KR101726581B1 - 개변 류신 탈수소효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 총 분기쇄 아미노산 농도의 측정에 유용한 수단 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성(예를 들면, 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성, 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성, 및 류신 탈수소효소의 열 안정성)이 개선되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨, 개변 효소; 및 상기 개변 효소를 이용하여 피검 시료 중에 함유된 총 분기쇄 아미노산을 측정함을 포함하는, 총 분기쇄 아미노산의 분석 방법을 제공한다.

Description

개변 류신 탈수소효소{MODIFIED LEUCINE DEHYDROGENASE}
본 발명은, 개변(改變) 류신 탈수소효소, 및 이를 이용한 총 분기쇄(分岐鎖) 아미노산의 분석 방법 등에 관한 것이다.
몇몇의 아미노산은 건강 상태에 대한 지표가 될 수 있음이 공지되어 있다. 특히, 분기쇄 아미노산(BCAA: L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)은, 각종 생물학적 시료에 또는 식료품 및 음료에 많이 함유되어 있는 중요한 아미노산이다. 분기쇄 아미노산은, 생체에서 근육에 많이 함유되어 있고, 단백질 영양의 마커로서 공지되어 있다. 간 경변 또는 간성 뇌병증을 지닌 환자에서는 혈액 중의 분기쇄 아미노산의 농도가 저하됨이 공지되어 있고, 피셔(Fisher) 비 및 BTR 값과 같은 지표들이 간의 건강 상태의 진단 및 경과 관찰(follow-up)에 이용되고 있다.
아미노산의 측정 방법으로서는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법 및 LC-MS법을 포함하는 분석 기기를 이용한 방법들이 널리 사용되고 있다. 총 분기쇄 아미노산의 측정시, 류신 탈수소효소를 이용하여 BTR 값을 측정하기 위한 효소 키트(예를 들면, 특허문헌 1), 및 류신 탈수소효소를 이용하여 총 분기쇄 아미노산을 전기화학적으로 측정하기 위한 바이오센서(예를 들면, 특허문헌 2)가 사용되고 있다.
특허문헌 1: 일본 공개특허공보 특개2007-289096호 특허문헌 2: 국제 공개 제2005/075970호
류신 탈수소효소를 이용한 총 분기쇄 아미노산의 농도의 측정에 있어서는 몇몇의 개선할 점들이 존재한다.
예를 들면, 효소 키트에서는 류신 탈수소효소를 이용하여 총 분기쇄 아미노산의 농도를 측정한다. 그러나, 본 방법에서는 모든 기질이 반응할 때까지 측정을 행하는 엔드포인트(endpoint)법이 이용되고 있다. 그 이유는, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성(반응 속도)이 서로 상이하기 때문이다. 야생형 류신 탈수소효소에서 L-이소류신 및 L-발린에 대한 기질 특이성은 L-류신에 대한 기질 특이성보다 더 낮고, L-이소류신 및 L-발린에 대한 반응 속도는 L-류신에 대한 반응 속도보다 더 느리다. 따라서, 류신 탈수소효소를 이용한 효소 키트에서는 총 분기쇄 아미노산의 농도를 측정하는데 긴 반응 시간이 걸린다는 결점이 있었다.
또한, 류신 탈수소효소의 기질인 복수의 아미노산이 존재하는 경우, 분기쇄 아미노산의 각각의 농도는 바이오센서를 이용하여 독립적으로 측정될 수 없었다. 그 이유는, 류신 탈수소효소가 L-류신뿐만 아니라 L-이소류신 및 L-발린과도 반응하기 때문이다. 또한, 상기와 같은 경우에, 일반적으로, 분기쇄 아미노산들의 총 농도는 측정할 수 없었다. 그 이유는, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성(반응 속도)이 서로 상이하기 때문이다.
광범위한 연구의 결과로서, 본 발명자들은, 총 분기쇄 아미노산의 농도를 신속하게 측정하기 위해서, 분기쇄 아미노산의 각각의 아미노산에 대한, 특히, L-이소류신 및 L-발린에 대한 류신 탈수소효소의 활성을 향상시키는 등에 의해 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성을 개선시킴에 의한 레이팅법(rating method)(초기 속도법)을 이용하여 총 분기쇄 아미노산의 농도를 측정할 수 있음에 착상하였고, 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성을 개선시키도록 개변된 류신 탈수소효소를 개발하는데 성공하였다. 본 발명자들은, 또한, 총 분기쇄 아미노산의 농도의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 다른 특성들을 개선시키는데 성공하였고, 따라서, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 이하와 같다.
[1] (a) 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성;
(b) 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성; 및
(c) 류신 탈수소효소의 열 안정성
으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 류신 탈수소효소의 하나 이상의 특성이 개선되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨, 개변 효소.
[2] 상기 [1]에 있어서, 상기 돌연변이가 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 TGI 모티프 내의 이소류신의 치환인, 개변 효소.
[3] 상기 [2]에 있어서, 상기 TGI 모티프 내의 이소류신이 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 류신, 라이신, 시스테인, 티로신, 알라닌, 글라이신, 세린, 아스파라긴, 또는 트립토판에 의해 치환되어 있는, 개변 효소.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이가 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 GVI 모티프 내의 이소류신의 치환인, 개변 효소.
[5] 상기 [4]에 있어서, 상기 GVI 모티프 내의 이소류신이 페닐알라닌, 히스티딘, 아스파라긴, 티로신, 류신, 라이신, 글루타민, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 글루탐산, 세린, 시스테인, 알라닌, 글라이신, 발린, 트립토판, 또는 메티오닌에 의해 치환되어 있는, 개변 효소.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 류신 탈수소효소가 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)로부터 유래하는, 개변 효소.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 하기 (1) 또는 (2)의 단백질인, 개변 효소:
(1) 서열번호 2의 아미노산 서열에서, 하기 (i) 및/또는 (ii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로의, TGI 모티프 내의 이소류신의 치환 또는 치환들 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신의 치환 또는 치환들을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질:
(i) TGI 모티프 내의 이소류신
메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 류신, 라이신, 시스테인, 티로신, 알라닌, 글라이신, 세린, 아스파라긴, 또는 트립토판으로의 치환; 및/또는
(ii) GVI 모티프 내의 이소류신
페닐알라닌, 히스티딘, 아스파라긴, 티로신, 류신, 라이신, 글루타민, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 글루탐산, 세린, 시스테인, 알라닌, 글라이신, 발린, 트립토판, 또는 메티오닌으로의 치환; 또는
(2) 서열번호 2의 아미노산 서열에서, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로의, TGI 모티프 내의 이소류신의 치환 또는 치환들 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신의 치환 또는 치환들을 갖는 아미노산 서열에서 아미노산 잔기들의 1개 또는 수개(數個)의 보충적 돌연변이들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 개선된 특성을 갖는 단백질:
(a) 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성;
(b) 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성; 및
(c) 류신 탈수소효소의 열 안정성.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 개변 효소를 이용하여 피검 시료 중에 함유된 총 분기쇄 아미노산을 측정함을 포함하는, 총 분기쇄 아미노산의 분석 방법.
[9] 상기 [8]에 있어서, 상기 피검 시료를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)와 혼합하고, NAD+로부터 생성된 NADH를 개변 효소의 작용에 의해 검출함을 포함하는, 방법.
[10] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 개변 효소를 이용하여 분기쇄 아미노산으로부터 유도체를 생성함을 포함하는, 분기쇄 아미노산의 유도체의 제조 방법.
[11] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 개변 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
[12] 상기 [11]에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[13] 상기 [12]에 따른 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
[14] 상기 (13)에 따른 형질전환체를 이용하여, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성이 개선되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨 개변 효소를 생성함을 포함하는, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성이 개선되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨 개변 효소의 제조 방법.
[15] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 개변 효소를 포함하는, 총 분기쇄 아미노산 분석용 키트.
[16] 상기 [15]에 있어서, 반응용 완충액 또는 완충염, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 총 분기쇄 아미노산을 분석하기 위한 키트.
[17] (a) 검출용 전극, 및 (b) 상기 검출용 전극에 고정되거나 배치된 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 개변 효소를 포함하는, 총 분기쇄 아미노산 분석용 효소 센서.
본 발명의 개변 효소는, 개변 효소의 기질 특이성이 개선되므로, 엔드포인트법에 의해서뿐만 아니라 레이팅법(초기 속도법)에 의해서도 총 분기쇄 아미노산의 농도를 신속하게 측정하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 개변 효소는, 분기쇄 아미노산에 대한 개변 효소의 활성이 향상되므로, 임의의 분기쇄 아미노산의 측정 및/또는 임의의 분기쇄 아미노산의 유도체(예를 들면, 2-옥소-유도체)의 제조에도 유용하다. 또한, 본 발명의 개변 효소는, 수용액 중의 열 안정성에 있어서 우수하므로, 안정성에 있어서 우수하다. 따라서, 본 발명의 개변 효소는 특히 액체 시약으로서 유용하다. 본 발명의 분석 방법은, 간 경변, 및 간성 뇌병증 등의 질환의 진단에 유용하다.
도 1은, 각각의 분기쇄 아미노산(L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)에 대한 각각의 야생형 류신 탈수소효소의 기질 특이성을 나타내고;
도 2는, 각각의 분기쇄 아미노산(L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)이 야생형 효소 또는 개변 효소 I136R과 반응되었을 때의 시간에 따른 흡광도의 변화(n=3의 평균값)를 나타내며;
도 3은, 각종 농도에서의 각각의 분기쇄 아미노산(L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)에 대한 야생형 효소 또는 개변 효소 I136R의 활성을 흡광도의 변화(n=3의 평균값)로서 나타내고, 이들 값으로부터 작성된 표준 곡선을 나타내고;
도 4는, 효소적 방법 및 아미노산 분석기에 의해 측정된 래트 유래의 혈장 시료 중의 총 BCAA 농도(n=3의 평균값)를 나타낸다.
본 발명은 개변 효소를 제공한다. 본 발명의 개변 효소는, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성이 개선되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨 개변 효소일 수 있다.
아미노산 잔기의 돌연변이의 예로는 치환, 결실, 부가, 및 삽입이 포함될 수 있고, 치환이 바람직하다.
돌연변이되는 아미노산 잔기는, 천연 발생 L-α-아미노산인, L-알라닌(A), L-아스파라긴(N), L-시스테인(C), L-글루타민(Q), 글라이신(G), L-이소류신(I), L-류신(L), L-메티오닌(M), L-페닐알라닌(F), L-프롤린(P), L-세린(S), L-트레오닌(T), L-트립토판(W), L-티로신(Y), L-발린(V), L-아스파르트산(D), L-글루탐산(E), L-아르기닌(R), L-히스티딘(H), L-라이신(K)이다. 돌연변이가 치환, 부가, 또는 삽입인 경우, 치환되거나, 부가되거나, 또는 삽입되는 아미노산 잔기는, 상기 기술되어 있는 바와 같은 돌연변이되는 아미노산 잔기와 동일하다.
분기쇄 아미노산(BCAA)란, 천연 발생 L-α-아미노산 중 측쇄로서 분기쇄를 갖는 천연 발생 L-α-아미노산인, L-류신, L-이소류신, 또는 L-발린을 말한다. 모든 분기쇄 아미노산(즉, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)은 총 분기쇄 아미노산의 측정시에 측정된다.
류신 탈수소효소는, 이하의 반응을 촉매하는 산화환원효소이다(EC 1.4.1.9).
L-류신 + H2O + NAD+ → 4-메틸-2-옥소펜탄산 + NH3 + NADH + H+
야생형의 류신 탈수소효소는 L-류신뿐만 아니라 L-이소류신 및 L- 발린에 대해서도 작용하지만, L-이소류신 및 L- 발린에 대한 활성은 L-류신에 대한 활성보다 낮은 것으로 알려져 있다. 바실러스 종(Bacillus sp .) 및 게오바실러스 스테아로써모필러스로부터 유래한 야생형 류신 탈수소효소의 L-류신, L-이소류신, 및 L-발린에 대한 기질 특이성은, L-류신에 대한 상대 활성을 100으로 간주하는 경우의 상대 활성으로서 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 야생형 류신 탈수소효소의 활성은 L-류신 이외의 분기쇄 아미노산에 대해 상대적으로 낮고, 특히, L-이소류신의 상대 활성은 L-류신에 대하 활성에 비하여 75 이하이다.
본 발명의 개변 효소가 유도되는 류신 탈수소효소로서, 임의의 유기체(예를 들면, 세균, 방선균, 및 진균과 같은 미생물뿐만 아니라 곤충, 어류, 동물 및 식물)로부터 유래하는 효소를 사용할 수 있다. 류신 탈수소효소의 예로는, 바실러스 속(genus) 및 이에 관련된 속들에 속하는 유기체로부터 유래하는 효소들이 포함될 수 있다. 바실러스 속에 관련된 속들의 예로는, 게오바실러스(Geobacillus) 속, 파에니바실러스(Paenibacillus) 속, 및 오세아노바실러스(Oceanobacillus) 속이 포함될 수 있다. 바실러스 속에 관련된 속들은 바실러스 속과 마찬가지로 간균과(Bacillaceae)에 속한다.
바실러스 속 및 이에 관련된 속들에 속하는 미생물들의 예로는 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 종(Bacillus sp .), 및 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)가 포함될 수 있다.
류신 탈수소효소에서 돌연변이가 도입되는 위치는 바람직하게는 류신 탈수소효소의 활성 중심에 근접하게 위치한 아미노산 잔기이다. 당업자는, 게오바실러스 스테아로써모필러스의 아미노산 서열을 다른 류신 탈수소효소의 아미노산 서열과 정렬시킬 수 있으므로, 게오바실러스 스테아로써모필러스 이외의 유기체로부터 유래한 류신 탈수소효소의 활성 중심에 근접하게 위치한 아미노산 잔기를 쉽게 특정할 수 있다.
또한, 류신 탈수소 효소에 대해서는 3차원 구조 분석 결과가 보고되었다(예를 들면, Baker et al., Structure 3: 693-705 (1995)을 참조한다). 따라서, 당업자는, 또한, 3차원 구조 분석 결과에 기초하여, 게오바실러스 스테아로써모필러스 이외의 유기체로부터 유래한 류신 탈수소효소의 활성 중심에 근접하게 위치한 아미노산 잔기도 쉽게 특정할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성을 개선하는 돌연변이는, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 치환이다. TGI 모티프는 트레오닌(T)-글라이신(G)-이소류신(I)의 연속된 3개의 아미노산 잔기들로 구성된다. 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 TGI 모티프의 위치는 효소의 기원에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 TGI 모티프의 위치를 적절히 결정할 수 있고, 따라서, 치환되는 이소류신(I)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서, TGI 모티프는 134 내지 138 위치의 아미노산 영역 내에 위치하고, 이소류신(I)은 136 내지 138 위치에 위치한다(예를 들면, 표 1을 참조한다).
Figure 112014102665829-pct00001
다른 바람직한 실시형태에서, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성을 개선하는 돌연변이는, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 치환이다. GVI 모티프는 글라이신(G)-발린(V)-이소류신(I)의 연속된 3개의 아미노산 잔기들로 구성된다. 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 GVI 모티프의 위치는 효소의 기원에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서의 GVI 모티프의 위치를 적절히 결정할 수 있고, 따라서, 치환되는 이소류신(I)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에서, GVI 모티프는 290 내지 294 위치의 아미노산 영역 내에 위치하고, 이소류신(I)은 292 내지 294 위치에 위치한다(예를 들면, 표 2를 참조한다). 본 발명의 개변 효소는, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성을 개선하는 돌연변이로서 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 치환에 추가하여 TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
Figure 112014102665829-pct00002
총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성으로는 이하가 포함될 수 있다:
(a) 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성;
(b) 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성; 및
(c) 류신 탈수소효소의 열 안정성.
본 발명의 개변 효소는, 상술한 특성들 중 1개만을 가질 수 있거나, 상술한 특성들 중 2개 또는 3개의 특성을 조합하여 가질 수 있다.
TGI 모티프 내의 이소류신(I)에 관해서, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 1개 이상의 특성을 개선하는 돌연변이의 예로는 메티오닌(M), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 류신(L), 라이신(K), 시스테인(C), 티로신(Y), 알라닌(A), 글라이신(G), 세린(S), 아스파라긴(N), 및 트립토판(W)로의 치환이 포함될 수 있다.
GVI 모티프 내의 이소류신(I)에 관해서, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 1개 이상의 특성을 개선하는 돌연변이의 예로는 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 티로신(Y), 류신(L), 라이신(K), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 시스테인(C), 알라닌(A), 글라이신(G), 발린(V), 트립토판(W), 및 메티오닌(M)으로의 치환이 포함될 수 있다.
본 발명의 개변 효소는 임의의 pH 조건 하에 사용될 수 있지만, 중성 조건 및/또는 알칼리성 조건 하에 적합하게 사용된다.
본 발명의 개변 효소가 적합하게 사용되는 중성 조건이란 pH 6.0 이상, pH 8.0 이하의 범위 내인 임의의 pH 조건을 말한다. 바람직하게는 중성 조건은 pH 7.0 이상, pH 8.0 이하의 범위 내인 임의의 pH 조건(예를 들면, pH 7.0, pH 7.5, 또는 pH 8.0)이다.
본 발명의 개변 효소가 적합하게 사용되는 알칼리성 조건이란 pH 8.0 초과, pH 11.0 이하의 범위 내인 임의의 pH 조건을 말한다. 알칼리성 조건에서의 pH 범위의 상한은 바람직하게는 10.5 이하이고, 보다 바람직하게는 10.0 이하이다. 특히 바람직하게는 pH 8.5 이상, pH 9.5 이하의 범위 내인 임의의 pH 조건(예를 들면, pH 9.0)이다.
한 실시형태에서, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성으로서, 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성이 개선된다. 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성의 개선은, 소정의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성을 향상시키도록 의도되는 것은 아니지만, 모든 분기쇄 아미노산들(즉, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린)에 대한 기질 특이성(반응 속도)이 보다 등가가 되도록 하는 것을 말한다. 구체적으로, 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성의 개선은, 류신에 대한 류신 탈수소효소의 상대 활성을 100으로 간주하는 경우, 이소류신 및 발린에 대한 개변 효소의 각각의 상대 활성이 이소류신 및 발린에 대한 야생형 효소의 각각의 상대 활성에 비하여 100에 보다 근접한 경우에 달성될 수 있다. 총 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 기질 특이성에 관해서, 류신에 대한 류신 탈수소효소의 상대 활성을 100으로 간주하는 경우, 이소류신 및 발린 둘 다에 대한 류신 탈수소효소의 상대 활성은 80 이상, 120 이하인 것이 바람직하고, 85 이상, 115 이하인 것이 보다 바람직하며, 90 이상, 110 이하인 것이 더욱 바람직하고, 95 이상, 105 이하인 것이 특히 바람직하다. 류신에 대한 류신 탈수소효소의 상대 활성을 100으로 간주하는 경우, 이소류신 및 발린 둘 다에 대한 류신 탈수소효소의 상대 활성이 80 이상, 120 이하인 본 발명의 개변 효소에서의 개변의 예로는, 1) 알칼리성 조건 하에 기질 특이성의 개선에 적합한, TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 기술되는 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 기술되는 아미노산 잔기로의 치환, 및 2) 중성 조건 하에 특성의 개선에 적합한, TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 기술되는 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 기술되는 아미노산 잔기로의 치환이 포함될 수 있다.
1) 알칼리성 조건 하에서의 기질 특이성의 개선에 적합한 치환
(a) 136 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(알칼리성 조건)
메티오닌(M), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 라이신(K), 시스테인(C), 티로신(Y), 알라닌(A), 글라이신(G), 또는 세린(S)
(b) 292 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(알칼리성 조건)
페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 티로신(Y), 라이신(K), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 또는 글라이신(G)
2) 중성 조건 하에서의 기질 특이성의 개선에 적합한 치환
(c) 136 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(중성 조건)
알라닌(A), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 세린(S), 또는 티로신(Y)
(d) 292 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(중성 조건)
알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글라이신(G), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 또는 발린(V).
다른 실시형태에서, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성으로서, 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성이 개선된다. 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성의 개선은, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산에 대한 개변 효소의 활성이, 동일한 아미노산에 대한 야생형 효소의 활성에 비하여 보다 향상됨을 의미한다. 구체적으로, 임의의 분기쇄 아미노산에 대한 류신 탈수소효소의 활성의 개선은, L-류신, L-이소류신, 및 L-발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 아미노산에 대한 야생형 류신 탈수소효소의 활성을 100으로 간주하는 경우, 상기 아미노산에 대한 개변 류신 탈수소효소의 활성이 100을 초과하는 경우에 달성될 수 있다. 이러한 개변 효소는, 각각의 분기쇄 아미노산을 신속하게 측정하는 것을 가능하게 하고, 결과적으로 총 분기쇄 아미노산의 측정에 유용하다. 개변 효소의 활성의 향상 수준은, 야생형 효소의 활성에 비하여 1.3배 이상인 것이 바람직하고, 1.5배 이상인 것이 보다 바람직하며, 1.7배 이상인 것이 더욱 바람직하고, 2.0배 이상인 것이 특히 바람직하다. 개변 효소의 활성의 향상이 야생형 효소에 비하여 1.3배 이상인 본 발명의 개변 효소에서의 개변의 예로는, 1) 알칼리성 조건 하에 활성의 개선에 적합한, TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환, 및 2) 중성 조건 하에 활성의 개선에 적합한, TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환이 포함될 수 있다.
1) 알칼리성 조건 하에서의 활성의 개선에 적합한 치환
1-1) 136 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(알칼리성 조건 하)
(i) L-류신에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
메티오닌(M), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 류신(L), 라이신(K), 시스테인(C), 티로신(Y), 알라닌(A), 글라이신(G), 세린(S), 아스파라긴(N), 또는 트립토판(W).
(ii) L-이소류신에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
메티오닌(M), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 류신(L), 라이신(K), 시스테인(C), 티로신(Y), 알라닌(A), 글라이신(G), 세린(S), 아스파라긴(N), 또는 트립토판(W).
(iii) L-발린에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
메티오닌(M), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 류신(L), 라이신(K), 시스테인(C), 티로신(Y), 알라닌(A), 글라이신(G), 세린(S), 아스파라긴(N), 또는 트립토판(W).
1-2) 292 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(알칼리성 조건 하)
(iv) L-류신에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 티로신(Y), 류신(L), 라이신(K), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 시스테인(C), 알라닌(A), 또는 글라이신(G).
(v) L-이소류신에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 티로신(Y), 류신(L), 라이신(K), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 시스테인(C), 알라닌(A), 글라이신(G), 발린(V), 또는 트립토판(W).
(vi) L-발린에 대한 활성의 향상(알칼리성 조건 하)
페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 티로신(Y), 류신(L), 라이신(K), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 시스테인(C), 알라닌(A), 글라이신(G), 또는 발린(V).
2) 중성 조건 하에서의 활성의 개선에 적합한 치환
2-1) 136 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(중성 조건 하)
(i') L-류신에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 세린(S), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
(ii') L-이소류신에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 세린(S), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
(iii') L-발린에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
2-2) 292 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기(중성 조건 하)
(iv') L-류신에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
(v') L-이소류신에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
(vi') L-발린에 대한 활성의 향상(중성 조건 하)
알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 또는 티로신(Y).
또 다른 실시형태에서, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 특성으로서, 류신 탈수소효소의 열 안정성이 개선된다. 류신 탈수소효소의 열 안정성의 개선은, 개변 효소의 열 안정성이 야생형 효소의 열 안정성에 비하여 추가로 향상됨을 의미한다. 구체적으로, 류신 탈수소효소의 열 안정성의 개선은, 개변 효소가 수용액 중에서 60℃에서 1시간 동안 처리되는 경우, 개변 효소의 잔존 활성이 야생형 효소의 잔존 활성보다 큰 경우에 달성될 수 있다. 수용액 중에서의 류신 탈수소효소의 열 안정성 시험은 류신 탈수소효소의 안정성(특히, 액상 안정성)을 평가하기 위한 가속 시험으로서의 유의성을 가질 수 있다. 따라서, 수용액 중에서의 개변 효소의 열 안정성이 높은 경우, 개변 효소의 안정성(특히, 액상 안정성)도 높은 경향이 있다. 높은 액상 안정성을 나타내는 효소는 장시간 동안 액상 형태로 보관할 수 있고, 따라서, 이러한 개변 효소는 총 분기쇄 아미노산의 측정을 위한 액상 시약으로서 유용하다. 개변 효소의 열 안정성의 향상 수준은 야생형 효소의 열 안정성의 향상에 비하여 1.1배 이상인 것이 바람직하고, 1.2배 이상인 것이 보다 바람직하다. 야생형 효소에 비하여 1.1배 이상 향상된 열 안정성을 갖는 본 발명의 개변 효소에서의 개변의 예로는, TGI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 하기 아미노산 잔기로의 치환이 포함될 수 있다.
136 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기
메티오닌(M), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 또는 라이신(K)
292 위치에서의 치환 후의 아미노산 잔기
페닐알라닌(F)
본 발명의 개변 효소는, 또한, C-말단 또는 N-말단에 다른 펩타이드 성분(예를 들면, 태그 모이어티(tag moiety))도 가질 수 있다. 본 발명의 개변 효소에 부가될 수 있는 다른 펩타이드 성분들의 예로는, 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩타이드 성분(예를 들면, 히스티딘 태그 및 Strep-태그 II와 같은 태그 모이어티; 글루타티온-S-트랜스페라제, 및 말토스-결합 단백질과 같은 목적 단백질의 정제에 흔히 사용되는 단백질), 목적 단백질의 가용성을 향상시키는 펩타이드 성분(예를 들면, Nus-태그), 샤페론(chaperon)으로서 작용하는 펩타이드 성분(예를 들면, 트리거 인자(trigger factor)), 및 다른 기능을 갖는 단백질 또는 단백질의 도메인, 또는 이들을 연결하는 링커로서의 펩타이드 성분이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 효소는, 상술한 특성이 유지되는 한, 상기 돌연변이(들)를 갖는 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기들의 보충적 돌연변이(예를 들면, 치환, 결실, 삽입, 및 부가)를 가질 수 있다. 보충적 돌연변이가 도입될 수 있는 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1개 내지 100개, 바람직하게는 1개 내지 50개, 보다 바람직하게는 1개 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 30개, 가장 바람직하게는 1개 내지 20개, 또는 1개 내지 10개(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)이다. 당업자는, 상술한 특성을 유지하는 이러한 개변 효소를 적절하게 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 개변 효소는 하기 (i) 또는 (ii)일 수 있다:
(i) 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에 있어서, TGI 모티프 내의 이소류신(I), 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 돌연변이 또는 돌연변이들(예를 들면, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 개선된 특성을 갖는, 단백질; 또는
(ii) 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에 있어서, TGI 모티프 내의 이소류신(I) 및/또는 GVI 모티프 내의 이소류신(I)의 돌연변이 또는 돌연변이들(예를 들면, 치환)을 갖는 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기들의 보충적 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 총 분기쇄 아미노산의 측정과 관련되는 류신 탈수소효소의 개선된 특성을 갖는, 단백질.
또한, 본 발명의 개변 효소는, 상술한 돌연변이 또는 돌연변이들 및 보충적 돌연변이 또는 돌연변이들 둘 다를 갖기 때문에, 돌연변이 전의 (야생형) 류신 탈수소효소의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 아미노산 서열의 동일성의 백분율은 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다.
아미노산 서열들 사이의 동일성은, 예를 들면, Karlin 및 Altschul(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))에 의한 알고리듬 BLAST 및 Pearson(MethodsEnzymol., 183, 63 (1990))에 의한 FASTA를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리듬 BLAST에 기초하여, BLASTP로서 언급되는 프로그램이 개발되어 왔다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 따라서, 아미노산 서열들 사이의 동일성은, 이들 프로그램을 디폴트 설정으로 이용하여 계산할 수 있다. 또한, 예를 들면, ORF에 암호화된 전장 폴리펩타이드 부분을 이용하고, Lipman-Pearson법을 사용하여, Genetyx Corporation으로부터의 소프트웨어 GENETYX Ver. 7.09를 Unit Size to Compare=2의 설정으로 이용하여, 유사성을 백분율로서 계산함으로써 얻어지는 수적 값을 아미노산 서열들 사이의 동일성으로서 사용할 수 있다. 이들 계산으로부터 유도된 값들 중에서 최저값을 아미노산 서열들 사이의 동일성으로서 사용할 수 있다.
아미노산 서열에 있어서 보충적 돌연변이를 도입할 수 있는 아미노산 잔기의 위치는 당업자에게 명백하다. 예를 들면, 보충적 돌연변이는 아미노산 정렬을 참고하여 도입할 수 있다. 구체적으로, 당업자는, (1) 복수의 상동체(homolog)들의 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열, 및 다른 상동체의 아미노산 서열)들을 비교하고, (2) 상대적으로 보존되는 영역 및 상대적으로 보존되지 않는 영역을 입증하고, 이어서, (3) 상대적으로 보존되는 영역 및 상대적으로 보존되지 않는 영역으로부터 각각 기능적으로 중요한 역할을 행할 수 있는 영역 및 기능적으로 중요한 역할을 행할 수 없는 영역을 예측하고, 따라서, 구조와 기능 사이의 상관성을 인지할 수 있다. 또한, 상기 기술되어 있는 바와 같이, 류신 탈수소효소에 관해서는 3차원 구조의 분석 결과가 보고되어 있다. 따라서, 당업자는, 3차원 구조의 분석 결과에 기초하여, 상술한 특성의 유지가 가능해지도록 보충적 돌연변이를 도입할 수 있다.
아미노산 잔기의 보충적 돌연변이가 치환인 경우, 아미노산 잔기의 이러한 치환은 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은, 주어진 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이러한 패밀리의 예로는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 위치에서 분기된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실(예를 들면, 알콜성, 페놀성) 그룹을 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 세린, 트레오닌, 티로신), 및 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 시스테인, 메티오닌)이 포함될 수 있다. 바람직하게, 아미노산의 보존적 치환은, 아스파라긴산과 글루탐산 사이에서의 치환, 아르기닌과 라이신과 히스티딘 사이에서의 치환, 트립토판과 페닐알라닌 사이에서의 치환, 페닐알라닌과 발린 사이에서의 치환, 류신과 이소류신과 알라닌 사이에서의 치환, 및 글라이신과 알라닌 사이에서의 치환일 수 있다.
본 발명의 개변 효소는, 본 발명의 개변 효소를 발현하는 본 발명의 형질전환체, 또는 무세포계(cell-free system)를 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 형질전환체는, 예를 들면, 본 발명의 개변 효소의 발현 벡터를 제조하고 이 발현 벡터를 숙주에 도입함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 형질전환체는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 포함된 발현 벡터를 제조하고 이 벡터를 적절한 숙주에 도입함으로써 얻어질 수 있다. 에스케리키아(Escherichia) 속(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 코리네박테리움(Corynebacterium) 속(예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)), 및 바실러스(Bacillus) 속(예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis))에 속하는 세균 유래의 세포를 포함하는 각종 원핵 세포, 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 피키아(Pichia) 속(예를 들면, 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속(예를 들면, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae))에 속하는 진균 유래의 세포를 포함하는 각종 진핵 세포를 본 발명의 개변 효소를 발현시키기 위한 숙주로서 사용할 수 있다. 소정 유전자가 결실된 스트레인(strain)을 숙주로서 사용할 수 있다. 형질전환체의 예로는, 세포질 중에 벡터를 보유하는 형질전환체, 및 목적 유전자가 게놈에 통합된 형질전환체가 포함될 수 있다.
본 발명의 형질전환체는, 주어진 배양 장치(예를 들면, 시험관, 플라스크, 자 발효조(jar fermenter))를 이용하여 후술의 조성을 갖는 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건은 적절하게 결정할 수 있다. 구체적으로, 배양 온도는 25℃ 내지 37℃일 수 있고, pH 값은 6.5 내지 7.5일 수 있으며, 배양 기간은 1시간 내지 100시간일 수 있다. 또한, 배양은, 용존 산소 농도를 관리하면서 행할 수 있다. 이러한 경우, 용존 산소 농도(DO 값)는 제어에 대한 지표로서 사용할 수 있다. 대기 중의 산소 농도가 21%인 경우, 상대적인 용존 산소 농도, DO 값이, 예를 들면, 1% 내지 10%, 바람직하게는 3% 내지 8%를 미만이 되지 않도록, 통기/교반 조건을 제어할 수 있다. 배양은 배치(batch) 배양 또는 페드-배치(fed-batch) 배양일 수 있다. 또한, 페드-배치 배양의 경우, 당원으로서의 용액 및 인산을 함유하는 용액을 배양 배지에 연속적으로 또는 비연속적으로 순차 첨가함으로써 배양을 계속할 수 있다.
형질전환되는 숙주는 상기 기술한 바와 같고, 에스케리아 콜라이를 상세히 기술하면, 숙주는 에스케리키아 콜라이 K12 아종(subspecies) 에스케리키아 콜라이 JM109 스트레인, DH5α 스트레인, HB101 스트레인, 및 BL21 (DE3) 스트레인 등으로부터 선택될 수 있다. 형질전환을 행하는 방법, 및 형질전환체를 선택하는 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15)] 등에 기술되어 있다. 이하, 형질전환된 에스케리키아 콜라이를 제조하고, 이것을 이용하여 소정의 효소를 제조하는 방법을 일례로서 구체적으로 설명할 것이다.
이. 콜라이에서 이종 단백질을 생산하는데 사용되는 프로모터는, 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서 사용할 수 있다. 그 예로는, PhoA, PhoC, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의 PR 및 PL 프로모터, 및 T5 프로모터와 같은 강력한 프로모터가 포함될 수 있고, PhoA, PhoC 및 lac 프로모터가 바람직하다. 예를 들면, pUC(예를 들면, pUC19, pUC18), pSTV, pBR(예를 들면, pBR322), pHSG(예를 들면, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF(예를 들면, RSF1010), pACYC(예를 들면, pACUC177, pACYC184), pMW(예를 들면, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE(예를 들면, pQE30) 및 이들의 유도체를 벡터로서 사용할 수 있다. 또한, 파지 DNA 유래의 벡터도 다른 벡터로서 이용할 수 있다. 추가로, 프로모터를 포함하고, 삽입된 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 발현 벡터도 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는 pUC, pSTV, 또는 pMW일 수 있다.
또한, 전사 종결 서열인 터미네이터(terminator)가 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 하류에 라이게이션될(ligated) 수 있다. 이러한 터미네이터의 예로는 T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터, 및 에스케리키아 콜라이 trpA 유전자의 터미네이터가 포함될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 에스케리키아 콜라이에 도입하기 위한 벡터로는 소위 멀티카피형이 바람직하고, 그 예로는 ColE1 유래의 복제 기원을 갖는 플라스미드, 예를 들면, pUC-계 플라스미드, pBR322-계 플라스미드, 및 이들의 유도체가 포함될 수 있다. 여기서, "유도체"는, 염기(들)의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가에 의해서 플라스미드에 개변을 제공하는 것을 의미한다. 또한, 본원에 언급된 "개변"은, 돌연변이 제제(mutating agent) 또는 UV 방사선 조사 등을 이용한 돌연변이 유발, 또는 자연 발생 돌연변이에 의한 개변도 포함한다.
형질전환체를 선택하기 위해서, 벡터는 암피실린 내성 유전자와 같은 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드로서, 강력한 프로모터를 갖는 발현 벡터들이 상업적으로 입수가능하다(예를 들면, pUC-계(Takara Bio Inc.로부터 공급됨), pPROK-계(Clontech로부터 공급됨), pKK233-2-계(Clontech로부터 공급됨)).
얻어진 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 에스케리키아 콜라이를 형질전환시키고, 이 에스케리키아 콜라이를 배양함으로써, 본 발명의 개변 효소가 얻어질 수 있다.
에스케리키아 콜라이를 배양하는데 일반적으로 사용되는 M9/카사미노산 배지 및 LB 배지와 같은 배지를 배지로서 사용될 수 있다. 배지는 소정의 탄소원, 질소원, 및 보조 효소(coenzyme)(예를 들면, 피리독신 하이드로클로라이드)를 함유할 수 있다. 구체적으로, 펩톤, 효모 추출물, NaCl, 글루코스, MgSO4, 황산 암모늄, 인산 이수소 칼륨, 황산 제2철, 및 황산 망간 등을 사용할 수 있다. 배양 조건 및 생산 유도 조건은, 사용되는 벡터의 마커, 프로모터, 및 숙주의 종류에 따라 적절하게 선택한다.
본 발명의 개변 효소는 이하의 방법에 의해 수집할 수 있다. 본 발명의 개변 효소는, 본 발명의 형질전환체를 수집하고, 후속적으로 미생물 세포를 분쇄(예를 들면, 초음파 처리(sonication) 또는 균질화(homogenization)), 또는 용해(예를 들면, 라이소자임 처리)시킴으로써 분쇄물 또는 용해물로서 얻을 수 있다. 본 발명의 개변 효소는, 상기 분쇄물 또는 용해물을 추출, 침전,여과, 및 컬럼 크로마토그래피와 같은 기술에 제공함으로써 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 총 분기쇄 아미노산의 분석 방법도 제공한다. 본 발명의 분석 방법은, 본 발명의 개변 효소를 이용하여, 피검 시료에 함유된 총 분기쇄 아미노산을 측정함을 포함할 수 있다.
피검 시료는, 임의의 분기쇄 아미노산(바람직하게는 총 분기쇄 아미노산)을 함유하는 것으로 의심되는 한 특별하게 한정되지 않고, 그 예로는 생물학적 시료(예를 들면, 혈액, 뇨, 타액, 및 눈물 등) 및 식료품 및 음료(예를 들면, 영양 드링크 및 아미노산 음료)가 포함될 수 있다.
본 발명의 분석 방법은, 본 발명의 개변 효소를 이용하여 총 분기쇄 아미노산을 측정할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 알칼리성 조건 또는 중성 조건 하에 바람직하게는 알칼리성 완충액 중에서 피검 시료를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)와 혼합하고, 이어서, 본 발명의 개변 효소를 이용하여 혼합된 시료를 효소 반응시키고, 마지막으로, 본 발명의 개변 효소의 작용에 의해 NAD+로부터 생성된 NADH를 검출함으로써 총 분기쇄 아미노산을 측정할 수 있다. 구체적으로, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)의 존재시 알칼리성 완충액 중에서 개변 효소를 피검 시료에 작용시킴으로써, 생물학적 시료 중에 함유된 기질의 아미노 그룹이 산화적으로 탈아미노화되면서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)로부터 환원형(NADH)이 생성된다. 따라서, NADH를 흡광도(340nm) 등에 의해 검출함으로써 총 분기쇄 아미노산을 정량화할 수 있다. 이러한 방법론에 의한 아미노산의 측정 방법은 문헌[예를 들면, Ueatrongchit T, Asano Y, Anal Biochem., 2011 Mar 1; 410(1): 44-56을 참조]에 공지되어 있다. 또한, 생성된 NADH로 색소를 환원시키고, 환원된 색소의 발색을 흡광도 등으로서 검출함으로써 총 분기쇄 아미노산을 정량화할 수도 있다. 추가로, 전기화학적 기술에 의해서도 NADH를 검출할 수 있다. 예를 들면, 알칼리성 또는 중성 조건 하에서 개변 효소를 피검 시료에 작용시킴으로써 생성된 NADH를 전기화학적으로 산화시키고, 이의 산화 전류를 측정함으로써, 또는 공존하는 전자 메디에이터(electronic mediator)를 생성된 NADH에 의해 환원시키고, 이의 환원된 전자 메디에이터가 전기화학적으로 산화될 때의 산화 전류를 측정함으로써, 분기쇄 아미노산을 측정하는 것이 가능하다. NADH와 전자 메디에이터 사이의 전자 이동은 촉매에 의해 매개될 수 있다. 총 분기쇄 아미노산은 레이팅법(초기 속도법)에 의해 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 개변 효소는, 분기쇄 아미노산 이외의 아미노산과 반응하지 않거나, 분기쇄 아미노산 이외의 아미노산과의 낮은 반응성을 갖는다. 따라서, 시험 시료 중에 분기쇄 아미노산뿐만 아니라 다른 아미노산도 함유되는 경우에도, 본 발명의 개변 효소를 사용함으로써 피검 시료 중의 분기쇄 아미노산의 양을 평가할 수 있다.
추가로, 본 발명은, 본 발명의 개변 효소를 포함하는 총 분기쇄 아미노산을 분석하기 위한 키트를 포함한다.
본 발명의 키트는, 반응용 완충액 또는 완충염, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
반응용 완충액 또는 완충염은, 반응액 중의 pH 값을 목적하는 효소적 반응에 적합하게 유지하기 위해 사용된다. 반응용 완충액 또는 완충염은 알칼리성 또는 중성이고, 바람직하게는 알칼리성이다.
본 발명의 키트가 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)를 포함하는 경우, 본 발명의 키트는, NADH에 의해 환원되는 색소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 개변 효소의 작용에 의해 NAD+로부터 생성되는 NADH에 의해 색소가 환원되고, 환원된 색소로부터의 발색은 흡광도 등에 의해 검출할 수 있다. 전자 메디에이터로서 작용하는 물질은 색소의 환원에 관여될 수 있다.
본 발명은, 또한, (a) 검출용 전극, 및 (b) 상기 검출용 전극 상에 고정되거나 보유되는 본 발명의 개변 효소를 포함하는, 총 분기쇄 아미노산을 분석하기 위한 효소 센서를 제공한다. 본 발명의 개변 효소는 전극 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정되거나 보유된다.
상기 검출용 전극으로서, 예를 들면, 본 발명의 개변 효소에 의해 총 분기쇄 아미노산으로부터 생성된 생성물 또는 부 생성물(NH3+NADH+H+)을 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 바이오센서를 사용하는 것이 가능하다. 보다 구체적으로, 상기 검출용 전극의 예로는, 본 발명의 개변 효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)를 이용한 검출용 전극이 포함된다. 이러한 검출용 전극으로서는, 예를 들면, 국제 공개 제2005/075970호, 또는 국제 공개 제00/57166호 등에 기재된 것들을 사용할 수 있다.
실시예
본 발명은, 이하의 실시예를 참조하여 상세히 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
(효소 정량법)
L-류신, L-이소류신, 및 L-발린의 효소 정량법에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)의 존재시 알칼리성 완충액 중에서 류신 탈수소효소를 생물학적 시료(예를 들면, 혈장)에 작용시켰고, 생물학적 시료 중에 함유된 기질의 아미노 그룹이 산화적으로 탈아미노화되었고, 또한, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)로부터 환원된 생성물(NADH)이 생성되었다. 생성된 NADH의 양은, 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M2e, Molecular Devices로부터 공급됨)를 이용하여 측정하였다.
실시예 1: 개변 효소(I136R)의 제조
(1) 주형 Idh 유전자의 제조
(a) 배양 및 염색체 DNA의 정제
행정 독립 법인 제품 평가 기술 기구, 생물 유전 자원 부문(NBRC: National Institute of Technology and Evaluation, Biological Resource Center)으로부터 수득된 게오바실러스 스테아로써모필러스 NBRC 12550의 동결건조된 펠렛을 성장 배지 702에 현탁시켰고, 이어서, 성장 배지 802의 한천 배지 상에 도포하였고, 50℃에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 콜로니를 5mL의 성장 배지 702에 접종하였고, 50℃에서 30시간 동안 정치 배양하였다. 이의 세포 배양액 5mL로부터 염색체 DNA를 정제하였고, 하기의 실험에 제공하였다.
배지를 제조하기 위한 상세 설명은 하기 표 3에 기술된 바와 같았다.
Figure 112014102665829-pct00003
(b) 플라스미드의 제조
문헌[Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009; 73: 729-732]에 기술되어 있는 방법에 의해 제조된 pUC18His 플라스미드는, 벡터를 지닌 재조합체 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이 JM109/pUC18His)의 배양 배지로부터 Invisorb Spin Plasmid Mini Kit(Invitek로부터 공급됨)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 이어서, 정제된 플라스미드 pUC18His의 벡터 DNA 7㎕, 10XK 완충액(Takara Bio Inc.로부터 공급됨) 2.5㎕, 및 PstI 및 BamHI 각각 0.8㎕를 혼합하였고, 멸균된 초순수를 첨가하여 반응액의 총 용적이 25㎕가 되게 하였고, 이어서, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 제한 효소로 처리하였다. 이어서, 상기 반응액 25㎕에, 새우로부터 유래한 알칼리성 포스파타제(Roche로부터 공급됨) 2㎕ 및 X10 알칼리성 포스파타제 완충액 5㎕를 첨가하였고, 멸균된 초순수를 첨가하여 반응액의 총 용적이 50㎕가 되게 하였고, 이어서, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하여 TE 용액 중에 용해된 탈인산화된 pUC18His 벡터 DNA 20㎕를 얻었다.
(c) 류신 탈수소효소 유전자의 증폭
지. 스테아로써모필러스로부터 유래한 류신 탈수소효소 유전자의 증폭에 있어서, 지. 스테아로써모필러스 염색체 DNA를 주형으로서 사용하였고, 지. 스테아로써모필러스 IFO 12550의 류신 탈수소효소 유전자(Sequence Listing 1; Biochemistry, 27, 9056 (1988))를 기반으로 제조된, BamHI 인식 부위 서열을 함유하는 합성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 1: 5'-CCGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGGAAAC-3'(서열번호 11)(Hokkaido System Science Co., Ltd로부터 공급됨), 및 PstI 인식 부위 서열을 함유하는 합성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 2: 5'-ACTGCAGTTATATTGCCGAAGCACC-3'(서열번호 12)(Hokkaido System Science Co., Ltd로부터 공급됨)을 사용하였다. PCR 반응액으로서, 50ng의 염색체 DNA, 각각 1㎕의 100pmol/㎕의 합성된 뉴클레오타이드 프라이머, 5㎕의 ExTaq X10 완충액(Takara Bio Inc.로부터 공급됨), 5㎕의 2.5mM dNTP 혼합물(Takara Bio Inc.로부터 공급됨), 1㎕의 TaKaRa ExTaq DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc.로부터 공급됨)를 혼합하였고, 멸균된 초순수를 첨가하여 반응액의 총 용적이 50㎕가 되게 하였다. PCR은 PTC-200 Peltier 써멀 사이클러(MJ Research Japan으로부터 공급됨)을 이용하여 수행하였고, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복하였다.
PCR 산물은 전기영동하였고, 자외선 조사 하에 절단된 2개의 증폭된 산물(1400bp 및 1900bp 부근)을 겔 추출 키트 Gel-MTM Gel Extraction Kit(VIOGENE으로부터 공급됨)를 이용하여 추출 및 정제하여, 50㎕의 정제된 산물을 얻었다. 후속적으로, 정제된 산물 4㎕에, 6㎕의 10XK 완충액(Takara Bio Inc.로부터 공급됨), 및 각각 1㎕의 PastI 및 BamHI를 첨가하였고, 멸균 초순수를 첨가하여 반응액 총 용적이 60㎕가 되게 하였다. 반응액은 37℃에서 3시간 동안 반응시켜, 정제된 PCT 산물의 양쪽 말단을 제한 효소로 처리하였다. 반응액을 60℃에서 15분 동안 항온배양하여 제한 효소를 불활성화시켰다. 후속적으로, 에탄올 침전을 수행하여, 정제된 삽입 단편을 얻었다.
(d) 라이게이션 및 형질전환
1㎕의 상기에서 얻어진 탈인산화 플라스미드, 5㎕의 정제된 삽입 단편, 및 6㎕의 Ligation Mix(Takara Bio Inc.로부터 공급됨)를 혼합하였고, 반응액의 총 용적은 12㎕로 제조하였고, 라이게이션 반응은 16℃에서 하룻밤 수행하였다. 후속적으로, 라이게이션 반응 후, 이. 콜라이 JM109를 6㎕의 반응액으로 형질전환시켰고, 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지 상에 도포하였고, 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 얻어진 콜로니를 마스터 플레이트에 접종하여 배양하였고, 이어서, 새롭게 형성된 콜로니를 5ml의 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 접종하여 하룻밤 배양하였다. 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였고, 이의 뉴클레오타이드 서열은 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems로부터 공급됨)을 이용하여 분석하였다. 지. 스테아로써모필러스로부터 유래한 류신 탈수소효소 유전자의 정확한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것으로 확인된 클론을 각각 이. 콜라이 JM109/pUCHisLDH로서 표기하였다.
(2) 게오바실러스 스테아로써모필러스로부터 유래한 류신 탈수소효소의 개변 효소의 제조
개변 효소(I136R)에 대한 발현 플라스미드는, QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kits(Agilent Technologies)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라 pUCHisLDH에 부위-특이적 돌연변이를 도입함으로써 제조하였다. 이 때, 돌연변이된 코돈을 함유하는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서, 각각, 서열: 5'-GACTATGTCACCGGCCGTTCGCCCGAATTCGG-3'(서열번호 9), 및 서열: 5'-CCGAATTCGGGCGAACGGCCGGTGACATAGTC-3'(서열번호 10)을 사용하였다. 형질전환, 배양, 및 플라스미드 추출 등과 관련되는 실험적 조작은 표준 방법에 따라 수행하였다. 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것으로 확인된 클론을 에스케리키아 콜라이 JM109/pUCHisLDH 돌연변이체로서 표기하였고, 후속 실험에 사용하였다.
(3) 개변 효소의 발현 및 정제
상술한 바와 같이 작제된 개변 효소의 발현 및 정제는 이하에 나타낸다. 개변 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pUCHisLDH 돌연변이체를 이용하여 형질전환된 재조합체 에스케리키아 콜라이(에스케리키아 콜라이 JM109/pUCHisLDH 돌연변이체)의 콜로니는, 50㎍/ml의 암피실린염을 함유하는 LB 배지 5mL를 함유하는 시험관에서 진탕하면서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 50㎍/ml의 암피실린염을 함유하는 LB 배지 100ml를 함유하는 0.5리터의 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 상기 배양액을 접종하였고, O.D가 1.0에 도달할 때까지 37℃에서 진탕하면서 배양하였다. 이어서, 1M의 이소프로필-β-D-갈락토시드(Nacalai Tesque Inc.로부터 공급된 IPTG)를 1mM의 최종 농도로 첨가하였고, 추가로, 진탕 배양을 추가의 5시간 동안 계속하였다. 얻어진 배양된 배지를 원심분리(8,000rpm, 15분, 4℃; Hitachi 고속 냉각 원심분리기, Hitachi Ltd.로부터 공급된 HIMAC CR21G)하여, 배양된 미생물 세포를 침전시켰고, 상청을 제거하였다. 얻어진 미생물 세포를, 300mM의 NaCl 및 10mM의 이미다졸을 함유하는 50mM의 NaH2PO4 완충액(pH 8.0) 중에 현탁시켰다. 이어서, 초음파 파쇄 장치(KUBOTA INSONATOR 모델 201M, Kubota Corporation으로부터 공급됨)를 이용하여 4℃에서 15분 동안 180W로 상기 미생물 세포를 파쇄하여 효소를 추출하였다. 세포 용해물을 원심분리(8,000rpm, 15분, 4℃; Hitachi 고속 냉각 원심분리기, Hitachi Ltd.로부터 공급된 HIMAC CR21G)하였고, 상청은 효소 단백질의 정제를 위한 무세포 추출액으로서 사용하였다. 1mL의 Ni-NTA 수지(Qiagen으로부터 공급됨)로 충진되고 완충액(300mM의 NaCl 및 10mM의 이미다졸을 함유하는 50mM의 NaH2PO4 완충액(pH 8,0))으로 평형화된 컬럼에 무세포 추출액을 가하였다. 세척 완충액(1M의 NaCl 및 20mM의 이미다졸을 함유하는 50mM의 NaH2PO4 완충액(pH 6.5)) 5mL로 수지를 세척하였고, 후속적으로, 결합된 효소 단백질을 용출 완충액(300mM의 NaCl 및 250mM의 이미다졸을 함유하는 50mM의 NaH2PO4 완충액(pH 8.0))으로 용출하였다. 용출된 분획은 한외여과막(예를 들면, GE Healthcare로부터 공급되는 Vivaspin 6 100kDa WMCO)을 이용하여 농축시켰다. 단백질 농도는 Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific으로부터 공급됨)를 이용하여 측정하였고, 소정 농도의 소 혈청 알부민을 이용하여 작성된 표준 곡선에 기초하여 계산하였다. 정제된 효소의 순도는 도데실 황산 나트륨/폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 얻어진 정제된 효소를 이용하여 후속 실험을 수행하였다.
실시예 2: 기질 특이성의 평가
류신 탈수소효소의 활성은, Asano 등의 방법(Eur. J. Biochem. (1987) 168 (1), 153-159)에 따른 큐벳(cuvette)도 이용할 수 있는 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M2e, Molecular Devices로부터 공급됨)를 이용하여 광로 길이 1cm의 큐벳(Bio-Rad로부터 공급됨) 중에서 측정하였다. 반응액의 조성은 이하와 같았다. 0.5mL의 2M 글라이신-KCl-KOH 완충액(pH 9.0), 0.04mL의 25mM NAD+(Sigma로부터 공급됨), 및 0.1mL의 0.1M L-류신(Sigma로부터 공급됨) 또는 L-이소류신(Sigma로부터 공급됨) 또는 L-발린(Sigma로부터 공급됨) 수용액, 및 적절한 양의 효소 용액을 첨가하여 반응액의 총 용적이 1.0mL가 되게 하였다. 효소 반응은 실온에서 1분 동안 수행하였고, 340nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸다. 야생형(WT)을 주형으로서 사용하여 돌연변이를 도입한 개변 효소(I136R)의 상대 활성은 각각의 BCAA에 대해 개선되었다. 이하에 야생형은 종종 WT로 약기한다.
실시예 3: 개변 효소(I136R)를 이용한 BCAA의 표준 곡선의 작성
0.5mL의 0.2M 글라이신-KCl-KOH 완충액(pH 9.0), 0.04mL의 25mM NAD+ 용액(Sigma로부터 공급됨), 및 알려진 농도의 L-류신 또는 L-이소류신 또는 L-발린 수용액을 혼합하였고, MilliQ 수를 첨가하여 총 용적이 0.96mL가 되게 하였다. 이 혼합물을 큐벳에 가하였다. 이 용액에, 0.04mL의 0.5mg/mL 효소 용액을 1mL의 총 용적이 되도록 첨가하였고, 얻어진 용액을 전도(upside down) 혼합하였다. 효소 반응은 실온에서 1분 동안 수행하였고, 340nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다.
상기 측정의 결과를 도 3에 나타낸다. BCAA 농도가 140 내지 560μM(140, 280, 420, 및 560μM의 4개의 포인트에서 측정됨)이었던 경우, WT의 경우에 있어서 각각의 BCAA에 대한 WT의 활성이 상이하였으므로 Leu, Ile, 및 Val에 대한 표준 곡선은 각각 크게 상이하였다. 한편, 개변 효소 I136R을 이용한 Leu, Ile, 및 Val에 대한 표준 곡선은, 각각의 BCAA에 대한 활성이 거의 동일하였으므로, 거의 동일하였다. 상기로부터, 개변 효소 I136R에 따르면, 혼합물 중의 Leu, Ile, 및 Val 중 임의의 2개 또는 전부를 함유하는 시료에서도 총 BCAA 농도는 Leu, Ile, 및 Val 중 임의의 하나의 농도로서 간주될 수 있었음이 밝혀졌다.
실시예 4: 개변 효소(I136R)에 의한 실제 시료 중의 총 BCAA의 정량
래트 혈장 시료(SD 스트레인, 암컷, 20주령, Charles River Laboratories Japan, Inc.)을 실제 시료로서 사용하였고, LeuDH WT 및 LeuDH I136R에 의해 시료 중의 총 BCAA를 측정하였다. 상기 측정은, 효소법에 의해 계산된 총 BCAA 측정 값을 아미노산 분석기 L-8900(Hitachi High Technologies Corporation으로부터 공급됨)에 의해 얻어진 총 BCAA 측정 값과 비교함으로써 평가하였다.
효소법에 의한 총 BCAA의 정량은 하기 절차에 따라 수행하였다. 0.5ml의 0.2M 글라이신-KCl-KOH 완충액(pH 9.0), 0.04mL의 25mM NAD+ 용액(Sigma로부터 공급됨), 및 0.04mL 또는 0.02mL의 알려진 농도의 L-발린 수용액 또는 래트 혈장 시료를 혼합하였고, MilliQ 수를 첨가하여 총 용적이 0.96mL가 되게 하였다. 이 혼합물을 큐벳에 첨가하였다. 이 용액에, 0.04mL의 0.5mg/mL 효소 용액을 1mL의 총 용적이 되도록 첨가하였고, 얻어진 용액을 전도(upside down) 혼합하였다. 효소 반응은 실온에서 1분 동안 수행하였고, 340nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 혈장 시료 중의 총 BCAA는, L-발린 수용액을 이용하여 작성된 표준 곡선을 이용하여 정량하였다.
아미노산 분석기로 측정하기 위한 래트 혈장 시료에서, 설포살리실산에 의한 제단백(Deproteinization)을 수행하였다.
효소법에 의해 그리고 아미노산 분석기에 의해 얻어진, 래트 혈장 시료 중의 총 BCAA 농도의 각각의 측정값을 비교하는 그래프를 도 4에 나타낸다. 그 결과로서, 효소법에 의해 얻어진 실제 시료 중의 총 BCAA 농도의 측정값은, 분석기에 의해 얻어진 총 BCAA의 측정값과 거의 동일하였다. 야생형 류신 탈수소효소는, 분기쇄 아미노산 이외의 아미노산에 대한 촉매 활성을 거의 갖지 않는 것으로 공지되어 있다. 본 실험에서, 복수의 아미노산들을 함유하는 혈장 시료 중의 BCAA가 정량될 수 있었다. 따라서, 본 발명의 개변 효소는, 야생형 효소가 분기쇄 아미노산 이외의 아미노산에 대한 촉매 활성을 거의 갖지 않는 야생형 효소의 특성을 보유하는 것으로 예측된다. 상기 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 개변 효소는, 실제 시료 중의 총 BCAA에 대해 특이적인 측정에 유용함이 입증되었다.
실시예 5: 무세포계를 이용한 개변 효소의 합성 및 개변 효소의 정제
히스티딘 친화성 태그 및 TEV 프로테아제 인식 부위를, 주형으로서 야생형 유전자 또는 목적한 돌연변이체 유전자를 이용한 2-단계 PCR법에 의해 N 말단 측에 융합시켜, 목적한 돌연변이가 도입된 작제물의 직쇄상 DNA를 제조하였다. 이러한 DNA를 주형으로서 사용하여 에스케리키아 콜라이로부터 유래한 무세포 합성 반응계에서 단백질을 합성하였다. 1mL의 반응 스케일을 사용한 6시간 동안의 투석법에 의해 합성된 산물의 원심분리 후의 상청 분획을 Ni에 대한 친화성을 이용하여 정제하여 용출 분획을 얻었다. 후속적으로, 목적하는 효소인 것으로 여겨질 수 있는 단백질의 존재는, SDS-PAGE 및 SYPRO ORANGE 단백질 겔 염색제(Life Technologies Japan Ltd.)를 이용한 염색에 의해 확인하였다. 얻어진 용출 분획 중의 단백질 농도는, 표준 물질로서 BSA를 사용한 브래드포드(Bradford)법에 의해 정량하였다. 용출 분획은 필요에 따라서 목적한 농도로 조정하였고, 후속적으로 평가하였다. 야생형 효소에 관해서, 직쇄상 DNA의 제조, 무세포 합성, 및 효소의 정제 및 분석을 상기와 동일한 방식으로 수행하였다. 주형으로서 야생형 유전자를 사용하여 PCR에 의해 제조된 효소는 표 4에 나타낸다. 주형으로서 목적한 돌연변이가 도입된 유전자를 이용하여 PCR에 의해 제조된 효소들은 표 5 및 표 6에 나타낸다. 정제에 사용된 수지 및 완충액은 하기와 같다.
수지: Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare Japan)
완충액:
결합 완충액 (NaCl 750mM, NaPi 20mM, pH 8.0),
세척 완충액 (NaCl 750mM, NaPi 20mM, pH8.0)
수집 및 측정 완충액 (NaCl 300mM, NaPi 50mM, EDTA 34mM, pH 7.0, 10% D2O, 0.01% NaN3)
실시예 6: 활성 및 기질 특이성의 평가
실시예 5에서 합성된 야생형 효소 및 개변 효소의 활성 및 상대 활성은 실시예 2의 방법에 따라 평가하였다. 그 결과를 표 4, 표 5, 및 표 6에 나타낸다. 표 4 및 표 5에서는 야생형의 3개의 시료들의 결과의 평균값을 WT로부터의 값으로 사용하였다. 표 6에서의 결과는, 동일한 시료에 대해 실험이 3회 수행된 경우의 평균값으로부터 계산하였다. 복수의 돌연변이가 도입된 개변 효소를 나타내는 경우, 도입된 돌연변이의 각각은 슬래시(/)를 이용하여 표시하고 연속적으로 기재하였다. 예를 들면, 돌연변이체 I136R/I292F는, I136R 및 I292F의 2개의 돌연변이를 갖는 개변 효소를 나타낸다. 돌연변이를 도입함으로써, WT의 경우에 비하여, 개변 효소의 활성은 추가로 향상되고/향상되거나 각각의 BCAA에 대한 활성이 더 등가가 되었다. 1개의 돌연변이를 도입하는 경우에 비하여, 각각의 BCAA에 대한 활성의 상대값이 WT보다 더 등가인 2개의 돌연변이를 도입함으로써, 각각의 BCAA에 대한 활성의 상대값이 보다 등가가 되었다.
Figure 112014102665829-pct00004
Figure 112014102665829-pct00005
Figure 112014102665829-pct00006
또한, 광로 길이 1cm의 큐벳 대신에 96웰 마이크로웰 플레이트를 사용하였고, 30℃에서 1분 동안 하기의 반응액에서 효소 반응을 수행하였고, 이어서, 340nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 사용되는 효소는, 주형으로서 야생형 유전자를 사용하여 제조된 직쇄상 DNA를 이용하여 합성하였고, 실시예 5에 나타낸 바와 같이 정제하였다. 150㎕의 완충액(0.2M HEPES, 0.28M 염화 나트륨, 8.4mM 인산 수소 2나트륨, pH 7.0 또는 7.5 또는 8.0), 30㎕의 25mM NAD+ 수용액, 1.5㎕의 1M 염화 칼륨 수용액, 3㎕의 10mM L-류신 또는 L-이소류신 또는 L-발린 수용액, 및 100.5㎕의 MilliQ 수를 혼합하고, 이것에 추가로 15㎕의 1mg/ml의 효소 용액을 첨가함으로써, 반응액을 제조하였다. 그 결과는 표 7 및 표 8에 나타낸다. I136K 및 I136R에 대한 각각의 값은 1회의 실험으로부터 얻어졌고, 다른 효소들에 대한 다른 값들은, 동일한 시료에 대한 2회의 실험들로부터 계산된 평균값이었다. 표 7은 개변 효소의 WT에 대한 활성의 상대값을 나타내고, 표 8은 효소의 각각의 BCAA에 대한 활성의 상대값을 나타낸다.
Figure 112014102665829-pct00007
Figure 112014102665829-pct00008
실시예 7: 열 안정성의 평가
실시예 5에서 합성된 LeuDH WT 및 하기 개변 효소의 5종의 효소 용액을 60, 70, 80℃에서 1시간 동안 열 처리하였고, 후속적으로 활성을 측정하였다. 열 처리 후의 각각의 효소 용액의 잔존 활성은 표 9에 나타낸다. 60℃ 또는 70℃로의 열 처리 후의 임의의 개변 효소의 잔존 활성은 WT의 잔존 활성보다 더 높았다.
Figure 112014102665829-pct00009
산업상 이용가능성
본 발명의 개변 효소는, 총 분기쇄 아미노산 농도의 신속한 측정에 유용하다. 본 발명의 개변 효소는, 또한, 임의의 분기쇄 아미노산의 측정 및/또는 임의의 분기쇄 아미노산의 유도체의 제조에도 유용하다. 본 발명의 개변 효소는, 추가로, 액상 시약으로서 유용하다. 본 발명의 분석 방법은, 예를 들면, 간 경변, 간성 뇌병증과 같은 질환의 진단에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO CO., INC. <120> MODIFIED LEUCINE DEHYDROGENASE <130> PAMA-25042 <150> JP 2012-082777 <151> 2012-03-30 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 1 atggaattgt tcaaatatat ggaaacttac gattatgagc aagtgctgtt ttgccaagat 60 aaagaatcgg gtttgaaagc gatcattgcc attcatgaca caacgctcgg cccggcgctc 120 ggcgggacgc gcatgtggat gtacaattcg gaagaagaag cgcttgaaga cgccttgcgc 180 ctcgcccgcg gcatgacgta caaaaacgcg gccgccggcc tcaacttggg cgggggcaaa 240 acggtcatca tcggcgaccc gcgcaaagat aaaaacgaag cgatgttccg ggcgttcggc 300 cgcttcattc aagggctgaa cggccgctac atcacggcgg aagacgtcgg cacgaccgtc 360 gccgatatgg atatcatcta tcaagaaacc gactatgtca ccggcatttc gcccgaattc 420 ggctcatccg gcaacccatc gccggcgacc gcctacggcg tataccgcgg catgaaggcg 480 gcggcaaaag aggcgttcgg cagcgattcg ctcgaaggaa aagtcgtcgc cgtccaagga 540 gtcggcaatg tcgcgtatca tttgtgccgc catttgcacg aagaaggagc gaaactcatc 600 gtgactgaca tcaacaagga agtggtggcg cgcgcggtcg aggaattcgg agcgaaagcg 660 gtcgacccga acgacattta cggcgtggag tgcgacattt ttgctccatg cgcgctcggc 720 ggcatcatca acgatcaaac gattccgcaa ctgaaagcga aagtgatcgc cggatcggca 780 gacaaccagc tgaaagagcc gcgccatggc gacatcatcc atgaaatggg catcgtctat 840 gccccggatt atgtgatcaa cgccggcggc gtcatcaacg tcgcggacga actgtacggc 900 tacaatcggg aacgggcgat gaaaaaaatc gagcaaattt atgacaacat cgaaaaagtg 960 tttgccatcg ccaagcgcga caacattcca acgtatgtgg ccgccgaccg gatggcggaa 1020 gaacggattg aaacgatgcg caaagcgcgc agtccatttt tgcaaaatgg tcaccatatt 1080 ttaagccgcc gtcgcgcccg ctaa 1104 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 2 Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Thr Tyr Asp Tyr Glu Gln Val Leu 1 5 10 15 Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His 20 25 30 Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Met Tyr 35 40 45 Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly 50 55 60 Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys 65 70 75 80 Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe 85 90 95 Arg Ala Phe Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr 100 105 110 Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Ala Asp Met Asp Ile Ile Tyr Gln 115 120 125 Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Glu Phe Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Asn Pro Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val 165 170 175 Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Arg His Leu 180 185 190 His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Val 195 200 205 Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Lys Ala Val Asp Pro Asn 210 215 220 Asp Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ile Ile Asn Asp Gln Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile 245 250 255 Ala Gly Ser Ala Asp Asn Gln Leu Lys Glu Pro Arg His Gly Asp Ile 260 265 270 Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala 275 280 285 Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu 290 295 300 Arg Ala Met Lys Lys Ile Glu Gln Ile Tyr Asp Asn Ile Glu Lys Val 305 310 315 320 Phe Ala Ile Ala Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp 325 330 335 Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Thr Met Arg Lys Ala Arg Ser Pro 340 345 350 Phe Leu Gln Asn Gly His His Ile Leu Ser Arg Arg Arg Ala Arg 355 360 365 <210> 3 <211> 1095 <212> DNA <213> Lysinibacillus sphaericus <400> 3 atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60 gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120 ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180 ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240 acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300 cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 360 acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420 ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480 gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540 ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600 gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660 gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720 gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780 aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840 gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900 tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960 tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020 gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080 ttgaacggcc gttaa 1095 <210> 4 <211> 364 <212> PRT <213> Lysinibacillus sphaericus <400> 4 Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val 1 5 10 15 Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His 20 25 30 Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr 35 40 45 Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly 50 55 60 Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys 65 70 75 80 Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe 85 90 95 Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr 100 105 110 Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu 115 120 125 Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile 165 170 175 Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu 180 185 190 His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala 195 200 205 Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp 210 215 220 Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly 225 230 235 240 Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile 245 250 255 Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr 260 265 270 Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala 275 280 285 Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu 290 295 300 Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile 305 310 315 320 Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn 325 330 335 Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln 340 345 350 Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg 355 360 <210> 5 <211> 1101 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 5 atgacattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60 caagataaag aatctggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120 gctcttggtg gaacaagaat gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180 ttgcgtcttg caaaagggat gacatacaaa aacgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240 gcgaaaacag taattatcgg tgatcctcgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgca 300 ctaggacgtt atatccaagg actaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360 acagtagatg atatggatat tatccatgaa gaaactgact ttgtaacagg tatctcacca 420 tcattcggtt cttctggtaa cccatctccg gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480 aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gacaatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540 caaggcgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600 ttaattgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg ctgtagaaga attcggtgca 660 tcagcagttg aaccaaatga aatttacggt gttgaatgcg atatttacgc accatgtgca 720 ctaggcgcaa cagttaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780 tctgcgaata accaattaaa agaagatcgt catggtgaca tcattcatga aatgggtatt 840 gtatacgcac cagattatgt aattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgaatta 900 tatggataca atagagaacg tgcactaaaa cgtgttgagt ctatttatga cacgattgca 960 aaagtaatcg aaatttcaaa acgcgatggc atagcaactt atgtagcggc agatcgtcta 1020 gctgaagagc gcattgcaag cttgaagaat tctcgtagca cttacttacg caacggtcac 1080 gatattatta gccgtcgcta a 1101 <210> 6 <211> 366 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 6 Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln 1 5 10 15 Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala 20 25 30 Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp 35 40 45 Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala 50 55 60 Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala 85 90 95 Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr 100 105 110 Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile 115 120 125 His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser 130 135 140 Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met 145 150 155 160 Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys 165 170 175 Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys 180 185 190 His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys 195 200 205 Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu 210 215 220 Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala 225 230 235 240 Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys 245 250 255 Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly 260 265 270 Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile 275 280 285 Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn 290 295 300 Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala 305 310 315 320 Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala 325 330 335 Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg 340 345 350 Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg 355 360 365 <210> 7 <211> 1095 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 7 atggaactat ttcgatatat ggaacagtat gactacgagc aattggtatt ttgccaagat 60 aaacagtccg gtttaaaagc gatcatcgcg attcatgata cgacgctcgg gccggctctc 120 ggcggcacaa gaatgtggac atacgaaagt gaagaagccg caattgaaga tgcgctgcgc 180 cttgcgcggg gaatgaccta caaaaatgcg gcggccggac tgaacctcgg aggaggcaaa 240 accgttatta tcggagatcc gcgcaaagat aaaaacgaag aaatgttccg cgctttcggc 300 cgctacattc aaggcttgaa cggcagatac atcacagccg aagacgtcgg tacaaccgtt 360 gaagatatgg acatcattca tgacgaaacc gatttcgtta caggcatttc acctgctttc 420 ggttcatcag gaaatccttc tccggtaaca gcttacgggg tatataaagg gatgaaggcg 480 gcggcgaaag cggcattcgg aacggattcg cttgaaggca aaaccgttgc ggttcaaggc 540 gtcggaaacg tggcctacaa cctgtgccgg cacctccacg aagaaggcgc gaaactgatc 600 gtgaccgaca tcaacaaaga agcagttgaa cgtgcagtcg ccgaattcgg cgcccgcgcc 660 gtcgatccgg atgatattta ttcgcaggaa tgcgatatat atgcgccgtg tgccctcgga 720 gcgacaatca acgatgatac gattccgcag ctgaaagcca aagtgattgc cggggcagcc 780 aacaaccagc tgaaagaaac ccgccacggt gatcaaatcc acgacatggg catcgtttat 840 gccccggact atgtcatcaa tgccggcggc gtcatcaatg tcgctgacga gctttacggc 900 tataattcgg agcgcgcgct gaagaaagtc gaaggcatct acggaaacat tgaacgcgtc 960 cttgaaattt cgaagcgcga ccgcattccg acatacttgg ccgcagaccg tctggcggaa 1020 gaacgaattg agcgcatgcg ccaatcgaga agccaatttt tgcaaaacgg ccatcacatt 1080 ttaagcagac gttaa 1095 <210> 8 <211> 364 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 8 Met Glu Leu Phe Arg Tyr Met Glu Gln Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val 1 5 10 15 Phe Cys Gln Asp Lys Gln Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His 20 25 30 Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr 35 40 45 Glu Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly 50 55 60 Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys 65 70 75 80 Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe 85 90 95 Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr 100 105 110 Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Asp 115 120 125 Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Lys Gly Met Lys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ala Phe Gly Thr Asp Ser Leu Glu Gly Lys Thr Val 165 170 175 Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Asn Leu Cys Arg His Leu 180 185 190 His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Ala 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ala Glu Phe Gly Ala Arg Ala Val Asp Pro Asp 210 215 220 Asp Ile Tyr Ser Gln Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala Leu Gly 225 230 235 240 Ala Thr Ile Asn Asp Asp Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Thr Arg His Gly Asp Gln 260 265 270 Ile His Asp Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala 275 280 285 Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Glu 290 295 300 Arg Ala Leu Lys Lys Val Glu Gly Ile Tyr Gly Asn Ile Glu Arg Val 305 310 315 320 Leu Glu Ile Ser Lys Arg Asp Arg Ile Pro Thr Tyr Leu Ala Ala Asp 325 330 335 Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Glu Arg Met Arg Gln Ser Arg Ser Gln 340 345 350 Phe Leu Gln Asn Gly His His Ile Leu Ser Arg Arg 355 360 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for preparing a mutated leucine dehydrogenase <400> 9 gactatgtca ccggccgttc gcccgaattc gg 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for preparing a mutated leucine dehydrogenase <400> 10 ccgaattcgg gcgaacggcc ggtgacatag tc 32

Claims (17)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열에서, 하기 (i), 하기 (ii), 또는 하기 (i)과 (ii) 둘 다의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로의, (1) TGI 모티프 내의 이소류신의 치환, (2) GVI 모티프 내의 이소류신의 치환, 또는 (3) 상기 (1)과 (2) 둘 다의 치환들을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 개변 효소:
    (i) TGI 모티프 내의 이소류신의
    메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 류신, 라이신, 시스테인, 티로신, 알라닌, 글라이신, 세린, 아스파라긴, 또는 트립토판으로의 치환;
    (ii) GVI 모티프 내의 이소류신의
    페닐알라닌, 히스티딘, 아스파라긴, 티로신, 류신, 라이신, 글루타민, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 글루탐산, 세린, 시스테인, 알라닌, 글라이신, 발린, 트립토판, 또는 메티오닌으로의 치환.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개변 효소가 이의 C-말단 또는 N-말단에 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩타이드 성분, 목적 단백질의 가용성을 향상시키는 펩타이드 성분, 샤페론(chaperon)으로서 작용하는 펩타이드 성분 및 링커로서의 펩타이드 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 성분을 추가로 포함하는, 개변 효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 개변 효소를 이용하여 피검 시료 중에 함유된 총 분기쇄 아미노산을 측정함을 포함하는, 총 분기쇄 아미노산의 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 피검 시료를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)와 혼합하고, 상기 개변 효소의 작용에 의해 NAD+로부터 생성된 NADH를 검출함을 포함하는, 총 분기쇄 아미노산의 분석 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 개변 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항에 따른 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
  8. 제7항에 따른 형질전환체를 이용하여 개변 효소를 생성함을 포함하는, 개변 효소의 제조 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 따른 개변 효소를 포함하는, 총 분기쇄 아미노산 분석용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 반응용 완충액 또는 완충염, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 총 분기쇄 아미노산 분석용 키트.
  11. (a) 검출용 전극, 및 (b) 상기 검출용 전극에 고정되거나 배치된 제1항 또는 제2항에 따른 개변 효소를 포함하는, 총 분기쇄 아미노산 분석용 효소 센서.
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