CN109988819A - 一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用 - Google Patents

一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用 Download PDF

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CN109988819A CN201910315777.XA CN201910315777A CN109988819A CN 109988819 A CN109988819 A CN 109988819A CN 201910315777 A CN201910315777 A CN 201910315777A CN 109988819 A CN109988819 A CN 109988819A
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聂俊伟
瞿志鹏
韩锦雄
曹林
张力军
叶廷跃
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

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Abstract

本发明公开了一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用，包含：核心序列；随机序列(N)n，N为随机序列，共n个；和反向互补序列；其中核心序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，反向互补序列如SEQ ID NO.3所示。本发明在转座酶包埋复合物上增加特异性接头分子标签，使cDNA片段在不同酶切位点上连接的接头分子标签序列不同，在测序数据拼接时，带相同分子标签的cDNA片段连接在一起，得出转录本序列，检测可变剪接事件。本发明保证了拼接的高度准确性，还原了转录本的真实情况，在拼接的时候即使出现外显子跳跃情况，也能准确进行拼接，从而获得更多的遗传信息，增加可变剪切预测的数量。

Description

一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用。
背景技术
可变剪切是mRNA前体通过不同的剪接方式产生的剪接异构体，由此产生的不同的mRNA可能被翻译成不同的蛋白质构体，使遗传信息得到放大，因此一个基因可能编码多种蛋白质。可变剪切的原理图如图1所示，其是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制，在真核生物基因转录后调控中发挥了关键作用，参与了多种重要的发育过程，如：mRNA产物的降解、肌肉组织分化、人类器官和组织发育等。同时，异常的可变剪切会导致疾病的发生，如：地中海贫血症、囊性纤维化、荷尔蒙缺陷、强制性肌营养不良等复杂疾病。
转录组测序技术(RNA-seq)指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一特定组织在某种状态下的几乎所有转录本。RNA-seq测序的优势包括：单次测序实验提供全面的转录组信息；无需预先知道任何序列信息；提高了动态检测范围和灵敏度；可提供转录本中序列变异信息。利用基因组和转录组测序来研究转录本可变剪切已经较为普遍，测序平台得到的数据为原始数据，通过对这些数据进行质量剪切(去除接头序列、低质量读段、N端较长序列和长度过短序列)，从而得到高质量的数据，然后通过拼接得到mRNA的碱基信息。
由于转录组较大，而二代测序的读长较短，现有技术对转录组的拼接及可变剪切的预测存在一定的困难。普通转录组测序，在数据拼接的过程中，很容易丢失多种可变剪切。对于一些外显子跳跃的情况，难以准确的预测可变剪切，或者丢失部分信息；不同剪切形式之间可能存在较大的gap，比对结果不够精确。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种特异性接头分子标签。
本发明目的之二在于提供所述特异性接头分子标签的应用。
本发明的目的之三在于提供一种预测可变剪切的方法。
本发明的目的通过下述技术特征实现：
本发明所提供的一种特异性接头分子标签，包含：核心序列；随机序列(N)n，N为随机序列，共n个；和反向互补序列；其中核心序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，反向互补序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，本发明所述的特异性接头分子标签，具体序列如下：
退火接头序列P5：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
退火接头序列P7：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
反向互补序列：CTGTCTCTTATACACATCT
其中，N选自A、T、C、G，优选的，n为3-10，更优选为3-6个。
本发明还提供了所述特异性接头分子标签在RNA建库或者单细胞建库中的应用。
本发明还提供了所述特异性接头分子标签在cDNA打断建库中的应用。
本发明还提供了所述特异性接头分子标签在预测可变剪切中的应用。
本发明还提供一种预测可变剪切的方法，在转座酶包埋复合物上增加特异性接头分子标签，使cDNA片段在不同片段化位点上连接的接头分子标签序列不同，在测序数据拼接时，带相同分子标签的cDNA片段连接在一起，得出转录本序列，检测可变剪接事件；所述的接头分子标签包含：核心序列；随机序列(N)n，N为随机序列，共n个；和反向互补序列；其中核心序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，反向互补序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，本发明所述的预测可变剪切的方法，其中的特异性接头分子标签具体序列如下：
退火接头序列P5：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
退火接头序列P7：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
反向互补序列：CTGTCTCTTATACACATCT
其中，N选自A、T、C、G，优选的，n为3-10，更优选为3-6个。
在一种具体的实施方式中，本发明所述的预测可变剪切的方法，包括如下步骤：
(1)扩增全长cDNA；
(2)转座酶包埋复合物的制备：将带有相同接头分子标签的退火接头序列P5和退火接头序列P7，分别与反向互补序列退火，形成接头分子标签，将形成的接头分子标签包埋到同一个转座酶中形成一个转座酶包埋复合物；重复此方法，使不同转座酶中包埋的接头分子标签具特异性，即形成不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物；其中所述的特异性接头分子标签如权利要求1所述；
(3)将步骤(2)得到的不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物混合并与步骤(1)所得全长cDNA进行孵育，完成cDNA片段化和加带分子标签的接头，使cDNA片段在同一断点两端的接头分子标签序列相同而不同酶切位点上连接的接头分子标签序列不同；
(4)通过对特异性接头分子标签序列的比对识别，结合局部组装，得到转录本序列，从而检测可变剪接事件。
本发明步骤(1)全长cDNA的扩增可以通过现有常规的方法进行扩增获得，如PCR等。
本发明步骤(2)接头分子标签的形成，即将带有相同接头分子标签的退火接头序列P5和退火接头序列P7，分别与反向互补序列退火，可以采用本领域常规的退火方法。例如，退火接头序列P5和退火接头序列P7分别可以有4n种序列，4n种序列分别单独合成，然后分别与反向互补序列进行退火。在一种实施方式中，具体为：将退火接头序列P5和反向互补序列混合，将退火接头序列P7和反向互补序列混合，进行引物退火。进一步优选的，将退火接头序列P5和反向互补序列等比例混合，将退火接头序列P7和反向互补序列等比例混合，进行引物退火，形成接头分子标签。
本发明步骤(2)将形成的接头分子标签包埋到同一个转座酶中形成一个转座酶包埋复合物的具体制备方法和体系可以按照本领域的常规方法和常规体系，在一种实施方式中，本发明提供一种具体的转座酶包埋复合物的制备方法：转座酶(10U)12-15μL、接头分子标签各2-3μL、包埋缓冲液12-15μL，混匀，置于PCR仪上28-32℃反应1-2小时。
本发明所述的转座酶包埋复合物中的转座酶可以为本领域常用的转座酶，例如为Tn5家族转座酶，包括野生型Tn5转座酶、突变型Tn5转座酶等，均可适用于本发明。
本发明所述的包埋缓冲液为本领域常规的包埋缓冲液。
在一种优选的实施方式中，本发明步骤(3)中将步骤(2)得到的不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物按照相同体积混合，形成转座酶包埋复合物的混合物，混合物与步骤(1)所得全长cDNA进行孵育，完成cDNA片段化和加带分子标签的接头，使cDNA片段在同一断点两端的接头分子标签序列相同而不同酶切位点上连接的接头分子标签序列不同。
本发明步骤(3)不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物混合并与步骤(1)所得全长cDNA进行孵育，完成cDNA片段化和加带分子标签的接头的方法可以按照分子生物学常规方法进行。
本发明步骤(4)中，通过对特异性接头分子标签序列的比对识别，结合局部组装，得到转录本序列，可以按照分子生物学常规方法进行。在后期信息分析时，通过对转座酶上特异性序列标签的比对识别，结合局部组装，达到区分来自不同转录本测序reads的目的，得出更加完整与精确的不同转录本序列，从而检测出更完善的可变剪接事件。
相关术语解释：
可变剪切：是mRNA前体通过不同的剪接方式产生的剪接异构体，由此产生的不同的mRNA可能被翻译成不同的蛋白质构体，使遗传信息得到放大，因此一个基因可能编码多种蛋白质。
外显子跳跃：例如外显子1跳过了外显子2和外显子3，和外显子4连接，而出现在成熟的mRNA中，因此，外显子跳跃很可能产生多种蛋白，当然也就可以拥有不同情况下选择性剪接的功能。
本发明相对于现有技术的优势：
本发明是在退火接头上引用分子标签技术，使得每一个转座酶携带不同分子标签的接头，但是同一个转座酶包埋的两段核心序列上的分子标签是相同的，则转座酶在将cDNA打断的同时，将带有相同分子标签的两个接头插入到断口的两端，因此，相临的两个片段其连接位置的分子标签是相同的。在序列拼接的过程中，将相同分子标签的两段序列拼接在一起，从而保证了拼接的高度准确性，还原了转录本的真实情况，这样在拼接的时候即使出现外显子跳跃情况，也能准确的进行拼接，从而获得更多的遗传信息，增加了可变剪切预测的数量。
附图说明
图1：可变剪切原理图；
图2：实施例2正常建库2100图；
图3：实施例2本发明的方案建库2100图；
图4：实施例3正常建库2100图；
图5：实施例3本发明的方案建库2100图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1制备含特异性分子标签的转座酶包埋复合物
转座酶及包埋缓冲液由南京诺唯赞生物科技有限公司生产的(Vazyme)Tn5Transposome(S111)试剂盒提供。
特异性分子标签的核酸序列具体为：
退火接头序列P5：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(N)3
退火接头序列P7：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)3
反向互补序列：CTGTCTCTTATACACATCT
订引物时将N3种退火接头序列P5(64种)和退火接头序列P7(64种)引物分开合成，分开装管。64种接头序列与反向互补序列退火后分别选择相同标签的两个接头和转座酶进行包埋反应。配制如表1所示的反应体系，用移液器轻轻吹打混匀，将配好的反应体系置于PCR仪上30℃反应1.5小时，得到转座酶包埋复合物，后等比例混合，于-20℃保存。
表1
组分 体积
Tn5转座酶(10U) 14μl
如退火接头序列P5所示的退火接头 2.5μl
如退火接头序列P7所示的退火接头 2.5μl
包埋缓冲液 14μl
Total 33μl
实施例2含特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物在单细胞建库中的应用
1、逆转录合成第一链cDNA
选择人的293细胞为实验材料，利用南京诺唯赞(Vazyme)的Discover-sc WTA KitV2(N711)试剂盒进行转录组扩增。所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如，单细胞裂解液、RNase Inhibitor、逆转录缓冲液、DTT、TS Oligo、逆转录酶、高保真酶等。
1)按照以下顺序配制10×Sample Buffer，用移液器轻轻混匀，并短暂离心收集。
表2
2)取1μl的10×Sample Buffer到0.2ml的PCR管中，再加入4μl的Nuclease-freeH2O。
3)单细胞的分离
取新鲜培养的293细胞悬浮液，在常温下离心收集，弃培养液加PBS重悬，在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的单细胞加入到步骤2)含10×SampleBuffer的0.2ml的PCR管中，轻弹管壁混匀，室温孵育5min。
4)将样品置于冰上，按照表3配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。将有热盖功能的PCR仪提前预热至72℃。反应程序：72℃，3min；立刻置于冰上，2min。
表3
组分 体积
步骤3)细胞样本 3μL
Oligo dT Primer 2μl
dNTP Mix 2μl
Total 10μl
5)将PCR仪预热至42℃备用。
6)按表4配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表4
组分 体积
Nuclease-free H<sub>2</sub>O 2.5μl
步骤4)反应产物 10μl
逆转录缓冲液 4μl
DTT 1μl
RNase Inhibitor 0.5μl
TS Oligo 1μl
逆转录酶 1μl
总体积 20μl
7)将PCR管放入预热至42℃的PCR仪中，运行表5中的程序。
表5
热盖 105℃
42℃ 90min
70℃ 15min
4℃ hold
这一步逆转录合成了第一链cDNA。
2、全长cDNA扩增
1)按照表6配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表6
组分 体积
第一链cDNA合成产物 20μl
Nuclease-free H<sub>2</sub>O 4μl
Discover-sc WTA PCR Primer 1μl
2×Discover-sc PCR Mix 25μl
总体积 50μl
2)在PCR仪中运行表7的程序。
表7
3)PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，所得到的产物即为全长cDNA。
3、全长cDNA片段化
使用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的(Vazyme)TruePrep DNA Library PrepKit V2for Illumina(TD503)试剂盒进行，所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如，转座酶、包埋缓冲液、转座酶缓冲液、PCR缓冲液、高保真酶等。
1)在灭菌PCR管中依次添加如表8所示各反应组分，使用移液器轻轻吹打混匀。本实验的阴性对照(即表12中的正常建库)为不含特异性接头分子标签的转座酶进行片段化处理，其他步骤相同。
表8
2)进行如表9所示PCR反应，立即向反应产物中加入5μl的5×TS，使用移液器轻轻吹打混匀，室温放置5min。
表9
热盖 105℃
55℃ 10min
10℃ Hold
4、PCR富集
(1)配制如表10所示PCR反应液，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
上游引物N7序列：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTCTCGTGGGCTCGG
下游引物N5序列：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxTCGTCGGCAGCGT
其中xxxxxxxx为index序列。
表10
组分 体积
上一步骤中的片段化产物 25μl
PCR缓冲液 10μl
上游引物N7 5μl
下游引物N5 5μl
高保真酶 1μl
ddH<sub>2</sub>O 4μl
Total 50μl
(2)在PCR仪中运行如表11所示程序：
表11
5、PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司生产的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，最终得到的产物为带特异性分子标签修饰的接头的cDNA文库，按照常规方法用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析。
另一组实验是用不含特异性接头分子标签的转座酶进行片段化，其他步骤与本实验相同，其产出的文库2100图谱如图2；本发明中用含有特异性接头分子标签的转座酶进行片段化得到的文库2100图谱如图3，从中可知：本发明得到的文库片段大小、文库浓度等都不亚于使用普通转座酶。
送测序得到的测序数据进行数据分析，得到表12所示的结果，从表12最后一栏可见：使用本发明的方法，在信息分析之后，得到的可变剪切的数量为3954，正常建库为3533，本发明的可变剪切数提高了约12％。
表12下机数据信息
注：上表中“正常建库”即为使用不含特异性接头分子标签的转座酶进行片段化得到的文库信息；“本发明”即为用含有特异性接头分子标签的转座酶进行片段化得到的文库信息。
实施例3含特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物在RNA建库中的应用
1、mRNA获取
选择人的293细胞为实验材料，使用分子生物学常规方法提取细胞总RNA。利用南京诺唯赞(Vazyme)的VAHTS mRNA-seq V3Library Prep Kit for Illumina(NR611)试剂盒进行mRNA的获取，所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如：mRNA Capture Beads，Beads Wash Buffer，Tris Buffer，Beads Binding Buffer等。
1)将NR1各组分(mRNA Capture Beads，Beads Wash Buffer，Tris Buffer，BeadsBinding Buffer)从2-8℃取出，静置使其平衡至室温。
2)准备RNA样品：将1μg总RNA溶解于Nuclease-free H2O至总体积50μl，冰上放置备用。
3)缓慢颠倒使mRNA Capture Beads充分混匀，吸取50μl加入到准备好的RNA样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
4)在PCR仪中进行第一次mRNA结合，程序如表13：
表13
温度 时间
65℃ 5min
25℃ 5min
5)置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
6)将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
7)将样品从磁力架上取出，加入50μl Tris Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
8)在PCR仪中进行mRNA洗脱，程序如表14：
表14
温度 时间
80℃ 2min
25℃ hold
9)加入50μl Beads Binding Buffer，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
10)室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。
11)置于磁力架上，使mRNA与总RNA分离，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
12)将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
13)将样品从磁力架上取出，加入19μl Nuclease-free H2O重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取17μl留用。
14)将样品置于冰上，按照表15配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。将有热盖功能的PCR仪提前预热至72℃。反应程序：72℃，3min；立刻置于冰上，2min。
15)将PCR仪预热至42℃备用。
16)按表15配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表15
组分 体积
洗脱的mRNA 17μl
Oligo dT Primer 4μl
dNTP Mix 4μl
逆转录缓冲液 8μl
DTT 2μl
RNase Inhibitor 1μl
TS Oligo 2μl
逆转录酶 2μl
总体积 40μl
17)将PCR管放入预热至42℃的PCR仪中，运行表16中的程序。
表16
热盖 105℃
42℃ 90min
70℃ 15min
4℃ hold
这一步逆转录合成了第一链cDNA。
2、PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司生产的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，20μl Elution Buffer洗脱。
3、全长cDNA扩增
1)按照表17配制反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
表17
2)在PCR仪中运行表18的程序。
表18
3)PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，所得到的产物即为全长cDNA。
4、全长cDNA片段化
使用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的(Vazyme)TruePrep DNA Library PrepKit V2for Illumina(TD501)试剂盒进行，所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，例如，转座酶、包埋缓冲液、转座酶缓冲液、PCR缓冲液、高保真酶等。
1)在灭菌PCR管中依次添加如表19所示各反应组分，使用移液器轻轻吹打混匀。本实验的阴性对照(即表23中的正常建库)为不含特异性接头分子标签的转座酶进行片段化处理，其他步骤相同。
表19
2)进行如表20所示PCR反应，立即向反应产物中加入5μl的5×TS，使用移液器轻轻吹打混匀，室温放置5min。
表20
热盖 105℃
55℃ 10min
10℃ Hold
5、PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，24μl ddH2O洗脱。
6、PCR富集
(1)配制如表21所示PCR反应液，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
上游引物N7序列：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTCTCGTGGGCTCGG
下游引物N5序列：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxTCGTCGGCAGCGT
其中xxxxxxxx为index序列。
表21
组分 体积
上一步骤中的片段化产物 24μl
PCR缓冲液 10μl
上游引物N7 5μl
下游引物N5 5μl
PPM 5μl
高保真酶 1μl
Total 50μl
(2)在PCR仪中运行如表22所示程序：
表22
6、PCR产物纯化
使用南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司生产的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附PCR产物，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，最终得到的产物为带特异性分子标签修饰的接头的cDNA文库，按照常规方法用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析。
另一组实验是用不含特异性接头分子标签的转座酶进行片段化，其他步骤与本实验相同，其产出的文库2100图谱如图4；本发明中用含有特异性接头分子标签的转座酶进行片段化得到的文库2100图谱如图5，从中可知：本发明得到的文库片段大小、文库浓度等都不亚于使用普通转座酶。
送测序得到的测序数据进行数据分析，得到表23所示的结果，从表23最后一栏可见：使用本发明的方法，在信息分析之后，得到的可变剪切的数量为4026，正常建库为3834，本发明的可变剪切数提高了约12.8％。
表23下机数据信息
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司
<120> 一种特异性接头分子标签及其在预测可变剪切中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19

Claims (10)

1.一种特异性接头分子标签，其特征在于包含：核心序列；随机序列(N)n，N为随机序列，共n个；和反向互补序列；其中核心序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，反向互补序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的特异性接头分子标签，其特征在于，具体序列如下：
退火接头序列P5：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
退火接头序列P7：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
反向互补序列：CTGTCTCTTATACACATCT
其中，N选自A、T、C、G，优选的，n为3-10，更优选为3-6个。
3.权利要求1或2所述特异性接头分子标签在RNA建库或者单细胞建库中的应用。
4.权利要求1或2所述特异性接头分子标签在cDNA打断建库中的应用。
5.权利要求1或2所述特异性接头分子标签在预测可变剪切中的应用。
6.一种预测可变剪切的方法，其特征在于，在转座酶包埋复合物上增加特异性接头分子标签，使cDNA片段在不同片段化位点上连接的接头分子标签序列不同，在测序数据拼接时，带相同分子标签的cDNA片段连接在一起，得出转录本序列，检测可变剪接事件；所述的接头分子标签包含：核心序列；随机序列(N)n，N为随机序列，共n个；和反向互补序列；其中核心序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示，反向互补序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求6所述的预测可变剪切的方法，其特征在于所述接头分子标签序列如下：
退火接头序列P5：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
退火接头序列P7：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)n
反向互补序列：CTGTCTCTTATACACATCT
其中，N选自A、T、C、G，优选的，n为3-10，更优选为3-6个。
8.根据权利要求6所述的预测可变剪切的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)扩增全长cDNA；
(2)转座酶包埋复合物的制备：将带有相同接头分子标签的退火接头序列P5和退火接头序列P7，分别与反向互补序列退火，形成接头分子标签，将形成的接头分子标签包埋到同一个转座酶中形成一个转座酶包埋复合物；重复此方法，使不同转座酶中包埋的接头分子标签具特异性，即形成不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物；其中所述的特异性接头分子标签如权利要求1所述；
(3)将步骤(2)得到的不同的带有特异性接头分子标签的转座酶包埋复合物混合并与步骤(1)所得全长cDNA进行孵育，完成cDNA片段化和加带分子标签的接头，使cDNA片段在同一断点两端的接头分子标签序列相同而不同酶切位点上连接的接头分子标签序列不同；
(4)通过对特异性接头分子标签序列的比对识别，结合局部组装，得到转录本序列，从而检测可变剪接事件。
9.根据权利要求8所述的预测可变剪切的方法，其特征在于，步骤(2)转座酶包埋复合物的制备方法：转座酶12-15μL、特异性接头分子标签各2-3μL、包埋缓冲液12-15μL，混匀，置于PCR仪上28-32℃反应1-2小时。
10.根据权利要求9所述的预测可变剪切的方法，其特征在于，所述转座酶为Tn5家族转座酶。
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