WO2022006857A1 - 一种基于干血片的痕量dna提取方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Definitions

  • the invention belongs to the field of trace DNA detection, and particularly relates to a method for extracting trace DNA based on dried blood slices.
  • Trace DNA refers to DNA with a content as low as picogram level.
  • forensic evidence criminal cases and trace organisms, sensitive and accurate DNA quantification methods play an important role in biological research and applications.
  • the Chinese Pharmacopoeia 2005 Edition uses the Southern blotting hybridization method to detect the content of exogenous DNA. This method can detect DNA at the pg level, but it is a semi-quantitative method.
  • some researchers have also established a trace DNA fluorescence detection method. This method extracts DNA and plays a role in concentration. After concentration, the DNA in the sample can reach the level of fluorescence detection. Compared with the Southern blotting hybridization method, the fluorescence method is faster and more accurate.
  • a trace DNA extraction method based on dried blood slices mainly prepares high-performance liquid phase separation tubes during the trace DNA extraction process, adds 100ng carrier RNA to mix after the DNA solution is collected, adds an equal volume of phenol chloroform, and transfers to High-efficiency liquid phase separation tube, high-speed centrifugation for liquid phase stratification, and 98% of the supernatant was recovered.
  • the final concentration of the polydimethylsiloxane is 10-50%), and the final concentration of the SiO2 solution is 1-10%.
  • the constant temperature mode is a water bath constant temperature, a sand bath or a metal bath;
  • the carrier RNA is used as a yeast tRNA solution as a carrier in the nucleic acid purification and precipitation process.
  • the method of the present invention provides that in the process of transferring the supernatant, the traditional method is to add phenol and chloroform in a common centrifuge tube to centrifuge and layer the supernatant, and the supernatant is not recovered completely, and the supernatant can be completely transferred. And in the process of separation, 100ng of carrier RNA was added to mix, which achieved a substantial increase in the extraction rate and high precision. At the same time, the method did not increase the equipment of the original method when improving the precision.
  • Fig. 1 main steps of a kind of trace DNA extraction method based on dried blood sheet provided by the present invention
  • Fig. 2 increases the high-efficiency liquid phase separation tube and preparation process of carried RNA in the present invention
  • FIG. 3 is a structural comparison diagram of an embodiment of the patent of the present invention.
  • carrier RNA yeast tRNA solution, used as a carrier in the nucleic acid purification and precipitation process
  • phenol chloroform a carrier in the nucleic acid purification and precipitation process
  • phase stratification 98% supernatant is recovered (traditional method is to add phenol chloroform in a common centrifuge tube and then absorb the supernatant after centrifugation and layering, and the recovery of the supernatant is incomplete);

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Abstract

一种基于干血片的痕量DNA提取方法，在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。

Description

一种基于干血片的痕量DNA提取方法 技术领域
本发明属于痕量DNA检测领域，特别涉及到一种基于干血片的痕量DNA提取方法。
背景技术
痕量DNA是指含量低至皮克级别的DNA，在法医物证、刑事案件和微量生物上，灵敏、准确的DNA定量方法在生物学研究及应用领域中发挥着重要的作用，根据2005版《中国药典2005版(三部)》检测外源DNA含量采用的是Southern blotting杂交法，此法可以检出pg水平的DNA，但是半定量的方法。此外，也有相关研究人员建立了痕量DNA荧光检测方法，该方法抽提DNA起到了浓缩作用，样品中的DNA经过浓缩后可以达到荧光检出的水平。荧光法和Southern blotting杂交法比较，更快速、精度更高。
然而，上述方法存在着上清液提取不完全和提取率不高以及DNA纯度不高等不足。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于干血片的痕量DNA提取方法。本发明技术方案如下：
一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要是在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。
进一步的，所述提取方法步骤主要为以下所述：
(1)取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管中。
(2)加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液。
(3)涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温中过夜。
(4)将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量。
(5)制备高效液相分离管，向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷+SiO2溶液200-300ul真空硅脂，混合均匀，并快速高速离心30秒-60秒。
(6)DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清液；
(7)加入1.3ml-1.5ml体积的无水乙醇，100ul 3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清；
(8)再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次；
(9)晾干后加入水溶解，获得初始DNA；
(10)获得的初始DNA在通过Beckman XP Beads纯化。
进一步的，所述聚二甲基硅氧烷终浓度为10-50％)，所述SiO2溶液终浓度为1-10％。
进一步的，所述恒温方式为水浴恒温、沙浴或者金属浴；
进一步的，所述carrier RNA作为酵母tRNA溶液，用作核酸纯化和沉淀过程中的载体。
更进一步的，所述提取方法得到高纯度的DNA，纯度可达到260/280＝1.8-2.1之间。
与现有技术对比，本发明方法提供了在上清液转移过程中，传统方法是在普通离心管内加酚氯仿离心分层后吸取上清，回收上清不彻底，上清液能够全部转移，并且在分离的过程中增加了100ng carrier RNA混合，实现了提取率大幅增加，精密度较高，同时，本方法在提高精度的时，并没有增加原始方法的设备。
附图说明
图1本发明提供的一种基于干血片的痕量DNA提取方法主要步骤；
图2本发明中增加carried RNA的高效液相分离管和制备流程；
图3本发明专利实施例结构对比图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
实施例：
根据图1和图2的所示流程，接下来主要使用传统方法与本发明专利的发明进行对比操作，主要介绍新方法的操作步骤，如下所示：
传统方法步骤如下：
1.样品加入等体积和酚或酚/氯仿(1：1)混合液.
2.上下颠倒很匀.
3.室温，12000转/分钟，离心5分钟.如蛋白质较多或分界不清时，可离心10分钟。
4.吸取上层(水层)移置另一新的离心管中.
5.加入等体积酚/氯仿/异戊酸(25：24：1)溶液.重复步骤2、3、4.
6.加入等体积氯仿/异戊酸(24：1)溶液.重复步骤2、3、4。
7.乙醇沉淀核酸(见核酸的沉淀纯化).
本发明专利方法步骤：
1.取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管(自备)中(101)。
2.加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液(102)。
3.涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温(金属浴，水浴，沙浴)中过夜(103)。
4.将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量(104)。
5.制备高效液相分离管(105)：向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷(终浓度10-50％)+SiO2溶液(终浓度1-10％)+200-300ul真空硅脂(201)，混合均匀(202)，并快速高速离心30秒-60秒(203)。
6.DNA溶液收集后加100ng carrier RNA(106)(酵母tRNA溶液，用作核酸纯化和沉淀过程中的载体)混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清(传统方法是在普通离心管内加酚氯仿离心分层后吸取上清，回收上清不彻底)；
7.加入1.3ml-1.5ml体积的无水乙醇，100ul 3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清(107)。
8.再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次(108)。
9.晾干后加入水溶解，获得初始DNA(109)。
获得的初始DNA在通过Beckman XP Beads纯化，得到高纯度的DNA，纯度可达到260/280＝1.8-2.1之间。
通过以上两种方法的对比，得出了如图3所示。
上述实验结果充分说明本方法的创新性，大大超越了传统方法。
最后，有必要说明一下，上述实施例，只是针对本发明技术方案作进一步详细说明，不能够理解为本发明的保护范围，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质改变和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

  1. 一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。
  2. 根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，所述提取方法步骤主要为以下所述：
    (1)取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管中。
    (2)加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液。
    (3)涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温中过夜。
    (4)将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量。
    (5)制备高效液相分离管，向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷+SiO2溶液200-300ul真空硅脂，混合均匀，并快速高速离心30秒-60秒。
    (6)DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清液；
    (7)加入1.3ml-1.5ml体积的无水乙醇，100ul 3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清；
    (8)再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次；
    (9)晾干后加入水溶解，获得初始DNA；
    (10)获得的初始DNA在通过Beckman XP Beads纯化。
  3. 根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷终浓度为10-50％)，所述SiO2溶液终浓度为1-10％。
  4. 根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，所述恒温方式为水浴恒温、沙浴或者金属浴；
  5. 根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，所述carrier RNA作为酵母tRNA溶液，用作核酸纯化和沉淀过程中的载体。
  6. 根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，其特征在于，所述提取方法得到高纯度的DNA，纯度可达到260/280＝1.8-2.1之间。
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