CN112289378A - 中药组合物的确定方法以及其药效的确定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药组合物领域，特别涉及中药组合物的确定方法以及其药效的确定方法。本发明以逆转疾病状态的全部失调信号通路为原则，得到的中药组合，认为是可治疗此疾病的潜在组方。通过中药组合逆转失调通路的程度，可以评价不同中药组合的疗效。本发明首次基于信号通路的富集情况，给出了中药组方设计和药效评价方法，本发明可以定量化，使中药组方的效果看得见、说得清，为中医药领域组方提供了新的现代化的方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药组合物领域，特别涉及中药组合物的确定方法以及其药效的确定方法。
背景技术
传统中药配伍主要是通过望闻问切、辨证论治后，再结合中药的药理药性给予开方。且中药配伍多参考古代经方，这样的中药组合来源于数千年的经验，可是难以如西医一般给予科学解释，也难以统一标准。因此需要用一种基于现代科学技术的方法来指导中医的开放。
细胞内各种不同的生理生化反应途径都是由一系列不同的蛋白组成的，执行着不同的生理生化功能。信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列生物反应通路。每条信号通路包括不同的蛋白，代表某种生物学过程，它是高于基因的一个概念。常见的信号通路如NF-κB通路、JAK-STAT通路等。在疾病状态下，机体存在着信号通路的紊乱，通过逆转这些失调的信号通路，有助于改善疾病状态，达到治疗的目的。
转录组是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物，特别是mRNA的集合。随着生物芯片和二代测序技术的发展，获取疾病状态或药物作用后的转录组信息越来越容易。而获得转录信息后，可以进行基因富集分析，富集是指将基因按照先验知识，也就是基因组注释信息进行分类。通过信号通路的富集分析可以得到疾病状态或药物作用后的通路变化情况。
目前，中药组方基于中医的辨证论治、中药的药理药性并以经方为指导，属于经验科学，缺乏科学指导。不同中药组方的疗效难于定量评价。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种科学的中药组方确定和药效确定方法。技术核心是以逆转疾病状态的全部失调信号通路为原则，得到的中药组合，认为是可治疗此疾病的潜在组方。通过中药组合逆转失调通路的程度，可以评价不同中药组合的疗效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了中药组合物的确定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得疾病状态下的转录组数据，经基因集富集分析，获得与疾病相关的失调通路的标准化富集得分；
步骤2：测试待测中药的提取物的活性，获得所述待测中药作用后的转录组数据，以溶剂对照处理组为基础，所述待测中药的提取物处理组的基因变化倍数≥预设变化率，基因表达显著上调或下调；
步骤3：采用GSEA进行信号通路的富集分析，获得所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分；
步骤4：中药组合物的标准化富集得分为单味所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分的总和；
步骤5：选择逆转所述失调通路的所述待测中药，获得中药组合物。
在本发明中，所述基因集富集分析采用GSEA进行信号通路的富集分析，得到每种中药在每条通路上的失调情况。其中FDR<0.25被认为是显著富集，NES为正表示中药作用的基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病可以为急性疾病(如感染性疾病，新型冠状病毒感染)，也可以为慢性疾病(如肝功能不全、肾纤维化)；所述疾病可以涉及神经系统、消化系统(如肝功能不全)、循环系统、呼吸系统(如新型冠状病毒感染)、泌尿生殖系统(如肾纤维化)、骨骼肌肉系统、血液系统、内分泌系统、皮肤和附属器、代谢性疾病、风湿性疾病。
在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病包括但不限于：
在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒感染疾病、肝功能不全或肾纤维化。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述失调通路为公认的细胞信号通路，例如KEGG数据库中涉及代谢、遗传信息处理、环境处理、细胞内过程、器官系统、人体疾病、药物开发等各个方面的300余条信号通路。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述失调通路包括但不限于：
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述转录组数据的检测方法为RNA-seq，所用平台为IlluminaNextseq-500；所述失调通路包括甲流、乙肝、丙肝、埃博拉病毒感染中的一条或多条通路。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述“获得所述待测中药作用后的转录组数据”具体为：
步骤2-1：利用90％RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗作为THP1细胞的完全培养基，4000细胞/孔铺板于384孔板，同时加入100ng/mL PMA诱导细胞贴壁，37℃培养箱培养48h；
步骤2-2：分别利用不同的中药提取物，以100μg/mL浓度处理诱导的THP1细胞24小时；
步骤2-3：细胞裂解，-80℃保存等待进行后续实验；
步骤2-4：细胞裂解液中加入基因特异性探针对，65℃使RNA变性8min，45℃孵育1h，使得探针对能够退火与RNA模板结合在一起；37℃孵育1h，使得探针对能够在T4连接酶作用下被连接起来；
步骤2-5：65℃孵育10min，将连接成功的探针洗脱，利用PCR技术进行扩增和建库测序，获得所述待测中药作用后的转录组数据；
步骤2中所述预设变化率为1.5倍。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中对基因表达变化倍数分析，采用DEseq2方法，得到基因的表达变化倍数。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4具体为：采用穷举的方式列举所有的中药组合，可以得到N味药中药组合，中药组合在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如，中药组合物X包含三味中药，分别是中药1、中药2、中药3，则通路1的中药组合物X的NES值＝中药1的NES值+中药2的NES值+中药3的NES值。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5之后还包括根据所述标准化富集得分的总和的大小，获得所述中药组合物的药效；所述标准化富集得分的总和与药效成正比。
在本发明的一些具体实施方案中，由于新冠病毒感染的疾病状态下11条通路的NES均为正，则所有使得11条通路的NES均为负的中药组合被认为可以治疗新冠病毒感染。
例如：
一味药：桂枝自身就可逆转全部11条通路，每条通路上NES均为负。
两味药：大黄和艾叶，通过组合能够实现对11条通路的全逆转。
三味药：白扁豆、红景天、桑枝，通过组合能够实现对11条通路的全逆转。
在本发明的一些具体实施方案中，所述待测中药包括桂枝、大黄、艾叶、白扁豆、红景天、桑枝中的一种或两者以上组合物。
在上述研究的基础上，本发明提供了治疗新冠病毒感染疾病的中药组合物，包括桂枝、大黄、艾叶、白扁豆、红景天、桑枝中的一种或两者以上组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述中药组合物包括如下组合：
组合一：桂枝；或
组合二：大黄和艾叶；或
组合三：白扁豆、红景天和桑枝。
此外，本发明还提供了所述的中药组合物在制备治疗新冠病毒感染疾病的药物中的应用。
本发明还提供了中药组合物的药效的确定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得疾病状态下的转录组数据，经基因集富集分析，获得与疾病相关的失调通路的标准化富集得分；
步骤2：测试待测中药的提取物的活性，获得所述待测中药作用后的转录组数据，以溶剂对照处理组为基础，所述待测中药的提取物处理组的基因变化倍数≥预设变化率，基因表达显著上调或下调；
步骤3：采用GSEA进行信号通路的富集分析，获得所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分；
步骤4：中药组合物的标准化富集得分为单味所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分的总和；
步骤5：根据所述标准化富集得分的总和的大小，获得所述中药组合物的药效；所述标准化富集得分的总和与药效成正比。
在本发明中，所述基因集富集分析采用GSEA进行信号通路的富集分析，得到每种中药在每条通路上的失调情况。其中FDR<0.25被认为是显著富集，NES为正表示中药作用的基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病可以为急性疾病(如感染性疾病，新型冠状病毒感染)，也可以为慢性疾病(如肝功能不全、肾纤维化)；所述疾病可以涉及神经系统、消化系统(如肝功能不全)、循环系统、呼吸系统(如新型冠状病毒感染)、泌尿生殖系统(如肾纤维化)、骨骼肌肉系统、血液系统、内分泌系统、皮肤和附属器、代谢性疾病、风湿性疾病。
在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒感染疾病、肝功能不全、肾纤维化。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述失调通路为公认的细胞信号通路，例如KEGG数据库中涉及代谢、遗传信息处理、环境处理、细胞内过程、器官系统、人体疾病、药物开发等各个方面的300余条信号通路。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中对基因表达变化倍数分析，采用DEseq2方法，得到基因的表达变化倍数。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4具体为：采用穷举的方式列举所有的中药组合，可以得到N味药中药组合，中药组合在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如，中药组合物X包含三味中药，分别是中药1、中药2、中药3，则通路1的中药组合物X的NES值＝中药1的NES值+中药2的NES值+中药3的NES值。
在本发明的一些具体实施方案中，由于新冠病毒感染的疾病状态下11条通路的NES均为正，则所有使得11条通路的NES均为负的中药组合被认为可以治疗新冠病毒感染，因此，湿热蕴肺方、内闭外脱方安宫牛黄丸、湿毒郁肺方、疫毒闭肺方、疏风解毒胶囊、清肺排毒方均符合此要求，我们认为治疗效果好。且从NES值定量的看，清肺排毒汤最优。
本发明中，将疾病状态下的转录组数据进行信号通路富集，其中疾病状态可以是患者的组织样品，可以是疾病动物模型，也可以是体外细胞模型；转录组可以来源于二代测序、基因芯片、蛋白质组、甚至是实时定量PCR、以及公共数据库或文献中提供的所得的全部或部分基因表达数据；信号通路富集方法可以是来自生物信息学分析软件或R包。
本发明中，对中药作用后的转录组数据也进行信号通路富集，其中中药作用后的转录组数据可以是人体服用中药后的组织样品，可以是中药作用于动物模型，也可以是中药粗提物作用于体外细胞。
本发明中，以所得的每条通路方向为基准，认为逆转此通路方向的中药为具有治疗效果的药物，通过叠加中药，使得所有通路得以逆转，以此得到中药组合。
本发明中，该中药组合在所有通路上的逆转程度给予量化，以此可以比较不同中药组合的疗效，进行优劣评价。
本发明中，“疾病状态”也可扩展至任何生理状态的异常，而不局限于明确诊断的疾病。
本发明中，本发明适合于中药组方和疗效评价，也适用于其他西药、天然产物的组合开发。
本发明以逆转疾病状态的全部失调信号通路为原则，得到的中药组合，认为是可治疗此疾病的潜在组方。通过中药组合逆转失调通路的程度，可以评价不同中药组合的疗效。本发明首次基于信号通路的富集情况，给出了中药组方设计和药效评价方法，本发明可以定量化，使中药组方的效果看得见、说得清，为中医药领域组方提供了新的现代化的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示中药组合物的通路计算；
图2示桂枝对通路的调控；
图3示大黄、艾叶及其组合对通路的调控；
图4示白扁豆、红景天、桑枝及其组合对通路的调控；
图5示22个方剂或成药对通路的调控。
具体实施方式
本发明公开了一种中药组合物的确定方法以及其药效的确定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的中药组合物的确定方法以及其药效的确定方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1治疗新型冠状病毒感染的中药组合
1、获取新冠病毒感染的疾病状态数据
在NCBI官网GEO数据库检索公开发表的新冠病毒感染数据，其中GSE147507包含新冠病毒感染Calu-3细胞系后的转录数据，检测方法为RNA-seq，所用平台为IlluminaNextseq-500。在KEGG通路数据库中，在“Infectious disease：viral”部分，总共有11条和病毒感染相关的通路，例如甲流、乙肝、丙肝、艾滋病毒感染等。
对GSE147507数据进行基因表达变化倍数分析，采用DEseq2方法，得到基因的表达变化倍数。采用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)进行信号通路的富集分析，得到疾病状态在11条通路上的失调情况。其中FDR<0.25被认为是显著富集，11条通路均被显著富集。标准化富集得分(Normalized enrichment score，NES)可以表征该通路的失调方向，NES为正表示基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
表1新冠病毒感染的疾病状态通路富集结果
2、利用HTS2(基于高通量测序的高通量筛选)技术，检测《中国药典》(2015版本)578种中药提取物在THP-1人急性单核细胞白血病细胞诱导的巨噬细胞后，3000多个特征基因表达的影响，具体实验过程为：
①利用90％RPMI1640培养基+10％FBS+1％双抗作为THP1细胞的完全培养基，4000细胞/孔铺板于384孔板，同时加入100ng/mL PMA诱导细胞贴壁，37度培养箱培养48h。
②分别利用不同的中药提取物，以100μg/mL浓度处理诱导的THP1细胞24小时。
③细胞裂解，-80℃保存等待进行后续实验。
④细胞裂解液中加入基因特异性探针对，65℃使RNA变性8min，45℃孵育1h，使得探针对能够退火与RNA模板结合在一起。37℃孵育1h，使得探针对能够在T4连接酶作用下被连接起来。
⑤65度孵育10min，将连接成功的探针洗脱，利用PCR技术进行扩增和建库测序。
⑥数据处理：以溶剂对照DMSO处理组为对照组，药物处理组的基因变化倍数≥1.5倍，P值<0.05定义为基因表达显著上调或下调。
⑦通路富集分析：采用GSEA进行信号通路的富集分析，得到每种中药在11条通路上的失调情况。其中FDR<0.25被认为是显著富集，NES为正表示中药作用的基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
⑧中药组合的通路情况：采用穷举的方式列举所有的中药组合，可以得到N味药中药组合(N＝1到578)，中药组合在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如，中药组合X包含三味中药，分别是中药1、中药2、中药3，则通路1的中药组合X的NES值＝中药1的NES值+中药2的NES值+中药3的NES值。
⑨由于新冠病毒感染的疾病状态下11条通路的NES均为正，则所有使得11条通路的NES均为负的中药组合被认为可以治疗新冠病毒感染。例如：
一味药：桂枝自身就可逆转全部11条通路，每条通路上NES均为负。
表2桂枝对通路的调控
| 通路 | COVID-19 | 桂枝 |
| EPSTEIN-BARRVIRUSINFECTION | 2.308146 | -2.4419727 |
| HEPATITISB | 1.8874385 | -2.3871713 |
| HEPATITISC | 2.0569391 | -1.8027866 |
| HERPESSIMPLEXVIRUS1INFECTION | 2.7820446 | -2.3504822 |
| HUMANCYTOMEGALOVIRUSINFECTION | 1.8468535 | -2.4907367 |
| HUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUS1INFECTION | 1.3982676 | -2.568852 |
| HUMANPAPILLOMAVIRUSINFECTION | 1.392506 | -1.6758713 |
| HUMANT-CELLLEUKEMIAVIRUS1INFECTION | 1.3825307 | -1.6919051 |
| INFLUENZAA | 2.6200814 | -2.8921103 |
| KAPOSISARCOMA-ASSOCIATEDHERPESVIRUSINFECTION | 2.2070804 | -1.9773232 |
| MEASLES | 2.562117 | -2.3089073 |
两味药：大黄和艾叶，通过组合能够实现对11条通路的全逆转。
表3大黄、艾叶及其组合对通路的调控
三味药：白扁豆、红景天、桑枝，通过组合能够实现对11条通路的全逆转。
表4白扁豆、红景天、桑枝及其组合对通路的调控
实施例2治疗新冠病毒感染的方剂疗效评价
一、针对新冠状病毒感染，国家出台了《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》，其中包括了方剂或成药共22首，分别是：
表5《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》所涉及方剂或成药
①轻型、普通型、重型、危重型的分型标准：
轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；
普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学可见肺炎表现。
重型：符合下列任何一条：
1、出现气促，RR≥30次/分
2、静息状态下，指氧饱和度≤93％
3、动脉血压分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300mmHg
高海拔(海拔超过1000米)地区应根据以下公式对PaO2/Fi02进行校正：Pa02/Fi02X[大气压(mg)/760]
肺部影像学显示24-48小时内病灶明显进展>50％者按重型管理。
危重型：符合以下情况之一者：
1、出现呼吸衰竭，且需要机械通气；
2、出现休克；
3、合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。
②疗效评价标准(解除隔离和出院标准)：
1、体温恢复正常3天以上；
2、呼吸道症状明显好转；
3、肺部影像学显示急性渗出性病变明显改善；
4、连续两次呼吸道标本核酸检测阴性(采样时间至少间隔1天)。
二、对于每首方剂，分别计算在11条通路上的NES值。同样地，方剂在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如：
参麦注射液的NES值＝红参的NES值+麦冬的NES值
三、由于新冠病毒感染的疾病状态下11条通路的NES均为正，则所有使得11条通路的NES均为负的中药组合被认为可以治疗新冠病毒感染，因此，湿热蕴肺方、内闭外脱方安宫牛黄丸、湿毒郁肺方、疫毒闭肺方、疏风解毒胶囊、清肺排毒方均符合此要求，我们认为治疗效果好。且从NES值定量的看，清肺排毒汤最优。
表6 22个方剂或成药对通路的调控
在推荐的6个治疗效果好的方剂中，清肺排毒汤、疫毒闭肺方(又称为化湿败毒方)、湿毒郁肺方(又称为宣肺败毒方)在2020年3月23日国务院新闻发布会上被公布为“三药三方”中的三方，是指目前已通过实验数据和临床效果，而筛选出的有效中成药和方剂。清肺排毒方，来源于麻杏石甘汤、射干麻黄汤还有小柴胡汤、五苓散等，它是一个轻型、普通型、重型、危重型的一个通用方。在全国10个省(除湖北省以外)，66个定点医疗机构已纳入1263名确诊患者，治愈出院的1214例，占到96.12％。57例重症患者采用中西医结合治疗、服用清肺排毒汤的临床观察中，其中42例治愈出院，占到了73.7％，无一例转为危重症型。患者的肺部影像学对比显示，服用清肺排毒汤两个疗程(6天)后，53例(93％)患者的肺部病灶显示不同程度的缩小和吸收。
宣肺败毒方，是在麻杏石甘汤、麻杏薏甘汤、葶苈大枣泄肺汤、千金苇茎汤等经典名方的基础上凝练而来。在武汉市中医院、湖北省中西医结合医院等单位开展的宣肺败毒组(70例)与对照组(50例)的研究对照显示：宣肺败毒方在控制炎症、提高淋巴细胞计数方面具有显著疗效。与对照组相比，淋巴细胞的恢复提高17％，临床治愈率能够提高22％。河南中医药大学第一附属医院使用该方治疗轻型、普通型患者40例，平均转阴时间为9.66天，无一例转为重型、危重型，CT诊断好转率为85％。
化湿败毒方，是在国家诊疗方案推荐的方剂的基础上，由中国中医科学院医疗队在金银潭医院结合临床实践优化而成。分别在金银潭医院、东西湖方舱医院、将军路街卫生院开展了重型、普通型、轻型的临床疗效观察。在金银潭医院临床对照试验入组75例重症患者，CT诊断的肺部炎症以及临床症状改善非常明显，核酸的转阴时间以及住院时间平均缩短了3天。在将军路街卫生院治疗普通型124例，在东西湖方舱医院随机对照观察的轻型、普通型894例(中药组452例)，确证了该方的有效性。3月18号化湿败毒颗粒已正式获得国家药监局药物临床试验的批件。
实施例3治疗肝功能不全的中药组方
1、获取肝功能不全的疾病状态数据
在NCBI官网GEO数据库检索公开发表的肝功能不全数据，其中GSE141864是一项关于感染奈瑟氏脑膜炎菌而罹患急性败血症休克和多器官功能衰竭的研究，包含患者死后的肝脏组织的全转录组数据，检测方法为微阵列芯片，所用平台为Affymetrix GeneChipHuman Transcriptome 2.0arrays。
对GSE141806数据进行基因表达变化倍数分析，采用DEseq2方法，得到基因的表达变化倍数。采用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)进行信号通路的富集分析，得到在43条肝功能相关通路上的失调情况，标准化富集得分可以表征该通路的失调方向，NES为正表示基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
表7肝功能不全患者的通路富集结果
2、利用HTS2(基于高通量测序的高通量筛选)技术，检测《中国药典》(2015版本)中归肝经的33种中药提取物作用于HepG2人肝癌细胞系，3000多个特征基因表达的影响，具体实验过程同实施例1。
在本实施例中，以8味药的中药组合方式为例，采用穷举的方式列举所有的8味药中药组合(共有C33/8)，中药组合在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如，中药组合X包含8味中药，分别是中药1、中药2、中药3……中药8，则通路1的中药组合X的NES值＝中药1的NES值+中药2的NES值+……+中药8的NES值。
3、以逆转肝功能不全病人43条信号通路为目标，在全部13884156种组合中共有12633种组合可以实现全逆转。其中包括了用于治疗肝功能不全的经典名方逍遥散，逍遥散包括的8味中药分别为：柴胡、当归、茯苓、白芍、白术、炙甘草、薄荷和生姜，逍遥散通路上的表现如下：
表8逍遥散的通路富集结果
实施例4治疗肾纤维化的中药组方
1、获取肾纤维化的疾病状态数据
利用DMEM培养基培养HK2细胞(肾小管上皮细胞)，将3000个细胞/孔铺板于384孔板，37度培养箱培养过夜。加入终浓度10ng/mL的TGFβ处理细胞24小时，模仿肾纤维化过程。TGFβ是促进肾纤维化的关键细胞因子，其可通过激活Smad信号通路，介导肾小管细胞上皮-间质转化(EMT)，并诱导细胞外基质(ECM)的合成与沉积。细胞用裂解液裂解后进行HTS2试验。获得3000多个特征基因表达情况后，采用DEseq2方法，得到基因的表达变化倍数。
采用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)进行信号通路的富集分析，得到在21条肾功能相关通路上的失调情况，标准化富集得分可以表征该通路的失调方向，NES为正表示基因集在基因的顶部富集(表达值高)，NES为负表示基因集在基因的底部富集(表达值低)。
表9 TGFβ造模后的通路富集结果
2、利用HTS2(基于高通量测序的高通量筛选)技术，检测《中国药典》(2015版本)中归肾经的146种中药提取物作用于HK2人肾小管上皮细胞系，3000多个特征基因表达的影响，具体实验过程同实施例一。
在本实施例中，以6味药的中药组合方式为例，采用穷举的方式列举所有的6味药中药组合(共有C146/8)，中药组合在某条通路上的NES值＝每个单味药在该通路上的NES值的总和。例如，中药组合X包含6味中药，分别是中药1、中药2、中药3……中药6，则通路1的中药组合X的NES值＝中药1的NES值+中药2的NES值+……+中药6的NES值。
3、以逆转TGFβ模拟肾纤维化过程的21条信号通路为目标，在全部12122560164种组合中共有1408种组合可以实现全逆转。其中包括了用于治疗肾病的经典名方六味地黄丸，六味地黄丸包括的6味中药分别为：茯苓、牡丹皮、芍药、山吴茱萸、熟地黄和泽泻，六味地黄丸在通路上的表现如下：
表10六味地黄丸的通路富集结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.中药组合物的确定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得疾病状态下的转录组数据，经基因集富集分析，获得与疾病相关的失调通路的标准化富集得分；
步骤2：测试待测中药的提取物的活性，获得所述待测中药作用后的转录组数据，以溶剂对照处理组为基础，所述待测中药的提取物处理组的基因变化倍数≥预设变化率，基因表达显著上调或下调；
步骤3：采用GSEA进行信号通路的富集分析，获得所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分；
步骤4：中药组合物的标准化富集得分为单味所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分的总和；
步骤5：选择逆转所述失调通路的所述待测中药，获得中药组合物。
2.如权利要求1所述的确定方法，其特征在于，所述疾病包括急性疾病或慢性疾病；或所述疾病包括神经系统疾病、消化系统疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病、骨骼肌肉系统疾病、血液系统疾病、内分泌系统疾病、皮肤和附属器疾病、代谢性疾病或风湿性疾病中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的确定方法，其特征在于，所述失调通路为公认的细胞信号通路，包括KEGG数据库中涉及代谢、遗传信息处理、环境处理、细胞内过程、器官系统、人体疾病、药物开发中的一条或多条信号通路。
4.如权利要求1至3任一项所述的确定方法，其特征在于，所述转录组数据的来源包括二代测序、基因芯片、蛋白芯片、实时定量PCR、以及公共数据库或文献中提供的全部或部分基因表达数据。
5.如权利要求1至4任一项所述的确定方法，其特征在于，所述的疾病具体包括新型冠状病毒感染、肝功能不全、肾纤维化中的一种或多种。
6.如权利要求1至5任一项所述的确定方法，其特征在于，所述的通路包括HEPATITISB、HEPATITIS C、INFLUENZA A、HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS 1INFECTION、AMPKSIGNALING PATHWAY、FOXO SIGNALING PATHWAY、INSULIN SIGNALING PATHWAY、PPARSIGNALING PATHWAY、NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE(NAFLD)、CHEMOKINESIGNALING PATHWAY、CYTOKINE-CYTOKINE RECEPTOR INTERACTION、JAK-STAT SIGNALINGPATHWAY、NF-KAPPA B SIGNALING PATHWAY、TGF-BETA SIGNALING PATHWAY、VASOPRESSIN-REGULATED WATER REABSORPTION中的一种或多种。
7.如权利要求1至6任一项所述的确定方法，其特征在于，步骤5之后还包括根据所述标准化富集得分的总和的大小，获得所述中药组合物的药效；所述标准化富集得分的总和与药效成正比。
8.治疗新冠病毒感染疾病的中药组合物，其特征在于，包括桂枝、大黄、艾叶、白扁豆、红景天、桑枝中的一种或两者以上组合物。
9.中药组合物的药效的确定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得疾病状态下的转录组数据，经基因集富集分析，获得与疾病相关的失调通路的标准化富集得分；
步骤2：测试待测中药的提取物的活性，获得所述待测中药作用后的转录组数据，以溶剂对照处理组为基础，所述待测中药的提取物处理组的基因变化倍数≥预设变化率，基因表达显著上调或下调；
步骤3：采用GSEA进行信号通路的富集分析，获得所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分；
步骤4：中药组合物的标准化富集得分为单味所述待测中药在所述失调通路上的标准化富集得分的总和；
步骤5：根据所述标准化富集得分的总和的大小，获得所述中药组合物的药效；所述标准化富集得分的总和与药效成正比。
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