JPWO2013146940A1 - 改変ロイシン脱水素酵素 - Google Patents
改変ロイシン脱水素酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2013146940A1 JPWO2013146940A1 JP2014507983A JP2014507983A JPWO2013146940A1 JP WO2013146940 A1 JPWO2013146940 A1 JP WO2013146940A1 JP 2014507983 A JP2014507983 A JP 2014507983A JP 2014507983 A JP2014507983 A JP 2014507983A JP WO2013146940 A1 JPWO2013146940 A1 JP WO2013146940A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- modified enzyme
- leucine
- branched chain
- chain amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010028658 Leucine Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 125000001909 leucine group Chemical class [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 160
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 123
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 61
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 90
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 76
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 73
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 60
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 58
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 51
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 36
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 31
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 31
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 30
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 30
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 30
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 30
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 30
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 30
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 29
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 29
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 29
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 29
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 29
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 29
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 29
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 28
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 28
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 28
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 27
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 27
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 27
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 27
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 27
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 26
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 26
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 26
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 25
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 24
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 22
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 22
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 21
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 16
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 claims description 16
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 claims description 16
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 16
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 16
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 16
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 15
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Chemical group OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 9
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- NTOKKQYUXMUQQD-GDZDFWBTSA-N (2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NTOKKQYUXMUQQD-GDZDFWBTSA-N 0.000 claims description 2
- NREKYJNUNHNXAF-DHYYHALDSA-N (2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical class CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CSCC[C@H](N)C(O)=O NREKYJNUNHNXAF-DHYYHALDSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 139
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 28
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 28
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 20
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 20
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 20
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 13
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 229910020360 KCl—KOH Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 3
- 208000007386 hepatic encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001142 4-methyl-2-oxopentanoic acid Substances 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 1
- 101000659581 Geobacillus stearothermophilus Anthranilate synthase component 1 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001072230 Oceanobacillus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 235000015897 energy drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150104734 ldh gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
- C12Y104/01009—Leucine dehydrogenase (1.4.1.9)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
- G01N2333/90605—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- G01N2333/90611—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general
- G01N2333/90616—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general with a definite EC number (1.4.1.-)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
例えば、酵素キットでは、ロイシン脱水素酵素を用いて総分岐鎖アミノ酸濃度が測定されている。しかしながら、本方法では、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法が利用されている。この理由は、L−ロイシン、L−イソロイシンおよびL−バリンに対するロイシン脱水素酵素の基質特異性(反応速度)が異なるためである。野生型のロイシン脱水素酵素は、L−ロイシンに比べてL−イソロイシンおよびL−バリンに対する基質特異性が低く、反応速度が遅い。したがって、ロイシン脱水素酵素を用いる酵素キットでは、総分岐鎖アミノ酸濃度の測定に長い反応時間を要するという欠点があった。
〔1〕以下:
(a)総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性;
(b)任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性;および
(c)ロイシン脱水素酵素の熱安定性;
からなる群より選ばれるロイシン脱水素酵素の1以上の特性を改善するようにその少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。
〔2〕変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のTGIモチーフ中のイソロイシンの置換である、〔1〕の改変酵素。
〔3〕TGIモチーフ中のイソロイシンが、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンに置換されている、〔2〕の改変酵素。
〔4〕変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のGVIモチーフ中のイソロイシンの置換である、〔1〕〜〔3〕のいずれかの改変酵素。
〔5〕GVIモチーフ中のイソロイシンが、フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンに置換されている、〔4〕の改変酵素。
〔6〕ロイシン脱水素酵素が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)に由来する、〔1〕〜〔5〕のいずれかの改変酵素。
〔7〕以下(1)あるいは(2)のタンパク質である、〔1〕〜〔6〕のいずれかの改変酵素:
(1)配列番号2のアミノ酸配列において、TGIモチーフ中のイソロイシン、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシンが、下記(i)および/または(ii)のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質:
(i)TGIモチーフ中のイソロイシン
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンへの置換;および/または
(ii)GVIモチーフ中のイソロイシン
フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンへの置換;あるいは
(2)配列番号2のアミノ酸配列におけるTGIモチーフ中のイソロイシン、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシンが、上記(i)および/または(ii)のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記(a)〜(c)からなる群より選ばれる1以上の特性が改善されている、タンパク質:
(a)総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性;
(b)任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性;および
(c)ロイシン脱水素酵素の熱安定性。
〔8〕〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変酵素を用いて被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含む、総分岐鎖アミノ酸の分析方法。
〔9〕被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)と混合し、改変酵素の作用によりNAD+から生成したNADHを検出することを含む、〔8〕の方法。
〔10〕〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変酵素を用いて分岐鎖アミノ酸からその誘導体を生成することを含む、分岐鎖アミノ酸の誘導体の製造方法。
〔11〕〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔12〕〔11〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔13〕〔12〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔14〕総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善するようにその少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、〔13〕の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
〔15〕〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
〔16〕反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)の少なくとも一つをさらに含む、〔15〕の総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
〔17〕(a)検出用電極、および(b)検出用電極に固定または配置された、〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用酵素センサー。
→ 4−メチル−2−オキソペンタン酸+NH3+NADH+H+
また、ロイシン脱水素酵素については、立体構造の解析結果が報告されている(例、Baker et al.,Structure 3:693−705(1995)を参照)。したがって、当業者は、立体構造の解析結果に基づき、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス以外の生物に由来するロイシン脱水素酵素についても、活性中心付近にあるアミノ酸残基を容易に特定することができる。
(a)総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性;
(b)任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性;および
(c)ロイシン脱水素酵素の熱安定性。
本発明の改変酵素は、上述した特性のうち1つのみを有していてもよいが、上述した特性のうち2つまたは3つの特性を併有していてもよい。
本発明の改変酵素が好適に使用される中性条件とは、pH6.0以上8.0以下の範囲内にある任意のpH条件をいう。好ましくは、中性条件は、pH7.0以上8.0以下の範囲内にある任意のpH条件(例、pH7.0、pH7.5またはpH8.0)である。
本発明の改変酵素が好適に使用されるアルカリ性条件とは、pHが8.0よりも大きく11.0以下の範囲内にある任意のpH条件をいう。アルカリ性条件におけるpH範囲の上限値は、10.5以下であることが好ましく、10.0以下であることがより好ましい。特に好ましくは、アルカリ性条件は、pH8.5以上9.5以下の範囲内にある任意のpH条件(例、pH9.0)である。
(a)136位の置換後のアミノ酸残基(アルカリ性条件)
メチオニン(M)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、リジン(K)、システイン(C)、チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、またはセリン(S)
(b)292位の置換後のアミノ酸残基(アルカリ性条件)
フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、リジン(K)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、またはグリシン(G)
(c)136位の置換後のアミノ酸残基(中性条件)
アラニン(A)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、セリン(S)、またはチロシン(Y)
(d)292位の置換後のアミノ酸残基(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グリシン(G)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、またはバリン(V)
1−1)136位の置換後のアミノ酸残基(アルカリ性条件)
(i)L−ロイシンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
メチオニン(M)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、ロイシン(L)、リジン(K)、システイン(C)、チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、アスパラギン(N)、またはトリプトファン(W)
(ii)L−イソロイシンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
メチオニン(M)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、ロイシン(L)、リジン(K)、システイン(C)、チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、アスパラギン(N)、またはトリプトファン(W)
(iii)L−バリンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
メチオニン(M)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、ロイシン(L)、リジン(K)、システイン(C)、チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、アスパラギン(N)、またはトリプトファン(W)
(iv)L−ロイシンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、リジン(K)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、システイン(C)、アラニン(A)、またはグリシン(G)
(v)L−イソロイシンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、リジン(K)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、システイン(C)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、またはトリプトファン(W)
(vi)L−バリンに対する活性の向上(アルカリ性条件)
フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、リジン(K)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、システイン(C)、アラニン(A)、グリシン(G)、またはバリン(V)
2−1)136位の置換後のアミノ酸残基(中性条件)
(i’)L−ロイシンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、アルギニン(R)、セリン(S)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
(ii’)L−イソロイシンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、アルギニン(R)、セリン(S)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
(iii’)L−バリンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
(iv’)L−ロイシンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
(v’)L−イソロイシンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
(vi’)L−バリンに対する活性の向上(中性条件)
アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)
メチオニン(M)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、またはリジン(K)
フェニルアラニン(F)
(i)ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列において、TGIモチーフ中のイソロイシン(I)、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシン(I)が変異(例、置換)したアミノ酸配列を含み、かつ、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性が改善されている、タンパク質;または
(ii)ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列におけるTGIモチーフ中のイソロイシン(I)、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシン(I)が変異(例、置換)したアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性が改善されている、タンパク質。
本発明のキットは、反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)の少なくとも一つをさらに含むことができる。
L−ロイシン、L−イソロイシンおよびL−バリンの酵素定量法では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)の存在下、アルカリ性緩衝液中において、ロイシン脱水素酵素を生体由来試料(例、血漿)に作用させ、生体由来試料中に含まれる基質のアミノ基を酸化的脱アミノ化するとともに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)から還元型(NADH)を生成させた。NADHの生成量は、マイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e,モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。
(1)鋳型ldh遺伝子の調製
(a)培養および染色体DNAの精製
行政独立法人 製品評価技術機構 生物遺伝資源部門(NBRC)より入手したGeobacillus stearothermophilus NBRC 12550の凍結乾燥ペレットは、growth medium 702にて懸濁し、growth medium 802寒天培地に塗布したものを、50℃にて一晩培養した。コロニーを5mlのgrowth medium 702に植菌した後、50℃にて30時間静置培養を行った。この細胞培養液5mlより、染色体DNAを精製し、下記の実験に供した。
培地の調製の詳細は、以下の表3に記載されるとおりであった。
Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009;73:729−732に記載の方法にて作成されたpUC18Hisプラスミドの精製は、ベクターを組込んだ組換え大腸菌(E.coli JM109/pUC18His)培養液より、Invisorb Spin Plasmid Mini Kit(Invitek社製)を用いて、プロトコールに従って行った。精製プラスミドpUC18HisのベクターDNAを7μl、10×K buffer(タカラバイオ(株)社製)を2.5μl、PstIおよびBamHIをそれぞれ0.8μlを加え、滅菌超純水で反応液総量を25μlとし、37℃にて3時間制限酵素処理した。上記の反応液25μlに、それぞれシュリンプ由来アルカリフォスファターゼ(Roche社製)を2μl、×10アルカリフォスファターゼバッファーを5μl加え、滅菌超純水にて反応液総量を50μlとし、37℃にて1時間反応させた。反応液はフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、TE溶液に溶解して脱リン酸化pUC18HisベクターDNA 20μlを得た。
G.stearothermophilus由来ロイシン脱水素酵素遺伝子の増幅では、G.stearothermophilus染色体DNAを鋳型として、G.stearothermophilus IFO 12550のロイシン脱水素酵素遺伝子(配列表1;Biochemistry,27,9056(1988))を基に作成したBamHI認識部位配列を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー1:5’−ccggatccgatggaattgttcaaatatatggaaac−3’(配列番号11)(北海道システム・サイエンス(株)社製)およびPstI認識部位配列を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー2:5’−actgcagttatattgccgaagcacc−3’(配列番号12)(北海道システム・サイエンス(株)社製)を用いた。PCR反応液組成を50ngの染色体DNA,100pmol/μlの合成ヌクレオチドプライマーをそれぞれ1μl、ExTaq ×10 buffer(タカラバイオ(株)社製)を5μl、2.5mM dNTP mixture(タカラバイオ(株)社製)を5μl、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase(タカラバイオ(株)社製)を1μl加え、滅菌超純水で反応液総量を50μlとした。PCRは、PTC−200ペルチェ・サーマルサイクラー(MJリサーチ・ジャパン(株)社製)を用い、反応条件は、94℃30秒、55℃30秒、72℃2分の反応サイクルを30回繰り返した。
PCR産物の電気泳動を行い、紫外線照射下において切り出した2つの増幅産物(1400bpおよび1900bp付近)を、ゲル抽出キットGel−MTM Gel Extraction Kit(VIOGENE社製)にて抽出、精製して、50μlの精製産物を得た。精製産物4μlに対し、10×K buffer(タカラバイオ(株)社製)を6μl、PstIおよびBamHIをそれぞれ1μlずつ加え、滅菌超純水で反応液総量を60μlとし、37℃にて3時間反応させ、精製PCR産物両端の制限酵素処理を行った。反応液は、60℃にて15分インキュベートし、制限酵素を失活させた後、エタノール沈殿を行い、精製挿入断片を得た。
上記で得られた脱リン酸化プラスミドを1μl、精製挿入断片を5μl、Ligation mix(タカラバイオ(株)社製)6μlを混合し、反応液総量を12μlとして16℃にて一晩ライゲーション反応を行った後、反応液6μlでE.coli JM109を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で10時間培養した。得られたコロニーをマスタープレートに植菌し、コロニーを形成したものを、50μg/mlのアンピシリンを含む5mLのLB培地に植菌し、一晩培養した。培養液からプラスミドDNAを精製し、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列解析を行い、G.stearothermophilus由来ロイシン脱水素酵素遺伝子の正しいヌクレオチド配列が確認されたクローンを、それぞれE.coli JM109/pUCHisLDHとした。
改変酵素(I136R)の発現用プラスミドは、QuikChange Lightning Site−Directed Mutagenesis Kits(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、製品添付のプロトコルに従い、pUCHisLDHに対して部位特異的変異を導入することによって作製した。その際、変異コドンを含むセンスプライマーとして、5’−GACTATGTCACCGGCCGTTCGCCCGAATTCGG−3’(配列番号9)、アンチセンスプライマーとして、5’−CCGAATTCGGGCGAACGGCCGGTGACATAGTC−3’(配列番号10)を用い、また形質転換や培養、プラスミド抽出などの関連する実験操作については定法に従い行った。目的のヌクレオチド配列が確認されたクローンをEscherichia coli JM109/pUCHisLDH変異体として以降の実験に使用した。
先述のとおり構築された改変酵素の発現および精製について以下に示す。改変酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドpUCHisLDH変異体によって形質転換された組換え大腸菌(Escherichia coli JM109/pUCHisLDH変異体)のコロニーを50μg/mlのアンピシリン塩を含むLB培地5mlが入った試験管にて37℃で16時間振とう培養した。前記培養液を50μg/mlのアンピシリン塩を含むLB培地100mlの入った0.5リットル容坂口フラスコに植菌し、37℃でO.D.1.0に達するまで振とう培養し、1Mイソプロピル−β−D−ガラクトシド(IPTG;ナカライテスク社製)を終濃度1mMとなるように添加し、さらに5時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離(8,000rpm、15分、4℃;日立高速冷却遠心機himac CR21G、日立社製)し、培養菌体を沈澱させ上清を除去した。得られた菌体を、300 mM NaCl、10 mM イミダゾールを含む50mM NaH2PO4 buffer(pH8.0)に懸濁させた後、超音波破砕装置(KUBOTA INSONATOR model 201M、久保田社製)を用いて180W、15分、4℃にて菌体の破砕および酵素の抽出を行った。破砕液を遠心分離(8,000rpm、15分、4℃;日立高速冷却遠心機himac CR21G、日立社製)し、上清を無細胞抽出液として酵素タンパク質の精製に用いた。緩衝液(300mM NaCl、10mMイミダゾールを含む50mM NaH2PO4 buffer,pH8.0)で平衡化したNi−NTA樹脂(キアゲン社製)1mlの充填されたカラムに添加した。洗浄用緩衝液(1M NaCl、20mMイミダゾールを含む50mM NaH2PO4 buffer,pH6.5)5mlにて樹脂の洗浄を行い、その後、溶出用緩衝液(300mM NaCl、250mMイミダゾールを含む50mM NaH2PO4 buffer,pH8.0)5mlにて結合した酵素タンパク質の溶出を行った。溶出画分を限外ろ過膜(例えば、Vivaspin6 100kDa MWCO;GEヘルスケア社製)を用いて濃縮した。タンパク質濃度の算出は、Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて牛血清アルブミンの所定濃度で作成した検量線をもとに行った。精製酵素の純度の確認は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により行った。得られた精製酵素を用いて以降の実験を行った。
ロイシン脱水素酵素の活性測定は、浅野らの方法(Eur.J.Biochem.(1987)168(1),153−159)に従い、キュベットの利用も可能なマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e、モレキュラーデバイス社製)を用いて、光路長1cmのキュベット(Bio−rad社製)で測定した。反応液の組成は、以下のとおりであった。0.2M Glycine−KCl−KOH buffer(pH9.0)を0.5ml、25mM NAD+(シグマ社製)溶液を0.04ml、0.1M L−ロイシン(シグマ社製)もしくはL−イソロイシン(シグマ製)あるいはL−バリン(シグマ社製)などの水溶液を0.1mlおよび適量の酵素溶液を加えて反応液総量を1.0mlとした。酵素反応は、室温で1分間行い、340nmの吸光度変化を測定した。その結果を図2に示す。野生型(WT)を鋳型として変異導入した改変酵素I136Rは、各BCAAに対する相対活性が改善されていた。なお、以降は野生型をWTと示す場合がある。
0.2M Glycine−KCl−KOH buffer(pH9.0)を0.5ml、25mM NAD+(シグマ社製)溶液を0.04ml、既知濃度のL−ロイシン水溶液またはL−イソロイシン水溶液またはL−バリン水溶液、MilliQ水で総量が0.96mlになるように調製し、キュベットに添加した。この溶液に、0.5mg/mlの酵素混合溶液0.04mlを加えて総量を1mlとし,転倒混和した。酵素反応は、室温で1分間行い、340nmの吸光度変化を測定した。
実試料としてラット血漿サンプル(SD系、メス、20週齢、日本チャールズリバー製)を用いて、LeuDH WT及びLeuDH I136Rによる試料中の総BCAA測定評価を行った。その評価は、酵素法によって算出された総BCAA測定値とアミノ酸分析計L−8900(日立ハイテク社製)から得られた総BCAA測定値とを比較することにより行った。
野生型の遺伝子または目的とする変異体の遺伝子を鋳型に、2−StepPCR法でヒスチジンアフィニティタグおよびTEVプロテアーゼ認識配列をN末端側に融合させ、目的変異が導入されたコンストラクトの直鎖状DNAを調製し、このDNAを鋳型として用いて、大腸菌由来のセルフリー合成反応系でタンパク質を合成した。反応スケール1mL、透析法で6時間合成を行った産物の遠心後の上清画分について、Niに対するaffinity精製の溶出画分を得た。続いて、SDS−PAGEおよびSYPRO ORANGE Protein Gel Stain(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いた染色により、目的酵素と考えられるタンパク質の存在を確認した。得られた溶出画分について、BSAを標準物質としたBradford法によりタンパク質濃度を定量し、必要に応じ目的の濃度に調製した後、評価に供した。野生型酵素についても同様の手順で、直鎖状DNAの調製、セルフリー合成、酵素の精製および分析を行った。野生型の遺伝子をPCRの鋳型として用いて調整した酵素を表4に、目的変異を導入した遺伝子をPCRの鋳型として用いて調整した酵素を表5および6に示す。なお、精製に用いたレジンと緩衝液は、以下のとおりである。
レジン:Ni Sepharose High Performance(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)
緩衝液:
Binding Buffer(NaCl 750mM,NaPi 20mM,pH8.0)
Wash Buffer(NaCl 750mM,NaPi 20mM,pH8.0)
回収・測定Buffer(NaCl 300mM,NaPi 50mM,EDTA 34mM,pH7.0,10% D2O,0.01% NaN3)
実施例5で合成された野生型酵素および改変酵素の活性および相対活性の評価は、実施例2の方法に従って行った。その結果を表4、5、および6に示す。表4、5におけるWTの値は、野生型3サンプルでの結果の平均値を用いた。また、表6の結果は、同一サンプルについて3回実験を行った際の平均値より算出した。なお、変異を複数導入した改変酵素を示す場合、導入した変異を/で区切り、続けて記載した。例えば、I136R/I292Fは、I136RとI292Fの2つの変異を有する改変酵素であることを示す。変異の導入により、WTに比べ活性が向上および/または各BCAAに対する活性がより等しくなった。また、各BCAAに対する活性の相対値がWTより等しくなる変異を2つ導入することで、1変異の場合に比べ、相対値がより等しくなった。
実施例5で合成されたLeuDH WTおよび下記改変酵素5種の酵素溶液を60、70、80℃にて1時間熱処理した後、活性測定を行った。熱処理後の各酵素溶液の残存活性を表9に示す。いずれの改変酵素も、60℃、70℃での熱処理後の残存活性は、野生型より高かった。
Claims (17)
- 以下:
(a)総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性;
(b)任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性;および
(c)ロイシン脱水素酵素の熱安定性;
からなる群より選ばれるロイシン脱水素酵素の1以上の特性を改善するようにその少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。 - 変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のTGIモチーフ中のイソロイシンの置換である、請求項1記載の改変酵素。
- TGIモチーフ中のイソロイシンが、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンに置換されている、請求項2記載の改変酵素。
- 変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のGVIモチーフ中のイソロイシンの置換である、請求項1〜3のいずれか一項記載の改変酵素。
- GVIモチーフ中のイソロイシンが、フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンに置換されている、請求項4記載の改変酵素。
- ロイシン脱水素酵素が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)に由来する、請求項1〜5のいずれか一項記載の改変酵素。
- 以下(1)あるいは(2)のタンパク質である、請求項1〜6のいずれか一項記載の改変酵素:
(1)配列番号2のアミノ酸配列において、TGIモチーフ中のイソロイシン、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシンが、下記(i)および/または(ii)のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質:
(i)TGIモチーフ中のイソロイシン
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンへの置換;および/または
(ii)GVIモチーフ中のイソロイシン
フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンへの置換;あるいは
(2)配列番号2のアミノ酸配列におけるTGIモチーフ中のイソロイシン、および/またはGVIモチーフ中のイソロイシンが、上記(i)および/または(ii)のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記(a)〜(c)からなる群より選ばれる1以上の特性が改善されている、タンパク質:
(a)総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性;
(b)任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性;および
(c)ロイシン脱水素酵素の熱安定性。 - 請求項1〜7のいずれか一項記載の改変酵素を用いて被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含む、総分岐鎖アミノ酸の分析方法。
- 被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)と混合し、改変酵素の作用によりNAD+から生成したNADHを検出することを含む、請求項8記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の改変酵素を用いて分岐鎖アミノ酸からその誘導体を生成することを含む、分岐鎖アミノ酸の誘導体の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項12記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善するようにその少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、請求項13記載の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
- 反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)の少なくとも一つをさらに含む、請求項15記載の総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
- (a)検出用電極、および(b)検出用電極に固定または配置された、請求項1〜7のいずれか一項記載の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用酵素センサー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012082777 | 2012-03-30 | ||
JP2012082777 | 2012-03-30 | ||
PCT/JP2013/059124 WO2013146940A1 (ja) | 2012-03-30 | 2013-03-27 | 改変ロイシン脱水素酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013146940A1 true JPWO2013146940A1 (ja) | 2015-12-14 |
JP6119738B2 JP6119738B2 (ja) | 2017-04-26 |
Family
ID=49260189
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014507983A Active JP6119738B2 (ja) | 2012-03-30 | 2013-03-27 | 改変ロイシン脱水素酵素 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9347047B2 (ja) |
JP (1) | JP6119738B2 (ja) |
KR (1) | KR101726581B1 (ja) |
CN (2) | CN104271739B (ja) |
WO (1) | WO2013146940A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104271739B (zh) | 2012-03-30 | 2017-03-08 | 味之素株式会社 | 经修饰的亮氨酸脱氢酶 |
EP2980215B1 (en) | 2013-03-29 | 2019-03-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Modified glycine oxidase |
CN109387555B (zh) * | 2017-08-08 | 2021-07-20 | 太原师范学院 | 一种膜电极及其制备方法和用途 |
CN108103038B (zh) * | 2017-12-15 | 2021-03-02 | 江南大学 | 一种合成l-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用 |
CN108559735B (zh) * | 2018-05-10 | 2020-07-07 | 江南大学 | 一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用 |
JP2022537214A (ja) * | 2019-06-21 | 2022-08-24 | ギンゴー バイオワークス, インコーポレイテッド | メープルシロップ尿症(msud)の処置のおける使用のための酵素の生合成 |
CN110760562A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-07 | 申友基因组研究院(南京)有限公司 | 一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用 |
CN110904174B (zh) * | 2019-12-16 | 2022-08-30 | 湖北大学 | 缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用 |
CN113106078B (zh) * | 2021-04-26 | 2022-09-16 | 华东理工大学 | 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备l-叔亮氨酸中的应用 |
CN116042559A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-05-02 | 厦门大学 | 一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0856660A (ja) * | 1994-08-26 | 1996-03-05 | Ikeda Shokken Kk | 耐熱性ロイシン脱水素酵素およびその製造法 |
US20040115691A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-06-17 | Rozzell J. David | Mutants of enzymes and methods for their use |
WO2005075970A1 (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | アミノ酸バイオセンサー、フィッシャー比バイオセンサー、及び健康情報管理システム |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005075970A (ja) | 2003-09-02 | 2005-03-24 | Ge Toshiba Silicones Co Ltd | 導電性シリコーンインク組成物の製造方法 |
JP2007289096A (ja) | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | 総分岐鎖アミノ酸/チロシンモル比測定用液状試薬 |
WO2008013996A2 (en) * | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Gevo Inc. | Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems |
WO2011145664A1 (ja) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | 味の素株式会社 | 含硫黄アミノ酸誘導体 |
BR112013032690A2 (pt) | 2011-06-28 | 2017-01-24 | Ajinomoto Kk | método para produzir um composto, composto, e, uso do mesmo |
CN102352387A (zh) * | 2011-09-19 | 2012-02-15 | 尚科生物医药(上海)有限公司 | 固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法 |
CN104271739B (zh) | 2012-03-30 | 2017-03-08 | 味之素株式会社 | 经修饰的亮氨酸脱氢酶 |
-
2013
- 2013-03-27 CN CN201380018064.8A patent/CN104271739B/zh active Active
- 2013-03-27 KR KR1020147030083A patent/KR101726581B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-27 JP JP2014507983A patent/JP6119738B2/ja active Active
- 2013-03-27 WO PCT/JP2013/059124 patent/WO2013146940A1/ja active Application Filing
- 2013-03-27 CN CN201710068954.XA patent/CN107043754B/zh active Active
-
2014
- 2014-09-19 US US14/491,501 patent/US9347047B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-20 US US15/133,599 patent/US9453206B2/en active Active
- 2016-08-29 US US15/250,056 patent/US20160362662A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0856660A (ja) * | 1994-08-26 | 1996-03-05 | Ikeda Shokken Kk | 耐熱性ロイシン脱水素酵素およびその製造法 |
US20040115691A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-06-17 | Rozzell J. David | Mutants of enzymes and methods for their use |
WO2005075970A1 (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | アミノ酸バイオセンサー、フィッシャー比バイオセンサー、及び健康情報管理システム |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6016032840; 'Accession No. G2RIK0' UniProt [online] , 2011 * |
JPN6016032844; Current Biology Vol. 3, 1995, pp. 693-705 * |
JPN6016032846; 'Accession No. P13154' UniProt [online] , 2011 * |
JPN6016032850; J. Biochem. Vol. 112, 1992, pp. 258-265 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107043754B (zh) | 2021-07-06 |
US20160362662A1 (en) | 2016-12-15 |
CN107043754A (zh) | 2017-08-15 |
US9347047B2 (en) | 2016-05-24 |
US9453206B2 (en) | 2016-09-27 |
CN104271739B (zh) | 2017-03-08 |
WO2013146940A1 (ja) | 2013-10-03 |
US20150010936A1 (en) | 2015-01-08 |
KR101726581B1 (ko) | 2017-04-13 |
CN104271739A (zh) | 2015-01-07 |
KR20140148453A (ko) | 2014-12-31 |
JP6119738B2 (ja) | 2017-04-26 |
US20160222359A1 (en) | 2016-08-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6119738B2 (ja) | 改変ロイシン脱水素酵素 | |
US10358638B2 (en) | Method of producing 1,5-pentadiamine using lysine decarboxylase mutant having improved thermal stability | |
US20170268033A1 (en) | Method of Analyzing L-Tryptophan in Biological Samples, and Kit Used Therein | |
JP6350519B2 (ja) | 改変グリシン酸化酵素 | |
US20230203456A1 (en) | L-glutamate oxidase mutant | |
US20220235333A1 (en) | Modified Phenylalanine Dehydrogenase | |
US20230295600A1 (en) | Mutated histidine decarboxylase and use thereof | |
JP7039897B2 (ja) | ヒスチジンの測定方法 | |
JP7081489B2 (ja) | トリプトファン酸化酵素およびその用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160830 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161005 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170228 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170313 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6119738 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |