WO2018112806A1 - 将线性测序文库转换为环状测序文库的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了将线性测序文库转换为环状测序文库的方法。其中,该方法包括以下步骤:利用正向接头引物和反向接头引物将线性测序文库进行PCR扩增,以便获得扩增产物;将所述扩增产物进行热变性处理,以便获得单链DNA混合物;将所述单链DNA混合物进行环化处理,以便获得环状DNA产物,所述环状DNA产物构成所述环状测序文库,其中,正向接头引物与所述线性测序文库的正向接头的至少部分序列互补配对,反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5'端核苷酸经过磷酸化修饰。
Description
优先权信息
无
本发明涉及文库构建和测序技术领域,具体地,涉及将线性测序文库转换为环状测序文库的方法。
对于一些商业项目,样品珍稀,样本量少,仅有已经构建好的文库样本,当因项目需求要转换测序平台时,由于样品含量少而无法直接利用剩余样品构建新的测序文库,而已构建好的文库样本也无法直接用于与其完全不同的目的测序平台。
而怎样将Illumina、Proton线性的测序文库转换为文库转换为环状测序文库而适用其它测序平台,如BGISEQ-500,目前尚无成熟的解决方案。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于,提供一种将已有的线性文库有效转换为环状测序文库的手段。
需要说明的是,本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的:
目前,已有较多商业或研究机构开始普遍使用BGISEQ-500代替Hiseq 2000/Hiseq 4000。而实践中常见珍贵稀有的样品或者单细胞样品,其已有Illumina或Proton文库,但样品余量不足以进行二次建库,无法采用BGISEQ-500常规建库技术获取标准的BGISEQ-500文库(现有的微量和常规建库方案均不适用);另一方面10X Genomics公司高通量单细胞文库制备仪器制备的单细胞Illumina文库无法与BGISEQ-500兼容,因此,目前急需相应文库进行测序平台转换的技术方案。
针对上述两种情况,发明人经过了一系列研究和探索,开发了一套特定的磷酸化修饰引物及反应体系,采用该体系能够使dsDNA线性测序文库(如Illumina或Proton文库)快速转换成环状测序文库(如BGISEQ-500文库),转换后文库可以直接在环状文库测序平台上进行测序。并且,本发明不仅可以适用于珍贵稀有样品文库转换,还适用于高通量Illumina文库转换。
进而,在本发明的一个方面,本发明提供了一种将线性测序文库转换为环状测序文库的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:利用正向接头引物和反向接头引物将线性测序文库进行PCR扩增,以便获得扩增产物;将所述扩增产物进行热变性处理,以便获得单链DNA混合物;将所述单链DNA混合物进行环化处理,以便获得环状DNA产物,所述环状DNA产物构成所述环状测序文库,其中,所述正向接头引物与所述线性测序
文库的正向接头的至少部分序列互补配对,所述反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,并且,所述正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰,所述环化处理采用环化引物进行,所述环化引物的5‘端和3’端分别与所述正向接头引物5’端、所述反向接头引物的3’端部分序列互补配对。
发明人惊奇地发现,利用该方法,能够使dsDNA线性文库快速转换成环状测序文库,转换后文库可以直接用于测序。并且,本发明尤其适用于Illumina文库和Proton文库的转换,其中,对于不同的线性测序文库,只需按照本发明的方法,使的正向接头引物和反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰,并使环化引物的5‘端和3’端分别与该正向接头引物5’端、反向接头引物的3’端部分序列互补配对即可。并且,针对转换获得的环状测序文库(如BGISEQ-500文库),只要采用与接头部分序列相同或互补的线性测序引物,即可有效地实现测序。
在本发明的另一方面,本发明还提供了一种确定线性测序文库的DNA序列的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:根据前面所述的将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,将所述线性测序文库转换为环状测序文库;以及利用所述环状测序文库对应的测序平台对所述环状测序文库进行测序,以便确定所述线性测序文库的DNA序列。由此,能够有效实现将线性测序文库用于环状文库测序平台(如BGISEQ-500测序平台)的目的。并且,测序结果准确、可靠,重复性好。
此外,需要说明的是,本发明具有下列优点的至少之一:
(1)本发明技术方案能够快速、高效的将双链线性DNA文库尤其是Illumina文库、Ion Proton文库转换成环状测序文库(如BGISEQ-500文库),且操作简单,测序结果稳定,整个文库转换过程可在5小时内完成,适合起始量为纳克级(1-100ng)和微克级的文库转换,极大地促进了环状测序文库类测序仪如BGISEQ500基因测序仪的应用和整体测序速度。
(2)本发明可推进高通量文库制备系统10X Genomics公司和GemCodeTM仪器和BGISEQ-500测序平台的联用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明的实施例,BGISEQ-500平台和Illumina平台测序的H1975细胞系基因表达数量检测结果;
图2显示了根据本发明的实施例,基于BGISEQ500平台测序的H1975Tn5文库大片段CNV检测结果;
图3显示了根据本发明的实施例,依据本发明的方法将Illumina文库转换为BGISEQ-500测序平台的技术原理示意图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
为方便理解,下面先对BGISEQ-500测序技术进行简单介绍。
BGISEQ-500是华大基因研发的新一代基因测序仪,其通过滚环扩增技术(Rolling circle amplification,RCA)将单链环状DNA文库扩增2-3个数量级,形成DNA纳米球(DNA nanoball,DNB),最终纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上,联合探针锚定聚合技术(cPAS)测序。与其他二代测序技术相比较,该测序技术具有能够降低扩增错误率、提高芯片利用率等优点。
目前的BGISEQ-500测序平台,主要可以采用两种常规建库技术获取标准的BGISEQ-500文库:
(1)1微克起始的常规BGISEQ-500文库构建技术
该技术采用常规超声打断技术实现DNA片段化,片段化的DNA经过磁珠筛选后,使用末端修复酶进行末端修复和加“A”处理,后在片段化的DNA两段加上接头序列,一侧接头采用磷酸化修饰,将双链变性后,磷酸化修饰的那一条单链能够在外源单链DNA模板的帮助下,自身发生环化,形成ssDNA,环化后的产物经过核酸外切酶处理,去除ssDNA中的dsDNA。消化的产物经过磁珠纯化获得较为干净ssDNA文库。
(2)微量起始的BGISEQ-500文库构建技术
该技术采用TN5转座酶实现纳克级DNA片段化,片段化的DNA直接通过PCR加上接头序列,一侧接头采用磷酸化修饰,将双链变性后,磷酸化修饰的那一条单链能够在外源单链DNA模板的帮助下,自身发生环化,形成ssDNA,环化后的产物经过核酸外切酶处理,去除ssDNA中的dsDNA。消化的产物经过磁珠纯化获得较为干净ssDNA文库。
Illumina的基因测序仪作为目前最广泛应用的基因测序仪,是通过桥式PCR扩增形成DNA clusters,每个cluster约有1000-6000拷贝的相同DNA模板,并结合微阵列技术和专有的可逆终止子技术对DNA clusters进行大规模平行的边合成边测序。
针对两类测序仪的技术差异和文库构建特点,发明人研究发现,针对Illumina文库或Proton文库等dsDNA文库,采用特定的正向接头引物和反向接头引物(所述正向接头引物与所述线性测序文库的正向接头的至少部分序列互补配对,所述反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,且所述正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰)进行PCR扩增,并将扩增产物进行热变性处理,然后采用特定的环化引物(所述环化引物的5‘端和3’端分别与所述正向接头引物5’端、所述反向接头引物的3’端部分序列互补配对)将单链DNA进行环化处理,即可成功地使dsDNA文库快速转换成BGISEQ-500ssDNA文库,进而转换获得的BGISEQ-500测序文库能够有效用于BGISEQ-500平台进行测序。简言之,本发明通过5’磷酸化修饰的接头引物进行PCR扩增,使Illumina双链DNA文库的5’端碱基获得磷酸化修饰,后经过热变性,
磷酸化修饰的正义单链DNA在借助外源单链DNA模板而使自身环化成ssDNA,从而转换为BGISEQ-500测序文库,进而,通过设计特殊测序引物,即可将该转换获得的文库用于BGISEQ-500测序。
进而,在本发明的一个方面,本发明提供了一种将线性测序文库转换为环状测序文库的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:利用正向接头引物和反向接头引物将线性测序文库进行PCR扩增,以便获得扩增产物;将所述扩增产物进行热变性处理,以便获得单链DNA混合物;将所述单链DNA混合物进行环化处理,以便获得环状DNA产物,所述环状DNA产物构成所述环状测序文库,其中,所述正向接头引物与所述线性测序文库的正向接头的至少部分序列互补配对,所述反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,并且,所述正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰,所述环化处理采用环化引物进行,所述环化引物的5‘端和3’端分别与所述正向接头引物5’端、所述反向接头引物的3’端部分序列互补配对。
发明人惊奇地发现,利用该方法,能够使dsDNA线性文库快速转换成ssDNA环状文库(例如BGISEQ-500测序文库),转换后文库可以直接在相应的环状测序文库的测序平台上测序。并且,本发明尤其适用于Illumina文库和Proton文库的转换,其中,对于不同的线性测序文库,只需按照本发明的方法,将正向接头引物和反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸进行磷酸化修饰,并使环化引物的5‘端和3’端分别与该正向接头引物5’端、反向接头引物的3’端部分序列互补配对即可。并且,针对转换获得的环状测序文库,只要采用与已知的线性测序文库的相同的测序引物,即可有效地利用环状测序文库的测序平台进行测序。
如前所述,本发明的将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,适用于双链DNA文库,且尤其适用于Illumina测序文库、Ion Protona测序文库的转换。因而,根据本发明的实施例,所述线性测序文库为Illumina测序文库或Ion Protona测序文库。且根据本发明的实施例,所述环状测序文库为BGISEQ-500文库。
根据本发明的实施例,在PCR扩增之后,热变性处理之前,进一步包括:将所述扩增产物进行片段选择和纯化的步骤。由此,最终获得的环状测序文库质量好。
根据本发明的实施例,在95摄氏度下进行所述热变性处理3分钟。由此,热变性处理效果好,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,利用T4DNA连接酶进行所述环化处理。由此,环化处理效果好。
根据本发明的实施例,在所述环化处理中,所述单链DNA混合物与所述环化引物的比例为1:10。由此,环化处理效果好,获得的环状测序文库质量高。
根据本发明的实施例,进一步包括:将所述环状DNA产物依次进行消化处理和纯化处理的步骤。由此,获得的BGISEQ-500测序文库纯度高、质量好,用于测序后结果准确可靠。
根据本发明的一些具体示例,所述线性测序文库为Illumina测序文库,所述正向接头引物的序列如SEQ ID NO:1所示:5’-PhosAATGATACGGCGACCACCGA-3’,所述反向接头
引物的序列如SEQ ID NO:2所示:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’,所述环化引物的序列如SEQ ID NO:3所示:5’-GCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3’。由此,能够有效将Illumina测序文库转换为环状测序文库(如BGISEQ-500测序文库),进而,将环状测序文库用于对应的测序平台(如BGISEQ-500测序平台),能够有效实现测序、确定原Illumina测序文库的DNA序列。并且,针对Proton文库进行文库转化时,本领域技术人员只需要依据前述的本发明的方法进行,并依据Ion Proton文库序列以及正、反向接头,对正向接头引物、反向接头引物、环化引物和测序引物进行相应调整即可。
在本发明的另一方面,本发明还提供了一种确定线性测序文库的DNA序列的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:根据前面所述的将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,将所述线性测序文库转换为环状测序文库;以及利用所述环状测序文库对应的测序平台对所述环状测序文库进行测序,以便确定所述线性测序文库的DNA序列。由此,能够有效实现将线性测序文库用于环状测序文库的测序平台(如BGISEQ-500测序平台)的目的。并且,测序结果准确、可靠,重复性好。
根据本发明的实施例,所述测序采用测序引物进行,所述测序引物与接头部分序列相同或互补配对。
根据本发明的实施例,当利用SEQ ID NO:1-3所示的接头引物和环化引物,按照前述方法将Illumina测序文库转换为环状测序文库——BGISEQ-500测序文库,并将该BGISEQ-500测序文库应用于BGISEQ-500进行测序时,测序引物可以与该Illumina测序文库的测序引物一致。具体地,根据本发明的实施例,所述测序引物的序列如下:
正向引物如SEQ ID NO:4所示:5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC,
反向引物如SEQ ID NO:5所示:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA。
由此,能够有效地进行测序,从而实现利用BGISEQ-500测序平台确定线性测序文库的DNA序列的目的。并且,测序结果准确、可靠、重复性好。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
一般方法:
根据本发明的实施例,本发明的将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,一般可以采用以下步骤进行:
利用正向接头引物和反向接头引物将线性测序文库进行PCR扩增,以便获得扩增产物;
将所述扩增产物进行热变性处理,以便获得单链DNA混合物;
将所述单链DNA混合物进行环化处理,以便获得环状DNA产物,所述环状DNA产
物构成所述环状测序文库,
其中,
所述正向接头引物与所述线性测序文库的正向接头的至少部分序列互补配对,所述反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,并且,所述正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰,
所述环化处理采用环化引物进行,所述环化引物的5‘端和3’端分别与所述正向接头引物5’端、所述反向接头引物的3’端部分序列互补配对。
实施例1:
本实施例以Illumina文库(样本为一肺癌H1975细胞系的Illumina文库)为例,利用本发明的方法将线性测序文库转换为环状测序文库(BGISEQ-500测序文库)并测序,具体步骤如下:
1、接头转换PCR扩增
a)将灭菌PCR管置于冰浴中,依次添加各反应组分:
正向接头引物的序列:5’-PhosAATGATACGGCGACCACCGA-3’(SEQ ID NO:1),
反向接头引物的序列:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO:2)。
b)使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
c)将PCR管置于PCR仪中,设置如下反应程序(Hot lid:105℃):
2、扩增产物片段选择.
每个样品使用0.8X+0.2X Agencourt AMPure XP beads,进行选择性纯化。
a)起始PCR产物体积应为50ul。因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50ul,
进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至50ul,否则分选长度会与预期不一致。
b)涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取40ul体积至50ul PCR产物中,使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育10分钟。
c)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心转移上清至干净EP管中,丢弃磁珠。
d)涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取10ul体积至上清中,使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
e)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心移除上清。
f)保持EP管始终处于磁力架中,加入200ul新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清。
g)重复上步,总计漂洗两次。
h)保持EP管始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠10分钟。
i)将EP管从磁力架中取出,加入25ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心吸取上清至灭菌EP管中,于-20℃保存。
注意:如需获得长度分布更集中的文库,扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化。如果PCR后产物浓度偏低,可适当减少步骤i)中的洗脱体积。
3、扩增产物QC质量标准与评估
质量指标名称 | 质量指标 | 测量方法 |
片段大小 | 300bp±100bp | Agilent 2100 |
质量浓度 | >3.5ng/μl | QPCR |
4、Pooling
a)按照DNA mix总量390ng pooling,根据样品pooling基数,确定每个样品的pooling体积;
b)目前pooling基数只能是8的倍数,8*N个样品测1条lane则pooling基数为8*N,INDEX目前只有48种(建库Pooling的时候,同一个文库必须是一组8个成套的(或者8的倍数)Barcode Pooling在一起,保证碱基平衡。如果是非成套的会造成测序的时候Barcode测序部分碱基不平衡,测序质量较差,影响Barcode拆分。)
c)换算方法:例如,16个样品pool成1个文库,每个样品应取得总量为390/16=24.375ng,样品1的浓度为5ng/ul,则样品1对应的体积为24.375ng/(5ng/ul)=4.875ul;样品2按照此方法计算;
d)Pool好的DNA mix可以冻存到-20℃备用。
注意事项:如果上一步PCR产物双选后浓度在1.0ng/ul~2.0ng/ul,按照390ng总量DNA
pooling后的DNA mix体积大于96ul,pooling之后的样品应该采用1.6*XP磁珠纯化,采用40ul NF H2O回溶解,再按后续体系继续实验。
5、ssDNA热变性处理、环化
a)按照以下配方准备试剂
环化引物的序列:5’-GCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3’(SEQ ID NO:3)。
b)按照以下程序设置参数,进行热变性处理:
c)ssDNA环化,将上述PCR管置于冰浴中,依次添加各反应组分:
d)配制好上述反应液后,vortex,轻甩5s;37℃孵育1h,4℃hold;连接后产物取1ul测dsDNA浓度;
6、EXO消化
a)将步骤5反应液置于冰浴中,依次添加各反应组分:
b)配制好上述反应液后,vortex,轻甩5s;37℃孵育30min,4℃hold;酶切
后产物取1ul测dsDNA浓度和ssDNA浓度,确定dsDNA酶切效果。
7、磁珠纯化
a)取170ul PEG32beads,加入到上述反应液,涡旋震荡混匀,室温孵育10分钟;
b)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟),小心移除上清;
c)保持EP管始终处于磁力架中,加入200ul新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清;
d)重复上步,总计漂洗两次;
e)保持EP管始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠10分钟;
f)将EP管从磁力架中取出,加入25ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心吸取上清至灭菌EP管中,于-20℃保存;
g)纯化后产物取1ul测ssDNA浓度。
纯化产物即为BGISEQ500测序文库。
8、质量标准与评估
质量指标名称 | 质量指标 | 测量方法 |
片段大小 | 300bp±100bp | Agilent 2100 |
浓度 | >1.5ng/ul | QPCR |
9、测序和结果分析
针对上述获得的BGISEQ500测序文库,使用BGISEQ500测序平台测10M reads。
其中,采用如下测序引物进行测序:
正向引物:5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC(SEQ ID NO:4),
反向引物:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA(SEQ ID NO:5)。
数据下机后,使用onhouse pipleline将下机数据过滤,进而使用tophat比对把fq转为bam,并把比对reads比对到基因上,用使用edgeR计算表达量(结果见图1,其中,BGISEQ-500测序类型:SE50,Illumina平台测序类型:PE100);使用bwa比对把fq转为bam,samtools去重,onhouse pipleline选取unique,和计算CNV(结果见图2)。其中,实验采用转换前的Illumina文库的Illumina测序结果作为对照。
针对图1,其上方的柱状图中,横坐标:H1975-1表示单细胞起始的测序结果;H1975-5表示5个细胞起始的测序结果;BGI表示BGISEQ-500平台测序,Hiseq表示Illumina平台测序。纵坐标表示转录组测序结果经下游信息分析后,检测到的基因数量。
图1下方的表格中,横坐标表示检测到的基因数量,纵坐标表示基因的丰度。
其中,RPKM是Reads Per Kilobases per Millionreads的缩写,代表每百万reads中来自
于某基因每千碱基长度的reads数,将map到基因的read数除以map到基因组上的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。RPKM在二代测序技术中用来表示基因表达量或丰富的指标。通常认为RPKM>1的基因表达量比较丰富,检测到RPKM>1的基因的数量是比较可信的;RPKM<1或者<0.1的基因丰度较低,检测到的0<RPKM<0.1的基因通常认为可信度稍差。
针对图2,横坐标表示染色体序列号,纵坐标表示检测到DNA上面的大片段拷贝数变异(倍增或者缺失)
基于图2可知:
1、采用BGISEQ-500平台测序的测序结果能检测到大片段CNV;
2、单细胞和5个cell mix的CNV结果大部分一致,在少数染色体上CNV(1p,3p,11q上)单细胞的结果和cell mix存在差异,正好说明了肿瘤细胞的异质性。
进一步,根据以上技术方案,以10ng单细胞H1975DNA和RNA文库(Illumina文库)为模板制备BGISEQ500测序文库,终产物ssDNA纯化后,20ul NF H2O回溶。然后,同样采用转换前的Illumina文库的Illumina测序结果作为对照,使用BGISEQ500测序平台将获得的BGISEQ500测序文库测10M reads,数据下机后,使用onhouse pipleline将下机数据过滤,使用tophat比对把fq转为bam,并把比对reads比对到基因上,用使用edgeR计算表达量;使用bwa比对把fq转为bam,samtools去重,onhouse pipleline选取unique,和计算CNV。结果显示,转化获得的BGISEQ500测序文库的测序结果可靠。
本发明的将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,能够使dsDNA线性文库尤其是Illumina文库和Proton文库快速转换成ssDNA环状测序文库(如BGISEQ-500文库),转换后文库可以直接在环状测序文库对应的测序平台上测序。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
Claims (11)
- 一种将线性测序文库转换为环状测序文库的方法,其特征在于,包括以下步骤:利用正向接头引物和反向接头引物将线性测序文库进行PCR扩增,以便获得扩增产物;将所述扩增产物进行热变性处理,以便获得单链DNA混合物;将所述单链DNA混合物进行环化处理,以便获得环状DNA产物,所述环状DNA产物构成所述环状测序文库,其中,所述正向接头引物与所述线性测序文库的正向接头的至少部分序列互补配对,所述反向接头引物与所述线性测序文库的反向接头的至少部分序列互补配对,并且,所述正向接头引物和所述反向接头引物的至少之一的5’端核苷酸经过磷酸化修饰,所述环化处理采用环化引物进行,所述环化引物的5‘端和3’端分别与所述正向接头引物5’端、所述反向接头引物的3’端部分序列互补配对。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述线性测序文库为Illumina测序文库或Ion Protona测序文库,所述环状测序文库为BGISEQ-500文库。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在PCR扩增之后,热变性处理之前,进一步包括:将所述扩增产物进行片段选择和纯化的步骤。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在95摄氏度下进行所述热变性处理3分钟。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,利用T4 DNA连接酶进行所述环化处理。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述环化处理中,所述单链DNA混合物与所述环化引物的比例为1:10。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进一步包括:将所述环状DNA产物依次进行消化处理和纯化处理的步骤。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述线性测序文库为Illumina测序文库,所述正向接头引物的序列如SEQ ID NO:1所示:5’-PhosAATGATACGGCGACCACCGA-3’,所述反向接头引物的序列如SEQ ID NO:2所示:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’,所述环化引物的序列如SEQ ID NO:3所示:5’-GCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3’。
- 一种确定线性测序文库的DNA序列的方法,其特征在于,包括以下步骤:根据权利要求1-8任一项所述的方法,将所述线性测序文库转换为环状测序文库;以及利用所述环状测序文库对应的测序平台对所述环状测序文库进行测序,以便确定所述线性测序文库的DNA序列。
- 根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述测序采用测序引物进行,所述测序引物与接头部分序列相同或互补配对。
- 根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述测序引物的序列如下:正向引物如SEQ ID NO:4所示:5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC,反向引物如SEQ ID NO:5所示:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA。
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