CN112899293A - 桑树中类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因及其原核表达 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及其原核表达，该基因为首次分离得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，对研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的功能以及裂解产物奠定基础。本发明所提供的桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本发明提供的桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的原核表达为首次通过原核表达的方式成功得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因及其原核表达。
背景技术
类胡萝卜素是广泛分布于自然界的一种色素，同时也是合成多种活性物质的前体，而类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs)在合成多种活性物质的过程中起到了重要的作用。其中，CCDs家族包括CCDs和9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(9-cis-epoxycarotenoid dioxy genase，NCEDs)两个亚家族。
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal,AM)和植物根系可以形成有益的共生联合体，菌根菌通过其庞大的菌丝网络提高植物对矿质养分的吸收，从而有利于植物的生态适应。研究表明丛枝菌根真菌能够诱导类胡萝卜素生物合成和类胡萝卜素的氧化裂解。有研究人员在小麦、玉米和大麦的AM菌根中鉴定出了类胡萝卜素裂解形成的环己稀酮衍生物，并且玉米丛枝菌根共生根系提取物环己稀酮衍生物的配糖基具有抗菌性，也是土传植物病原菌的抑制剂。类胡萝卜素裂解双加氧酶基因裂解类胡萝卜产生脱辅基类胡萝卜素参与了丛枝菌根真菌与根系的共生，从而参与植物抗逆境胁迫，所以了解类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的功能以及裂解产物对进一步探索类胡萝卜素裂解酶在植物抵御逆胁迫过程中的作用尤为重要。
桑树是重要的经济作物，具有良好逆境适应能力，是很好的研究材料，而桑树中的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的功能还没有被鉴定，但是生物体内基因数目庞大，而各种基因的含量很小，基因间的物理化学性质差异微小，因此造成基因分离困难，因此目前还没有关于桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的研究，因此桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的作用机理尚不明确；也还没有一种通过原核表达的方式成功得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白的方法。
因此，亟需一种能够获得桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因以及通过原核表达的方式成功得到桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的蛋白的方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现本发明的这些目的和其他优点，现提供一种桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因，选自下列六个核酸序列之一：SEQ ID NO.1所示碱基序列；或SEQ IDNO.2所示碱基序列；或SEQ ID NO.3所示碱基序列；或SEQ ID NO.4所示碱基序列；或SEQ IDNO.5所示碱基序列；或SEQ ID NO.6所示碱基序列所示。
桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因的原核表达方法，具体步骤包括：S1、获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6任意一个碱基序列，及其对应的全长编码序列；S2、将所得的全长编码序列通过载体转入大肠杆菌，选取阳性克隆作为构建好的原核表达载体；S3、将构建好的原核表达载体转入菌株并挑取阳性单克隆，进行扩大培养，获得原核表达的种子菌。
优选的是，所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的碱基序列通过以下步骤获得：S1、以国际生物基因数据库中已报道的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的氨基酸序列作为查询参数，在川桑蛋白质数据库进行氨基酸序列比对，得到10条候选氨基酸序列；S2、将得到的10条候选氨基酸序列在国际生物基因数据库保守结构域预测网站进行预测，得到7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列；S3、以7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列的mRNA为模板设计定量引物，并通过Real-time quantitative RT-PCR分析方法在川桑中鉴定得到6条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因序列，即为对应的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的碱基序列。
优选的是，所述全长特异引物序列如下所示：
Mn012507-F:5’-atggagctcggtaccATGGCGGAAGTGGCGTC-3’，
Mn012507-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcGATATTCAGTTTGAGTCCGAGTA-3’；
Mn012508-F:5’-atggagctcggtaccATGGCCGAAATAGTGGATGTGAAT-3’，
Mn012508-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTAGGACACCATTCCCAACATCAA-3’；
Mn012509-F:5’-atggagctcggtaccATGGCGGAGAAGCCGAGC-3’，
Mn012509-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcGAGTTTTGCTTGTTCTTGCAGTTG-3’；
Mn023189-F:5’-atggagctcggtaccATGGCTTCCTCTTTTTTGGCAC-3’，
Mn023189-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTCATGCCTGGTGAACCAAGTCC-3’；
Mn008739-F:5’-atggagctcggtaccATGCCACATCACGTCTCCAA-3’，
Mn008739-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcCACCGAGACTGGTATGAAAGCT-3’；
Mn008741-F:5’-atggagctcggtaccATGGCATCATCGTATATGGCAT-3’，
Mn008741-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTGGTGAGATTGGTATGAAAGCT-3’；其中大写部分为引物序列；小写部分为含有Kpn I和ECOR I酶切位点的同源臂。
优选的是，所述构建好的原核表达载体通过以下方式获得：S1、根据MnNCED1和MnNCED3基因cDNA全序列的编码区和Pcold-TF载体的多克隆位点，设计6对特异引物用于6个类胡萝卜素裂解双加氧酶基因完整开放阅读框的扩增，分别在5’和3’引入含有Kpn I和ECOR I酶切位点的同源臂，得到载体片段；S2、将任一类胡萝卜素裂解双加氧酶碱基序列和载体片段在Peasy basic seamless同源重组酶的作用下50℃连接30min，连接产物转化感受态E.coli DH5a，涂在含有Amp+的LB平板上，挑取阳性单克隆，即得到构建好的原核表达载体。
一种桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因核酸序列或桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因的原核表达方法获得种子菌作为提高植物抵御逆胁迫的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明首次分离得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，对研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的功能以及裂解产物奠定基础。
本发明首次通过原核表达的方式成功得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白的方法，为提高桑树的抗逆性提供了一个理论基础。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例7中得到的6条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因克隆的电泳检测凝胶图；
图2为本发明实施例8中编码氨基酸的蛋白序列比对分析图；
图3为本发明实施例9中桑树与其他物种类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的进化分析图；
图4～图8为本发明实施例12中胁迫处理后MnCCDs基因在川桑叶中的表达模式分析图；
图9为本发明实施例13中桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的蛋白结构示意图；
图10为本发明实施例16中类胡萝卜素裂解双加氧酶重组蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)细胞中表达的SDS-PAGE分析图；
图11为本发明实施例16中类胡萝卜素裂解双加氧酶重组蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)细胞中纯化的SDS-PAGE分析图；
图12为本发明实施例11中桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶活性分析图；
注：图1中M.5000DNA Marker：1.Mn023189；2.Mn008741；3.Mn012508；4.Mn012509；5.Mn008739；6.Mn012507；
图2使用ClustalX2.1软件创建比对，Mn024617：MnNCED1；Mn021647：MnNCED3；
图3三角形表示桑树的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因；Genebank登录号：FaNCED1(AFU61914.1)，FaNCED2(AFU61915.1)，FaNCED3(AFU61916.1)，AtNCED6(NP_189064.1)，AtNCED3(NP_188062.1)，AtNCED2(NP_193569.1)，AtNCED9(NP_177960.1)，AtNCED5(NP_174302.1)，Mn024617(EXB52067.1)，Mn012647(EXC29339.1)，VP14(ONM07009.1)，VvNCED1(NP_001268199.1)，VvNCED3(AFP28804.1)，VvNCED2(NP_001268200.1)，MdNCED6(XP_017183533.2)，MdNCED2(XP_008371610.2)，MdNCED1(XP_008382970.1),ZmNCED2(ONM02149.1)，ZmNCED1(XP_008644645.1)，ZmNCED4(XP_008670979.1)，ZmNCED3(ONM32808.1)，ZmNCED9(AQK64170.1)，ZmNCED5(ONM51390.1)，StNCED1(NP_001275103.1)，StNCED12(NP_001274963.1)，TaCCD4(QEX50885.1)，TaCCD1(QEX50880.1),TaCCD7(ASW22783.1)，SlCCD1A(NP_001234542.1)，SlCCD1B1(NP_001233838.1)，SlCCD1B2(NP_001310512.1)，CsCCD1(AYK03324.1)，CsCCD4(AYK03325.1)，SlCCD1A(NP_001234542.1)，SlCCD1B1(NP_001233838.1)，SlCCD1B2(NP_001310512.1)，SbCCD1(AGN03859.1)，SbCCD4(AGN03860.1)，CcCCD4B(ABC26012.1)，CcCCD4A(ABC26011.1)，MdCCD4(ABY47995.1)，MdCCD7(AUZ82805.1)，OsCCD7(XP_015637185.1)，OsCCD1(ABA99624.2)，OsCCD8A(sp|Q93VD5.1)；
图4～图6为在相同条件下生长的桑幼苗分别经ABA、ET和MeJA处理0、1、2、6、12h；
图7为在相同条件下生长的桑幼苗经干旱处理0、8、24、32、48h；
图8为在相同条件下生长的桑幼苗经病原菌处理0、8、24、32、48h；将处理过的幼苗的叶子直接收获到液氮中并储存在-80℃下用于总RNA提取；未处理的幼苗的相应组织用作对照；通过qPCR获得基因的相对表达，S实验结果显示为平均值±SD(n＝3)；其中：a为MnCCD1B2、b为MnCCD4、c为MnCCD1A、d为MnCCD1B1、e为Mn008739、f为Mn008741；
图9左边白色的矩形为5'UTR，右边白色的多边形为3'UTR，中间灰色、黑色矩形均为外显子，其中带斜杠的灰色矩形代表叶绿体转运肽，不带斜杠的灰色矩形代表RPE65结构域，黑色折线为内含子，浅灰色三角形为转录起始位点；
图10中M：180kD蛋白Marker，甬道1：对照，甬道2-7：Mn008741，MnCCD1B1，MnCCD1A，MnCCD4，MnCCD1B2，Mn008739；
图11中M：250kD蛋白Marker，甬道1-6：Mn008741，MnCCD1B2，MnCCD1B1，MnCCD1A，MnCCD4，Mn008739；
图12通过BCA方法测量桑树多酚氧化酶的浓度。使用对香豆酸、酪胺和酪氨酸作为底物，用酶标仪测量5个多酚氧化酶的活性，实验结果显示为平均值±SD(n＝3)；其中：a为violaxanthin、b为Lycopene、c为β-carotene。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例3
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例4
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例5
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例6
一种桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例7
类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的克隆：
S1、以国际生物基因数据库NCBI中下载的已经报道的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的氨基酸序列作为查询参数，在川桑蛋白质数据库进行氨基酸序列比对，得到10条候选氨基酸序列。
S2、将得到的10条候选氨基酸序列在国际生物基因数据库保守结构域预测网站进行预测，得到7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列，3条属于NCED亚家族。
S3、以7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列的mRNA为模板设计定量引物，并通过Real-time quantitative RT-PCR分析方法在川桑中鉴定(如图1所示)，得到6条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因序列，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
实施例8
获取桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的编码区：
S1、分别将6条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的目的片段插入peasy-blunt载体，构建出重组载体。
S2、将重组载体转入大肠杆菌，然后挑取阳性克隆。
S3、经上海生工公司测序，得到目的片段分别为1617bp、1620bp、1635bp、1713bp、1746bp、1791bp，并分别编码538、539、544、570、581、596个氨基酸的蛋白质(如图2所示)。
S4、将S3得到的目的片段与推测的片段长度和序列进行对比，均一致，即说明已经成功克隆出桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的编码区。
实施例9
类胡萝卜素裂解双加氧酶序列分析：
利用ClustalX2.1本地软件将桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白序列与已报导的其他物种的类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白序列进行比对分析，并通过软件MEGA5得到桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶与其他物种类胡萝卜素裂解双加氧酶的进化图谱(如图3所示)。由进化树可知植物类胡萝卜素裂解双加氧酶分为NCED和类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD两个亚家族，Mn024617与苹果的NCED1聚为一支，Mn021647与葡萄的NCED2聚为一支，表明这两个蛋白属于NCED亚家族，在NCBI上的注释分别为MnNCED1和MnNCED3；Mn008739、Mn012509、Mn012507、Mn008741、Mn012508以及Mn023189属于类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD亚家族，植物中的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD命名根据该基因与拟南类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD亲缘关系和同源性来命名，从进化树中可以看出Mn012507、Mn012508和Mn012509与拟南芥的CCD1的亲缘关系最近,故将这三个基因分别命名为MnCCD1A、MnCCDB1以及MnCCDB2，Mn023189与拟南芥的CCD4的亲缘关系最近，故将这个基因命名为MnCCD4；因为进化树中Mn008739和Mn008741单独聚为一支，故很难将其命名，后续需要根据其作用底物及裂解位点来进一步确定。
实施例10
启动子顺式作用元件分析：
使用PLANTCARE在线软件分析类胡萝卜素裂解双加氧酶启动子元件(如表1所示)，类胡萝卜素裂解双加氧酶启动子中含有多种响应激素和参与逆境胁迫的应答元件，如参与干旱胁迫的转录因子结合位点(MBS)、ABA响应元件、茉莉酸甲酯响应元件及赤霉素响应元件。
表1：启动子顺式作用元件分析
其中，ABRE：cis-acting element involved in the abscisic acidresponsiveness，TGACG/CGTCA-motif：cis-acting regulatory element involved inthe MeJA-responsiveness，TC-Rich repeats：cis-acting element involved indefense and stress responsiveness，LTR：cis-acting element involved in low-temperature responsiveness，GARE：gibberellin-responsive element，WUN-motif：wound-responsive element，MBS：MYB binding site involved in drought-inducibility MBSI：MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genesregulation。
实施例11
荧光定量分析：
通过qPCR分析桑叶中6个胡萝卜素裂解双加氧酶在逆境胁迫下基因的转录水平(如图4～图8所示)。当植物处于逆境胁迫(病原菌或干旱处理)时，6个桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的表达量都发生了变化。MnCCD4的表达量在干旱胁迫8h时，表达量就出现峰值，随后表达量降低。MnCCD1A、MnCCD1B1和MnCCD1B2的表达量在干旱胁迫24h时达到峰值，随后表达量下降。而Mn008739和Mn008741的表达量在干旱胁迫32h时才达到峰值，随后表达量下降。且在干旱胁迫后，MnCCD1B2基因的表达上调量是桑树6个胡萝卜素裂解双加氧酶基因中最显著的。灰霉菌菌丝接种到川桑叶上8h时，MnCCD4基因的表达水平达到最高值，而其余5个胡萝卜素裂解双加氧酶基因在灰霉菌处理24h时达到最高表达量。并且灰霉菌处理后，MnNCED3基因的表达量上调趋势也是最显著的。经过茉莉酸甲酯、乙烯以及脱落酸处理后，桑叶中6个胡萝卜素裂解双加氧酶基因的表达水平均有变化。茉莉酸甲酯处理后，Mn008741基因的表达量上调最显著，Mn008741基因的表达水平在茉莉酸甲酯处理12h内一直上调，在茉莉酸甲酯处理12h，其表达量上调了8.3倍。
实施例12
桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的生物学分析：
S1、通过国际生物基因数据库NCBI保守结构域分析对桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD的氨基酸序列进行了保守结构域在线预测，结果表明桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD均属于RPE65超家族。
S2、分别对桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD的氨基酸序列进行信号肽、叶绿体转运肽以及亚细胞定位在线预测，结果表明CCD亚家族的蛋白均不含信号肽，但Mn023189和Mn008741含有叶绿体转运肽，其余则不含叶绿体转运肽，亚细胞定位在线预测结果表明Mn023189(MnCCD4)定位在叶绿体中而其他的定位在细胞质中，根据生物信息分析绘制得到桑树CCD基因的蛋白结构示意图(如图9所示)。
实施例13
原核表达载体的构建：
S1、根据MnNCED1和MnNCED3基因cDNA全序列的编码区和Pcold-TF载体的多克隆位点，设计6对特异引物用于6个类胡萝卜素裂解双加氧酶基因完整开放阅读框的扩增，分别在5’和3’引入含有Kpn I和ECOR I酶切位点的同源臂，得到载体片段。
S2、将类胡萝卜素裂解双加氧酶基因片段和载体片段在Peasy basic seamless同源重组酶的作用下50℃连接30min，连接产物转化感受态E.coli DH5a，涂在含有Amp+的LB平板上，挑取阳性单克隆，即得到构建好的原核表达载体。
实施例14
获得原核表达的种子菌：
将构建好的原核表达载体转入BL21、DE3菌株并挑取阳性单克隆，进行扩大培养，获得原核表达的种子菌。
实施例15
原核表达的种子菌的功能研究：
在20℃条件下，原核表达的种子菌经过0.25mM的IPTG诱导表达12个小时，超声破碎细菌之后，经过SDS-PAGE电泳检测，发现表达的桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白质与对照组(空载)相比，在上清中发现明显的新的蛋白条带(如图10所示)。
利用镍亲和层析柱纯化桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白，SDS-PAGE电泳检测洗脱组分，经考马斯亮蓝染色之后，在300mM咪唑的组分中，含有一条纯化的目的蛋白条带，蛋白条带的位置与预测的重组桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白的位置是一致的(如图11所示)。因此认为重组桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶蛋白已经被纯化，且纯度较高，可以用于后续的酶活性及产物鉴定实验。
实施例16
重组蛋白酶底物专一性分析：
使用β-胡萝卜素，紫黄质和番茄红素作为底物，用酶标仪法测量类胡萝卜素裂解双加氧酶的活性。CCD活性测定体系包含5μM FeSO4、0.5M VC、10mM底物和重组酶，用100mMbis-tris(pH 6.7)补足总体积到200μl，在室温下孵育15min，将每分钟380nm波长下吸光度增加0.001定义为一个酶活性单位，每种底物的酶比活力代表其底物特异性。
结果表明：桑树六种CCD重组酶对β-胡萝卜素和番茄红素的催化活性也各不相同(如图12所示)。MnCCD1A对β-胡萝卜素的催化活性最高，MnCCD1B1对β-胡萝卜素的催化活性最低。MnCCD4不能催化β-胡萝卜素但能催化番茄红素。Mn008739对番茄红素的催化活性最高，MnCCD1B1对番茄红素的催化活性最低，而MnCCD1A和MnCCD4对番茄红素的催化活性无显著性差异(p>0.05)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。
<110> 广西壮族自治区蚕业技术推广站
<120> 桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及其原核表达
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 1
atgccacatc acgtctccaa aaccatcaag aatgctacga ccaaaacgtt ggatgccatt 60
gttgatttgg cgtttgaatt tgttgatata ccactgcatc catcccagac aaactttgca 120
ccggttgagg agctgggagg accggctggt atcaccacca ttcaagggat cattcctgac 180
gattttccag agggagtcta cataagaaac ggagcaaatc ctctttttgg aggattaaaa 240
tcaacaaaat cagcgtttgg aaaatcaaag caaatttgga tagagggaga agggatgcta 300
catgctttgt attttaccaa aaaagacggt aattgtaaat ggactgtcaa ttacaataac 360
agctacgttg aaactgaaac tttcaagcaa gaaaagcaaa agaacaagcc gtcttttatt 420
cccatcattg aaggcgatac actggccgtc atatcagccg ctctgttcaa ttttctccga 480
tttggcaaaa tagacaaaca cgttagcaac accaatgtgt ttgagcattc agggaagtta 540
tattccattg cagaatctca catgcctcaa gagattgacg tttttacatt agaaacttta 600
gggcattgga atctttccag agcttggaat agacccttta caagccatcc aaaggtagtt 660
ccaggcaccg gggagctagt tataattgga atggatgcaa ttaaacgtcc ttatattgag 720
ttaggagtaa tttctgctga tggaaagaaa ttagttcata gagctgatct caaactcgac 780
cggtgtccat tttgtcatga ttttggggtt acacagaggt acaatgtgtt gatagatttt 840
cctgttacta tagacataat gagacttttc cagggaggcc cattgattaa gtacgacaat 900
aaaggatatg caagaattgg ggttatgcct cgttatggag atggagattc aatcaaatgg 960
tttaaagttg aaccaaattg cacatttcac atatttaatt gttttgaaga tggagacgac 1020
aaggttgtgg tgtggggttg tagagctctg gaatcagtcc tgccttttga taatacagtc 1080
aaagacgggt tggtacatag tcgaccttat gaatggaaat taaacatgca aactggagaa 1140
gtcgtggaga gaaatctcac agccgatgca gagttttcca tggaagttcc tctaataaat 1200
gcaaatttta tcggtttgaa gaacaaattt gggtattccc aagtttttga ctttgtgccc 1260
agctctaacg cagacaatat gtttaaattt ggaggtctag caaagttgca ctttgagaag 1320
ctagacaaaa aagtttcttc gacgacaaga gaaattgatg aggaggtaat aaaagtggaa 1380
taccatatgt ttgaggagaa cacgttttgt agtggagccg cttttgtccc caaaaagggt 1440
ggtcttgaag aagatgatgg ttggataatc acttttgttc acgatgaaga caccaatata 1500
tctcaggttt acgtgattga cacaaaaaag ttttcccacg aaccaatttt caaaattact 1560
ttgccatgca gagtgccgta tggatttcat ggagctttca taccagtctc ggtgtag 1617
<210> 2
<211> 1620
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 2
atggcggaga agccgagcaa aatgattgtg gccgtgaatc cgaagccaaa cagaggtctg 60
acttcgaagc tcattgactg cttcgagact gtcatcgtca agctcttcta ccgctcttct 120
cagtctcacc attatctctc cggtaccttc gccccagttc gccacgaaac ccctcccacc 180
gccgaccttc ccgtctccgg ttctcttcct gaatgcttaa atggagagtt tgttcgggtg 240
ggtcccaacc ccaagttaga cccagttgct ggatatcatt ggtttgatgg tgatggtatg 300
gttcatggtg tgcgcatcaa agatggaaaa gcaacatatg tctcccgtta tgtgaaaaca 360
tcgcgtcttc aacaagaaga gtattttgga ggtgctaaat ttttgaagat tggagacctt 420
aaagggcttt ttggattact catgtttaac atgcaaacgc tgagaagaat gctcaaagta 480
ttagatcttt catatggatc tggaacagct aatacagctc ttgtatatca cagcggaaaa 540
cttctagcac ttcatgaagg ggacaaacct tatgtcctta aagtcttgga agatggagat 600
ctgcaaacac ttggcatgct tgattatgac aagagattgc aacatccatt cacggcccat 660
ccaaaggttg acccatttac tggagagatg ttctcgtttg gttatgcaac aacccctcca 720
tatgtcactt acagaatcat ttcaaaggat ggcttcatgc atgatccagt gcctctaaca 780
atatcggacc ccgtaatgat gcacgacttc gccattactg agaattatgc tattttcatg 840
gatcttcctt tgattatgaa gccaaaggaa atggtgacag aaaacaggct gatatactca 900
tttgacgcga ataaaaaagc tcgcttcggt gtgcttcctc ggtacgcaaa ggatgagctt 960
ttaatcaaat ggtttgagct tccaaattgc ttcatatttc ataatgcgac tgcatgggag 1020
gaggaagatg aagttgttct aatcacttgc cgcgtcgata atctagattt agacgcgggc 1080
ggtggaactg tcaaagaaaa tctcgagcat tcccgaactg aactgtatga gatgagattc 1140
aacatgaaga ctggtctagc atcacagaga aaactctccg catcagctgt agattttccc 1200
agggtgaatg agagctacac tggcaggaaa cagcgttatg tgtatggaac caaactggga 1260
agcatcggaa aaatcacagg cattgtcaaa tttgatctac attccgaacc agatagtgac 1320
aaaacatgtc ttgaggttgg tgggactgtt caaggcctct atgacctggg acccaaccga 1380
tgcggttccg aggctgtgtt tgttcccaag gtgcctgggg tcacttctga agaagatgat 1440
ggctacttga tattctttgt gcatgatgag aaatccggaa aatcagcagt gcatgttatt 1500
gatgcaaaaa caatgtcacc agatcccgtt gcagttgttg atttgcccag cagagttcca 1560
cctggattcc atgccttatt tgtcacagag gaacaactgc aagaacaagc aaaactctga 1620
<210> 3
<211> 1635
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 3
atggcggaag tggcgtcgga gaagccgagc tccggcgaag aaattgtgac ggtgaatcct 60
aagccgaaca aaggccttac ttccaagctc atcgacttgt tcgagaagct cgtcgtcaag 120
ctcggctacg actcttccca gattcatcac tatctctccg gtaacttcgc tccagttccc 180
gacgaaactc cccccaccgt cgacctcccc gtctccggtt atcttccgga atgcttaaat 240
ggagagtttg ttcgggtggg tcctaatcca aagttctctc cggtggctgg ctatcactgg 300
tttgatggag acggtatgat acatggtctg cgcatcaaag atggaaaagc aacatatgtc 360
tcccgttatg taagaacctc gcgtcttaaa caggaagaat actttggagg tgctaaattc 420
atgaaggttg gagaccttaa agggttcttt ggattattca tggttaacat gcaaattctg 480
agagcaaagt tcaaagtaat agatctttca catggacatg gaacagatgc tctcaaagtc 540
ttggaagatg gagatctgca gacacttggc ttgcttgatt atgacaagag attgcaacat 600
tcattcacag ctcatccgaa ggttgatcca tttactggcg agatgtttac atttggttac 660
tcacatactc ctccatacat cacttacaga gtcatttcga aggatggttt catgcatgat 720
ccagtaccta taacagtatc ggaccccatc atgatgcatg actttgccat tacagagaat 780
tatgccattt tcatggatct tcctttgttc ttcaagccaa aggaaatggt gaaggaaaag 840
aagttgatat tccaatttga tcccaccaga aaagcacgct ttggagtgct tccacggtat 900
gcaaagaatg agcttctaat caaatggttc gagcttccaa attgcttcat attccataat 960
gccaacgcat gggaggagga agacgaggtt gttctaatca catgccgcct tgagaatccg 1020
gatttggaca tggtcagtgg gaaggtcaaa gaaaagcttc agaatttctc aaatgagcta 1080
tatgaaatga ggttcaactt gaaaactggc ctagcatcac agaggaaact ctcagaatca 1140
gcagttgatt ttcctagagt gaacgagagc tacactggca ggaaacagcg ctatgtgtat 1200
ggaaccacac tggacagcat tgcgaaagtc acgggaattg tcaaatttga tttgcatggt 1260
aaaccagaaa gtggtaaaac acgcattgag gttggtggaa atgttcaagg tctgtatgaa 1320
ctgggacccg gccgatttgg ctccgaggct atatttgtcc ccaaggtgcc tggaatcact 1380
tctgaagaag atgatggcta cctaatattc tttgttcatg atgagaatac tggaaaatca 1440
gcagtgcatg tgattgatgc aaaaacaatg tcaccagatc cggttgcagt cgttgagttg 1500
ccccatagag ttccatatgg gttccatgcc ttctttgtga ctgaggtcag tattacttta 1560
attgatgttc ttggactttc taattgcttt gtttctttaa gtaaaaaggt actcggactc 1620
aaactgaata tctag 1635
<210> 4
<211> 1713
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 4
atggcatcat cgtatatggc atttcaagtg agttgctcta ttcaagggag gccctcttta 60
cctgccaact atgagaactt gaagacaaca ttctcttcac ttgtcaagcc attgttgaga 120
tcagcagtgc aacaagtaga tcatgtctcg aaaaccatca agaatggtac ggccaaaatg 180
ttggatgact ttgttgattc ggcgtttgaa tttgttgatc aaccattgct accgtctcag 240
agcaactttg cgccggttga tgagcttgga ggacctgttg ttatcaacaa cgttaaagga 300
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ggaggattaa aatcaacgaa atcggtattc ggaaagtcaa atcacacttg ggtagaagga 420
gaaggaatgc ttcatgctct gtactttagt agagacgatg atcgcaatcg gactctccac 480
tataacaaca gatatgttga aacagaaact ttcaagcaag ataaacaaag aactaagcca 540
tcttttattc ccatcatgga aggcgatgta acagctgtta tatctgctat tgtgctcaac 600
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gggaaggtat attccgtggc agaagattac atgcctcaag agattgatat ttccacatta 720
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aagatagctc ctggcactgg agagttggtt ataattggaa tggacgcaat taaaccttat 840
tatgaattgg gcgtaatttc cgctgatgga aaggaattag ttcatagagc ggatcttaaa 900
ctcgatcggt gtacatttag ccatgacttt ggtattacag agagacttat gaaatacaac 960
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tggtttgaag ttgaaccgaa ttgcacattt cacatcatta attgttttga agatggcgat 1080
gacgaggttg tggtgtgggg ttgtagatct cttgaatcag tcataccagg accaggttta 1140
ggtccaagta aagaaaaatt tgatacctcg atcaaagatg gattactata cgatcgccct 1200
tacgaatggc gattaaacat gcaaactgga aaagttaggg agagaaatct cacggctgac 1260
acagaatttt ccatggattt tcccatgatc aatccaagtt ttactggtct caagaacaaa 1320
tttggttaca cacaagttgt tcatgattct agggagagct ctccgaccga agataatatg 1380
cccagattta gtggtctagc aaagctacat tttgaacagc tagatgaaag gttttcaacg 1440
acaacaagag agattgaaga ggtgctaaaa gtggaatacc atatgtttga ggagaacact 1500
ttttgtactg gagctgcttt tgtcgctaag aaaggaggtc ttgaagaaga tgatggttgg 1560
attgtcactt ttgttcacaa tgaagcgacc aacatatctc aagtttttct gatcgatgca 1620
caaaaattct ccggtgagcc cgttgccaga attacattgc catgtagagt tccatatgga 1680
ttccatggag ctttcatacc aatctcacca tag 1713
<210> 5
<211> 1746
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 5
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gactggttcg agaatgttgt cgtaaagctc atgtacgact cttctcactc tcaccattat 120
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atcaaagatg gaaaagcaac atacgtctcc cgttatgtga aaacatcgcg tcttaaacaa 360
gaagaatatt ttggagctgc taaatatttg aagtatggag accttaaagg gctttctgga 420
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ggaggtggaa cagctaatac agctctcgtg tatcacagtg gaaaacttct agcgcttcat 540
gaagtagaca aaccttatgt ccttaaagtc ttggaagatg gagatctgga gacacttggc 600
atgctggatt atgacaagag attgcagcat tcattcacag ctcatccgaa aattgaccca 660
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agcgggattg tcaagtttga tttacatgct gagccagaaa gtgggaaaac atgcattgag 1320
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ctataa 1746
<210> 6
<211> 1791
<212> DNA
<213> 桑树
<400> 6
atggacgcct tgtcttcctc cttcctctcc acattttcca ccaaaaaaaa tctccggcga 60
caaaccttgc ctcctaaacc aaccatcata acaaatgtta gaattgaaga aaaaccctct 120
tctactacta ccaccactac ttctaccaca ccaaaaacca caccaccacg cactacaaag 180
ccccaatcat cgtcgtcgtc gtcgctgcgt aatgttactg ctataagaag gcgggtaact 240
tctccgacac tgcccggaat gatcttcaac gcttttgatg acatcatcaa caactttata 300
gaccctcctc ttcgctcctc agtcgacccg aagctcgtcc tgtctgacaa tttcgctccg 360
gtcaccgacg agctcccccc caccgaatgc accatcactc acggctccct ccctccttgc 420
ctcgacggcg cctacatccg caacggccca aacccgcagt tcctcccccg tgggccctac 480
catctcttcg atggcgacgg catgatccac tccttaagaa tccgccaaaa aaaaccgccc 540
attctctgca gccgctacgt caagacttac aaattctccg tggaaaaaga agccggacat 600
ccggttctcc ccaacgtctt ctcggggttc aacggcgtcg ttccctcggc ggcccgtggc 660
gctctctccg ctgctagaat attcatcggc cagtacaacc ccgccaacgg aatcggcctc 720
gccaacacca gcctcgcctt cttcgccgac cgccttttcg cgctcggcga gtcagatctt 780
ccctacgagg ttagagttac gcccgaagga gatatacaaa ccattggtcg ccatgatttc 840
gacggcaagc tttccatgag catgactgct caccccaaga tagatcctaa taccggcgag 900
gccttcgcgt ttcgatacgg cccaatcccg ccttttctca cgtacttcta cttcgataaa 960
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agcaatctcg acttcggggt cataaatccg gcctacgtcg ggaggaggaa cagatatgtc 1440
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gcagcagacg atcagcgaag gggagaatgt acggtggcaa ggaggatgtt tggcgacggg 1560
tgctacggcg gggagccctt ttttgtggcg aaagacgtag cagaggaaga ggacgacggt 1620
tacgtggtgt catacgtgca caatgagaag tcgggagagt caactttctg ggtgatggac 1680
gccaagtcac ccgagcttga cattgtggct gaagtcaagt tgccccgtcg agtgccttat 1740
ggtttccacg gcctcttcgt caaggaaacg aaccttagaa agcgagcata g 1791
Claims (6)
1.桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因，其特征在于，选自下列六个核酸序列之一：
SEQ ID NO.1所示碱基序列；
或SEQ ID NO.2所示碱基序列；
或SEQ ID NO.3所示碱基序列；
或SEQ ID NO.4所示碱基序列；
或SEQ ID NO.5所示碱基序列；
或SEQ ID NO.6所示碱基序列所示。
2.桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因的原核表达方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1、获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6任意一个碱基序列，及其对应的全长编码序列；
S2、将所得的全长编码序列通过载体转入大肠杆菌，选取阳性克隆作为构建好的原核表达载体；
S3、将构建好的原核表达载体转入菌株并挑取阳性单克隆，进行扩大培养，获得原核表达的种子菌。
3.如权利要求2所述的桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因的原核表达方法，其特征在于，所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的碱基序列通过以下步骤获得：
S1、以国际生物基因数据库中已报道的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的氨基酸序列作为查询参数，在川桑蛋白质数据库进行氨基酸序列比对，得到10条候选氨基酸序列；
S2、将得到的10条候选氨基酸序列在国际生物基因数据库保守结构域预测网站进行预测，得到7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列；
S3、以7条属于类胡萝卜素裂解双加氧酶亚家族的候选氨基酸序列的mRNA为模板设计定量引物，并通过Real-time quantitative RT-PCR分析方法在川桑中鉴定得到6条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因序列，即为对应的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的碱基序列。
4.如权利要求2所述的桑树中与类胡萝卜素裂解双加氧酶相关的基因的原核表达方法，其特征在于，所述全长特异引物的序列如下所示：
Mn012507-F:5’-atggagctcggtaccATGGCGGAAGTGGCGTC-3’，
Mn012507-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcGATATTCAGTTTGAGTCCGAGTA-3’；
Mn012508-F:5’-atggagctcggtaccATGGCCGAAATAGTGGATGTGAAT-3’，
Mn012508-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTAGGACACCATTCCCAACATCAA-3’；
Mn012509-F:5’-atggagctcggtaccATGGCGGAGAAGCCGAGC-3’，
Mn012509-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcGAGTTTTGCTTGTTCTTGCAGTTG-3’；
Mn023189-F:5’-atggagctcggtaccATGGCTTCCTCTTTTTTGGCAC-3’，
Mn023189-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTCATGCCTGGTGAACCAAGTCC-3’；
Mn008739-F:5’-atggagctcggtaccATGCCACATCACGTCTCCAA-3’，
Mn008739-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcCACCGAGACTGGTATGAAAGCT-3’；
Mn008741-F:5’-atggagctcggtaccATGGCATCATCGTATATGGCAT-3’，
Mn008741-R:5’-caggtcgacaagcttgaattcTGGTGAGATTGGTATGAAAGCT-3’。
5.如权利要求4所述的桑树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的原核表达方法，其特征在于，所述构建好的原核表达载体通过以下方式获得：
S1、根据MnNCED1和MnNCED3基因cDNA全序列的编码区和Pcold-TF载体的多克隆位点，设计6对特异引物用于6个类胡萝卜素裂解双加氧酶基因完整开放阅读框的扩增，分别在5’和3’引入含有Kpn I和ECOR I酶切位点的同源臂，得到载体片段；
S2、将任一类胡萝卜素裂解双加氧酶碱基序列和载体片段在Peasy basic seamless同源重组酶的作用下50℃连接30min，连接产物转化感受态E.coli DH5a，涂在含有Amp+的LB平板上，挑取阳性单克隆，即得到构建好的原核表达载体。
6.一种权利要求1所述核酸序列或权利要求2所述方法获得种子菌作为提高植物抵御逆胁迫的应用。
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| CN (1) | CN112899293A (zh) |
Cited By (1)
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2021
- 2021-03-11 CN CN202110264528.XA patent/CN112899293A/zh active Pending
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