JP2001521739A - αアミラーゼ変異体 - Google Patents

αアミラーゼ変異体

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JP2001521739A JP2000519071A JP2000519071A JP2001521739A JP 2001521739 A JP2001521739 A JP 2001521739A JP 2000519071 A JP2000519071 A JP 2000519071A JP 2000519071 A JP2000519071 A JP 2000519071A JP 2001521739 A JP2001521739 A JP 2001521739A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Termamyl様αアミラーゼを親として、ｉ）pH８〜10.5におけるpH安定性の向上；及び／又はii）pH８〜10.5におけるCa2+安定性の向上；及び／又はiii ）10〜60℃での比活性の向上という特性変化を少くとも１つ呈する変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 〔発明の分野〕 本発明は、Termamyl様αアミラーゼを親酵素とし、中温及び／又は高pHでより
高い活性を有する変異体に関する。 〔発明の背景〕 αアミラーゼ（α-1,4- グルカン-4- グルカノヒドロラーゼ、EC3.2.1.1)は、
でんぷん並びに直鎖状及び分鎖状の1,4-グルコシド性の少糖及び多糖の加水分解
を触媒する一群の酵素から成る。
【０００２】 この工業的にとても重要な酵素群に関する多数の特許及び科学文献が存在する
。いくつかのαアミラーゼ、例えばTermamyl様αアミラーゼの変異体は、例えば
WO90/11352, WO95/10603, WO95/26397, WO96/23873及びWO96/23874に記載されて
いる。 αアミラーゼに関する最近の文献の中で、WO96/23874には、Termamyl様αアミ
ラーゼの３次元Ｘ線結晶構造解析のデータが報告されている。このαアミラーゼ
は、B. amyloliquefaciensのαアミラーゼ（BAN(登録商標））のＮ末端の300 ア
ミノ酸残基、及びB. licheniformisのαアミラーゼ（市販品Termamyl（登録商標
））のＣ末端アミノ酸301-483 から成り、従って工業的に重要なバチルス菌αア
ミラーゼ（これは、本文中では、用語「Termamyl様αアミラーゼ」に含まれ、特
にB. licheniformis，B. amyloliquefaciens（BAN)及びB. stearothermophilus
(BSG（登録商標))のαアミラーゼを含む）と近縁である。更にWO96/23874は、親
のTermamyl様αアミラーゼの構造分析に基づいて、親酵素と比べて特性が変化し
たTermamyl様αアミラーゼの変異体を設計する方法論が記載されている。 〔発明の簡単な説明〕 本発明は、高pH及び中温で（親酵素に比べて）活性が向上した、Termamyl様α
アミラーゼに由来するαアミロース分解性変異体に関する。
【０００３】 用語「中温」は、本明細書中では、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30
〜40℃を意味する。 用語「高pH」は、今日洗浄の際に用いられるアルカリpHを意味し、特には約８
〜10.5である。 本明細書中では、「低温αアミラーゼ」は、０〜30℃の温度範囲で相対的に至
適な活性を示すαアミラーゼを意味する。
【０００４】 本明細書中では、「中温αアミラーゼ」は、30〜60℃の温度範囲で至適活性を
示すαアミラーゼを意味する。例えばSP690 及びSP722 のαアミラーゼは、各々
「中温αアミラーゼ」である。 本明細書中では、「高温αアミラーゼ」は、60〜110 ℃の温度範囲で至適活性
を示すαアミラーゼを意味する。例えばTermamylは「高温αアミラーゼ」である
。
【０００５】 本発明の変異体において達成され得る特性変化は、以下の特性に関する変化で
ある：pH８〜10.5での酵素安定性、及び／又は、pH８〜10.5でのCa2+安定性、及
び／又は、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃での比活性。 相対至適温度は、しばしば、使用した特定のpHに依存することに注意すべきで
ある。すなわち、例えばpH８で決定された相対至適温度は、pH10で決定されたも
のとは実質的に異なり得る。酵素活性に対する温度の影響 活性部位及びその周囲における動態は、温度及びアミノ酸組成に依存し、酵素
の相対至適温度にとってとても重要である。中温αアミラーゼと高温αアミラー
ゼの動態を比較することによって、中温における高温αアミラーゼの機能にとっ
て重要な領域を決定できる。SP722 αアミラーゼ（配列番号２）及びB. licheni
formisαアミラーゼ（市販品Termamyl、Novo Nordisk) （配列番号４）の温度活
性曲線を図２に示す。
【０００６】 SP722 の相対至適温度、すなわち中温域（30〜60℃）において、その絶対活性
は、相同酵素であるB. licheniformisαアミラーゼより高い。後者は、約60〜10
0 ℃で至適活性を示す。この曲線は、主に、温度安定性、及び活性部位残基とそ
の周囲の動態に依存する。更に、この活性曲線は、使用したpHと活性部位残基の
pKa に依存する。
【０００７】 本発明の第１点目は、Termamyl様αアミラーゼを親とし、αアミラーゼ活性を
有する変異体であって、配列番号２のアミノ酸配列中の以下の変異に相当する変
異を１つ以上含んでいる変異体に関する：T141, K142, F143, D144, F145, P146
, G147, R148, G149, Q174, R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, S193
, N195, H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F173
, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, K311, E346, K385
, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
【０００８】 本発明の変異体は、以下の置換又は欠失を１つ以上有する： T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; E346A, D, R, N, C, Q, G, H, I, K, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K385A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y; T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【０００９】 以下の置換又は欠失を１つ以上有する変異体が好ましい：K142R; S193P; N195
F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174 * ; R181Q, N, S; G182T, S, N; D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H
, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; 189T, S, N, Q。 D183及びG184の位置の欠失、そして更に１つ以上の下記の置換又は欠失を有す
る変異体が特に好ましい：K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311
R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174* ; R181Q, N, S; G182T, S, N;
K185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N
, I, V, R; W189T, S, N, Q 。
【００１０】 前記の本発明の変異体は、親のαアミラーゼに比べて以下の特性を少くとも１
つ呈する改変を有する： ｉ）pH８〜10.5におけるpH安定性の向上；及び／又は ii）pH８〜10.5におけるCa2+安定性の向上；及び／又は iii ）10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温度での比活性の増
加。 更に、この詳細を以下に記す。
【００１１】 更に本発明は、本発明の変異体をコードするDNA 構成体；本発明の変異体の調
製方法；及び、様々な工業製品又は方法において、例えば洗剤又はでんぷんの融
解において、単独で又は他酵素と共に、本発明の変異体を使用することに関する
。 本発明の最後の点は、至適pHの変化、及び／又は至適温度の変化、及び／又は
安定性の向上を伴ったαアミラーゼを提供する方法に関する。命名法 本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の通常の１文字表記及び
３文字表記を使用する。参照を容易にするために、本発明のαアミラーゼ変異体
を、以下の規則で命名記載する：元のアミノ酸：位置：置換アミノ酸。
【００１２】 この命名法に従えば、例えばアスパラギンによる位置30のアラニンの置換を、
Ala30Asn又はA30Nと表し、同位置のアラニンの欠失を、 Ala30* 又は A30* と表
し、そして、追加アミノ酸の挿入を、Ala30AlaLys 又はA30AK と表す。 連続したアミノ酸の欠失、例えばアミノ酸30〜33の欠失は、（30〜33）* 又は
Δ（A30-N33)と表す。
【００１３】 特定のαアミラーゼが、他のαアミラーゼと比べて「欠失」を有していて、そ
の位置に挿入があった場合、例えば位置36にアスパラギン酸が挿入された場合、 * 36Asp 又は *36D と表す。 複数の変異は、＋で分け、例えば位置30と34でアラニンとグルタミン酸が、ア
スパラギンとセリンに各々置換した変異は、Ala30Asp＋Glu34Ser又はA30N＋E34S
と表す。
【００１４】 ある位置に１つ以上のアミノ酸が互換的に挿入される場合、A30N, E 又はA30N
or A30Eと表す。 修飾に適する位置が、修飾が特定されずに示されている場合、その位置のアミ
ノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得ることを示す。従って、位置30のアラニン
の修飾が、特定されずに記載されている場合、そのアラニンが欠失しているか、
又は、任意の他のアミノ酸、すなわち、R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K,
M, F, P, S, T, W, Y, Vの中のいずれかで置換され得ることを示す。 〔発明の詳細な説明〕Termamyl様αアミラーゼ バチルス菌種によって生産されるαアミラーゼは、アミノ酸レベルで高い相同
性を有することが知られている。例えば、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成
るB. licheniformisαアミラーゼ（市販品Termamyl）は、配列番号５のアミノ酸
配列を含んで成るB. amyloliquefacien αアミラーゼに対して約89％相同であり
、配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るB. stearothermophilus αアミラーゼ
に対して約79％相同である。その他の相同なαアミラーゼには、バチルス菌種の
菌株NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513又はDSM 9375に由来するαアミラーゼ
が含まれ、これらは全てWO95/26397に詳細に記載されており、更にTsukamoto et
al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), p
p. 25-31に記載されているαアミラーゼ（配列番号６参照）が含まれる。
【００１５】 更に、相同なαアミラーゼには、EP 0252666に記載されているB. licheniform
isの菌株（ATCC 27811) によって生産されるαアミラーゼ、及びWO91/00353とWO
94/18314に記載されているαアミラーゼも含まれる。その他の市販されているTe
rmamyl様のB. licheniformisαアミラーゼには、製品 Optitherm（登録商標）と
Takatherm（登録商標）（Solvay社製）、 Maxamyl（登録商標）（Gist-brocade
s/Genencor社製) 、 Spezym AA（登録商標）とSpezyme Delta AA（登録商標）（
Genencor社製）、及びKeistase（登録商標）（Daiwa 社製）が含まれる。
【００１６】 これらのαアミラーゼは、実質的に相同なので、αアミラーゼの同一群、すな
わち「Termamyl様αアミラーゼ」群に属すると考えられる。 従って、本明細書では、用語「Termamyl様αアミラーゼ」は、アミノ酸レベル
において、Termamyl、すなわち配列番号４のアミノ酸配列を有するB. lichenifo
rmisαアミラーゼ、に対して実質的に相同なαアミラーゼを意味する。すなわち
、配列番号１，２，３，４，５，６，７又は８のアミノ酸配列、あるいは、WO95
/26397に記載の配列番号１又は２のアミノ酸配列（各々本明細書の配列番号７又
は８のアミノ酸配列に等しい）、又は、Tsukamoto et al., 1988に記載のアミノ
酸配列（本明細書の配列番号６のアミノ酸配列に等しい）を有する前記全てのα
アミラーゼが、「Termamyl様αアミラーゼ」と考えられる。その他のTermamyl様
αアミラーゼは、 ｉ）配列番号１〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して、少くとも60％、例え
ば少くとも70％、例えば少くとも75％、又は、少くとも80％、例えば少くとも85
％、少くとも90％、又は、少くとも95％の相同性を示す、及び／又は、 ii）前記αアミラーゼの少くとも１つに対して作られた抗体と免疫交差反応す
る、及び／又は、 iii ）本明細書の配列番号９，10, 11又は12（各々配列番号１，２，３，４及
び５のアミノ酸配列をコードするDNA 配列）、WO95/26397の配列番号４（停止コ
ドンTAA と合わせて、本明細書の配列番号13のDNA 配列に等しく、本明細書の配
列番号８のアミノ酸配列をコードするDNA 配列）、及びWO95/26397の配列番号５
（本明細書の配列番号14に等しい）から明らかである前記特定のαアミラーゼを
コードするDNA 配列にハイブリダイズするDNA 配列によってコードされる、 αアミラーゼである。
【００１７】 ｉ）の特性に関連して、「相同性」は、任意の通常のアルゴリズム、好ましく
は、GCG パッケージ、バージョン 7.3（1993年６月）の中のGAP プログラムを用
いて、その場合、GAP ペナルティのデフォルト値、すなわちGAP クリエーション
ペナルティ3.0 及びGAP エクステンションペナルティ0.1 において、決定され得
る（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package,
version, 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 。
【００１８】 Termamyl（配列番号４）とTermamyl様αアミラーゼとの間の構造整列によって
、その他のTermamyl様αアミラーゼにおける等価／対応位置を同定できる。この
構造整列を得る１つの方法は、デフォルトのgap ペナルティ値、すなわちgap ク
リエーションペナルティ3.0 及びgap エクステンションペナルティ0.1 において
、GCG パッケージのPile Up プログラムを用いることである。その他の構造整列
する方法には、疎水性クラスター分析（Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTE
RS 224, pp. 149-155)及びリバーススレッディング（Huber, T ; Torda, AE, PR
OTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1, No. 1 pp. 142-149 (1998) がある。
【００１９】 前記のαアミラーゼの特性ii）、すなわち免疫交差反応性は、関連するTermam
yl様αアミラーゼの少くとも１つのエピトープに対して作られた抗体、又はその
エピトープと反応する抗体を用いて検査され得る。モノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体は、ともに、当業界の既存の方法、例えばHudson et al., Practical
Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsに記
載の方法によって作成され得る。免疫交差反応性は、当業界の既存の検査法、例
えば、Hudson et al., 1989 に記載されている通り、ウエスタンブロッティング
法又は放射状免疫拡散法によって決定され得る。この様にして、配列番号１，２
，３，４，５，６，７又は８のアミノ酸配列を有するαアミラーゼ間で、各々免
疫交差反応性が認められた。
【００２０】 前記特性 iii）に従ってTermamyl様αアミラーゼを評価する際に使用されるオ
リゴヌクレオチドプローブは、問題とするαアミラーゼの完全又は部分ヌクレオ
チド又はアミノ酸配列を基にして適切に調製され得る。 検査ハイブリダイゼーションのための適当な条件は、５×SSC 中での予備浸漬
；20％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8 、及
び50mg変性超音波処理子牛胸腺DNA から成る溶液中で40℃で１時間のプレハイブ
リダイゼーション；その後100mM ATP を補充した同上溶液中で〜40℃で18時間の
ハイブリダイゼーション；その後２×SSC 、 0.2％ SDS中で、40℃で（低ストリ
ンジェント性）、好ましくは50℃で（中ストリンジェント性）、より好ましくは
65℃で（高ストリンジェント性）、さらに好ましくは〜75℃で（超高ストリンジ
ェント性）、30分間３回の当フィルターの洗浄を含む。ハイブリダイゼーション
法に関する詳細は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manu
al, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 に記載されている。
【００２１】 本明細書中で、「から得られる、に由来する」は、問題とする生物株によって
生産された、又は生産され得るαアミラーゼだけでなく、その株から単離された
DNA 配列によってコードされるαアミラーゼ、そして、そのDNA 配列によって形
質転換された宿主細胞によって生産されたαアミラーゼをも含む様な意味である
。最後に、当用語は、合成及び／又はcDNA起源のDNA 配列によってコードされ、
そして問題とするαアミラーゼの同定特性を有するαアミラーゼを含んで意味す
る。また当用語は、親のαアミラーゼが、天然に存在するαアミラーゼの変異体
、すなわち、天然のαアミラーゼの１つ以上のアミノ酸残基が修飾（挿入、置換
、欠失）された結果の変異体であり得ることも意味する。親のハイブリッドαアミラーゼ 親のαアミラーゼ（すなわち基幹体αアミラーゼ）は、ハイブリッドαアミラ
ーゼ、すなわち少くとも２つのαアミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み
合せを含んで成るαアミラーゼであってよい。
【００２２】 親のハイブリッドαアミラーゼは、アミノ酸相同性及び／又は免疫交差反応性
及び／又はDNA ハイブリダイゼーション（前記通り）に基づいて、Termamyl様α
アミラーゼ群に属することが決定され得るものでよい。この場合、そのハイブリ
ッドαアミラーゼは、典型的には、Termamyl様αアミラーゼの少くとも１つの部
分と、微生物（細菌又は真菌）及び／又は哺乳動物起源のTermamyl様αアミラー
ゼ又は非Termamyl様αアミラーゼから選ばれた１つ以上の他のαアミラーゼの部
分とを含んで成る。
【００２３】 従って、親のハイブリッドαアミラーゼは、少くとも２つのTermamyl様αアミ
ラーゼに由来する部分アミノ酸の組合せ、少くとも１つのTermamyl様αアミラー
ゼと少くとも１つの非Termamyl様の細菌αアミラーゼとに由来する部分アミノ酸
の組合せ、あるいは、少くとも１つのTermamyl様αアミラーゼと少くとも１つの
真菌αアミラーゼとに由来する部分アミノ酸の組合せを含んで成り得る。この部
分アミノ酸の由来であるTermamyl様αアミラーゼは、例えば、本明細書中に参照
された前記の特定のTermamyl様αアミラーゼのいずれかであってよい。
【００２４】 例えば、親のαアミラーゼは、B. licheniformisの菌株に由来するαアミラー
ゼのＣ末端と、B. amyloliquefaciens又はB. stearothermophilus の菌株に由来
するαアミラーゼのＮ末端部分とを含んで成り得る。例えば、親のαアミラーゼ
は、B. licheniformisαアミラーゼのＣ末端部分の少くとも430 アミノ酸を含ん
でよく、例えば、ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するB. amyloliquefaciens
αアミラーゼのＮ末端の37アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分、及び配列番号
４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼのＣ末端の445 アミノ
酸残基に相当するアミノ酸部分を含むものでよく、あるいは、ハイブリッドのTe
rmamyl様αアミラーゼは、その成熟タンパク質のＮ末端の35アミノ酸残基が、BA
N （成熟タンパク質）、すなわち配列番号５のB. amyloliquefaciensαアミラー
ゼのＮ末端の33残基によって置換されていること以外は、Termamylの配列、すな
わち配列番号４のB. licheniformisαアミラーゼの配列に等しいものでよく、あ
るいは、ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するB. stearothermophilus αアミ
ラーゼのＮ末端の68アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分、及び、配列番号４の
アミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼのＣ末端の415 アミノ酸残
基に相当するアミノ酸部分を含むものでよい。
【００２５】 別の適当な親のハイブリッドαアミラーゼは、WO96/23874 (Novo Nordisk) に
記載されたもので、BAN(B. amyloliquefaciensαアミラーゼ）のＮ末端（成熟タ
ンパク質のアミノ酸１〜300 ）及びTermamylのＣ末端（成熟タンパク質のアミノ
酸 301〜483 ）を含むものである。このハイブリッドαアミラーゼ（BAN : 1-30
0/Termamyl : 301-483) の下記の１つ以上の位置を置換することによって、その
活性が増加した：Q360, F290及びN102。特に興味深い置換は、下記の１つ以上の
置換である：Q36E, D; F290A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T;
N102D, E 。
【００２６】 配列番号２に示したSP722 αアミラーゼ上の対応位置は、S365, Y295及びN106
である。配列番号２のαアミラーゼにおける特に興味深い対応する置換は、下記
の１つ以上の置換である：S365D, E; Y295 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N,
P, Q, R, S, T;及びN106D, E。 配列番号１に示したSP690 αアミラーゼ上の対応位置は、S365, Y295, N106で
ある。これの特に興味深い対応する置換は、下記の１つ以上の置換である：S365
D, E; Y295 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T; N106D, E 。
【００２７】 前記の非Termamyl様αアミラーゼは、例えば、真菌のαアミラーゼ、哺乳動物
又は植物のαアミラーゼ、あるいは細菌のαアミラーゼ（Termamyl様αアミラー
ゼとは異なるもの）である。この様なαアミラーゼの特定の例には、Aspergillu
s oryzae TAKA αアミラーゼ A. niger 酸性αアミラーゼ、Bacillus subtilis
αアミラーゼ、ブタ膵臓αアミラーゼ及び大麦αアミラーゼが含まれる。これら
全てのαアミラーゼは、本明細書中に参照した典型的なTermamyl様αアミラーゼ
の構造とは著しく異なった構造を有することが解明されている。
【００２８】 前記の真菌αアミラーゼ、すなわちA. niger及びA. oryzae 由来のものは、ア
ミノ酸レベルで高度に相同であり、一般に、同一αアミラーゼ群に属すると考え
られる。A. oryzae 由来の真菌αアミラーゼは、商品名Fungamyl（登録商標）と
して市販されている。 更に、Termamyl様αアミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）を、通常の
様式で、特定のTermamyl様αアミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基
の修飾（例えば欠失又は置換）を参照して言及する場合には、相当する位置にお
いて修飾された別のTermamyl様αアミラーゼの変異体も本発明に含まれると解釈
する（相当する位置は、各アミノ酸配列間の考えられる最良のアミノ酸配列の整
列に基づいて決定される）。
【００２９】 本発明の好ましい態様では、このαアミラーゼ基幹体は、（親のTermamyl様α
アミラーゼとして）B. licheniformisに由来するものであり、前記参照例の１つ
、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼで
ある。本発明の変異体の変更された特性 本発明の変異体に存在する変異と、それに帰因する特性の変化（親のTermamyl
様αアミラーゼに対する変化）との間の関係を、以下に考察する。pH８〜10.5での安定性の向上 本発明では、高pH（すなわちpH８〜10.5）での安定性の向上の獲得に関して重
要な変異（アミノ酸置換を含む）には、（配列番号２のアミノ酸配列を有する）
SP722 αアミラーゼにおける１つ以上の下記の位置の変異に相当する変異が含ま
れる：T141, K142, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, R181, A186,
S193, N195, K269, N270, K311, K458, P459, T461。
【００３０】 本発明のこの変異体は、（配列番号２のアミノ酸番号に従い）下記の１つ以上
の置換を有する： T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K181A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, P, K, M, F, S, T, W, Y, V; S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【００３１】 好ましい高pH安定性変異体は、SP722 αアミラーゼ（配列番号２のアミノ酸配
列）における下記の１つ以上の置換を有するものが含まれる：K142R, R181S, A1
86T, S193P, N195F, K269R, N270Y, K311R, K458R, P459T及びT461P 。 特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミ
ラーゼ、又は配列番号３の配列を有するB. stearothermophilus のαアミラーゼ
、又は配列番号４の配列を有するB. licheniformisのαアミラーゼ、又は配列番
号５の配列を有するB. amyloliquefaciensのαアミラーゼを、基幹体、すなわち
親のTermamyl様αアミラーゼとして、前記の修飾のために使用する。
【００３２】 図１の整列から分かる通り、B. stearothermophilus αアミラーゼでは、SP72
2 のN270に対応する位置が既にチロシンである。更に、バチルス菌株NCIB 12512
のαアミラーゼ、B. stearothermophilus αアミラーゼ、B. licheniformisαア
ミラーゼ及びB. amyloliquefaciensαアミラーゼでは、SP722 のK458に対応する
位置が既にアルギニンである。更に、B. licheniformisαアミラーゼでは、SP72
2 のT461に対応する位置が既にプロリンである。従って、これらのαアミラーゼ
においては、それらの置換は適当でない。
【００３３】 高pHで安定性が向上したαアミラーゼ変異体を、実施例２に記した分子動態シ
ュミレーションによって見出した領域において置換を行うことによって、作るこ
とができる。このシュミレーションによって、中pHに比べて、高pH（pH８〜10.5
）で、より高い柔軟性又は運動性を有する領域が示めされる。 WO96/23874 (Novo Nordisk) の付表に開示されている3D構造を有するTermamyl
様αアミラーゼ(BA2) に相同な（下記参照）任意の細菌αアミラーゼの構造を利
用することによって、その様なαアミラーゼの構造をモデル化すること、そして
それに対して分子動態シュミレーションを施すことが可能となる。前記の細菌α
アミラーゼの相同性は、前記Termamyl様αアミラーゼ(BA2) に対して、少くとも
60％、好ましくは70％超、より好ましくは80％超、最も好ましくは90％超であっ
てよく、ただしこれは、GCG パッケージ、バージョン 7.3（1993年６月）の中の
UWGCG GAP プログラムを、デフォルトのGAP ペナルティ値で使用して測定される
（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, ve
rsion 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 ）。
【００３４】 好ましくない残基を別の残基に置換することも適用可能であろう。pH８〜10.5でのCa2+安定性の向上 Ca2+安定性の向上は、Ca2+除去時の酵素安定性が向上することを意味する。本
発明では、高pHでのCa2+安定性の向上の獲得に関して重要な変異（アミノ酸置換
を含む）には、配列番号２のアミノ酸配列を有するSP722 αアミラーゼ中の下記
の位置に対応する１つ以上の位置での変異又は欠失が含まれる：R181, G182, D1
83, G184, K185, A186, W189, N195, N270, E346, K385, K458, P459。
【００３５】 本発明のこの変異体は、１つ以上の下記の置換又は欠失を有する： R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; E346A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K385A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V 。
【００３６】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する変異体が好ましい：R181Q, N; G182T,
S, N; D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S,
T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V; W189T, S, N, Q; N195F; N270R, D; E346Q;
K385R; K458R; P459T 。 特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミ
ラーゼ、又は配列番号５の配列を有するB. amyloliquefaciensαアミラーゼ、又
は配列番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼを、前記変異のため
の基幹体として使用する。
【００３７】 図１の整列から分かる通り、前記B. licheniformisαアミラーゼでは、SP722
のD183及びG184に対応する位置が欠失している。従って、このαアミラーゼにお
いては、それらの置換は適当でない。 好ましい態様では、この変異体は、D183及びG184の欠失、そして更に下記の１
つの置換を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼである：R181Q, N及び
／又はG182T, S, N 及び／又はD183* ; G184* 及び／又はK185A, R, D, C, E, Q
, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V 及び／又はA186T, S, N, I, V 及び
／又はW189T, S, N, Q及び／又はN195F 及び／又はN270R, D及び／又はE346Q 及
び／又はK385R 及び／又はK458R 及び／又はP459T 。中温での比活性の増加 本発明の別の点として、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温
度で比活性が増加する変異体を獲得することに関する重要な変異には、配列番号
２のアミノ酸配列を有するSP722 αアミラーゼの下記の１つ以上の位置に対応す
る変異が含まれる：H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171,
Q172, F173, Q174, D183, G184, N195, F267, W268, K269, N270, D271, L272,
G273, A274, L275, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
【００３８】 本発明のこの変異体は、１つ以上の下記の置換を有する： H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; G184* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y; T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【００３９】 好ましい変異体は、１つ以上の下記の置換又は欠失を有する：Q174* , D183* , G184* , K269S 。 特定の態様では、配列番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼを
、それらの変異の基幹体として用いる。本発明の変異体における一般的変異：中温での比活性の増加 特に興味深いアミノ酸置換は、当酵素の活性部位周辺の運動性を増加させるも
のである。これは、活性部位の近傍、すなわち活性部位を構成する任意の残基か
ら、好ましくは10Å又は８Å又は６Å又は４Å以内の安定な相互作用を壊す変化
によって達成される。
【００４０】 この変異の例には、側鎖の大きさを減少させる変異、例えば下記のものがある
： Ala からGly へ Val からAla 又はGly へ Ile 又はLeu からVal, Ala又はGly へ Thr からSer へ。
【００４１】 この様な変異は、腔の導入又は当変異によって残された空間を満たす構造的再
構築によって、活性部位領域の柔軟性を増加することが期待される。 本発明の変異は、好ましくは、上記概説した変異に加えて、１つ以上の修飾を
含み得る。従って、有利には、修飾される当αアミラーゼ変異体のその部分に存
在する１つ以上のプロリン残基が、天然の任意の可能な非プロリン残基、好まし
くはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン又はロイシンによって置
換され得る。
【００４２】 同様にして、好ましくは、修飾される親のαアミラーゼのアミノ酸残基中に存
在する１つ以上のシステイン残基が、非システイン残基、例えばセリン、アラニ
ン、スレオニン、グリシン、バリン又はロイシンによって置換され得る。 更に、本発明の変異体では、配列番号４のアミノ酸断片 185〜209 に対応する
アミノ酸断片中に存在する１つ以上のAsp 及び／又はGlu が、各々Asu 及び／又
はGln によって、単独で、又は上記概説した修飾のいずれかと共に、置換され得
る。また、Termamyl様αアミラーゼでは、配列番号４のアミノ酸断片 185〜209
に対応するアミノ酸断片中に存在する１つ以上のLys 残基の、Arg による置換も
注目される。
【００４３】 本発明には、２つ以上の上記概説した修飾を組込んだ変異体が含まれると解釈
される。 更に、本明細書中に記載した任意の変異体において、点突然変異を導入するこ
とも有利であろう。活性部位周辺の運動性が増加したαアミラーゼ変異体 本発明のαアミラーゼ変異体の運動性は、基質部位の近傍の１つ以上の位置で
１つ以上のアミノ酸を置換することによって増加し得る。この様な位置は、（配
列番号２のSP722 αアミラーゼの番号に従い）V56, K108, D168, Q169, Q172, L
201, K269, L272, L275, K446, P459 である。
【００４４】 従って、本発明の１つの点は、１つ以上の前記位置に変異を有する変異体に関
する。 好ましい置換は、下記の１つ以上の置換である： V56A, G, S, T; K108A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V; D168A, G, I, V, N, S, T; Q169A, D, G, H, I, L, M, N, S, T, V; Q172A, D, G, H, I, L, M, N, S, T, V; L201A, G, I, V, S, T; K269A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V; L272A, G, I, V, S, T; L275A, G, I, V, S, T; Y295A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, S, T, V; K446A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V; P459A, G, I, L, S, T, V 。
【００４５】 特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミ
ラーゼ、配列番号３の配列を有するB. stearothermophilus αアミラーゼ、配列
番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼ、又は配列番号５の配列を
有するB. amyloliquefaciensαアミラーゼを、これらの変異の基幹体として用い
る。
【００４６】 図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ及びB. amyloliqu
efaciensαアミラーゼは、SP722 のK269に対応する位置にグルタミンを有する。
更に、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のK269に対応する位置に
セリンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適
当ではない。
【００４７】 更に、図１の整列から分かる通り、B. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP
722 のL272に対応する位置にアラニンを有し、B. stearothermophilus αアミラ
ーゼは、SP722 のL272に対応する位置にイソロイシンを有する。従って、これら
のαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。 図１の整列から分かる通り、バチルス菌株12512 のαアミラーゼは、SP722 の
L275に対応する位置にイソロイシンを有する。従って、このαアミラーゼにおい
ては、その置換は適当でない。
【００４８】 図１の整列から分かる通り、B. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP722 の
Y295に対応する位置にフェニルアラニンを有する。更に、B. stearothermophilu
s αアミラーゼは、SP722 のY295に対応する位置にアスパラギンを有する。従っ
て、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。 図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ及びB. amyloliqu
efaciensαアミラーゼは、SP722 のK446に対応する位置にアスパラギンを有する
。更に、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のK446に対応する位置
にヒスチジンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置
換は適当でない。
【００４９】 図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ、B. amyloliquef
aciensαアミラーゼ、及びB. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のP4
59に対応する位置にセリンを有する。更に、バチルス菌株NCIB 12512のαアミラ
ーゼは、SP722 のP459に対応する位置にスレオニンを有する。従って、これらの
αアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。中温で高活性を有する酵素の安定化 別の態様では、本発明は、低温αアミラーゼ（例えばAsteromonas haloplanct
isのもの (Feller et al., (1994), Eur. J. Biochem. 222 : 441-447)) 、及び
中温で活性を有する中温αアミラーゼ（例えばSP722 及びSP690)、すなわち一般
的に好冷性及び好中温性酵素として知られている酵素の安定性の改良に関する。
この特定の酵素群における安定性は、温度安定性、又はカルシウム欠失条件下で
の安定性として解釈され得る。
【００５０】 典型的には、中温で高活性を示す酵素は、酵素にストレスを与える条件、例え
ば温度又はカルシウム欠失において深刻な問題を露呈する。 従って、本発明の対象は、少しばかり負荷のかかった条件下で、その活性を失
うことなく、同時に中温での希望する高活性を示す酵素を提供することである。 中温で測定される当安定化変異体の活性は、酵素安定化前の特定温度における
元々の活性の、好ましくは 100％以上から50％まで、より好ましくは 100％以上
から70％まで、そして最も好ましくは 100％以上から85％までであるべきであろ
う。そして生成した酵素は、野生型酵素に比べて、負荷のかかった条件下でより
長いインキュベーションに耐え得る必要がある。
【００５１】 考え得る酵素には、例えば細菌又は真菌由来のαアミラーゼが含まれる。 その様な低温αアミラーゼの例には、Alteromonas haloplanctisから単離され
たものがある (Feller et al., (1994), Eur. J. Biochem. 222 : 441-447)。こ
のαアミラーゼの結晶構造が解明されている（Aghajari et al., (1988), Prote
in Science 7 : 564-572) 。
【００５２】 このA. haloplanctis αアミラーゼ（AHA)（図４の整列中の第５番）は、ブタ
膵臓αアミラーゼ（PPA)（図４の整列中の第３番）に対して約66％の相同性を示
す。PPA の３Ｄ構造は知られており、Brookhavenデータベースから1OSE又は1DHK
の名称で得ることができる。その他のより安定なαアミラーゼに対する相同性に
基づいて、Alteromonas haloplanctisαアミラーゼに由来する「低温高活性酵素
」の安定化は、中温での希望する高活性の維持と同時に、得ることができる。
【００５３】 図４は、５つのαアミラーゼの配列整列を示すもので、AHA 及びPPA のαアミ
ラーゼを含んでいる。Alteromonas haloplanctisαアミラーゼの安定性を改良す
る特定の変異は、T66P, Q69P, R155P, Q177R, A205P, A232P, L243R, V295P, S3
15R である。αアミラーゼ変異体の調製方法 遺伝子に変異を導入するいくつかの方法が、当業界に知られている。αアミラ
ーゼをコードするDNA 配列のクローニングを簡単に検討した後、そのαアミラー
ゼのコード配列中の特定部位に変異を発生する方法を説明する。αアミラーゼをコードするDNA 配列のクローニング 親のαアミラーゼをコードするDNA 配列を、当業界に周知の種々の方法によっ
て、そのαアミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離し得る。最初に
、ゲノムDNA 及び／又はcDNAのライブラリーを、研究対象のαアミラーゼを生産
する生物体に由来する染色体DNA 又はメッセンジャーRNA を用いて構築する必要
がある。次に、そのαアミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同の標
識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを用いて、問題とする生物体から
調製したゲノムライブラリーから、αアミラーゼをコードするクローンを同定し
得る。あるいは、既知のαアミラーゼ遺伝子に相同な配列を有する標識オリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、より低いストリンジェント性条件下でのハイブリ
ダイゼーション及び洗浄によって、αアミラーゼをコードするクローンを同定し
得る。
【００５４】 αアミラーゼをコードするクローンを同定する更に別の方法は、ゲノムDNA の
断片を、発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、できたゲノムDNA ライブラ
リーによってαアミラーゼ陰性の細菌を形質転換し、αアミラーゼの基質を含有
するアガープレートに、形質転換した細菌をまき、それによって、同定する対象
のαアミラーゼを発現するクローンを得ること、を含んで成る。
【００５５】 あるいは、当酵素をコードするDNA 配列を、確立した標準的な方法、例えばS.
L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) に記載されたホスホロアミダイト法又
はMatthes et al. (1984) に記載された方法によって、合成調製してもよい。ホ
スホロアミダイト法では、例えば自動DNA 合成装置によって、オリゴヌクレオチ
ドを合成し、精製し、アニールし、適当なベクター中に連結して、クローン化す
る。
【００５６】 最後に、当DNA 配列は、ゲノム由来と合成由来の混合物、合成由来とcDNA由来
の混合物、又はゲノム由来とcDNA由来の混合物であってよく、これらは、合成由
来、ゲノム由来又はcDNA由来の断片（完全な当DNA 配列の種々の部域に対応する
適当な断片としてのもの）を、標準的な方法に従って連結することによって調製
され得る。当DNA 配列を、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR
) によって、例えばUS 4,683,202又は R.K. Saiki et al. (1988) に記載されて
いる通りに、調製してもよい。αアミラーゼ変異体の発現 本発明では、上記方法又は当業界で既知の代替方法によって作成された変異体
をコードするDNA 配列を、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソー
ム結合部位、翻訳開始シグナル、及び、場合によってリプレッサー遺伝子又は種
々のアクチベーター遺伝子を含んだ発現ベクターを用いて、酵素の形で発現させ
ることができる。
【００５７】 本発明のαアミラーゼ変異体をコードするDNA 配列を運搬する組換え発現ベク
ターは、DNA 組換え技術を簡便に施すことが可能な任意のベクターであってよく
、当ベクターの選択は、それを導入する宿主細胞にしばしば依存する。従って、
当ベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外に全体が存在して、染
色体複製とは独立に複製するベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ
又は染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であり得る。あるいは、当ベクタ
ーは、宿主細胞内に導入された場合、その宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そして
組込まれた染色体と共に複製するベクターであり得る。
【００５８】 ベクター内では、当DNA 配列は、適当なプロモーター配列に作用可能に連結さ
れる必要がある。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示
す任意のDNA 配列であり、その宿主細胞に対して同種性又は異種性のタンパク質
をコードする遺伝子から得られるものでよい。本発明のαアミラーゼ変異体をコ
ードするDNA 配列の転写を指令するために適したプロモーターの例は、選択した
宿主細胞において転写活性を示し、その宿主細胞に対して同種性又は異種性のタ
ンパク質をコードする遺伝子から得られ得る配列である。本発明のαアミラーゼ
変異体をコードするDNA 配列の転写を指令するために適したプロモーターの、特
に細菌宿主における例は、E. coli のlac オペロン、Streptomyces coelicolor
のアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター、Bacillus licheniformisαアミラーゼ
遺伝子（amyL) のプロモーター、Bacillus stearothermophilus マルトース生成
アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、Bacillus amyloliquefaciensαアミ
ラーゼ（amyQ）のプロモーター、Bacillus subtilis xylA及びxylB遺伝子のプロ
モーターなどである。真菌宿主での転写に有用なプロモーターの例は、A. oryza
e TAKAアミラーゼ、Rhizomucor miehei アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. nig
er中性αアミラーゼ、A. niger酸安定性αアミラーゼ、A. nigerグルコアミラー
ゼ、Rhizomucor miehei リパーゼ、A. oryzae アルカリプロテアーゼ、A. oryza
e トリオースリン酸イソメラーゼ、又はA. nidulans アセトアミダーゼ、をコー
ドする遺伝子に由来するものである。
【００５９】 本発明の発現ベクターは、適当な転写ターミネーター、そして真核生物の場合
には、ポリアデニル化配列を含み得、これらは、本発明のαアミラーゼ変異体を
コードするDNA 配列に作用可能に連結される。この停止配列及びポリアデニル化
配列を、プロモーターと同一の起源から適切に得ることができる。 当ベクターは、更に、問題の宿主細胞中で当ベクターを複製可能にするDNA 配
列を含んでよい。その様な配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, p
E194, pAMB1 及びpIJ702内の複製起点である。
【００６０】 当ベクターは、更に、選択マーカー、例えば、宿主細胞内の欠損を補完する産
物の遺伝子、例えば、B. subtilis 又はB. licheniformis由来のdal 遺伝子、あ
るいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリ
ンなどの抗生物質への耐性を付与する遺伝子、を含んでもよい。更に、当ベクタ
ーは、アスペルギルス菌の選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD及びsC、すな
わちハイグロマイシン耐性を付与するマーカーを含んでもよいし、あるいは、例
えばWO91/17243に記載の通り、共（同時）形質転換を介して選択を行ってもよい
。
【００６１】 ある観点で、例えば宿主細胞として細菌を用いる場合、細胞内発現が有利であ
るかもしれないが、一般的には、細胞外発現が好ましい。一般に、本明細書に記
載されているバチルス菌αアミラーゼは、培地中に発現プロテアーゼを分泌させ
る前領域を含む。希望する場合、この前領域を、異なる前領域又はシグナル配列
によって置換してもよい。これは、各々の前領域をコードするDNA 配列の置換に
よって簡便に達成される。
【００６２】 αアミラーゼ変異体をコードする本発明のDNA 構成体、プロモーター、ターミ
ネーター及びその他の要素を各々連結する方法、並びに、それらを、複製に必要
な情報を含有する適当なベクターに挿入する方法は、当業者に周知である（例え
ば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboraotry Manual, 2nd Ed., C
old Spring Harbor, 1989)。
【００６３】 前記通りの本発明のDNA 構成体又は発現ベクターのいずれかを含んでいる本発
明の細胞を、本発明のαアミラーゼ変異体の組換え生産において、宿主細胞とし
て使用することが有利である。この細胞は、本変異体をコードする本発明のDNA
構成体によって形質転換され得る。これは、宿主染色体に、そのDNA 構成体を（
１以上のコピー数で）組込むことによって簡便になされる。この組込みは、その
DNA 配列が細胞内で安定に維持される可能性がより高いので、一般に有利である
だろう。宿主染色体へのDNA 構成体の組込みは、従来の方法に従い、例えば相同
又は非相同組換えによって、行なわれ得る。あるいは、異なるタイプの宿主細胞
において、前記の発現ベクターによって細胞を形質転換してもよい。
【００６４】 適当な細菌の例は、グラム陽性菌、例えばBacillus subtilis, Bacillus lich
eniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus
, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thur
ingiensis 、又はStreptomyces lividans 若しくはStreptomyces murinus、ある
いはグラム陰性菌、例えばE. coli である。細菌の形質転換は、例えば、プロト
プラスト又はコンピテント細胞を用いて、既知の方法に従って行われ得る。
【００６５】 酵母菌を、好ましくはSaccharomyces 又はSchizosaccharomyces の菌種、例え
ばSaccharomyces cerevisiaeから選択し得る。糸状真菌は、アスペルギルス菌種
、例えばA. oryzae 又はA. nigerが有利であろう。真菌の形質転換は、既知の方
法に従い、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、そして細胞壁の再
生を含んで成る方法で行われ得る。アスペルギルス菌宿主細胞の形質転換に適す
る方法が、EP 238023 に記載されている。
【００６６】 更に別の点として、本発明は、本発明のαアミラーゼ変異体を生産する方法に
関し、この方法は、その変異体の生産を誘導する条件下で前記宿主細胞を培養す
ること、そしてその細胞及び／又は培地から当変異体を回収することを含んで成
る。 当細胞を培養する培地は、問題の宿主細胞を増殖させて、そして本発明のαア
ミラーゼ変異体を発現させるために適した任意の通常の培地でよい。適当な培地
を、業者から購入できるし、又は報告された組成（例えばAmerican Type Cultur
e Collectionのカタログに記載されたもの）に従って調製してもよい。
【００６７】 その宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体を、その培地から周知の方法
によって簡便に回収することができ、その方法には、遠心又は濾過による培地か
らの細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる培地中タンパク質成分の沈
殿、そしてクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和
性クロマトグラフィーなどの使用が含まれる。産業上の利用性 本発明のαアミラーゼ変異体は、産業において様々に利用されるための貴重な
特性を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗浄用、食器洗浄用及び硬質表面
洗浄用の洗浄組成物における成分として使用可能である。
【００６８】 多数の変異体が、でんぷんからの甘味料及びエタノール生産、及び／又は繊維
品の糊抜きのために、特に有用である。通常のでんぷん変換、例えばでんぷんの
液化及び／又は糖化、の条件が、例えばUS 3,912,590、並びにEP特許公報 252,7
30及び63,909に記載されている。洗浄組成物 前記通り、本発明の変異体を、適当に洗浄組成物中に組込むことができる。洗
浄組成物（例えば洗濯用又は食器用洗剤）中の適当な成分、その様な洗浄組成物
に本変異体を配合する適当な方法に関して、そして適当な種類の洗浄組成物の例
に関して、例えばWO96/23874及びWO97/07202を参照する。
【００６９】 本発明の変異体を含有する洗浄組成物は、更に、１種以上の他の酵素、例えば
リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はラッ
カーゼ、及び／又はその他のαアミラーゼを含んでよい。 本発明のαアミラーゼ変異体を、通常使用される濃度になる様に、洗浄組成物
中に組込み得る。現在、本発明の変異体を、洗剤の通常の添加レベルに従って、
洗浄／食器洗浄液１リッターあたり 0.00001〜１mg（純粋な活性酵素タンパク質
として）に相当する量で組込み得ると考えられる。
【００７０】 本発明は、また、１）至適pHが変化した、及び／又は、２）至適温度が変化し
た、及び／又は、３）安定性が向上した、αアミラーゼを提供する方法に関し、
本方法は、以下の過程を含んで成る： ｉ）pH、温度及び／又は安定性の実質的に異なる特性を有する２つ以上のαア
ミラーゼの３Ｄ構造の分子動態を比較することによって、そのαアミラーゼの変
異のための標的位置及び／又は領域を同定すること； ii）それらの同定された位置及び／又は領域において、１つ以上のアミノ酸を
置換、付加及び／又は欠損すること。
【００７１】 本発明の態様では、中温αアミラーゼを、高温αアミラーゼと比較する。別の
態様では、低温αアミラーゼを、中温又は高温αアミラーゼのいずれかと比較す
る。 比較するαアミラーゼは、相互に、好ましくは少くとも70％、好ましくは80％
、90％まで、例えば95％まで、特には95％相同である必要がある。
【００７２】 比較するαアミラーゼは、前記通り、Termamyl様αアミラーゼでよい。特定の
態様では、比較するαアミラーゼは、配列番号１〜８に示すαアミラーゼである
。 別の態様では、比較する問題のαアミラーゼの安定性の特性は、Ca2+依存的な
特性である。 〔材料と方法〕酵素 SP722 （配列番号２、Novo Nordiskから購入可） Termamyl（配列番号４、Novo Nordiskから購入可） SP690 （配列番号１、Novo Nordiskから購入可） バチルス・ズブチリスSHA273 : WO95/10603 参照プラスミド pJE1は、SP722 αアミラーゼの変異体、すなわち、その成熟タンパク質のアミ
ノ酸D183−G184に対応する６ヌクレオチドが欠失した変異体をコードする遺伝子
を含む。そのJE1 遺伝子の転写は、amyLプロモーターに支配される。このプラス
ミドは、更に、プラスミドpUB110 (Gryczan, TJ et al. (1978) J. Bact. 134 :
318-329) に由来する複製起点、及びカナマイシン耐性を付与するcat 遺伝子を
含む。 ＜方法＞ライブラリーベクターpDorK101の構築 大腸菌中でαアミラーゼを発現させることなく変異を導入し、そしてバチルス
菌中でαアミラーゼが活性を示す様に修飾するために、大腸菌／バチルス菌シャ
トルベクターpDorK101（下記）を使用し得る。このベクターを下記の様に構築し
た。pJE1において、大腸菌の複製起点を含有する 1.2kb断片によって、配列番号
２の５’コード領域にあるPstI部位のところで遺伝子を中断することによって、
JE1 コード遺伝子（D183−G184を欠失したSP722)を不活性化した。順方向プライ
マー：5'-gacctgcagtcaggcaacta-3'及び逆方向プライマー：5'-tagagtcgacctgca
ggcat-3'を用いて、pUC19 (GenBankアクセスNo. X02514) から、PCR によって前
記断片を増幅した。PCR 増幅断片及びpJE1ベクターを、PstIによって37℃で２時
間消化した。そのpJE1ベクター断片とPCR 断片とを、室温で１時間連結し、それ
によって大腸菌を電気的な方法で形質転換した。できたベクターをpDorK101と称
する。フィルタースクリーニング検査 この検査法を用いて、親酵素に比べて高pHにおいて安定性が向上したTermamyl
様αアミラーゼ変異体を、並びに、スクリーニング時の設定温度に応じて、親酵
素に比べて高pH及び中温において安定性が向上したTermamyl様αアミラーゼ変異
体をスクリーニングし得る。高pHフィルター検査 バチルス菌ライブラリーを、カナマイシン10μｇ／mlを含有するTYアガープレ
ート上の酢酸セルロースフィルター（OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, G
ermany) とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuel
l, Dassel, Germany) とのサンドイッチフィルター上にまき、少くとも21時間37
℃でインキュベーションする。酢酸セルロース層をTYアガープレートにのせる。
【００７３】 プレートにまいた後、フィルター上で陽性変異体の位置を決めるために、イン
キュベーション前に、各サンドイッチフィルターに針で目印を付ける。変異体が
結合したニトロセルロースフィルターを、グリシン／NaOH緩衝液（pH8.6 〜10.6
）が入った容器に移し、そして15分間室温で（10〜60℃の範囲で変更可能）イン
キュベーションする。コロニーが結合した酢酸セルロースフィルターを、使用す
るまで、室温でTYプレート上で保存する。インキュベーション後、１％アガロー
ス、 0.2％でんぷん及びグリシン／NaOH緩衝液（pH8.6 〜10.6）を含んで成るプ
レート上で、残存する活性を検出する。そのニトロセルロースフィルターをのせ
た検査用プレートに、前記サンドイッチフィルターの場合と同様に、目印を付け
、そして２時間室温でインキュベーションする。フィルターを除いた後、その検
査用プレートを、10％ Lugol溶液で染色する。でんぷんを分解する変異体を、暗
青色の背景に白点として検出し、そして保存プレート上で同定する。陽性変異体
を、１回目のスクリーニング法と同一条件で、２度再スクリーニングする。低カルシウムフィルター検査 バチルス菌ライブラリーを、適当な抗生物質、例えばカナマイシン又はクロラ
ムフェニコールを含有するTYアガープレート上の酢酸セルロースフィルター（OE
67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とニトロセルロースフィルター
（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とのサンドイッチ
フィルター上にまき、少くとも21時間37℃でインキュベーションする。酢酸セル
ロース層をTYアガープレートにのせる。
【００７４】 プレートにまいた後、フィルター上で陽性変異体の位置を決めるために、イン
キュベーション前に、各サンドイッチフィルターに針で目印を付ける。変異体が
結合したニトロセルロースフィルターを、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH8.5 〜10
）及び異なった濃度の EDTA (0.001mM〜100mM)が入った容器に移す。そのフィル
ターを１時間室温でインキュベーションする。コロニーが結合した酢酸セルロー
スフィルターを、使用するまで、室温でTYプレート上で保存する。インキュベー
ション後、１％アガロース、 0.2％でんぷん及び炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH8.
5 〜10）を含んで成るプレート上で、残存する活性を検出する。そのニトロセル
ロースフィルターをのせた検査用プレートに、前記サンドイッチフィルターの場
合と同様に、目印を付け、そして２時間室温でインキュベーションする。フィル
ターを除いた後、その検査用プレートを、10％ Lugol溶液で染色する。でんぷん
を分解する変異体を、暗青色の背景に白点として検出し、そして保存プレート上
で同定する。陽性変異体を、１回目のスクリーニング法と同一条件で、２度再ス
クリーニングする。注目する領域を得る方法 ３つの細菌αアミラーゼの３Ｄ構造が既知である。その中に、２つのB. liche
niformisαアミラーゼ、Brookhavenデータベースの1BPL (Machius et al. (1995
), J. Mol. Biol. 246, p. 545-559) 及び1VJS (Song et al. (1996), Enzymes
for Carbohydrate 163 Engineering (Prog. Biotechnol. V 12) ）がある。これ
らの２つの構造では、２つのカルシウムイオン及び１つのナトリウムイオンの結
合部位の周辺領域において、いわゆるＢドメインから構造内の重要な断片が欠失
している。従って、本発明者は、αアミラーゼ BA2 (WO96/23874 ; BAN（配列番
号５）とB. licheniformisαアミラーゼ（配列番号４）とのハイブリッド）の３
Ｄ構造を用いた。その構造を基にして、B. licheniformisαアミラーゼ及びSP72
2 αアミラーゼのモデルを構築した。αアミラーゼ変異体の発酵と精製 当業界に周知の方法によって、発酵と精製を行い得る。安定性の決定 全ての安定性試験を、同一の設定で行う。その方法を以下に示す。適当な条件
下（１〜４）で、当酵素をインキュベーションする。種々の時点で、例えば０，
５，10，15及び30分後に試料を採取し、検査用緩衝液(0.1Ｍ 50mM Britton 緩衝
液pH7.3)中に25倍希釈する。 pH7.3, 37℃の標準条件下でPhadebas検査(Pharmac
ia) によって、活性を測定する。
【００７５】 インキュベーション前（０分時）に測定した活性を、参照値(100％）として用
いる。減少％を、インキュベーション時間の関数として計算する。表では、例え
ばインキュベーション30分後の残存活性を示す。比活性の決定 Phadebas検査(Pharmacia) を用いて、活性／mg酵素として比活性を決定する。
その製造業者の取扱説明に従う（次の「αアミラーゼ活性の検査」を参照する）
。αアミラーゼ活性の検査 １．Phadebas検査 基質としてPhadebas（登録商標）錠剤を用いる方法によって、αアミラーゼ活
性を決定する。Phadebas錠剤（Phadebas Amylase Test, Pharmacia Diagnostic)
は、ウシ血清アルブミン及び緩衝剤と混合した架橋不溶性青色でんぷんポリマー
を含んだ錠剤である。
【００７６】 １回の測定毎に、１錠を、５mlの50mM Britton-Robinson 緩衝液（50mM酢酸、
50mMリン酸、50mMホウ酸、0.1mM CaCl2 、そしてNaOHでpHを設定値に合わせる）
を含んだ試験管に懸濁する。設定温度の水浴中で検査を行う。検査する対象のα
アミラーゼを、ｘmlの50mM Britton-Robinson 緩衝液中に希釈する。このαアミ
ラーゼ溶液１mlを、５mlの50mM Britton-Robinson 緩衝液に加える。でんぷんが
αアミラーゼによって加水分解され、可溶性青色断片が生じる。生じた青色溶液
を 620nmで分光光度計で測定した吸光度が、αアミラーゼ活性の関数である。
【００７７】 インキュベーション10分又は15分後（検査時間）に測定した 620nmの吸光度が
、 0.2〜２吸光単位の範囲にあることが重要である。この吸光度の範囲において
、活性と吸光度との間に比例関係が存在する（ランベルト・ベールの法則）。従
って、この基準に合う様に、酵素の希釈を調整する必要がある。特定の条件設定
（温度、pH、反応時間、緩衝液条件）下で、あるαアミラーゼ１mgが、一定量の
基質を加水分解し、そして青色が生じる。この色の強度を 620nmで測定する。一
定の条件設定下では、測定された吸光度は、問題のαアミラーゼの比活性（活性
／mg純粋αアミラーゼタンパク質）に正比例する。 ２．代替方法 PNP-G7を基質として使用する方法によって、αアミラーゼ活性を決定する。PN
P-G7（p-ニトロフェニル- α, D-マルトヘプタオシドの略称）は、エンドアミラ
ーゼによって切断され得る保護化オリゴ糖である。切断後、キットに含まれるα
グルコシダーゼによって、その基質が消化されて、遊離のPNP 分子が放出される
。この分子は黄色であり、波長 405nm（400 〜420nm)の可視分光光度計によって
測定される。PNP-G7基質及びαグルコシダーゼを含有するキットが、Boehringer
-Mannheim 社（カタログ番号1054635)から製造販売されている。
【００７８】 その基質を調製するために、基質１ボトル（BM 1442309) を５ml緩衝液（BM 1
442309) に加える。αグルコシダーゼを調製するために、αグルコシダーゼ１ボ
トル（BM 1462309) を45ml緩衝液（BM 1442309) に加える。このαグルコシダー
ゼ溶液５mlと基質溶液 0.5mlとを混合して、作業溶液を作る。 この検査では、酵素溶液20μｌを96ウェルマイクロタイタープレートに加え、
25℃でインキュベーションする。25℃の作業溶液 200mlを追加する。この溶液を
混合し、１分間インキュベーションしてから、 405nmの吸光度を、３分間に亘っ
て15秒毎に測定する。
【００７９】 一定の条件設定下では、その吸光度の時間変化曲線の傾きは、問題のαアミラ
ーゼの比活性（活性／mg酵素）に正比例する。DOPEプログラムを用いたランダム変異誘発の一般方法 以下の過程に従って、ランダム変異誘発を行い得る： １．親酵素において、修飾のための注目領域を選択する； ２．選択領域において、変異部位と非変異部位を決定する； ３．誘発する変異の種類を、例えば、構築する変異体の希望する安定性及び／又
は性能に応じて、決定する； ４．構造的に合理的な変異を選択する； ５．過程４に応じて過程３に従って選択される残基を調整する； ６．適当なdopeアルゴリズムに従って、ヌクレオチド分布を分析する； ７．必要がある場合には、必要とされる残基を遺伝子コードの実際に合わせる（
例えば、（例えば停止コドンの導入を避けるために）遺伝子コードから生じる制
約を考慮する）（あるコドンの組合せが実際には使用できないことが当業者に知
られており、従って調整が必要となる）； ８．プライマーを作る； ９．そのプライマーを用いて、ランダム変異誘発を行う； 10．希望する特性の向上をスクリーニングすることによって、生じたαアミラー
ゼ変異体を選択する。
【００８０】 過程６で使用するために適したdopeアルゴリズムは、当業界に周知である。１
つのアルゴリズムが、Tomandl, D. et al., Journal of Computer-Aided Molecu
lar Design, 11 (1997), pp. 29-38) に記載されている。もう１つのアルゴリズ
ムDOPEについて、以下に記す。dopeプログラム 「DOPE」プログラムは、必要とされるアミノ酸分布に最も近似するアミノ酸分
布をコードする様に、三連コドンのヌクレオチド組成を最適化するために有用な
コンピュータプログラムである。可能な分布のうちのいずれが、必要とされるア
ミノ酸分布に最も近似しているかを評価するために、評価関数が必要である。「
DOPE」プログラムでは、以下の関数が適すると認められた：
【００８１】
【数１】
【００８２】 式中、ｘi は、当プログラムによって計算して得られた、アミノ酸及びアミノ酸
の基の量であり、ｙi は、当プログラムの使用者によって決められた、アミノ酸
及びアミノ酸の基の必要とされる量であり（例えば、通常の20アミノ酸又は停止
コドンのうちのいずれが、例えばある割合（例えば90％ Ala, ３％ Ile, ７％ V
al) にて、導入されることが必要とされるかを特定する）、そしてｗi は、当プ
ログラムの使用者によって決められた、割当の荷重係数である（例えば、問題の
位置に挿入される特定のアミノ酸残基を有することの重要性に依存する）。Ｎは
、当プログラムの使用者によって決められたアミノ酸基の数＋21である。この関
数のために、０0 を１とする。
【００８３】 この関数の最大値を見い出すために、Monte-Carlo アルゴリズム（１つの例が
、Valleau, J.P. & Whittington, S.G. (1977) A guide to Mont Carlo for sta
tistical mechanics : 1 Highways 。In“Stastistical Mechanics, Part A”Eq
ulibrium Techniqeues ed. B.J. Berne, New York : Plenumに記載されている）
を用いる。各反復において、以下の過程が行われる： １．各塩基において、新しいランダムなヌクレオチド組成が選択され、その場合
、その時の組成と新しい組成との間の絶対差が、当コドンの３つの全ての位置が
、４つのヌクレオチドＧ，Ａ，Ｔ，Ｃの各々である場合のｄよりも小さいか、又
は等しい（ｄの定義は下記参照のこと）。 ２．新しい組成の評価点と、その時の組成の評価点とを、前記の関数ｓを用いて
比較する。新しい評価点が、その時の評価点よりも大きいか、又は等しい場合に
は、新しい組成を保持し、その時の組成を新しい組成に変える。新しい評価点が
より小さい場合には、新しい組成を保持する確率は、exp [1000 [新しい評価点
−その時の評価点]]である。
【００８４】 １サイクルは、標準的には、前記の反復過程1000回から成り、その場合、ｄは
、１から０へ直線的に減少する。最適化においては、 100回以上のサイクルを行
う。最高の評価点を得たヌクレオチド組成が、最後に提示される。 〔実施例〕 実施例１：Termamylの相同性構築の例 B. licheniformisαアミラーゼ（以下Termamylとする）の、その他のTermamyl
様αアミラーゼに対する総体的な相同性は高く、そしてその相似率は極端に高い
。GCG プログラム（University of Wisconsin Genetics Computer Group's prog
ram)を用いて計算された、 BSG（配列番号３を有するB. stearothermophilus α
アミラーゼ）、及び BAN（配列番号５を有するB. awyloliquefaciensαアミラー
ゼ）に対するTermamylの相似率は、各々89％及び78％であった。Termamylは、BA
N 及びBSG と比べて、残基G180とK181との間の２残基が欠失している。BSG は、
BAN 及びTermamylと比べて、G371とI372との間の３残基が欠失している。Ｎ末端
において、BSG と比べて、BAN は２残基少く、そしてTermamylは１残基少い。
【００８５】 B. licheniformisαアミラーゼ（Termamyl）及びB. awyloliquefaciensαアミ
ラーゼ(BAN) の各構造のモデルが、WO96/23974の付表１に開示されている構造に
基づいて構築された。他のTermamyl様αアミラーゼ（例えば本明細書に開示した
もの）の構造も、同様なやり方で構築し得る。 構造を解明するために用いられるαアミラーゼと比べて、Termamylは、 178〜
182 付近の２つの残基が欠失している点で、異なっている。モデル構造において
、これを補うために、BIOSYMのHOMOLOGYプログラムを用いて、欠失点を除いて、
当構造の相当する位置（構造的に保存された領域だけでなく）における残基を置
換した。Termamyl（BAN)におけるG179 (G177) とK180 (K180) との間でペプチド
結合を成立させた。解明された構造とモデル構造との間の構造上の密接な関係（
従って後者の有効性）が、モデルにおいて相互にあまりに近接していることが判
明した原子が、非常にほんの少ししか存在しないことから指摘される。
【００８６】 次にINSIGHT プログラムによって、この非常に粗いTermamylの構造に、解明さ
れた構造の場合（WO96/23874の付表１参照）と同じ座標で、その解明された構造
に由来する全ての水(605個）及びイオン（４カルシウムと１ナトリウム）を付け
加えた。この場合、ほんの少しの重複しか認められず、すなわち非常に良好な適
合が認められた。次に、このモデル構造を、200 過程の急勾配降下（Steepest d
escent) 及び600 過程の共役勾配（Conjugated gradient)によって最小化した（
Brooks et al., 1983, J. Computational Chemistry 4, p. 187-217)。次に、こ
の最小化構造に分子動力学を適用し、35psを超えて 200psの平衡まで、５psの加
熱を行った。この動力学は、Verletアルゴリズムに従って運用され、Behrendsen
による水環境との共役（Berendsen et al., 1984, J. Chemical Physics 81, p.
3684-3690) に従って平衡温度 300Ｋを維持した。ピコ秒毎に回転と並進を取り
出した。 実施例２：pH安定性の向上及び温度依存的な活性の変化を示すαアミラーゼ変異体を同定す るために重要な領域を導き出す方法 注目の酵素、ここではSP722 とTermamyl、のＸ線解析構造及び／又はモデル構
築構造に対して、分子動力学的シュミレーションを行う。この分子動力学的シュ
ミレーションを、CHARMM (Molecular simulations (MSI））プログラム又はその
他の適当なプログラム、例えば DISCOVER (MSI) によって行う。この分子動力学
的分析を、孤立状態、あるいは、より好ましくは、結晶水を含んだ状態、又は、
水中に、例えば水球若しくは水箱中に埋め込まれた状態、の酵素に対して行う。
このシュミレーションを、 300ピコ秒（ps）又はそれ以上、例えば 300〜1200ps
の期間運用する。前記構造のＣα炭素に関して、等方性振動を取り出し、前記構
造間で比較する。一方の配列中に欠失及び／又は挿入がある場合、他方の構造に
由来する等方性振動をはめ込み、等方性変動の差を０にする。等方性振動の説明
に関して、CHARMMの使用説明書（MSI から入手できる）を参照すること。
【００８７】 荷電性アミノ酸に対する標準的な荷電に従って、この分子動力学的シュミレー
ションを行うことができる。すなわち、Asp 及びGlu は陰性荷電され、そしてLy
s 及びArg は陽性荷電される。この条件は、約７の中性pHを近似する。より高い
又は低いpHで分析するために、標準滴定可能な残基の変化したpKa を通常pH２〜
10の範囲内で得て、当分子の滴定を行うことができる。この様な残基は、Lys, A
rg, Asp, Glu, Tyr 及びHis である。また、Set, Thr及びCys は滴定可能である
が、ここでは考慮しない。ここで、pHのために変化した荷電に関して、高pHでは
、Asp 及びGlu は陰性であり、Arg 及びLys は非荷電である。これは、約10〜11
のpHを近似していて、この場合、Lys 及びArg の標準pKa が約９〜11であるとし
て、これらの残基の滴定を開始する。 １．高pH安定性を有するαアミラーゼ変異体を同定するために重要な領域を導き
出すために用いる方法： pH安定性が改良された変異体を構築するために重要な領域は、極端なpHにおい
て最良の運動性を示す領域、すなわち最大の等方性振動を有する領域である。
【００８８】 この様な領域は、以下の２つの分子動力学シュミレーションを行うことによっ
て同定される：ｉ）塩基性アミノ酸Lys 及びArg が中性であり（すなわちプロト
ン化されていない）、そして酸性アミノ酸Asp 及びGlu が荷電（−１）を有する
高pHでの運用、並びに、ii）塩基性アミノ酸Lys 及びArg が正味の荷電（＋１）
を有し、そして前記酸性アミノ酸が荷電（−１）を有する中性pHでの運用。
【００８９】 この２つの運用を比較して、中性pHに比べて高pHにて相対的により高い運動性
を示す領域を同定した。 一般的な安定性、例えば水素結合、を向上させる残基、その領域をより硬直に
する（例えば、グリシン残基のプロリン置換などの変異による）残基、あるいは
、荷電又は残基間相互作用を向上させる残基を導入することによって、当酵素の
高pH安定性が向上する。 ２．中温での活性が増加したαアミラーゼ変異体を同定するための領域を取り出
す方法： 中温での活性が増加した変異体を構築するために重要な領域を、SP722 とTerm
amylとの等方性振動の差、すなわちSP722 でのＣαの等方性振動からTermamylで
のものを引いた差から、見い出した。その等方性振動の運動性が最大である領域
を選択した。この様な領域及びそこの残基が、中温での活性を増加させると期待
された。それらの残基に適切な運動性が存在する場合には、αアミラーゼの活性
が発現するだけである。それらの残基の運動性があまりに低い場合、活性は低下
又は消滅する。 実施例３：局所的ランダムdope変異誘発法による、親酵素と比べて中温でのCa2+安定性が向 上したTermamyl様αアミラーゼの構築 低カルシウム濃度におけるαアミラーゼの安定性を改良するために、予じめ選
択した領域で、ランダム変異誘発を行った。 領域：SAI 残基：R181-W189 停止コドンの量を最小化する様に、SAI 領域において示唆された各変異のため
の導入（spiked）コドンを決定するために、DOPEプログラム（「材料と方法」参
照）を用いた（表１）。示唆された一群のアミノ酸変異を得るために、そのコド
ンの３つの位置において、ヌクレオチドの正確な分布を計算した。希望の残基に
する確率を高くするために、指示された位置において特異的に対象領域を処理し
たが、それでもなお他の可能性もあり得る。 表１： 各位置におけるアミノ酸残基の分布 ───────────────────────────────── R181: 72% R, 2% N, 7% Q, 4% H, 4% K, 11% S G182: 73% G, 13% A, 12% S, 2% T K185: 95% K, 5% R A186: 50% A, 4% N, 6% D, 1% E, 1% G, 1% K, 5% S, 31% T W187: 100% W D188: 100% D W189: 92% W, 8% S ───────────────────────────────── 表２に、得られた処理済みオリゴヌクレオチド鎖をセンス鎖として示し、それ
と共に、野生型のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びに各処理位置におけ
るヌクレオチド分布も示す。 表２： ───────────────────────────────── 位置 181 182 185 186 187 188 199 アミノ酸配列 Arg Gly Lys Ala Thr Asp Thr 野生型ヌクレオチド配列 cga ggt aaa gct tgg gat tgg 順方向プライマー（配列番号15）： FSA: 5'-caa aat cgt atc tac aaa ttc 123 456 a7g 8910 tgg gat t11g gaa gta gat tcg gaa aat-3' 各処理位置におけるヌクレオチド分布 １：35% A, 65% C ２：83% G, 17% A ３：63% G, 37% T ４：86% G, 14% A ５：85% G, 15% C ６：50% T, 50% C ７：95% A, 5% G ８：58% G, 37% A, 5% T ９：86% C, 13% A, 1% G 10：83% T, 17% G 11：92% G, 8% C 逆方向プライマー（配列番号16）： RSA: 5'-gaa ttt gta gat acg att ttg-3' ─────────────────────────────────ランダム変異誘発 表２から明白な導入（spiked）オリゴヌクレオチド（FSA とする）及びSAI 領
域のための逆方向プライマーRSA 、並びにSacII 部位からDraII 部位までのSP72
2 （配列番号２）特異的プライマーを用いて、21塩基対の重複による重複伸長方
法（Horton et al., Gene 77 (1989), pp. 61-68) によって、PCR ライブラリー
断片を作成する。このPCR の鋳型は、プラスミドpJE1である。このPCR 断片を、
大腸菌／バチルス菌シャトルベクターpDorK101にクローン化する（「材料と方法
」参照）ことで、大腸菌で変異誘発し、即座にバチルス・ズブチリスで発現させ
ることが可能となり、従って大腸菌内でのアミラーゼの致死的な集積を回避する
。大腸菌内でクローン化PCR 断片を確立した後、そのプラスミドから修飾された
pUC19 断片を切り出し、そしてプロモーターと、変異Termamyl遺伝子とを自然に
連結し、その様にしてバチルス菌内での発現が可能となる。スクリーニング 「材料と方法」で記載した通り、このライブラリーを低カルシウムフィルター
検査でスクリーニングし得る。 実施例４：配列番号１のアミラーゼ(SP690) の変異体の構築 配列番号１のアミラーゼをコードする遺伝子は、WO96/23873に記載されている
プラスミドpTVB106 中に存在する。バチルス・ズブチリス内で、この構成体のam
yLプロモーターから、そのアミラーゼを発現させる。
【００９０】 当タンパク質の１つの変異体は、デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K4
44Q である。この変異体の構築は、WO96/23873に記載されている。 Sarkar and Sommer, (1990), BioTechniques 8 : 404-407に記載されたメガプ
ライマー法によるデルタ（T183−G184) ＋N195F の構築を以下に示す。 遺伝子特異的プライマーＢ１（配列番号17）及び変異生成プライマー101458（
配列番号19）を用いて、pTVB106 様プラスミド（配列番号１のアミラーゼをコー
ドする遺伝子中にデルタ（T183−G184）変異を有するもの）から、約 645bpのDN
A 断片を、PCR によって増幅した。
【００９１】 この 645bp断片をアガロースゲルから精製し、これをメガプライマーとして、
プライマーＹ２（配列番号18）と共に用いて、同一の鋳型に対して２回目のPCR
を行った。 生じた約1080bpの断片を、制限酵素BstEIIとAflIIIとで切断し、生じた約 510
bpのDNA 断片を精製し、同酵素で切断したpTVB106 様プラスミド（配列番号１の
アミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（T183−G184）変異を有するもの）に
連結した。この連結物によって、コンピテントなバチルス・ズブチリスSHA273細
胞を形質転換し、そのクロラムフェニコール耐性の形質転換体を、DNA 配列決定
によって検査して、プラスミド上に適切な変異が存在することを確認した。 プライマーＢ１：（配列番号17） 5' CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3' プライマーＹ２：（配列番号18） 5' CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3' プライマー101458：（配列番号19）： 5' GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3' 変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T を、変異生成プライマー101638
を用いること以外は、先と同様にして構築した。 プライマー101638：（配列番号20） 5' CC CAG TCC CAC GTA CGT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3' 変異体：デルタ（T183−G184）＋A186T 、デルタ（T183−G184）＋A186I 、デ
ルタ（T183−G184）＋A186S 、デルタ（T183−G184）＋A186N を、pTVB106 様プ
ラスミド（変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T を有する）を鋳型及び
クローニングベクターとして用いること以外は、先と同様にして構築する。その
ための変異生成オリゴヌクレオチド（オリゴ１）は、 5' CC CAG TCC CAG NTCTTT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3' （配列番号21） である。
【００９２】 Ｎは、この変異生成オリゴヌクレオチドの合成時に、４つの塩基：Ａ，Ｃ，Ｇ
及びＴの混合物を使用したことを意味する。形質転換体のDNA 配列決定によって
、その成熟タンパク質のアミノ酸位置186 における適正なコドンを確認する。 変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T ＋N195F を以下の様にして構築
する。
【００９３】 pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T の変異を有す
るもの）に対してプライマーｘ２（配列番号22）及びプライマー101458（配列番
号19）を用いてPCR を行う。できたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマ
ーＹ２（配列番号18）と共に用いて、pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G1
84）＋N195F の変異を有するもの）に対してPCR を行う。この２回目のPCR 産物
を、制限エンドヌクレアーゼAcc65I及びAflIIIによって切断し、同酵素によって
切断したpTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋N195F)中にクローン化
した。 プライマーｘ２：（配列番号22） 5' GCG TGG ACA AAG TTT GAT TTT CCT G 3' 変異体：デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T ＋N195F ＋Y243F ＋Q391E ＋
K444Q を以下の様にして構築する。
【００９４】 pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T の変異を有す
るもの）に対してプライマーｘ２及びプライマー101458を用いて、PCR を行う。
できたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーＹ２と共に用いて、pTVB10
6 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q)の変異を有す
るもの）に対してPCR を行う。この２回目のPCR 産物を、制限エンドヌクレアー
ゼAcc65I及びAflIIIによって切断し、同酵素によって切断したpTVB106 様プラス
ミド（デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q)中にクローン化した。 実施例５親酵素SP722 αアミラーゼ（配列番号２）における部位特異的αアミラーゼ変異 体の構築 配列番号２のアミラーゼ(SP722）の変異体を以下の様にして構築する。
【００９５】 配列番号２のアミラーゼをコードする遺伝子は、WO96/23873に記載のプラスミ
ドpTVB112 中に存在する。このアミラーゼは、バチルス・ズブチリス内で、この
構成体のamyLプロモーターから発現される。 Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプ
ライマー法によるデルタ（D183−G184）＋V56Iの構築を以下に示す。
【００９６】 遺伝子特異的プライマーDA03及びメガプライマーDA07を用いて、pTVB112 様プ
ラスミド（配列番号２のαアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G1
84）の変異を有するもの）から、約 820bpのDNA 断片をPCR によって増幅する。 この 820bp断片をアガロースゲルから精製し、これをメガプライマーとして、
プライマーDA01と共に用いて、同一の鋳型に対して２回目のPCR を行う。
【００９７】 生じた約 920bpの断片を、制限酵素NgoMI 及びAatII によって切断し、生じた
約 170bpのDNA 断片を精製し、同酵素で切断したpTVB112 様プラスミド（配列番
号２のアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G184）変異を有するも
の）に連結する。この連結物によって、コンピテントなバチルス・ズブチリスSH
A273細胞（低アミラーゼ及び低プロテアーゼ）を形質転換し、そのクロラムフェ
ニコール耐性の形質転換体を、DNA 配列決定によって検査して、プラスミド上に
適切な変異が存在することを確認する。 プライマーDA01：（配列番号23） 5' CCTAATGATGGGAATCACTGG 3' プライマーDA03：（配列番号24） 5' GCATTGGATGCTTTTGAACAACCG 3' プライマーDA07：（配列番号25） 5' CGCAAAATGATATCGGGTATGGAGCC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K108L 、デルタ（D183−G184）＋K108Q 、デ
ルタ（D183−G184）＋K108E 、デルタ（D183−G184）＋K108V を、Sarkar and S
ommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプライマー法によ
って構築した。
【００９８】 プライマーDA03及び変異生成プライマーDA20を用いてpTVB112 様プラスミド（
デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を行う。生じたDNA 断
片をメガプライマーとして、プライマーDA01と共に用いて、pTVB112 様プラスミ
ド（デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を行う。２回目の
PCR で生じた約 920bpの断片を、制限酵素AatII 及びMluIによって切断し、同酵
素で切断したpTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）変異を有するもの）
に連結する。 プライマーDA20：（配列番号26）： 5' GTGATGAACCACSWAGGTGGAGCTGATGC 3' Ｓは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ｃ及びＧの混合
物を用いること、そしてＷは、その際に、２つの塩基Ａ及びＴの混合物を用いる
ことを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位
置108 に適切なコドンが存在することを確認する。
【００９９】 変異体：デルタ（D183−G184）＋D168A 、デルタ（D183−G184）＋D168I 、デ
ルタ（D183−G184）＋D168V 、デルタ（D183−G184）＋D168T を、変異生成プラ
イマーDA14を用いること以外は同様にして、構築する。 プライマーDA14（配列番号27）： 5' GATGGTGTATGGRYCAATCACGACAATTCC 3' Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合
物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いる
ことを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位
置168 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１００】 変異体：デルタ（D183−G184）＋Q169N を、変異生成プライマーDA15を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA15（配列番号28）： 5' GGTGTATGGGATAACTCACGACAATTCC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋Q169L を、変異生成プライマーDA16を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA16（配列番号29）： 5' GGTGTATGGGATCTCTCACGACAATTCC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋Q172N を、変異生成プライマーDA17を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA17（配列番号30）： 5' GGGATCAATCACGAAATTTCCAAAATCGTATC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋Q172L を、変異生成プライマーDA18を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA18（配列番号31）： 5' GGGATCAATCACGACTCTTCCAAAATCGTATC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋L201I を、変異生成プライマーDA06を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA06（配列番号32）： 5' GGAAATTATGATTATATCATGTATGCAGATGTAG 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K269S を、変異生成プライマーDA09を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA09（配列番号33）： 5' GCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K269Q を、変異生成プライマーDA11を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA11（配列番号34）： 5' GCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋N270Y を、変異生成プライマーDA21を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA21（配列番号35）： 5' GAATTTTGGAAGTACGATTTAGGTCGG 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋L272A 、デルタ（D183−G184）＋L272I 、デ
ルタ（D183−G184）＋L272V 、デルタ（D183−G184）＋L272T を、変異生成プラ
イマーDA12を用いること以外は同様にして構築する。 プライマーDA12（配列番号36）： 5' GGAAAAACGATRYCGGTGCCTTGGAGAAC 3' Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合
物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いる
ことを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位
置272 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０１】 変異体：デルタ（D183−G184）＋L275A 、デルタ（D183−G184）＋L275I 、デ
ルタ（D183−G184）＋L275V 、デルタ（D183−G184）＋L275T を、変異生成プラ
イマーDA13を用いること以外は同様にして構築する。 プライマーDA13（配列番号37）： 5' GATTTAGGTGCCTRYCAGAACTATTTA 3' Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合
物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いる
ことを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位
置275 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０２】 変異体：デルタ（D183−G184）＋Y295E を、変異生成プライマーDA08を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA08（配列番号38）： 5' CCCCCTTCATGAGAATCTTTATAACG 3' Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプ
ライマー法によるデルタ（D183−G184）＋K446Q の構築を以下に示す。
【０１０３】 停止コドンの下流 214〜231bp にアニールする遺伝子特異的プライマーDA04及
び変異生成プライマーDA10を用いて、pTVB112 様プラスミド（配列番号２のアミ
ラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G184）の変異を有するもの）から
、約 350bpのDNA 断片をPCR によって増幅した。 生じたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーDA05と共に用いて、pTVB
112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を
行う。この２回目のPCR による約 460bpの産物を、制限酵素SnaBI 及びNotIによ
って切断し、そして同酵素によって切断されたpTVB112 様プラスミド（デルタ（
D183−G184））中にクローン化する。 プライマーDA04（配列番号39）： 5' GAATCCGAACCTCATTACACATTCG 3' プライマーDA05（配列番号40）： 5' CGGATGGACTCGAGAAGGAAATACCACG 3' プライマーDA10（配列番号41）： 5' CGTAGGGCAAAATCAGGCCGGTCAAGTTTGG 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K458R を、変異生成プライマーDA22を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA22（配列番号42）： 5' CATAACTGGAAATCGCCCGGGAACAGTTACG 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋P459S 及びデルタ（D183−G184）＋P459T を
、変異生成プライマーDA19を用いること以外は同様にして構築する。 プライマーDA19（配列番号43）： 5' CTGGAAATAAAWCCGGAACAGTTACG 3' Ｗは、変異生成プライマーを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＴの混合物を用い
ることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸
位置459 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０４】 変異体：デルタ（D183−G184）＋T461P を、変異生成プライマーDA23を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA23（配列番号44）： 5' GGAAATAAACCAGGACCCGTTACGATCAATGC 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K142R を、変異生成プライマーDA32を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA32（配列番号45）： 5' GAGGCTTGGACTAGGTTTGATTTTCCAG 3' 変異体：デルタ（D183−G184）＋K269R を、変異生成プライマーDA31を用いる
こと以外は同様にして構築する。 プライマーDA31（配列番号46）： 5' GCTGAATTTTGGCGCAATGATTTAGGTGCC 3' 実施例６親のTermamylαアミラーゼ（配列番号４）における部位特異的αアミラーゼ変異 体の構築 TermamylαアミラーゼをコードするamyL遺伝子は、WO95/10603 (Novo Nordisk
) に記載されたプラスミドpDN1528 中に存在する。この親に各々が由来する置換
変異体N265R 及びN265D を、WO97/41213に記載の方法又は前記の「メガプライマ
ー」法によって構築する。変異生成プライマーは、以下の通りである： N265R 置換のためのプライマーｂ11： 5' PCC AGC GCG CCT AGG TCA CGC TGC CAA TAT TCA G (配列番号56） N265D 置換のためのプライマーｂ12： 5' PCC AGC GCG CCT AGG TCA TCC TGC CAA TAT TCA G (配列番号57） Ｐはリン酸基を表す。 実施例７配列番号２のアミノ酸配列を有する親αアミラーゼに由来する変異体におけるア ルカリpHでのpH安定性の決定 この一連の分析では、精製酵素試料を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩
衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液を75℃でインキュベ
ーションした。
【０１０５】 20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（「材料と方法」参照
）によって残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液
(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び75℃でインキュベーションしなかった同酵
素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１０６】 ────────────────────────────────── 変異体 20分後の残存活性 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（D183−G184）＋M323L 56％ 44％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋R181S 67％ 55％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋A186T 62％ 50％ ────────────────────────────────── もう１つの一連の分析では、培養上清を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS
緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液を80℃でインキュ
ベーションした。
【０１０７】 30分間インキュベーションした後、Phadebas検査（「材料と方法」参照）によ
って、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7
.3) を用いて測定した。高pH及び80℃でインキュベーションしなかった同酵素の
対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１０８】 ────────────────────────────────── 変異体 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（D183−G184） ４％ Δ（D183−G184）＋P459T 25％ Δ（D183−G184）＋K458R 31％ Δ（D183−G184）＋K311R 10％ ────────────────────────────────── 実施例８配列番号１，２及び４のアミノ酸配列を有する親αアミラーゼに由来する変異体 におけるアルカリpHでのカルシウム安定性の決定 Ａ．配列番号１の配列の変異体におけるカルシウム安定性 pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行っ
た。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた
。この溶液を50℃でインキュベーションした。
【０１０９】 20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残
存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用
いて測定した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照
溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１０】 ────────────────────────────────── 変異体 20分後の残存活性 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（T183−G184） 32％ 19％ Δ（T183−G184）＋A186T 36％ 23％ Δ（T183−G184）＋K185R ＋A186T 45％ 29％ Δ（T183−G184）＋A186I 35％ 20％ Δ（T183−G184）＋N195F 44％ n.d. ────────────────────────────────── n.d.＝未決定Ｂ．配列番号２の配列の変異体におけるカルシウム安定性 この一連の分析では、精製酵素試料を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩
衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で）
終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を50℃でインキュベー
ションした。
【０１１１】 20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残
存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用
いて測定した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照
溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１２】 ────────────────────────────────── 変異体 20分後の残存活性 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（D183−G184）＋M323L 21％ 13％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋R181S 32％ 19％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋A186T 28％ 17％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋A186R 30％ 18％ ────────────────────────────────── ────────────────────────────────── 変異体 20分後の残存活性 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（D183−G184） 30％ 20％ Δ（D183−G184）＋N195F 55％ 44％ ────────────────────────────────── もう１つの一連の分析では、培養上清を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS
緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で
）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を50℃でインキュベ
ーションした。
【０１１３】 30分間インキュベーションした後、前記のPhadebas検査によって、残存活性を
測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定
した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０
分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１４】 ────────────────────────────────── 変異体 30分後の残存活性 ────────────────────────────────── Δ（D183−G184） ０％ Δ（D183−G184）＋P459T 19％ Δ（D183−G184）＋K458R 18％ Δ（D183−G184）＋T461P 13％ Δ（D183−G184）＋E346Q ＋K385R ４％ ──────────────────────────────────Ｃ．配列番号４の配列の変異体におけるカルシウム安定性 pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行っ
た。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた
。この溶液を60℃でインキュベーションした。
【０１１５】 20分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残存活性を
測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定
した。高pH及び60℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０
分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。 以下の表では、親酵素（配列番号４）及び問題の変異体において、初期活性の
関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１６】 ────────────────────────────────── 変異体 20分後の残存活性 ────────────────────────────────── Termamyl（配列番号４） 17％ N265R 28％ N265D 25％ ────────────────────────────────── 実施例９配列番号１のアミノ酸配列を有するαアミラーゼにおける中温での活性の測定 Ａ．配列番号１の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性 pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて
、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton R
obinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃で、そして50mM CAPS 緩衝液（pH10.5) を
用いて25℃で測定した。
【０１１７】 以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、温度依存的
な活性、並びに、37℃での活性に対する25℃での活性の比率％を示している。 ────────────────────────────────── 変異体 NU／mg 25℃ NU／mg 37℃ NU（25℃）／ NU（37℃） ────────────────────────────────── SP690 1440 35000 4.1％ Δ（T183−G184） 2900 40000 7.3％ Δ（T183−G184）＋K269S 1860 12000 15.5％ Δ（Q174） 3830 38000 7.9％ ────────────────────────────────── pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて
、前記のPhadebas検査によってもう１つの測定を行った。試料中の活性を、50mM
Britton Robinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃及び50℃で測定した。
【０１１８】 以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、温度依存的
な活性、並びに、50℃での活性に対する37℃での活性の比率％を示している。 ────────────────────────────────── 変異体 NU／mg 37℃ NU／mg 50℃ NU（37℃）／ NU（50℃） ────────────────────────────────── SP690 （配列番号１） 13090 21669 60％ K269Q 7804 10063 78％ ──────────────────────────────────Ｂ．配列番号２の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性 pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて
、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton R
obinson 緩衝液(pH7.3) を用いて25℃及び37℃で測定した。
【０１１９】 以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、温度依存的
な活性、並びに、37℃での活性に対する25℃での活性の比率％を示している。 ────────────────────────────────── 変異体 NU／mg NU／mg NU（25℃）／ 25℃ 37℃ NU（37℃） ────────────────────────────────── Δ（D183−G184）＋M323L 3049 10202 30％ Δ（D183−G184）＋M323L ＋R181S 18695 36436 51％ ──────────────────────────────────Ｃ．配列番号４の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性 pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて
、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton R
obinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃で、そして50mM CAPS 緩衝液（pH10.5) を
用いて60℃で測定した。
【０１２０】 以下の表では、親酵素（配列番号４）及び問題の変異体において、温度依存的
な活性、並びに、60℃での活性に対する37℃での活性の比率％を示している。 ────────────────────────────────── 変異体 NU／mg 37℃ NU／mg 60℃ NU（37℃）／NU（60℃） ────────────────────────────────── Termamyl 7400 4350 170％ Q264S 10000 4650 215％ ────────────────────────────────── 実施例10BAN:1-300/Termamyl:301-483から成る親のハイブリッドαアミラーゼに由来する 変異体の構築 プラスミドpTVB191 は、BAN:1-300/Termamyl:301-483からなるハイブリッドα
アミラーゼをコードする遺伝子と共に、バチルス・ズブチリス内で機能する複製
起点、及びクロラムフェニコール耐性を付与するcat 遺伝子を含んでいる。
【０１２１】 変異体BM4 (F290E) を、プラスミドpTVB191 を鋳型としてメガプライマー法（
Sarkar and Sommer, 1990)によって構築した。 プライマーｐ１（配列番号52）及び変異生成オリゴヌクレオチドbm4 （配列番
号47）を用いて標準条件下でPCR を行って、 444bp断片を増幅した。この断片を
アガロースゲルから精製して、これをメガプライマーとして、プライマーｐ２（
配列番号53）と共に用いて２回目のPCR を行い、 531bp断片を得た。この断片を
制限エンドヌクレアーゼHindIII 及びTth111I によって切断した。これによって
生じた 389bp断片を、同酵素で切断したプラスミドpTVB191 内に連結した。でき
たプラスミドによってバチルス・ズブチリスSHA273を形質転換した。クロラムフ
ェニコール及び不溶性でんぷんを含有したプレート上で増殖させることによって
、クロラムフェニコール耐性クローンを選択した。そのプレートをヨウ素蒸気で
染色した後、染色輪を形成したクローンを選択することによって、活性αアミラ
ーゼを発現するクローンを単離した。DNA 配列の決定によって、導入された変異
の存在を確認した。
【０１２２】 変異体BM5 (F290K), BM6 (F290A), BM8 (Q360E) 及びBM11 (N102D)を同様にし
て構築した。それらの構築の詳細を以下に記す。 変異体：BM5 (F290K) 変異生成オリゴヌクレオチド：bm5 （配列番号48） プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52） 生成断片サイズ： 444bp プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53） 制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I 切断断片サイズ： 389bp
【０１２３】 変異体：BM6 (F290A) 変異生成オリゴヌクレオチド：bm6 （配列番号49） プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52） 生成断片サイズ： 444bp プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53） 制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I 切断断片サイズ： 389bp
【０１２４】 変異体：BM8 (Q360E) 変異生成オリゴヌクレオチド：bm8 （配列番号50） プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52） 生成断片サイズ： 230bp プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53） 制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I 切断断片サイズ： 389bp
【０１２５】 変異体：BM11 (N102D) 変異生成オリゴヌクレオチド：bm11（配列番号51） プライマー（１回目 PCR) ：ｐ３（配列番号54） 生成断片サイズ： 577 プライマー（２回目 PCR) ：ｐ４（配列番号55） 制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, PvuI 切断断片サイズ： 576変異生成オリゴヌクレオチド bm4 （配列番号47）：F290E プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GAG AAT TTA CAG G bm5 （配列番号48）：F290K プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT AAG AAT TTA CAG G bm6 （配列番号49）：F290A プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GCC AAT TTA CAG G bm8 （配列番号50）：Q360E プライマー 5' AGG GAA TCC GGA TAC CCT GAG GTT TTC TAC GG bm11（配列番号51）：N102D プライマー 5' GAT GTG GTT TTG GAT CAT AAG GCC GGC GCT GAT G その他のプライマー ｐ１： 5' CTG TTA TTA ATG CCG CCA AAC C （配列番号52） ｐ２： 5' G GAA AAG AAA TGT TTA CGG TTG CG（配列番号53） ｐ３： 5' G AAA TGA AGC GGA ACA TCA AAC ACG （配列番号54） ｐ４： 5' GTA TGA TTT AGG AGA ATT CC (配列番号55） 実施例11BAN:1-300/Termamyl:301-483から成る親のハイブリッドαアミラーゼに由来する 変異体におけるアルカリpHでのαアミラーゼ活性 各酵素溶液を用いて、Phadebas検査（前記）によって測定を行った。NaOHによ
って指示したpHに合わせた50mM Britton-Robinson 緩衝液中で30℃にて15分間イ
ンキュベーションした後に、活性を測定した。 NU／mg酵素 pH wt Q360E F290A F290K F290E N102D 8.0 5300 7800 8300 4200 6600 6200 9.0 1600 2700 3400 2100 1900 1900
【０１２６】引用文献 Klein, C., et al., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746, Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283, Chang, C., et al, J. Mol. Biol. (1993) 229, 235-238, Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584, Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600, Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785-799, Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 527-535, Swift, H.J., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 535-544 A. Kadziola, Ph.D. Thesis:“An alpha-amylase from Barley and its Complex with a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography ”
, Department of Chemistry University of Copenhagen 1993 MacGregor, E.A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol.1, No. 5-6, p. B. Dideric
hsen and L. Christiansen, Cloning of a maltogenic α-amylase from Bacill
us stearothermophilus, FEMS Microbiol. letters: 56: pp. 53-60 (1988) Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Sci
entific Publications, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor, 1989 S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859
-1869 Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, pp. 801-805. R.K. Saiki et al., Science 239, 1988, pp. 487-491. Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2 : 646-639) Nelson and Long, Analytical Biochemistry 180, 1989, pp. 147-151 Hunkapiller et al., 1984, Nature 310 : 105-111 R. Higuchi, B. Krummel, and R.K. Saiki (1988). A general method of in vi
tro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of prot
ein and DNA interactions. Nucl. Acids Res. 16 : 7351-7367. Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221. Gryczan et al., 1978, J. Bacteriol. 134, pp. 318-329. S.D. Erlich, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, pp. 1680-1682. Boel et al., 1990, Biochemistry 29, pp. 6244-6249.
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ６つの親のTermamyl様αアミラーゼのアミノ酸配列の整列を示す。左端の数字
は、以下の通り、各アミノ酸配列を示す： １：配列番号２ ２：Kaoamyl ３：配列番号１ ４：配列番号５ ５：配列番号４ ６：配列番号３
【図２】 SP722 （配列番号２）（pH９における）、及びB. licheniformisαアミラーゼ
（配列番号４）（pH7.3 における）の温度活性曲線を示す。
【図３】 SP690 （配列番号１）、SP722 （配列番号２）、及びB. licheniformisαアミ
ラーゼ（配列番号４）の、pH10における温度活性曲線を示す。
【図４】 ５つのαアミラーゼのアミノ酸配列の整列を示す。左端の数字は、以下の通り
、各アミノ酸配列を示す： １：マウスαアミラーゼ（amyp mouse） ２：ラットαアミラーゼ（amyp rat） ３：ブタ膵臓αアミラーゼ（PPA)（amyp pig） ４：ヒトαアミラーゼ（amyp human） ５：A. haloplanctis αアミラーゼ（AHA)（amy altha)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:10） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:09） Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10） Ｃ１２Ｒ 1:09） 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スベンセン，アラン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 アンデルセン，カルステン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ニールセン，ビャルネ レンフェルト デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ニッセン，トルベン ラウエスガールド デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 キャエルルフ，セーレン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA13 CA03 CA09 DA06 DA07 EA04 GA11 GA14 GA19 HA01 4B050 CC04 DD02 LL04 4B065 AA15Y AA19X AA26X AB01 AC06 BA02 BA03 CA32 CA57 4H003 DA01 DA17 DA19 EC01 FA16 FA28 FA47

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Termamyl様αアミラーゼを親とする変異体であって、αアミ
    ラーゼ活性を有し、且つ配列番号２のアミノ酸配列中の下記の位置の変異に対応
    する１つ以上の変異を含んでいる当変異体：T141, K142, F143, D144, F145, P1
    46, G147, R148, G149, Q174, R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, S1
    93, N195, H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F1
    73, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, K311, E346, K3
    85, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
  2. 【請求項２】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する、請求項１の変異体
    ： T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; E346A, D, R, N, C, Q, G, H, I, K, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K385A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y; T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
  3. 【請求項３】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する、請求項２の変異体
    ：K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R
    ; P459T; T461P; Q174* ; R181Q, N, S; G182T, S, N; D183* ; G184* ; K185A,
    R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V
    , R; W189T, S, N, Q 。
  4. 【請求項４】 D183及びG184の位置の欠失、そして更に１つ以上の下記の置
    換又は欠失を有する、請求項１〜３のいずれかの変異体：K142R; S193P; N195F;
    K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174* ; R181Q, N, S; G182T, S, N; D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H,
    I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; W189T, S, N, Q 。
  5. 【請求項５】 親のαアミラーゼと比べて、少くとも１つの下記の特性変化
    を示す、請求項１〜４のいずれかの変異体： ｉ）pH８〜10.5におけるpH安定性の向上；及び／又は ii）pH８〜10.5におけるCa2+安定性の向上；及び／又は iii ）10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温度における比活性
    の向上。
  6. 【請求項６】 pH８〜10.5における安定性が向上し、且つ下記の位置（配列
    番号２の配列順序に基づく位置）に対応する１つ以上の位置に変異を有する、請
    求項１〜５のいずれかの変異体：T141, K142, F143, D144, F145, P146, G147,
    R148, G149, R181, A186, S193, N195, K269, N270, K311, K458, P459, T461。
  7. 【請求項７】 １つ以上の下記の置換を有する、請求項６の変異体： T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K181A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, P, K, M, F, S, T, W, Y, V; S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
  8. 【請求項８】 １つ以上の下記の置換を有する、請求項７の変異体：K142R,
    R181S, A186T, S193P, N195F, K269R, N270Y, K311R, K458R, P459T及びT461P
    。
  9. 【請求項９】 pH８〜10.5におけるCa2+安定性が向上し、且つ下記の位置（
    配列番号２の配列順序に基づく位置）に対応する１つ以上の位置に変異を有する
    、請求項１〜５のいずれかの変異体：R181, G182, D183, G184, K185, A186, W1
    89, N195, N270, E346, K385, K458, P459。
  10. 【請求項１０】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する、請求項９の変異
    体： R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; E346A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K385A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V 。
  11. 【請求項１１】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する、請求項１０の変
    異体：R181Q, N; G182T, S, N; D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H
    , I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V; W189T, S, N, Q; N1
    95F; N270R, D; E346Q; K385R; K458R; P459T 。
  12. 【請求項１２】 親のTermamyl様αアミラーゼが下記の中から選択される、
    請求項１〜１１のいずれかの変異体：配列番号１の配列を有するバチルス（Baci
    llus) 菌体NCIB 12512のαアミラーゼ；配列番号５の配列を有するバチルス・ア
    ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens) のαアミラーゼ；配列
    番号４の配列を有するバチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformis)
    のαアミラーゼ。
  13. 【請求項１３】 10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温度に
    おける比活性が増加し、且つ下記の位置（配列番号２の配列順序に基づく位置）
    に対応する１つ以上の位置に変異を有する、請求項１〜５のいずれかの変異体：
    H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F173, Q174,
    D183, G184, N195, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275,
    G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
  14. 【請求項１４】 １つ以上の下記の置換を有する、請求項１３の変異体： H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V; R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D183* , A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; G184* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V; W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V; K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V; G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V; V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y; T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
  15. 【請求項１５】 １つ以上の下記の置換又は欠失を有する、請求項１４の変
    異体：Q174* , D183* , G184* , N195F, K269S。
  16. 【請求項１６】 親のTermamyl様αアミラーゼが、配列番号４の配列を有す
    るバチルス・リシェニホルミスのαアミラーゼである、請求項１３〜１５のいず
    れかの変異体。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれかのαアミラーゼ変異体をコード
    するDNA 配列を含有するDNA 構成体。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のDNA 構成体を保有する組換え発現ベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項１７のDNA 構成体又は請求項１８のベクターによっ
    て形質転換された細胞。
  20. 【請求項２０】 微生物である、請求項１９の細胞。
  21. 【請求項２１】 細菌又は真菌である、請求項２０の細胞。
  22. 【請求項２２】 グラム陽性細菌：例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus
    subtilis)、バチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformis) 、バチル
    ス・レンツス（Bacillus lentus)、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis)、バ
    チルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus)、バチルス・
    アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリクエファシエ
    ンス（Bacillus amyloliquefaciens) 、バチルス・コアグランス（Bacillus coa
    gulans) 、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans) 、バチルス・ラウツ
    ス（Bacillus lautus)又はバチルス・チューリンゲネシス（Bacillus thuringie
    nsis) である、請求項２１の細胞。
  23. 【請求項２３】 洗浄及び／又は食器洗浄のための、請求項１〜１６のいず
    れかのαアミラーゼ変異体の使用。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜１６のいずれかのαアミラーゼ変異体を、場合
    により非粉末化顆粒、安定化液又は保護化酵素の形で、含んでいる、洗浄性添加
    剤。
  25. 【請求項２５】 その添加剤１ｇあたり0.02〜200mg のその酵素タンパク質
    を含んでいる、請求項２４の洗浄性添加剤。
  26. 【請求項２６】 更に、別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオ
    キシダーゼ、別のでんぷん分解酵素、及び／又はセルラーゼを含んでいる、請求
    項２４又は２５の洗浄性添加剤。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜１６のいずれかのαアミラーゼ変異体を含んで
    いる、洗浄性組成物。
  28. 【請求項２８】 更に、別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオ
    キシダーゼ、別のでんぷん分解酵素及び／又はセルラーゼを含んでいる、請求項
    ２７の洗浄性組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜１６のいずれかのαアミラーゼ変異体を含んで
    いる、手洗い又は自動洗い用の食器洗浄性組成物。
  30. 【請求項３０】 更に、別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオ
    キシダーゼ、別のでんぷん分解酵素及び／又はセルラーゼを含んでいる、請求項
    ２９の食器洗浄性組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項１〜１６のいずれかのαアミラーゼ変異体を含んで
    いる、手洗い又は自動洗い用の衣類洗浄性組成物。
  32. 【請求項３２】 更に、別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオ
    キシダーゼ、別のでんぷん分解酵素、及び／又はセルラーゼを含んでいる、請求
    項３１の衣類洗浄性組成物。
  33. 【請求項３３】 １）至適pHの変化、及び／又は２）至適温度の変化、及び
    ／又は３）安定性の改良、を呈するαアミラーゼを提供する方法であって、下記
    の過程を含んで成る方法： ｉ）pH、温度及び／又は安定性の特性が実質的に異なっている２つ以上のαア
    ミラーゼの３Ｄ構造の分子動力学を比較することによって、当αアミラーゼにお
    ける変異のための標的部位及び／又は領域を同定すること； ii）同定された部位及び／又は領域において、１つ以上のアミノ酸を置換、付
    加及び／又は欠失すること。
  34. 【請求項３４】 中温αアミラーゼを、高温αアミラーゼと比較する、請求
    項３３の方法。
  35. 【請求項３５】 低温αアミラーゼを、中温又は高温αアミラーゼと比較す
    る、請求項３３の方法。
  36. 【請求項３６】 それらのαアミラーゼ間の相同性が、少くとも70％、好ま
    しくは80％、90％まで、95％まで、特には95％である、請求項３３〜３５のいず
    れかの方法。
  37. 【請求項３７】 比較するそれらのαアミラーゼが、Termamyl様αアミラー
    ゼである、請求項３６の方法。
  38. 【請求項３８】 比較するそれらのαアミラーゼが、配列番号１〜８に示さ
    れた任意のαアミラーゼである、請求項２８の方法。
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