、それぞれ、Y及びLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206[F、Y、L、H又はN]を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位及び210位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び210位での、[F、W、Y、V、I、L、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び210位での置換として、それぞれ、F及びYを含む。別の態様では、変異体は、置換N195F+H210Yを含み、親は、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び210位での置換として、Yを含む。別の態様では、変異体は、置換N195Y+H210Yを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び210位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び210位での、[F、W、Y、V、I、L、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位及び210位での置換として、それぞれ、F及びYを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195F+H210Yを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10、12、18は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び210位に相当する位置での置換として、Yを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195Y+H210Yを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、198位及び206位に相当する位置での置換を含む。別の態様では、変異体は、198位及び206位での、[N、Q、L、I、F、Y、C、N、S、T、D、E又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、198位及び206位での置換として、それぞれ、N及び[F又はY]を含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換Y198N+V206[F、Y、L、H又はN]を含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換Y198N+I206[F、Y、L、H又はN]を含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、198位及び206位に相当する位置での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、198位及び206位での、[N、Q、L、I、F、Y、C、N、S、T、D、E又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、198位及び206位での置換として、それぞれ、N及び[F又はY]を含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換Y198N+V206[F、Y、L、H又はN]を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換Y198N+I206[F、Y、L、H又はN]を更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、206位及び213位での置換を含む。

別の態様では、変異体は、206位及び213位での、[D、E、L、I、V、F、Y、W、G、A、S、T又はM]での置換を含む。別の態様では、変異体は、206位及び210位での置換として、それぞれ、[F又はY]及びAを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206F又はY+V213Aを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206[F、Y、L、H又はN]+V213Aを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、206位及び213位での置換を更に含む。

別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、206位及び213位での、[D、E、L、I、V、F、Y、W、G、A、S、T又はM]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、206位及び位210での置換として、それぞれ、[F又はY]及びAを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206[F、Y、L、H又はN]+V213Aを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換I206[F、Y、L、H又はN]+V213Aを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位及び243位での置換として、それぞれ、Fを含む。別の態様では、変異体は、置換N195F及びY243Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び243位での置換として、それぞれ、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、置換N195Y+Y243Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び243位に相当する位置での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位及び243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位及び243位での置換として、それぞれ、Fを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195F+Y243Fを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、195位及び243位での置換として、それぞれ、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換N195Y+Y243Fを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、206位及び243位での、[H、D、E、N、F、W、Y、L、I又はV]での置換を含む。別の態様では、変異体は、それぞれ、206位及び243位での置換として、それぞれ、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206[F、Y、L、H又はN]+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換V206[F、Y、L、H又はN]+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、206位及び243位での、[H、D、E、N、F、W、Y、L、I又はV]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、それぞれ、206位及び243位での置換として、それぞれ、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換V206[F、Y、L、H又はN]+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換V206[F、Y、L、H又はN]+Y243Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、193位、195位、及び197位での置換を含む。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を含む。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位に相当する位置での置換として、それぞれ、T及びFを含む。別の態様では、変異体は、置換S193T+N195F+N197Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での置換として、それぞれ、T、F及びLを含む。別の態様では、変異体は、置換S193T+N195F+N197Lを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位に相当する位置での置換として、それぞれ、T、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、置換S193T+N195Y+N197Fを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位に相当する位置での置換として、それぞれ、T、Y及びLを含む。別の態様では、変異体は、置換S193T+N195Y+N197Lを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193位、195位、及び197位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193位、195位、及び197位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での置換として、それぞれ、T及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換S193T+N195F+N197Fを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での置換として、それぞれ、T、F及びLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換S193T+N195F+N197Lを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での置換として、それぞれ、T、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換S193T+N195Y+N197Fを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、193位、195位、及び197位での置換として、それぞれ、T、Y及びLを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、置換S193T+N195Y+N197Lを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、18又は22、好ましくは、配列番号6、8、10又は12を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206Y+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206Y+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206Y+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206Y+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206L+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206L+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206L+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206L+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、N及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206N+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206N+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、N及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206N+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206N+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、H及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206H+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206H+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、H及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206H+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206H+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、195位、206位及び243位での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、F及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206F+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206F+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、F及びFを含む。別の態様では、変異体は、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206F+Y243Fを含む。別の態様では、変異体は、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206F+Y243Fを含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206Y+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206Y+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、Y及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206Y+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206Y+Y243Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206L+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206L+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、L及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206L+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206L+Y243Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、N及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206N+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206N+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、N及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206N+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206N+Y243Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、H及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206H+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206H+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、H及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206H+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206H+Y243Fを更に含む。

別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号6による番号付けを用いて、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195位、206位及び243位での、[D、E、L、I、F、V、Y、C、N、S、T又はH]での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、F、F及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195F+V206F+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195F+I206F+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、195位、206位、及び243位での置換として、それぞれ、Y、F及びFを含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号6又は12の成熟ポリペプチドの置換N195Y+V206F+Y243Fを更に含む。別の態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、配列番号8又は10の成熟ポリペプチドの置換N195Y+I206F+Y243Fを更に含む。

本発明の一態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、以下の置換N195[F若しくはY]、N197[F若しくはL]、Y198N、Y200F、Y203F、I206[H、L、N、F若しくはY]、H210Y、E212[V若しくはG]、V213Aのうちの1つ以上と、配列番号10の成熟ポリペプチド配列の1つ以上の位置M116T、Q129L、G133E、E134Y、K142R、P146S、G147E、G149R、N151R、Y152H、Q169E、N174R、A186R、Y243F、S244Q、G303V、R320N、R359I、N418D、A447Vでの置換、あるいは配列番号10を有するアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも91%、特に好ましくは少なくとも92%、特に好ましくは少なくとも93%、特に好ましくは少なくとも94%、更に特により好ましくは少なくとも95%の相同性、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、以下の置換N195[F若しくはY]、N197[F若しくはL]、Y198N、Y200F、Y203F、I206[F、Y、L、H若しくはN]、H210Y、E212[V若しくはG]、V213A、又はY243Fのうちの1つ以上と、配列番号8の成熟ポリペプチド配列の1つ以上の位置M116T、Q129L、G133E、E134Y、P146S、G147E、G149R、T151R、Y152H、Q169E、N174R、G186R、S244Q、G303V、R320N、R359I、N418D、A447Vでの置換、あるいは配列番号8を有するアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも91%、特に好ましくは少なくとも92%、特に好ましくは少なくとも93%、特に好ましくは少なくとも94%、更に特により好ましくは少なくとも95%の相同性、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の一態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、以下の置換N195[F若しくはY]、N197[F若しくはL]、Y198N、Y200F、Y203F、V206[F、Y、L、H若しくはN]、H210Y、E212[V若しくはG]、V213A、又はY243Fのうちの1つ以上と、配列番号6の成熟ポリペプチド配列の1つ以上の位置I116T、Q129L、G133E、E134Y、K142R、P146S、G147E、G149R、N151R、Y152H、Q169E、Q174R、A186R、S244Q、G303V、K320N、R359I、N418D、A447Vでの置換、あるいは配列番号6を有するアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも91%、特に好ましくは少なくとも92%、特に好ましくは少なくとも93%、特に好ましくは少なくとも94%、更に特により好ましくは少なくとも95%の相同性、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の一態様では、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、以下の置換N195[F若しくはY]、N197[F若しくはL]、Y198N、Y200F、Y203F、V206[F、Y、L、H若しくはN]、H210Y、E212[V若しくはG]、V213A、又はY243Fのうちの1つ以上と、配列番号12の成熟ポリペプチド配列の1つ以上の位置I116T、Q129L、G133E、E134Y、K142R、P146S、G147E、G149R、N151R、Y152H、Q169E、Q174R、A186R、S244Q、G303V、K320N、R359I、N418D、A447Vでの置換、あるいは配列番号12を有するアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、特に好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも91%、特に好ましくは少なくとも92%、特に好ましくは少なくとも93%、特に好ましくは少なくとも94%、更に特により好ましくは少なくとも95%の相同性、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

したがって、本発明の一態様は、195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体を含む組成物に関し、
(a)(1つ又は複数の)変更は、独立して、
(i)その位置のすぐ下流でのアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。

したがって、本発明の一態様は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される1つ以上の位置での変更と、を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体に関し、
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。

好ましくは変異体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26、好ましくは、配列番号6、8、10、12、14、16、18又は20のうちの1つのアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、及び更に最も好ましくは少なくとも約97%程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、上で同定された位置のうちの1つ以上での変更を含む変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較して、洗剤、好ましくは液体洗剤において増加した安定性を有する。

本発明者は、これらの変異体が、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤を含む組成物において、改善された安定性を有することを見出しており、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

したがって、本発明の別の態様は、以下:
(a)アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する工程、
(b)配列番号6の成熟ポリペプチドの195、197、198、200、203、206、210、212、213、243位に相当する1つ以上の位置を占有する1つ以上のアミノ酸を選択し、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418,431、434、447、458位に相当する1つ以上の位置を更に選択する工程、
(c)選択されたアミノ酸残基を置換若しくは欠失することによって、又は選択されたアミノ酸残基に下流で隣接した1つ以上のアミノ酸残基を挿入することによって、配列を修飾する工程、
(d)修飾された配列を有する変異体ポリペプチドを産生する工程、
(e)変異体ポリペプチドを、アミラーゼ活性及び安定性について試験する工程、及び
(f)親ポリペプチドと比較して、キレート剤の存在下で、アミラーゼ活性及び増加した安定性を有する変異体ポリペプチドを選択する工程を含むポリペプチドを調製するための方法に関し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。

好ましくは、変異体は、3つの位置、より好ましくは4つの位置、更により好ましくは5つの位置、及び最も好ましくは6つの位置での変更を含み、特に好ましい実施形態では、変異体は、(配列番号6による番号付けを用いて)181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、更に193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される親アルファ−アミラーゼにおける位置に相当する1つ以上の位置での1つ以上の置換と、を含む。

したがって、好ましい態様は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失と、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される1つ以上の位置での変更と、を含み、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418,431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体に関し、
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。

好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、1つ以上の(いくつかの)アミノ酸欠失及び/又は置換及び/又は挿入を有する。特に好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、本明細書において配列番号6に示されるアミノ酸配列を有し、以下の変更:D183及びG184(183位及び184位での欠失)を更に含むアルファ−アミラーゼを含み、この変異体は、キレート剤の存在下で、洗剤における良好な性能及び改善された安定性を示す。

好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、SP707+R181 G182、SP707+G182 H183、SP707+H183 G184のうちのいずれかを含む、SP707(配列番号8)を含む。

別の好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、SP722+R181 G182、SP722+G182 D183、SP722+D183 G184のうちのいずれかを含む、SP722(配列番号6)を含む。

更に別の好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、AA560+R181 G182、AA560+G182 D183、AA560+D183 G184のうちのいずれかを含む、AA560(配列番号10)を含む。

別の好ましい実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、SP690+R181 G182、SP690+G182 T183、SP690+T183 G184のうちのいずれかを含む、SP690(配列番号12)を含む。

「SP722+R181 G182」は、バチルス種アルファ−アミラーゼSP722が位置R181+G182における欠失によって変異されたことを意味し、番号付けは、配列番号6に相当する。

したがって、本発明の一態様では、変異体アルファ−アミラーゼは、以下のうちのいずれかを含む、SP722、SP690、SP707、又はAA560のうちの任意の1つを含む:
SP722+R181G182、SP722+G182+D183、SP722+D183及びG184;SP722+R181G182 N195F;SP722+G182 D183 N195F;SP722+D183 G184 N195F;SP722+R181G182 M202L;SP722+G182 D183 M202L;SP722+D183 G184 M202L;SP722+R181 G182 N195F M202L;SP722+G182 D183 N195F M202L SP722+D183 G184 N195F M202L;SP722+D183 G184 N195F V206L Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206Y Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206F Y243F;
SP722+R181 G182 R181Q;SP722+G182 D183 R181Q;SP722+D183 G184 R181Q;SP722+R181 G182 L118K N195F H458K;SP722+G182 D183 L118K N195F H458K;SP722+D183 G184 L118K N195F H458K;SP722+D183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L;
AA560+R181 G182;AA560+G182 D183;AA560+D183 G184;AA560+R181 G182 N195F;AA560+G182 D183 N195F;AA560+D183 G184 N195F;AA560+ D183 G184 I206Y;AA560+ D183 G184 Y243F;AA560+ D183 G184 I206L Y243F;AA560+ D183 G184 N195F I206L;AA560+D183 G184 N195F Y243F;AA560+D183 G184 N195F I206L、Y243F;AA560+D183 G184 N195F I206Y Y243F;AA560+D183 G184 N195F I206F;AA560+R181 G182 M202L;AA560+G182 D183 M202L;AA560+D183 G184 M202L;
AA560+R181 G182 N195F M202L;AA560+G182 D183 N195F M202L;AA560+D183 G184 N195F M202L;
AA560+R181 G182 R118K N195F R320K T458K;AA560+G182 D183 R118K N195F R320K T458K;AA560+D183 G184 R118K N195F R320K T458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206Y R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F Y243F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L Y243F R320K R458K
SP707+R181 G182、SP707+G182 H183、SP707+H183 G184;SP707+ R181 G182 N195F;SP707+ G182 H183 N195F;SP707+H183 G184 N195F I206L、Y243F;SP707+H183 G184 N195F I206Y Y243F;SP707+H183 G184 N195F I206F Y243F;SP707+H183 G184 N195F;SP707+ R181 G182 M202L;SP707+ G182 H183 M202L;SP707+D183 G184 M202L;SP707+ R181 G182 N195F M202L;SP707+ G182 H183 N195F M202L;SP707+H183 G184 N195F M202L;SP707+R181 G182 R181Q;SP707+G182 H183 R181Q;SP707+H183 G184 R181Q;
SP707+R181 G182 R118K N195F R320K R458K;SP707+G182 H183 R118K N195F R320K R458K;SP707+H183 G184 R118K N195F R320K R458K;
SP690+R181 G182、SP690+G182 T183、SP690+T183 G184;SP690+R181 G182 N195F;SP690+G182 T183 N195F;SP690+T183 G184 N195F;SP690+T183 G184 N195F V206L、Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206Y Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206F Y243F;SP690+R181 G182 M202L;SP690+G182 T183 M202L;SP690+T183 G184 M202L;
SP690+R181 G182 N195F M202L;SP690+G182 T183 N195F M202L;SP690+T183 G184 N195F M202L;
SP690 +R181 G182 R118K N195F R320K R458K;SP690 +G182 T183 R118K N195F R320K R458K;SP690 +T183 G184 R118K N195F R320K R458K。

「SP722+R181 G182 N195F」は、バチルス種アルファ−アミラーゼSP722が、位置R181+G182での欠失及び195位でのAsn(N)からPhe(F)への置換によって変異されたことを意味し、番号付けは、配列番号6に相当する(欠失した位置が依然として存在するかのように計数する。すなわち、2つの位置を欠失するときに、番号付けが2つの位置によってシフトダウンしない)。

本発明の特定の好ましい実施形態では、変更は、以下の置換から選択される:
X193A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはS193T、
X195A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはN195[F又はY]、
X197A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはN197[F又はL]、
X198A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはY198N、
X200A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはY200F、
X203A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、X、Y、好ましくはY203F、
X206A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはV206[F、Y、L、H又はN]、
X210A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはH210Y、
X212A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはE212[V又はG]、及び
X213A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、X、Y、好ましくはV213A、
X243A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY243F。

別の好ましい実施形態では、変異体は、3つの位置、より好ましくは4つの位置、より好ましくは5つの位置、及びより好ましくは6つの位置での変更を含み、特に好ましい実施形態では、変異体は、(配列番号6による番号付けを用いて)181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更と、116、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、243、244、303、320、359、418、447からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更と、を更に含む。

したがって、本発明の特定の好ましい実施形態では、変更は、以下の置換から選択される:
X116A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはN116T
X118A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR118K
X129A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、好ましくはQ129L
X133A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG133E
X134A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはD134Y
X142A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはK142R
X146A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはP146S
X147A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、Y、好ましくはG147E
X149A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG149R
X151A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはT151R
X152A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY152H
X169A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはQ169E
X174C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはQ174R
X186A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、Y、好ましくはA186R
X235A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはI235N
X243A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY243F
X244A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS244Q
X303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG303V
X320A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはK320N
X339A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS339P
X359C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR359I
X418A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはN418D
X431A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS431T
X434A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはP434T
X447A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはA447V
X458A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR458K。

特定の好ましい実施形態において、変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を更に含む。

好ましい実施形態では、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、好ましくは17置換、より好ましくは16置換、より好ましくは15置換、より好ましくは14置換、より好ましくは13置換、より好ましくは12置換、より好ましくは11置換、より好ましくは10置換、より好ましくは9置換、より好ましくは8置換、より好ましくは7置換、より好ましくは6置換、より好ましくは5置換、より好ましくは4置換、更により好ましくは3置換、及び最も好ましくは2置換である。別の好ましい実施形態では、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、好ましくは17置換、より好ましくは16置換、より好ましくは15置換、より好ましくは14置換、より好ましくは13置換、より好ましくは12置換、より好ましくは11置換、より好ましくは10置換、より好ましくは9置換、より好ましくは8置換、より好ましくは7置換、より好ましくは6置換、より好ましくは5置換、より好ましくは4置換、更により好ましくは3置換、及び最も好ましくは2置換からなる。

具体的には、好ましい実施形態において、本発明による変異体は、異なる変更の組み合わせを含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明による変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失、好ましくは、183位及び184位での欠失を含み、186位及び195位での変更置換の以下の組み合わせ:174位及び212位での置換、206位及び212位での置換、206位、212位及び304位での置換、206位、212位、304位及び447位での置換、116位及び133位での置換、235位及び339位での置換、193位及び206位での置換、116位、133位及び142位での置換、116位、133位、142位及び198位での置換、116位、133位、142位、198位及び206位での置換、133位及び195位での置換、133位、195位及び198位での置換、133位、195位、198位及び200位での置換、116位及び195位での置換、116位、195位及び198位での置換、142及び146位での置換、142位、146位及び149位での置換、142位、146位、149位及び195位での置換、142位、146位、149位、195位及び198位での置換、142位、146位、149位、195位、198位及び206位での置換、151及び210位での置換、151位、210位及び320位での置換、186位、195位、212位及び213位での置換、151位、210位、320位及び359位での置換、151位、210位、320位、359位及び418位での置換、147位及び149位での置換、147位、149位及び169位での置換、147位、149位、169位及び198位での置換、147位、149位、169位、198位及び203位での置換、147位、149位、169位、198位、203位及び206位での置換、133位及び149位での置換、133位、149位及び195位での置換、133位、149位、195位及び198位での置換、133位、149位、195位、198位及び203位での置換、147位及び152位での置換、147位、152位及び169位での置換、147位、152位、169位及び198位での置換、147位、152位、169位、198位及び206位での置換、195位及び206位での置換、195位及び243位での置換、195位及び210位での置換、206位及び210位での置換、186位及び195位での置換、195位及び206位での置換、195位、206位及び243位での置換、206位及び243位での置換、133位及び149位での置換、133位、149位及び198位での置換、133位、149位、198位及び206位での置換、116位及び133位での置換、116位、133位及び147位での置換、116位、133位、147位及び152位での置換、116位、133位、147位、152位及び198位での置換、116位、133位、147位、152位、198位及び203位での置換、116位、133位、147位、152位、198位、203位及び206位での置換、147位及び149位での置換、147位、149位及び195位での置換、147位、149位、195位及び198位での置換、147位、149位、195位、198位及び206位での置換、133位及び142位での置換、133位、142位及び195位での置換、133位、142位、195位及び198位での置換、133位及び149位での置換、133位、149位及び152位での置換、133位、149位、152位及び195位での置換、133位、149位、152位、195位及び198位での置換、133位、149位、152位、195位、198位及び206位での置換、116位及び129位での置換、116位、129位及び142位での置換、116位、129位、142位及び195位での置換、116位、129位、142位、195位及び198位での置換、116位、129位、142位、195位、198位及び203位での置換、116位、129位、142位、195位、198位、203位及び206位での置換、133位及び149位での置換、133位、149位及び152位での置換、133位、149位、152位及び195位での置換、133位、149位、152位、195位及び198位での置換、133位、149位、152位、195位、198位及び203位での置換、133位、149位、152位、195位、198位、203位及び206位での置換、116位及び133位での置換、116位、133位及び149位での置換、116位、133位、149位及び198位での置換、116位、133位、149位、198位及び203位での置換、116位、133位、149位、198位、203位及び206位での置換、195位及び198位での置換、195位、198位及び203位での置換、195位、198位、203位及び206位での置換、133位、149位、195位、203位及び206位での置換のうちの1つを更に含む。

別の特定の好ましい実施形態では、本発明による変異体は、異なる変更の組み合わせを含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明による変異体は、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失、好ましくは、183位及び184位での欠失を含み、186位での、[R、T、K、H、E、D、Q又はN]での変更置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での変更置換の以下の組み合わせのうちの1つを更に含む:174位での、[R、K、H、E、D、Q又はN]での置換、及び212位での置換、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;206位での、[D、E、F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換、及び212位での[F、W、Y、L、I又はV]での置換;206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換、212位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び304位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換、212位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、304位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び447位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び133位での、[E又はD]での置換;235位での、[N又はL]での置換、及び339位での、[P]での置換;193位での、[G、A、T又はM]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q、又はH]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、及び142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;186位での、[R、T、K、H、E、D、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、212位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、及び213位での、[A]での置換;133位での、[E又はD]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び200位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び146位での、[G、A、S、T又はM]での置換;142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、146位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、146位での、[G、A、S、T又はM]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、146位での、[G、A、S、T又はM]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、146位での、[G、A、S、T又はM]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;151位及び210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;151位、210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び320位での、[Q又はN]での置換;151位、210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、320位での、[Q又はN]での置換、及び359での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;151位、210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、320位での、[Q又はN]での置換、359位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び418位での、[E又はD]での置換;147位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び169位での、[E又はD]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、169位での、[E又はD]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、169位での、[E又はD]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、169位での、[E又はD]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;147位での、[E又はD]での置換、及び152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び169位での、[E又はD]での置換;147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、169位での、[E又はD]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、169位での、[E又はD]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換、及び210位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;186位での、[R、K、H、E、D、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、206及び243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;206位及び243位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位及び206位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び133位での、[E又はD]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、及び147位での、[E又はD]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、147位での、[E又はD]での置換、及び152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、147位での、[E又はD]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;147位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;147位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位及び206位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y
、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位及び206位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び133位での、[E又はD]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;133位での、[E、又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、203位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q、又はH]での置換。

本発明における特定の有用な変異体は、(配列番号6の番号付けを用いて)以下を含む:
D183 G184 N195L;D183 G184 N197F;D183 G184 N197L;D183 G184 Y243F;D183 G184 N195F、D183 G184 N277F;D183 G184 S431T;D183 G184 P434T;D183 G184 I235N S339P;D183 G184 L351F;D183 G184 A186R、N195F;D183 G184 H210Y;D183 G184 V206Y;D183 G184 V206L;D183 G184 V206F;D183 G184 V213A Q174R;D183 G184 E212V;D183 G184 V206F E212G G304V A447V;N116T G133E K142R D183 G184 Y198N V206Y;G133E D183 G184 N195Y Y198N Y200F;D183 G184 A186D N195F E212V V213A;N116T D183 G184 N195Y Y198N;K142R P146S G149K D183 G184 N195Y Y198N V206I;D134Y D183 G184;T151R D183 G184 H210Y K320N R359I N418D Q490H;G147E G149R Q169E D183 G184 Y198N Y203F V206Y;G133E G149R D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;G147E Y152H Q169E D183 G184 Y198N V206Y;D183 G184 N195F V206Y;D183 G184 N195F V206L;D183 G184 N195F V206F;D183 G184 V206L Y243F;D183 G184 V206F Y243F;D183 G184 N195F Y243F;D183 G184 N195F H210Y;D183 G184 V206Y H210Y;D183 G184 V213A;D183 G184 S193T;D183 G184 A186T N195F;D183 G184 N195F V206Y Y243F;D183 G184 N195F V206L Y243F;D183 G184 N195F V206Y Y243F;D183 G184 N195F V206F Y243F;D183 G184 V206Y Y243F;D183 G184 N195Y;G133D G149R D183 G184 Y198N V206Y;N116T G133E G147E Y152H D183 G184 Y198N Y203F V206Y;G147E G149R D183 G184 N195F Y198N V206Y;G133E K142R D183 G184 N195F Y198N;G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N V206Y;N116T Q129L K142R D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;N116T G133E G149R G182 D183 Y198N Y203F V206Y;D183 G184 S193T V206L、D183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L。

好ましい実施形態では、本発明において有用な変異体は、以下を含む:
SP722SP722+D183 G184 N195L;SP722SP722+D183 G184 N197F;SP722SP722+D183 G184 N197L;SP722SP722+D183 G184 Y243F;SP722SP722+D183 G184 N195F、SP722SP722+D183 G184 N277F;SP722+D183 G184 S431T;SP722+D183 G184 P434T;SP722+D183 G184 I235N S339P;SP722+D183 G184 L351F;SP722+D183 G184 A186D N195F E212V V213A;SP722+D183 G184 A186R、N195F;SP722+D183 G184 H210Y;SP722+D183 G184 V206Y;SP722+D183 G184 V206L、SP722+D183 G184 V206F;SP722+D183 G184 V213A Q174R;SP722+D183 G184 E212V;SP722+D183 G184 V206Y E212G G304V A447V;SP722+N116T G133E K142R D183 G184 Y198N V206Y;SP722+G133E D183 G184 N195Y Y198N Y200F;SP722+N116T D183 G184 N195Y Y198N;SP722+K142R P146S G149K D183 G184 N195Y Y198N V206I;SP722+D134Y D183 G184;SP722+T151R D183 G184 H210Y K320N R359I N418D;SP722+G147E G149R Q169E D183 G184 Y198N Y203F V206Y;SP722+G133E G149R D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP722+G147E Y152H Q169E D183 G184 Y198N V206Y;SP722+D183 G184 N195F V206Y;SP722+D183 G184 N195F V206F;SP722+D183 G184 N195F V206L;SP722+D183 G184 I206L Y243F;SP722+D183 G184 I206F Y243F;SP722+D183 G184 N195F Y243F;SP722+D183 G184 N195F H210Y;SP722+D183 G184 V206Y H210Y;SP722+D183 G184 V213A;SP722+D183 G184 S193T;SP722+D183 G184 A186T N195F;SP722+D183 G184 N195F V206Y Y243F;SP722+D183 G184 V206Y Y243F;SP722+D183 G184 N195Y;SP722+G133D G149R D183 G184 Y198N V206Y;SP722+N116T G133E G147E Y152H D183 G184 Y198N Y203F V206Y;SP722+G147E G149R D183 G184 N195F Y198N V206Y;SP722+G133E K142R D183 G184 N195F Y198N;SP722+G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N V206Y;SP722+N116T Q129L K142R D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP722+G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP722+N116T G133E G149R G182 D183 Y198N Y203F V206Y;SP722+D183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L。

好ましい一実施形態において、変異体は、以下から選択される:SP722+D183 G184 N195F V206L Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206Y Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206N Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206F Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206H;SP722+D183 G184 N195F V206Y;SP722+D183 G184 V206F Y243F;SP722+D183 G184 N195F V206L H210Y;SP722+D183 G184 S193T V206L;SP722+D183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L。

別の好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む:
SP707+H183 G184 N195L;SP707+H183 G184 N197F;SP707+H183 G184 N197L;SP707+H183 G184 Y243F;SP707+H183 G184 N195F、SP707+H183 G184 N277F;SP707+H183 G184 A186D N195F E212V V213A;SP707+H183 G184 S431T;SP707+H183 G184 A434T;SP707+H183 G184 I235N A339P;SP707+H183 G184 L351F、SP707+H183 G184 A186R N195F;SP707+H183 G184 H210Y;SP707+H183 G184 I206Y;SP707+H183 G184 I206L、SP707+H183 G184 I206F;SP707+H183 G184 V213A Q174R;SP707+H183 G184 E212V;SP707+H183 G184 I206Y E212G G304V A447V;SP707+M116T G133E H183 G184 Y198N I206Y;SP707+G133E H183 G184 N195Y Y198N Y200F;SP707+M116T H183 G184 N195Y Y198N;SP707+P146S G149K H183 G184 N195Y Y198N V206I;SP707+E134Y H183 G184;SP707+ T151R H183 G184 H210Y R320N R359I N418D ;SP707+G147E G149R Q169E H183 G184 Y198N Y203F I206Y;SP707+G133E G149R H183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;SP707+G147E Q169E H183 G184 Y198N I206Y;SP707+H183 G184 N195F I206Y;SP707+H183 G184 N195F I206L;SP707+H183 G184 N195F I206F;SP707+H183 G184 N195F Y243F;SP707+H183 G184 N195F H210Y;SP707+H183 G184 I206Y H210Y;SP707+H183 G184 V213A;SP707+H183 G184 S193T;SP707+H183 G184 A186T N195F;SP707+H183 G184 N195F I206Y Y243F;SP707+H183 G184 N195F I206F Y243F;SP707+H183 G184 N195F I206L Y243F;SP707+H183 G184 N195F I206Y Y243F SP707+H183 G184 I206Y Y243F;SP707+H183 G184 I206L Y243F;SP707+H183 G184 I206F Y243F;SP707 ;SP707+H183 G184 N195Y;SP707+G133D G149R H183 G184 Y198N I206Y;SP707+M116T G133E G147E H183 G184 Y198N Y203F I206Y;SP707+G147E G149R H183 G184 N195F Y198N I206Y;SP707+G133E H183 G184 N195F Y198N;SP707+G133E G149R H183 G184 N195Y Y198N I206Y;SP707+M116T Q129L H183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;SP707+G133E G149R H183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;SP707+M116T G133E G149R G182 H183 Y198N Y203F I206Y;SP707+D183 G184 R118K N195F R320K R458K;SP707+D183 G184 R118K N195F I206L R320K R458K;SP707+D183 G184 R118K N195F I206Y R320K R458K;SP707+D183 G184 R118K N195F Y243F R320K R458K;SP707+D183 G184 R118K N195F I206L Y243F R320K R458K。

好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む:
AA560+D183 G184 N195L;AA560+D183 G184 N197F;AA560+D183 G184 N197L;AA560+D183 G184 Y243F;AA560+D183 G184 N195F、AA560+D183 G184 N277F;AA560+D183 G184 S431T;AA560+D183 G184 A434T;AA560+D183 G184 I235N A339P;AA560+D183 G184 L351F;D183 G184 G186D N195F E212V V213A AA560+D183 G184 G186R、N195F;AA560+D183 G184 H210Y;AA560+D183 G184 I206Y;AA560+D183 G184 I206L;AA560+D183 G184 I206F;AA560+D183 G184 V213A Q174R;AA560+D183 G184 E212V;AA560+D183 G184 I206Y E212G G304V A447V;AA560+M116T G133E K142R D183 G184 Y198N I206Y;AA560+G133E D183 G184 N195Y Y198N Y200F;AA560+M116T D183 G184 N195Y Y198N;AA560+K142R P146S G149K D183 G184 N195Y Y198N I206I;AA560+E134Y D183 G184;AA560+T151R D183 G184 H210Y R320N R359I N418D;AA560+G147E G149R Q169E D183 G184 Y198N Y203F I206Y;AA560+G133E G149R D183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;AA560+G147E Y152H Q169E D183 G184 Y198N I206Y;AA560+D183 G184 N195F I206Y;AA560+D183 G184 N195F I206L;AA560+D183 G184 N195F I206F;AA560+D183 G184 I206L Y243F;AA560+D183 G184 I206F Y243F;AA560+D183 G184 N195F Y243F;AA560+D183 G184 N195F H210Y;AA560+D183 G184 I206Y H210Y;AA560+D183 G184 V213A;AA560+D183 G184 S193T;AA560+D183 G184 G186T N195F;AA560+D183 G184 N195F I206Y Y243F、AA560+D183 G184 N195F I206L Y243F;AA560+D183 G184 N195F I206Y Y243F AA560+D183 G184 I206Y Y243F;AA560+D183 G184 I206L Y243F;AA560+D183 G184 N195Y;AA560+G133D G149R D183 G184 Y198N I206Y;AA560+M116T G133E G147E Y152H D183 G184 Y198N Y203F I206Y;AA560+G147E G149R D183 G184 N195F Y198N I206Y;AA560+G133E K142R D183 G184 N195F Y198N;AA560+G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N I206Y;AA560+M116T Q129L K142R D183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;AA560+G133E G149R Y152H D183 G184 N195Y Y198N Y203F I206Y;AA560+M116T G133E G149R G182 D183 Y198N Y203F I206Y;AA560+D183 G184 R118K N195F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206Y R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F Y243F R320K R458K;AA560+D183 G184 R118K N195F I206L Y243F R320K R458K。

好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む:
SP690+T183 G184 N195L;SP690+T183 G184 N197F;SP690+T183 G184 N197L;SP690+T183 G184 Y243F;SP690+T183 G184 N195F、SP690+T183 G184 N277F;SP690+T183 G184 S431T;SP690+T183 G184 P434T;SP690+T183 G184 I235N A339P;SP690+T183 G184 L351F;SP690+T183 G184 A186D N195F E212V V213A;SP690+T183 G184 A186R N195F;SP690+T183 G184 H210Y;SP690+T183 G184 V206Y;SP690+T183 G184 V206L、SP690+T183 G184 V206F;SP690+T183 G184 V213A Q174R;SP690+T183 G184 E212V;SP690+T183 G184 V206Y E212G G304V A447V;SP690+N116T G133E K142R T183 G184 Y198N V206Y;SP690+G133E T183 G184 N195Y Y198N Y200F;SP690+N116T T183 G184 N195Y Y198N;SP690+K142R P146S G149K T183 G184 N195Y Y198N V206I;SP690+E134Y T183 G184;SP690+N151R T183 G184 H210Y K320N R359I N418D;SP690+G147E G149R Q169E T183 G184 Y198N Y203F V206Y;SP690+G133E G149R T183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP690+G147E Y152H Q169E T183 G184 Y198N V206Y;SP690+T183 G184 N195F V206Y;SP690+T183 G184 N195F V206F;SP690+T183 G184 N195F V206L;SP690+T183 G184 I206L Y243F;SP690+T183 G184 I206F Y243F;SP690+T183 G184 N195F Y243F;SP690+T183 G184 N195F H210Y;SP690+T183 G184 V206Y H210Y;SP690+T183 G184 V213A;SP690+T183 G184 S193T;SP690+T183 G184 A186T N195F;SP690+T183 G184 N195F V206Y Y243F;SP690+T183 G184 V206Y Y243F;SP690+T183 G184 N195Y;SP690+G133D G149R T183 G184 Y198N V206Y;SP690+N116T G133E G147E Y152H T183 G184 Y198N Y203F V206Y;SP690+G147E G149R T183 G184 N195F Y198N V206Y;SP690+G133E K142R T183 G184 N195F Y198N;SP690+G133E G149R Y152H T183 G184 N195Y Y198N V206Y;SP690+N116T Q129L K142R T183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP690+G133E G149R Y152H T183 G184 N195Y Y198N Y203F V206Y;SP690+N116T G133E G149R G182 T183 Y198N Y203F V206Y、SP690+T183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L、SP690+T183 G184 R118K N195F R320K R458K;SP690+T183 G184 N118K N195F V206L R320K R458K;SP690+T183 G184 N118K N195F V206Y R320K R458K;SP690+T183 G184 N118K N195F Y243F R320K R458K;SP690+T183 G184 N118K N195F V206L Y243F R320K R458K;SP690+T183 G184 N195F V206L Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206Y Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206N Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206F Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206H;SP690+T183 G184 N195F V206Y;SP690+T183 G184 V206F Y243F;SP690+T183 G184 N195F V206L H210Y;SP690+T183 G184 S193T V206L;SP690+T183 G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L。

洗浄組成物
本発明は、好ましくは、消費者用又は業務用のエアケア、カーケア、食器洗浄、布地柔軟剤(軟化剤を含む)、洗濯洗浄力、洗濯及びリンス剤及び/又はケア、塗装面洗浄及び/又はトリートメント、並びに他の洗浄のための特許請求される組成物に関する方法及び/又はその使用のための製品に関する。本発明による、上述のアルファ−アミラーゼ変異体は、典型的には、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物又は食器洗浄洗剤組成物等の洗浄組成物中の構成要素であり得る。液体洗濯洗剤組成物が特に好ましい。

そのような洗浄組成物は、上で定義されるようなキレート剤ではない洗浄/洗剤添加物を含み、好ましくは、構成要素の混合物を含む。典型的には、洗浄補助剤は、0.001〜99.9重量%、より典型的には、0.01〜80重量%の洗浄補助剤の量で構成要素の混合物中に存在する。好適な洗浄補助剤は、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白触媒、着色剤、漂白ブースター、染料移行剤、沈着補助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素源、蛍光増白剤、光活性剤、蛍光剤、布地色相剤、布地柔軟剤、予備形成過酸、ポリマー分散剤、粘土質土壌除去/再付着防止剤、充填塩、ハイドロトロープ、光沢剤、石鹸泡抑制剤、構造伸縮剤、布地軟化剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、殺菌剤、防カビ剤、変色防止剤、防食剤、アルカリ度源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、染料、香料並びにpH調整剤を含む。例えば、これらは、イミン漂白ブースター等の漂白成分;過炭酸塩及び/又は過ホウ酸塩等の過酸化水素源、特に炭酸塩及び/又は硫酸塩等の材料でコーティングされた過炭酸塩、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、及びこれらの任意の混合物;カプセル形態の予備過酸を含む予備過酸;遷移金属触媒;シリコーンベースの石鹸泡抑制剤及び/又は脂肪酸ベースの石鹸泡抑制剤等の石鹸泡抑制剤又は抑制剤系;粘土、シリコーン及び/又は四級アンモニウム化合物等の布地柔軟剤;ポリエチレンオキシド等の凝集剤;ポリビニルピロリドン、ポリ4−ビニルピリジンN−オキシド、並びに/又はビニルピロリドン及びビニルイミダゾールのコポリマー等の染料移行阻害剤;イミダゾール及びエピクロルヒドリンの縮合によって産生されるオリゴマー等の布地統合成分;エトキシ化ポリアミン及びエトキシ化エチレンイミンポリマー等の土壌分散剤及び土壌再付着防止補助剤;ポリエステル等の再付着防止成分;マレイン酸ポリマー等のカルボン酸ポリマー又はマレイン酸及びアクリル酸のコポリマー;香料マイクロカプセル、デンプンカプセル型調和剤、スプレー式香料等の香料;石鹸リング;美的粒子;染料;硫酸ナトリウム等の充填材(組成物が充填材を実質的に含まないことが好ましいが);1.6R及び2.0Rケイ酸ナトリウムを含むケイ酸ナトリウム等のケイ酸塩、又はメタケイ酸ナトリウム;ジカルボン酸及びジオールのコポリエステル;メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエトキシセルロース、又は他のアルキル若しくはアルキルアルコキシセルロース等のセルロースポリマー;1,2プロパンジオール、モノエタノールアミン等の溶媒;ジエチレングリコール、エタノール、及びこれらの任意の混合物;クメンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、及びこれらの任意の混合物等のヒドロトロープ;クエン酸等の有機酸;並びにこれらの任意の組み合わせを含み得る。

別の好ましい態様では組成物は、非イオン性を含む半極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオン性及び/又は両性及び/又は半極性非イオン性及び/又はこれらの混合物であり得る1つ以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、0.1重量%〜60重量%又は0.5〜50重量%又は1〜40重量%の組成物のレベルで存在する。

それに含まれるとき、洗浄組成物は、通常、線状アルキルベンゼンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート、アルキルサルフェート(高級アルコール硫酸エステル塩)、アルコールエトキシサルフェート、二級アルカンスルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸等の約1%〜約40%のアニオン性界面活性剤を含有する。

それに含まれるとき、洗浄剤は、通常、アルコールエトキシレート、ノニル−フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミン−オキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミン、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体(「グルカミド」)等の約0.2%〜約40%の非イオン性界面活性剤を含有する。

洗浄組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素、例えば、別のアルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ及び/若しくはセルラーゼ、マンナナーゼ(Novozymes,DenmarkのMANNAWAY(商標)等)、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、並びに/又はラッカーゼ等の1つ以上の他の酵素を含み得る。

概して、選択された(1つ又は複数の)酵素の性質は、選択された洗剤と適合すべきであり(すなわち、pH最適条件、他の酵素及び非酵素成分との適合性等)、(1つ又は複数の)酵素は、有効量で存在すべきである。

プロテアーゼ:好適なプロテアーゼとしては、サブチリシン(EC 3.4.21.62)などの、中性又はアルカリ性の微生物セリンプロテアーゼを含めた、メタロプロテアーゼ及び/又はセリンプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。一態様では、そのような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものとすることができる。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの、化学修飾された又は遺伝子組み換えされた、突然変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は/及びトリプシン型プロテアーゼなどの、セリンプロテアーゼとすることができる。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下のものが挙げられる。

(a)米国特許第6,312,936(B1)号、米国特許第5,679,630号、米国特許第4,760,025号、米国特許第7,262,042号、及び国際公開第09/021867号に記載のバチルス・レンタス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・サブティリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス及びバチルス・ギブソニイ等のに由来するバチルスサブチリシンを含む、サブチリシン(EC 3.4.21.62)。

(b)トリプシン(例えば、ブタ又はウシ由来)などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ(国際公開第89/06270号に記述されているフサリウムプロテアーゼ、及び同第05/052161号及び同第05/052146号に記述されているCellumonasに由来するキモトリプシンプロテアーゼを含む)。

(c)メタロプロテアーゼ(国際公開第07/044993(A2)号に記述されているBacillus amyloliquefaciensから誘導されたものを含む)。

好ましいプロテアーゼとしては、Bacillus gibsonii又はBacillus Lentusから誘導されたものが挙げられる。

好適な市販のプロテアーゼ酵素には、Novozymes A/S(Denmark)の商標名、Alcalase(登録商標)、Savinase(登録商標)、Primase(登録商標)、Durazym(登録商標)、Polarzyme(登録商標)、Kannase(登録商標)、Liquanase(登録商標)、Liquanase Ultra(登録商標)、Savinase Ultra(登録商標)、Ovozyme(登録商標)、Neutrase(登録商標)、Everlase(登録商標)、及びEsperase(登録商標)で販売されているプロテアーゼ酵素、Genencor Internationalの商標名、Maxatase(登録商標)、Maxacal(登録商標)、Maxapem(登録商標)、Properase(登録商標)、Purafect(登録商標)、Purafect Prime(登録商標)、Purafect Ox(登録商標)、FN3(登録商標)、FN4(登録商標)、Excellase(登録商標)、及びPurafect OXP(登録商標)で販売されているプロテアーゼ酵素、Solvay Enzymesの商標名、Opticlean(登録商標)及びOptimase(登録商標)で販売されているプロテアーゼ酵素、Henkel/ Kemiraから入手可能なプロテアーゼ酵素、すなわち、BLAP(以下の変異:S99D+S101 R+S103A+V104I+G159Sを伴う米国特許第5,352,604号の図29に示される配列、以下、BLAPと称される)、BLAP R(S3T+V4I+V199M+V205I+L217Dを伴うBLAP)、BLAP X(S3T+V4I+V205Iを伴うBLAP)、及びBLAP F49(S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217Dを伴うBLAP)(すべてHenkel/Kemira);並びにKaoのKAP(変異A230V+S256G+S259Nを伴うバチルス・アルカロフィルスサブチリシン)が含まれる。

リパーゼ:好適なリパーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、フミコーラ(別名、サーモミセス)由来、例えば、欧州特許第258 068号及び欧州特許第305 216号に記載のフミコーラ・ラヌギノーサ(サーモミセス・ラノギノサス)由来又は国際特許第96/13580号に記載のフミコーラ・インソレンス由来のリパーゼ;例えば、シュードモナス・アルカリゲネス又はシュードモナス・シュードアルカリゲネス(欧州特許第218 272号)、シュードモナス・セパシア(欧州特許第331 376号)、シュードモナス・スツッツェリ(英国特許第1,372,034号)、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス種株SD 705(国際特許第95/06720号及び国際特許第96/27002号)、シュードモナス・ウィスコンシネシス(国際特許第96/12012号)由来のシュードモナスリパーゼ;例えば、バチルス・サブティリス(Dartois et al.(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253〜360)、バチルス・ステアロサーモフィルス(日本特許第64/744992号)、又はバチルス・プミルス(国際特許第91/16422号)由来のバチルス・リパーゼが挙げられる。

リパーゼは、米国特許第6,939,702(B1)号及び米国特許第2009/0217464号に記載のリパーゼ等の「第1のサイクルリパーゼ」であり得る。一態様では、リパーゼは、第一洗浄リパーゼ、好ましくは、T231R+N233R変異を含む、サーモミセス・ラノギノサス由来の野生型リパーゼの変異体である。野生型配列は、Swiss−prot O59952の受け入れ番号Swiss−Prot O59952の、(Thermomyces lanuginosus(Humicola lanuginosa)由来の)269個のアミノ酸(アミノ酸23〜291)である。好ましいリパーゼは、商標名、Lipex(登録商標)、Lipolex(登録商標)、及びLipoclean(登録商標)で販売されているリパーゼを含むであろう。セルラーゼ:好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第4,435,307号、同第5,648,263号、同第5,691,178号、同第5,776,757号、及び国際特許第89/09259号に開示のフミコーラ・インソレン、ミセリオフトラ・サーモフィラ、及びフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌性セルラーゼが含まれる。

セルラーゼ:好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第4,435,307号、同第5,648,263号、同第5,691,178号、同第5,776,757号、及び国際特許第89/09259号に開示のフミコーラ・インソレン、ミセリオフトラ・サーモフィラ、及びフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌性セルラーゼが含まれる。

特に好適なセルラーゼは、色彩維持利点のある(colour care benefits)アルカリ性セルラーゼ又は中性セルラーゼである。かかるセルラーゼの例は、欧州特許第0 495 257号、同第0 531 372号、国際公開特許第96/11262号、同第96/29397号、同第98/08940号に記載されたセルラーゼである。他の例は、国際公開特許第94/07998号、欧州特許第0 531 315号、米国特許第5,457,046号、同第5,686,593号、同第5,763,254号、国際公開特許第95/24471号、同第98/12307号及び国際出願第PCT/DK98/00299号に記載されたもののようなセルラーゼ変異体である。

市販のセルラーゼとしては、Celluzyme(登録商標)及びCarezyme(登録商標)(Novozymes A/S)、Clazinase(登録商標)及びPuradax HA(登録商標)(Genencor International Inc.)、並びにKAC−500(B)(登録商標)(花王)が挙げられる。

ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ:好適なペルオキシダーゼ/オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、コプリナス由来、例えば、国際特許第93/24618号、同第95/10602号、及び同第98/15257号に記載されるようなコプリナス・シネレウス及びその変異体由来のペルオキシダーゼが挙げられる。

市販のペルオキシダーゼには、GUARDZYME(登録商標)(Novozymes A/S)が含まれる。

他の酵素:他の好ましい酵素には、商標名、Pectawash(登録商標)、Pectaway(登録商標)で販売されているペクチン酸リアーゼ、及び商標名、Mannaway(登録商標)(以上すべてNovozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark)、及びPurabrite(登録商標)(Genencor International Inc.,Palo Alto,California)で販売されているマンナナーゼが含まれる。

(1つ又は複数の)洗剤酵素は、1つ以上の酵素を含有する別個の添加物を添加することによって、又はこれらの酵素のすべてを含む混合添加物を添加することによって、洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加物、すなわち、別個の添加物又は混合添加物は、例えば、粒状、液体、スラリー等に製剤化され得る。好ましい洗剤添加物製剤は、粒状、具体的には、非ダスティング粒状、液体、具体的には、安定化された液体、又はスラリーである。

非ダスティング粒状は、例えば、米国特許第4,106,991号及び同第4,661,452号に開示されるように産生され得、当該技術分野において既知の方法で、任意でコーティングされ得る。ワックスコーティング材の例として、1000〜20000の平均分子量を有するポリ(エチレンオキシド)産物(ポリエチレングリコール、PEG);16〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニル−フェノール;アルコールが12〜20個の炭素原子を含有し、15〜80個のエチレンオキシド単位が存在する、エトキシ化脂肪アルコール;脂肪アルコール;脂肪酸;並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドがある。流動床技法による適用に好適なフィルム形成コーティング材の例は、英国特許第1483591号に定められている。液体酵素の調製は、例えば、実証されている方法に従って、プロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸などのポリオールを加えることにより安定化させることができる。被保護酵素は、欧州特許第238,216号に開示の方法に従って調製され得る。

組成物は、布地色相剤を含み得る。好適な布地色相剤には、好ましくは、以下の本明細書に記載の試験方法1の要件を満たす染料、染料粘土共役体、及び色素が含まれる。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドのカラーインデックス(C.I.)分類に該当する染料、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられ、例えば次のものが挙げられる。

(1)以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー染料
式中、ナプチル環A、B及びCの少なくとも2つがスルホネート基で置換されており、環Cは5位をNH又はNHPh基で置換してもよく、Xは2つ以下のスルホネート基で置換されているベンジル又はナフチル環あり、2位をOH基で置換してもよく、更にNH又はNHPh基で置換してもよい。

(2)以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット染料
式中、ZはH又はフェニルあり、環Aは矢印で示される位置が好ましくはメチル及びメトキシ基で置換されており、環Aはナフチル環あってもよく、Y基はベンジル又はナフチル環あり、サルフェート基で置換されており、メチル基により一又は二置換されてもよい。

(3)以下の式のブルー又はレッドアシッド染料
式中、X及びYの少なくとも1つは芳香族基でなければならない。一態様では、芳香族基はいずれも置換ベンジル又はナフチル基であってよく、このベンジル又はナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよく、X及びYはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換されなくてもよい。他の態様では、Xはニトロ基で置換されたベンジル基あり、Yはベンジル基ある。

(4)以下の構造のレッドアシッド染料
式中、Bはアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチル又はベンジル基であり、Bはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換されなくてもよい。

(5)以下の構造のジアゾ染料、並びにそれらの対応する塩及び混合物:
式中、X及びYはそれぞれ、相互から独立して、水素、C〜Cアルキル、又はC〜C−アルコキシであり、Rαは、水素又はアリールであり、Zは、C〜Cアルキル、C〜C−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、又はカルボキシルであり、nは、1又は2であり、mは、0、1又は2である。

(6)以下の構造のトリフェニルメタン染料
及びこれらの混合物である。別の態様では、好適な小分子染料には、カラーインデックス(Society of Dyers and Colourists,Bradford,UK)番号ダイレクトバイオレット9、ダイレクトバイオレット35、ダイレクトバイオレット48、ダイレクトバイオレット51、ダイレクトバイオレット66、ダイレクトバイオレット99、ダイレクトブルー1、ダイレクトブルー71、ダイレクトブルー80、ダイレクトブルー279、アシッドレッド17、アシッドレッド73、アシッドレッド88、アシッドレッド150、アシッドバイオレット15、アシッドバイオレット17、アシッドバイオレット24、アシッドバイオレット43、アシッドレッド52、アシッドバイオレット49、アシッドブルー15、アシッドブルー17、アシッドブルー25、アシッドブルー29、アシッドブルー40、アシッドブルー45、アシッドブルー75、アシッドブルー80、アシッドブルー83、アシッドブルー90、及びアシッドブルー113、アシッドブラック1、ベーシックバイオレット1、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット35、ベーシックブルー3、ベーシックブルー16、ベーシックブルー22、ベーシックブルー47、ベーシックブルー66、ベーシックブルー75、ベーシックブルー159並びにこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が含まれる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス(染色業者及びカラーリスト協会(Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK))番号がアシッドバイオレット17、アシッドバイオレット43、アシッドレッド52、アシッドレッド73、アシッドレッド88、アシッドレッド150、アシッドブルー25、アシッドブルー29、アシッドブルー45、アシッドブルー113、アシッドブラック1、ダイレクトブルー1、ダイレクトブルー71、ダイレクトバイオレット51及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス(染色業者及びカラーリスト協会(Society of Dyers and Colourists, radford, UK))番号が、アシッドバイオレット17、ダイレクトブルー71、ダイレクトバイオレット51、ダイレクトブルー1、アシッドレッド88、アシッドレッド150、アシッドブルー29、アシッドブルー113又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。

好適な高分子染料には、共役色原体を含むポリマー(染料−ポリマー共役体)、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー及びこれらの混合物からなる群から選択される高分子染料が挙げられる。

他の態様では、好適なポリマー染料としては、Liquitint(登録商標)(Milliken、Spartanburg、South Carolina、USA)の名称で市販されている布地直接着色剤、及び少なくとも1つの反応染料と、ヒドロキシル部分、1級アミン部分、2級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。更に他の態様では、好適なポリマー染料としては、Liquitint(登録商標)(Milliken、Spartanburg、South Carolina、USA)バイオレットCT、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット又はリアクティブレッド染料CMCが共役されているものとしては、Megazyme(アイルランド、ウイックロー)からAZO−CM−セルロースの商品名、商品コードS−ACMCで市販されているC.I.リアクティブブルー19、アルコキシル化トリフェニール−メタン重合着色料、アルコキシル化チオフェン重合着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。

適切な染料粘土共役体には、少なくとも1つのカチオン性/塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。他の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のC.I.からなる群から選択される1つのカチオン性/塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー1〜108、C.I.ベーシックオレンジ1〜69、C.I.ベーシックレッド1〜118、C.I.ベーシックバイオレット1〜51、C.I.ベーシックブルー1〜164、C.I.ベーシックグリーン1〜14、C.I.ベーシックブラウン1〜23、CIベーシックブラック1〜11、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される粘土。更に別の態様では、好適な染料粘土共役体には、以下からなる群から選択される染料粘土共役体が含まれる:モンモリロナイトベーシックブルーB7 C.I.42595共役体、モンモリロナイトベーシックブルーB9 C.I.52015共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットV3 C.I.42555共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンG1 C.I.42040共役体、モンモリロナイトベーシックレッドR1 C.I.45160共役体、モンモリロナイトC.I.ベーシックブラック2共役体、ヘクトライトベーシックブルーB7 C.I.42595共役体、ヘクトライトベーシックブルーB9 C.I.52015共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットV3 C.I.42555共役体、ヘクトライトベーシックグリーンG1 C.I.42040共役体、ヘクトライトベーシックレッドR1 C.I.45160共役体、ヘクトライトC.I.ベーシックブラック2共役体、サポナイトベーシックブルーB7 C.I.42595共役体、サポナイトベーシックブルーB9 C.I.52015共役体、サポナイトベーシックバイオレットV3 C.I.42555共役体、サポナイトベーシックグリーンG1 C.I.42040共役体、サポナイトベーシックレッドR1 C.I.45160共役体、サポナイトC.I.ベーシックブラック2共役体及びこれらの混合物。

好適な色素には、フラバントロン、インダントロン、1〜4個の塩素原子を含有する塩素化インダントロン、ピラントロン、ジクロロピラントロン、モノブロモジクロロピラントロン、ジブロモジクロロピラントロン、テトラブロモピラントロン、ペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミド(イミド基は、C1〜C3−アルキル又はフェニル又は複素環ラジカルによって非置換又は置換され得、フェニル及び複素環ラジカルは、水溶性を与えない置換基を更に担持し得る)、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン、イソビオラントロン、ジオキサジン色素、1個の分子につき最大2個の塩素原子を含有する銅フタロシアニン、ポリクロロ銅フタロシアニン又は1個の分子につき最大14個の臭素原子を含有するポリブロモクロロ銅フタロシアニン及びこれらの混合物からなる群から選択される色素が含まれる。

別の態様では、好適な色素には、ウルトラマリンブルー(C.I.色素ブルー29)、ウルトラマリンバイオレット(C.I.色素バイオレット15)、及びこれらの混合物からなる群から選択される色素が含まれる。

前述の布地色相剤は、組み合わせて使用することができる(布地色相剤の任意の混合物を使用することができる)。好適な布地色相剤を、Aldrich、Milwaukee,Wisconsin,USA;Ciba Specialty Chemicals,Basel,Switzerland;BASF,Ludwigshafen,Germany;Dayglo Color Corporation,Mumbai,India;Organic Dyestuffs Corp.,East Providence,Rhode Island,USA;Dystar,Frankfurt,Germany;Lanxess,Leverkusen,Germany;Megazyme,Wicklow,Ireland;Clariant,Muttenz,Switzerland;Avecia,Manchester,UKから購入することができ、及び/又は本明細書に包含される実施例に従って作製することができる。好適な色調剤については、詳しくは米国特許第7,208,459(B2)号に記述されている。

試験方法1
染料又は顔料物質が本発明の意図する布地色相剤であるかどうかを定義するための手順プロトコルを以下に記載する。

1.)2つのターゴトメーターポットを、800mLの英国ニューカッスルアポンタインの水(Northumbrian Water,Pity Me,Durham,Co.Durham,UKによって供給される、1米国ガロンにつき約12グラムの全硬度)で充填する。

2)実験期間中、水温を30℃に調整し、撹拌を40rpmに設定して、ポットをターゴトメーターに挿入する。

3)各ポットにIEC−B洗剤((IEC 60456 Washing Machine Reference Base Detergent Type B)、wfk(Bruggen−Bracht、Germany)から供給)を4.8g加える。

4)2分後、第1のポットに活性着色剤を2.0mg加える。

5)1分後、5cm×5cmの材料見本に切断した平坦な綿肌着(Warwick Equest,Consett,County Durham,UKから供給)50gを各ポットに加える。

6)10分後、ポットを排水し、硬度14.4(イギリスクラーク硬度)を有し、カルシウム対マグネシウムのモル比が3:1の冷水(16℃)を再充填する。

7)2分間すすいだ後、布地を取り出す。

8)同じ処理を用いて更に3回のサイクルで工程3〜7を繰り返す。

9)布地を収集し、屋内で12時間自然乾燥させる。

10)D65光源及びUVA遮断フィルタを取り付けたハンターミニスキャン(Hunter Miniscan)スペクトロメーターを使用して材料見本を分析し、ハンターa(赤−緑軸)及びハンターb(黄−青軸)値を得る。

11)各組の布地についてハンターa及びハンターb値の平均値を計算する。着色剤で処理した評価対象布地がa軸又はb軸のいずれかにおいて平均で0.2単位より大きい色相の差を示した場合、本発明の意図する布地色相剤であると判断される。

洗浄組成物は、ゼオライトA、ゼオライトMAP(最大アルミニウムP型)等のゼオライトであり得る炭酸塩、重炭酸塩又はケイ酸塩に基づくビルダー等のビルダーを更に含有し得る。洗濯に使用可能なゼオライトは、好ましくは、式Na12(AlO12(SiO12・27HOを有し、粒径は、通常、ゼオライトAにおいて1〜10μm、及びゼオライトMAPにおいて0.7〜2umである。他のビルダーは、メタケイ酸ナトリウム(NaSiO・nHO又はNaSi・nHO)強アルカリ性であり、好ましくは、食器洗浄において使用される。好ましい実施形態では、洗剤ビルダーの量は、5%超、10%超、20%超、30%超、40%超、又は50%超であり得、また80%未満、65%未満であり得る。食器洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には、40〜65%、特に50〜65%、又は更には75〜90%である。

組成物は、カプセル剤を含み得る。一態様では、カプセル剤は、コア、内面及び外面を有するシェルを含み、前記シェルは、前記コアをカプセル化する。

前記カプセル剤の一態様では、前記コアは、以下からなる群から選択される材料を含み得る:香料、光沢剤、染料、防虫剤、シリコーン、ワックス、フレーバー、ビタミン、布地軟化剤、スキンケア剤、一態様では、パラフィン、酵素、抗菌剤、漂白剤、感覚剤、及びこれらの混合物、並びに前記シェルは、以下からなる群から選択される材料を含み得る:ポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリイソプレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート、アミノプラスト(一態様では、前記アミノプラストは、ポリ尿素、ポリウレタン、及び/又はポリ尿素ウレタンを含み得、一態様では、前記ポリ尿素は、ポリオキシメチレン尿素及び/又はメラミンホルムアルデヒドを含み得る)、ポリオレフィン、多糖類、(一態様では、前記多糖類は、アルギン酸塩及び/又はキトサンを含み得る)、ゼラチン、セラック、エポキシ樹脂、ビニルポリマー、水溶性無機物、シリコーン、及びこれらの混合物である。

前記カプセル剤の一態様では、前記コアは、香料を含み得る。

前記カプセル剤の一態様では、前記シェルは、メラミンホルムアルデヒド及び/又は架橋メラミンホルムアルデヒドを含み得る。

一態様では、好適なカプセル剤は、コア材料及びシェルを含み得、前記シェルが少なくとも部分的に前記コア材料を包囲するカプセル剤が開示される。少なくとも75%、85%、又は更には90%の前記カプセル剤は、約0.2MPa〜約10MPa、約0.4MPa〜約5MPa、約0.6MPa〜約3.5MPa、又は更には約0.7MPa〜約3MPaの破壊強度、及び0%〜約30%、0%〜約20%、又は更には0%〜約5%の有益剤漏れを有し得る。

一態様では、少なくとも75%、85%、又は更には90%の前記カプセル剤は、約1マイクロメートル〜約80マイクロメートル、約5マイクロメートル〜60マイクロメートル、約10マイクロメートル〜約50マイクロメートル、又は更には約15マイクロメートル〜約40マイクロメートルの粒径を有し得る。

一態様では、少なくとも75%、85%、又は更には90%の前記カプセル剤は、約30nm〜約250nm、約80nm〜約180nm又は更には約100nm〜約160nmの粒子壁厚を有し得る。

一態様では、前記カプセル剤のコア材料は、香料原材料からなる群から選択される材料、及び/又は任意で、以下からなる群から選択される材料を含み得る:ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、菜種油、大豆油、トウモロコシ油、ヤシ油、亜麻仁油、ベニバナ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム核油、ヒマシ油、レモン油及びこれらの混合物を含むストレート及び/又はブレンド植物油を含む植物油;植物油のエステル(エステルは、アジピン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、アジピン酸ブチルベンジル、アジピン酸ベンジルオクチル、リン酸トリクレジル、リン酸トリオクチル及びこれらの混合物を含む);約80℃を超える沸点を有する直鎖又は分枝鎖炭化水素を含む、直鎖又は分枝鎖炭化水素;部分的に水素化したテルフェニル、フタル酸ジアルキル、モノイソプロピルビフェニルを含むアルキルジフェニル、ジプロピルナフタレンを含むアルキル化ナフタレン、灯油、鉱油及びこれらの混合物を含むペトロリウムスピリット;ベンゼン、トルエン及びこれらの混合物を含む芳香族溶媒;シリコーン油;並びにこれらの混合物である。

一態様では、前記カプセル剤の壁材料は、アルデヒド及びアミンの反応生成物を含む好適な樹脂を含み得、好適なアルデヒドには、ホルムアルデヒドが含まれる。好適なアミンには、メラミン、尿素、ベンゾグアナミン、グリコールウリル、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なメラミンには、メチロールメラミン、メチル化メチロールメラミン、イミノメラミン及びこれらの混合物が挙げられる。好適な尿素には、ジメチロール尿素、メチル化ジメチロール尿素、尿素−レゾルシノール、及びこれらの混合物が挙げられる。

一態様では、好適なホルムアルデヒドスカベンジャーは、カプセル剤とともに、例えば、カプセルスラリー中に採用され得、及び/又はカプセル剤が消費者製品に添加される前、添加中若しくは添加した後に、そのような消費者製品に添加され得る。

好適なカプセルを、米国特許出願第2008/0305982(A1)号及び/又は米国特許出願第2009/0247449(A1)号の教示に従って作製することができる。あるいは、好適なカプセルは、Appleton Papers Inc.(Appleton,Wisconsin,USA)から購入することができる。

加えて、上述のカプセル剤を作製するための材料を、Solutia Inc.(St Louis,Missouri U.S.A.)、Cytec Industries(West Paterson,New Jersey U.S.A.)、sigma−Aldrich(St.Louis,Missouri U.S.A.)、CP Kelco Corp.(San Diego,California,USA)、BASF AG(Ludwigshafen,Germany)、Rhodia Corp.(Cranbury,New Jersey,USA)、Hercules Corp.(Wilmington,Delaware,USA)、Agrium Inc.(Calgary,Alberta,Canada)、ISP(New Jersey U.S.A.)、Akzo Nobel(Chicago,IL,USA)、Stroever Shellac Bremen(Bremen,Germany)、Dow Chemical Company(Midland,MI,USA)、Bayer AG(Leverkusen,Germany)、Sigma−Aldrich Corp.(St.Louis,Missouri,USA)から入手することができる。

一態様では、組成物は、(a)カルシウム塩、マグネシウム塩及びこれらの混合物からなる群から選択される無機塩、(b)オリゴ糖、多糖類及びこれらの混合物からなる群から選択される炭水化物、(c)フェニルボロン酸及びその誘導体からなる群から選択される質量効率的可逆プロテアーゼ阻害剤、並びに(d)これらの混合物からなる群から選択される酵素安定剤を含み得る。

別の実施形態では、組成物は、(1)ホウ素含有化合物等の可逆プロテアーゼ阻害剤、(2)1〜2プロパンジオール、(3)ギ酸カルシウム及び/又はギ酸ナトリウム、並びに(4)その任意の組み合わせを含む。

一態様では、組成物は、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロースベースの材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、並びにこれらの混合物からなる群から選択される構造剤を含み得る。

洗剤は、1つ以上のポリマーを含み得る。例には、カルボキシメチルセルロース、ポリ(ビニル−ピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピリジン−N−オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリアクリル酸塩等のポリカルボン酸塩、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、及びメタクリル酸ラウリル/アクリル酸コポリマーがある。

洗剤は、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート等の過酸形成漂白活性化剤と合わせることができる過ホウ酸塩又は過炭酸塩等のH源を含み得る漂白系を含有し得る。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。

一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、標記洗浄組成物の約0.1重量%〜約50重量%、又は更に約0.1重量%〜約25重量%の漂白剤を含んでよい。

本発明の酵素変異体は、従来の安定化剤、並びに/又はプロテアーゼ阻害剤、例えば、プロピレングリコール若しくはグリセロール等のポリオール、糖類若しくは糖アルコール、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等の塩、乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又は4−ホルミルフェニルボロン酸等のフェニルボロン酸誘導体、又はジ−、トリ−、若しくはテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒド類似体等のペプチドアルデヒドを用いて安定化され得、これらのいずれかはB1−B0−Rを形成し、式中、Rは、H、CH3、CX3、CHX2、若しくはCH2Xであり(X=ハロゲン)、B0は、単一アミノ酸残基であり(好ましくは、任意で置換された脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を有する)、並びにB1は、任意でN末端保護基を含むか、あるいは国際公開第09118375号、同第98/13459号)に記載の1つ以上のアミノ酸残基(好ましくは1つ、2つ又は3つ)、あるいはRASI、BASI、WASI(稲、大麦及び小麦の二官能性アルファ−アミラーゼ/サブチリシン阻害剤)、又はCI2若しくはSSI等のタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤からなる。組成物を、例えば、国際特許第92/19709号及び同第92/19708号又は米国特許6472364号に記載されるように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において採用される酵素は、以下のようなイオンを酵素に提供する最終組成物中で、亜鉛(II)、カルシウム(II)及び/又はマグネシウム(II)イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン(例えば、バリウム(II)、スカンジウム(II)、鉄(II)、マンガン(II)、アルミニウム(III)、スズ(II)、コバルト(II)、銅(II)、ニッケル(II)、及びオキソバナジウム(IV))の存在によって安定化される。

組成物は、例えば、布地調整剤を含む粘度、起泡力増進剤、石鹸泡抑制剤、防食剤、土壌沈殿防止剤、土壌再堆積防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り防止剤、エタノール等の有機溶媒、又は香料等の他の従来の洗剤成分も含有し得る。更に、洗剤は、全般的な洗浄レベルを増加させるために洗濯物に付加される事前染み抜き又は増進剤を含有し得、これらの添加物のうちのいずれかは、洗浄工程前に織物に適用される前処理剤としても使用され得る。

洗剤組成物中の任意の酵素、具体的には、本発明の酵素は、洗浄液1リットル当たり0.001〜100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液1リットル当たり0.005〜5mgの酵素タンパク質、より好ましくは洗浄液1リットル当たり0.01〜1mgの酵素タンパク質、及び具体的には、洗浄液1リットル当たり0.1〜1mgの酵素タンパク質に相当する量で添加され得ることが、現在企図されている。しかしながら、本発明の組成物は、少なくとも0.0001〜約0.1重量%、例えば、約0.0001重量%〜約0.01重量%、約0.001重量%〜約0.01重量%、又は約0.001重量%〜約0.01重量%の純酵素タンパク質を含む。しかしながら、製剤化された酵素を用いるとき、洗剤組成物は、約0.02%〜約20重量%、又は例えば約0.05重量%〜約15重量%、又は約0.05重量%〜約20重量%、又は約0.05重量%〜約5重量%、又は約0.05重量%〜約3重量%を含む。

本発明において有用なアルファ−アミラーゼ変異体は、国際特許第97/07202号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示の洗剤製剤に更に組み込まれ得る。

本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、タブレット、粉末、顆粒、ペースト、ゲル、又は液体であり得る。組成物は、粉末形態の汎用「強力」洗浄剤、ペースト形態の汎用及び強力な液体タイプ、上質布地用液体タイプ、手洗い用食器洗浄剤、軽質の食器洗浄剤、泡立ち良好タイプ、食器洗い機用洗浄剤、種々のタブレットタイプ、食器洗浄顆粒タイプ、食器洗浄液体タイプ、泡切れ良好タイプであり得る。組成物は、当該技術分野において既知のもの、並びに水溶性、不水溶性、及び/又は透水性のものを含む単位用量包装であり得る。液体洗剤は、典型的には、最大70%の水及び0〜30%の有機溶媒を含有する水性の液体洗剤であるか、非水性であるか、あるいは0.5g/Lを超える洗剤組成物を含有する溶液であり得る。

本発明の組成物は、例えば、染みのついた布地の前処理に好適な洗濯添加組成物及びすすぎ添加布地柔軟剤組成物を含む手洗い用又は機械用洗濯洗剤組成物として製剤化され得るか、全般的な家庭の硬表面洗浄作業で用いる洗剤組成物として製剤化され得るか、あるいは手洗い用又は機械用食器洗浄作業のために製剤化され得る。洗剤は、粉末若しくは粒状形態であり得るか、液体、ゲル、若しくはペーストの形態、又はタブレット若しくは多区画ポーチを含むポーチ等の単位用量製品の形態であり得るか、あるいは洗剤は、シート形態であり得る。

実施例:洗濯洗剤組成物
以下はそれぞれ、トップローディング全自動洗濯機(1及び2)並びにフロントローディング洗濯機(3)に特に好適な液体洗濯洗剤組成物である。
ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約6000であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約40:60であり、50個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は1以下である。
1つの−NHにつき20個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン(MW=600)。
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、1つの−NHにつき24個のエトキシレート基と、1つの−NHにつき16個のプロポキシレート基とを有するポリエチレンイミン(MW=600)である。

実施例:食器洗浄洗剤
以下の例、食器洗浄洗剤4〜8はゲル形態である。
BASF(Ludwigshafen,Germany)により商品名Polytergent(登録商標)SLF−18で販売。
Novozymes A/S(Denmark)により販売。
本発明のカプセル化プロテアーゼ。
Genencor International(California,USA)により販売。好適なプロテアーゼ錠剤は、商品名FN3(登録商標)及びProperase(登録商標)で販売。
Alco Chemical(Tennessee,USA)により販売。
そのような好適なポリマーの1つは、Nippon Shokubai(Japan)により商品名Aqualic TLで販売。
Arch Chemicals Incorporated(Smyrna,Georgia,USA)により販売。
Rohm and Haas(Philadelphia,Pennsylvania,USA)により販売。

2.0Rケイ酸塩は、PQCorporation(Malvern,PA,USA)から供給されている。

炭酸ナトリウムは、Solvay(Houston,Texas,USA)から供給されている。

Solvay(Houston,Texas,USA)から供給されている、過炭酸ナトリウム(2NaCO・3H)。

ヒドロキシエタンジホスホン酸塩(HEDP)は、Dow Chemical(Midland,Michigan,USA)から供給されている。

食器洗浄洗剤組成物
本発明の酵素を、以下を含む食器洗浄洗剤組成物において使用することもできる:
1)粉末全自動食器洗浄組成物

2)粉末全自動食器洗浄組成物

3)粉末全自動食器洗浄組成物

4)粉末全自動食器洗浄組成物

5)粉末全自動食器洗浄組成物

6)洗浄界面活性剤系を有する粉末及び液体食器洗浄組成物

7)非水性液体全自動食器洗浄組成物

8)非水性液体食器洗浄組成物

9)チキソトロピー性液体全自動食器洗浄組成物

10)液体全自動食器洗浄組成物

11)保護された漂白粒子を含有する液体全自動食器洗浄組成物

12)過ホウ酸塩が過炭酸塩によって置換される、1)、2)、3)、4)、6)及び10)に記載の全自動食器洗浄組成物。

13)マンガン触媒を更に含有する、1)〜6)に記載の全自動食器洗浄組成物マンガン触媒は、例えば、「Efficient manganese catalysts for low−temperature bleaching」,Nature,369,1994,pp.637〜639に記載の化合物のうちの1つであり得る。

本発明は、洗浄のためにアルファ−アミラーゼ変異体を含む組成物を使用するための方法も対象とする。

変異体アルファ−アミラーゼは、好ましくは、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物、例えば、家庭用洗濯洗剤組成物、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれ、及び/又はそれらとともに使用される。具体的には、洗剤は、少なくとも1つのキレート剤を含み、洗剤組成物は、典型的には、従来の洗剤添加物/成分等の界面活性剤(アニオン性、カチオン性、非イオン性、両性イオン性、両性)、ビルダー、漂白剤、ポリマー、他の酵素、及び例えば、国際特許第2007/130562号及び同第2007/149806号に記載の他の成分を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明の有用な態様において、本発明による組成物を洗浄プロセスに添加する工程を含む洗浄方法が提供される。好ましい実施形態では、前記洗浄プロセスは、洗濯、食器洗浄、工業又は企業洗浄プロセスにおける少なくとも1つの洗浄工程からなる群から選択される。

アルカリpH値におけるそれらの活性のため、本発明のα−アミラーゼは、多種多様の工業プロセスでの使用に非常に好適であり、具体的には、酵素は、洗浄、食器洗浄及び硬表面洗浄洗剤組成物中の構成要素としての可能性のある用途を見出すが、デンプン由来の甘味料及びエタノールの製造においても有用であり得る。従来のデンプン変換プロセス及び液化及び/又は糖化プロセスの条件は、例えば、米国特許第3,912,590号並びに欧州特許公開第252,730号及び同第63,909号に記載されている。

材料及び方法
酵素:
SP722:配列番号:6、Novozymesから入手可能であり、国際特許第95/26397号に開示される。

SP707又は#707:配列番号8
AA560:配列番号10
一般的な分子生物学方法:
別途言及されない限り、DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準の方法を用いて行なった(Sambrook et al.(1989)、Ausubel et al.(1995)、Harwood and Cutting(1990)。

アルファ−アミラーゼ及び変異体の発酵
発酵を、当該技術分野において周知の方法によって、又は以下のように行なうことができる。関連した発現プラスミドを持つバチルス・サブティリス株を、関連した抗生物質を有するLB−寒天プレート上でストリーキングし、37℃で一晩成長させる。コロニーを、500mLの振盪フラスコ中の関連した抗生物質(例えば、10mg/Lのクロラムフェニコール)で補充された100mLのBPX培地に移す。

培養物を、270rpm、37℃で4〜5日間振盪する。

細胞及び細胞残屑を、4500rpmで20〜25分間の遠心分離によって、発酵ブロスから除去する。その後、上清を濾過して、完全に透明な溶液を得る。濾液を濃縮し、UF−フィルタ(10000カットオフ膜)上で洗浄し、緩衝液は、例えば、透析又はゲル濾過によって、pH 5.5の20mMの酢酸塩に変化する。UF−濾液を、S−セファロースF.F.(General Electric、カチオン交換、マトリックス:架橋アガロース、官能基:−OCHCHOHCHOCHCHCHSO)上に塗布し、同一の緩衝液中の0.2MのNaClでの溶出工程によって溶出を実行する。溶出液を、pH 9.0の10mMのトリス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−プロパン−1,3−ジオール)に対して透析し、Q−セファロースF.F.(General Electric、アニオン交換、マトリックス:架橋アガロース、官能基:−OCHCHOHCHOCHCHOHCH(CH)上に塗布し、6カラム体積にわたって0〜0.3MのNaClから線形勾配で溶出する。活性(EnzCheckアッセイによって測定される)を含有する画分をプールし、pHをpH 7.5に調整し、0.5% w/volの活性石炭での5分間の処理によって、残りの色を除去する。例えば、透析又はゲル濾過によって、好ましくは、保管中にアミラーゼを安定化する少濃度のカルシウム(例えば、0.1mM)、及び容器及びピペットへの酵素タンパク質の吸着の危険性を減少させる約0.01%のTriton X−100を有する、それ自体の洗浄結果に影響を及ぼさない緩衝系、例えば、EPPS緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸塩緩衝液、又は同等物に、更なる緩衝液交換工程を付加することは、更に有利であり得る。

モデル洗剤

遊離カルシウムイオンの測定のためのアッセイ。

以下のアッセイを、溶液中の遊離カルシウムイオンの測定のため、ひいては、遊離カルシウムイオンの濃度(Ca2+)を、pH 8で、例えば、2.0mMから0.10mMに減少させるキレート剤(キレート化物)能力の決定のために使用することができる。

アッセイの原理:
種々の量のキレート化物を、2.0mMのCa2+の溶液に添加し、遊離Ca2+の濃度を、一定のpH及び温度でカルシウムイオン選択性電極を用いることによって決定する。遊離カルシウムの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、キレート化物の濃度に対して測定される遊離カルシウム濃度のプロットから決定することができる。本アッセイにおいて、遊離カルシウムの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、pH 8及び21℃で、塩化カリウム及び49mMのEPPS中で測定する。

溶液:
電解液:超純水(ミリQ水)中の4Mの塩化カリウム。

pH 8の緩衝液:最小限の1Nの水酸化ナトリウムを用いてpH 8.0に調整した50mMのEPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)。

カルシウム原液:CaCl・2HOから作製される、pH 8の緩衝液中の25mMのCa2+

キレート原液:最小限の1M NaOH又は1M HClを用いてpH 8.0に再調整した、pH 8の緩衝液中の15mMのキレート化物(100%乾燥キレート化剤に基づく)。

すべての緩衝液及び溶液の調製のために、超純水(ミルQ水)を使用する。

設備:
塩化カルシウム標準溶液に対して較正される、Thermo Scientific(カタログ番号9720BNWP)のカルシウムイオン選択性電極。本電極を、本電極に付随するガイドラインで説明されるように較正する。

手順:
全容積を50mLに調整するためにpH 8の緩衝液を用いて、それぞれ、4mLのカルシウム原液(最終濃度2.0mM)、1mLの電解液(最終濃度80mMの塩化カリウム)、種々の量(0〜45mL)のキレート原液を含有する一連のバイアルを調製する。本アッセイにおけるEPPSの最終濃度は、49mMである。

混合後、遊離Ca2+の濃度をカルシウム電極で測定する。遊離カルシウム濃度は、それぞれのキレート化物を試験するのに十分な異なるキレート化物濃度で決定されるはずであり、データセットが、2.0mMの遊離カルシウムイオンから0.10mM未満の値までの全範囲を包含することを確実にするか、あるいはアッセイにおける最終キレート化物濃度は、10.0mMよりも高い。好適なデータ点の数は、8以上である。最初の2.0mMの遊離カルシウムイオンを0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物濃度は、内挿によってキレート化剤濃度に対して測定された遊離カルシウムイオン濃度のプロットから得られる。

溶液を、所望の温度に平衡化し、所望の温度は、本アッセイにおいて21℃である。

logKの決定
キレート剤はまた、キレート剤(キレート化剤)及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けられ得る。この定数を、AD Nielsen,CC Fuglsang and P Westh,Analytical Biochemistry Vol.314(2003)page 227〜234、及びT Wiseman,S Williston,JF Brandts and L−N Lin,Analytical Biochemistry Vol.179(1989)page 131〜137によって説明されるITC(等温滴定熱量計)によって決定することができる。

使用するすべてのガラス製品及びプラスチックボトルを、1%(w/w)のEDTA溶液で洗浄し、その後、Chelex 100処理超純水(ミルQ水)中で完全にすすぐ。溶液をプラスチックボトル中に保管し、使用するまで5℃で保持する。

緩衝液:
20mMのHEPES(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−エタンスルホン酸)、pH 8、超純水(ミルQ水)で調整。

20mMのグリシン、pH 10、超純水(ミルQ水)で調整。

溶液:
−20mMのHEPES中の125μMのキレート化物、pH 8、又は20mMのグリシン中の125μMのキレート化物、pH 10。

−20mMのHEPES中の4mMのCaCl、pH 8、又は20mMのグリシン中の4mMのCaCl、pH 10。

−超純水(ミルQ水)
カルシウムイオンを除去するために、すべての緩衝液を、Chelex 100カラム(Sigma Aldrich C−7901、メチル基を介する芳香環へのマトリックス1%架橋ポリスチレンマトリックス活性基イミノ二酢酸(ナトリウム形態)マトリックス付着)に通過させる。実験前に、すべての溶液を真空下で撹拌して脱気する。

計器:
MCS−ITC(MicroCal Inc.,Northampton,MA,USA)
手順
参照細胞を超純水(ミルQ水)で充填する。試料細胞を、選択されたpHのキレート化物液で充填し、注射器を、選択されたpHのカルシウム溶液で充填する。溶液を、所望の温度、例えば、19℃に平衡化する。

次に、試料細胞中のキレート化剤液を、30〜40一定分量の8μLのカルシウム溶液で滴定する。

次に、ITCから得たシグナルを、MicroCal Incから供給されるOriginソフトウェアを用いて統合する。結合等温線を得るために、同一のソフトウェアパッケージを用いて回帰ルーチンを作製する。次に、これらのデータを、Originソフトウェアに埋め込まれたルーチンを用いてモデルに当てはめる。一般的に使用されるキレート剤の大部分への最善のフィットをもたらす「ワンサイト」モデルが現在好ましく、すなわち、残差が約ゼロに均等に分配される。K値から、log Kを、K値の対数(10を底とする)として計算する。

洗浄性能を決定するためのアッセイ
洗剤組成物中のアルファ−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を行うことができる。酵素を、自動機械的ストレスアッセイ(AMSA)を用いて試験するか、又はビーカーを用いて洗浄実施試験をする。AMSA試験で、大量の少容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することが可能である。AMSAプレートは、試験溶液のための多くのスロット及び洗浄される繊維製品の材料見本をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドを有している。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際特許第02/42740号、特に23〜24ページの段落「Special method embodiments」を参照されたい。

一般的な洗浄性能記述:
水(15度dH)、0.8g/Lの洗剤、例えば、上述のモデル洗剤A若しくはB、又は50mMのHCO3−、並びに例えば、1リットル当たり0、0.2、0.4、0.8及び/若しくは1.2mgの酵素タンパク質濃度の本発明の酵素を含む試験溶液を調製する。デンプン(例えば、Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120,3133 KT,Vlaardingen,The NetherlandsのCS−28)で染色した布地を添加し、20℃で30分間洗浄する。水道水を流して完全にすすぎ、暗所で乾燥させた後、続いて、染色した布地の光強度又は反射率の値を、洗浄性能の尺度として測定する。デルタレミッション値を得るために、0mgの酵素タンパク質/Lを有する試験物を、ブランクとして使用する。好ましくは、機械的な動きを、例えば、布地を有する洗浄液の振盪、回転又は撹拌の形態で、洗浄工程中に適用する。

AMSA洗浄性能実験を、以下に指定される実験条件下で実行することができる。

試験系にCaCl、MgCl、及びNaHCO(Ca2+:Mg2+:HCO =4:1:7.5、モルベース)を添加して、水の硬度を15°dHに調整する。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、暗所で乾燥させる。

酵素変異体の性能を、特定のアミラーゼで洗浄した織物の色の輝度として測定する。白色光で照射するとき、輝度を、試料から反射される光の強度として表すこともできる。試料が染色されると、反射光の強度は、きれいな試料の反射光の強度よりも低い。したがって、反射光の強度を、アミラーゼ洗浄性能を測定するために使用することができる。

洗浄した織物の画像を捕捉するために使用する、専門のフラットベッドスキャナー(Kodak iQsmart,Kodak)を用いて色測定を行うことができる。

スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの24ビットピクセル値を、RGB値としても既知である、レッド(r)、グリーン(g)及びブルー(b)の値に変換する。RGB値をベクターとして合計し、その後、結果として生じるベクターの長さを算出して、強度値(Int)を計算する:

織物:織物試料CS−28(綿上の米デンプン)を、Center For Test materials BV,P.O.Box 120,3133 KT Vlaardingen,the Netherlandsから入手することができる。

ビーカーを用いた洗浄性能試験は、トップローダー洗濯機の小型モデルにおけるアッセイであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために使用される。250mLのビーカー、及び1分間当たり80回の振動数で、それぞれの方向に180度の振動回転運動を提供するパドル撹拌器を用いたビーカー洗浄性能試験は、以下の工程:50mMのNaHCO及び0.4mg/Lの酵素を含有する100mLの洗浄液(6℃、15度dH、pH 8.0)を提供する工程と、CS−28(5×5cm)の2つの見本及びEMPA162(5×5cm)の2つの見本を、洗浄液に添加して、洗浄を開始する工程と、撹拌速度を80rpmに設定する工程と、60分後に撹拌を停止する工程と、見本を冷たい水道水ですすぎ流す工程と、すすいだ見本を暗所で一晩乾燥させる工程と、以下に説明されるカラーアイを用いて、460nmで入射光のレミッションを測定して、洗浄性能を評価する工程と、を含む。

機器及び材料
循環水浴(5℃)、ガラスビーカー(250mL)、100mL容量の洗浄液を有する1つのビーカーにつき1つの回転アーム、試験見本:Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,The NetherlandsのCS−28(綿上の米デンプン)及びEMPA Testmaterials AG,St.Gallen,SwitzerlandのEMPA162(綿上の米デンプン/ポリエステル)、見本を5×5cmに切断する。

洗浄液:50mMのNaHCO緩衝液、pH 8.0、水の硬度:15度dH、カルシウム:マグネシウム比4:1。

アミラーゼ原液:1mLにつき1mgの酵素タンパク質。超純水(ミリQ水)中の0.1%(w/v)のTriton X−100及び0.1mMのCaClの溶液を、アミラーゼの希釈のために使用する(アミラーゼ希釈緩衝液)。

カラーアイ測定
洗浄性能を、デルタレミッション値(ΔRem)として表す。非常に小さい、すなわち、0.7cm(約0.7×1.0cm)の楕円形口径を有するMacbethカラーアイ7000反射分光光度計を用いて、見本の光反射率評価を行った。入射光中の紫外線なしで測定を行い、460nmでのレミッションを抽出した。測定開口部に対して見本を押し上げるピストンからの反射を減少させるために、見本を測定する前に、測定する見本を同一の種類の別の見本の上部に設置した。アミラーゼで洗浄した見本のレミッション値から、添加アミラーゼ(対照)なしで洗浄した見本のレミッション値を引くことによって、個々の見本のデルタレミッション値を計算した。

デンプン分解活性(アルファ−アミラーゼ活性)の測定のためのアッセイ
EnzChekアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性を、以下のEnzCheckアッセイによって決定することができる。基質は、トウモロコシデンプン誘導体、DQ(商標)デンプン(トウモロコシデンプンBODIPY FL共役体)であり、蛍光を消す程度にBODIPY(登録商標)FL(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸)染料で標識されるトウモロコシデンプンである。約1mgの凍結乾燥基質を含有する1つのバイアルを、pH 4.0、100μLの50mM酢酸ナトリウム中に溶解する。バイアルを20秒間ボルテックスし、溶解するまで時折混合しながら室温で暗所に留置した。次に、950μLの10mM酢酸ナトリウム、0.01%(w/V)Triton X100((ポリエチレングリコールp−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェニルエーテル(C1422O(CO)(n=9〜10))、pH 5.0を添加し、完全にボルテックスし、使用する準備が整うまで室温で暗所に保存する。基質作用液を、5mLの50mM HEPES、0.01%(w/V)Triton X100、1mM CaCl、pH 7.0と混合して、1mLのこの溶液から調製する。

洗剤を含有する酵素を、50mMのHEPES、0.01%のTriton X100、1mMのCaCl、pH 7.0中で、15ngの酵素タンパク質/mLの濃度に希釈する(6826.7倍の希釈)。アッセイのために、25μLの基質作用液を、黒色384ウェルマイクロタイタープレート中で25μLの希釈酵素と10秒間混合する。蛍光強度を、25℃で、それぞれのウェル中で、2分に1回、30分間測定し(励起:485nm、発光:555nm)、V最大を、時間に対する蛍光強度のプロットの勾配として計算する。プロットは線形であるべきであり、希釈した参照酵素溶液が活性アッセイの線形範囲内であるように、残存活性アッセイを調整しなければならない。

少数例で、アッセイにおいてアミラーゼを有しない洗剤からの著しい妨害がある。そのような場合、代替のアミラーゼアッセイを使用することができる。既知量のアミラーゼを2つのレベルで洗剤に添加し、その後、2つの試料の活性を測定することによって、アミラーゼアッセイにおける洗剤からの妨害を試験することができる。測定した活性の差異が、添加したアミラーゼ間のレベルの差異に相当する場合、アッセイを用いて、保管後のアミラーゼの残存活性を決定することができる。

PNP−G7アッセイ
アルファ−アミラーゼ活性を、PNP−G7基質を採用する方法によって決定することができる。PNP−G7は、4,6−エチリデン(G)−p−ニトロフェニル(G)−α、D−マルトヘプタオシドの省略形であり、アルファ−アミラーゼ等のエンドアミラーゼで切断することができるブロックオリゴ糖である。切断後、キット中に含まれるアルファ−グルコシダーゼは、加水分解基質を更に消化して、黄色を有する遊離PNP分子を自由にし、ひいては、λ=405nm(400〜420nm)で、可視分光測光で測定することができる。PNP−G7基質及びアルファ−グルコシダーゼを含有するキットは、Roche/Hitachi(カタログ番号11876473)によって製造される。

試薬:
このキットのG7−PNP基質は、22mMの4,6−エチリデン−G7−PNP及び52.4mMのHEPES(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−エタンスルホン酸)(pH 7.0)を含有する。

アルファ−グルコシダーゼ試薬は、52.4mMのHEPES、87mMのNaCl、12.6mMのMgCl、0.075mMのCaCl、≧4kU/Lのアルファ−グルコシダーゼ)を含有する。

1mLのアルファ−グルコシダーゼ試薬を0.2mLのG7−PNP基質と混合して、基質作用液を作製する。この基質作用液を、使用直前に作製する。

希釈緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)Triton X100(ポリエチレングリコールp−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェニルエーテル(C1422O(CO)(n=9〜10)))、1mMのCaCl2、pH 7.0。

手順:
分析するアミラーゼ試料を、希釈試料のpHが7になるように、希釈緩衝液中で希釈した。20μLの希釈酵素試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、80μLの基質作用液を添加することによって、アッセイを行なった。溶液を混合し、室温で1分間事前インキュベートし、吸収を20秒毎に5分間、OD 405nmで測定する。

時間依存吸収曲線の勾配(1分間当たりの吸収度)は、所与の一連の条件下での問題のアルファ−アミラーゼの比活性(1mg酵素当たりの活性)に直接比例する。アミラーゼ試料を、勾配が1分間当たり0.4吸収度単位未満のレベルに希釈すべきである。

百分率点(pp)の決定
親と比較した変異体の残存活性(安定性)における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異、すなわち、変異体残存活性−親の残存活性として計算する。

実施例1変異体の調製
配列番号6 SP722のアミラーゼ変異体を、標準の手順、手短に言うと、ランダム及び/又は部位特異的変異を遺伝子に導入する工程、バチルス・ズブチルス宿主細胞を変異遺伝子で形質転換する工程、(例えば、国際特許第2004/111220号の実施例1に記載されるように)形質転換した宿主細胞を発酵させる工程、並びに発酵ブロスからアミラーゼを精製する工程によって調製した。類似した様式で、参照アミラーゼ(配列番号6)をバチルス・ズブチルスにおいて組み換え的に産生した。

実施例2:キレート剤の特徴付け
実施例2a
遊離カルシウムイオンの測定
キレート剤(キレート化物)を、遊離カルシウムイオンの濃度(Ca2+)をpH 8で2.0mMから0.10mMに減少させるそれらの能力でランク付けすることができ、M.K.Nagarajan et al.,JAOCS,Vol.61,no.9(September 1984),pp.1475〜1478によって説明される方法から開発された。遊離カルシウムイオンの測定のための「材料及び方法」における上述のアッセイを用いた。

したがって、水の硬度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、上述のように決定した。21℃及びpH 8の緩衝液を用いて実験を実行した。

使用したキレート化物の最終濃度及び測定された遊離Ca2+濃度が、以下の表Iに示される。

これらのデータから、遊離Ca2+濃度を2.0mMから0.10mM未満に減少させるのに必要なキレート剤の濃度を、内挿によって決定し、結果は、表IIに提示される。

いくつかのキレート化物を、本アッセイを用いて特徴化し、49mMのEPPS緩衝液及び80mMの塩化カリウム中の、遊離カルシウムイオンの濃度をpH 8.0で2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化剤濃度が、表IIに示される。

実施例2b
log Kの決定
あるいは、キレート剤は、キレート剤(キレート化剤)及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けることができる。この定数を、AD Nielsen,CC Fuglsang and P Westh,Analytical Biochemistry Vol.314(2003)page 227〜234、及びT Wiseman,S Williston,JF Brandts and L−N Lin,Analytical Biochemistry Vol.179(1989)page 131〜137によって説明されるITC(等温滴定熱量計)によって決定することができる。log Kを決定するための手順を説明する。

この手順を用いて、以下のlog K値をpH 10で決定する(表IIIを参照のこと)。

実施例3:キレート剤とのインキュベーション後の残存活性
EnzChekアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性は、本発明において、上述のようにEnzCheckアッセイによって決定される。概して、モデル洗剤Bにおける残存アミラーゼ活性を、31℃で18時間のインキュベーション後に決定し、その後、活性を、上述のように4℃で18時間インキュベートした参照の活性と比較した。

キレート化物を有する洗剤中のアミラーゼ変異体の安定性試験
洗剤中のアミラーゼの安定性を決定するために、20mMのHEPES、0.1%(w/V)のTriton X100中(pH 8.0)での希釈によって、試験した酵素を0.6mg/mLの酵素タンパク質の濃度に調整した。開始のアミラーゼ濃度が低すぎる場合、それを、10kDaのカットオフを有するUF膜を用いて、限外濾過(UF)によって濃縮することができる。

25μLのアミラーゼ溶液及び125μLの洗剤(モデル洗剤B)を、96ウェルマイクロタイタープレートに4回に分けて移した。1つの小さい磁石(5×2mm)をそれぞれのウェルに設置し、配合物を磁気撹拌器で、室温で5分間混合した。2つの同一のプレートを調製した。これらのプレートのうちの一方を、4℃で18時間インキュベートし(参照試料)、他方のプレートを31℃で18時間インキュベートした(31℃試料)。

インキュベーションの直後、洗剤中の残存アミラーゼ活性を決定するために、プレート上の試料を、アミラーゼ活性についてEnzCheckアッセイに記載されるように分析した。アッセイ上で酵素よりも他の洗剤成分からの妨害を減少させるために、参照及び31℃試料の両方を同一のタンパク質濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及び31℃試料の両方の活性を、同一の384ウェルプレート上で決定した。参照アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、100×V最大(31℃試料)/V最大(参照試料)として計算した。

結果は、参照アミラーゼ(親)としてSP722又はSP722+D183 G184のいずれかを用いて、表IVに示される。親と比較した変異体の残存活性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性割合と親の残存活性割合との間の差異として計算する。

結果は、本発明の変異体が、参照アルファ−アミラーゼよりも強力なキレート剤の存在にかなりの耐性を示すことを明確に示す。少数例で、残存活性は100を超え、本アッセイの分析的相違を反映する。

結果は、参照アルファ−アミラーゼと比較して、本発明の変異体が、pH 8.0で、安定性も改善したことを示し、それは、アミノ酸183及び184が欠失された配列番号6である、配列番号6 SP722又は配列番号6+D183 G184であり得る。

実施例4:pH 8及びpH 10でのキレート剤とのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPAの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定するが、EnzCheckアッセイを用いて活性を決定する原理は、上述と同一である。概して、残存アミラーゼ活性を、キレート剤を含有する緩衝液中で、pH 8及び49℃又はpH 10及び42℃のいずれかで1時間インキュベーションした後に決定し、その後、その活性を、上述の「材料及び方法」に記載されるように、4℃で1時間インキュベートした参照の活性と比較する。

pH 8及びpH 10の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理:
酵素試料を、pH 8.0の緩衝液中で、1.5%の最終濃度のDTPAと49℃で1時間インキュベートし、参照試料を、4℃で1時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、pH 10.0の緩衝液中で、1.5%の最終濃度のDTPAと42℃で1時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。

試薬:
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%のTriton X100、1.875%のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのEPPS、0.01%のTriton X100、1.875%のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01% Triton X−100、pH 8.0
手順:
160μL緩衝液(DTPAを有するpH 8緩衝液又はDTPAを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPAは、それぞれのウェルにおいて1.5%であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置した新しいPCRマイクロタイタープレート(PCR MTP)に移した(参照試料)。PCR MTPを、緩衝液がpH 8.0を有した場合、49℃で1時間(pH 8、49℃試料)、緩衝液がpH 10.0を有した場合、42℃で1時間(pH 10、42℃試料)、PCR機器内でインキュベートした。

インキュベーションの直後、PCRプレート上の試料を、希釈緩衝液中で10倍に希釈し、PNP−G7アッセイに記載されるように、アミラーゼ活性について分析した。アッセイ上でのキレート剤、ここではDTPAからの妨害を減少させるために、参照及びpH 8で49℃の試料/pH 10で42℃の試料の両方を、残存活性について分析する前に同一の濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及びpH 8で49℃の試料又はpH 10で42℃の試料の両方の活性を、同一の96ウェルプレート上で決定した。親アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、100×V最大(pH 8で42℃又はpH 10で49℃の試料)/V最大(参照試料)として計算し、結果が表Vに示される。百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
結果は、本発明の変異体が、変異体の残存活性を親の残存活性と比較したとき、及び変異体の百分率点改善を考察したときの両方で、pH 8で49℃及びpH 10で42℃での1時間のインキュベーション後に、高度に安定し、高い残存活性を有することを明確に示す。相対的に、SP722+D183 G184アミラーゼは、20%の残存活性を有し、SP722は、更に低い残存活性を有する。

実施例5:1.5%(w/v)のDTPAを有するpH 8及びpH 10の緩衝液中でのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPAの存在下でのインキュベーション後のSP722変異体の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。

pH 8及びpH 10の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPAを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度及びインキュベーション時間でインキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPAを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。

試薬:
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μL緩衝液(DTPAを有するpH 8緩衝液又はDTPAを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPAは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。

インキュベーションの直後、PCRプレート上の試料を、希釈緩衝液中で10倍に希釈し、PNP−G7アッセイに記載されるように、アミラーゼ活性について分析した。アッセイ上のキレート剤、ここではDTPAからの妨害を減少させるために、参照及びストレス試料の両方を、残存活性について分析する前に同一の濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及びストレス試料の両方の活性を、同一の96ウェルプレート上で決定した。親アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。結果を表5.1に示す。

残存活性から、SP722変異体がDTPAの存在下でより安定していることが明確に見られ、これは、親と比較して変異体の安定性における百分率点改善にも反映される。

実施例6:pH 10のHEDPとのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤HEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 10のキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。

pH 10の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。

試薬:
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(HEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表6.1に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。

結果は、親と比較して、変異体が、HEDPの存在下でインキュベートされるときにより安定していることを明確に示す。

実施例7:1.5%(w/v)のHEDPを有するSP722+D183 G184及びその変異体の安定性
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤HEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。

pH 8及びpH 10の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。

試薬:
HEDPを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 8.0
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(HEDPを有するpH 8緩衝液又はHEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表7.1に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。

結果は、SP722+D183 G184の変異体が、キレート剤HEDPの存在下でインキュベートしたとき、はるかにより安定していることを明確に示す。

実施例8:1.5%(w/v)のDTPA又は1.5%(w/v)のHEDPの存在下でのAA560変異体の安定性
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPA又はHEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。

pH 8及びpH 10の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPA又はHEDPを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)最終濃度のDTPA又はHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。

試薬:
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
HEDPを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 8.0
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)Triton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(DTPA若しくはHEDPを有するpH 8緩衝液又はDTPA若しくはHEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPA又はHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表8.1及び表8.2に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。

実施例9:キレート剤を有する洗剤中でのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、PNP−G7アッセイを用いて、実施例5に記載されるように、キレート化の存在下で洗剤中でインキュベーションした後、残存アミラーゼ活性を決定する。

概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8.2のキレート剤DTPMP及びHEDPを含有する洗剤C中で、30℃で3週間及び6週間インキュベーションした後に決定した。その後、アミラーゼの残存活性を、以下に記載されるように、第0日の新たに作製した洗剤(インキュベーション前)中でのアミラーゼの活性と比較する。
Genencor International,Palo Altoの商標名Purafect Prime(登録商標)で販売されているこれは、活性プロテアーゼ酵素である洗剤の割合として表される(すなわち、産物におけるこの%は、酵素の100%活性を想定する)。

pH 8.2のキレート剤を有する洗剤中でのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
方法:それぞれが、本発明のアミラーゼ変異体又はSP722+D183及びG184とも称される以下の2つの欠失:D183及びG184を有する配列番号6(SP722)を含有するpH 8.2の洗剤C試料を、調製した。それぞれの洗剤試料を、インキュベーション前に最初の残存酵素活性について決定した(参照試料)。

それぞれの試料の残存酵素活性を、30℃で3週間及び6週間インキュベーションした後に決定し、それらの参照試料と比較した。残存活性を、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて決定した。

アミラーゼ溶液:pH 8.2の100gの洗剤C中の13.77mgの活性アミラーゼタンパク質
手順:
アミラーゼを含有するpH 8.2の5gの洗剤Cを、エアタイトリッドを有する7mLのガラスバイアルに二重に設置した。最初の二重の試料の残存酵素活性を、インキュベーション前に決定した。

試料を、30℃で3週間及び6週間、インキュベータに設置した。インキュベーションの直後、PNP−G7アッセイに記載されるように、試料を残存アミラーゼ活性について分析した。この試験において、100%の残存活性は、インキュベーション前の最初の残存酵素活性(参照試料)と比較して、喪失がないアミラーゼ活性と等しい。親と比較した変異体の残存活性(安定性)における百分率点(pp)改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。

結果は、本発明の変異体が、pH 8.2の洗剤C中での30℃で3週間及び6週間のインキュベーション後、高度に安定しており、高い残存活性を有することを明確に示す。相対的に、SP722+D183 G184アミラーゼは、3週間後に19%、6週間後に3%の残存活性を有する。

種々の参照が本明細書において引用され、それらの開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

本明細書に記載され、特許請求される本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態が本発明のいくつかの態様の説明として意図されるため、これらの実施形態によって範囲を限定するものではない。任意の同等の実施形態は、本発明の範囲内であるよう意図されている。実際、本明細書に示され、記載される修正に加えて、本発明の種々の修正は、前述の記述から当業者には明らかとなる。

そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に収まるよう意図されている。不一致が生じた場合、定義を含む本開示が支配する。

本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳しく制限されるものとして理解されるべきでない。それよりむしろ、特に指定されない限り、そのような各寸法は、列挙された値とその値周辺の機能的に同等の範囲との両方を意味することを意図する。例えば、「40mm」として開示された寸法は、「約40mm」を意味することを意図する。

Claims (14)

  1. 洗浄組成物であって、
    (a)親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号6による番号付けを用いて、243の位置での置換と、195、193、197、198、200、203、206、210、212、および213からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
    (b)0.01〜99.9重量%の量の洗浄補助剤と、
    (c)少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。
  2. キレート剤を含み、
    (a)10mM未満の濃度の前記キレート剤が、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
    (b)10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
    (c)前記キレート剤が、8mM未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
    (d)前記キレート剤が、21℃及びpH 8で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
    (e)前記キレート剤が、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.7倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、請求項1に記載の組成物。
  3. 洗浄組成物であって、
    (a)親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号6による番号付けを用いて、243の位置での置換と、195、193、197、198、200、203、206、210、212、および213からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
    (b)0.01〜99.9重量%の量の洗浄補助剤と、
    (c)少なくとも1つのキレート剤であって、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンを2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。
  4. (a)前記変異体が、配列番号6による番号付けを用いて、243の位置での置換と、195、193、197、198、200、203、206、210、212、又は213に相当する1つ以上の位置での置を含み、及び/又は
    (b)前記親アルファ−アミラーゼ配列が、193が、[G、A、S、T又はM]であるか、195位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、197位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、198位が、[Q又はN]であるか、200位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、203位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、206位が、[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D又はE]であるか、210位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、212位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、又は213位が、[G、A、S、T又はM]であるか、あるいは243が、[F、W、Y、L、I又はV]である置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、及び/又は
    (c)前記親アルファ−アミラーゼ配列が、193がTであるか、195位がF又はYであるか、197位がF又はLであるか、198位がNであるか、200位がFであるか、203位がFであるか、206位がYであるか、210位がYであるか、212位がVであるか、又は213位がAであるか、あるいは243位がFである置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、かつ/あるいは前記変異体が、(配列番号6の番号付けを用いて)181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つの欠失を更に含み、及び/又は
    (d)前記変異体が、配列番号6の成熟ポリペプチドの193、195、197、198、200、203、206、210、212、213位に相当する1つ以上の位置での置換と、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458位に相当する1つ以上の位置での置換と、を含み、及び/又は
    (e)前記変異体が、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後、少なくとも60%の残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
    (f)前記変異体が、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後、少なくとも70%の残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、請求項1又は2に記載の組成物。
  5. 前記キレート剤が、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP、HEDP及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、配列番号6の成熟ポリペプチドの、243の位置での変更と、195、197、198、200、203、206、210、212、及び213からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を更に含み、
    (a)前記(1つ又は複数の)変更が独立して、
    (i)前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
    (ii)前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び/又は
    (iii)前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
    (b)前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
    (c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において少なくとも1つの欠失を含み、243の位置での変更と、195、197、198、200、203、206、210、212、及び213からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、
    (a)前記(1つ又は複数の)変更が独立して、
    (i)前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
    (ii)前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び/又は
    (iii)前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
    (b)前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
    (c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記変異体が、キレート剤を含む組成物において、前記親アルファ−アミラーゼと比較して、又は配列番号6と比較して、改善された安定性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. デンプン分解活性を有する前記変異体が、配列番号6、8、10、12、18又は20の成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. デンプン分解活性を有する前記親ポリペプチドが、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、(i)配列番号5、7、9又は11、17、19の成熟ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号5、7、9、11、17、19の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列、又は(iii)(i)若しくは(ii)の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記キレート剤が、DTPA、HEDP、MGDA、DTPMP及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記洗浄補助剤が、香料マイクロカプセル、布地色相剤、プロテアーゼ、ポリエチレンイミンポリマー、リパーゼ、及びこれらの任意の混合物のうちの1つ以上を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、液体洗濯洗剤組成物である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 洗濯方法であって、30℃以下の温度で、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物で衣類を洗濯する工程を含む、方法。
JP2012552988A 2010-02-10 2011-02-10 キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 Active JP5823414B2 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10153223A EP2357220A1 (en) 2010-02-10 2010-02-10 Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent
EP10153223.2 2010-02-10
PCT/US2011/024321 WO2011100410A2 (en) 2010-02-10 2011-02-10 Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013519757A JP2013519757A (ja) 2013-05-30
JP5823414B2 true JP5823414B2 (ja) 2015-11-25

Family

ID=42342632

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012552988A Active JP5823414B2 (ja) 2010-02-10 2011-02-10 キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物
JP2015101354A Active JP6234960B2 (ja) 2010-02-10 2015-05-18 キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015101354A Active JP6234960B2 (ja) 2010-02-10 2015-05-18 キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9493730B2 (ja)
EP (3) EP2357220A1 (ja)
JP (2) JP5823414B2 (ja)
CN (2) CN107267304A (ja)
AR (1) AR092774A1 (ja)
CA (1) CA2787825C (ja)
DK (1) DK2534233T3 (ja)
MX (1) MX2012009344A (ja)
WO (1) WO2011100410A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015199964A (ja) * 2010-02-10 2015-11-12 ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6185243B2 (ja) 2010-02-10 2017-08-23 ノボザイムス アクティーゼルスカブ キレート剤存在下で高安定な変異体及び変異体含有組成物
EP2726607B1 (en) 2011-06-30 2018-08-08 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP2540824A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 The Procter and Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing
WO2014106593A1 (en) * 2013-01-03 2014-07-10 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
EP3011020A1 (en) 2013-06-17 2016-04-27 Danisco US Inc. Alpha-amylase from bacillaceae family member
FR3008184B1 (fr) 2013-07-03 2017-01-27 Eurocopter France Systeme et procede de controle d une piece a surveiller rotative qui est agencee dans un organe mecanique
US20160348084A1 (en) * 2013-09-30 2016-12-01 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20160160199A1 (en) 2013-10-03 2016-06-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
US20160186102A1 (en) 2013-10-03 2016-06-30 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
CN105960456A (zh) 2013-11-20 2016-09-21 丹尼斯科美国公司 对蛋白酶裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶及其使用方法
WO2015091959A2 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2015098265A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 花王株式会社 粉末洗浄剤組成物
EP3097172A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter and Gamble Company Method of treating textile fabrics
EP3097174A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter and Gamble Company Method of treating textile fabrics
WO2015112339A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 The Procter & Gamble Company Fabric treatment composition
EP3097175B1 (en) 2014-01-22 2018-10-17 The Procter and Gamble Company Fabric treatment composition
EP3122861B1 (en) * 2014-03-26 2019-05-08 Unilever N.V. Liquid detergent compositions comprising an alpha-amylase
CA2967658A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 The Procter & Gamble Company Benefit agent delivery compositions
DE102014225473A1 (de) * 2014-12-10 2016-06-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit einer Kombination aus Amylase und Protease
EP3034596B1 (en) 2014-12-17 2018-08-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034592A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034591A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034589A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034588B1 (en) 2014-12-17 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034590A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034597A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
WO2016176240A1 (en) 2015-04-29 2016-11-03 The Procter & Gamble Company Method of treating a fabric
EP3088503B1 (en) 2015-04-29 2018-05-23 The Procter and Gamble Company Method of treating a fabric
JP6545822B2 (ja) 2015-04-29 2019-07-17 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーThe Procter & Gamble Company 布地の処理方法
CN107548415A (zh) 2015-04-29 2018-01-05 宝洁公司 洗涤织物的方法
CN107820515A (zh) 2015-04-29 2018-03-20 宝洁公司 洗涤剂组合物
EP3101103B1 (en) 2015-06-05 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
JP2019502779A (ja) 2015-11-26 2019-01-31 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー プロテアーゼを含む液体洗剤組成物及び封入リパーゼ
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
EP3241890B1 (en) * 2016-05-03 2019-06-26 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3241891B1 (en) 2016-05-03 2019-04-03 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
JP2019515679A (ja) * 2016-05-09 2019-06-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 向上した性能を有する変異体ポリペプチドおよびその使用
EP3257931A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3301155A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-04 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
WO2018102478A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
CA3044420A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
US20180216039A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-02 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants
EP3415592A1 (en) 2017-06-15 2018-12-19 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose article comprising a solid laundry detergent composition
EP3502245A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502244A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502227A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502246A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition

Family Cites Families (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
US3912590A (en) 1973-01-03 1975-10-14 Novo Industri As Procedure for liquefying starch
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
US4282877A (en) 1979-02-26 1981-08-11 Alleghany Pharmacal Hair removing arrangement
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
JPS6225036B2 (ja) 1981-04-20 1987-06-01 Novo Industri As
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4683202B1 (ja) 1985-03-28 1990-11-27 Cetus Corp
DE3684398D1 (de) 1985-08-09 1992-04-23 Gist Brocades Nv Lipolytische enzyme und deren anwendung in reinigungsmitteln.
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
DK311186D0 (da) 1986-06-30 1986-06-30 Novo Industri As Enzymer
KR960006119B1 (ko) 1986-07-09 1996-05-09 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브 전분 액화용 알파-아밀라아제 혼합물
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
DE3854249T2 (de) 1987-08-28 1996-02-29 Novo Nordisk As Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
EP0394352B1 (en) 1988-01-07 1992-03-11 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体dna、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
DK0410498T3 (da) 1989-06-29 1999-03-22 Genencor Int Mutante mikrobielle alfa-amylaser med øget termisk, syre og/eller alkalisk stabilitet
DE69033388D1 (de) 1989-08-25 2000-01-13 Henkel Research Corp Alkalisches proteolytisches enzym und verfahren zur herstellung
US5008497A (en) * 1990-03-22 1991-04-16 Asher David J Touch controller
DE59101948D1 (de) 1990-04-14 1994-07-21 Kali Chemie Ag Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren.
WO1991017243A1 (en) 1990-05-09 1991-11-14 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
DE69133035D1 (de) 1991-01-16 2002-07-18 Procter & Gamble Kompakte Waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven Cellulasen
DE69209500T2 (de) 1991-04-30 1996-10-31 Procter & Gamble Gerüstsubstanzhaltige flüssigwaschmittel mit borsäure-polyolkomplex zur ptoteolytischen enzyminhibierung
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 THE PROCTER & GAMBLE COMPANY Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
JP3681750B2 (ja) 1992-10-06 2005-08-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セルラーゼ変異体
PT867504E (pt) 1993-02-11 2003-08-29 Genencor Int Alfa-amilase estavel a oxidacao
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
CN1133062A (zh) 1993-10-13 1996-10-09 诺沃挪第克公司 对过氧化氢稳定的过氧化物酶变体
US5679630A (en) 1993-10-14 1997-10-21 The Procter & Gamble Company Protease-containing cleaning compositions
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
DE69534513T2 (de) 1994-03-08 2006-07-27 Novozymes A/S Neuartige alkalische zellulasen
AT305031T (de) 1994-03-29 2005-10-15 Novozymes As Alkalische amylase aus bacellus
DE4422198C2 (de) 1994-06-24 1997-08-28 Audi Ag Verfahren zum Steuern der elektrischen Beheizung eines Katalysators
AU3604595A (en) 1994-10-06 1996-05-02 Novo Nordisk A/S An enzyme and enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
BR9509525A (pt) 1994-10-26 1995-10-26 Novo Nordisk As Construção de dna vetor de expressão recombinante célula processo para produzir a enzima que exibe atividade lipolítica enzima que exibe atividade lipolítica preparação de enzima aditivo de detergente e composição de detergente
AR000862A1 (es) * 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN102146362A (zh) 1995-03-17 2011-08-10 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
JP3025627B2 (ja) 1995-06-14 2000-03-27 花王株式会社 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子
WO1997007202A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
WO1998008940A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
EP1726644A1 (en) 1996-09-17 2006-11-29 Novozymes A/S Cellulase variants
DE69717133T2 (de) 1996-09-24 2003-07-10 Procter & Gamble Flüssige reinigungsmittel, die proteolytisches enzyme, peptidaldehyd und kalziumionen enthalten
CN1232384A (zh) 1996-10-08 1999-10-20 诺沃挪第克公司 作为染料前体的二氨基苯甲酸衍生物
AR017331A1 (es) * 1997-10-13 2001-09-05 Novozymes As Polipeptidos mutantes de alfa-amilasas, aditivo para detergentes y composiciones detergentes que los comprenden.
US6361989B1 (en) * 1997-10-13 2002-03-26 Novozymes A/S α-amylase and α-amylase variants
EP2011864B1 (en) * 1999-03-31 2014-12-31 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
AR015977A1 (es) 1997-10-23 2001-05-30 Genencor Int Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes
AU9737398A (en) * 1997-10-30 1999-05-24 Novo Nordisk A/S Alpha-amylase mutants
US6472364B1 (en) 1998-10-13 2002-10-29 The Procter & Gamble Company Detergent compositions or components
US6197565B1 (en) * 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
US6939702B1 (en) 1999-03-31 2005-09-06 Novozymes A/S Lipase variant
JP2000330096A (ja) * 1999-05-25 2000-11-30 Nec Corp 液晶表示装置およびその組立方法
CN1302006A (zh) * 1999-12-29 2001-07-04 仁宝电脑工业股份有限公司 便携式电脑用的磁控式启闭装置
AU5857301A (en) * 2000-05-18 2001-11-26 Electrotextiles Co Ltd Data input device
EP2298903A3 (en) * 2000-08-01 2011-10-05 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
JP4426716B2 (ja) 2000-10-11 2010-03-03 花王株式会社 高生産性α−アミラーゼ
AU2302002A (en) 2000-11-27 2002-06-03 Novozymes As Automated mechanical stress assay for screening cleaning ingredients
US7289083B1 (en) * 2000-11-30 2007-10-30 Palm, Inc. Multi-sided display for portable computer
FR2822296A1 (fr) 2001-03-19 2002-09-20 Atofina Elements de batteries lithium-ion fabriques a partir d'une poudre microcomposite a base d'une charge et d'un fluoropolymere
AU2002254876A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
DE10162728A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
JP4346853B2 (ja) * 2002-02-26 2009-10-21 富士通コンポーネント株式会社 電子装置及びその制御方法
US7466307B2 (en) * 2002-04-11 2008-12-16 Synaptics Incorporated Closed-loop sensor on a solid-state object position detector
US8488308B2 (en) * 2003-02-12 2013-07-16 3M Innovative Properties Company Sealed force-based touch sensor
CN1809635A (zh) 2003-06-19 2006-07-26 诺维信公司 蛋白酶
EP1492136A1 (de) * 2003-06-23 2004-12-29 IEE International Electronics & Engineering S.A.R.L. Drucksensor in Folienbauweise
EP1675941B1 (en) 2003-06-25 2013-05-22 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
JP4245433B2 (ja) * 2003-07-23 2009-03-25 パナソニック株式会社 動画作成装置および動画作成方法
EP1662707A4 (en) * 2003-07-23 2012-06-06 Sony Computer Entertainment Inc Communication device, game system, connection establishment method, communication method, adapter device, and communication system
US20050059489A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Kim Taek Sung Motion sensing applications
US7256768B2 (en) * 2003-09-16 2007-08-14 Microsoft Corporation Computer keyboard with quantitatively force-sensing keys
KR100593982B1 (ko) * 2003-11-06 2006-06-30 삼성전자주식회사 가상 그래피티를 제공하는 장치 및 방법과 그에 따른기록매체
AU2004293826B2 (en) 2003-11-19 2009-09-17 Danisco Us Inc. Serine proteases, nucleic acids encoding serine enzymes and vectors and host cells incorporating same
JP4188810B2 (ja) * 2003-11-26 2008-12-03 富士フイルム株式会社 カメラ付携帯機器
US7277087B2 (en) * 2003-12-31 2007-10-02 3M Innovative Properties Company Touch sensing with touch down and lift off sensitivity
US20070182663A1 (en) * 2004-06-01 2007-08-09 Biech Grant S Portable, folding and separable multi-display computing system
WO2006002034A1 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Novozymes North America, Inc Simultaneous desizing and scouring process
US7208459B2 (en) 2004-06-29 2007-04-24 The Procter & Gamble Company Laundry detergent compositions with efficient hueing dye
US7724242B2 (en) * 2004-08-06 2010-05-25 Touchtable, Inc. Touch driven method and apparatus to integrate and display multiple image layers forming alternate depictions of same subject matter
US7834855B2 (en) * 2004-08-25 2010-11-16 Apple Inc. Wide touchpad on a portable computer
US7239505B2 (en) * 2004-10-08 2007-07-03 Microsoft Corporation Direct hinge for optimizing conversion
US20080053222A1 (en) * 2005-10-06 2008-03-06 Cypak Ab Single use, self-contained assay device for quantitative and qualitative measurements
US7392410B2 (en) * 2004-10-15 2008-06-24 Dell Products L.P. Power adapter having power supply identifier information functionality
WO2006063594A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
US7823214B2 (en) * 2005-01-07 2010-10-26 Apple Inc. Accessory authentication for electronic devices
US8369795B2 (en) * 2005-01-12 2013-02-05 Microsoft Corporation Game console notification system
SG171484A1 (en) * 2005-01-30 2011-06-29 Simtrix Ltd Computer mouse peripheral
GB0503291D0 (en) * 2005-02-17 2005-03-23 Eleksen Ltd Mobile communication
US20070072474A1 (en) * 2005-04-27 2007-03-29 Nigel Beasley Flexible power adapter systems and methods
US20070062089A1 (en) * 2005-08-31 2007-03-22 Homer Steven S Display device
KR20080066921A (ko) 2005-10-12 2008-07-17 더 프록터 앤드 갬블 캄파니 저장-안정성 중성 메탈로프로테아제의 용도 및 제조
US7684878B2 (en) * 2006-02-07 2010-03-23 National Instruments Corporation Programmable hardware element pre-regulator
WO2007112365A2 (en) * 2006-03-26 2007-10-04 Chatsworth Product, Inc. Indexing hinge
US20080015135A1 (en) 2006-05-05 2008-01-17 De Buzzaccarini Francesco Compact fluid laundry detergent composition
MX2008016448A (es) 2006-06-19 2009-01-22 Procter & Gamble Composiciones detergentes liquidas con polimeros a base de acido poliacrilico y polidispesidad baja.
WO2008018233A1 (fr) * 2006-08-11 2008-02-14 Sharp Kabushiki Kaisha Dispositif d'affichage à cristaux liquides et appareil électronique pourvu de celui-ci
US8046619B2 (en) * 2006-10-03 2011-10-25 Avaya Inc. Apparatus and methods for data distribution devices having selectable power supplies
CN101681189B (zh) * 2007-05-01 2012-07-04 惠普开发有限公司 电源适配器和负载的双向控制
EP2148238A4 (en) * 2007-05-18 2012-04-25 Sega Kk Dba Sega Corp Digitizer function-equipped liquid crystal display device, information processing electronic device, and game device
US7936341B2 (en) * 2007-05-30 2011-05-03 Microsoft Corporation Recognizing selection regions from multiple simultaneous inputs
WO2008153882A1 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Appleton Papers Inc. Benefit agent containing delivery particle
US8086781B2 (en) * 2007-06-22 2011-12-27 Apple Inc. Serial pass-through device
US8065624B2 (en) * 2007-06-28 2011-11-22 Panasonic Corporation Virtual keypad systems and methods
US8014138B2 (en) * 2007-07-05 2011-09-06 Daley Iii Charles A Bag computer manual character input device and cover
US8255708B1 (en) * 2007-08-10 2012-08-28 Marvell International Ltd. Apparatuses and methods for power saving in USB devices
DE102007038031A1 (de) 2007-08-10 2009-06-04 Henkel Ag & Co. Kgaa Mittel enthaltend Proteasen
US8387078B2 (en) * 2007-09-27 2013-02-26 Intel Corporation Determining the context of a computing device that is powered off
WO2009061381A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Danisco Us Inc., Genencor Division Alpha-amylase variants with altered properties
US20090140985A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Eric Liu Computing device that determines and uses applied pressure from user interaction with an input interface
US8344998B2 (en) * 2008-02-01 2013-01-01 Wimm Labs, Inc. Gesture-based power management of a wearable portable electronic device with display
US20090217464A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Philip Frank Souter Detergent composition comprising lipase
WO2009120526A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 The Procter & Gamble Company Delivery particle
RU2510662C2 (ru) 2008-03-26 2014-04-10 Новозимс А/С Стабилизированные жидкие ферментные композиции
KR101051311B1 (ko) * 2008-04-22 2011-07-22 한국과학기술원 직물형 입력장치
WO2009155926A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Hasselblad A/S Tilt and shift adaptor, camera and image correction method
US8842076B2 (en) * 2008-07-07 2014-09-23 Rockstar Consortium Us Lp Multi-touch touchscreen incorporating pen tracking
US9335868B2 (en) * 2008-07-31 2016-05-10 Apple Inc. Capacitive sensor behind black mask
US20100038821A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-18 Microsoft Corporation Tactile Enhancement For Input Devices
TWI367442B (en) * 2008-08-27 2012-07-01 Au Optronics Corp Touch panel
US20100051432A1 (en) * 2008-09-04 2010-03-04 Goda Technology Co., Ltd. Membrane type computer keyboard
US20100085321A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Mark Stephen Pundsack Small touch sensitive interface allowing selection of multiple functions
TWI364172B (ja) * 2008-10-29 2012-05-11
US20100123686A1 (en) * 2008-11-19 2010-05-20 Sony Ericsson Mobile Communications Ab Piezoresistive force sensor integrated in a display
TWI350963B (en) * 2008-11-28 2011-10-21 Asustek Comp Inc Electronic device with magnetic supporting structure
CN101754609B (zh) * 2008-12-08 2012-08-22 深圳富泰宏精密工业有限公司 便携式电子装置
US8502878B2 (en) * 2008-12-12 2013-08-06 Olympus Imaging Corp. Imaging apparatus having a changeable operating mode responsive to an inclined orientation
US9684375B2 (en) * 2008-12-12 2017-06-20 Immersion Corporation Systems and methods for stabilizing a haptic touch panel or touch surface
US8224405B2 (en) * 2008-12-18 2012-07-17 Motorola Mobility, Inc. Implementation of friction hinge with a range of motion and detent separation greater than 180 degrees
US8250001B2 (en) * 2008-12-18 2012-08-21 Motorola Mobility Llc Increasing user input accuracy on a multifunctional electronic device
CN101465107B (zh) * 2008-12-31 2010-12-08 华为终端有限公司 一种显示装置、使用该显示装置的终端及显示方法
US8441441B2 (en) * 2009-01-06 2013-05-14 Qualcomm Incorporated User interface for mobile devices
US20100188299A1 (en) * 2009-01-07 2010-07-29 Audiovox Corporation Laptop computer antenna device
US20100238620A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-23 Ram David Adva Fish Magnetic Notebooks and Tablets
CN101904661A (zh) * 2009-06-08 2010-12-08 鸿富锦精密工业(深圳)有限公司;鸿海精密工业股份有限公司 具有支架的设备
KR101626621B1 (ko) * 2009-12-30 2016-06-01 엘지전자 주식회사 원형 디스플레이부를 구비한 이동 통신 단말기의 데이터 제어 방법 및 이를 적용한 이동 통신 단말기
EP2357220A1 (en) * 2010-02-10 2011-08-17 The Procter and Gamble Company Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent
US9310838B2 (en) * 2010-03-19 2016-04-12 I/O Interconnect, Ltd. Power management method for switching power mode of a computer system based on detection of a human interface device
US20120032891A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Nima Parivar Device, Method, and Graphical User Interface with Enhanced Touch Targeting
US8390411B2 (en) * 2010-09-17 2013-03-05 Apple Inc. Tablet device
US8264310B2 (en) * 2010-09-17 2012-09-11 Apple Inc. Accessory device for peek mode
US8474832B2 (en) * 2010-12-27 2013-07-02 Randy Mersky Mobile device holder
US8973795B2 (en) * 2011-07-08 2015-03-10 Herbert Chiu, Jr. Multifunctional strap system for handheld portable electronic devices
US9470941B2 (en) * 2011-08-19 2016-10-18 Apple Inc. In-cell or on-cell touch sensor with color filter on array
US8700829B2 (en) * 2011-09-14 2014-04-15 Dell Products, Lp Systems and methods for implementing a multi-function mode for pressure sensitive sensors and keyboards
US9134807B2 (en) * 2012-03-02 2015-09-15 Microsoft Technology Licensing, Llc Pressure sensitive key normalization
US20130229366A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-05 Rajesh Manohar Dighde Support for an Optically Bonded Display Device
US9064654B2 (en) * 2012-03-02 2015-06-23 Microsoft Technology Licensing, Llc Method of manufacturing an input device

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015199964A (ja) * 2010-02-10 2015-11-12 ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物

Also Published As

Publication number Publication date
CN102753670A (zh) 2012-10-24
AR092774A1 (es) 2015-05-06
EP2534233B1 (en) 2019-04-17
CA2787825C (en) 2015-04-07
JP2015199964A (ja) 2015-11-12
EP2534233A2 (en) 2012-12-19
WO2011100410A3 (en) 2011-11-10
US9493730B2 (en) 2016-11-15
EP3428260A2 (en) 2019-01-16
DK2534233T3 (da) 2019-07-15
JP6234960B2 (ja) 2017-11-22
EP2357220A1 (en) 2011-08-17
CA2787825A1 (en) 2011-08-18
US20110212876A1 (en) 2011-09-01
JP2013519757A (ja) 2013-05-30
CN107267304A (zh) 2017-10-20
EP3428260A3 (en) 2019-04-24
MX2012009344A (es) 2012-09-07
WO2011100410A2 (en) 2011-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2598717C2 (ru) Потребительские товары с вариантами протеазы
CA2704745C (en) Alpha-amylase variants with altered properties
ES2707869T3 (es) Composiciones y métodos comprendiendo variantes de serina proteasa
AU2005259686B2 (en) Alpha-amylase variants with altered properties
EP0722490B2 (en) Amylase variants
CA2713582C (en) Ts23 alpha-amylase variants with altered properties
CN102884183B (zh) 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化
JP4550285B2 (ja) α−アミラーゼ変異体
JP4855632B2 (ja) 変更された性質を有するα−アミラーゼ突然変異体
JP4047379B2 (ja) 予め決められた性質を有するα−アミラーゼ変異体のデザイン方法
US7153818B2 (en) Amylolytic enzyme extracted from bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme
EP2771458B1 (en) Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
DK2970930T3 (da) Kombinatoriske alfa-amylasevarianter
CN101848985B (zh) 具有改变性质的杆菌物种TS-23的α-淀粉酶变体
US20140193888A1 (en) Fabric and home care products
US8470758B2 (en) Detergent compositions and methods of use for an alpha-amylase polypeptide of bacillus species 195
ES2322426T3 (es) Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos.
US9670471B2 (en) Alpha-amylase variant with altered properties
JP5738756B2 (ja) ファミリー44のキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物
CN1234854C (zh) 具有碱性α-淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的核酸
US20020155574A1 (en) Alpha-amylase mutants with altered properties
US20090275078A1 (en) Alpha-Amylase Variants
DK2414514T3 (en) FORMATIONS AND PROCEDURES COMPREHENSIVE Alpha- amylase variants WITH CHANGED PROPERTIES
EP2212410B1 (en) Variants of bacillus licheniformis alpha-amylase with increased thermostability and/or decreased calcium dependence
US8877479B2 (en) Halomonas strain WDG195-related alpha-amylases, and methods of use, thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20131010

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131122

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140224

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140303

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140324

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20141128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150302

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150330

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150428

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150518

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150908

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151007

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5823414

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250