CN113444712B - 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体及其在合成β‑丙氨酸中的应用。本发明通过全质粒定点突变改造L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶通过取代具有氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于Escherichia coli的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的第14位，44位，85位氨基酸位点，获得了影响L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶自剪切的突变菌株。本发明通过比较突变体EcoPanDK14T、EcoPanDI44V、EcoPanDV85L和野生型，发现与野生型相比，突变体自剪切水平显著增加，且在发酵后β‑丙氨酸产量均显著增加。

Description

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其在微生物中合成β-丙氨酸方面的应用，属于基因工程技术领域。
(二)背景技术
β-丙氨酸(β-Alanine，C3H7NO2)，易溶于水，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。与组成人体蛋白质20种氨基酸之一的α-丙氨酸互为同分异构体。β-丙氨酸作为一种非蛋白氨基酸，在某些细菌、真菌、植物和动物中可以自身合成，而哺乳动物则需从外界环境中摄取。β-丙氨酸广泛被应用在医药、食品、化工和环境等领域，市场前景广泛。首先，工业上很多重要化合物如：3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、聚3-羟基丙酸酯(Poly-3-hydroxypropionate)、泛酸(pantothenic acid)、肌肽(camosine)、帕米膦酸钠(balsalazide)和巴柳氮(balasalazide)等是以β-丙氨酸为重要前体或中间体合成的。其次，在食品行业中，β-丙氨酸既是一种食品添加剂改善食品味道，还被作为运动员营养补充剂，改善身体机能。此外，它还可以直接用于生产聚β-丙氨酸，广泛应用于化妆品、水净化和建筑等领域。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)是生物体内β-丙氨酸合成的关键酶，能够催化一分子L-天冬氨酸脱去α位羧基生成β-丙氨酸，释放一分子CO2。生物体内PanD主要包括两种类型，一种是以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶的来源于真核生物昆虫赤拟谷道(Triboliumcastaneum)、果蝇(Drosophilid melanogaster)的PanD酶，另一种是原核生物(Escherichia coli、Bacillus subtilis等)中以丙酮酰基团为辅酶的PanD酶。其中真核生物来源的PanD其催化机理尚无明确报道。原核生物中的PanD在来源、结构和催化机理等方面已经取得了深入的进展，它可以显著影响β-丙氨酸的合成。比如：高丽娟等在E.coliBL21(DE3)中过表达E.coli来源的panD，PanD过表达后与底物L-天冬氨酸进行酶促反应最终生成3.96g/L的β-丙氨酸。随后，Shen等将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的panD在宿主E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，以L-天冬氨酸为底物最终转化得到12.85g/L的β-丙氨酸，转化效率为97.2％。接着，范雪萍等直接将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)来源的panD基因在E.coli BL21(DE3)中重组表达，以200g/L L-天冬氨酸作为底物，β-丙氨酸最终产量达66.4g/L，转化率达到99.2％。此外，研究还发现，在不同的生物如E.coli、B.subtilis、C.glutamicum和Mycobacterium tuberculosis等中，PanD已经出现了较大的分化，这都与PanD的蛋白结构有关。自1980年，JE Cronan等人通过突变体的方式证明了E.coli中PanD是催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸的关键酶以后，Webb ME和Ramjee MK等进一步揭示了PanD的催化机理。Webb ME等人通过突变体方式发现E.coli中的PanD蛋白在编码过程中会先形成一个非活性前体(通常叫做π蛋白)，随后，π蛋白在Gly24-Ser25位置通过非水解丝氨酸作用分子内发生自裂解，该反应也称为N→O酰基转移；这一过程产生了一条11kDa的α链，在新的N-末端有一个丙酮酸基，和一条2.8kDa的β链。进一步研究发现，不同来源的PanD酶剪切模式具有较大的差异，首先，在E.coli中PanD蛋白主要以非活性的π蛋白形式表达，之后在激活剂PanZ的作用下，形成PanZ-AcCoA复合物，通过反应构象的选择促进PanD的活化，但是由于细胞内PanZ的不足，导致E.coli中活化的PanD较少。而在C.glutamicum和B.subtilis中，PanD蛋白则不需要激活剂，完全自发裂解，因而具有较高的催化活力。
为了揭示不同生物体内PanD分子差异的原因为PanD的应用提供基础，本发明采用分子进化的方式进行分析，并通过定向进化，揭示影响其自剪切的位点，通过对影响其自剪切的位点进行定向突变，得到具有较高的催化活力的PanD，为PanD的工业化应用提供基础。
(三)发明内容
为了进一步提供PanD的催化活力，本发明提供一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其在合成β-丙氨酸中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体是将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列(Class II系列蛋白的保守序列)第14位、第44位、第85位进行单突变或多位点突变获得的。
进一步，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体进行了以下一个或两个以上位点的突变：(1)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第14位赖氨酸突变成苏氨酸；(2)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第44位异亮氨酸突变成缬氨酸；(3)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第85位缬氨酸突变成亮氨酸。
优选地，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第14位赖氨酸突变成苏氨酸；(2)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第44位异亮氨酸突变成缬氨酸；(3)将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列第85位缬氨酸突变成亮氨酸。
优选地，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第14位赖氨酸突变成苏氨酸(EcoPanDK14T，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；(2)将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第44位异亮氨酸突变成缬氨酸(EcoPanDI44V，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；(3)将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第85位缬氨酸突变成亮氨酸(EcoPanDV85L，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。更优选所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为EcoPanDI44V。
第二方面，本发明还提供一种上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因、重组表达质粒以及由所述重组表达质粒转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。
进一步，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述的重组表达质粒的载体为pTrc99A。所述的宿主细胞包括但不限于本领域的各种常规宿主细胞，本发明优选E.coli W3110。
进一步，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的重组表达质粒是将SEQ ID NO：5所示氨基酸序列插入pTrc99A质粒的多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)(基因全部取代MCS)得到。
特别优选地，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的重组表达质粒采用如下方法获得：
(1)利用引物对EcopanD–F和EcopanD–R对E.coli W3110基因组进行PCR扩增，得到EcopanD基因；
EcopanD–F 5’-3’aggaaacagaccatgATGATTCGCACGATGCTGCAG
EcopanD–R 5’-3’tccgccaaaacagccTCAAGCAACCTGTACCGGAATC
(2)利用引物对Trc-F和Trc-R对pTrc99A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc99A质粒；
Trc-F 5’-3’GGCTGTTTTGGCGGATGAGA
Trc-R 5’-3’CATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAAT
(3)利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将步骤(1)所述EcopanD基因和步骤(2)所述线性化pTrc99A质粒连接，获得插入EcopanD基因的重组质粒；
(4)以步骤(3)所述的插入EcopanD基因的重组质粒为模板，利用引物对1、2或3进行全质粒定点突变，所得PCR产物经后处理，获得所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的重组表达质粒；
引物对1：
K14T-F1 5’-3’cgcgtgaccgtgactCATGCGGACCTGCACTATGA
K14T-R1 5’-3’agtcacggtcacgcgGTGGAGTTTGCCCTGCAGC
引物对2：
I44V-F1 5’-3’gaagccgttgatatcTGGAATGTCACCAACGGCA
I44V-R1 5’-3’gatatcaacggcttcGTTTTCGAGAATACCGGCTGC
引物对3：
V85L-F1 5’-3’gatattctgatcatcGCCAGCTTCGTTACCATGC
V85L-R1 5’-3’gatgatcagaatatcGCCGACACTGGCGCAG。
进一步，所述后处理为：将所述PCR产物用内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA，然后用纯化试剂盒纯化，即得所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的重组表达质粒。
优选地，所述重组基因工程菌按以下方法制备：
利用热激法将所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的重组表达质粒转入E.coliW3110感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，挑取单克隆测序验证，获得所述重组基因工程菌。
第三方面，本发明提供一种上述重组基因工程菌在发酵制备β-丙氨酸中的应用。
具体地，所述应用为：
将含有所述重组基因工程菌接种于含有100μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃，200rpm摇床震荡12h，获得种子液；将所述种子液以2％接种量转接于含有100μg/mLKana的LB培养基中，在37℃，200rpm摇床震荡至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.3mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，接着在28℃，180rpm诱导表达培养12h，4500rpm,低速离心8min，弃上清收集菌体；取新鲜的发酵培养基A在离心管中将菌体重悬，之后将悬浮的菌体移至新鲜的发酵培养基B中，并且添加终浓度为0.3mM的IPTG及100μg/mL的Kana，发酵12-48h，得到所述β-丙氨酸(β-丙氨酸在胞外，发酵液离心后的上清中)。
进一步，所述发酵培养基A的体积为发酵培养基B的10％。
本发明所阐述LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；所述LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
本发明所阐述发酵培养基组成为：16g/L(NH4)2SO4，2g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖,1g/L KH2PO4，10g/L CaCO3，1g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L MnSO4·4H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，溶剂为去离子水，pH自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明通过全质粒定点突变改造L-天冬氨酸-α-脱羧酶通过取代具有氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于E.coli的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的第14位，44位，85位氨基酸位点，获得了影响L-天冬氨酸-α-脱羧酶自剪切的突变菌株。
本发明通过比较突变体EcoPanDK14T、EcoPanDI44V、EcoPanDV85L和野生型，发现与野生型相比，突变体自剪切水平显著增加，且在发酵后β-丙氨酸产量均显著增加。
(四)附图说明
图1 panD基因家族系统发育树。
图2 PanD蛋白的同源序列比对；注：★表示14，44，85位点。
图3定向进化EcoPanD蛋白的SDS-PAGE分析：M:蛋白marker；1：EcoPanDK14T蛋白条带；2：EcoPanDI44V蛋白条带，3：EcoPanDV85L蛋白条带；4：EcoPanD蛋白条带。
图4定向进化EcoPanD的菌株对β-丙氨酸产量的影响：误差线表示三个生物学重复的标准差；(a)定向进化菌株细胞生长曲线；(b)定向进化重组菌株合成β-丙氨酸的产量；星号＊表示显著性(p＜0.05)。
图5β-丙氨酸液相图：(a)β-丙氨酸标样；(b)WED菌株发酵β-丙氨酸液相图；(c)WED+K14T菌株发酵β-丙氨酸液相图；(d)WED+I44V菌株发酵β-丙氨酸液相图；(e)WED+V85L菌株发酵β-丙氨酸液相图。(其中衍生化试剂DNFB出峰时间为4.3min，β-丙氨酸出峰时间为5.4～5.5min)
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。
LB液体培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
发酵培养基组成为：16g/L(NH4)2SO4，2g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖,1g/L KH2PO4，10g/L CaCO3，1g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L MnSO4·4H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，溶剂为去离子水，pH自然。
实施例1：panD基因分子进化关系分析和选择压力分析
(1)panD基因分子进化关系分析
本研究通过分子进化的方法，探究panD基因在不同生物中的序列分化。以大肠杆菌基因EcopanD(SAMN02604091)为原始模板，通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对panD基因家族的序列进行全面搜索。确认标准是E值<1×e-05且氨基酸同源性>40％的序列为panD基因家族成员。最终获得24种微生物的PanD氨基酸序列，分别是Mycobacterium tuberculosis(MtupanD)、Mycobacterium africanum(MafpanD)、Mycobacterium canettii(McapanD)、Mycobacterium bovis(MbopanD)、Bacillus cereus(BcepanD)、Mycobacterium liflandii(MlipanD)、Streptomycesfradiae(SfrpanD)、Rhodococcus opacus(RoppanD)、Corynebacterium amycolatum(CampanD)、Corynebacterium glutamicum(CglpanD)、Bacillus paralicheniformis(BpapanD)、Bacillus mycoides(BmypanD)、Bacillus tropicus(BtrpanD)、Shigelladysenteriae(SdypanD)、Escherichia fergusonii(EfepanD)、Escherichia marmotae(EmapanD)、E.coli(EcopanD)、Klebsiella michiganensis(KmipanD)、Staphylococcuschromogenes(SchpanD)、Pectobacterium parmentieri(PpapanD)、CandidatusThalassoarchaea(CthpanD)，通过BioEdit v7.0.9.0和MEGA6进行序列比对，重建panD基因的系统进化关系。在系统发育分析中，通过从细菌中选取24种具有代表性的PanD酶核苷酸序列进行系统发育关系重建。采用最大似然法，利用PhyML3.0(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/)，通过软件对各项参数进行优化，以Akaike InformationCriterion(AIC)为模型，进化树的稳定性检测通过自展分析执行100次重复。最后进化树通过MEGA6软件进行展示。
panD基因家族的分子进化以CthpanD基因为根，panD基因在进化的过程中分化成三个分支，以其中的代表性菌株命名，分别是ClassⅠ分支(以CglpanD为代表)、ClassⅡ分支(以EcopanD为代表)和ClassⅢ分支(以BsupanD为代表)，该结果表明了三个分支的panD基因在功能上已经出现了一定程度的分化。
(2)panD基因选择压力分析
在panD基因分子进化关系的基础上，选择以PAML软件进行压力分析，分别以panD基因的分子进化树与核苷酸序列矩阵，进行选择压力分析。首先选定Model 2A模型，以Class II为前景枝，其余为背景枝，进行分支位点选择压力分析，该分析以M0为对照，选择压力参数如表1。
表1 选择压力参数
Figure BDA0003084237530000071
注：其中dN/dS(ω)for site classes(K＝4)
结果显示前景枝受到显著的正选择(ω＝999)，且获得受到正选择的位点为3个，矩阵上的顺序分别是K29、I59和V100(对应的EcoPanD上的位点分别是K14、I44和V85)。这些位点可能是影响PanD自剪切的关键位点，具体功能变化需要进一步的定点突变实验分析验证。
实施例2：利用全质粒定点突变构建L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体
(1)引物
进一步对以上3个位点，以EcoPanD蛋白为基础，以Class III中的对映位点作为对照，进行定向进化，形成L-天冬氨酸-α-脱羧酶EcoPanD突变体库，分别如下：(1)SEQ IDNO.1所示氨基酸第14位的赖氨酸突变成苏氨酸(EcoPanDK14T，突变体的核苷酸序列如SEQID NO.2所示)；(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸第44位异亮氨酸突变成缬氨酸(EcoPanDI44V，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸第85位缬氨酸突变成亮氨酸(EcoPanDV85L，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。本实施例所用到的PCR引物序列列于表2，在体外扩增EcopanD基因(来源于E.coli W3110基因组，引物对为EcopanD–F、EcopanD-R)SEQ ID NO.1，通过在MCS位点反向PCR线性化pTrc99A质粒(pTrc99A质粒来源于实验室，引物对为Trc-F和Trc-R)，之后利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺维赞生物科技有限公司，货号：C112-01)将EcopanD基因和线性化pTrc99A片段进行一步克隆，最终构建质粒pTrc-EcopanD，并以pTrc-EcopanD为模板通过全质粒定点突变(突变点设计在引物中)向其中引入上述3个位点的核苷酸突变(核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示)。
(2)全质粒定点突变PCR反应体系与反应条件(50μL体系)
1μL浓度1ng/μL的pTrc-EcopanD的DNA为模板，浓度10μM的引物F1和引物R1(表2)各1μL，2×PrimeSTAR HSDNA Polymerase高保真DNA聚合酶25μL，超纯水22μL。
表2 定点突变相关引物
Figure BDA0003084237530000081
注：小写字母均为同源臂，粗体为突变位点
PCR反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；58℃，10sec；72℃，1min；共30个循环，72℃，终延伸5min，最后终止温度为4℃。
全质粒定点突变PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA。用纯化试剂盒纯化后，直接热激转化E.coli W3110感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，经37℃过夜培养，构建突变体文库。所述琼脂平板组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
实施例3：突变体库的筛选与发酵
对实施例2的得到的转化子进行如下操作：
1、测序验证：用灭菌的枪头挑选平板上的3个转化子接种于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，同时E.coli W3110/pTrc99A-EcopanD作为对照接种于含有100μg/mLKana抗生素的LB液体培养基中。37℃，200r/min振荡培养12h，测序及保菌。构建的菌株如表3。
表3 实施例3中所构建的菌株
Figure BDA0003084237530000091
2、突变体的诱导表达：无菌条件下，从步骤1的LB液体培养基中取1mL种子液，转接到50mL LB培养基(终浓度为100μg/mL Kana)中，37℃，200r/min振荡培养2h左右直到OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.3mM IPTG震荡培养12h进行表达。粗蛋白验证步骤如下：取1mL的诱导液，12,000rpm，离心2min；去上清，加入超纯水悬浮沉淀，然后加入6×LoadingBuffer混匀，100℃水浴10min，12,000rpm，离心2min，取20μL样品进行SDS-PAGE电泳分析。
3、突变体菌株的发酵：诱导方法如步骤2，诱导结束后，在无菌超净台中收集菌体，5000rpm，低速离心5min，之后弃上清，离心管中收集菌体。取1mL发酵培养基在离心管中将菌体重悬，之后将悬浮的菌体移至50mL发酵培养基中，并且添加30μL(0.3mM)的IPTG及100μg/mL的Kana。为了增加其溶氧量，在500mL锥形瓶中配制发酵培养基。恒温30℃摇床匀速震荡持续发酵。每12h取样测定β-丙氨酸浓度。
4、取步骤3的发酵液样品，12000rpm，离心2min，取上清100μL，加入100μL NaHCO3(0.5M)以及100μL DNFB(DNFB:乙腈＝1:100v/v)混合在60℃下进行衍生化反应1h。后采用高效液相色谱(HPLC)检测反应生成的β-丙氨酸的含量。HPLC检测方法：色谱柱为WelchromC18(4.6mm×250mm)紫外检测波长为360nm，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温40℃，流动相为乙酸钠与甲醇体积比1:1配比混合。
5、重组菌株蛋白条带的验证：将筛选得到的突变体如步骤2所示进行诱导表达，所得的湿菌体用50mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，经超声波破碎(超声2s，间隔2s，有效超声时间10min)，离心去除细胞碎片，所得的上清液即为粗酶液。上清液通过0.25μM的滤膜过滤，并置于冰上。将1mL的His Trap安置于AKTA Avant蛋白纯化仪，洗泵结束后用无浓度的咪唑缓冲液(8.76g NaCl，200mL 50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，定容至500mL)平衡柱子。取25mL的样品上样，用低浓度50mM浓度的咪唑缓冲液(500mM咪唑稀释十倍)将杂蛋白冲洗掉。用高浓度的咪唑缓冲液(500mM咪唑，16.9g咪唑，300mM NaCl，200mL 50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液，最后定容至500mL)对目的蛋白进行洗脱，采用离心管收集样品。最后将纯化得到的蛋白进行Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果见图3。
6、步骤4实验结果(图4)表明，相较于原始未突变菌株(WED)β-丙氨酸产量0.215g/L，经过步骤3突变体(EcoPanDK14T、EcoPanDI44V、EcoPanDV85L)的表达发酵(液相出峰时间如图5)，分别是WED+K14T(SEQ ID N0.1所示氨基酸第14位的赖氨酸突变为苏氨酸)、WED+I44V(SEQ ID N0.1所示氨基酸第44位异亮氨酸突变成缬氨酸)、WED+V85L菌株(SEQ ID N0.1所示氨基酸第85位缬氨酸突变成亮氨酸)，与未突变的野生型相比β-丙氨酸产量均增加，β-丙氨酸产量依次为0.265g/L、0.360g/L和0.241g/L。
突变体自剪切水平的验证结果表明:突变体酶EcoPanDK14T、EcoPanDI44V、EcoPanDV85L的自剪切均受到影响，π、α、β条带比例发生变化，π条带比例在减小的同时，影响PanD酶活性的α、β条带与野生型相比均不同程度增加(如表4)。
因此，最终提出14、44和85位这三个位点是影响PanD酶的自剪切，进而影响β-丙氨酸产量的关键位点。
表4 π、α、β条带比例
Figure BDA0003084237530000111
SEQ ID NO:1(EcopanD)
ATGATTCGCACGATGCTGCAGGGCAAACTCCACCGCGTGAAAGTGACTCATGCGGACCTGCACTATGAAGGTTCTTGCGCCATTGACCAGGATTTTCTTGACGCAGCCGGTATTCTCGAAAACGAAGCCATTGATATCTGGAATGTCACCAACGGCAAGCGTTTCTCCACTTATGCCATCGCGGCAGAACGCGGTTCGAGAATTATTTCTGTTAACGGTGCGGCGGCCCACTGCGCCAGTGTCGGCGATATTGTCATCATCGCCAGCTTCGTTACCATGCCAGATGAAGAAGCTCGCACCTGGCGACCCAACGTCGCCTATTTTGAAGGCGACAATGAAATGAAACGTACCGCGAAAGCGATTCCGGTACAGGTTGCTTGA
SEQ ID NO:2(EcopanD-K14T)
ATGATTCGCACGATGCTGCAGGGCAAACTCCACCGCGTGACCGTGACTCATGCGGACCTGCACTATGAAGGTTCTTGCGCCATTGACCAGGATTTTCTTGACGCAGCCGGTATTCTCGAAAACGAAGCCATTGATATCTGGAATGTCACCAACGGCAAGCGTTTCTCCACTTATGCCATCGCGGCAGAACGCGGTTCGAGAATTATTTCTGTTAACGGTGCGGCGGCCCACTGCGCCAGTGTCGGCGATATTGTCATCATCGCCAGCTTCGTTACCATGCCAGATGAAGAAGCTCGCACCTGGCGACCCAACGTCGCCTATTTTGAAGGCGACAATGAAATGAAACGTACCGCGAAAGCGATTCCGGTACAGGTTGCTTGA
SEQ ID NO:3(EcopanD-I44V)
ATGATTCGCACGATGCTGCAGGGCAAACTCCACCGCGTGAAAGTGACTCATGCGGACCTGCACTATGAAGGTTCTTGCGCCATTGACCAGGATTTTCTTGACGCAGCCGGTATTCTCGAAAACGAAGCCGTTGATATCTGGAATGTCACCAACGGCAAGCGTTTCTCCACTTATGCCATCGCGGCAGAACGCGGTTCGAGAATTATTTCTGTTAACGGTGCGGCGGCCCACTGCGCCAGTGTCGGCGATATTGTCATCATCGCCAGCTTCGTTACCATGCCAGATGAAGAAGCTCGCACCTGGCGACCCAACGTCGCCTATTTTGAAGGCGACAATGAAATGAAACGTACCGCGAAAGCGATTCCGGTACAGGTTGCTTGA
SEQ ID NO:4(EcopanD-V85L)
ATGATTCGCACGATGCTGCAGGGCAAACTCCACCGCGTGAAAGTGACTCATGCGGACCTGCACTATGAAGGTTCTTGCGCCATTGACCAGGATTTTCTTGACGCAGCCGGTATTCTCGAAAACGAAGCCATTGATATCTGGAATGTCACCAACGGCAAGCGTTTCTCCACTTATGCCATCGCGGCAGAACGCGGTTCGAGAATTATTTCTGTTAACGGTGCGGCGGCCCACTGCGCCAGTGTCGGCGATATTCTGATCATCGCCAGCTTCGTTACCATGCCAGATGAAGAAGCTCGCACCTGGCGACCCAACGTCGCCTATTTTGAAGGCGACAATGAAATGAAACGTACCGCGAAAGCGATTCCGGTACAGGTTGCTTGA
SEQ ID NO:5(ClassⅡ的保守序列)
Figure BDA0003084237530000121
SEQ ID NO:6(EcopanD)
Figure BDA0003084237530000122
Figure BDA0003084237530000131
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60
cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120
aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180
gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240
gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300
tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360
attccggtac aggttgcttg a 381
<210> 2
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga ccgtgactca tgcggacctg 60
cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120
aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180
gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240
gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300
tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360
attccggtac aggttgcttg a 381
<210> 3
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60
cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120
aacgaagccg ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180
gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240
gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300
tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360
attccggtac aggttgcttg a 381
<210> 4
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60
cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120
aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180
gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240
gtcggcgata ttctgatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300
tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360
attccggtac aggttgcttg a 381
<210> 5
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Xaa Arg Xaa Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr
1 5 10 15
Xaa Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe
20 25 30
Xaa Asp Ala Xaa Gly Ile Leu Glu Xaa Glu Ala Ile Xaa Xaa Xaa Asn
35 40 45
Val Xaa Asn Gly Xaa Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Xaa Glu Arg
50 55 60
Gly Ser Xaa Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala Xaa Cys Ala Xaa
65 70 75 80
Val Gly Asp Xaa Xaa Ile Ile Xaa Ser Xaa Val Xaa Met Xaa Asp Glu
85 90 95
Xaa Ala Arg Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Val Ala Tyr Phe Xaa Gly Xaa Asn
100 105 110
Glu Xaa Xaa Arg Xaa Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala
115 120 125
<210> 6
<211> 126
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 6
Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr
1 5 10 15
His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe
20 25 30
Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn
35 40 45
Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg
50 55 60
Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser
65 70 75 80
Val Gly Asp Ile Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu
85 90 95
Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn
100 105 110
Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala
115 120 125

Claims (7)

1.一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第14位赖氨酸突变成苏氨酸；(2)将SEQ IDNO：6所示氨基酸序列第44位异亮氨酸突变成缬氨酸；(3)将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第85位缬氨酸突变成亮氨酸。
2.如权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因，其特征在于：所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。
4.如权利要求2所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的重组表达质粒。
5.如权利要求4所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的重组表达质粒，其特征在于：所述的重组表达质粒的载体为pTrc99A。
6.如权利要求4所述的重组表达质粒转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。
7.如权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述宿主细胞为E.coli W3110。
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