BR112016022088B1

BR112016022088B1 - Composição de detergente líquido, uso de uma alfa-amilase em uma composição de detergente líquido e processo de lavagem de tecidos

Info

Publication number: BR112016022088B1
Application number: BR112016022088-9A
Authority: BR
Inventors: Vincent Charles Mole; Gleb Urevich Priimov; Dawn Rigby; Alastair Richard Sanderson
Original assignee: Unilever Ip Holdings B.V.
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2022-07-05
Also published as: BR112016022088A2; AR099849A1; EP3122861A1; PH12016501818A1; CN106488975A; EP3122861B1; WO2015144561A1; PH12016501818B1; CN106488975B; CL2016002351A1; TR201908657T4; ZA201606389B

Abstract

COMPOSIÇÃO DE DETERGENTE LÍQUIDO , USO DE UMA ALFA -A MILASE EM UMA COMPOSIÇÃO DE DETERGENTE LÍQUIDO E PROCESSO DE LAVAGEM DE TECIDOS. É provida uma composição de detergente líquido estável ao armazenamento compreendendo: a) pelo menos 5% em peso de água, b) pelo menos 3% em peso de um sistema tensoativo compreendendo de 10 a 100% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo aniônico, c) uma alfa-amilase tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e dita alfa-amilase compreendend o as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao utilizar a SEQ ID NO: 1 para numeração.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a composições de detergente líquido compreendendo um sistema tensoativo e uma alfa-amilase. Mais particularmente, se refere a composições de detergente líquido compreendendo pelo menos 3% em peso de um sistema tensoativo compreendendo 10 a 60% em peso de tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS) e uma alfa-amilase.

Antecedentes da Invenção

[0002] Composições aquosas de detergente líquido compreendendo tensoativos aniônicos, tais como sulfonato de alquilbenzeno (LAS) e uma alfa- amilase são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o documento US-A-4 537 706 (Severson) revela diversas composições de detergente líquido compreendendo pelo menos 5% em peso de um sistema tensoativo compreendendo tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS), lauriletoxissulfato de sódio (SLES), não iônico, ácido graxo e uma alfa-amilase.

[0003] As alfa-amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolases, E.C. 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e de outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados. Entre as primeiras alfa-amilases bacterianas a serem utilizadas está uma alfa-amilase de B. licheniformis, também conhecida como Termamyl™, que foi amplamente caracterizada e a estrutura cristalina foi determinada para esta enzima. Termamyl™ e muitas outras alfa-amilases altamente eficientes necessitam de cálcio para atividade. Para Termamyl™ descobriu-se que quatro átomos de cálcio são ligados na estrutura da alfa-amilase coordenada por resíduos de aminoácido carregados negativamente. Em outras alfa-amilases, a quantidade de íons cálcio ligados na estrutura pode ser diferente. Essa exigência de cálcio é uma desvantagem em aplicações em que fortes compostos quelantes estão presentes, por exemplo, em detergentes, ao passo que os quelantes geralmente não são adicionados em outras aplicações, tais como liquefação de amido e produção de biocombustível.

[0004] O principal problema encontrado com essa alfa-amilase contendo composições de detergente líquido é que a estabilidade do armazenamento das enzimas na composição de detergente geralmente deixa a desejar. É particularmente difícil estabilizar amilases na presença de proteases, que podem facilmente degradar amilases em composições de detergente líquidas aquosas ou em gel. Outro problema relacionado a estas composições de detergente contendo detergente líquido é que os tensoativos aniônicos, em particular sulfonato de alquilbenzeno (LAS), têm a tendência de inativar enzimas, por exemplo, a enzima alfa-amilase.

[0005] Por este motivo, o documento US-A-4 537 706 (Severson) emprega um sistema de estabilização de enzima compreendendo uma mistura de ácido bórico ou um borato de metal alcalino com íon cálcio, e preferivelmente um poliol. Esse sistema de estabilização de enzimas compreendendo uma mistura de ácido bórico ou um borato de metal alcalino com íon cálcio, e preferivelmente um poliol, tem a desvantagem de que estes componentes em si não contribuem para a atividade de limpeza. Além disso, a exigência do cálcio é uma desvantagem em aplicações em que fortes compostos quelantes estão presentes, por exemplo, em detergentes e composições de limpeza. A adição de cálcio a um detergente líquido também pode apresentar problemas com a formulação, ou seja, a estabilidade física do detergente. O boro é menos preferido por motivos ambientais.

[0006] Mais recentemente, foram desenvolvidas alfa-amilases que são mais estáveis na presença de agentes quelantes. Por exemplo, o documento WO-A- 2011/100410 (Procter & Gamble) revela composições de limpeza compreendendo variantes de uma alfa-amilase SP722 obtenível a partir de quaisquer das cepas de Bacillus NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 e DSM 9375. Algumas destas variantes de alfa-amilases apresentam boa estabilidade de armazenamento em pH 8,2 na presença de tensoativos aniônicos e agentes quelantes.

[0007] O documento WO-A-2011/082429 (Novozymes) revela um vasto número de outras variantes de alfa-amilase com reduzida sensibilidade ao cálcio compreendendo um domínio A de uma alfa-amilase sensível ao cálcio, um domínio B de uma alfa-amilase insensível ao cálcio e um domínio C de uma alfa-amilase sensível ao cálcio. Essas variantes são ditas como úteis para uma variedade de aplicações, a saber, no processamento de amido (por exemplo, liquefação); processos de trituração úmida; produção de álcool a partir de fontes de carboidratos; detergentes; composições para lavagem de louças; amido desizing na indústria têxtil; aplicações de fermentação; na indústria de bebidas; campos de petróleo em processos de perfuração; processos de reciclagem, por exemplo, remoção de tinta de papel, e ração animal.

[0008] Uma vez que as condições são relativamente diferentes nestas várias aplicações de alfa-amilases, diferentes alfa-amilases são desenvolvidas para cada aplicação em particular. Assim, as alfa-amilases de detergente são otimizadas pelo pH alcalino (acima de 8) e aplicações em temperatura relativamente baixa (15-60 °C), ao passo que as alfa-amilases para uso na produção de biocombustível ou liquefação de amido são otimizadas para pH ácido (abaixo de 6) e temperaturas acima de 80 °C. Assim, não seria esperado que as amilases destinadas ao uso na liquefação ou na produção de biocombustível fossem adequadas para uso em detergentes.

[0009] Ainda permanece a necessidade de prover outras composições ou composições de detergente líquido aprimoradas compreendendo tensoativos aniônicos que são estáveis em termos de armazenamento e que demonstram bom desempenho de limpeza, sem a necessidade de sistemas de estabilização de enzima, mesmo se as composições compreenderem agentes quelantes. Os agentes quelantes são incorporados em composições de detergente para reduzir a dureza da água durante a lavagem, protegem os agentes alvejantes que também podem estar presentes, e também podem ainda ter um efeito direto sobre a remoção de certas manchas.

[0010] Além disso, foi descoberto que as alfa-amilases algumas vezes causam problemas de mal odor em composições de detergente líquido que as contém.

[0011] Assim, é um objetivo da presente invenção prover composições de detergente líquido compreendendo alfa-amilases e tensoativos aniônicos, composições estas que têm estabilidade de armazenamento e/ou desempenho de lavagem após o armazenamento aprimorados em comparação com composições compreendendo alfa-amilases intimamente relacionadas.

[0012] É outro objetivo da presente invenção prover composições de detergente líquido compreendendo alfa-amilases que podem ser utilizadas em composições de lavagem de roupas compreendendo quelantes.

[0013] Por fim, outro objetivo da presente invenção é prover composições de detergente líquido compreendendo alfa-amilases que evitam os problemas de mal odor que são algumas vezes observados.

[0014] Surpreendentemente descobrimos agora que um ou mais destes objetivos podem ser alcançados pelas composições de detergente líquido de acordo com a invenção compreendendo a) pelo menos 5% em peso de água, b) pelo menos 3% em peso de um sistema tensoativo compreendendo de 10 a 100% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo aniônico, c) uma alfa- amilase tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e a dita alfa-amilase compreendendo as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao utilizar a SEQ ID NO: 1 para numeração. Também foi surpreendentemente descoberto que as composições de detergente líquido de acordo com a invenção podem superar certos problemas de mau odor.

Sumário da Invenção

[0015] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provida uma composição de detergente líquido compreendendo: a) pelo menos 5% em peso de água, b) pelo menos 3% em peso de um sistema misto tensoativo compreendendo de 10 a 100% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo aniônico, c) uma alfa-amilase tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e a dita alfa-amilase compreendendo as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao utilizar a SEQ ID NO: 1 para numeração.

[0016] Um segundo aspecto da presente invenção se refere ao uso de uma alfa-amilase para lavagem de roupas.

[0017] De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é provido um processo de lavagem de tecidos, compreendendo a lavagem de um tecido com a composição de detergente líquido acima, preferivelmente a uma temperatura de 40 °C ou menos.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

[0018] Alfa-amilase: (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolases, E.C. 3.2.1.1) constitui um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e de outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados. Conforme aqui utilizado, o termo “alfa-amilases” significa que a enzima possui atividade de alfa-amilase. Alfa-amilase da SEQ ID NO: 1

[0019] Esta amilase da SEQ ID NO: 1 é artificial e pode ser produzida por métodos conhecidos na técnica. Alfa-amilase da SEQ ID NO: 2

[0020] Esta é a amilase da SEQ ID NO: 1, porém tendo as substituições G46A+T47I+G105A+I199F.

[0021] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa quaisquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente por meio de mutação e pode resultar em polimorfismo entre populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0022] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura e entrelaçada obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não possui sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. A transcrição de RNA inicial primária é um precursor do mRNA que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo entrelaçamento, antes de aparecer como mRNA maduro entrelaçado.

[0023] Sequência de codificação: O termo “sequência de codificação” significa um polinucleotídeo que diretamente especifica a sequência de aminoácido de uma variante. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por uma estrutura de leitura aberta, que começa com um códon inicial, por exemplo, ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de parada, por exemplo, TAA, TAG, ou TGA. A sequência de codificação pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma combinação destes.

[0024] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (ou seja, do mesmo gene) ou externa (ou seja, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica a variante ou a nativa ou a externa entre si. Essas sequências de controle incluem, entre outras, uma sequência de poliadenilação líder, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada de transcrição e translação. As sequências de controle podem ser providas com ligantes com a finalidade de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica uma variante.

[0025] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, entre outras, transcrição, modificação pós- transcrição, translação, modificação pós-translação, e secreção.

[0026] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante e que está operacionalmente ligado a sequências de controle que proveem sua expressão.

[0027] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer descendência de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0028] Propriedade aprimorada: O termo “propriedade aprimorada” significa uma característica associada a uma variante ou uma alfa-amilase que é aprimorada em comparação ao precursor ou à amilase da técnica anterior mais próxima. Essas propriedades aprimoradas incluem, entre outras, eficiência catalítica, velocidade catalítica, estabilidade química, atividade de pH, estabilidade de pH, atividade específica, estabilidade sob condições de armazenamento, desempenho de lavagem e desempenho de lavagem após o armazenamento, em que o período de armazenamento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais semanas a 30, 37, 40 ou 45 °C.

[0029] Isolada: O termo “isolada” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitativos de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, entre outras, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou de todos os constituintes de ocorrência natural com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais ela está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado com o gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0030] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo que codifica uma variante.

[0031] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita única quanto de dupla fita, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outra forma na natureza ou que fosse sintética, o que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0032] Precursora ou alfa-amilase precursora: O termo “precursora” ou “alfa-amilase precursora” significa uma alfa-amilase na qual uma alteração é realizada para produzir variantes de enzima. A alfa-amilase da SEQ ID NO: 1 pode ser referida como a precursora, ao passo que, por exemplo, a alfa- amilase da SEQ ID NO: 1 contendo uma ou mais das substituições G46A, T47I, G105A e I199F pode ser referida como uma variante da alfa-amilase da SEQ ID NO: 1. A precursora também pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural (do tipo selvagem) ou uma variante ou fragmento desta ou outra alfa-amilase tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a alfa-amilase da SEQ ID NO: 1, por exemplo, pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a alfa-amilase da SEQ ID NO: 1.

[0033] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro de “identidade de sequência”. Para as finalidades da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa de Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros utilizados são gap open penalty de 10, gap extension penalty de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS do BLOSUM62). O resultado do Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido utilizando-se a opção - nobrief) é utilizado como a identidade percentual e é calculada como segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Gaps no Alinhamento)

[0034] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase compreendendo uma alteração, por exemplo, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a inclusão de um aminoácido adjacente e imediatamente seguinte ao aminoácido que ocupa uma posição. As variantes de alfa-amilase da presente invenção têm preferivelmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade inicial de alfa- amilase de após duas semanas de armazenamento em detergente líquido modelo B a 37 °C.

[0035] Alfa-amilase do tipo selvagem: O termo alfa-amilase “do tipo selvagem” significa uma alfa-amilase expressa por um micro-organismo de ocorrência natural, por exemplo, uma bactéria, levedura, ou fungos filamentosos encontrados na natureza.

[0036] Desempenho de lavagem: O termo “desempenho de lavagem” é utilizado como a capacidade de uma enzima de remover manchas presente no objeto a ser limpo durante, por exemplo, a lavagem ou a limpeza de superfície dura. O desempenho de lavagem pode ser quantificado calculando-se o assim chamado valor de remissão delta (ΔRem) conforme aqui descrito na definição.

[0037] Valor de remissão delta (ΔRem): Os termos “Remissão delta” ou “Valor de remissão delta” são aqui definidos como o resultado de uma medição de reflectância ou remissão a 460 nm de um material de teste, uma tira de CS- 28 (Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos). A tira é medida com pelo menos outra tira, lavada sob condições idênticas, como base. A remissão delta é o valor de remissão do material em teste lavado com amilase subtraído do valor de remissão do material em teste lavado sem amilase.

[0038] Desempenho de lavagem aprimorado: O termo “desempenho de lavagem aprimorado” é aqui definido como uma enzima (variante) (também uma mistura de enzimas, não necessariamente somente variantes, mas também backbones, e em combinação com certas composições de limpeza etc.) que exibe uma alteração no desempenho de lavagem, por exemplo, maior remoção de manchas.

Composição de detergente

[0039] As composições de detergente da presente invenção são líquidas em temperatura ambiente (por exemplo, 25 °C). Estas podem ser isotrópicas ou estruturadas e sua viscosidade pode variar de relativamente baixa a muito alta, de modo que podem se parecer com géis. Compreendem pelo menos 5% em peso de água e são preferivelmente aquosas, em que a água forma a maior parte do solvente na composição. Hidrótropos, tais como propilenoglicol e glicerol/glicerina, podem ser incluídos como co-solventes em uma quantidade menor do que a água. A água é necessária na composição para manter o tensoativo, quaisquer polímeros, agentes anti-calcário solúveis, enzimas etc. em solução. A quantidade de água informada inclui tanto água livre quanto qualquer água ligada. A quantidade de água na composição é preferivelmente de pelo menos 20% em peso, mais preferivelmente de pelo menos 30% em peso. O sistema tensoativo

[0040] O detergente líquido, de acordo com a invenção, compreende pelo menos 3% em peso de um sistema tensoativo compreendendo de 10 a 100% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo aniônico. Preferivelmente, o detergente líquido compreende pelo menos 3% em peso a cerca de 40% em peso do sistema tensoativo, por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 5% a cerca de 15%, ou de cerca de 20% a cerca de 25% do sistema tensoativo. O sistema tensoativo pode completamente consistir em um ou mais tensoativos aniônicos, porém também pode compreender outros tensoativos, tais como tensoativos não iônicos e/ou catiônicos. O(s) tensoativo(s) é(são) escolhido(s) em base no tipo de aplicação e inclui(em) qualquer ou quaisquer tensoativo(s) convencional(ais) conhecido(s) na técnica. Os tensoativos que formam o sistema tensoativo podem ser escolhidos entre os tensoativos descritos em 'Surface Active Agents' Vol. 1, by Schwartz and Perry, Interscience 1949, Vol. 2 by Schwartz, Perry and Berch, Interscience 1958, 'McCutcheon's Emulsifiers and Detergents' published by Manufacturing Confectioners Company or in Tenside Taschenbuch', H. Stache, 2nd Edn., Carl Hauser Verlag, 1981.

[0041] Exemplos não limitativos de tensoativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa-olefinossulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alceno, alcano-2,3-di-ilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS), tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), eterssulfatos alcoólicos (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos alcoólicos ou sulfatos de éter de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), sulfonatos de éster, ésteres de glicerol de ácido graxo sulfonado, ésteres metílicos de ácido graxo alfa-sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo sulfonato de éster metílico (MES), ácido alquil- ou alquenilssuccínico, ácido dodecenil/tetradecenilssuccínico (DTSA), ácidos graxos derivados de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão, e combinações destes. Um eterssulfato alcoólico preferido é lauriléter sulfato de sódio ou SLES.

[0042] Um sistema tensoativo altamente preferido compreende dois diferentes tensoativos aniônicos, preferivelmente sulfonato de alquilbenzeno linear e um sulfato, por exemplo, LAS e SLES.

[0043] O tensoativo aniônico também pode incluir sabão (sal de ácido graxo). Um sabão preferido é produzido por neutralização de ácido graxo de coco hidrogenado, por exemplo, Prifac(R) 5908 (ex Croda). Misturas de ácidos graxos saturados e insaturados também podem ser utilizados.

[0044] Preferivelmente, o sistema tensoativo compreende de 10 a 100% em peso, mais preferivelmente de 25 a 50% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS). Ainda mais preferivelmente, o sistema tensoativo compreende de 5 a 75% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS) e de 5 a 90% em peso do sistema tensoativo de lauriléter sulfato de sódio (SLES).

[0045] Além do tensoativo aniônico, as composições de detergente geralmente conterão de cerca de 0,2% a cerca de 50% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo não iônico, por exemplo, de cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular de cerca de 1% a cerca de 20%, de cerca de 3% a cerca de 10%, por exemplo, de cerca de 3% a cerca de 5%, ou de cerca de 8% a cerca de 12% do sistema tensoativo. Os tensoativos não iônicos adequados incluem etoxilados alcoólicos (AE ou AEO), propoxilados alcoólicos, alcoóis graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilado, tais como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilado e/ou propoxilado, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxilado (EFAM), monoetanolamidas de ácido graxo propoxiladas (PFAM), amidas de ácido graxo de poli-hidroxialquila, ou derivados de N-acila N-alquila de glucosamina (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob as denominações comerciais SPAN e TWEEN, e combinações destes. Um tensoativo não iônico preferido é um álcool etoxilado C12-C18, compreendendo de 3 a 9 unidades de óxido de etileno por molécula. São mais preferidos os alcoóis etoxilados lineares primários C12-C15 com, em média, 5 a 9 grupos de óxido de etileno, mais preferivelmente, em média, 7 grupos de óxido de etileno.

[0046] Um detergente líquido especialmente preferido, de acordo com a invenção, compreende de 5 a 75% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS), de 5 a 90% em peso do sistema tensoativo de lauriléter sulfato de sódio (SLES) e de 5 a 60% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo não iônico.

[0047] O(s) tensoativo(s) está(estão) tipicamente presente(s) em um nível de cerca de 0,1% a 60% em peso, por exemplo, de cerca de 1% a cerca de 40%, ou de cerca de 3% a cerca de 20%, ou de cerca de 3% a cerca de 10%. O(s) tensoativo(s) é(são) escolhido(s) com base na aplicação de limpeza desejada e inclui qualquer(quaisquer) tensoativo(s) convencional(ais) conhecido(s) na técnica. Qualquer tensoativo conhecido na técnica para uso em detergentes pode ser utilizado.

[0048] Se desejado, as composições de detergente líquido de acordo com a invenção também podem conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo catiônico. Exemplos não limitativos de tensoativos catiônicos incluem quat de alquildimetiletanolamina (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetil- amônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário, de alquila compostos amônio quaternário alcoxilado (AQA) e combinações destes.

[0049] A composição de detergente líquido, de acordo com a invenção, também pode conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo semipolar. Exemplos não limitativos de tensoativos semipolares incluem óxidos de amina (AO), por exemplo, óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(cocoalquil)-N,N-dimetilamina e óxido de N-(sebo-alquil)-N,N-bis(2- hidroxietil)amina, alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas, e combinações destes.

[0050] Por fim, a composição de detergente líquido, de acordo com a invenção, pode conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo zwiteriônico. Exemplos não limitativos de tensoativos zwiteriônicos incluem betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína, e combinações destas. A alfa-amilase Convenções para Designação de Variantes e Número de Posição de Aminoácido

[0051] Para os fins da presente invenção, o polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 é utilizado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase. A sequência de aminoácido de outra alfa-amilase está alinhada com o polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número da posição do aminoácido correspondente a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 é determinado utilizando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa de Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276277), preferivelmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros utilizados são: penalidade por abertura de intervalo de 10, penalidade por extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeo utilizando vários programas de computador incluindo, entre outros, MUSCLE (comparação de sequência múltipla por expectativa de log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando seus respectivos parâmetros padrão.

[0052] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro do SEQ ID NO: 1 de modo que a comparação tradicional com base na sequência falha em detectar sua relação (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequência emparelhados podem ser usados. Maior sensibilidade na busca com base na sequência pode ser alcançada usando programas de busca que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeo (perfis) para buscar as bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de busca de base de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Mesmo maior sensibilidade pode ser alcançada se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados estruturais da proteína. Os programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informações de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, predição estrutural secundária, perfis de alinhamento estrutural e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prediz a dobra estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados de SCOP. Esses alinhamentos podem, por sua vez, ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e esses modelos podem ser avaliados para precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para aquela finalidade.

[0053] Para proteínas de estrutura conhecida, diversas ferramentas e recursos estão disponíveis para recuperação e geração de alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias SCOP de proteínas foram estruturalmente alinhadas, e aqueles alinhamentos são acessíveis e transferíveis. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e implementação desses algoritmos podem ser adicionalmente utilizados para consultar as bases de dados da estrutura com uma estrutura de interesse a fim de descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567). Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. A abreviação de aminoácido de uma ou três letras IUPAC aceita é empregada.

[0054] Substituições. Para uma substituição de aminoácido, a seguinte nomenclatura usada: aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Consequentemente, a substituição de treonin na posição 226 com alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Múltiplas mutações são separadas pelas marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) com arginina (R) e serina (S) com fenilalanina (F), respectivamente.

[0055] Deleções. Para uma deleção de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, *. Consequentemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Múltiplas deleções são separadas pelas marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0056] Inserções. Para uma inserção de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Consequentemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido no 1, aminoácido inserido no 2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[0057] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido é/são numerado(s) pela adição de letras minúsculas no número de posição do resíduo de aminoácido que precede o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido. No exemplo acima, a sequência então seria: Tabela 1

[0058] Múltiplas alterações. Variantes que compreendem múltiplas alterações são separadas pelas marcas de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 com tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0059] Diferentes alterações. Onde diferentes alterações podem ser introduzidas em uma posição, as diferentes alterações são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 com tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly”, e “Tyr167Ala+Arg170Ala”.

[0060] A invenção refere-se a uma composição de detergente líquido que compreende uma alfa-amilase tendo pelo menos uma alfa-amilase tendo pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1 e a dita alfa- amilase compreendendo as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao usar SEQ ID NO: 1 para numeração.

[0061] A alfa-amilase também pode compreender alterações adicionais. Por exemplo, a amilase pode compreender, ainda, de 1 a 20 alterações, por exemplo, 1 a 10 ou 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações adicionais, onde as alterações são independentemente substituições, deleções e/ou inserções e as alterações são relativas à sequência de aminoácido do SEQ ID NO: 1.

[0062] As mudanças ou alterações do aminoácido podem ser de uma natureza menor, isto é, substituições ou inserções de aminoácido conservador que não afetam significativamente a dobra e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; pequenas extensões de amino-terminal ou carbóxi, tais como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação ao alterar a carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação. Exemplos de substituições conservadoras estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tritofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram geralmente a atividade específica, são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em “The Proteins”, Academic Press, New York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0063] Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ideal e similar.

[0064] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina única são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de alfa-amilase para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Veja também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado pela análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração eletrônica ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Veja, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser deduzida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0065] Em outras realizações, a amilase da composição de detergente líquido da invenção tem pelo menos 86%, ou pelo menos 87%, ou pelo menos 88%, ou pelo menos 89%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% mas menos de 100% de identidade de sequência para a amilase do SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições G46A+T47I+G105A+I199F.

[0066] Desse modo, são fornecidas as composições de detergente líquido que têm estabilidade e/ou atividade melhorada após armazenamento e/ou desempenho de lavagem melhorado no amido contendo manchas. O período de armazenamento pode ser de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou pelo menos 26 semanas ou mesmo períodos de tempo mais longos. A temperatura durante o armazenamento pode ser qualquer temperatura relevante, tal como entre 20 e 40 °C, tal como 20, 22, 25, 30, 35, 37 ou 40 °C. Os presentes inventores descobriram que, por exemplo, após 1 semana a 40 °C ou após 2 semanas de armazenamento a 37 °C, o detergente líquido da presente invenção melhorou o desempenho da lavagem comparado a uma detergente líquido idêntico que compreender a alfa-amilase do SEQ ID NO: 1, particularmente no amido contendo manchas (veja os exemplos abaixo). Uma razão para essa melhora no desempenho da lavagem pode ser que as amilases que têm as substituições mencionadas acima no SEQ ID NO: 1 melhoram a estabilidade nos detergentes líquidos comparado às amilase do SEQ ID NO: 1. Assim, em uma realização, a invenção refere-se a uma composição de detergente líquido que compreende uma alfa-amilase conforme definido acima, cuja alfa-amilase tem uma estabilidade de armazenamento melhorada nos detergentes líquidos em relação à alfa-amilase do SEQ ID NO: 1.

[0067] A estabilidade de armazenamento melhorada pode ser determinada como atividade residual após um período de armazenamento de 1 a 8 semanas, tal como de 2 a 6 semanas, de preferência 2, 3, 4, 5 ou 6 semanas (vide Exemplos). Em outra realização, a invenção refere-se a uma composição de detergente líquido que compreende uma amilase conforme descrito acima, em que a composição de detergente líquido melhorou o desempenho de lavagem após armazenamento dos detergentes líquidos por duas semanas a 37 °C, em relação à composição de detergente líquido que compreende a alfa- amilase do SEQ ID NO: 1.

[0068] Nas realizações adicionais da invenção, a composição de detergente líquido compreende, ainda, um ou mais agentes quelantes. Conforme mencionado acima, os agentes quelantes podem ser adicionados às composições de detergente. Esses agentes agem para reduzir a concentração de íons de cálcio livre na composição. Entretanto, a maioria das alfa-amilases exige cálcio para a atividade. Os presentes inventores descobriram que a alfa- amilase conforme definido no primeiro objeto, é surpreendentemente estável nos detergentes líquidos que compreendem agentes quelantes e que é estável mesmo em detergentes líquidos que compreendem concentração alta ou muito alta dos agentes quelantes. As capacidades dos agentes quelantes em reduzir a concentração de íon de cálcio livre podem ser caracterizadas de acordo com o Exemplo 5 (vide também Tabela 16.1).

[0069] Em uma realização, o detergente líquido, de acordo com a invenção, compreende um agente quelante em uma concentração de pelo menos 0,25% em p/p, tal como pelo menos 0,3%, ou pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, ou 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0% em p/p ou mesmo pelo menos 1,5% em p/p. É preferido que o agente quelante tenha uma capacidade de reduzir a concentração de íons de cálcio livre igual a ou melhor que a capacidade de reduzir a concentração de íon de cálcio livre do agente quelante HEDP a 0,25% em p/p. Essa capacidade de reduzir o cálcio livre pode ser medida no detergente líquido do detergente modelo 2 a 21 °C ou a 37 °C. Assim, os agentes quelantes devem ser adicionados de modo que a capacidade de redução da concentração de íons de cálcio livre seja pelo menos igual à dita capacidade de HEDP a 0,25% em p/p. Isto é, se usar um agente quelante com uma capacidade de redução da concentração de íons de cálcio livre cuja capacidade é menor que a dita capacidade de HEDP em concentrações iguais em detergentes líquidos ou no tampão, conforme descrito abaixo, então o agente quelante deve ser adicionado em concentrações mais altas para alcançar uma capacidade de redução da concentração de íons de cálcio livre que é pelo menos igual à dita capacidade de HEDP a 0,25% em p/p. Os fatores que afetam a capacidade de redução da concentração de íons de cálcio livre são conhecidos dos técnicos no assunto. Eles incluem a afinidade de ligação para cálcio e a concentração do agente quelante. Em outra realização, o agente quelante é adicionado em uma quantidade que corresponde à adição de pelo menos 0,3%, ou pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, ou 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0% em p/p de HEDP ou mesmo pelo menos 1,5%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, ou pelo menos 2,0% em p/p de HEDP para o detergente líquido. Assim, os agentes quelantes devem ser adicionados em uma concentração de modo que a capacidade de redução da concentração de íons de cálcio livre no detergente líquido é pelo menos igual à dita capacidade de HEDP em uma concentração de pelo menos 0,3%, ou pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, ou 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0% em p/p de HEDP ou mesmo pelo menos 1,5%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, ou pelo menos 2,0% p/p.

[0070] Em outra realização, as capacidades de redução da concentração de íons de cálcio livre são comparadas pela medição da dita capacidade em cloreto de potássio a 80 mM e EPPS a 49 mM a 21 °C e pH 8,0. A capacidade de um agente quelante em reduzir a concentração de íons de cálcio livre é descrita, ainda, abaixo sob “agentes quelantes caracterizantes”. Em uma realização, o quelante é HEDP. Em outras realizações, o detergente líquido da invenção compreende pelo menos 0,25% em p/p de HEDP, tal como pelo menos 0,3%, ou pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, ou 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0% em p/p ou mesmo pelo menos 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, ou pelo menos 2,0% em p/p.

[0071] Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,25% em p/p de HEDP.

[0072] Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes nas concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,3% em p/p de HEDP. Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,4% em p/p de HEDP. Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,5% em p/p de HEDP. Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,6% em p/p de HEDP.

[0073] Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 0,7% em p/p de HEDP. Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 1,0% em p/p HEDP.

[0074] Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 1,5% em p/p de HEDP. Em outra realização, o detergente líquido da invenção compreende um ou mais agentes quelantes em concentrações de modo que a capacidade quelante no dito detergente pelo menos corresponda às capacidades quelantes obtidas ao adicionar 2,0% em p/p de HEDP.

[0075] Em outra realização, o agente quelante é DTMPA em uma concentração de pelo menos 0,25% em p/p ou pelo menos 0,3%, ou pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, ou 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0% em p/p de HEDP ou até pelo menos 1,5%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, ou pelo menos 2,0% em p/p. Nos exemplos, pode ser visto que a amilase do detergente líquido da presente invenção (tal como a amilase do SEQ ID NO: 1 que tem mutações G46A+T47I+G105A+I199F) melhorou a estabilidade e melhorou o desempenho de lavagem em detergentes líquidos que compreendem uma alta concentração de agentes quelantes (detergente modelo 2) comparado aos detergentes líquidos que compreendem a amilase do SEQ ID NO: 1. Em períodos de armazenamento mais longos e temperaturas mais elevadas, a diferença será mais acentuada. Assim, a composição de detergente líquido da presente invenção tem a vantagem que até em capacidades quelantes altas (para reduzir a concentração de íons de cálcio livre) a amilase é estável e tem bom desempenho de lavagem e melhor desempenho do que Termamyl™ ou a amilase do SEQ ID NO: 1.

[0076] A composição de detergente líquido da invenção é uma composição de detergente de lavagem de roupa. O pH da composição de detergente líquido da invenção pode ser pelo menos 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0. A composição de detergente líquido pode compreender, ainda, um ou mais adjuvantes de limpeza, conforme descrito abaixo, de preferência em uma quantidade de 0,01 a 99,9% em peso. Em outras realizações, a composição de detergente líquido da invenção compreende, adicionalmente, uma ou mais outras enzimas tal como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica, glucoamilase, amilase maltogênica, CGTase, mananase, cutinase, lacase e/ou uma celulase.

[0077] A alfa-amilase pode ser adicionada à composição de detergente líquido em uma quantidade que corresponde de 0,001 a 200 mg de proteína, tal como de 0,005 a 100 mg de proteína, de preferência de 0,01 a 50 mg de proteína, tal como 0,028 mg de proteína ou, com mais preferência, de 0,05 a 20 mg de proteína, ainda com mais preferência, de 0,1 a 10 mg de proteína por litro de licor de lavagem.

[0078] Embora isso não seja estritamente necessário, a alfa-amilase da composição de detergente da invenção pode ser estabilizada usando agentes estabilizadores convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, tal como ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada conforme descrito em, por exemplo, WO92/19709 e WO92/19708.

Outros componentes. Hidrótropos

[0079] Um hidrótropo é um composto que solubilize os compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou opostamente, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótropos têm tanto características hidrofílicas quanto hidrofóbicas (as chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensoativos); entretanto, a estrutura molecular dos hidrótropos geralmente não favorecem autoagregação espontânea, veja, por exemplo, revisão por Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótropos não exibem uma concentração crítica acima onde ocorre a autoagregação, conforme encontrado para tensoativos e lipídios que formam as fases micelar, lamelar ou outra bem-definida meso. Em vez disso, muitos hidrótropos mostram um processo de agregação do tipo contínuo onde os tamanhos dos agregados crescem conforme a concentração aumenta. Entretanto, muitos hidrótropos alteram o comportamento de fase, estabilidade e propriedades colodais dos sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensoativos e polímeros. Os hidrótropos são usados de maneira clássica através de indústrias de farmácia, cuidado pessoal alimentos a aplicações técnicas. O uso dos hidrótropos nas composições de limpeza ou detergente permite, por exemplo, formulações mais concentradas de tensoativos (como no processo de compactação de detergentes líquidos pela remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fase ou alta viscosidade.

[0080] O detergente pode conter de 0 a 25% em peso, tal como cerca de 0,5 a cerca de 10%, ou cerca de 2% a cerca de 5%, de um hidrótropo. Qualquer hidrótropo conhecido na técnica para uso em detergentes pode ser utilizado. Exemplos não limitantes de hidrótropos incluem benzeno sulfonato de sódio, p- tolueno sulfonato de sódio (STS), xileno sulfonato de sódio (SXS), cumeno sulfonato de sódio (SCS), cimeno sulfonato de sódio, óxidos de amina, alcoóis e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftaleno sulfonato de sódio, etil-hexil sulfato de sódio, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina e combinações destes.

Agentes anti-calcário e Coagentes anti-calcário

[0081] A composição de detergente pode conter cerca de 0 a 65% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 45% de um agente anti-calcário ou co-agente anti-calcário de detergente, ou uma mistura deste. O agente anti-calcário e/ou co-agente anti-calcário pode ser, particularmente, um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg.

[0082] Agentes quelantes ou quelantes são químicos que formam moléculas com certos íons de metal, inativando os íons de modo que eles não possam reagir com outros elementos, assim um agente de ligação que suprime a atividade química pela formação de quelantes. A quelação é a formação ou presença de duas ou mais ligações separadas entre um ligante e um único átomo central. O ligante pode ser qualquer composto orgânico, um silicato ou um fosfato. No presente contexto, o termo “agentes quelantes” compreende quelantes, agente quelante, agentes quelantes, agentes complexantes, ou agentes sequestrantes que formam complexos solúveis em água com íons de metal tais como cálcio e magnésio. O efeito quelato descreve a melhora da afinidade dos ligantes quelantes para um íon de metal comparado à afinidade de uma coleção de ligantes não quelantes similares para o mesmo metal. Os agentes quelantes que têm capacidade de ligação com íons de metal, em particular íons de cálcio (Ca2+), e foram usados amplamente nos detergentes e composições em geral para lavagem, tal como lavagem de roupa ou louça. Os agentes quelantes se mostraram, porém, inibir a atividade enzimática. O termo agente quelante é usado no presente pedido indistintamente com “agente complexante” ou “agente quelante” ou “quelante”.

[0083] Uma vez que a maioria das alfa-amilases são sensíveis ao cálcio, a presença de agentes quelantes pode prejudicar a atividade enzimática. A sensibilidade de alfa-amilases ao cálcio pode ser determinada pela incubação de uma determinada alfa-amilase na presença de um forte agente quelante e analisar o impacto dessa incubação na atividade da alfa-amilase em questão. Uma alfa-amilase sensível ao cálcio perderá uma maior parte de sua atividade durante a incubação.

[0084] Agentes quelantes caracterizantes: Conforme mencionado, o efeito quelato ou o efeito quelante descreve a melhora de afinidade dos ligantes quelantes para um íon de metal comparado à afinidade de uma coleção de ligantes não quelantes similares para o mesmo metal. Entretanto, a resistência desse efeito quelato pode ser determinada por vários tipos de ensaios ou métodos de medição, dessa maneira, diferenciando ou classificando os agentes quelantes de acordo com seu efeito quelante (ou resistência). Em um ensaio, os agentes quelantes podem ser caracterizados por sua habilidade em reduzir a concentração de íons de cálcio livre (Ca2+) de 2,0 mM para 0,10 mM ou menos em pH 8,0, por exemplo, pelo uso de um teste com base no método descrito por M.K. Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (Setembro 1984), pp. 1475-1478. Um exemplo de caracterização dos agentes quelantes que usam o método com base em Nagarajan et al. é descrito no exemplo 3a. Preferencialmente, o agente quelante de acordo com a invenção engloba agentes quelantes capazes de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,1 mM em uma concentração que seja igual ou inferior à concentração de HEDP necessária para reduzir a concentração de íon de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM nas mesmas condições. Assim, o agente quelante da presente invenção pode ter capacidade igual, ou melhor, de redução de “cálcio livre” como HEDP em condições similares ou idênticas.

[0085] Preferencialmente, o agente quelante de acordo com a invenção engloba agentes quelantes capazes de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,1 mM em uma concentração abaixo de 10 mM, preferencialmente abaixo de 9,5 mM, preferencialmente abaixo de 9 mM, preferencialmente abaixo de 8,5 mM, preferencialmente abaixo de 8 mM, preferencialmente abaixo de 7,5 mM, preferencialmente abaixo de 7 mM, preferencialmente abaixo de 6,5 mM, preferencialmente abaixo de 6 mM, preferencialmente abaixo de 5,5 mM, preferencialmente, preferencialmente abaixo de 5 mM, preferencialmente abaixo de 4,5 mM, abaixo de 4 mM, preferencialmente abaixo de 3,5 mM, preferencialmente abaixo de 3 mM, preferencialmente abaixo de 2,5 mM, preferencialmente abaixo de 2 mM, preferencialmente abaixo de 1,5 mM ou preferencialmente abaixo de 1 mM, quando medida em cloreto de potássio a 80 mM e EPPS a 49 mM ((ácido 4-(2- hidroxietil)piperazina-1-propanossulfônico)), em pH 8 e 21 °C. Em uma realização preferida particular, o agente quelante é capaz de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,1 mM quando medida em cloreto de potássio a 80 mM e EPPS a 49 mM, em pH 8 e 21 °C e usando um eletrodo seletivo de íon de cálcio para a determinação da concentração de cálcio livre, conforme descrito sob “Materiais e Métodos”. Assim, preferencialmente, os agentes quelantes englobam agentes quelantes que são capazes de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em uma concentração abaixo de 10 mM, preferencialmente abaixo de 9,5 mM, preferencialmente, preferencialmente abaixo de 5,0 mM, preferencialmente abaixo de 4,5 mM, abaixo de 4,0 mM, preferencialmente abaixo de 3,5 mM, preferencialmente abaixo de 3,0 mM, preferencialmente abaixo de 2,5 mM, preferencialmente abaixo de 2,0 mM, preferencialmente abaixo de 1,5 mM ou preferencialmente abaixo de 1,0 mM quando testada em pH 8,0 e 21 °C, conforme descrito sob “Materiais e Métodos”.

[0086] Em uma realização particularmente preferida, o agente quelante é capaz de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM quando medida em cloreto de potássio a 80 mM e EPPS a 49 mM em pH 8 e 21 °C em uma concentração de 9 mM para 0,5 mM, preferencialmente de 9 mM para 1 mM, preferencialmente de 8 mM para 1 mM, preferencialmente de 7 mM para 1 mM, preferencialmente de 6 mM para 1 mM, preferencialmente de 5 mM para 1 mM, preferencialmente de 4 mM para 1 mM, preferencialmente de 3 mM para 1 mM, preferencialmente de 2 mM para 1 mM, preferencialmente de 9,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 8,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 7,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 6,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 5,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 4,0 mM para 1,5 mM, preferencialmente de 3,0 para 1,5 mM, preferencialmente de 2,5 mM para 1,0 mM, preferencialmente de 2,0 mM para 1,1 mM, preferencialmente de 1,85 mM para 1,0 mM.

[0087] A redução na concentração de íon de cálcio livre de 2,0 mM Ca2+ para 0,10 mM, corresponde à redução da dureza da água de 200 ppm (como CaCO3, na forma de Ca(HCO3)2 na presença de CO2 ácido) para 10 ppm. O nível mínimo do agente anti-calcário é calculado a partir do sal de sódio do quelante e em uma base quelante seca de 100%.

[0088] O efeito quelante do agente quelante também pode ser medido em relação ao citrato. A concentração do citrato capaz de reduzir a quantidade de concentração de íon de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM é atribuída o valor de 1 e os resultados dos agentes quelantes são comparados a esse valor. O agente quelante preferido de acordo com a invenção é capaz de reduzir a concentração de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em uma concentração abaixo de 0,9, tal como abaixo de 0,8, tal como abaixo de 0,7, tal como abaixo de 0,6, tal como abaixo de 0,5, tal como abaixo de 0,4, tal como abaixo de 0,3, tal como abaixo de 0.2, tal como abaixo de 0,1 vez menor comparado à concentração de citrato, quando medida em pH 8,0 e 21 °C. O agente quelante preferido de acordo com a invenção é capaz de reduzir a concentração de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em uma concentração abaixo de 0,9, tal como abaixo de 0,8, tal como abaixo de 0,7, tal como abaixo de 0,6, tal como abaixo de 0,5, tal como abaixo de 0,4, tal como abaixo de 0,3, tal como abaixo de 0.2, tal como abaixo de 0,1 vez menor comparado à concentração de citrato, quando medida em pH 8,0 a 21 °C usando um eletrodo seletivo de íon de cálcio para a determinação da concentração de cálcio livre quando medida em cloreto e potássio a 80 mM e EPPS a 49 mM a 21 °C e pH 8,0.

[0089] Em uma realização particularmente preferida, o agente quelante é capaz de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em uma concentração de agente quelante abaixo de 1,0 para 0,1, tal como abaixo de 0,9 para 0,1, tal como abaixo de 0,8 para 0,1, tal como abaixo de 0,7 para 0,1, tal como abaixo de 0,6 para 0,1, tal como abaixo de 0,5 para 0,1, tal como abaixo de 0,4 para 0,1, tal como abaixo de 0,35 para 0,1, tal como abaixo de 0,3 para 0,1 vez menor comparado à concentração de citrato capaz de reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM, quando medida em pH 8,0 e 21 °C. Assim, o agente quelante de acordo com a invenção pode ser capaz de reduzir a concentração de íon de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em uma concentração inferior à concentração de HEDP necessária para reduzir a concentração de íon de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM nas mesmas condições.

[0090] Alternativamente, a resistência do complexo formado entre o agente quelante e íons de metal tais como cálcio e/ou magnésio, é expressa conforme o valor de log K (equilíbrio ou ligação ou dissociação ou constante de estabilidade). Essa constante pode ser medida em um determinado pH, em uma determinada temperatura e em uma determinada resistência iônica. Conforme mencionado acima, a resistência do complexo formada entre o agente quelante e os íons de metal, por exemplo, cálcio e/ou magnésio pode ser expressa conforme o valor de log K (equilíbrio ou ligação ou dissociação ou constante de estabilidade), a constante pode ser medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) conforme descrito em A. Nielsen et al., Anal. Biochem. Vol. 314, (2003), pp 227-234 e a partir do valor de K, o log K pode ser calculado como o logaritmo do valor de K (base 10). O valor de log K medido por esse método dependerá da temperatura, pH, resistência iônica, por isso é importante ao comparar os valores de log K, que eles são determinado em condições similares, preferencialmente as mesmas. Além disso, pela introdução de um padrão como referência, tal como citrato, impactos de variações nos experimentos podem ser reduzidos. Preferencialmente, o log K é determinado conforme descrito sob “Materiais e Métodos” do presente pedido, assim, em uma realização da invenção, o agente quelante na composição de acordo com a invenção tem um log K de pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 11, quando o log K é medido em pH 10 e 19 °C conforme descrito sob “Materiais e Métodos”. O valor de log K do agente quelante nas composições de acordo com a invenção também pode estar na faixa de 3 a 11, tal como de 3 a 10, tal como de 3 a 9, tal como de 3 a 8, tal como de 4 a 11, tal como de 5 a 11 tal como de 6 a 11, tal como de 4 a 10, tal como de 5 a10, tal como de 4 a 9, tal como de 5 a 9, tal como de 4 a 8, em particular de 5 a 8. Preferencialmente, o log K do agente quelante na composição de acordo com a invenção é um fator de pelo menos 1, tal como pelo menos 1,33, tal como pelo menos 1,67, tal como pelo menos 2, tal como pelo menos 2.33, tal como pelo menos 2,67, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 3,33, tal como pelo menos 3,67 vezes o log K de citrato determinado conforme descrito sob “Materiais e Métodos”. O agente quelante nas composições de acordo com a invenção também pode estar na faixa de um fator de 1 a 3,67, tal como de 1 a 3,33, tal como de 1 a 3,00, tal como de 1 a 2,67, tal como de 1,33 a 3,67, tal como de 1,33 a 3,33, tal como de 1,33 a 3,00, tal como de 1,33 a 2,67, tal como de 1,67 a 3,67, tal como de 1,67 a 3,33, tal como de 1,67 a 3, em particular de 1,67 a -2,67 vezes o log K de citrato determinado conforme descrito sob “Materiais e Métodos”.

[0091] Os agentes quelantes úteis podem ser, entre outros, da seguinte maneira: ácido N-(1,2-dicarboxietil)-D,L-aspártico (IDS), ácido N-(2- hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico ácido-N-monoacético (ASMA), ácido aspártico ácido-N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico ácido-N-- monopropiônico (ASMP), ácido iminodissuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil) aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil) glutâmico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil) glutâmico (SEGL), ácido N- metiliminodiacético (MIDA), ácido a-alanina-N,N-diacético (α -ALDA), ácido serina-N,N-diacético (SEDA), ácido isosserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico ácido-N ,N -diacético (ANDA), ácido N-sulfanílico, ácido N-diacético (SLDA), taurina-N, ácido N- diacético (TUDA), ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N-(hidroxietil)- etilidenodiaminatriacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP).

[0092] O agente quelante preferido pode conter um grupo amino e pode ser, por exemplo, um aminopolicarboxilato ou um fosfonato. Ele pode ser uma molécula monomérica compreendendo um, dois ou três grupos amino (grupos amino tipicamente secundários ou terciários), e pode conter dois, três, quatro ou cinco grupos arboxila ou até mais grupos carboxila. Os agentes quelantes podem ser fósforo contendo ou não fósforo. Há muitas maneiras de agrupar os agentes quelantes, uma maneira pode ser como a seguir:

[0093] Os agentes quelantes podem ser carboxilatos ou ser baseados em grupos carboxilatos como EDTA (tetra-acetato de etileno diamina), NTA (2,2',2"-nitrilotriacetato), citrato, 2-hidroxipropan-1,2,3tricarboxilato, DTPA (ácido dietilenotriaminapenta-acético), MGDA (ácido metilglicinadiacético ou N,N’-bis(carboximetil)alanina), EGTA (ácido tetra-acético de etileno glicol), EDDS (ácido etilenodiamina-N,N’-dissuccínico), GLDA (ácido L-Glutâmico, ácido N,N-diacético), Policarboxilatos tais como PAA [poli(ácido acrílico)], PAA/PMA [copoli(ácido acrílico / ácido maleico)].

[0094] Os agentes quelantes contendo fósforo podem ser polifosfatos ou fosfonatos, tais como tripolifosfato de sódio (STP), HEDP (Ácido 1- hidroxietilideno-1,1-Difosfônico), EDTMP [ácido bis(fosfonometil)amino] metilfosfônico] ou (etilenodiamina tetra(ácido metileno fosfônico)), EDTMPA (ácido etilenodiaminatetrametilenotetrafosfônico), DTPMP (dietilenotriamina penta (ácido metileno fosfônico), DTMPA (dietilenotriaminapenta(ácido metileno-fosfônico)). Os agentes quelantes podem conter nitrogênio, tal como em EDTA, NTA, DTPA, PDTA, GLDA, MGDA, EDDS, EDTMP, EDTMPA, and DTPMP ou ASMA, ASDA, ASMP, IDA, SMAS, SEAS, SMGL, SEGL, MIDA, α- ALDA, SEDA, ISDA, PHDA, ANDA, SLDA, TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP, ou misturas destes.

[0095] Assim, os agentes quelantes preferidos podem ser, entre outros, da seguinte maneira: ácido etileno-diamina-tetra-acético (EDTA), ácido dietileno triamina penta metileno fosfônico (DTMPA, DTPMP), ácido hidróxi-etano difosfônico (HEDP), ácido etilenodiamina N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metil glicina di-acético (MGDA), ácido dietileno triamina penta acético (DTPA), ácido propileno diamina tetra-acético (PDTA), 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO), ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido glutâmico de ácido N,N-diacético, sal tretrassódico de ácido (N,N-dicarboximetil) glutâmico (GLDA) e ácido nitrilotriacético (NTA) ou misturas destes. Os agentes quelantes podem estar presentes em sua forma ácida ou um sal, preferencialmente, os agentes quelantes podem estar presentes como sais de sódio, potássio, amônio ou amina (tal como trietanolamina e monoetanolamina).

[0096] Outros agentes quelantes podem ser agentes quelantes que se originam do material de planta, tal como, por exemplo, material contendo amido conforme descrito em detalhes abaixo. Exemplos de tais agentes quelantes naturais são, entre outros, ácido fítico (também conhecido como ácido Inositol hexafosfórico (IP6), ou fitina, ou fitato quando em sal), ácido Inositol difosfórico, ácido Inositol trifosfórico ou Inositol pentafosfórico. O agente quelante pode estar presente na composição em uma quantidade de 0,0001% em peso a 20% em peso, preferencialmente de 0,01 a 10% em peso, mais preferencialmente de 0,1 a 5% em peso.

Sistemas de Branqueamento

[0097] A composição de detergente líquido da invenção pode conter de 0 a 50% em peso, tal como cerca de 0,1% a cerca de 25%, de um sistema de branqueamento. Qualquer sistema de branqueamento conhecido na técnica para uso em detergentes líquidos de lavagem de roupa pode ser usado. Os componentes do sistema de branqueamento adequado incluem catalisadores de branqueamento, fotobranqueadores, ativadores de branqueamento, fontes de peróxido de hidrogênio tais como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré-formados e misturas destes. Os perácidos pré-formados adequados incluem, entre outros, ácidos peroxicarboxílicos e sais, ácidos percarbônicos e sais, ácidos perimídicos e sais, ácidos peroximonossulfúricos e sais, por exemplo, Oxona (R), e misturas destes. Exemplos não limitantes de sistemas de branqueamento incluem sistemas de branqueamento à base de peróxido, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico incluindo sais de metal alcalino tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono ou tetra-hidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais persilicato, em combinação com um ativador de branqueamento de formação de perácido. O termo ativador de branqueamento significa aqui como um composto que reage com branqueador de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido. O perácido assim formado constitui o branqueador ativado. Os ativadores de branqueamento adequados a serem usados aqui incluem aqueles que pertencem á classe de ésteres amidas, imidas ou anidridos. Exemplos adequados são tetracetiletileno diamina (TAED), 4-[(3,5,5-trimetil- hexanoil) oxi]benzeno sulfonato de sódio (ISONOBS), ácido diperóxi dodecanoico, 4-(dodecanoiloxi) benzenossulfonato (LOBS), 4-(decanoiloxi) benzenossulfonato, 4-(decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoiloxi)- benzenossulfonato (NOBS) e/ou aqueles revelados no documento WO98/17767. Uma família particular de ativadores de branqueamento de interesse foi revelada no documento EP624154 e, particularmente preferido naquela família é o citrato de acetil trietila (ATC). ATC ou um triglicerídeo de cadeia curta como triacetina tem a vantagem que é ele amigo do meio ambiente já que eventualmente degrada em ácido cítrico e álcool. Além disso, o citrato de acetil trietila e triacetina tem uma boa estabilidade hidrolítica no produto mediante armazenamento e é um eficaz ativador de branqueamento. Finalmente, ATC fornece uma boa capacidade de construção para o aditivo de lavagem de roupa. Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. O sistema de branqueamento também pode compreender perácidos tais como ácido 6-(ftalimido)peróxi-hexanoico (PAP). O sistema de branqueamento também pode incluir um catalisador de branqueamento. Em algumas realizações, o componente de branqueamento pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo em catalisadores orgânicos tendo as seguintes fórmulas:

(iii) e misturas destes; em que cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 24 carbonos ou grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, preferencialmente, cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 18 carbonos ou grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-propil- heptila, 2-butiloctila, 2-pentilnonila, 2-hexildecila, n-dodecila, n-tetradecila, n- hexadecila, n-octadecila, iso-nonila, iso-decila, iso-tridecila e iso-pentadecila. Outros sistemas de branqueamento exemplares são descritos, por exemplo, nos documentos WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 e WO2007/087242. Fotobranqueadores adequados pode ser, por exemplo, ftalocianina de zinco sulfonada. Polímeros

[0098] A composição de detergente líquido da invenção pode conter de 0 a 10% em peso, tal como de 0,5 a 5%, de 2 a 5%, de 0,5 a 2% ou de 0,2 a 1% de um polímero. Qualquer polímero conhecido na técnica para uso nos detergentes pode ser utilizado. O polímero pode funcionar como um co-agente anti-calcário conforme mencionado acima, ou pode fornecer antirredeposição, proteção de fibra, liberação de sujeira, inibição de transferência de corante, limpeza de gordura e/ou propriedades antiespumantes. Alguns polímeros podem ter mais de uma das propriedades mencionadas acima e/ou mais de um dos motivos mencionados abaixo. Polímeros exemplares incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli (vinil álcool) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilado, carboximetil inulina (CMI), e policarboxilatos tais como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico, e copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, CMC hidrofobicamente modificado (HM-CMC) e silicones, copolímeros de ácido tereftálico e glicóis oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) e poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridina-N-óxido) (PVPO ou PVPNO) e polivinilpirrolidona- vinilimidazol (PVPVI). Outros polímeros exemplares incluem policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno e óxido de polipropileno (PEO-PPO) e sulfato de etóxi diquatérnio. Outros polímeros exemplares são revelados, por exemplo, no documento WO 2006/130575. Os sais dos polímeros menciondos acima são contemplados. Agentes tonalizantes de tecido

[0099] A composição de detergente líquido da presente invenção também pode incluir agentes tonalizantes de tecido tais como corantes ou pigmentos, que quando formulados nas composições de detergente podem depositar em um tecido quando o dito tecido está em contato com um licor de lavagem compreendendo as ditas composições de detergente e assim alterando a matiz do dito tecido através da absorção/reflexão da luz visível. Os agentes de branqueamento emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes tonalizantes de tecido alteram a matiz de uma superfície conforme eles absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Os agentes tonalizantes de tecido adequados incluem corantes e conjugados de corante- argila, e também podem incluir pigmentos. Os corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Os corantes de molécula pequena adequados incluem corantes selecionados do grupo consistindo em corante que cai nas classificações de Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou misturas destes, por exemplo, conforme descrito nos documentos WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 e EP1876226 (incorporado aqui por referência). A composição de detergente preferencialmente compreende de cerca de 0,00003% em peso a cerca de 0,2% em peso, de cerca de 0,00008% em peso a cerca de 0,05% em peso, ou até de cerca de 0,0001% em peso a cerca de 0,04% em peso de agente tonalizante de tecido. A composição pode compreender de 0,0001% em peso a 0,2% em peso de agente tonalizante de tecido, isso pode ser especialmente preferido quando a composição está na forma de uma embalagem de dose unitária. Os agentes tonalizantes adequados também são revelados, por exemplo, nos documentos WO 2007/087257 e WO2007/087243.

Enzimas Adicionais

[0100] A composição de detergente líquido pode compreender uma ou mais enzimas adicionais, tais como uma protease, lipase, cutinase, amilase adicional, carboidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, a lacase, e/ou peroxidase. Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ideal, compatibilidade com outros componentes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes.

[0101] Celulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana e fúngica. Os mutante quimicamente modificados ou projetados de proteína estão incluídos. As celulases adequadas incluem as celulases a partir dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngica produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum reveladas nos documentos US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259. As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado com a cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas nos documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940, WO 02/099091. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas nos documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299. As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme®, e Carezyme®, Carezyme Premium®, Celluclean® (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[0102] Proteases: As proteases adequadas incluem aqueles de origem animal, vegetal ou microbiana. A de origem microbiana é preferida. Os mutante quimicamente modificados ou projetados de proteína estão incluídos. A protease por ser uma serina protease ou uma metaloprotease, preferencialmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease do tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descrita no documento WO 89/06279). Exemplos de proteases do tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease Fusarium descrita nos documentos WO 89/06270 e WO 94/25583. Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas nos documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das posições a seguir: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274. As enzimas protease preferidas comercialmente disponíveis incluem Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, and Kannase™ (Novozymes A/S), Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™ e FN3™ (Genencor International Inc.).

[0103] Lipases e Cutinases: As lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou projetados de proteína estão incluídos. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, por exemplo, de T. lanuginosus (anteriormente chamada Humicola lanuginosa) conforme descrito nos documentos EP 258 068 e EP 305 216, cutinase de Humicola, por exemplo, H. insolens conforme descrito no documento WO 96/13580, uma lipase Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422). Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas nos documentos WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/060063, WO2007/087508 e WO 2009/109500. As enzimas lipase preferidas comercialmente disponíveis incluem LipolaseTM, Lipolase UltraTM, e Lipex™; LecitaseTM, LipolexTM; LipocleanTM, LipoprimeTM (Novozymes A/S). Outras lipases comercialmente disponíveis incluem Lumafast (Genencor Int Inc); Lipomax (Gist-Brocades/Genencor Int Inc) e Bacillus sp. lipase da Solvay.

[0104] Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou projetados de proteína estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes destas como aquelas descritas nos documentos WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257. As peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[0105] A(s) enzima(s) de detergente) pode(m) estar incluída(s) em uma composição de detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta fluida, etc. As formulações preferidas de aditivo de detergente são granulados, em particular granulados não empoeirados, líquidos, em particular líquidos estabilizados ou pastas fluidas.

[0106] Os granulados não empoeirados podem ser produzidos, por exemplo, conforme revelado nos documentos US 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que há de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono , di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento de formação de filme adequados para aplicação através de técnicas de leito fluido são dados no documento GB 1483591. As preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com um método revelado no documento EP 238,216.

Materiais adjuvantes

[0107] Quaisquer componentes de detergente conhecidos na técnica para uso em detergentes líquidos de lavagem de roupa também podem ser usados. Outros componentes de detergente opcionais incluem agentes anticorrosão, agentes antiencolhimento, agentes antirredeposição de sujeira, agentes antirrugosidade, bactericidas, aglutinantes, inibidores de corrosão, desintegrantes/agentes de desintegração, corantes, estabilizadores de enzima (incluindo ácido bórico, boratos, CMC, e/ou polióis tais como propileno glicol), condicionadores de tecido incluindo argilas, auxiliares de enchimentos/ processamento, agentes de branqueamento fluorescentes/ branqueadores ópticos, ativadores de espuma, reguladores de espuma (espuma de sabão), perfumes, agentes de suspensão de sujeira, amaciantes, supressores de espuma de sabão, inibidores de mancha e agentes de capilaridade, sozinho ou em combinação. A escolha de tais componentes está bem dentro do conhecimento do técnico.

[0108] Dispersantes - As composições de detergente da presente invenção também podem conter dispersantes. Em particular, os detergentes pulverizados podem compreender dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo ou copoliméricos ou seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais que dois átomos de carbono. Os dispersantes adequados são, por exemplo, descritos em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

[0109] Agentes de Inibição de Transferência de Corante - As composições de detergente da presente invenção também podem incluir um ou mais agentes de inibição de transferência de corante. Os agentes adequados de inibição de transferência de corante polimérico incluem, entre outros, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N- vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou misturas destes. Quando presente em uma composição em questão, os agentes de inibição de transferência de corante podem estar presentes nos níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou até de cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso da composição.

[0110] Agente de branqueamento fluorescente - As composições de detergente da presente invenção também conterão, preferencialmente, componentes adicionais que podem tingir os artigos que estão sendo limpos, tal como agente de branqueamento fluorescente ou branqueadores ópticos. Onde presente, o branqueador está preferencialmente em um nível de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%. Qualquer agente de branqueamento fluorescente adequado para uso em uma composição de detergente de lavagem de roupa pode ser usado na composição da presente invenção. Os agentes de branqueamento fluorescentes mais comumente usados são aqueles que pertencem às classes de derivados de ácido diaminoestilbeno-sulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil-diestirila. Exemplos do tipo de derivado de ácido diaminostilbeno-sulfônico dos agentes de branqueamento fluorescentes incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s- triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6- ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidróxi- etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-1,2,3- triazol-2-il)estilbeno-2,2'-dissulfonato e 5-(2H-nafto[1,2-d][1,2,3]triazol-2-il)-2- [(E)-2-fenilvinil]benzenossulfonato de sódio. Os agentes de branqueamento fluorescentes preferidos são Tinopal DMS e Tinopal CBS disponível junto à Ciba-Geigy AG, Basel, Suíça. Tinopal DMS é o sal de dissódio de 4,4'-bis-(2- morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato. Tinopal CBS é o sal de dissódio de 2,2'-bis-(fenil-estiril)-dissulfonato. Também são preferidos agentes de branqueamento fluorescentes que são Parawhite KX comercialmente disponíveis, fornecido por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia. Outros agentes de fluorescência adequados para uso na invenção incluem as 1-3-diaril pirazolinas e as 7-alquilaminocumarinas. Os níveis de branqueadores fluorescentes adequados incluem níveis inferiores de cerca de 0,01, de 0,05, de cerca de 0,1 ou até de cerca de 0,2 % em peso para níveis superiores de 0,5 ou até 0,75 % em peso.

[0111] Polímeros de liberação de sujeira - As composições de detergente da presente invenção também podem incluir um ou mais polímeros de liberação de sujeira que auxiliam a remoção de sujeiras dos tecidos tal como tecidos com base de algodão e poliéster, em particular a remoção das sujeitas hidrofóbicas dos tecidos com base de poliéster. Os polímeros de liberação de sujeira podem, por exemplo, ser polímeros com base de tereftalato não iônico ou aniônico, polivinil caprolactama e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinila, poliamidas de poliéster, vide, por exemplo, Capítulo 7 em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Ouro tipo de polímeros de liberação de sujeira são polímeros de limpeza de gordura alcoxilada anfifílica compreendendo uma estrutura de núcleo e uma pluralidade de grupos alcoxilados anexados àquela estrutura de núcleo. A estrutura de núcleo pode compreender uma estrutura de polialquilenimina ou uma estrutura de polialcanolamina conforme descrito em detalhes no documento WO 2009/087523 (incorporado aqui por referência). Além disso, os copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujeira adequados. Os copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhes nos documentos WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (incorporados aqui por referência). Outros polímeros de liberação de sujeira são estruturas de polissacarídeos substituídos, especialmente estruturas de polissacarídeos substituídos, especialmente estruturas celulósicas substituídas tais como derivados de celulose modificada tais como aqueles descritos no documento EP 1867808 ou WO 2003/040279 (ambos são incorporados aqui por referência). Os polímeros celulósicos incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e misturas destes. Os polímeros celulósicos adequados incluem celulose anionicamente modificada, celulose não ionicamente modificada, celulose cationicamente modificada, celulose zwitterionicamente modificada, e misturas destes. Os polímeros celulósicos adequados incluem metil celulose, carboxi metil celulose, etil celulose, hidroxil etil celulose, hidroxil propil metil celulose, éster carboxi metil celulose, e misturas destes.

[0112] Agentes antirredeposição - As composições de detergente da presente invenção também podem incluir um ou mais agentes antirredeposição tais como carboximetilcelulose (CMC), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maleico, e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros com base de celulose descritos sob polímeros de liberação de sujeira acima também podem funcionar como agentes antirredeposição.

[0113] Outros materiais adjuvantes adequados incluem, entre outros, agentes antiencolhimento, agentes antirrugosidade, bactericidas, aglutinantes, transportadores, corantes, estabilizadores de enzima, amaciantes de tecido, enchimentos, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supressores de espuma de sabão, solventes e estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes elasticizantes de estrutura. Forma dos produtos de detergente líquido

[0114] A composição de detergente líquido da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Há várias formas de formulação de detergente tais como camadas (fases iguais ou diferentes), bolsas, bem como formas para unidade de dosagem de máquina.

[0115] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos únicos ou múltiplos. Pode ser de qualquer forma, formato e material que seja adequado para segurar a composição, por exemplo, sem permitir que a liberação da composição libere a composição da bolsa antes do contato com a água. A bolsa é feita a partir do filme solúvel em água que inclui um volume interno. O dito volume interno pode ser dividido nos compartimentos da bolsa. Os filmes preferidos são materiais poliméricos, preferencialmente, polímeros que são formados em um filme ou folha. Os polímeros, copolímeros ou derivados preferidos destes são poliacrilato selecionados e copolímeros de acrilato solúvel em água, metil celulose, carboxi metil celulose, dextrina sódica, etil celulose, hidroxietil celulose, hidroxipropil metil celulose, malto dextrina, poli metacrilatos, mais preferencialmente copolímeros de álcool polivinílico e hidroxipropil metil celulose (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímero no filme, por exemplo, PVA é pelo menos cerca de 60%. O peso molecular médio preferido tipicamente será de cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes também podem ser composições misturadas compreendendo misturas de polímero hidroliticamente degradável e solúvel em água tal como polilactídeo e álcool polivinílico (conhecido sob a referência do Comércio M8630 como vendido por MonoSol LLC, Indiana, EUA) mais plastificantes tipo glicerol, etileno glicerol, propileno glicol, sorbitol e misturas destes. As bolsas podem compreender uma composição de limpeza sólida de lavagem de roupa ou componentes em parte e/ou uma composição líquida de limpeza ou componentes em parte separados pelo filme solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que os compartimentos contendo sólidos. Ref: (US2009/0011970 A1).

[0116] Os componentes de detergente podem ser separados fisicamente um do outro pelos compartimentos em bolsas solúveis em água ou em diferentes camadas de comprimidos. Por isso, a interação de armazenamento negativo entre os componentes pode ser evitada. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos também podem dar origem à dissolução atrasada de componentes selecionados na solução de lavagem.

[0117] Um detergente líquido ou gel, que não é dosado em unidade, pode ser aquoso, tipicamente contendo pelo menos 20% em peso e até 95% de água, tal como até cerca de 70% de água, até cerca de 65% de água, até cerca de 55% água, até cerca de 45% de água, até cerca de 35% de água. Outros tipos de líquidos, incluindo sem limitação, alcanóis, aminas, dióis, éteres e polióis podem ser incluídos em um líquido aquoso ou gel. Um líquido aquoso ou detergente em gel pode conter de 0 a 30% de solvente orgânico. O detergente líquido ou em gel pode ser não aquoso, contendo de cerca de 5% a menos que cerca de 15 ou 10% em peso de água.

[0118] A composição de detergente líquido da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição de detergente de lavagem de roupa à mão ou à máquina incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecido adicionada ao enxague. Preparação de alfa-amilases da presente invenção

[0119] As alfa-amilases (variantes) da composição de detergente podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local, construção de gene sintético, construção de gene semissintético, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc. A mutagênese direcionada ao local é uma técnica em que uma ou mais (por exemplo, várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando a matriz.

[0120] A mutagênese direcionada ao local pode ser realizada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese direcionada ao local também pode ser realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica a ligação matriz e subsequente de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo extremidades coesivas do plasmídeo e a inserção para ligar um ao outro. Vide, por exemplo, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0121] A mutagênese direcionada ao local também pode ser realizada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16. Qualquer procedimento de mutagênese direcionada ao local pode ser usado na presente invenção. Há muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes. A construção de gene sintético implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo projetada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de gene pode ser realizada usando várias técnicas, tais como a tecnologia de base de microchip multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que os oligonucleotídeos são sintetizados e montados mediante chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[0122] As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido único ou múltiplo podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de varredura relevante, tal como aquele revelado por Reidhaar- Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente US 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127). Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com alto rendimento, métodos de varredura automáticos para detectar a atividade de polipeptídeos mutados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutadas que codificam os polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individual em um polipeptídeo.

[0123] A construção do gene semissintético é realizada pela combinação de aspectos de construção de gene sintético e/ou mutagênese direcionada ao local, e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo usando fragmentos de polinucleotídeo que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. As regiões definidas de genes podem, assim, ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos específicos de local, enquanto ainda outras regiões podem ser submetidas à amplificação de PCR propensa ao erro ou de PCR não propensa ao erro. As subsequências de polinucleotídeo podem então ser embaralhadas. A matriz pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável, em que outro polipeptídeo é fundido no N-terminal ou no C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido pela fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo para um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências de codificação que codificam os polipeptídeos de modo que eles estão em quadro e que a expressão do polipeptídeo de fusão está sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando tecnologia intein na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0124] Um polipeptídeo de fusão pode compreender, ainda, um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Mediante secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem, mas não se limitam a, locais revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0125] A matriz pode ser obtida a partir dos micro-organismos de qualquer gênero. Para finalidades da presente invenção, o termo “obtido de” conforme usado aqui em conexão com uma determinada fonte deve significar que a matriz codificada por um polinucleotídeo é produzida pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, a matriz é secretada extracelularmente. A matriz ou em outros termos a alfa-amilase tendo pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1 pode ser uma alfa-amilase bacteriana. Por exemplo, a alfa-amilase (matriz) pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como uma alfa-amilase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo tal como uma alfa-amilase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[0126] Em um aspecto, a alfa-amilase (matriz) é uma alfa-amilase de Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[0127] Em outro aspecto, a matriz de alfa-amilase é uma alfa-amilase artificial, por exemplo, a alfa-amilase do SEQ ID NO: 1. Será entendido que para as espécies mencionadas acima, a invenção engloba ambos estados perfeitos e imperfeitos e outros equivalente taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome das espécies pelo qual são conhecidos. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão facilmente a identidade de equivalentes apropriados. As cepas dessas espécies são facilmente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0128] A matriz pode ser identificada e obtida a partir de outras fontes incluindo micro-organismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima. Técnicas para isolar os micro-organismos e DNA diretamente dos habitats naturais são bem-conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica uma matriz pode, então, ser obtido por varredura similar de uma biblioteca de DNA ou cDNA genômico de outro micro-organismo ou amostra de DNA misturada. Uma vez que o polinucleotídeo que codifica uma matriz foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado pela utilização de técnicas que são conhecidas daqueles técnicos no assunto (veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0129] A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos revelados aqui, uma vez que esses aspectos são destinados para ser ilustrações de diversos aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são destinados para estar dentro do escopo dessa invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão aparentes para os técnicos no assunto da descrição anterior. Tais modificações também são destinadas para cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente revelação incluindo definições controlarão.

[0130] A invenção será agora ilustrada, ainda, pelos exemplos a seguir, não limitantes, nos quais partes e porcentagens estão em peso, a menos que indicado de outra maneira. Nas figuras anexas:

[0131] A Figura 1 mostra o perfil do pH de alpha amilase tendo SEQ NO1: com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao usar SEQ ID NO: 1 para numeração.

Materiais e métodos

[0132] Preparação de detergentes modelos. Os detergentes líquidos modelos com diferentes quelantes foram preparados para testar várias amilases. As composições dos dois detergentes modelos são conforme descrito abaixo: Tabela 2

Ensaio de PNP-G7 amilase

[0133] A atividade de alfa-amilase pode ser determinada por um método que emprega o substrato de PNP-G7. PNP-G7 que é uma abreviação para 4,6- etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1 )-a,D-maltoheptaosídeo, um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase, tal como uma alfa- amilase. Após a clivagem, a alfa-Glicosidase incluída no kit sintetiza o substrato hidrolisado para ainda liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medida pela espectrometria visível a À=405nm (400 a 420 nm). Os kits contendo substrato de PNP-G7 e alfa-Glicosidase são fabricados pela Roche (cat. no 11876473). REAGENTES: O substrato de G7- PNP desse kit contém 4,6-etilideno-G7-PNP a 22 mM e HEPES a 52,4 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanossulfônico), pH 7,0) .

[0134] O reagente alfa-Glicosidase contém HEPES a 52,4 mM, NaCl a 87 mM, MgCl2 a 12,6 mM, CaCl2 a 0,075 mM, > 4 kU/L alfa-glicosidase).

[0135] A solução de trabalho do substrato é feito através da mistura de 66 mL do reagente de alfa-Glicosidase com 16 mL do substrao de G7-PNP. Essa solução de trabalho do substrato é feita imediatamente antes do uso.

[0136] Tampão de diluição: CaCl2 a 30 mM + 0,0026% de BRIJ 35 (Polioxietilen-lauriléter) PROCEDIMENTO:

[0137] O ensaio foi realizado pela transferência de 40 μl de amostras de enzima diluídas em placa de microtitulação de 96 poços e adicionando 220 μl da solução de trabalho do substrato. A solução foi misturada e pré-incubada 15 minutos a 37 °C e a absorção é medida a cada 20 segundos durante 10 minutos a OD 405 nm em um leitor Eliza “Spectra max 384 plus” (dispositivos Moleculares). A inclinação (absorvência por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da alfa-amilase em questão sob o determinado conjunto de condições. Ensaio para medir os íons de cálcio livre

[0138] O ensaio a seguir pode ser usado para medir os íons de cálcio livre na solução, e assim para determinar a habilidade dos agentes quelantes (quelantes) em reduzir a concentração de íons de cálcio livre (Ca2+) de, por exemplo, 2,0 mM para 0,10 mM em pH 8. Princípio do ensaio:

[0139] Várias quantidades de quelantes são adicionadas a uma solução de Ca2+ a 2,0 mM e a concentração de Ca2+ livre é determinada pelo uso de um Eletrodo Seletivo de Íon de Cálcio em pH e temperatura fixos. A concentração do quelante necessário para reduzir a concentração de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM pode ser determinada a partir de um gráfico da concentração de cálcio livre medido versus a concentração do quelante. No presente ensaio, a concentração de quelante necessária para reduzir a concentração de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM é medida em pH 8, a 21 °C, em cloreto de potássio e EPPS a 49 mM.

SOLUÇÕES:

[0140] Solução de eletrólito: cloreto de potássio a 4 M em água ultrapura (água Milli-Q). Tampão de pH 8: EPPS a 50 mM (ácido 4-(2- Hidroxietil)piperazina-1-propanossulfônico) ajustado ao pH 8,0 usando quantidades mínimas de hidróxido de sódio a 1 N. Solução estoque de cálcio: Ca2+ a 25 mM em tampão pH 8, feito a partir de CaCl2.2H2O. Solução estoque de quelante: quelante a 15 mM (em uma base quelante seca a 100%) em tampão pH 8, reajustada para pH 8,0 usando quantidades mínimas de NaOH a 1 M ou HCl a 1 M.

[0141] Água ultrapura (água Milli Q) é usada para preparação de todos os tampões e soluções.

EQUIPAMENTO:

[0142] Eletrodo Seletivo de Íon de Cálcio de Thermo Scientific (cat. no 9720BNWP) calibrado contra uma solução padrão de cloreto de cálcio. O eletrodo é calibrado conforme descrito pelas orientações após o eletrodo. PROCEDIMENTO:

[0143] Uma série de frascos é preparada, cada contendo 4 mL da solução estoque de cálcio (concentração final 2,0 mM), 1 mL de solução de eletrólito (concentração final cloreto de potássio a 80 mM), solução estoque de quelante em várias quantidades (0 a 45 mL) e usando o tampão de pH 8 para ajustar o volume total para 50 mL. A concentração final de EPPS no ensaio é de 49 mM.

[0144] Após mistura, a concentração de Ca2+ livre é medida pelo eletrodo de cálcio. A concentração de cálcio livre deve ser determinada em um número suficiente de diferentes concentrações de quelante para cada quelante testado, garantindo que o conjunto de dados cobre toda a faixa de íons de cálcio livre a 2,0 mM em um valor abaixo de 0,10 mM ou a concentração final de quelante no ensaio é maior que 10.0 mM. Um número adequado de pontos de dados é 8 ou mais. A concentração de quelante exigida para reduzir os íons de cálcio livre a 2,0 mM iniciais para 0,10 mM é obtida a partir de um gráfico da concentração medida de íon de cálcio livre versus concentração de quelante por interpolação.

[0145] As soluções são equilibradas à temperatura desejada, que no presente ensaio é de 21 °C. Determinação de log K

[0146] Os agentes quelantes também podem ser caracterizados pela ligação constante do agente quelante (quelante) e íons de cálcio. Essa constante pode ser determinada por ITC (calorimetria de titulação isotérmica) conforme descrito por AD Nielsen, CC Fuglsang and P Westh, Analytical Biochemistry Vol. 314 (2003) page 227-234 and T Wiseman, S Williston, JF Brandts and L-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 (1989) page 131-137.

[0147] Todo o material de vidro e garrafas de plástico usadas são lavados com uma solução de EDTA a 1% (p/p) e subsequentemente enxaguados completamente em água ultrapura tratada Chelex 100 (água Milli-Q). As soluções são armazenadas em garrafas plásticas e mantidas a 5 °C até o uso.

[0148] TAMPÕES: HEPES a 20 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]- etanossulfônico), pH 8 preparado com água ultrapura (água Milli-Q) glicina a 20 mM, pH 10 preparado com água ultrapura (água Milli-Q). SOLUÇÕES: -125 μM de quelante em HEPES a 20 mM, pH 8 ou 125 μM de quelante em glicina a 20 mM, pH 10 - CaCl2 a 4 mM em HEPES a 20 mM, pH 8 ou CaCl2 a 4 mM em glicina a 20 mM, pH 10 - Água ultrapura (água Milli-Q)

[0149] Todos os tampões são passados através das colunas Chelex 100 (Sigma Aldrich C-7901, ácido iminodiacético de grupo ativo de matriz de poliestireno reticulado de matriz 1% (forma de sódio) fixação de matriz através do grupo de metila para anéis aromáticos) para remover os íons de cálcio. Todas as soluções são desgaseificadas por agitação sob vácuo antes dos experimentos.

INSTRUMENTO:

[0150] MCS-ITC (MicroCal Inc., Northampton, MA, EUA)

PROCEDIMENTO:

[0151] A célula de referência é preenchida com água ultrapura (água Milli-Q). A célula da amostra é preenchida com a solução de quelante no pH selecionado e a seringa é preenchida com a solução de cálcio solução no pH selecionado. As soluções são equilibradas para a temperatura desejada, por exemplo, 19 °C. A solução de quelante na célula de amostra é então titulada com 30 a 40 alíquotas de 8 μL da solução de cálcio.

[0152] Os sinais obtidos da ITC são então integrados usando o software Origin fornecido pela MicroCal Inc. Para obter os isotermas de ligação, as rotinas de regressão são feitas usando o mesmo pacote de software. Esses dados são então ajustados para um modelo usando as rotinas incorporadas no software Origin. Presentemente, o modelo “OneSites” é o preferido que dá o melhor ajuste para a maioria dos agentes quelantes comumente usados, isto é, os resíduos são uniformemente distribuídos em torno de zero. A partir do valor K, o log K é calculado como o logaritmo (base 10) do valor K. Ensaios para determinar o desempenho de lavagem Ensaio de lavagem de Terg-O-tometer (TOM)

[0153] O teste de desempenho de lavagem usando Terg-O-Tometer é um ensaio em um modelo de escala médio de uma máquina de lavar e usado para avaliar o desempenho de lavagem das amilases. Um TOM é basicamente um banho-maria controlado por temperatura ampla com até 12 béqueres de metal abertos submersos neles. Cada béquer constitui uma máquina de lavar pequena e durante um experimento, cada um deles conterá uma solução de um sistema de detergente específico/enzima e os tecidos sujos e não sujos e seu desempenho é testado. A tensão mecânica é alcançada por um braço de agitação rotativa, que agita o líquido dentro de cada béquer. Porque os béqueres de TOM não têm tampa, é possível retirar as amostras durante o experimento TOM e o ensaio para informação on-line durante a lavagem. O teste de desempenho de lavagem TOM, usando béqueres de 1000 mL e um agitador de pá provendo movimento de rotação oscilante, 180° em cada direção, com uma frequência de 120 por minuto, compreende as seguintes etapas: 500 mL de solução de lavagem (15°dH com uma razão Ca/Mg de 4:1 contendo NaHCO3 a 40 mM) adicionados aos béqueres. Quando a temperatura selecionada para lavagem, por exemplo, 40 °C, é alcançada, o detergente e a enzima são adicionados à solução de lavagem. Durante a lavagem, a concentração de detergente deve ser 3,3 g de detergente por L de solução de lavagem (3,3 g/L, por exemplo, detergente modelo 1 ou 2 conforme descrito acima). A concentração de enzima durante lavagem deve ser 0 e/ou 0,028 mg de solução de lavagem de proteína de enzima/L. 10 g de reator pré-lavado cortado em 5*5 cm WFK80A (wfk Testgewebe GmbH, Christenfeld 10; D-41379 Brüggen-Bracht; Alemanha) são adicionados junto de quatro amostras de amido de arroz de algodão de 5x5 cm, por exemplo, CS-28 (Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Baixos), para solução de lavagem para começar a lavagem. Após selecionar o tempo de lavagem, por exemplo, 20 minutos, a lavagem é interrompida e as amostras imediatamente enxaguadas por 5 minutos embaixo da água fria da torneira corrente. As amostras enxaguadas são subsequentemente secadas no escuro. Após secar, o desempenho de lavagem é avaliado através da medição da remissão de luz incidente a 460 nm usando Color Eye conforme descrito abaixo. O teste com 0 mg de proteína de enzima/L é usado como um espaço em branco para obter um valor de remissão delta. Medição de Color Eye

[0154] O desempenho de lavagem é expresso como um valor de remissão delta (ΔRem). As avaliações de remissão de luz das amostras foram feitas usando um espectrofotômetro de remissão Macbeth Color Eye 7000 com uma ampla abertura circular (25 mm de diâmetro). As medições foram feitas sem UV na luz incidente e a remissão a 460 nm foi extraída. A amostra a ser medida foi colocada no topo de três outras amostras, do mesmo tipo, lavadas em condições idênticas, antes de serem medidas para reduzir a reflexão a partir do pistão empurrando a amostra conta a abertura de medição. Os valores de remissão delta para uma determinada condição de lavagem foram calculados pela subtração do valor de remissão médio das amostras lavadas sem amilase adicionada (0 mg de proteína de enzima/L) a partir do valor de remissão das amostras lavadas com amilase (0.028 mg de proteína de enzima/L). Ensaio de Tensão Mecânica Automática (AMSA) para lavagem de roupa

[0155] Outro teste de desempenho de lavagem que pode seu usado é o AMSA. A fim de avaliar o desempenho de lavagem na lavagem de roupa, experimentos de lavagem podem ser realizados usando o Ensaio de Tensão Mecânica Automática (AMSA). Com o AMSA, o desempenho de lavagem de muitas soluções de enzima-detergente de volume pequeno pode ser examinado. A placa de AMSA tem várias fendas para soluções de teste e uma tampa que firmemente aperta o têxtil a ser lavado contra as aberturas da fenda. Durante a lavagem, a placa, as soluções de teste, o têxtil e a tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicam tensão mecânica em uma maneira regular, periódica, oscilante. Para descrição adicional, consulte o documento WO02/42740, especialmente o parágrafo “Realizações especiais do método” nas páginas 23 e 24. Tabela 3

[0156] Detergentes modelos e materiais de teste podem ser da seguinte maneira: Tabela 4

[0157] Os materiais de teste são obtidos de EMPA Testmaterials AG, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Suíça, de Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos, e WFK Testgewebe GmbH, Christenfeld 10, D-41379 Brüggen, Alemanha.

[0158] A dureza da água é ajustada para 15°dH pela adição de CaCl2, MgCl2, e NaHCO3 Ca2+:Mg2+ = 4:1:7,5) para o sistema de teste. Após lavagem, os têxteis são enxaguados em água corrente e secados.

[0159] O desempenho de lavagem é medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho também pode ser expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra é manchada, a intensidade da luz refletida é menor do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada par medir o desempenho de lavagem. As medições de cor são feitas com um digitalizador de mesa profissional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que é usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[0160] Para extrair um valor para a intensidade da luz das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits a partir da imagem são convertidos nos valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado pela adição dos valores RGB juntos como vetores a então tomando o comprimento do vetor resultante:

Exemplo 1 - Determinação do perfil do pH.

[0161] O perfil do pH foi determinado para a alpha amilase tendo SEQ NO1: com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao usar SEQ ID NO: 1 para numeração. Ensaio de redução do açúcar: Ensaios para medição de atividade amilolítica (atividade alfa-amilase).

[0162] A atividade alfa-amilase pode ser determinada por um método que emprega substrato de amido como amido de arroz S7260 de Sigma-Aldrich. A alfa-amilase cliva o substrato e a extremidade reduzida formada pela amilase é determinada pela reação com hidrazida de ácido p-Hidroxibenzoico (ensaio de redução do açúcar). Isso resulta na formação de hidrazona, que pode ser detectada por mediação de absorvência a 405 nm. O número de extremidades de redução formado é proporcional à atividade de amilase.

[0163] A enzima é diluída no tampão de diluição de enzima (MES a 10 mM, pH 7,0, 0,01% de TritonX100, CaCl2 a 0,100mM) a uma concentração de enzima onde uma curva de dose-resposta linear é obtida no ensaio. A atividade do pH é determinada usando tampões de atividade (MES a 50mM, acético ácido a 50 mM, Glicina a 50 mM) ajustado do pH4 a 11. O substrato (S7260 de Sigma-Aldrich) (3mg/ml em água milliQ) é cozido por 5 minutos e resfriado antes do uso. Para o ensaio, transferir 50 μl de substrato (3mg/ml) para placa de microtitulação de PCR e adicionar 50 μl de tampão de atividade (MES a 50mM, acético ácido a 50 mM, Glicina a 50 mM, pH4 a 11). Adicionar 50 μl de enzima diluída e misturar. Incubar na máquina de PCR por 5 minutos a 40 °C seguido pelo resfriamento.

[0164] Fazer a solução de paragem pela dissolução de hidrazida de ácido p- hidroxibenzoico (Sigma H-9882) em solução de Ka-Na-tartarato/NaOH (para 1 litro: adicionar 50g de K-Na-tartarato (Merck 8087) e 20 g de NaOH) em 15 mg/ml. Adicionar 75 μl de solução de paragem e incubar 10 minutos a 95 °C na máquina de PCR. Transferir 150 μl a nova placa de microtitulação de 96 poços e medir a absorvência a 405 nm. A enzima deve ser diluída, assim, está dentro da faixa linear do ensaio de atividade no determinado pH. A atividade de amilase é normalizada para a atividade máxima.

[0165] O perfil de pH da alpha amilase tendo SEQ NO1: com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao usar SEQ ID NO: 1 para numeração foi determinado e o resultado é mostrado na Figura 1. Pode ser visto que a atividade máxima é alcançada entre o pH 6 e 7 e a atividade cai acentuadamente na região alcalina, de modo que a enzima não parece ser especialmente atrativa para uso nos detergentes líquidos alcalinos. Os presentes inventores descobriram que a estabilidade extraordinária da enzima alfa-amilase (veja abaixo) compensa a atividade inferior nos detergentes líquidos tendo valores de pH alcalino. Nos Exemplos a seguir, as identificações de componente abreviado têm os significados a seguir: MPG é mono propileno glicol TEA é trietanolamina MEA is Monoetanolamina NaOH é 47% de solução de hidróxido de sódio NI 7EO é C12-15 álcool etoxilado 7EO não iônico Neodol® 25-7 (ex Shell Chemicals) Ácido LAS é C12-14 ácido alquilbenzeno sulfônico linear Prifac® 5908 é ácido graxo láurico saturado ex Croda SLES 3EO é lauril éter sulfato de sódio com 3 mols EO SLES 1EO é lauril éter sulfato de sódio com 1 mol EO EPEI é Sokalan HP20 - polímero de limpeza de imina de polietileno etoxilado: PEI (600) 20EO ex BASF Perfume é perfume isento de óleo Dequest® 2010 é HEDP (ácido 1-Hidroxietilideno-1,1,-difosfônico) Conservante é conservante antimicrobiano Proxel GXL, uma solução a 20% de 1,2 benzisotiazolin-3-ona em dipropileno glicol e água ex Arch Biocides Agente de fluorescência é Tinopal™ CBS-X ex Ciba Stainzyme™, Termamyl Ultra™, Savinase Ultra XL™, Mannaway™ são enzimas comerciais ex Novozymes

Exemplo 2: Estabilidade de armazenamento de amilase em detergentes líquidos.

[0166] Uma série de composições de detergente líquido foi formulada com amilases da técnica anterior (Stainzyme e Termamyl Ultra) e a amilase do SEQ ID NO: 1 com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F (que é a amilase SEQ ID NO: 2). As composições usadas são dadas na Tabela 5. As amostras de enzima do detergente foram colocadas em frascos de vidro e os frascos de vidro foram subsequentemente fechados. As amostras de enzima detergente foram incubadas por 2 e 4 semanas a 37 °C ou a 45 °C e um conjunto idêntico de amostras foi congelado para representar amostras frescas. Após armazenamento, a atividade de amilase residual foi subsequentemente medida usando o ensaio de atividade de amilase PNP-G7. As amilases que foram testadas são Termamyl Ultra, Stainzyme (Novozymes A/S; Krogshoejvej 36; 2880 Bagsvaerd; Dinamarca) e a amilase do SEQ ID NO: 2. Tabela 5 - Composições de detergente líquido

[0167] Sob as condições testadas, está claro que a amilase do SEQ ID NO: 1 com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F (que é a amilase SEQ ID NO: 2) é significativamente mais estável do que Termamyl Ultra™ e Stainzyme™ em todas as amostras de detergente.

Exemplo 3: Estabilidade de armazenamento nos detergentes líquidos.

[0168] As amilases testadas foram adicionadas aos detergentes a fim de alcançar uma concentração final da proteína de 0,084 mg de EP/g. 5 gramas de amostras de detergente com a amilase em questão foram colocados em frascos fechados de vidro por 1 semana a 40 °C ou 2 semanas a 37 °C. A atividade da amilase foi medida de acordo com um ensaio de amilase PNP-G7 descrito acima. As atividades residuais das amilases foram calculadas por comparação a uma amostra de referência armazenada por 1 e 2 semanas a - 18 °C. Tabela 9

Tabela 10

[0169] A partir desse exemplo, está claro que a amilase do SEQ ID NO: 1 tem uma boa estabilidade de armazenamento no Modelo 1, mas significativamente perde atividade no modelo 2 do detergente; logo após um armazenamento de uma semana a 40 °C. Também está claro que a amilase do SEQ ID NO: 1 tendo as substituições de G46A+T47I+G105A+I199F tem alta estabilidade em ambos os modelos 1 e 2 do detergente. Assim, essa amilase o SEQ ID NO: 1 tendo as substituições de G46A+T47I+G105A+I199F é estável no modelo 2 que contém uma concentração mais alta de um agente quelante comparado ao modelo 1. Termamyl não é estável nesses dois modelos de detergente. Exemplo 4: desempenho de lavagem de amilase residual no detergente. Preparação da amostra de enzima do detergente

[0170] As amostras de enzima de detergente contendo 0,084 mg de proteína de enzima de amilase/g de detergente, por exemplo, modelo 1 ou 2 do detergente, foram colocadas em frascos de vidro, e os frascos de vidro foram subsequentemente fechados. As amostras de enzima de detergente foram incubadas por 1 semana a 40 °C ou por 2 a 37 °C e um conjunto idêntico de amostra foi congelado para representar amostras frescas. Após armazenamento, o desempenho de lavagem foi subsequentemente determinado em Terg-O-Tometer de ambas as amostras congeladas e incubadas. As amilases que foram testadas são Termamyl (Novozymes A/S; Krogshoejvej 36; 2880 Bagsvaerd; Denmark), a amilase do SEQ ID NO: 1, e a amilase do SEQ ID NO: 1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F. Teste de desempenho de lavagem em Terg-O-Tometer

[0171] Após armazenamento, o desempenho de lavagem de Termamyl, da amilase do SEQ ID NO: 1, e da amilase do SEQ ID NO: 1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F foi avaliado em Terg-O-Tometer sob as condições experimentais descritas abaixo: Tabela 11

[0172] Para obter os 3,3 g de detergente finais por L de solução de lavagem, 1,485 g de detergente (por exemplo, Modelo 1 ou 2) foi adicionado em 500 mL de solução de lavagem com uma dureza de água de 15°dH, subsequentemente 0,165 g da amostra de amilase/detergente para ser investigada para desempenho de lavagem foi adicionado. A concentração de detergente é agora 3,3 g de detergente por L de solução de lavagem, e a concentração de amilase de 0,028 mg de proteína de enzima por L de solução de lavagem.

[0173] 10 g do reator pré-lavado cortado em 5*5 cm de WFK80A (wfk Testgewebe GmbH, Christenfeld 10; D-41379 Brüggen-Bracht; Alemanha) foram adicionados junto de quatros amostras de 5x5 cm de CS-28 (Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Baixos) para a solução de lavagem para começar a lavagem. Após lavagem de 20 minutos a 40 °C, a lavagem foi interrompida e as amostras de CS-28 foram imediatamente enxaguadas por 5 minutos em água corrente de torneira fria. Após secar, os valores de remissão das amostras de CS-28 foram medidos usando um espectrofotômetro de remissão Macbeth Color Eye 7000. O desempenho de lavagem (ΔRem) após incubação foi obtido e usado para calcular o desempenho de lavagem residual mostrado como uma razão entre o desempenho de lavagem de Termamyl, a amilase do SEQ ID NO:1, e a amilase do SEQ ID NO:1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F. O desempenho de lavagem (ΔRem) após incubação da amilase do SEQ ID NO:1 foi ajustado para 100% (tabela 2.1 & 2.2). Além disso, o desempenho de lavagem residual da amilase individual foi calculado pela divisão do desempenho de lavagem médio (ΔRem) da amostra armazenada com o desempenho de lavagem médio (ΔRem) da amostra congelada idêntica (Tabelas 12 & 13).

[0174] Tabela 12: Razão do desempenho de lavagem residual após armazenamento de 1 semana a 40 °C de Termamyl, da amilase do SEQ ID NO:1, e da amilase do SEQ ID NO:1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F. Com o desempenho de lavagem residual da amilase do SEQ ID NO: 1 ajustada para 100% em cada detergente. Tabela 12

[0175] A partir desses resultados, está evidente que o desempenho de lavagem residual da amilase do SEQ ID NO: 1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F lava melhor após armazenamento de 1 semana comparado à amilase do SEQ ID NO: 1 ao usar o modelo 2 do detergente. Ao usar o modelo 1 de detergente, a amilase do SEQ ID NO: 1 tem o maior desempenho de lavagem residual após armazenamento. Acredita-se que essa diferença seja devido à concentração mais alta dos agentes quelantes no modelo 2 versus modelo 1. Assim, a amilase do SEQ ID NO: 1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F tem bom desempenho de lavagem após armazenamento em detergentes que compreendem quantidades altas de agentes quelantes.

[0176] Tabela 13: Razão de desempenho de lavagem residual após armazenamento de 2 semanas a 37 °C de Termamyl, da amilase do SEQ ID NO:1, e da amilase do SEQ ID NO:1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F. Com o desempenho de lavagem residual da amilase do SEQ ID NO: 1 ajustado para 100%. Tabela 13

[0177] Esses resultados após armazenamento de 2 semanas s 37 °C confirmam os resultados após armazenamento de 1 semana.

[0178] Tabela 14: Desempenho de lavagem residual individual após armazenamento de 1 semana a 40 °C de Termamyl, da amilase do SEQ ID NO:1, e da amilase do SEQ ID NO:1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F. Tabela 14

[0179] Esses resultados mostram o desempenho de lavagem das amilases em dois detergentes comparado com as amostras congeladas das amilases. Assim, as amostras congeladas são ajustadas para 100%. A partir disso, pode ser visto que a amilase do SEQ ID NO: 1 perde desempenho de lavagem no modelo 2 enquanto esse não é o caso para a amilase do SEQ ID NO: 1 com as substituições G46A+T47I+G105A+I199F. Tabela 15: Desempenho de lavagem residual individual após armazenamento de 2 semanas a 37 °C de Termamyl, da amilase do SEQ ID NO:1, e da amilase do SEQ ID NO:1 com as seguintes substituições G46A+T47I+G105A+I199F.

[0180] Sob as condições testadas, está claro que a amilase do SEQ ID NO: 1 é mais estável do que Termamyl, e que as substituições (G46A+T47I+G105A+I199F) dão à amilase do SEQ ID NO:1 aumento de estabilidade e aumento de desempenho de lavagem no modelo 2 do detergente.

Exemplo 5: Caracterização dos agentes quelantes Exemplo 5a - Medição dos íons de cálcio livre.

[0181] Os agentes quelantes (quelante) podem ser classificados por sua habilidade de reduzir a concentração dos íons de cálcio livre (Ca2+) de 2,0 mM para 0,10 mM em pH 8 desenvolvida a partir de um método descrito por M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (setembro de 1984), pp. 14751478. O ensaio descrito acima sob “Materiais e Métodos” para medição dos íons de cálcio livre foi usado. Consequentemente, a concentração de quelante necessária para reduzir a dureza da água de 2,0 mM para 0,10 mM foi determinada conforme descrito acima. O experimento foi realizado com o tampão de pH 8 a 21 °C. As concentrações finais do quelante usado e a concentração medida de Ca2+ livre são mostradas na tabela 16.1 abaixo. Tabela 16.1: Concentração de Ca2+ livre determinada em uma mistura de Ca2+ a 2,0 mM e várias quantidade de agente quelante a pH 8.

[0182] A partir desses dados, a concentração do agente quelante necessária para reduzir a concentração de Ca2+ livre de 2,0 mM para abaixo de 0,10 mM foi determinada por interpolação. Vários quelantes foram caracterizado usando esse ensaio, e as concentrações do quelante necessárias para reduzir a concentração de íons de cálcio livre de 2,0 mM para 0,10 mM em pH 8,0 em tampão de EPPS a 49 mM e cloreto de potássio a 80 mM são mostrados abaixo na Tabela 16.2. Essa tabela também pode, assim, ser usada para comparar as capacidades dos agentes quelantes para reduzir a concentração de íons de cálcio livre. Tabela 16.2

Exemplo 5b - Determinação de log K

[0183] Alternativamente, os agentes quelantes podem ser caracterizados pela constante de ligação do agente quelante (quelante) e íons de cálcio. Essa constante pode ser determinada por ITC (calorimetria de titulação isotérmica) conforme descrito por AD Nielsen, CC Fuglsang and P Westh, Analytical Biochemistry Vol. 314 (2003) página 227-234 e T Wiseman, S Williston, JF Brandts and L-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 (1989) página 131-137. O procedimento para a determinação de log K é descrito em detalhes acima sob “Materiais e Métodos”. Usando esse procedimento para determinação de log K, os seguintes valores de log K por vários agentes quelantes foram determinados em pH 10 (Tabela 16.3). Tabela 16.3

Claims

1. Composição de detergente líquido, caracterizada por compreender: a) pelo menos 5% em peso de água, b) pelo menos 3% em peso de um sistema tensoativo compreendendo de 10 a 100% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo aniônico, c) uma alfa-amilase que consiste na sequência SEQ ID NO: 1 e a dita alfa-amilase apresentando as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao utilizar a SEQ ID NO: 1 para numeração; em que o detergente compreende ainda um agente quelante, e em que o agente quelante é HEDP ou outro agente quelante tendo capacidade de quelação igual ou maior ao HEDP sob condições idênticas, em que o dito HEDP ou outro agente quelante está presente em uma concentração de pelo menos 0,25% em peso.

2. Composição de detergente líquido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema tensoativo compreender de 0 a 85% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS).

3. Composição de detergente líquido, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo sistema tensoativo compreender de 10 a 75% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS).

4. Composição de detergente líquido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema tensoativo compreender de 0 a 90% em peso do sistema tensoativo de etersulfato alcoólico, preferivelmente lauriléter sulfato de sódio (SLES).

5. Composição de detergente líquido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender ainda de 0 a 60% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo não iônico.

6. Composição de detergente líquido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender de 5 a 75% em peso do sistema tensoativo de sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS), de 5 a 90% em peso do sistema tensoativo de lauriléter sulfato de sódio (SLES) e de 5 a 60% em peso do sistema tensoativo de um tensoativo não iônico.

7. Composição de detergente líquido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ter um pH de pelo menos 8.

8. Uso de uma alfa-amilase em uma composição de detergente líquido, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pela dita amilase consistir na alfa-amilase de SEQ ID NO: 1 e pela dita alfa-amilase apresentar as substituições G46A+T47I+G105A+I199F ao utilizar a SEQ ID NO: 1 para numeração.

9. Uso de uma alfa-amilase, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser destinado à lavagem de roupas, preferivelmente em temperaturas de 40°C ou menos, ou mais preferivelmente em uma temperatura de 30 °C ou menos ou ainda mais preferivelmente a uma temperatura de 20 °C ou menos.

10. Processo de lavagem de tecidos, caracterizado por compreender a lavagem de um tecido com a composição de detergente líquido, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, preferivelmente a uma temperatura de 40°C ou menos, ou mais preferivelmente a uma temperatura de 30°C ou menos ou ainda mais preferivelmente a uma temperatura de 20°C ou menos.