KR20150008305A - 오메가 트랜스아미나제의 촉매 작용을 이용한 비천연 아미노산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아미노 공여체로서 이소프로필아민 등을 사용하고, ω-TA 촉매 작용을 통하여 α-케토산으로부터 거울상 순수한 비천연 아미노산을 합성하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 고가의 아미노 공여체를 사용하지 않고, 이소프로필아민 등의 저렴한 아미노 공여체를 사용해서 이에 상응하는 케토산으로부터 비천연 아미노산을 오메가 트랜스아미나제에 의해서 우수한 공정 효율로 비대칭 합성할 수 있다. 또한, 종래 알파-트랜스오미나제 기반에서 불리한 평형을 이동시키거나, 부산물 축적을 방지하는 추가적인 효소 투입 공정 등을 사용하지 않고도 우수한 전환율로 아미노산을 합성할 수 있다. 또한, 부피가 큰 치환체를 지닌 α-케토산을 수용할 수 있는 ω-TA 변이체를 이용하여 다양한 비천연 아미노산을 합성할 수 있다.

Description

오메가 트랜스아미나제의 촉매 작용을 이용한 비천연 아미노산의 제조방법{Asymmetric synthesis method of unnatural amino acids using ω-transaminase catalysis}

본 발명은 오메가 트랜스아미나제의 촉매 작용을 이용한 비천연 아미노산의 제조방법에 관한 것으로서, 아미노 공여체로서 이소프로필아민 등을 사용하고, ω-TA 촉매 작용을 통하여 α-케토산으로부터 거울상 순수한 비천연 아미노산을 합성하는 방법에 관한 것이다.

비천연 측쇄를 지닌 L-α-아미노산과 D-α-아미노산을 포함하는 비단백질성 아미노산들은 높은 효소 및 약력학적 안전성과 천연 대응물질이 모방할 수 없는 구조적 다양성으로 인해서 여러 약제들의 키랄 빌딩 블록으로서 점차 중요해지고 있다. 예를 들어, 제약학상 중요한 L-호모알라닌은 레베티라세탐(levetiracetam) 및 브리바라세탐(brivaracetam)(항간질제)과 에탐부톨(ethambutol)(항결핵제)의 생산에서 핵심 중간체로서 사용되고 있다.

많은 화학촉매 및 생물촉매 방법이 비천연 아미노산의 비용 효과적인 합성을 위해서 개발되고 있다. L-호모알라닌의 산업적 생산이 티로신 트랜스아미나아제(TTA)를 사용한 2-옥소부티르산의 환원성 아민화에 의해서 확립되었다. 불리한 반응 평형을 극복하기 위해서 L-아스파르테이트가 아미노 공여체로서 사용되었는데, 결과의 케토산 산물(즉, 옥살로아세트산)은 자발적인 탈카르복실화를 거쳐서 피루브산이 되었다. 그러나, 이 반응은 TTA가 피부르산은 물론 2-옥소부티르산에 대해서도 반응성을 갖기 때문에 L-알라닌에 의한 산물 오염이 발생하는 문제점이 있다.

이러한 부산물 형성을 줄이기 위해서 TTA 반응을 피부르산을 아세토락트산으로 전환할 수 있는 아세토락테이트 합성효소와 커플링시킨 기술이 공개되었으며, 동일한 전략으로서 TTA를 D-아미노산 트랜스아미나아제(DATA)로 대체하여 D-알라닌의 생산에도 적용되었다.

또한, 불리한 평형을 다루기 위한 대안으로서, L-글루탐산이 일차 트랜스아미나아제의 아미노 공여체로서 사용하고, 오르니틴 트랜스아미나아제 반응을 동시에 발동시킴으로써 반응 평형을 이동시켜, 케토산 산물의 자발적 고리화를 가져오기도 하였다.

TTA 및 DATA와 같은 α-트랜스아미나아제(α-TA)에 의해 촉매 작용된 반응들에서 거의 일치하는 평형 상수(K _eq)와는 달리, ω-트랜스아미나아제(ω-TA)에 의해 촉매 작용된 일차 아민과 α-케토산 사이의 트랜스아민화는 에너지적으로 매우 유리하다. 예를 들어, 피부르산과 α-메틸벤질아민간의 트랜스아민화의 K_eq는 1130인 것으로 보고되었다. 따라서, 아미노 공여체로서 일차 아민을 사용한 트랜스아민화는 케토산의 열역학적으로 제약 없는 비대칭 아민화를 허용한다.

본 발명의 발명자들은 이전에 아미노 공여체로서 벤질아민을 사용하여 L-호모알라닌의 비대칭 합성을 연구개발하고, 이를 증명하였다. 그러나, 이 방법의 중대한 단점으로서, 결과의 탈아민화 산물, 즉 벤즈알데히드의 높은 아미노 수용체 반응성이 나타났으며, 이것은 높은 역반응 속도로 인해서 순 반응 속도의 급격한 감소를 야기했다. 예를 들어, 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccusdenitrificans)로부터의 (S)-선택적 ω-TA는 피부르산(ω-TA에 대한 전형적인 아미노 수용체)에 비해서 벤즈알데히드에 대해 84% 반응성을 나타냈다.

따라서, 탈아민화 산물이 비반응성이거나 쉽게 제거될 수 있는 저렴한 아미노 공여체가 ω-TA를 사용한 비천연 아미노산의 예비적 비대칭 합성을 실시하는데 있어서 매우 필요한 실정이다.

상기와 같은 문제점과 관련하여, 이소프로필아민의 경우 이의 탈아민화 산물인 아세톤이 비반응성 아미노 수용체이고, 높은 휘발성으로 인하여 쉽게 제거될 수 있을 뿐만 아니라 저렴한 가격으로 인하여 ω-TA의 이상적인 아미노 공여체라고 할 수 있다.

이와 같이 이소프로필아민을 이용하여 L-호모알라인과 D-호모알라닌 등을 포함하는 비천연 아미노산의 효과적인 합성이 가능함에도 불구하고, 이에 대한 연구개발이 이루어지지 않고 있어, 본 발명자의 발명자들은 아미노 공여체로서 이소프로필아민 등을 사용해서 ω-TA 촉매 작용을 통하여 α-케토산으로부터 거울상 순수한 비천연 아미노산을 합성하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 [반응식 1] 내지 [반응식 2]에 따라 하기의 단계를 포함하는 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제를 이용한 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법을 제공한다.

(ⅰ) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제에 제공하는 단계,

(ⅱ) 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제에 의한 아미노기 전달 반응을 통하여 상기 아미노 공여체로부터 상기 아미노 수용체로 아미노기를 전달하여 아미노산을 생성하는 단계.

[반응식 1]

2a-2p 3a-3d L-1a-1p 4a-4d

[반응식 2]

2a-2p 3a-3d D-1a-1p 4a-4d

상기 [반응식 1] 내지 [반응식 2]에서, 상기 R₁, R₂ 및 R₃은 구체적으로 다음과 같은 구조식으로 정의된다.

또한, 상기 아미노 수용체는 α-케토산으로서, 하기 [화학식 1]로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 [화학식 1]에서, R₁은 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기 및 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 18의 아릴기 중에서 선택되고, 상기 R₁은 수소, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기 및 탄소수 1 내지 10의 알킬기 중에서 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있다.

보다 구체적으로 상기 α-케토산은 2-옥소부티레이트, 피루베이트, 글리옥실레이트, 플루오로피루베이트, 히드록시피루베이트, 머캅토피루베이트, 브로모피루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 트리메틸피루베이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소펜타노에이트, 4-메틸-2-옥소펜타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소옥타노에이트, a-케토글루타레이트 및 페닐글리옥실레이트 중에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 아미노 공여체는 하기 [화학식 2]로 표시되는 아민 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

상기 [화학식 2]에서, R₂ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬기 및 탄소수 6 내지 18의 아릴기 중에서 선택된다.

보다 구체적으로 상기 아미노 공여체는 α-메틸벤질아민, 벤질아민, 이소프로필아민 및 2-부틸아민 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 파라코커스 데니트리피칸스(P. denitrificans, PDTA)에서 유래하거나, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi, OATA)에서 유래하는 것일 수 있으며, 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 아스로박터 종(Arthrobacter sp., ARTA)에서 유래하 것 또는 이의 변이체(AR_mutTA)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법에 따라 제조된 아미노산 및 이를 포함하는 중간체와 이의 의약품을 제공한다.

본 발명에 따르면 고가의 아미노 공여체를 사용하지 않고, 이소프로필아민 등의 저렴한 아미노 공여체를 사용해서 이에 상응하는 케토산으로부터 비천연 아미노산을 오메가 트랜스아미나제에 의해서 우수한 공정 효율로 비대칭 합성할 수 있다. 또한, 종래 알파-트랜스오미나제 기반에서 불리한 평형을 이동시키거나, 부산물 축적을 방지하는 추가적인 효소 투입 공정 등을 사용하지 않고도 우수한 전환율로 아미노산을 합성할 수 있다. 또한, 크기가 큰 치환체를 지닌 α-케토산을 수용할 수 있는 ω-TA 변이체를 이용하여 다양한 비천연 아미노산을 합성할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 아미노 공여체로서 벤질아민 또는 이소프로필아민을 사용한 2-옥소부티르산의 환원성 아민화의 시간과정을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 트레오닌 디아미나제(TD)와 OATA 또는 AR_mutTA가 커플링된 반응을 통하여 L-호모알라닌 또는 D-호모알라닌 전환 수율을 확인한 그래프이다.

이하, 도면, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예

(1) 효소 분석

37 ℃ 및 50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7)에서 전형적인 효소 분석을 수행했다. ω-TA 활성 1 유닛은 20 mM 피루베이트 및 20 mM (S)-또는 (R)-α-메틸벤질아민에서 아세토페논 1 μmole의 형성을 촉매 작용하는 효소량으로 정의하였다. 쓰레오닌 디아미나제(TD) 1 유닛은 50 mM L-쓰레오닌에서 1분 내에 2-옥소부티레이트 1 μmole을 생산하는 효소량으로 정의하였다.

(2) 아미노 공여체 및 수용체 반응성의 측정

50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7)에서 피루베이트(20 mM)와 아민(20 mM, α-메틸벤질아민, 벤질아민, 이소프로필아민)을 가지고 아미노 공여체 반응성을 측정했다. 반응 혼합물 중 효소 농도는 PDTA, OATA 및 (R)-선택적 ω-TA에 대해 각각 0.5, 0.7 및 0.2 U mL^{- 1}였다. 반응은 10분 유지했고, 생산된 L-알라닌(1b) 또는 D-알라닌(1b)를 분석해서 초기 속도(즉, 전환율 <15% )를 측정했다. (S)-메틸벤질아민(3a) 또는 (R)-메틸벤질아민(3a)(20 mM), α-케토산(20 mM) 및 ω-TA를 가지고 아미노 수용체 반응성을 측정했다(OATA 및 AR_mutTA에 대해 각각 0.1 및 0.05 U mL^-1). 생산된 아세토페논을 분석해서 초기 속도를 측정했다.

(3) 비천연 α-아미노산의 비대칭 합성

50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7)에서 100 mM 2-옥소부티레이트(2a), 150 mM 아민, 0.5 mM PLP 및 5 U mL^-1 OATA에서 아미노 공여체로서 벤질아민(3b) 또는 이소프로필아민(3c)를 사용했을 때 2-옥소부티레이트(2a)의 환원성 아민화의 시간 과정을 모니터했다. 반응 부피는 500 ㎕였고, 반응 혼합물을 37 ℃에서 인큐베이션했다. 반응 혼합물의 알리쿼트들(10 ㎕)을 정해진 반응 시간에 취하고, 60 ㎕ 아세토니트릴을 혼합해서 반응을 종료시켰다. 반응 혼합물로 2-옥소부티레이트(2a)의 HPLC 분석을 수행하여 전환율을 측정했다.

37 ℃에서 50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7)에서 100 mM α-케토산(2-옥소부티레이트, 피루베이트, 플루오로피루베이트, 히드록시피루베이트, 2-옥소옥타노에이트, 2a, 2b, 2d, 2e 및 2n), 150 mM 이소프로필아민(3c), 0.5 mM PLP 및 50 U mL^-1 ω-TA를 가지고 비천연 아미노산의 비대칭 합성(1 mL 반응 부피)을 수행했다. 케토산과 아미노산을 분석하여 각각 전환율과 거울상 초과량을 측정했다.

(4) TD /ω- TA 커플링 반응

50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7)에서 100 mM L-트레오닌(L-5), 200 mM 이소프로필아민(3c), 0.5 mM PLP, 5 U mL^-1 TD 및 20 U mL^-1 ω-TA를 가지고 37 ℃에서 커플링 반응을 수행하여 L-호모알라닌(1a) 및 D-호모알라닌(1a)(1 mL 반응 부피)를 합성했다. L-호모알라닌(1a) 및 D-호모알라닌(1a)의 제조를 위해 각각 OATA 및 AR_mutTA를 이용했다. 호모알라닌을 분석하여 전환 수율 및 거울상 초과량을 측정했다.

300 mM L-트레오닌(L-5), 450 mM 이소프로필아민(3c), 0.5 mM PLP, 5 U mL^-1 TD 및 10 U mL^-1 ω-TA(OATA 또는 AR_mutTA)를 함유하는 50 mL 반응 혼합물에서 37 ℃에서 마그네틱 교반하면서 L-호모알라닌 및 D-호모알라닌의 예비 규모 합성을 수행했다. 전환율이 99%를 초과했을 때 반응 혼합물에서 생성물을 분리했다.

(5) L-호모알라닌 및 D-호모알라닌의 정제 및 구조 특성화

5 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 조정해서 단백질을 침전시켰다. 유리-프릿 필터 깔대기를 통해 반응 혼합물을 여과해서 단백질 침전물을 제거했다. 여과액을 Dowex 50WX8 양이온-교환 수지(40 g)로 충전된 유리 컬럼에 로딩하고, 이어서 0.1 N HCl(120 mL)와 물(120 mL)로 세척한 후, 10% 암모니아 용액 145 mL로 용출시켰다. 용출액 분획들을 모아서 30 ℃ 및 0.1 bar에서 증발시켰다. 결과의 고체를 EtOH(50 mL)로 세척한 다음 하룻밤 오븐 건조시켰다. 정제된 L-호모알라닌 및 D-호모알라닌을 ¹H NMR, ¹³C NMR, IR, 원소 분석 및 LC/MS에 의해 구조적으로 특성화하여, 원하는 순수한 산물의 회수를 확인하였다.

실험예 1.

이소프로필아민은 이상적인 아미노 공여체기는 하지만, 대부분의 ω-TA들은 이소프로필아민에 대해 실질적인 반응성을 나타내지 않는다. 예를 들어, 두 전형적인 ω-TA, 즉 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis) JS17(J. S. Shin and B. G. Kim, J. Org . Chem ., 2002, 67, 2848-2853)에서 유래된 (S)-선택적 ω-TA와 아스로박터 종(Arthrobacter sp., ARTA)에서 유래된 (R)-선택적 ω-TA는 이소프로필아민에 대해 반응성이 없는 것으로 확인되었다.

따라서, 이소프로필아민에 대하여 반응성을 보이면서, 이소프로필 아민을 효과적인 아미노 공여체로 이용할 수 있는 최적의 ω-TA를 도출하였다.

이를 위하여, 파라코커스 데니트리피칸스(P. denitrificans, PDTA)와 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi, OATA)로부터 클로닝된 2 개의 (S)-선택적 ω-TA(각각 서열번호 1, 서열번호 2)와 이소프로필아민에 의한 부틸케톤의 환원성 아민화를 위해서 유전자 조작된 (R)-선택적 ARTA(서열번호 3) 및 이의 변이체(AR_mutTA, 서열번호 4)에 대해 4개의 1차 아민(α-메틸벤질아민, 벤질아민, 이소프로필아민, 2-부틸아민)의 아미노 공여체 반응성을 시험하였고, 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.

아민		상대적 반응성 (%)
		PDTA	OATA	ARTA	ARmutTA
3a	α-메틸벤질아민	100	100	100	100
3b	벤질아민	128	259	3	28
3c	이소프로필아민	7	43	2	8
3d	2-부틸아민	n.r.	23	2	14

상기 [표 1]은 ω-TA에 대한 일차 아민의 아미노 공여체 반응성에 대한 것으로서, 상대적 반응성(%)은 (S)-α-메틸벤질아민 또는 (R)-α-메틸벤질아민의 것으로 정규화된 초기 반응속도(즉, <15% 전환율)를 나타낸다.

반응 조건은 아민(20 mM) 및 피브루산(20 mM)이고, 거울상 순수한 (S)- 및 (R)-α-메틸벤질아민(20 mM)이 (S)- 및 (R)-선택적 ω-TA에서 각각 사용되었다. 또한, Rac-2-부틸아민(40 mM)이 반응성 측정에 사용되었으며, n.r.은 상대적 반응성이 1% 이하인 것으로서, 반응성 없음을 나타낸다.

2 개의 (S)-선택적 ω-TA는 벤질아민에서 (S)-α-메틸벤질아민보다 높은 반응성을 나타냈지만, 2 개의 (R)-선택적 ω-TA는 벤질아민에서 (R)-α-메틸벤질아민보다 훨씬 더 낮은 반응성을 나타냈다. PDTA와 ARTA는 알킬아민(즉, 이소프로필아민, 2-부틸아민)에 대해서는 평범한 반응성을 나타냈다. 반면에, OATA는 알킬아민에 대해 실질적인 반응성을 나타냈고, 이소프로필아민의 반응성은 (S)-α-메틸벤질아민에 비해 43%였다. 또한, AR_mutTA는 ARTA보다 이소프로필아민에 대해 높은 반응성을 나타냈다.

따라서, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi, OATA)로부터 클로닝된 (S)-선택적 ω-TA(OATA, 서열번호 2)와 아스로박터 종(Arthrobacter sp., ARTA)에서 유래된 (R)-선택적 ω-TA의 변이체(AR_mutTA, 서열번호 4)가 각각 이소프로필아민을 효과적인 아미노 공여체로 사용하여 L-아미노산 및 D-아미노산의 비대칭 합성에 적합한 것임을 확인하였다.

실험예 2.

이소프로필아민이 벤질아민보다 더 나은 아미노 공여체인지를 확인하기 위해 아미노 공여체로서 상기 두 아민을 사용해서 OATA에 의해 촉매작용된 2-옥소부티르산의 아민화 반응 진행을 비교하였고, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

하기 도 1은 아미노 공여체로서 벤질아민 또는 이소프로필아민을 사용한 2-옥소부티르산의 환원성 아민화의 시간과정 모니터한 결과이고, 반응 조건은 2-옥소부티르산(100 mM), 아민(150 mM) 및 OATA (5 U mL^-1)였다.

이소프로필아민보다 벤질아민의 반응성이 6배 더 높았지만, 두 반응은 30분까지는 유사한 전환율을 나타냈고, 이후 벤질아민과의 반응은 이소프로필아민과의 반응보다 훨씬 더 느려졌다. 또한, 4시간 반응 후 전환율은 이소프로필아민의 경우 >99%에 도달했고, 벤질아민은 86%의 전환율을 보였다. 이는 벤즈알데히드의 높은 아미노 수용체 반응성(피부르산에 비해 35%)에 의해 야기된 생성물 억제가 케토산의 효과적인 아민화에 매우 해롭다는 것을 명백히 보여주는 것이다.

실험예 3.

대부분의 ω-TA들은 결합에 있어서 심한 입체적 제약을 갖기 때문에 에틸기보다 큰 치환체의 진입이 불가능하다고 알려져 있다. 본 발명에 따라 최적의 ω-TA로 도출된 OATA 및 AR_mutTA에 의해 생산될 수 있는 아미노산의 범위를 확인하고자 α-케토산에 대한 상기 ω-TA의 기질 특이성을 실험하였으며, 그 결과를 하기 [표 2]에 나타내었다.

α-케토산		상대적 반응성(%)
		OATA	ARmutTA
2a	2-옥소부티레이트	13	33
2b	피루베이트	100	100
2c	글리옥실레이트	135	36
2d	플루오로피루베이트	43	5
2e	히드록시피루베이트	14	6
2f	머캅토피루베이트	n.r.	n.r.
2g	브로모피루베이트	n.r.	n.r.
2h	3-메틸-2-옥소부티레이트	n.r.	n.r.
2i	트리메틸피루베이트	n.r.	n.r.
2j	2-옥소펜타노에이트	n.r.	2
2k	3-메틸-2-옥소펜타노에이트	n.r.	n.r.
2l	4-메틸-2-옥소펜타노에이트	n.r.	n.r.
2m	2-옥소헥사노에이트	n.r.	2
2n	2-옥소옥타노에이트	n.r.	8
2o	a-케토글루타레이트	n.r.	n.r.
2p	페닐글리옥실레이트	n.r.	n.r.

상기 [표 2]에서 상대적 반응성(%)은 피루브산의 것으로 정규화된 초기 반응 속도를 나타낸다. 반응 조건은 α-케토산(20 mM) 및 (S)-α-메틸벤질아민 또는 (R)-α-메틸벤질아민(20 mM)이고, n.r.은 반응성 없음을 나타낸다.

상기 [표 1]에서 보는 바와 같이 OATA는 상기 실험된 16개 중에서 에틸기보다 작은 치환체를 지닌 α-케토산들, 즉 5개의 α-케토산(2a-2e)에 대해서만 실질적인 반응성을 나타냈다. 또한, α-케토산에 대한 ARTA(모 효소)의 입체 제약은 아릴알킬케톤의 부틸 치환체를 수용하기 위해 도입된 다중 돌연변이에도 불구하고 AR_mutTA에서도 여전히 보존되는 것으로 판명되었다.

그러나, AR_mutTA의 확장된 결합 포켓은 선형 알킬 치환체(즉, 2j, 2m-2n)를 지닌 α-케토산들에 대한 반응성이 개선되었다. 특히, 2n이 2j 및 2m보다 훨씬 높은 반응성을 나타낸 것이 주목할 만한 점이다.

실험예 4.

비천연 아미노산의 비대칭 합성을 위해, 본 발명에 따른 실시예에서는 OATA는 5% 이상의 상대 반응성을 나타내는 α-케토산, 즉 하기 [표 3]에서 2a 및 2d와 함께 진행하고, AR_mutTA는 2a-2b, 2d-2e 및 2n과 함께 진행하였다.

기질		ω-TA	반응시간 (h)	전환율 (%)	생성물 (% ee)
2a	2-옥소부티레이트	OATA	0.5	99	L-호모알라닌 (>99.9)
2d	플루오로피루베이트	OATA	10	79	L-플루오로알라닌 (>99.9)
2a	2-옥소부티레이트	ARmutTA	0.5	99	D-호모알라닌 (>99.9)
2b	피루베이트	ARmutTA	0.2	98	D-알라닌 (>99.9)
2d	플루오로피루베이트	ARmutTA	10	86	D-플루오로알라닌 (>99.9)
2e	히드록시피루베이트	ARmutTA	2	99	D-세린 (>99.9)
2n	2-옥소옥타노에이트	ARmutTA	0.5	99	D-노르류신 (>99.9)

이소프로필아민(1.5몰 당량)에 의한 α-케토산(100 mM)의 환원성 아민화는 플루오로피루베이트(2d)를 제외하고는 2 시간 이내에 98% 이상의 전환율 및 우수한 거울상 순도(>99.9%)를 가진 비천연 아미노산의 효과적인 합성을 가져왔다. 다른 α-케토산과 비교하여 플루오로피루베이트(2d)의 아민화는 두 ω-Ta에서 모두 예상외로 느린 반응 진행을 나타냈다. 두 아민화 반응에서 효소 응집체의 형성이 관찰되었기 때문에, 플루오로피루베이트(2d)나 이의 아민화 산물인 플루오로알라닌이 비가역적 효소 비활성화를 유도했다고 판단할 수 있다. 또한, 플루오로피루베이트(2d)나 이소프로필아민(3c)를 함유한 인큐베이션 용액에서는 효소 침전이 관찰되지 않았기 때문에 효소 비활성화를 유도한 것으로 판명되었다. 따라서, 플루오로피루베이트(2d)의 효과적인 아민화를 위해서 효소 고정과 같이 효소 안정성을 증진시키는 방법이 이용될 필요가 있다.

상기 [표 3]에 열거된 비천연 아미노산들은 산업적으로 매우 중요하다. L-호모알라닌은 제약 산업에서 활용도가 매우 높으며, 이뿐만 아니라 D-알라닌은 아바렐릭스(Abarelix)(항종양제)의 빌딩 블록이고, D-세린은 D-시클로세린(인지개선제)의 전구체이다. 또한, D-플로오로알라닌은 세균성 알라닌 라세미화 효소를 비활성화하는 능력 덕분에 항생제로 활용되고 있다.

실험예 5.

상기 [표 3]에서 사용된 α-케토산 중에서 2-옥소부티레이트는 트레오닌 디아미나아제(TD)를 사용해서 저렴한 전구체, 즉 L-트레오닌(L-5)으로부터 쉽게 얻을 수 있음을 이미 확인하였으며, L-트레오닌은 미생물 발효에 의해 대량 생산되는 저렴한 천연 아미노산 중 하나이다.

따라서, 본 발명의 실시예에서 하기 [반응식 2]와 같이, ω-TA 반응을 Escherichia coli로부터 클로닝된 트레오인 디아미나제(TD)와 커플링함으로써 호모알라닌(1a)의 두 거울상이성질체가 모두 L-트레오닌(L-5)과 이소프로필아민(3c)으로부터 생산할 수 있는지에 대해서 실험하였다.

[반응식 2]

상기 생성된 L-호모알라닌(1a) 및 D-호모알라닌(1a)의 탄소 골격과 아미노기는 L-트레오닌(L-5)과 이소프로필아민(3c)으로부터 각각 유래된 것이다. TD/OATA 커플링된 L-5(100 mM) 및 3c(2 당량)를 사용한 반응은 하기 도 2에서 보는 바와 같이, 60 분째 종료되었고, 전환 수율은 99%였으며, 생산된 L-호모알라닌(1a)는 >99.9% ee를 나타냈다.

D-호모알라닌(1a)를 생산하기 위해서 OATA를 AR_mutTA로 치환하여 동일한 기질 조건에서, TD/AR_mutTA 반응은 90분째에 98%의 전환 수율과 >99.9% ee로서 D-호모알라닌(1a)를 생산했다. TD/AR_mutTA 반응을 완료하기 위해 필요한 더 긴 반응 시간은 OATA보다 AR_mutTA에 대한 이소프로필아민(3c)의 반응성이 상대적으로 더 낮았기 때문이다.

상기 결과로부터, 제약학상 중요한 호모알라닌(1a)의 두 거울상 이성질체가 저렴한 기질로부터 쉽게 제조될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 6.

L-트레오닌(L-5)(1.79 g, 15 mmol) 및 이소프로필아민(3c)(1.94 mL, 22.5 mmol)로 채운 50 mL 반응 혼합물에서 상기 실험예 5의 TD/ω-TA 방법을 이용하여 L-호모알라닌(1a) 및 D-호모알라닌(1a)의 합성을 수행하였다.

그 결과, TD/OATA 및 TD/AR_mutTA 반응에서 99%를 넘는 전환율이 각각 12시간 및 24시간 이내에 얻어졌으며, 원하는 아미노산 산물의 정제 및 구조 특성화를 수행하여, 순수한 L-호모알라닌(1a)(1.20 g, 77.6% 분리 수율, >99.9% ee) 및 D-호모알라닌(1a)(1.21 g, 78.2% 수율, >99.9% ee)를 회수했다.

이와 같이 본 발명에 따르면,

1. 이소프로필아민을 사용해서 이에 상응하는 케토산으로부터 비천연 아미노산을 효과적인 생물 촉매에 의해 비대칭 합성할 수 있다.

2. 또한, α-TA 반응과는 달리, 저렴한 비키랄 아미노 공여체를 사용한 본 발명에 따른 ω-TA를 이용하는 방법은 열역학적으로 매우 유리하다. 이는 α-TA 기반에서 반드시 필요했던 불리한 평형을 이동시키거나, 부산물 축적을 방지하는 추가적인 효소의 필요성을 없앨 수 있으므로 공정 효율이 매우 우수하다고 할 수 있다.

3. 또한, D-아미노산의 합성과 관련해서, α-TA를 이용한 방법의 중대한 단점으로서, DATA 반응에서 D-아스파르트산을 사용하는 것처럼 아미노 공여체로서 고가의 D-아미노산이 필요하나, 본 발명에 따른 방법에 의하면 이러한 단점을 해소할 수 있다.

4. 또한, 구조적으로 다양한 비천연 아미노산의 비대칭 합성에 대해서 본 발명에 따른 방법을 적용하기 위해서는 ω-TA들의 기질 결합 포켓의 입체 제약이 해결되어야 한다. 현재 20개 이상의 ω-TA가 보고되고 있지만, 에틸기보다 부피가 큰 치환체를 지닌 α-케토산을 수용할 수 있는 자연 발생 효소는 확인되지 않고 있다. 본 발명은 크기가 큰 α-케토산을 수용할 수 있는 ω-TA 변이체를 설계하여 기질 결합 포켓이 다양한 벌키한 치환체를 수용할 수 있는 ω-TA 변이체를 만들어내어 이를 해결하였다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Asymmetric synthesis method of unnatural amino acids using omega transaminase catalysis <130> HPC-4357 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 1 atgaaccaac cgcaaagctg ggaagcccgg gccgagacct attcgctcta cggtttcacc 60 gacatgccct cggtccatca gcggggcacg gtcgtcgtga cccatggcga ggggccctat 120 atcgtcgatg tccatggccg ccgctatctg gatgccaatt cgggcctgtg gaacatggtc 180 gcgggcttcg accacaaggg cctgatcgag gccgccaagg cgcaatacga ccgctttccc 240 ggctatcacg cctttttcgg ccgcatgtcc gaccagaccg tgatgctgtc ggaaaagctg 300 gtcgaggtct cgccattcga caacggccgg gtcttctata ccaattccgg ctccgaggcg 360 aacgacacca tggtcaagat gctgtggttc ctgcatgccg ccgagggcaa gccgcaaaag 420 cgcaagatcc tgacgcgctg gaacgcctat cacggcgtga ccgcggtttc ggcctcgatg 480 accggcaagc cctacaactc ggtcttcggc ctgccgctgc ccggcttcat ccacctgacc 540 tgcccgcatt actggcgcta tggcgaggaa ggcgagaccg aggcgcaatt cgtcgcccgc 600 ctggcacgcg agcttgagga 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Claims (12)

1. (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제를 이용한 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법으로서,
   (ⅰ) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제에 제공하는 단계; 및
   (ⅱ) 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제에 의한 아미노기 전달 반응을 통하여 상기 아미노 공여체로부터 상기 아미노 수용체로 아미노기를 전달하여 아미노산을 생성하는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 아미노 수용체는 α-케토산으로서, 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 [화학식 1]에서,
   R₁은 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기 및 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 18의 아릴기 중에서 선택되고,
   상기 R₁은 수소, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기 및 탄소수 1 내지 10의 알킬기 중에서 선택되는 1종 이상으로 더 치환될 수 있다.
3. 제2항에 있어서,
   상기 α-케토산은 2-옥소부티레이트, 피루베이트, 글리옥실레이트, 플루오로피루베이트, 히드록시피루베이트, 머캅토피루베이트, 브로모피루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 트리메틸피루베이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소펜타노에이트, 4-메틸-2-옥소펜타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소옥타노에이트, α-케토글루타레이트 및 페닐글리옥실레이트 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 아미노 공여체는 하기 [화학식 2]로 표시되는 아민 화합물인 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법:
   [화학식 2]
   

   

   
   상기 [화학식 2]에서,
   R₂ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬기 및 탄소수 6 내지 18의 아릴기 중에서 선택된다.
5. 제4항에 있어서,
   상기 아미노 공여체는 α-메틸벤질아민, 벤질아민, 이소프로필아민 및 2-부틸아민 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 파라코커스 데니트리피칸스(P. denitrificans, PDTA)에서 유래하거나, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi, OATA)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 아스로박터 종(Arthrobacter sp., ARTA)에서 유래하 것 또는 이의 변이체(AR_mutTA)인 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미나제는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로부터 전사된 후 번역되어 생성되는 것을 특징으로 하는 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 비천연 아미노산의 비대칭 합성방법에 따라 제조된 아미노산.
11. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산은 L-폼 또는 D-폼의 글리신, 호모알라닌, 알라닌, 세린, 노르발린, 발린, 류신, 노르류신, 이소류신, 페닐글리신, 페닐알라닌, 플루오르알라닌, 브로모알라닌, 머캅토알라닌, 글루타메이트 및 아스파레이트 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노산.
12. 제8항에 따른 아미노산을 이용하여 제조된 의약품 중간체 또는 의약품.

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