CN110628889A - Illumina二代测序平台文库构建引入分子标签的方法、接头序列及应用 - Google Patents

Illumina二代测序平台文库构建引入分子标签的方法、接头序列及应用 Download PDF

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CN110628889A
CN110628889A CN201910739362.5A CN201910739362A CN110628889A CN 110628889 A CN110628889 A CN 110628889A CN 201910739362 A CN201910739362 A CN 201910739362A CN 110628889 A CN110628889 A CN 110628889A
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Koran Biomedical Technology Shanghai Co ltd
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Yuanchen Biotechnology Suzhou Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本申请提供了一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建中引入分子标签方法、接头序列及设计方法、使用所述接头序列构建文库的方法以及含有接头序列的试剂盒。所述接头序列包括：5’‑P‑E‑F‑Q‑3’，其中，P为测序平台配对序列、E为相同碱基构成的随机碱基序列、F为给定碱基序列、Q为Tn5转座酶末端识别序列。本发明所提供的接头序列以及构建文库的方法，可以对低至50pg的DNA样本成功建库，适用于制备DNA建库试剂盒、针对疾病的诊断试剂盒的应用。

Description

Illumina二代测序平台文库构建引入分子标签的方法、接头 序列及应用
技术领域
本发明涉及一种高通量测序文库构建方法，尤其涉及一种适用于Illumina二代测序平台的文库、尤其是文库构建中引入分子标签的方法、接头序列、接头序列设计方法、以及应用。
背景技术
二代测序又称作NGS测序或高通量测序，顾名思义，高通量测序由于其测序反应通量高，一次测序反应我们可以得到1Gb～3Tb的测序数据，人类基因组包括其所编码的2万余个基因序列可以一次性获得。高通量测序准确性也非常高，对于单碱基准确度超过99.9％。高通量测序平台已经实现了从科学研究到临床应用突破，广泛用于产前检测、单基因疾病筛查或诊断、癌症个体化治疗、药物基因组学检测等方面，也是目前应用最为广泛的核酸测序方法。
美国Illumina公司的台式测序系统MiSeqDx与囊性纤维化(一种单基因遗传病)诊断产品在美国获得食品药品监督管理局(FDA)批准，目前Illumina公司的高通量测序仪是市场上应用型最为广泛的二代测序平台。Illumina二代测序平台的工作原理是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来边合成边测序。其中，芯片内通道表面有两种接头序列，分别与DNA文库的两端序列互补。构建DNA文库是测序的第一步，标准的文库构建的流程包括了以下几个步骤：核酸的片段化、末端补平、接头连接、目的片段富集和PCR扩增。传统的建库方法过程繁琐、耗时较长，PCR扩增过程中会随机产生大量的拷贝重复，在计算基因变异位点的突变频率时，由于序列重复比对容易造成较大误差，而且对建库的DNA起始质量要求较高(一般要求在50ng以上)。
Tn5酶是最初在大肠杆菌中发现的一种转座子酶，可以将一段DNA序列随机插入到目的DNA序列之中。将两种不同的DNA接头序列组装到Tn5转座酶的复合体中，可对目标DNA进行打断，在打断的同时，Tn5转座酶会将这两种不同的DNA接头序列分别连接在打断的DNA分子的两端。
专利CN103938277B公开了一种测序文库的构建方法，采用的接头序列包括：
接头序列1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
接头序列2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNCGTGATCGGTCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。
其中，NNNNNNNN为8个碱基组成的随机碱基序列，CGTGAT为给定的barcode碱基序列。
发明内容
不同于上述专利中描述的接头序列设计方法，本申请提供了一种新的适用于Illumina二代测序平台的在文库构建中引入分子标签的方法、接头序列、接头序列设计方法、以及应用。
本申请第一个方面是提供一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列，包括：5’-P-E-F-Q-3’，其中，P为测序平台配对序列、E为随机碱基序列、F为给定碱基序列、Q为Tn5转座酶末端识别序列。
在一种优选实施例中，所述E为5-10个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-8个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-6个碱基组成的随机碱基序列。
在更优选实施例中，所述E中的碱基，可以是A、C、T、G中任意一种。
其中，E中各个碱基可以是全部相同、部分相同、全不相同。例如，所述E中的各个碱基，可以是独立地选自A、C、T、G中任意一种。
在一种优选实施例中，所述F为3-5个碱基组成的给定碱基序列，更优选为3-4个碱基组成的给定碱基序列，如3个碱基组成的给定碱基序列。
在更优选实施例中，所述F中的碱基，可以是独立地选自A、C、T、G中任意一种或更多种碱基的组合。
在一种优选实施例中，P选自：
1)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC，或
2)CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
在一种优选实施例中，Q选自：
1)TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，或
2)GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
在一种优选实施例中，所述5’-P-E-F-Q-3’为：所述5’-P-E-F-Q-3’选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.128中的任意一种或更多种。
在一种优选实施例中，所述5’-P-E-F-Q-3’为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-E-F-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'，和：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-E-F-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'。
本申请第二个方面是提供一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列的设计方法，包括：设计如下两个不同接头序列：
接头序列1：5’-P1-E1-F1-Q1-3’
接头序列2：5’-P2-E2-F2-Q2-3’
其中，P1、P2为所述测序平台配对序列、E1、E2为所述随机碱基序列、F1、F2为所述既定碱基序列、Q1、Q2为所述Tn5转座酶末端识别序列。
在一种优选实施例中，所述E1、E2分别独立的为5-10个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-8个碱基组成的随机碱基序列，更优选为5-6个碱基组成的随机碱基序列。
在更优选实施例中，所述E1、E2中的碱基，可以分别独立地是A、C、T、G中任意一种。
在一种优选实施例中，所述F1、F2分别独立地为3-5个碱基组成的给定碱基序列，更优选为3-4个碱基组成的给定碱基序列，如3个碱基组成的给定碱基序列。
在更优选实施例中，所述F1、F2中的碱基，可以分别独立地是A、C、T、G中任意一种或更多种碱基的组合。
在一种优选实施例中，P1、P2选自：
1)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC，或
2)CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
在一种优选实施例中，Q1、Q2选自：
1)TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，或
2)GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
在一种优选实施例中，所述5’-P1-E1-F1-Q1-3’为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-E1-F1-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'。
在一种优选实施例中，所述5’-P2-E2-F2-Q2-3’为：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-E2-F2-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'。
本申请第三个方面是提供一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建方法，包括：
采用上述接头序列1、上述接头序列2组装Tn5转座酶复合体；
使用组装后的Tn5转座酶复合体对DNA样本进行打断，打断的DNA分子两边分别标记E1-F1、E2-F2；
对打断后的DNA片段进行PCR扩增，纯化扩增产物。
在一种优选实施例中，所述DNA样本可以来自于病理组织、血液等各类组织的DNA样本。
在一种优选实施例中，所述组装Tn5转座酶复合体的过程中，还采用如下序列：
5’-Phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。
在一种优选实施例中，PCR扩增所用的扩增引物优选为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
本申请第四个方面是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：所述适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列5’-P-E-F-Q-3’。
在一种优选实施例中，所述试剂盒为适用于Illumina二代测序平台的文库构建的试剂盒。
在一种优选实施例中，所述试剂盒为通过检测DNA进行诊断疾病用的试剂盒。
在一种优选实施例中，所述适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列包括：
接头序列1：5’-P1-E1-F1-Q1-3’
接头序列2：5’-P2-E2-F2-Q2-3’。
在一种优选实施例中，所述试剂盒还包括如下序列(SEQ ID NO.129)：
5’-Phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。
在一种优选实施例中，所述试剂盒还包括扩增引物序列，更优选地，所述扩增因为序列优选为：
SEQ ID NO.130：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’；
SEQ ID NO.131：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
具体地，所述5’-P-E-F-Q-3’选自如下一种或更多种序列：
具体地，所述5’-P1-E1-F1-Q1-3’选自上述SEQ ID No:1-SEQ ID No:64中的一种或更多种序列。
具体地，所述5’-P2-E2-F2-Q2-3’选自上述SEQ ID No:65-SEQ ID No:128中的一种或更多种序列。
应当注意的是，E可以是n1n2n3n4n5，n1、n2、n3、n4、n5分别独立地选自C、A、G、T中的任意一种。但是为了便于在序列表中表示，本申请序列表、说明书附图中采用了“nnnnn”或“NNNNN”的表述方式，但并不意味着各个碱基n或碱基N必须是相同的，也可以是不同的，或者至少部分碱基n或碱基N是不同的。
本发明所提供的接头序列以及构建文库的方法，可以实现对低至50pg的DNA样本成功建库，适用于制备DNA建库试剂盒、针对疾病的诊断试剂盒的应用。
本发明是在基于Tn5的建库方法中引入了分子标签，用于防止由于PCR扩增偏好性造成的序列变异频率计算的误差，可以对DNA样品特别是微量的DNA样品中的突变频率进行准确的定量分析。
附图说明
图1为本申请接头序列组装的的Tn5转座酶复合体的结构示意图。
图2A、2B为使用Agilent 4200分析本申请所述方法构建的、适用于Illumina测序平台的两个DNA测序文库(图2A为来源于50ng的人DNA起始构建的文库、图2B为来源于50pg的人DNA起始构建的文库)。
图3为本申请测序结果数据统计与全基因组比对分析。
具体实施方式
以下通过具体实例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
Tn5转座酶复合物的制备
使用SEQ ID No.1-SEQ ID No.64所示的序列中的任意一个与SEQ ID No.129所示的序列按等摩尔数组装成支链A，组装过程在PCR仪上进行，程序如下：95℃孵育5min，然后以每秒降低0.1℃的速度降温至60℃并孵育15min，然后以每秒降低0.1℃的速度降温至25℃。
使用SEQ ID No.65-SEQ ID No.128所示的序列与SEQ ID No.129所示的序列按等摩尔数组装成支链B，组装过程在PCR仪上进行，程序如下：95℃孵育5min，然后以每秒降低0.1℃的速度降温至60℃并孵育15min，然后以每秒降低0.1℃的速度降温至25℃。
将支链A和支链B按等摩尔数混合成复合链，取7份体积的复合链与1份体积的Tn5转座酶进行混合，混合方法为25℃下孵育1h，即成Tn5转座酶复合物。参照图1，本发明所述的以两种不同接头序列为基础的Tn5转座酶复合体中，P5端和P7端是兼容Illumina测序平台的两种不同接头序列；NNNNN是5个碱基构成随机碱基，每一个N可以独立地是A、T、C、G中的任意一种。
两端的各3个给定碱基，图1中给出的是GTA和CGA的实例，但是也可以是A、T、C、G中选择三个碱基获得的组合中的其他任意一种组合。
DNA的片段化
步骤1，DNA的随机片段化与接头连接
参照表1，0.1μL的Tn5转座酶复合物、14.3μL的DNA样品、4μL的缓冲液、和1.6μL的PEG8000混合均匀，然后在PCR仪上55℃孵育7min。
缓冲液成分如下：50mM TAPS-NaOH、25mM MgCl2，缓冲液的pH值为8.5。
表1
步骤2，文库的纯化
使用0.9x的Beckman Coulter AMPure XP beads对文库进行纯化。纯化后，取1/5到1/10体积进行PCR扩增。
文库的制备
使用NEB Q5超保真DNA聚合酶对片段化产物进行扩增反应，扩增引物为SEQ IDNo.130、SEQ ID No.131，扩增条件为：72℃孵育3min——98℃孵育30s——(98℃孵育10s——63℃孵育30s——72℃孵育3min)×5个循环(50ng)或16个循环(50pg)。
使用的引物及扩增条件在表3列出：
表3
文库的纯化
使用0.9x的Beckman Coulter AMPure XP beads对文库进行纯化。
文库的质检：
使用Agilent 4200对纯化后的文库进行质检，插入的DNA片段平均大小在100-150bp左右。参照图2A和图2B，本申请获得了源于50ng的人DNA、50pg的人DNA起始构建的文库。
测序及数据分析：
对纯化的文库直接在Illumina HiSeq 4000测序平台上进行测序，测序模式为双端index/PE150，测序结果在图3中列出。结果显示，50ng的人DNA起始构建文库与50pg的人DNA起始构建文库的测序全基因组比对率关联度高，在各个染色体上的分布趋势呈现高度一致的显著性。说明本申请所用的接头序列，能够成功构建低至50pg DNA量的文库，通过本发明所述的文库构建方法进行的测序结果具有可靠的准确性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 远辰生物科技（苏州）有限公司
<120> Illumina二代测序平台文库构建引入分子标签的方法、接头序列及应用
<130> IPI20190115
<160> 135
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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caagcagaag acggcatacg agatnnnnng acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 116
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 117
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 118
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 119
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 120
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 121
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 122
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng ctgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 123
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng ccgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 124
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 125
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 126
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng gtgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 127
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng gcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 128
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng gggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 134
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
aaatcgtcgg cagcgtcaga tgtgtataag agacag 36
<210> 135
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
ggggtctcgt gggctcggag atgtgtataa gagacag 37

Claims (10)

1.一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列，其特征在于，所述接头序列包括：5’-P-E-F-Q-3’，其中，P为测序平台配对序列、E为随机碱基序列、F为给定碱基序列、Q为Tn5转座酶末端识别序列。
2.根据权利要求1所述的接头序列，其特征在于，所述E为5-10个碱基组成的随机碱基序列，所述F为3-5个碱基组成的给定碱基序列。
3.根据权利要求1所述的接头序列，其特征在于，P选自：
1)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC，或
2)CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
4.根据权利要求1所述的接头序列，其特征在于，Q选自：
1)TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，或
2)GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的接头序列，其特征在于，所述5’-P-E-F-Q-3’选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.128中的任意一种或更多种。
6.一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列的设计方法，其特征在于，包括：设计如下两个不同接头序列：
接头序列1：5’-P1-E1-F1-Q1-3’
接头序列2：5’-P2-E2-F2-Q2-3’
其中，P1、P2为如权利要求1所述的测序平台配对序列、E1、E2为如权利要求1所述的随机碱基序列、F1、F2为如权利要求1所述的既定碱基序列、Q1、Q2为如权利要求1所述的Tn5转座酶末端识别序列。
7.根据权利要求6所述的设计方法，其特征在于，在一种优选实施例中，所述5’-P1-E1-F1-Q1-3’选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.64中的任意一种或更多种；所述5’-P2-E2-F2-Q2-3’选自SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.128中的任意一种或更多种。
8.一种适用于Illumina二代测序平台的文库构建中引入分子标签方法，其特征在于，包括：
采用权利要求6所述接头序列1、所述接头序列2组装Tn5转座酶复合体；
使用组装后的Tn5转座酶复合体对DNA样本进行打断；打断的DNA分子两边分别标记E1-F1、E2-F2；
对打断后的DNA片段进行PCR扩增，纯化扩增产物。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述适用于Illumina二代测序平台的文库构建的接头序列5’-P-E-F-Q-3’。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括序列：
5’-Phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’，和/或：
5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’、5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251422A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 华中农业大学 含独特分子标签序列的转座酶复合体及其应用
CN113005121A (zh) * 2021-04-25 2021-06-22 纳昂达(南京)生物科技有限公司 接头元件、试剂盒及其相关应用
CN117844933A (zh) * 2024-03-07 2024-04-09 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103938277A (zh) * 2014-04-18 2014-07-23 中国科学院北京基因组研究所 以痕量dna为基础的二代测序文库构建方法
CN105525357A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 深圳华大基因股份有限公司 一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用
CN107747134A (zh) * 2017-10-20 2018-03-02 重庆天科雅生物科技有限公司 一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法
CN108866051A (zh) * 2018-06-19 2018-11-23 上海锐翌生物科技有限公司 扩增子测序文库及其构建方法
CN109321567A (zh) * 2018-10-10 2019-02-12 菲鹏生物股份有限公司 测序用dna文库试剂盒以及测序用dna文库构建方法
CN109576347A (zh) * 2018-12-06 2019-04-05 深圳海普洛斯医疗器械有限公司 含单分子标签的测序接头和测序文库的构建方法
JP2019110840A (ja) * 2017-12-25 2019-07-11 トヨタ自動車株式会社 次世代シーケンサー用プライマー並びにその製造方法、次世代シーケンサー用プライマーを用いたｄｎａライブラリー並びにその製造方法、及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103938277A (zh) * 2014-04-18 2014-07-23 中国科学院北京基因组研究所 以痕量dna为基础的二代测序文库构建方法
CN105525357A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 深圳华大基因股份有限公司 一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用
CN107747134A (zh) * 2017-10-20 2018-03-02 重庆天科雅生物科技有限公司 一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法
JP2019110840A (ja) * 2017-12-25 2019-07-11 トヨタ自動車株式会社 次世代シーケンサー用プライマー並びにその製造方法、次世代シーケンサー用プライマーを用いたｄｎａライブラリー並びにその製造方法、及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
CN108866051A (zh) * 2018-06-19 2018-11-23 上海锐翌生物科技有限公司 扩增子测序文库及其构建方法
CN109321567A (zh) * 2018-10-10 2019-02-12 菲鹏生物股份有限公司 测序用dna文库试剂盒以及测序用dna文库构建方法
CN109576347A (zh) * 2018-12-06 2019-04-05 深圳海普洛斯医疗器械有限公司 含单分子标签的测序接头和测序文库的构建方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251422A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 华中农业大学 含独特分子标签序列的转座酶复合体及其应用
CN112251422B (zh) * 2020-10-21 2024-04-19 华中农业大学 含独特分子标签序列的转座酶复合体及其应用
CN113005121A (zh) * 2021-04-25 2021-06-22 纳昂达(南京)生物科技有限公司 接头元件、试剂盒及其相关应用
CN113005121B (zh) * 2021-04-25 2022-12-06 纳昂达(南京)生物科技有限公司 接头元件、试剂盒及其相关应用
CN117844933A (zh) * 2024-03-07 2024-04-09 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途
CN117844933B (zh) * 2024-03-07 2024-06-11 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途

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