CN109793742A

CN109793742A - 一种药物化合物应用

Info

Publication number: CN109793742A
Application number: CN201910159938.0A
Authority: CN
Inventors: 刘玉; 陈崇; 吴宝红
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-05-24

Abstract

本发明公开了LSD1抑制剂在制备药物中的用途。LSD1抑制剂可以逆转Utx缺失所致细胞分化异常，缓解/抑制肿瘤细胞的增殖，发挥治疗肿瘤疾病的作用。

Description

一种药物化合物应用

技术领域

本发明涉及一种药物化合物的应用，特别是化合物SP2509在治疗肿瘤疾病中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

表观遗传因子是造血系统恶性肿瘤中最常见的突变基因之一。例如，TET2、DNMT3A、IDH1/2等基因功能障碍会导致了造血干细胞和祖细胞(HSPC)的分化受阻，进而引发白血病。我们研究发现混合谱系白血病蛋白3(MLL3，官方命名KMT2C)是染色体7q上的肿瘤抑制因子。HSPC中Mll3单倍剂量不足(Haploinsufficiency)致使正常HSPC细胞分化功能受损，最终导致MDS样表型。Mll3/4、H3K4单甲基化-、二甲基化-转移酶和X染色体上重复的转录三十四肽(UTX)与其他组分一起构成了COMPASS样复合物。UTX是H3K27去甲基化酶。因此，COMPASS样复合物可以通过同时修饰H3K4和H3K27来增强靶基因的转录表达。

在血液肿瘤和实体癌症患者体内，也经常检测到UTX突变。在大约10％慢性粒单核细胞白血病(CMML)和CMML衍生的急性髓性白血病(AML)患者，20％ALL患者中检测到UTX突变。UTX对多种生物过程至关重要，包括胚胎形成、干细胞自我更新和后发育。UTX缺乏本身或与其他驱动因素的组合，可导致恶性骨髓瘤和淋巴瘤。UTX敲除也可以导致胰腺癌或肺部肿瘤。因此，UTX是多种癌症的推定抑制因子。在造血系统中，UTX是正常造血功能所必需的基因。UTX缺失会影响细胞分化，导致LT-HSC和ST-HSC的比例和绝对数量增加。

促细胞分化疗法已被批准用于造血系统恶性肿瘤，例如全反式维甲酸和三氧化二砷用于急性早幼粒细胞白血病(APL)。鉴于UTX在调节HSPC分化中的关键作用，我们假设通过缓解UTX缺陷所致细胞分化阻滞，可以治疗UTX突变患者的病症。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中对于肿瘤疾病治疗效果不佳，愈后表现很差的问题，提供一种药物化合物的应用，用于肿瘤或癌症的药物制备当中。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种技术方案：

LSD1抑制剂在制备药物中的用途。

UTX可能是通过COMPASS样复合物促进细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达，调节细胞分化，同时UTX能够促进H3K4甲基化水平提高。在UTX缺失细胞中，LSD1(H3K4去甲基化酶)的抑制剂能够帮助LSD1靶基因的H3K4甲基化水平恢复平衡，缓解细胞分化阻滞。

进一步，所述LSD1抑制剂是SP2509。在LSD1抑制剂中，经过我们对表观遗传药物库筛选，发现SP2509能够特异性地促进UTX缺失的HSPC细胞分化，且对于正常的野生型HSPC细胞基本没有影响。

而且，SP2509对UTX突变的AML细胞具有相似的作用，能够有效延长UTX突变所致白血病小鼠寿命。优选地，化合物SP2509在治疗肿瘤疾病的药物制备中的应用。SP2509通过促进Utx缺失的HSPC细胞分化，实现对于肿瘤细胞增殖干预，实现基因表达层面的调整控制，发挥治疗肿瘤疾病的作用。SP2509对于促进细胞分化和/或降低细胞干性具有显著调节作用，能够发挥治疗肿瘤疾病的作用。

进一步，所述药物是治疗肿瘤疾病、遗传疾病的药物。

进一步，所述肿瘤疾病是实体肿瘤、血液肿瘤疾病。

优选地，所述实体肿瘤是膀胱癌(特别是Utx缺失的膀胱癌)、腺样囊性癌、成神经管细胞瘤、前列腺癌、肺癌、食管癌、胶质瘤等肿瘤疾病。优选地，所述血液肿瘤是指慢性粒单核细胞性白血病、慢性髓细胞白血病、T淋巴细胞白血病、B淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾肉瘤样癌、骨髓增生综合征、急性髓细胞性白血病。

进一步，所述遗传疾病是Utx缺失的性染色体遗传疾病。

进一步，所述化合物SP2509是LSD1抑制剂，其分子式如下：

SP2509是LSD1的选择性抑制剂，具有多重调节基因表达的功效。SP2509能够一定程度上逆转Utx缺失导致的造血干细胞基因信号异常，实现HSPC细胞分化表达促进作用，降低肿瘤细胞干性相关基因表达。

进一步，所述化合物SP2509通过逆转表观遗传发挥治疗肿瘤疾病的作用。

进一步，所述化合物SP2509通过抑制LSD1对H3K4的去甲基化活性，从而促进了细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达水平。

进一步，所述肿瘤疾病是血液类肿瘤疾病。化合物SP2509能够促进AML急性髓性白血病中白细胞的分化，延长实验模型的白血病小鼠的存活时间。

进一步，所述肿瘤疾病是骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓性白血病(AML)、白血病、B细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的一种。

本发明提供的新技术方案主要能够实现以下技术效果：

1.本发明将化合物SP2509应用于治疗肿瘤疾病的药物当中，利用SP2509逆转UTX缺失所致的细胞分化功能异常，促进HSPC细胞正常分化功能，缓解/抑制肿瘤细胞的增殖，发挥治疗肿瘤疾病的作用。

2.本发明筛选的化合物SP2509化合物是一种LSD1抑制剂，能够很好的发挥出基因调节作用，促进白细胞正常分化，白血病小鼠模型动物实验中表现出良好的延长存活寿命作用。

3.本发明筛选的化合物SP2509作为药物给予肿瘤模型动物，很好的促进细胞分化基因表达，并通过细胞表面分子标记物的检测验证，能够达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。

附图说明：

图1是表观遗传药物库筛选特异性促进Utx基因缺失的HSPC细胞分化的化合物。

图1a是表观遗传药物筛选的实验流程图：从年轻成年C57BL/6野生型(WT)和Utx^flox/flox；Mx-1-cre(KO)小鼠体内分离得到Utx WT和Utx KO HSPC，然后用表观遗传药物库的化合物(Selleck，总共276种化合物)分别进行处理。药物化合物处理72小时后，用流式细胞仪分析细胞表面标识物ckit和Mac-1的表达。

图1b是表观遗传药物库中药物分类，药物文库由直接靶向表观遗传酶和其他相关靶标的化合物组成。

图1c通过流式细胞术检测表观遗传药物库各个药物化合物处理后，Utx WT(Utx野生型，含有Utx基因)和Utx KO(Utx基因敲除模型)的HSPC的Mac-1染色平均荧光强度(MFI)的差值。

图1d通过流式细胞术检测来自表观遗传药物库各个药物化合物处理后，Utx WT和Utx KO HSPC的ckit染色的MFI差值。

图1e通过流式细胞术检测来自表观遗传药物库或载体的单个化合物处理的UtxWT和Utx KO HSPC的ckit+群所占百分比的差值。

图2是验证SP2509特异性诱导Utx KO HSPC的细胞分化的实验结果。

图2a为Utx野生型空白对照组和Utx敲除组HSPC的ckit标识物染色流式图比较。

图2b为Utx野生型空白对照组和Utx敲除组HSPC的Mac-1标识物染色流式图比较。

图2c为SP2509处理UtxWT和Utx KO HSPC上的ckit标识物染色流式图比较。

图2d为SP2509处理的Utx WT和Utx KO HSPC上Mac-1标识物染色流式图比较。

图2e为Utx野生型和Utx敲除型HSPC经过空白对照组和SP2509处理后，标识物ckit检测cKit+百分比的统计图。n＝3，显示平均值±SD。

图2f为SP2509分别处理Utx WT HSPC和Utx KO HSPC后，相比于空白对照组ckit+群体所占的百分比相对水平。

图2g是用空白手术和SP2509分别处理Utx WT和Utx KO的HSPC细胞标识物Mac-1+群体的所占百分比统计图。n＝3，显示平均值±SD。

图2h是用SP2509分别处理Utx WT和Utx KO HSPC后，相比于空白对照组，Mac-1+群体所占的百分比相对水平变化。

图2i是用空白对照组和SP2509处理组中，Utx WT和Utx KO HSPC中的ckit+的MFI值变化。n＝3，显示平均值±SD。

图2j是用SP2509分别处理Utx WT HSPC和Utx KO HSPC后，相比于空白对照组的ckit+的MFI的相对水平。

图2k是用空白对照和SP2509处理的UtxWT HSPC、Utx KO HSPC后Mac-1染色的MFI。n＝3，显示平均值±SD。

图2l是用SP2509分别处理Utx WT HSPC和Utx KO HSPC后，相比于对照组(空白手术处理的UtxWT HSPC和Utx KO HSPC)的Mac-1群体MFI的相对水平。

*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。

图3是SP2509处理Utx null HSPC前后对于转录组的影响

图3a是空白手术、SP2509处理Utx WT和Utx KO HSPC后12小时，RNA-seq的聚类分析结果。

图3b为Utx WT和Utx KO HSPC用空白处理或SP2509处理12小时后，主成分分析(PCA)的RNA-seq数据。

图3c是通过RNA-seq分析的Utx WT和KO HSPC细胞差异表达基因的热图(heatmap)。

图3d是通过RNA-seq分析的空白对照、SP2509处理Utx KO HSPC，12小时后，细胞差异表达基因的热图。

图4是Utx缺失导致细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达下调，而SP2509处理能够使之表达发生逆转。

图4a是基因富集分析GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，RPS14_DN.V1_UP基因组呈现负相关；但是，在Utx KO HSPC中，SP2509处理组与空白组相比，该基因组呈现正相关。

图4b是GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，Hallmark_IL2_STAT5信号基因组呈现负相关；但是，用SP2509处理的Utx KO HSPC组与空白组相比，相应基因呈现正相关富集。

图4c是GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，GO_Inflammatory_Response基因组呈现负相关；用SP2509处理的Utx KO HSPC与空白组相比，BMI1_DN.V1_UP基因组呈现正相关。

图4d是GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，p53_DN.V1_DN基因组在中呈现负相关；而用SP2509处理的Utx KO HSPC组与空白组相比，Hallmark_p53_pathway基因组呈现正相关。

图4e是GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，Hallmark_Myc_Targets_V1基因组呈现正相关；而用SP2509处理的Utx KO HSPC组与空白组相比，相应基因呈现负向富集。

图4f是GSEA显示，Utx KO HSPC与WT HSPC相比，GO_Ribosomal_Subunit基因组呈现正相关；而用SP2509处理的Utx KO HSPC与空白组相比，GO Ribosome_Biogenesis基因组呈现负相关。

图4g是通过qPCR测量Utx WT和Utx KO HSPC中，Car1，Car2，Gata1，Gata2，Fabp4和Arg1的相对mRNA表达。显示平均值±SD。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。

图4h是通过qPCR测量的Utx WT和Utx KO HSPC中，Fabp4，Igfbp7，Jag1，Arg1，Epha2和Bax的相对mRNA表达。显示平均值±SD。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。

图5.Utx缺失和SP2509治疗对组蛋白甲基化以及HSPC中细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子表达的逆转作用。

图5a是空白对照、SP2509处理UtxWT HSPC和Utx KO HSPC，12小时后，细胞裂解物进行蛋白质印迹检测H3K4me3的水平。

图5b是空白对照、SP2509处理Utx WT HSPC和Utx KO HSPC，12小时后，H3K4m3水平相对于总H3水平的定量。

图5c是通过Chip-seq分析Utx WT和Utx KO HSPC上H3K4m1在Car1基因的分布情况。

图5d是通过Chip-seq分析Utx WT和Utx KO HSPC上H3K4m1在Car2基因的分布情况。

图5e是通过Chip-seq分析Utx WT和Utx KO HSPC上H3K4m1的Gata1基因的分布情况。

图5f是通过Chip-seq分析Utx WT和Utx KO HSPC上H3K4m1的Bax基因的分布情况。

图5g是通过Chip-seq分析Utx WT和Utx KO的ES细胞中H3K4m1在Bax基因上的分布情况。

图5h是通过Chip-seq分析空白处理和OG86处理的白血病细胞系THP1，MLL4在Bax基因上的分布情况。

图6是(体外和体内环境下)SP2509通过促进细胞分化来抑制Utx突变体AML疾病。

图6a是流式细胞术检测空白处理和SP2509处理的Utx^-/-；shp53-mCherry；shNf1-GFP模型AML细胞的分化特征。左图，显示空白组和加药组AML细胞的Mac-1+细胞群。右图，Mac-1+群体的百分比(上)和Mac-1+的MFI(下)。

图6b是用空白处理和SP2509处理的AML细胞的ckit+的MFI。

图6c是用空白处理和SP2509处理的AML细胞生长的相对细胞数。

图6d是用空白处理和SP2509处理Utx^-/-；shp53-mCherry；shNf1-GFPAML小鼠模型示意图。对C57B/L6小鼠进行半致死照射，然后用Utx^-/-；shp53-mCherry；shNf1-GFP AML细胞移植。小鼠AML模型构建成功以后，随机分配成两组分别给予空白处理和25mg/kgSP2509，每周进行两次i.p注射。通过流式细胞术、CBC和血涂片检测小鼠病程。

图6e是给药处理一周后，流式检测对照组和SP2509组小鼠中外周血AML细胞中Mac-1的表达的流式图。

图6f是给药处理两周后，流式检测对照组和SP2509组小鼠中外周血AML细胞中Mac-1的表达的流式图。

图6g是给药处理一周和两周后对照组和SP2509组小鼠外周血中Mac-1+AML细胞的百分比。

图6h是给药处理一周和两周后对照组和SP2509组小鼠外周血中AML细胞的Mac-1染色的MFI。

图6i是随着病程发展对照组和SP2509组小鼠外周血中检测到的GFP+mCherry+群体的百分比

图6j是给药2.5周，对照组和SP2509组小鼠的WBC计数。

图6k对照组和SP2509组AML小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。n＝6，p＝0.0086。

图6l是对照组和SP2509组小鼠外周血涂片的白血病细胞。

图7是SP2509诱导Utx缺失的造血干细胞分化的分子机制模型示意图。

图7a的示意图显示，Utx缺失影响COMPASS类似复合物中MLL3的H3K4甲基化活性，导致细胞分化相关基因和肿瘤抑制基因的表达降低。

图7b的示意图显示，在Utx缺陷细胞中，SP2509通过抑制LSD1对H3K4的去甲基化活性，从而促进了细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达水平。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

<实施例1>

表观遗传药物库筛选用于特异性促进UTX缺失的造血干祖细胞分化表达的候选小分子化合物

已知UTX作用于组蛋白3，可调节造血干祖细胞分化，实现抑制肿瘤细胞增殖的作用。通过对野生型(WT)和造血干祖细胞分化基因UTX缺失(UTXnull HSPC)的小鼠进行表观遗传药物库的高通量筛选(图1a)。

将Utx^f/f条件敲除小鼠和Mx1-cre小鼠杂交后，使用pIpC诱导剂处理可使得cre酶和f/f位点作用从而使得Utx基因敲除(Knock out，KO)，获得敲除UTX基因的小鼠(UTX nullHSPC)，然后，通过磁珠分选(MACS)获得敲除型(KO)和野生型(WT)小鼠的造血干祖细胞(HSPC)。表观遗传药物库中276种小分子药物化合物(大部分是目前可用的表观遗传调节酶的激动剂和拮抗剂(图1b))进行高通量功能筛选，筛选测试药物浓度为10μM。

采用流式细胞术通过平均荧光强度(MFI)对造血干祖细胞表面抗体cKit和Mac-1进行评分，分析造血干祖细胞的干性和分化程度(图1c-d)。UTX基因缺失导致了HSPC分化阻滞，UTX敲除的小鼠(KO)和野生型(WT)小鼠相比，Mac-1(骨髓细胞表面标记物)表达程度更低，表明敲除Utx以后小鼠造血干祖细胞分化功能受损。与之相对的是，Utx敲除小鼠相比于野生型(WT)小鼠，cKit(造血干祖细胞表面标记物)表达水平更高。

筛选结果表明：Utx敲除的小鼠(KO)和野生型(WT)小鼠相比，BIX01294、双吲哚马来酰亚胺IX和SP2509三种化合物对于诱导Mac-1表达的数据差异最大(图1c)。BIX01294是组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂，在IC₅₀2.7μM时能够显著降低H3K9m2甲基化水平。双吲哚马来酰亚胺IX是一种pan-PKC抑制剂，极低的剂量即可(nMIC₅₀)抑制PKC-α，PKC-βI，PKC-βII，PKC-γ和PKC-ε。SP2509是组蛋白去甲基化酶LSD1的选择性抑制剂，IC50为3nM。

Utx敲除的小鼠(KO)和野生型(WT)小鼠相比，阿扎胞苷、地西他滨和SP2509(图1d)三种化合物对于诱导cKit表达作用最强。阿扎胞苷和地西他滨是用于造血系统的恶性肿瘤治疗的药物，能够诱导细胞正常分化或直接杀死白血病细胞。阿扎胞苷和地西他滨的检测结果验证表观遗传调节化合物对于修复Utx缺失导致的造血干祖细胞分化功能异常具有很好的防治作用。

SP2509的筛选测试结果显示，其对于Mac-1和cKit表达都具有调节作用，更具医学应用价值。实际上，Utx敲除(KO)小鼠和野生型(WT)小鼠试验中，如果按照cKit+群所占百分比分析，SP2509也是唯一引起Utx敲除小鼠造血干细胞cKit+群减少的小分子药物化合物(图1e)。

<实施例2>

SP2509作为Utx缺陷细胞的特异性分化诱导剂的验证

采取类似于实施例1高通量筛选试验(图1a)，将SP2509应用于Utx基因缺失造血干祖细胞。采用实施例1相同的方法准备Utx敲除小鼠和野生型(WT)小鼠，采用流式细胞术通过平均荧光强度(MFI)对造血干祖细胞表面抗体cKit和Mac-1进行评分。

手术4天后(手术方法见文件末尾)，Utx敲除的小鼠和野生型(WT)小鼠相比，cKit抗体检测阳性率分别为32.4％(Utx KO)、23.4％(WT)(图2a)。

流式细胞术检测结果显示：

Utx敲除造血干祖细胞中，56.2％表现出Mac-1分化阳性，野生型(WT)76.3％分化(图2b)，进一步确认Utx缺失会导致造血干祖细胞分化功能受阻。SP2509对于野生型(WT)小鼠造血干祖细胞功能没有显著影响，SP2509处理的野生型(WT)小鼠26％造血干祖细胞保持cKit阳性，但使用SP2509处理的敲除型(KO)小鼠中有69.7％逆转为Mac-1阳性(图2c-d)。

在SP2509处理后，Utx敲除小鼠只有9.38％的造血干祖细胞保持cKit阳性，与空白对照组(vehicle)的敲除Utx基因小鼠造血干祖细胞相比，细胞干性率减少约2.5倍(图2e-f)。

SP2509作用下90％Utx敲除小鼠的造血干祖细胞分化表达出Mac-1阳性，与对照组敲除Utx基因小鼠的造血干祖细胞分化率相比增加大约1倍，且显著高于野生型(WT)小鼠造血干祖细胞的分化率(图2g-h)。

在SP2509作用下，Utx敲除小鼠HSPC的cKit MFI测试值从2489降低至681，降幅达到2.65倍。而野生型(WT)小鼠在SP2509处理后，cKit MFI测试结果基本没有影响(图2i-j)。SP2509处理后，Utx敲除小鼠的HSPC的Mac-1MFI测试结果从空白手术组的1450增长到16326，增加了10.2倍。和SP2509处理野生型(WT)小鼠产生的HSPC分化程度变化相比，SP2509对于UTX KO小鼠作用非常显著(图2k-1)。

综上，SP2509对于Utx基因缺失的HSPC具有特异性分化诱导作用，且对于野生型(WT)健康HSPC分化基本没有影响。

<实施例3>

SP2509对于Utx缺失所致HSPC转录表达其他方面影响的修复作用

通过RNA-seq分析SP2509处理的野生型(WT)和Utx敲除小鼠基因转录情况，研究分析SP2509诱导Utx敲除小鼠造血干祖细胞的分化机理。

采用SP2509处理实验小鼠，12小时后，收集造血干祖细胞进行转录组测序分析，以确定SP2509对基因表达的直接影响。每个实验小组设置3个平行样本，聚类分析显示所有平行样本都聚合在一起，表现出良好的一致性(图3a)，说明所得RNA-seq数据具有极高的质量。主成分分析(PCA)也显示每个实验小组的平行样本紧密聚合。PCA测试结果显示SP2509对于野生型(WT)和敲除Utx小鼠造血干祖细胞分化具有显著影响(图3b)。

与野生型(WT)小鼠造血干祖细胞的差异表达基因分析发现，Utx敲除小鼠HSPC中的177个基因表达出现显著降低(p<0.05，log2[敲除/野生型]<-1)，只有34个基因表达出现增强(图3c)。SP2509对于基因表达的影响和Utx及其相关的COMPASS样复合物的组蛋白修饰功能一致。在Mll3(COMPASS样复合物的核心元件)缺陷型HSPC中也观察到类似的结果。

对SP2509组和空白手术组之间的差异表达分析发现，Utx敲除小鼠在SP2509处理后HSPC中99个基因显著上调(p<0.05，log2[敲除Utx/野生型]<-1)，只有9个基因显著下调(图3d)。SP2509对基因表达显著上调与HSPC中Utx缺失的影响正好相反。可见，SP2509处理对全局转录组的作用对于Utx敲除小鼠HSPC的表达具有特异性互补作用，SP2509处理逆转UTX缺失所致基因表达阻滞，并且SP2509对野生型(WT)小鼠HSPC的表达的影响基本上和正常的野生型小鼠HSPC表达相当。

<实施例4>

SP2509促进Utx敲除小鼠体内被抑制的HSPC细胞分化相关基因和肿瘤抑制基因的表达

为了研究SP2509调控基因的功能，进行基因富集分析(GSEA)。与Utx缺失所致HSPC分化阻滞相一致的是(图2a-d)，造血干细胞谱系和多种免疫相关通路是Utx KO HSPC细胞的基因表达过程中最常见的下调方式。Utx敲除HSPC对于基因调节的变化(与UtxWT相比)和分化相关RPS14通路转录信号呈现负相关(归一化富集评分[NES]＝-1.717，错误率[FDR]＝0.004)。在使用SP2509处理以后，相关的RPS14通路的转录信号逆转，表现出正相关([NES]＝1.694，[FDR]＝0.006)(图4a)。

类似地，在标志性IL2/STAT5免疫通路相关基因表达在Utx敲除小鼠HSPC中呈现负相关([NES]＝-1.561，[FDR]＝0.017)。应用SP2905处理后，逆转为正相关([NES]＝1.410，[FDR]＝0.170)(图4b)。

此外，Utx敲除小鼠HSPC的转录信号和炎症反应通路呈现负相关(NES＝-1.615，FDR q＝0.013)，而Bmi1基因组(HSPC干性相关的基因组)在SP2590处理后呈现正相关(NES＝1.651，FDR q＝0.010)。所以，Utx缺失导致的HSPC细胞分化相关基因的表达抑制可以被SP2509逆转。

Utx敲除小鼠HSPC转录信号特征与肿瘤抑制因子p53通路基因集呈负相关([NES]＝-1.600，[FDR]＝0.017)，与Myc通路相关基因呈正相关([NES]＝1.876)，[FDR]＝0.006)，表明Utx缺失和肿瘤发生有着密切关系。当采用SP2509处理Utx敲除小鼠以后，HSPC相关的转录信号特征与肿瘤抑制因子p53通路基因集呈现正相关([NES]＝1.859，[FDR]＝0.000)，转录信号特征与Myc途径相关基因呈负相关([NES]＝-2.490，[FDR]＝0.000)(图4e，4f)。Utx KO HSPC核糖体生源基因组通常呈现富集阳性([NES]＝1.90，[FDR]＝0.12)，在使用SP2590处理后，呈现富集阴性([NES]＝1.90，[FDR]＝-2.218)(图4f)。所以，SP2509能够逆转由于Utx缺失导致相的肿瘤抑制因子失效、癌基因活化。

通过GSEA对筛选的细胞分化因子基因Car1，Car2，Gata1和Gata2进行定量PCR分析，结果显示Utx KO HSPC与Utx WT HSPC相比，相关细胞分化因子的表达显着降低(p<0.01)(图4g)。所以，细胞分化因子基因和包括Bax在内肿瘤抑制因子表达强度的变化，都显示SP2509处理后，Utx KO HSPC与空白对照组的Utx KO HSPC相比转录水平得到显著增强(p<0.05)(图4h)。

<实施例5>

SP2509通过抑制LSD1修正Utx OK HSPC中细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的 H3K4甲基化水平

Utx是Mll3COMPASS样复合物的特异元件，而Mll3是H3K4甲基化活性位点，LSD1是H3K4去甲基化活性靶点。LSD1作为SP2509的推定靶标，可以说明SP2509诱导Utx缺失HSPC细胞分化的机制。免疫印迹试验(Western blotting)显示：与WT HSPC相比，Utx KO HSPC中H3K4三甲基化总水平降低(图5a-b)。虽然，Utx本身不具有H3K4修饰活性，但其关联的COMPASS样复合物的核心元件Mll3/是H3K4单甲基化、二甲基化转移酶。

Utx KO HSPC和WT HSPC相比，H3K4m1一甲基化水平全面降低(图5c-f)。直接导致Utx KO HSPC中，分化相关基因(如Car1，Car2和Gata1)以及肿瘤抑制因子Bax表达水平全面降低(图4h)。所以，Utx缺失可能损害Mll3的H3K4甲基转移酶活性。

相比之下，SP2509的靶标LSD1是H3K4和H3K9脱甲基酶。在SP2509对LSD1的抑制作用下，相应地增加了Utx KO HSPC的H3K4甲基化水平(图5a-b)。通过大数据分析，与野生型小鼠胚胎干细胞(WT cells)相比，Utx KO HSPC中肿瘤抑制因子Bax的H3K4m3水平降低(图5g)。使用另一种LSD1抑制剂OG86进行处理，增加了白血病细胞中MLL4与BAX启动子的结合率(图5h)，表明LSD1和COMPASS样复合物可能直接竞争分化相关基因和肿瘤抑制因子的启动子。因此，LSD1抑制使Utx缺陷细胞中的H3K4甲基化减少得到修复，使得分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达增强。

综上所述，Utx缺失导致H3K4甲基化水平降低，可能是通过COMPASS样复合物产生影响，进而抑制分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达，并最终导致HSPC的分化阻断，引发细胞肿瘤病变(图7a)。LSD1能够与MLL3竞争结合相关基因的启动子，所以LSD1抑制剂SP2509可以修复由于Utx缺陷导致的H3K4甲基化水平降低，进而促进分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达，最终有效的促进Utx突变细胞的正常分化(图7b)。

<实施例6>

体外、体内实验表明，SP2509可以促进Utx突变所致AML白血病细胞正常分化，并有效延长AML白血病小鼠的存活寿命

我们进一步研究了SP2509对于Utx突变所致癌细胞是否具有与SP2509对于Utx敲除小鼠的HSPC相似的抑制作用。将Utx^-/-；shp53-mCherry；shNf1-GFPAML细胞用10μM S2509处理3天，然后通过流式细胞术进行检测分析。结果显示，SP2509能够显著增加AML白血病细胞中分化标志物Mac-1的表达水平(图6a)。在SP2509组分化标志物Mac-1⁺平均荧光强度(MFI)大约是空白对照组的2倍，同时干性(stemness)标记物ckit的表达降低(图6b)。SP2509作用下细胞分化阻滞得到缓解，Utx缺失所致异常增殖的AML细胞数量减少(图6c)。所以，在体外试验中，SP2509对于Utx缺陷型癌前期HSPC异常增殖细胞，具有促进细胞分化作用，能够实现对于Utx突变所致AML白血病的治疗。

SP2509对活体Utx缺陷型AML肿瘤模型的治疗研究。

先将小鼠进行半致死辐照处理，然后将Utx^-/-；shp53-mCherry；shNf1-GFPAML细胞移植到亚致死照射的受体小鼠体内。手术7天后，通过流式细胞术测量，确定所有受体小鼠外周血管中均检测到GFP⁺-mCherry⁺AML细胞，表明小鼠模型建立成功。小鼠被随机分成两组，其中一组每周两次腹膜内注射25mg/kg SP2509，另一组同时进行空白注射手术。通过全血细胞测试(CBC)、血涂片染色、流式细胞术监测小鼠白血病疾病病程(图6d)。药物治疗一周后，SP2509组小鼠外周血中，Mac-1阳性AML细胞占比约50％，而空白手术组小鼠则为25％(图6e)。经过两周的治疗后，SP2509组小鼠白细胞的分化促进作用更加明显，SP2509组小鼠AML细胞绝大部分表现Mac-1阳性，Mac-1染色MFI测试结果大约是空白对照组的5倍(图6f-h)。以上数据表明，体内实验中条件下SP2509同样能够促进Utx突变体肿瘤细胞分化。

更重要的是，SP2509能够有效抑制体内AML的恶化。采用外周血中GFP⁺-mCherry⁺细胞百分比评估小鼠的肿瘤发生程度。Utx突变型AML白血病细胞具有非常强的攻击性，白血病细胞在空白手术组小鼠体内逐渐增殖。2.5周时间内，空白手术组小鼠肿瘤细胞占比从2％增长到70％。而SP2509组小鼠体内肿瘤发生程度非常缓慢，在2.5周后，小鼠外周血中仅有20％的AML细胞(图6i)。需要特别注意的是，在治疗的第一周，SP2509组小鼠的血液中白血病细胞多于空白手术组，这可能是细胞分化的早期增殖带来的影响，这在其他AML模型中也有观察到。空白对照组小鼠外周血液中WBC(White Blood Cell)计数为25-65k/μL，而SP2509组小鼠则处于正常水平(图6j)。所有空白对照组的模型小鼠在手术后17天内死亡，而六只SP2509组小鼠中有五只在手术后第3周依然存活(图6k)。存活小鼠的外周血中几乎没有白血病细胞(图6l)。所以，SP2509对于小鼠体内Utx突变型肿瘤具有显著疗效。

具体试验方法如下：

M1：Utx敲除小鼠：

将Utx^fl/fl小鼠(由Jackson Lab购买，024177-B6；129S-Kdm6atm 1.1Kaig/J)与Mx1-Cre小鼠(购自Jackson Lab，005673-C.Cg-Tg(Mx1-cre)1Cgn/J)杂交。选择5-6周龄小鼠(Sigma P1530)腹腔内注射pIpC(15μg/g，两天一次，总共10天)诱导Cre的表达。

M2：分离HSPC和细胞培养：

从6-8周Utx野生型(WT)和Utx敲除小鼠提取骨髓细胞WBM，然后用鼠抗CD117磁性微珠(Miltenyi Biotec，130-091-224)从WBM中分离得到造血干祖细胞(HSPC)。原代小鼠细胞用BCM培养基添加10％SCM(干细胞培养基)进行培养。

所述BCM培养基是由50％IMDM培养基+50％DMEM培养基+10％FBS+5％PS+0.34％BME配制而成。

所述SCM培养基包括10％FBS，IL3(10ng/ml；1：1000)，IL6(10ng/ml；1：500)，SCF(50ng/ml；1：1000)。

M3：药物筛选：

用于药物筛选的表观遗传学化合物库(包括276种药物化合物)购自Selleckchem(目录号#L1900)。药物化合物均稀释在DMSO溶液中，最终浓度为10uM。将Utx野生型和Utx敲除小鼠骨髓细胞分选得到HSPCs，分别在5个96孔低粘附表面培养板上均匀接种，体外培养24h。(原代细胞数为40,000，每孔含100μL培养基；在其中一个96孔板上，有60个孔接种细胞，而其余周围的板孔接种PBS)。然后，将276种药物化合物分别以10μM浓度接种到Utx野生型和Utx敲除的HSPC细胞培养板孔中。以DMSO作为对照处理。培养3天后，通过流式细胞术(FCM)进行细胞检测。

M4：流式细胞仪：

在接种药物化合物后，正常培养3天，然后对细胞进行标记物Mac-1(Clone：M1/70，BD101224)和C-kit(Clone：2B8，BD105812)染色。然后，使用多色高清流式细胞分析仪(BDLSRFortessa)进行流式细胞术分析，所得数据用FlowJo进行分析。

M5：RNA-Seq样品制备：

从Utx^+/+和Utx^-/-小鼠骨髓细胞中分离得到HSPC，体外培养24小时，均匀地接种在低粘附96孔板中(初始量为40,000/孔，100uL培养基/每孔)。然后，将药物化合物SP2509加入到Utx^+/+和Utx^-/-组，设置3个平行样。将没有添加药物作为对照组。添加药物化合物12小时后，将细胞收集起来进行RNA-Seq检测分析。

M6：RNA测序分析：

采用 Ultra^TMRNA库预处理工具对RNA-seq进行库化，然后用IlluminaHiSeq TM X测序仪，150bp配对末端读数，进行测序。RNA-seq测序结果通过STAR_2.6.0a与参考基因组(GRCm38)比对。将转录物丰度标准化，确定每百万个片段定位的片段(FPKM)中每千万个外显子含量。采用DESeq2分析细胞分化基因表达。将绝对倍数变化大于0.5，且FDR≤0.05的基因，计作细胞分化基因表达。细胞分化基因表达热图通过Heatmap进行分析，并按照Z core得分进行标准化。利用PCA和欧几里德距离计算样本热力图的差异大小。采用基因富集分析(GSEA)分析两组样品之间特定基因组的统计学相似性和差异性。

M7：Chip-seq数据收集和可视化：

从GEO数据库下载登录号为GSE63222，GSE101307和GSE76692的数据。并使用Integrative Genomics Viewer(IGV)将其可视化。

M8：蛋白质印迹：

从Utx^+/+和Utx^-/-小鼠骨髓细胞中分离得到HSPC细胞，体外培养24小时，均匀接种在低粘附96孔板中(初始量为40,000/孔，100uL培养基/每孔)。然后，将化合物SP2509加入到Utx^+/+和Utx^-/-组样本中，设置三份平行样。同时，设置不添加DMSO药物化合物的样本作为对照组。添加药物化合物12小时后，离心收集细胞样品。然后，使用超声波细胞破碎仪(Ultrasonic Cell Disruptor)将细胞沉淀在SDS缓冲液裂解。将裂解得到的蛋白质样品配制成15％浓度溶液，用15％SDS-PAGE凝胶进行分离，分离所得产物转移至PVDF膜。在蛋白质印迹中，使用H3K4me3(abcam，ab8580)的抗体进行检测。监控H3(组蛋白Histone 3，HuaBio，EM30605)的丰度以确保相等的加载。

M9：qPCR分析：

基因的表达水平使用SYBR Green Master Mix和Quant Studio 3实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行定量分析。一部分基因选自微阵列数据中的下调基因，用于Utx敲除组与Utx野生型比较。另一部分基因选自微阵列数据中的上调基因，用于SP2509处理的Utx敲除组与Utx野生型组比较。最后，通过ddCT值法计算基因的相对表达程度，最终分析方法如前所述。

M10：白血病小鼠造模和生物体内治疗：

所有动物研究均经四川大学机构动物护理和使用委员会批准。

将2×10⁶个Utx基因敲除的肿瘤细胞通过尾静脉注射移植到亚致死量(4.5Gy)辐射的8周龄雌性C57BL/6小鼠体内。术后7天开始药物处理，并在每次对6只小鼠进行给药处理：空白手术组vs.25mg/kg SP2509药物组每组设3个平行样。小鼠每周腹膜内注射给药2次(周一和周三给药)，SP2509组小鼠注射SP2509的缓冲溶液(20％PEG-40，20％二甲基亚砜，60％无菌水)，空白手术组小鼠注射等量无药物缓冲溶液。SP2509的药物溶液浓度为5mg/mL，注射量为5μL/小鼠(每g体重)。通过流式细胞术测试分析SP2509在试验组小鼠体内的作用。小鼠存活状态通过Kaplan-Meier生存曲线图进行展示。

Claims

1.LSD1抑制剂在制备药物中的用途。

2.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述LSD1抑制剂是SP2509，其分子式如下：

。

3.如权利要求2所述用途，其特征在于，化合物SP2509在治疗肿瘤疾病的药物制备中的应用。

4.如权利要求2所述用途，其特征在于，所述化合物SP2509通过逆转表观遗传发挥治疗肿瘤疾病的作用。

5.如权利要求2所述用途，其特征在于，所述化合物SP2509通过抑制LSD1对H3K4的去甲基化活性，从而促进了细胞分化相关基因和肿瘤抑制因子的表达水平。

6.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述药物是治疗肿瘤疾病、遗传疾病的药物。

7.如权利要求6所述用途，其特征在于，所述肿瘤疾病是实体肿瘤或血液肿瘤。

8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述实体肿瘤是膀胱癌、腺样囊性癌、成神经管细胞瘤、前列腺癌、肺癌、食管癌或胶质瘤。

9.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述血液肿瘤是指慢性粒单核细胞性白血病、慢性髓细胞白血病、T淋巴细胞白血病、B淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾肉瘤样癌、骨髓增生综合征或急性髓细胞性白血病。

10.如权利要求6所述用途，其特征在于，所述遗传疾病是Utx缺失的性染色体遗传疾病。