CN114107214A - 一种通用型异体car-t细胞制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通用型异体CAR‑T细胞制备方法及应用，包括以下步骤：S1、在T细胞中引入siRNA分子和Cas9分子；S2、在所述T细胞中引入CAR分子；其中，所述siRNA分子包含与来自TCR的a链和/或β链恒定编码区基因的靶区域互补的靶向结构域；其中，通过病毒转染技术将所述siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞中。本发明制备的通用型CAR‑T细胞避免了输注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰。

Description

一种通用型异体CAR-T细胞制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物细胞学技术领域，特别是涉及一种通用型异体CAR-T细胞制备方法。
背景技术
近几年，肿瘤免疫治疗进入了快速发展阶段，CAR-T疗法作为其中一种重要的方法在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。目前，国内越来越的企业、医院及学术机构加入到这一研究领域中，共同推进CAR-T疗法的发展，探索更为广泛的潜在应用价值。
目前，在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗领域，主要是采用自体的CAR-T细胞进行治疗，基本过程是采集患者自己的外周血，分离T细胞，并完成CAR-T细胞的制备和回输。因受限于免疫系统自身的某些限制性因素，如CAR-T异体回输时由于免疫原性等原因导致的免疫排斥、移植物抗宿主反应(GVHD)等，这将限制CAR-T细胞治疗技术广泛性和便捷性应用，同时也在一定程度上提高了该技术的成本，另外，对于婴儿患者、或者70岁以上的老年患者，或者一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者，其自体的T细胞的质量和数量达不到要求，是不适合制备CAR-T进行肿瘤治疗的。所以，通用型CAR-T技术将是今后的一个方向。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种通用型异体CAR-T细胞制备方法及应用，制备的通用型CAR-T细胞避免了输注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种通用型异体CAR-T细胞制备方法，包括以下步骤：
S1、在T细胞中引入siRNA分子和Cas9分子；
S2、在所述T细胞中引入CAR分子；
其中，所述siRNA分子包含与来自TCR的a链和/或β链恒定编码区基因的靶区域互补的靶向结构域；
其中，通过病毒转染技术将所述siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞中。
进一步地说，所述CAR分子通过慢病毒转染技术引入所述T细胞中。
进一步地说，所述靶向结构域的序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地说，所述CAR包含顺序连接的上膜信号区、CD8铰链区、克隆位点区、跨膜区和胞内信号区。
进一步地说，所述上膜信号区的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示。
进一步地说，所述CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No：4或SEQID No：5所示。
进一步地说，所述克隆位点区的核苷酸序列如SEQID No：6或SEQ ID No：7所示。
进一步地说，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID No：8或SEQ ID No：9所示。
进一步地说，所述胞内信号区的核苷酸序列如SEQ ID No：10、SEQ ID No：11或SEQID No：12所示。
所述方法在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明制备的通用型CAR-T细胞避免了输注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰，将会为通用型CAR-T细胞的使用铺平道路，具有重大的临床意义。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：通用型CAR-T细胞的制备
1.健康供者T细胞的分离与激活。
1)抽取健康志愿者外周血25ml，加入肝素继续拧抗凝，在室温条件下离心，所述离心条件为转速700xg/min，时间为20min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，进行离心，所述离心条件为转速900xg/min，时间为30min，取自体血浆4℃保存备用。
2)取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心，所述离心条件为转速800xg/min，时间为15min；利用培养基RPMI 1640进行离心洗涤，离心条件为转速600xg/min，时间为10min，洗涤两次，收集细胞即为PBMC细胞。
3)T细胞的分离和激活：将得到的外周血单个核细胞进行计数，按照1∶1的比例加入偶联CD3/CD28抗体的beads，轻轻震荡20min，利用吸附作用，得到CD3阳性的T细胞，此时的T细胞处于激活状态，加入完全培养基，对T细胞进行培养扩增。
2.利用CRISPR/Cas9系统敲除经步骤1获得的T细胞中的TCR基因，具体操作步骤如下所示：
1)针对TCR的a链和β链恒定编码区(TRAC、TRBC)基因的siRNA设计和质粒构建。
针对TRAC以及TRBC基因编码区的前三个外显子序列中选择5’-GNNGG-3’的序列。
合成引物，正义链为5’-ACTGN-3’，反义链为5’-AGACN-3’。将合成的序列片断各取22.5μL，与5μL
Figure BDA0003357197690000031
HiFi Buffer II混合，于95℃加热3min后缓慢冷却到室温。所得产物用T4PNK进行磷酸化处理，37℃温育30min。将磷酸化后的产物(Insert siRNA)分别通过Golden Gate反应连接到psiRNA载体中。
反应体系如下：
连接产物转化至DH5α感受态细菌后，挑选克隆使用通用引物U6进行测序，将正确插入siRNA序列的克隆摇菌提取质粒。
3)敲除T细胞系(Jurkat、SupT1等)和primary T细胞的TCR基因
利用慢病毒转染技术，将siRNA和Cas9导入到T细胞系(Jurkat、SupT1等)和primary T细胞中，通过流式分选技术或者免疫磁珠技术筛选出TCR阴性同时CD4或者CD8阳性的T细胞。
将筛选出的TCR阴性同时CD4或者CD8阳性的T细胞提取基因组，用特异性引物
TRAC：
Forward：TAATGACTGCCTTCACCGA，
Reverse：GCTGGTCCATCAGGCCG；
TRBC：
Forward：GATAGATGATCAACAACCT，
Reverse：GTAGCTGGTCCACCTAAT；
分别PCR扩增TRAC及TRBC包含对应siRNA的基因组区域，PCR产物进行TA克隆及测序以从分子水平上验证TCR的敲除。
3.CAR的设计及载体构建
设计包含顺序连接的上膜信号区、CD8铰链区、克隆位点区、跨膜区和胞内信号区的嵌合抗原受体(CAR)，并进行载体构建。上膜信号区的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQID No：2所示；所述CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No：4或SEQID No：5所示；所述克隆位点区的核苷酸序列如SEQID No：6或SEQ ID No：7所示；所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ IDNo：8或SEQ ID No：9所示；所述胞内信号区的核苷酸序列如SEQ ID No：10、SEQ ID No：11或SEQ ID No：12所示。
SEQ ID No：1 GCGTCTGGGCGGTGCTACAAC
SEQ ID No：2 GATGTGGAAGTCACGCCCCGTT
SEQ ID No：3 GACACCTTCTTCCCCAGCCC
SEQ ID No：4 TGTGCTAGACATGAGGTCTA
SEQ ID No：5 GAGAATCAAAATCGGTGAAT
SEQ ID No：6 GTCTCTCAGCTGGTACACGGC
SEQ ID No：7 TTGGTACAGC
SEQ ID No：8 CACGCTGTAT
SEQ ID No：9 AGAGATCTCCCACACCCAAA
SEQ ID No：10 AAGGCCACACTGGTGTGCC
SEQ ID No：11 CACTGGTGCCTGGCCAC
SEQ ID No：12 CAGGCTTCTTCCCCGACCACG
下面以CAR5和CAR6为例，具体说明CAR分子的核苷酸序列的制备步骤。
首先进行引物设计，本实施例中使用的引物序列如下：
1-1：5’-TACATCTGGGCGCCCTTGGCCGG-3’
1-2：5’-GGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCG-3’
2-1∶5’-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG-3’
2-2∶5’-TTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’
以人的cDNA文库为模板，分别以1-1和1-2、2-1和2-2为引物，通过PCR克隆出相应的CAR分子部分，在通过引物1-1和1-2获得完整的CAR分子的核苷酸序列，酶切位点为SpeI和MluI。
4.通用型CAR-T细胞的构建和扩增
如步骤1所述，利用偶联CD3/CD28抗体的beads将PBMC中的T细胞分选和激活后，用培养基将细胞密度调至1×106cell/mL。按照比例加入包装有CAR的慢病毒，24h后换液，48h后观察细胞的状态，收集细胞悬液，以500xg离心6min，弃上清，用培养基将细胞密度调至1×106cell/mL。使用试剂盒制备Cas9mRNA和TRAC mRNA，经过纯化和洗脱后待用。把细胞和mRNA混合，使其最终浓度达到每100μL中含1×106个细胞和500ng mRNA。利用电转仪将mRNA导入细胞中。每天观察细胞的生长状况，每隔一天进行换液。细胞培养11-12d后，对所得的T细胞进行质量检测。并在第12-14d对T细胞进行纯化，最后将终产品进行分装和冻存。
实施例2：通用型CAR-T(CAR-T细胞)有效性验证
观察实施例1得到的通用型CAR-T细胞对B细胞型急性淋巴细胞白血病的治疗作用。
动物实验验证：
一、淋巴瘤小鼠模型的构建：
实验所用雌性BalB/C裸小鼠，出生(4-6)周龄，体重(18-20)克。
1.细胞系：人淋巴瘤细胞系Daudi；
Daudi细胞是人淋巴瘤细胞系，可以通过皮下注射的方式构建小鼠的人淋巴瘤模型。其CD19表达为阳性，可以作为CAR-T细胞的靶细胞。
2.Daudi细胞培养
Daudi细胞系为悬浮细胞系，在含有20％FBS的1640培养基中可以快速生长。细胞密度为2-3×106/mL时需要传代。传代时取细胞悬液于离心管中，以500xg离心5min，弃上清。将细胞密度调整到0.3-0.5×106/mL，继续培养。正常生长情况下，Daudi细胞系为隔天传代，细胞密度维持在0.3-3×106/mL之间即可。
3.细胞系接种
用生理盐水重悬Daudi细胞，调整其活细胞浓度为3×106/mL，在冰上将其与Matrigel按照2∶1的体积比充分混匀。通过皮下注射的方式进行接种，23天后观察小鼠肿瘤生长速度。
以成功长出100mm3的肿瘤作为小鼠淋巴瘤模型构建成功的判定标准。其中肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径(mm)×0.5mm：
4.小鼠淋巴瘤模型给药。取淋巴瘤模型构建成功率高于95％的小鼠的同批次小鼠进行标记分组，20只1组共4组，每组中的10只解剖测量计算该组肿瘤体积平均值；剩余的每组10只分别给药，记录给药当天为D0，给药方式：通过尾静脉注射的方式分别进行细胞输注(0组：PBS 200μL、1组：人T细胞200μL(总计1×10/只)、2组：人WT CAR-T细胞200μL(总计1×10/只)、3组：人CAR-T细胞200μL(总计1×10/只))，所有小鼠均单次给药。
给药前解剖的40只小鼠，每组的平均肿瘤体积相差不超过2％，遂取40只小鼠整体的平均肿瘤体积作为给药前的空白基准，规定为原始肿瘤体积。给药后，正常饲养即可，随时间监测小鼠体重变化，监测结果为2-3组所有样本均未再出现显著的(减轻体重超过给药D0体重的10％)体重减轻情况，1组小鼠有3只出现显著体重减轻(减轻体重超过给药D0体重的15％)，但情况并不严重，0组小鼠均出现显著的体重减轻(减轻体重为给药D0体重的10-15％)，情况并不严重。在饲养第28天时全部处死进行解剖，检测肿瘤体积，每组小鼠取平均肿瘤体积，结果为：0组小鼠肿平均体积较原始肿瘤体积增大了79％；1组小鼠肿平均体积较原始肿瘤体积减小了3％；2组小鼠肿平均体积较原始肿瘤体积减小了46％；3组小鼠肿平均体积较原始肿瘤体积减小了57％。
述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Figure BDA0003357197690000081
Figure BDA0003357197690000091
Figure BDA0003357197690000101
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序列表
<110> 广东万海细胞生物科技有限公司
<120> 一种通用型异体CAR-T细胞制备方法及应用
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<213> 人工序列()
<400> 10
aaggccacac tggtgtgcc 19
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
cactggtgcc tggccac 17
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
caggcttctt ccccgaccac g 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
tacatctggg cgcccttggc cgg 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ggagcgatag gctgcgaagt cgcg 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
agagtgaagt tcagcaggag cg 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ttagcgaggg ggcagggcct 20

Claims (10)

1.一种通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、在T细胞中引入siRNA分子和Cas9分子；
S2、在所述T细胞中引入CAR分子；
其中，所述siRNA分子包含与来自TCR的a链和/或β链恒定编码区基因的靶区域互补的靶向结构域；
其中，通过病毒转染技术将所述siRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞中。
2.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述CAR分子通过慢病毒转染技术引入所述T细胞中。
3.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述靶向结构域的序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述CAR包含顺序连接的上膜信号区、CD8铰链区、克隆位点区、跨膜区和胞内信号区。
5.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述上膜信号区的核苷酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示。
6.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示。
7.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述克隆位点区的核苷酸序列如SEQ ID No:6或SEQ ID No:7所示。
8.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID No:8或SEQ ID No:9所示。
9.根据权利要求1所述的通用型异体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述胞内信号区的核苷酸序列如SEQ ID No:10、SEQ ID No:11或SEQ ID No:12所示。
10.权利要求1-9中任一所述方法在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105177031A (zh) * 2015-06-12 2015-12-23 北京艺妙神州医疗科技有限公司 嵌合抗原受体修饰的t细胞及其用途
CN106544321A (zh) * 2016-10-13 2017-03-29 北京艺妙神州医疗科技有限公司 通用型car‑t细胞及其制备方法和用途

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