CN112940088B - DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白 - Google Patents

DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白 Download PDF

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Abstract

DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白。本发明发现了一种提高蛋白有序性的氨基酸序列及该序列的几个关键突变位点。实验结果表明，通过对这些突变位点进行基因替换，分别得到的几个重组蛋白能够在逆境条件下保护酶的活性，并且可减少酶发生聚集，防止其结构发生改变。

Description

DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位 点和重组蛋白
技术领域
本发明涉及一种提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白及应用。
背景技术
冷冻和氧化等逆境是制约生物生长和发育的非生物胁迫因素，比如蛋白在逆境胁迫条件下往往会降低或失去活性。尤其是酶蛋白，容易发生聚集或结构的其它改变而失活。
因此，通过基因工程手段，得到能在逆境条件下保护蛋白活性的重组蛋白，很有必要。
发明内容
本发明的目的是通过提供一种提高蛋白有序性的氨基酸序列以及发现其相关的突变位点，得到具有抗逆保护功能的重组蛋白。
本发明发现，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的DosH蛋白在逆境胁迫条件下可保护酶的活性，并能减少酶发生聚集和阻止结构发生改变。
DosH蛋白由298个氨基酸组成，分子量为30.9kDa，富含亲水性氨基酸，亲水氨基酸含量为61％，是一类亲水蛋白。
本发明对DosH蛋白进行一级结构分析发现，与其它典型的亲水蛋白质比较，DosH蛋白显著的特点是含有一个有序性升高的多肽(SEQ ID NO.2；N-DosH：1-103位氨基酸)，为Deinococcus属特异序列，具有高度保守性，可能是DosH蛋白折叠成有序二级结构的关键区域。
本发明发现，在DosH蛋白中有几个关键位点，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)位点高度保守，且能够促成蛋白形成二级结构。
其中，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)3种氨基酸能够促成蛋白形成有序二级结构；谷氨酸(E)和赖氨酸(K)促成蛋白形成无序二级结构。
本发明将DosH蛋白61位的W和75位的I突变为脯氨酸(P)，该突变蛋白命名为WIP(SEQ ID NO.3)；
将14-17位4个连续L、61位的W和75位的I突变为P，该突变蛋白命名为LWIP(SEQ IDNO.4)；
将6位的E、59位的K、62位的E突变为A，该突变蛋白命名为3A(SEQ ID NO.5)。
软件预测突变后的蛋白，与DosH蛋白相比，有序性从高到低依次为3A>DosH>WIP>LWIP。
进一步利用圆二色谱技术测定DosH及突变蛋白二级结构的有序性，结果显示，3个蛋白的有序性分别为DosH：82.5％；WIP：62.2％；LWIP：51.4％，有序性与预测结果一致。
本发明表达了3A、WIP和LWIP重组蛋白，发现3个重组蛋白在逆境胁迫条件(液氮反复冻融和H2O2冲击)下都有不同程度对酶的保护作用，证实以上提到的几个位点是DosH蛋白的关键位点。
本发明进行的具体研究工作如下：
1、DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白表达载体的构建：
1)以本实验室保存的重组质粒pET28a-DosH为模板，通过PCR扩增出目的基因(DosH、3A、WIP和LWIP)；
2)将DosH、3A、WIP和LWIP基因连接于pET28a表达载体上，构建完整基因重组质粒pET28a-DosH、pET28a-3A、pET28a-WIP和pET28a-LWIP；
3)将导入DosH、3A、WIP和LWIP基因的重组质粒pET28a-DosH、pET28a-3A、pET28a-WIP和pET28a-LWIP转入受体大肠杆菌BL21中，获得工程菌株BL-DosH、BL-3A、BL-WIP和BL-LWIP(见实施例2)。
2、将DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化:
实验证实，在IPTG浓度为0.5mM、诱导温度为16℃的条件下，可溶性目的蛋白条带最清晰，蛋白表达量最大。用不同浓度咪唑洗脱液对树脂上的融合蛋白进行洗脱并收集洗脱液，经SDS-PAGE电泳分析，确定最合适的咪唑浓度洗脱液。实验结果显示，将DosH、3A、WIP和LWIP蛋白在200mM咪唑处获得较纯的蛋白(见实施例3)。
3、将DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在逆境胁迫条件下对苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用：
1)未加入待测样品的MDH和LDH酶溶液为对照组，分别进行胁迫处理(液氮反复冻融和H2O2冲击)，测定MDH和LDH酶的活性；
2)分别取10μL胁迫处理后的样品，分别加入到600μL的反应液中反应1min，测定A340的吸收，根据A340吸收值的变化计算酶活变化率；
此实验表明：将DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在逆境胁迫条件下能够保护MDH和LDH酶活，减少酶活损失(见实施例4)。
4、将DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在液氮反复冻融胁迫条件下可减少乳酸脱氢酶(LDH)发生聚集。
1)未加入待测样品的LDH酶溶液为对照组，分别经反复冻融处理1、2、3次，测定LDH的聚合度；
2)取200μL胁迫处理后的样品，测定A340的吸收，根据A340吸收值的变化计算LDH的聚合度；
此实验表明：DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在液氮反复冻融条件下能减少LDH发生聚集(见实施例4)。
本发明的效果
体外酶活实验结果表明，DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白在胁迫条件下均能够保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。
此外，通过测定蛋白聚合度实验表明，在反复冻融处理条件下，DosH、3A、WIP和LWIP蛋白可阻止LDH发生聚集。
其保护功能大小为3A>DosH>WIP>LWIP，表明：DosH氨基酸序列的6位的谷氨酸(E)、59位的赖氨酸(K)、62位的谷氨酸(E)、61位的W和75位的I，14-17位4个连续L与DosH蛋白对酶保护能力相关。
附图说明：
图1 N端区域在DosH蛋白中的位置(下划线标出)；
图2是构建重组载体示意图；
图3是4个蛋白的亲和层析；
图4是4个蛋白的圆二色谱结构有序性分析
图5是蛋白可保护液氮反复冻融条件下苹果酸脱氢酶(MDH)的活性；
图6是蛋白可保护不同浓度H2O2条件下苹果酸脱氢酶(MDH)的活性；
图7是蛋白可保护液氮反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)的活性；
图8是蛋白保护不同浓度H2O2条件下乳酸脱氢酶(LDH)的活性；
图9是蛋白可防止液氮反复冻融条件下LDH发生聚集；
序列表说明
SEQ ID NO.1是编码DosH蛋白氨基酸序列；
SEQ ID NO.2是N-DosH蛋白氨基酸序列；
SEQ ID NO.3是突变蛋白WIP氨基酸序列；
SEQ ID NO.4是突变蛋白LWIP氨基酸序列；
SEQ ID NO.5是突变蛋白3A氨基酸序列。
具体实施方式
实施例1DosH蛋白N端多肽分析
DosH蛋白由298个氨基酸组成，分子量为30.9kDa，富含亲水性氨基酸，亲水氨基酸含量为61％，是一类亲水蛋白。与其它典型的亲水蛋白质比较，DosH蛋白显著的特点是含有一个有序性升高的多肽(N-DosH：1-103位氨基酸)，为Deinococcus属特异序列，具有高度保守性，可能是DosH蛋白折叠成有序二级结构的关键区域，且呈有序的几个位点高度保守，第14-17位的4个连续的亮氨酸(L)、61位色氨酸(W)、75位异亮氨酸(I)、6位的谷氨酸(E)、59位的赖氨酸(K)、62位的谷氨酸(E)，预测这几个位点可能是关键位点，推测该位点在DosH蛋白保护酶的功能中起着重要作用。
实施例2重组蛋白表达载体的构建
为了研究重组蛋白的保护功能，本研究对DosH突变蛋白进行分析，对DosH突变蛋白进行重组并分别构建表达载体，根据上述几个位点在DosH蛋白中的位置，我们分别构建了3个突变蛋白。将61位色氨酸(W)和75位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，获得突变蛋白WIP；将第14-17位的4个连续的亮氨酸(L)、61位色氨酸(W)、75位异亮氨酸(I)都突变为脯氨酸(P)，获得突变蛋白LWIP；将6位的谷氨酸(E)、59位的赖氨酸(K)和62位的谷氨酸(E)突变为丙氨酸(A)，获得突变蛋白3A。
以本实验室保存的重组质粒pET28a-DosH为模板，加入PCR特异性引物，扩增完整的核苷酸序列：PCR反应条件：98℃5min，[98℃30sec，64℃30sec，72℃1min]33个循环，72℃10min，PCR产物进行胶回收。使用Nco I/Xho I双酶切pET28a载体以及含有相邻片段互补序列且带有突变位点的目的基因片段于50℃30min同源重组连接。取10μL连接产物加到已经化冻的50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。轻轻混匀，置于冰上放置30min；42℃水浴热击60s后立即冰浴2min；加入600μL新鲜LB培养基，混匀后，37℃，200rpm培养1h。取200μL菌液涂于含卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR验证，提取重组质粒进行酶切，测序验证正确，将该重组菌株分别命名为BL-DosH、BL-3A、BL-wip、BL-lwip，经DNA测序正确后于-80℃冰箱保存。
实施例3重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化(一)实验方法
1、IPTG诱导重组蛋白表达
1)将成功构建的重组菌株BL-DosH、BL-3A、BL-wip、BL-lwip划线活化。挑取单菌落于新鲜的(含卡那霉素50mg/mL)3mL的LB培养基中，37℃220rmp振荡培养过夜。
2)次日将种子液按1：100转接于含Km(50mg/mL)20mL的LB培养基中，于37℃220rmp振荡培养，OD600约0.6～0.8。
3)加入终浓度分别为0.5、1.0、1.5mM的IPTG于16℃过夜(同时未加IPTG的作为空白对照)，诱导大肠杆菌进行外源表达。
4)分别取诱导后的菌液2mL，5,000rmp离心5min，收集菌体。将收集的细胞用NTA-0缓冲液进行震荡悬浮(1/20培养体积)，混匀，冰浴30min。
5)加入终浓度为0.05％的Triton X-100，混匀，置于冰上15min。
6)利用超声波对细胞进行破碎。超声波破碎时间为15min，破碎细胞频率为每间隔2s，破碎3s。破碎后，置于冷冻离心机，12000rpm离心10min。
7)吸取上清液进行纯化。
2、带有His标签融合蛋白的纯化
8)提前制备层析柱，加入2-3mL NTA树脂于层析柱中，用10倍NTA体积的NTA-0Buffer进行洗脱。
9)将破碎后的细胞总蛋白加入到层析柱中，流速为每小时15mL，收集穿透部分。为增加纯化效率，反复上样3次。流出部分进行SDS-PAGE分析。
10)加入NTA-0缓冲液进行洗脱，用量为5倍树脂体积。收集液体用于检测蛋白与树脂的结合情况。
11)分别加入5倍体积的NTA-20，NTA-50，NTA-100，NTA-200，NTA-500缓冲液进行洗脱，流速为每小时15mL。分别收集洗脱缓冲液，用于SDS-PAGE分析确定目标蛋白在不同洗脱缓冲液中的分布情况。
12)取少量分别加入5×蛋白上样缓冲液混匀后于沸水浴中煮沸10min，12000rpm，10min。取10μL上清液进行SDS-PAGE电泳，确定最终洗脱浓度。
(二)实验结果
通过对重组蛋白的表达，最终确定在200mM咪唑处获得较纯的蛋白(箭头)。
实施例4突变蛋白的结构分析(一)实验方法
突变蛋白的圆二色谱性分析
1)开通氮气和仪器
打开氮气压力阀，设定氮气的输出压力约0.4Mpa。开启仪器的电源进行仪器自检。开启电脑，进入ANMSNitrogen软件，点亮氙灯。设定工作目录。设定带宽Bandwidth，选择光谱的测量范围(蛋白样品如180-260nm)及单个数据点的采样时间，默认Time-per-point为0.5s。
2)实验测量步骤
测量仪器背景：记录吸收零值。测量样品体系背景：采集Buffer或溶剂的光谱值。
测量样品：使用上步中同一个比色皿，装入要测量的样品，放入样品槽中，单击Acquire。
多次测量：通常建议对溶剂采集2次，对样品采集3次数据。
(二)实验结果
软件预测突变后的蛋白，与DosH蛋白相比，有序性从高到低依次为3A>DosH>WIP>LWIP。进一步利用圆二色谱技术测定DosH及突变蛋白二级结构的有序性，结果显示，4个蛋白的有序性分别为DosH：82.5％；WIP：62.2％；LWIP：51.4％；3A：85.7％，有序性与预测结果一致(图4)。
实施例5重组蛋白的功能研究
实验(一)三个重组蛋白(3A、WIP、LWIP)在逆境胁迫条件下对酶的保护作用1.实验目的
验证重组蛋白是否在逆境胁迫条件下对苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用。实验中，所述逆境具体是液氮反复冻融、并用不同浓度H2O2处理。
2.实验材料和方法
样品准备：MDH(来自于猪心脏)、NADH和LDH(来自于兔肌肉)均购自SIGMA公司；BSA为限制性内切酶中BSA(购自NEB公司)。
酶活测定所用溶液：
(1)苹果酸脱氢酶(MDH)酶活测定所用溶液配制：
MDH酶溶解液的配制(50mM磷酸钾缓冲液)：取7.17mL 1mol/L K2HPO4和2.83mL1mol/L KH2PO4混合后，加灭菌水定容至200mL，调pH至7.2。
MDH酶反应液的配制：称取0.00264g草酰乙酸和0.0142g NADH，加入150mM磷酸钾缓冲液定容至100mL，配制成终浓度为0.2mM的草酰乙酸和0.2mM的NADH的磷酸钾缓冲液。
(2)乳酸脱氢酶(LDH)酶活测定所用溶液配制：
LDH酶溶解液的配制：25mM Tris-HCl，加灭菌水定容至500mL，调pH至7.5。LDH酶反应液的配制：分别称取1.489g的氯化钾，0.044g的丙酮酸钠，0.02127g的NADH，加入25mMTris-HCl定容至200ml，配制成终浓度为100mM氯化钾，2mM丙酮酸钠和0.15mM的NADH，调pH至7.5。
(3)酶活性的测定方法
取10μl待测溶液加入到600μL底物中。紫外分光光度计测定反应体系在1min内340nm处吸光值的减少。每个反应独立重复3次。
3.实验结果
如图4-7和表1-4所示。
在未处理时，MDH和LDH没有受到影响，在经过反复冻融和H2O2处理后，MDH和LDH活性均有不同程度的降低，而加入重组蛋白后可保护MDH和LDH酶的活性。BSA是一种蛋白稳定剂，对MDH和LDH也有一定的保护作用，但其保护作用低于重组蛋白对MDH和LDH酶的保护作用，且保护强弱顺序为3A>DosH>WIP>LWIP>BSA。
从表1-4中MDH和LDH酶的活性，可看出重组蛋白在液氮反复冻融和H2O2条件下对MDH和LDH的保护作用的强弱变化。
表1重组蛋白可保护液氮反复冻融条件下MDH的活性
Figure BDA0002598750860000071
表2重组蛋白可保护不同浓度H2O2条件下MDH的活性
Figure BDA0002598750860000081
表3重组蛋白可保护液氮反复冻融条件下LDH的活性
Figure BDA0002598750860000082
表4重组蛋白可保护不同浓度H2O2条件下LDH的活性
Figure BDA0002598750860000083
4.实验结论：
重组蛋白在逆境胁迫条件下能够保护MDH和LDH的活性，且随蛋白有序性增加功能增强，有序性减弱功能降低。
实验(二)重组蛋白在逆境胁迫条件下减少LDH酶聚集的保护作用
1.实验目的
验证重组蛋白能否在逆境胁迫(液氮反复冻融)条件下减少LDH发生聚集。
2.实验方法
LDH聚合度是使用紫外分光光度计测定样品在340nm处的吸光值。170μL的LDH酶溶液，终浓度配成200μg/mL的测试溶液。根据文献报道，LDH与蛋白的摩尔比为1：5。将酶溶液放入液氮中速冻1min，室温复性，依次反复冻融1次、2次和3次，测定酶溶液在A340处的吸光值。
3.实验结果
如图8和表5所示，在经过反复冻融处理后，LDH迅速发生了聚集，随着冻融次数增加，LDH发生聚集的程度越高，而加入重组蛋白可显著减少LDH发生聚集。BSA虽然也减少LDH发生一定程度的聚集，但保护能力比重组蛋白弱。表明重组蛋白可减少反复冻融处理下LDH酶发生聚集(图9)。
表5重组蛋白在液氮反复冻融条件下减少LDH发生聚集
Figure BDA0002598750860000091
4.实验结论：
重组蛋白在液氮反复冻融条件下能够减少LDH发生聚集，且功能强弱顺序为3A>DosH>WIP>LWIP>BSA。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白
<160> 5
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 298
<212> PRT
<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）
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<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）
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245 250 255
Trp Ala Phe Asp Leu Arg Thr Asp Ala Glu Ala Gly Lys Gln Gly Gly
260 265 270
Gln Thr Gly Ser Thr Thr Asn Asn Ala Gly Thr Ala Gly Asn Thr Gly
275 280 285
MET Thr Gly Asn Thr Asn Thr Arg Lys Asn
290 295
<210> 4
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
MET Phe Glu Arg Asp Glu His His Phe Pro Val Lys Arg Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Gly Ala Leu Val Gly Ala Gly Ala Tyr Tyr Leu Ser Arg Glu Gln
20 25 30
Asn Arg Lys Ala Leu Asp Ala Lys Leu Ala Glu Leu Gly Leu Lys Asp
35 40 45
Ala Ala Gln Asp Val Gly Ser Ser Val Thr Lys Gly Pro Glu Lys Thr
50 55 60
Lys Asp Ala Ala Gln Asn Ala Gly Ser Val Pro Ala Asp Lys Ala Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Gly Glu Val Lys Ser Ala Val Ala Gly Ala Thr Ala Glu
85 90 95
Ile Lys Asp Ala Gly Lys Glu Val Ala Asp Thr Ala Lys Asp Ala Gly
100 105 110
Gln Asn Val Gly Gln Asn Val Lys Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ala Asp
115 120 125
Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Lys Ala Asp Val Ser Lys Ala
130 135 140
Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Gln
145 150 155 160
Ala Gly Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asn Val Lys Asp Lys Val Gln Asp
165 170 175
Val Lys Ala Asp Ala Ser Lys Ala Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala
180 185 190
Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Lys Gln Gly Ala Gln Gln Ala Ala Ser
195 200 205
Asp Ala Lys Asp Lys Val Gln Asp Val Lys Ala Asp Ala Ser Arg Ala
210 215 220
Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Lys
225 230 235 240
Gln Ser Ala Gln Asp Ala Lys Thr Asp Val Asp Ala Lys Ala Lys Ser
245 250 255
Trp Ala Phe Asp Leu Arg Thr Asp Ala Glu Ala Gly Lys Gln Gly Gly
260 265 270
Gln Thr Gly Ser Thr Thr Asn Asn Ala Gly Thr Ala Gly Asn Thr Gly
275 280 285
MET Thr Gly Asn Thr Asn Thr Arg Lys Asn
290 295
<210> 5
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
MET Phe Glu Arg Asp Ala His His Phe Pro Val Lys Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Val Gly Ala Gly Ala Tyr Tyr Leu Ser Arg Glu Gln
20 25 30
Asn Arg Lys Ala Leu Asp Ala Lys Leu Ala Glu Leu Gly Leu Lys Asp
35 40 45
Ala Ala Gln Asp Val Gly Ser Ser Val Thr Ala Gly Trp Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Asp Ala Ala Gln Asn Ala Gly Ser Val Ile Ala Asp Lys Ala Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Gly Glu Val Lys Ser Ala Val Ala Gly Ala Thr Ala Glu
85 90 95
Ile Lys Asp Ala Gly Lys Glu Val Ala Asp Thr Ala Lys Asp Ala Gly
100 105 110
Gln Asn Val Gly Gln Asn Val Lys Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ala Asp
115 120 125
Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Lys Ala Asp Val Ser Lys Ala
130 135 140
Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Gln
145 150 155 160
Ala Gly Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asn Val Lys Asp Lys Val Gln Asp
165 170 175
Val Lys Ala Asp Ala Ser Lys Ala Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala
180 185 190
Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Lys Gln Gly Ala Gln Gln Ala Ala Ser
195 200 205
Asp Ala Lys Asp Lys Val Gln Asp Val Lys Ala Asp Ala Ser Arg Ala
210 215 220
Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Lys
225 230 235 240
Gln Ser Ala Gln Asp Ala Lys Thr Asp Val Asp Ala Lys Ala Lys Ser
245 250 255
Trp Ala Phe Asp Leu Arg Thr Asp Ala Glu Ala Gly Lys Gln Gly Gly
260 265 270
Gln Thr Gly Ser Thr Thr Asn Asn Ala Gly Thr Ala Gly Asn Thr Gly
275 280 285
MET Thr Gly Asn Thr Asn Thr Arg Lys Asn
290 295

Claims (7)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的多肽在构建具有抗逆保护功能的重组蛋白中的应用；所述构建，包括将SEQ ID NO. 2的以下关键位点进行基因突变：
将6位的谷氨酸（E）、59位的赖氨酸（K）和62位的谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）。
2.权利要求1所述的应用，所述抗逆保护，是在逆境胁迫条件下保护酶的活性，并减少酶发生聚集和阻止酶结构发生改变。
3.权利要求2所述的应用，所述逆境胁迫条件是冷冻或氧化环境。
4.权利要求1所述的应用，是制备酶保护剂。
5.具有抗逆保护功能的重组蛋白，选自氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的多肽。
6.权利要求5所述重组蛋白在蛋白活性保护中的应用。
7.权利要求5所述重组蛋白在制备酶保护剂中的应用。
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