CN109019875B - 一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法 - Google Patents

一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法，其特征在于：其处理的工艺步骤按下列顺序依次进行：预处理，生化处理，沉淀处理，沉淀污物浓缩处理，浓缩污泥脱水处理。方法简单，具有很高的应用价值。

Description

一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法
技术领域
本发明涉及一种污水处理方法，尤其涉及一种提高低温污水中磷和氮去除果的方法。
背景技术
污水经处理再回收利用可以保护自然环境，同时能有效的缓解水资源短缺的现状。但是高纬度地区冬季漫长、气温低直接影响了污水的处理效果。目前为了保证出水质量主要采用升高污水温度、提高污泥浓度、延长沉淀时间、向CASS(CyclicActiavated SludgeSystem)池投加粘土和增加曝气量等方法，但是存在工艺复杂、处理成本高、能耗大的问题。
城市污水处理主要采用生物活性污泥法，污水中的有机物在活性污泥工艺中微生物的催化作用下经过一系列的生物化学反应，逐级释放能量，最终以低能位的无机物稳定下来。但是生物处理工艺需要采取一定的人工技术措施(如曝气、回流循环、保温等)，为微生物的生长、繁殖创造良好的环境，以使污水中的有机性污染物得以降解、去除。由于很多北方地区污水处理厂需要面临长达3-5个月的低温环境，对水温敏感的微生物会由于水温的下降造成活性污泥的吸附性能、沉降性能、微生物的种群结构发生，影响最终出水水质。特别是低温污水中较高含量的颗粒物和胶体物质会严重抑制微生物生物活性，延缓生化反应速率，降低生物处理工艺运行稳定性和处理水水质。针对水温下降的弊端，大多数污水处理厂采用降低污泥负荷、增加污泥量、延长污水停留时间或采取保温、升温等办法来维持冬季处理水质的达标的运行策略，不仅增加了投资与运行费用，而且污水处理效果也难得到保证，还会引起污泥膨胀等问题造成管理不便。
为了解决现有技术的缺陷，CN102060361A提供了一种低温污水的物化强化处理方法。处理方法如下：一、原水通过进水管进入混合区，同时将絮凝药剂聚合氯化铝通过投药点投加到原水中；二、经步骤一处理原水分别经过一级絮凝反应区、二级絮凝反应区和三级絮凝反应区；三、经步骤二处理得到的稳定絮体经固液分离，处理后的出水溢流排出系统，污泥排出系统。本发明采用多级控制方式，通过分形维数和絮体粒径成长状况的控制解决了利用传统速度梯度G值控制的弊端，处理效果好，达到了提高低温条件下絮凝反应效率和污染物降解效率的目的。但是该方法物理程序较长，并且使用的成分较多，成本较高，不适宜大规模的推广使用。
CN102533590A中公开了一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌及分离培养方法，投加该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCCNo.5280在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对磷去除有明显的强化作用，磷去除率提高了10％，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为0.5mg/L)。但是该菌只能去除磷，对于其他有机物没有较好的去除作用，同时磷的去除率也有待进一步的提高。
CN101054242A中公开了应用即耐冷动性球菌AS 1.2722在低温污水处理中的应用。低温污水处理的方法是将耐冷动性球菌AS 1.2722接种于污水中在10℃至25℃下培养，利用耐冷动性球菌AS 1.2722在较低的温度下，可以有效去除污水中淀粉、蛋白、脂肪和BOD、COD。但是该方法针对氮和磷的去除能力还有待改进，其他有机物的去除也有待进一步的提高。
本发明基于现有技术的缺陷，针对低温污水的处理提供了相应的改进。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前低温污水处理方法工艺复杂、处理成本高和能耗大的问题，而提供的一种低温污水处理方法。
本发明的一个技术方案为：一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法，其特征在于：其处理的工艺步骤按下列顺序依次进行：预处理，生化处理，沉淀处理，沉淀污物浓缩处理，浓缩污泥脱水处理。
本发明的一个技术方案为提供一株耐冷动性球菌在低温污水处理中的应用，即耐冷动性球菌(Planococcus psychrotoleratus)CGMCC1.2722在低温污水处理中的应用。
本发明另外提供一种增强耐冷动性球菌在低温条件下增强污水中氮和磷去除的蛋白的筛选方法，将黄杆菌节杆菌液体过夜培养，收集菌体，提取总DNA，DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。纯化好的总DNA经BamHI酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa REC0CHIP回收0.5-1OKb之间的片段。pET-28a质粒经BamHI酶切后用去磷酸化酶(CIP)处理，防止在后续连接中的自连。将回收得到0.5-10Kb之间的DNA片段连入pET-28a载体，连接产物经醇沉处理，用去离子水溶解，电转化感受态细胞DH5α。得到库容大约l08的基因组文库。将文库质粒化学转化至BL21(DE3)，在氮和磷分别在LB培养基中分别添加1000mg/L的浓度下，进行筛选，以氮磷去除效率最高的摇瓶进行涂布2000mg/L氮磷平板，挑选单菌落，在3000mg/L的氮和磷的LB培养基中进行再次摇瓶培养，选择氮磷去除效果较高的作为候选基因来源，提取质粒，测序。即可获得能够显著提高氮磷去除效果的蛋白。
本发明另外提供一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法，包含如下步骤：用接种针挑取少许斜面培养的转基因耐冷动性球菌先进行扩培,以1.5X108cfu/mL分别接种于生活污水中，12℃搅拌培养3天即可；其中，转基因耐冷动性球菌为耐冷动性球菌CGMCC1.2722导入了序列为SEQ ID NO：1所示的基因而获得；或者在SEQ ID NO：1所示的基因基础上，将其编码的氨基酸序列进行突变后的序列，所述突变的位点为有一个下述任一情形的点突变：83A/T、221E/G、342A/S、401R/G、422L/A、449T/R、或463K/V。
本发明另外提供一种提高氮磷去除效果的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明另外提供一种提高氮磷去除效果的蛋白，其氨基酸序列为在SEQ ID NO：2所示序列的基础上，有一个下述任一情形的点突变：83A/T、221E/G、342A/S、401R/G、422L/A、449T/R、或463K/V。
本发明还涉及上述蛋白在提高耐冷动性球菌CGMCC1.2722去除低温污水中氮磷中的应用。
本发明另外提供一种增强耐冷动性球菌在低温条件下增强污水中氮和磷去除的蛋白，其序列如SEQ ID NO：2所示，其基因序列如SEQ ID NO：1所示.
其中本发明还提供了一种改进的增强耐冷动性球菌在低温条件下增强污水中氮和磷去除的蛋白，其序列为在SEQ ID NO：2的基础上将83A、221E、342A、401R、422L、449T、463K进行突变。
进一步的，所述突变分别为83A/T、221E/G、342A/S、401R/G、422L/A、449T/R、463K/V。该突变为从300种突变情形中筛选获得的具有提高蛋白活性的情形。
本发明还提供转基因的耐冷动性球菌(Planococcus psychrotoleratus)CGMCC1.2722(即AS1.2722)进行低温污水处理的方法，所述基因对应编码SEQ ID NO：2所示的蛋白，或者在SEQ ID NO：2的基础上将83A、221E、342A、401R、422L、449T、463K进行突变的蛋白。
本发明所提供低温污水处理的方法是利用转基因的耐冷动性球菌(Planococcuspsychrotoleratus)CGMCC1.2722,在低温条件下进行污水处理，具体方法是将转基因的耐冷动性球菌(Planococcus psychrotoleratus)CGMCC1.2722接种于污水中在10℃至25℃下培养。
所述耐冷动性球菌在污水中培养的温度优选为18-22℃。
所述耐冷动性球菌接种浓度的沮围可为l05-l08cfu/mL,优选为107cfu/mL。
所述污水可为生活污水、淀粉厂污水、蓄禽养殖污水或屠宰场污水，优选为生活污水。
本发明利用转基因的耐冷动性球菌(Planococcuspsychrotoleratus)CGMCC1.2722耐受低温生长环境的特点，将其用于低温污水处理，实验证明，将耐冷动性球菌接入生活污水中，在较低的温度下(10-25摄氏度)该菌株生长良好，可以有效去除污水中淀粉、蛋白、脂肪和BOD、COD，在含此类污染物的低温污水/废水(如生活污水)的生物处理中，具有很高的应用价值。
具体实施方式
实施例1文库构建以及氮磷降解蛋白的筛选
一种增强耐冷动性球菌在低温条件下增强污水中氮和磷去除的蛋白的筛选方法，将节杆菌Arthrobacter luteolus采用液体过夜培养，所述培养基为透明质酸0.8g，牛肉膏15g，蛋白胨10g，MgSO4 0.5g,NaCl 5g，H20 1000mL，自然pH中，培养条件为培养温度32℃，培养转速160rpm。收集菌体，提取总DNA，DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。纯化好的总DNA经BamHI酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa REC0CHIP回收0.5-1OKb之间的片段。pET-28a质粒经BamHI酶切后用去磷酸化酶(CIP)处理，防止在后续连接中的自连。将回收得到0.5-10Kb之间的DNA片段连入pET-28a载体，连接产物经醇沉处理，用去离子水溶解，电转化感受态细胞DH5α。得到库容大约l08的基因组文库。将文库质粒化学转化至BL21(DE3)，在氮和磷分别在LB培养基中分别添加1000mg/L的浓度下，进行筛选，以氮磷去除效率最高的摇瓶进行涂布2000mg/L氮磷平板，挑选单菌落，在3000mg/L的氮和磷的LB培养基中进行再次摇瓶培养，选择氮磷去除效果较高的作为候选基因来源，提取质粒，测序。获得能够显著提高氮磷去除效果的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2蛋白活性提高
采用CN103103167A中公开的点突变方法，以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基础，构建突变体库，采用实施例1中相似的方法，进行活性蛋白的筛选，最终得到在83A/T(表述将A突变为T)、221E/G、342A/S、401R/G、422L/A、449T/R、463K/V进行点突变后的蛋白其活性得到了显著的提高。
将所述突变后的蛋白的编码序列分别在两端添加HindIII和Xhol酶切位点，然后将目的基因构建到pGL3-basic载体中，随后通过电击转化到感受态细胞CGMCC1.2722中，筛选阳性克隆，进行后续实验。
实施例3污水处理实验
耐冷动性球菌CGMCC1.2722对模拟生活污水的处理效果实验
根据生活污水以淀粉、蛋白和脂肪为主要污染物，以及它的C0D含量约为300mg/L、且C:N:P约为100:5:1的特点，配制模拟生活污水：以葡萄糖+淀粉(各50％)、NH4C1+蛋白胨(各50％)、K2HPO4以及5mL/L的无机盐溶液配制成C0D为300mg/L的模拟生活污水(葡萄糖0.15g/L,淀粉0.15g/L,酵母粉0.01g/L，NH4Cl 0.01g/L,KH2P04 0.005g/L，无机盐溶液5mL/L)。其中，无机盐溶液同实施例3的无机盐溶液。该模拟生活污水COD为300mg/L，BOD含量为285mg/L、淀粉含量为150mg/L,蛋白含量为10mg/L。
对耐冷动性球菌进行生活污水处理的模拟试验，具体步骤如下所述：
用接种针挑取少许斜面培养的耐冷动性球菌以及相应的转基因菌株和含有突变蛋白的转基因株先进行扩培,以1.5X108cfu/mL分别接种于含1OOmL上述模拟生活污水的250mL三角瓶中，12℃摇床培养3天后测定菌株在模拟生活污水中的生长情况以及C0D的去除效果。菌株生长的测定以波长600nm处的浊度表示；C0D的测定采用国标法(GB11 914-89)、淀粉的测定采用碘-碘化钾法、蛋白的测定采用Bradford法、B0D5的测定采用标准法测定了培养前后的各项指标。
结果如表1所示。
表1.耐冷动性球菌对模拟生活污水的处理效果
Figure BDA0001794923230000061
Figure BDA0001794923230000071
从表1的结果可以看出，本发明通过导入了SEQ ID NO：2以及相应变体的蛋白，能够显著的提高所述的耐冷动性球菌对模拟生活污水的处理效果，各项污染物指标的去除率可从原始的未导入基因的90％以上(除蛋白外)提高到99％以上，而且在相同的培养时间内，菌体的繁殖效率也显著的提高从OD的结果可以看出，繁殖的增速很快，具有显著的进步。
序列表
<110> 余素萍
<120> 一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1515
<212> DNA
<213> 节杆菌(Arthrobacter luteolus)
<400> 1
atgaccgtga gcctgagccc ccccaccgcc aggctgcaga ggctgctggg caagaccagc 60
atgtacagga tgctggtgat gctgctgctg gccatggccg cctggagctt cgtgctgagc 120
ctgaccggcg ccctgttcta cacccccgcc gagctgggcg ccaccctggc caccgccgtg 180
atcagcaccc tggtggccag cagggtgatg ggcctgctgt tcaggacctt cccccagacc 240
gacagcgccc tgatcaccgg cctgctgctg ttcttcctgt tctggcccac caccagcggc 300
cccgagctgg gcaccatcgc cctggccgcc ttcgccgcca ccgccagcaa gtacctgctg 360
gtgtggagga ggaggcacat cttcaacccc gccgccctgg gcgccgtggt gatcggcctg 420
accggcctga accagcccgt gtggtgggtg gccgcccccc tgatgctggt ggtggtgctg 480
cccgccgcct tcctggtgct gtacaggagc aggctgctgc ccatggccgg cgtgttcgtg 540
ctggtgaccg tgggcatcgt ggtgctgagg ttcgccgtga gcggcgagcc cgccctggac 600
ggcctggcca ccgccttcac cagctacccc atcctgttct tcgccggctt catgctgagc 660
gagcccctga ccctgccccc cctgaggtgg cagaggctgg ccgaggccgc cgtggtggcc 720
gtgctgttca ccacccccct gagcgtgggc cccgtgttca tgagccccga gctggccctg 780
ctgatcggca acctgctggc cttcgccgtg ggccagaggg gcggcatcag cctgaggctg 840
agggagacca gggacctgac ccccaccagc agggagctgg tgttcgagcc cgccaggacc 900
ctgaggtaca gggccggcca gtacctggag ctgagcctgc cccaccccaa ccccgacggc 960
aggggcctga ggaggatctt cagcatcacc agcgaccccg ccgacgccag gaccgtgagc 1020
gtggccctga gggtgagcga gcccggcagc agcttcaaga ccaagctgct gaggctgaag 1080
cccggcgcca ggatcagcgc caccaccgtg ggcggcgact tccagctgcc cagggacgtg 1140
agcaggaaga tcctgatggt ggccagcggc atcggcatca cccccttcgt gagccagctg 1200
aggagcggcg ccgccagggg cagggacatc gtgctggtgt acgccgccag cagcccccag 1260
gagctggcct acgccaggga gctggccgac ctgggcgtga gggtgttcgt gtgcaccccc 1320
gaggaccccc agctgcccgg ctggacctgg ctgggcagcg gcctgcccga cgccgacagg 1380
ctgctgaagg ccgtgcccga cgccgtggag aggagcgcct tcgtggccgg cagccccagc 1440
gccgtgagct tcgtgagggg cgaggccagg agggccggca tcaggaggat ccacaccgac 1500
cccttcctgg gctac 1515
<210> 2
<211> 505
<212> PRT
<213> 节杆菌(Arthrobacter luteolus)
<400> 2
Met Thr Val Ser Leu Ser Pro Pro Thr Ala Arg Leu Gln Arg Leu Leu
1 5 10 15
Gly Lys Thr Ser Met Tyr Arg Met Leu Val Met Leu Leu Leu Ala Met
20 25 30
Ala Ala Trp Ser Phe Val Leu Ser Leu Thr Gly Ala Leu Phe Tyr Thr
35 40 45
Pro Ala Glu Leu Gly Ala Thr Leu Ala Thr Ala Val Ile Ser Thr Leu
50 55 60
Val Ala Ser Arg Val Met Gly Leu Leu Phe Arg Thr Phe Pro Gln Thr
65 70 75 80
Asp Ser Ala Leu Ile Thr Gly Leu Leu Leu Phe Phe Leu Phe Trp Pro
85 90 95
Thr Thr Ser Gly Pro Glu Leu Gly Thr Ile Ala Leu Ala Ala Phe Ala
100 105 110
Ala Thr Ala Ser Lys Tyr Leu Leu Val Trp Arg Arg Arg His Ile Phe
115 120 125
Asn Pro Ala Ala Leu Gly Ala Val Val Ile Gly Leu Thr Gly Leu Asn
130 135 140
Gln Pro Val Trp Trp Val Ala Ala Pro Leu Met Leu Val Val Val Leu
145 150 155 160
Pro Ala Ala Phe Leu Val Leu Tyr Arg Ser Arg Leu Leu Pro Met Ala
165 170 175
Gly Val Phe Val Leu Val Thr Val Gly Ile Val Val Leu Arg Phe Ala
180 185 190
Val Ser Gly Glu Pro Ala Leu Asp Gly Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ser
195 200 205
Tyr Pro Ile Leu Phe Phe Ala Gly Phe Met Leu Ser Glu Pro Leu Thr
210 215 220
Leu Pro Pro Leu Arg Trp Gln Arg Leu Ala Glu Ala Ala Val Val Ala
225 230 235 240
Val Leu Phe Thr Thr Pro Leu Ser Val Gly Pro Val Phe Met Ser Pro
245 250 255
Glu Leu Ala Leu Leu Ile Gly Asn Leu Leu Ala Phe Ala Val Gly Gln
260 265 270
Arg Gly Gly Ile Ser Leu Arg Leu Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Pro
275 280 285
Thr Ser Arg Glu Leu Val Phe Glu Pro Ala Arg Thr Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Ala Gly Gln Tyr Leu Glu Leu Ser Leu Pro His Pro Asn Pro Asp Gly
305 310 315 320
Arg Gly Leu Arg Arg Ile Phe Ser Ile Thr Ser Asp Pro Ala Asp Ala
325 330 335
Arg Thr Val Ser Val Ala Leu Arg Val Ser Glu Pro Gly Ser Ser Phe
340 345 350
Lys Thr Lys Leu Leu Arg Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Ser Ala Thr
355 360 365
Thr Val Gly Gly Asp Phe Gln Leu Pro Arg Asp Val Ser Arg Lys Ile
370 375 380
Leu Met Val Ala Ser Gly Ile Gly Ile Thr Pro Phe Val Ser Gln Leu
385 390 395 400
Arg Ser Gly Ala Ala Arg Gly Arg Asp Ile Val Leu Val Tyr Ala Ala
405 410 415
Ser Ser Pro Gln Glu Leu Ala Tyr Ala Arg Glu Leu Ala Asp Leu Gly
420 425 430
Val Arg Val Phe Val Cys Thr Pro Glu Asp Pro Gln Leu Pro Gly Trp
435 440 445
Thr Trp Leu Gly Ser Gly Leu Pro Asp Ala Asp Arg Leu Leu Lys Ala
450 455 460
Val Pro Asp Ala Val Glu Arg Ser Ala Phe Val Ala Gly Ser Pro Ser
465 470 475 480
Ala Val Ser Phe Val Arg Gly Glu Ala Arg Arg Ala Gly Ile Arg Arg
485 490 495
Ile His Thr Asp Pro Phe Leu Gly Tyr
500 505

Claims (3)

1.一种提高氮磷去除效果的蛋白，其氨基酸序列为在SEQ ID NO：2所示序列的基础上，有一个下述任一情形的点突变：83A/T、221E/G、342A/S、401R/G、422L/A、449T/R、或463K/V。
2.权利要求1所述的蛋白在提高耐冷动性球菌CGMCC1.2722去除低温污水中氮磷中的应用。
3.一种提高低温污水中磷和氮去除效果的方法，其特征在于包含如下步骤： 用接种针挑取少许斜面培养的转基因耐冷动性球菌先进行扩培,以1.5×108cfu/mL分别接种于生活污水中，12℃搅拌培养3天即可；其中，转基因耐冷动性球菌为耐冷动性球菌CGMCC1.2722导入了序列为SEQ ID NO：1所示的基因而获得；或者导入了编码权利要求1所述蛋白的基因而获得。
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