CN111051524A - 从rna和dna制备核酸文库 - Google Patents

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Abstract

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及衍生自RNA和DNA的核酸文库的制备和用途。在一些实施方式中，核酸文库可以通过标签化衍生自RNA的多核苷酸来制备。一些实施方式包括对来自这样的文库的序列数据的分析。

Description

从RNA和DNA制备核酸文库
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月22日提交的题为“PREPARATION OF NUCLEIC ACIDLIBRARIES FROM RNA AND DNA”的美国临时申请号62/646487的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及衍生自RNA和DNA的核酸文库的制备和用途。在一些实施方式中，可以通过标签化衍生自RNA的多核苷酸来制备核酸文库。
发明背景
组织样品的全基因组测序、基因分型、靶向再测序和基因表达分析可以具有极大的重要性，用于识别疾病生物标志物，准确诊断和预测疾病，和选择对于患者适当的治疗。例如，从患者切除的肿瘤组织的核酸序列分析可用于确定特定基因生物标志物的存在或不存在，例如体细胞变异、结构重排、点突变、缺失、插入，和/或特定基因的存在或不存在。无细胞(cell free)样品可用于制备核酸文库用于序列分析。然而，在这样的文库中包含疾病生物标志物的核酸可以是稀有且难以检测的。因此，在疾病生物标志物的检测中的增加的灵敏度是期望的。
发明内容
一些实施方式包括一种用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)使多个多核苷酸与包含标签的多个引物杂交，其中所述多个多核苷酸包含RNA和DNA；(b)用逆转录酶延伸所杂交的引物；和(c)从所延伸的引物和所述DNA产生核酸文库。一些实施方式还包括(d)测序所述核酸文库。一些实施方式还包括(e)识别包含所述标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的RNA多核苷酸的序列。一些实施方式还包括识别缺少所述标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的DNA多核苷酸的序列。
在一些实施方式中，多个引物包含不同的序列。在一些实施方式中，每个引物包含不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含大于10,000种不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含大于100,000种不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含随机六聚体序列。在一些实施方式中，多个引物包含相同的标签。
在一些实施方式中，逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。在一些实施方式中，逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)(avian myeloblastosis virus)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)(moloney murine leukemia virus)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)(humanimmunovirus)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)(equine infectious anemia virus)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)(Rous-associated virus-2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
在一些实施方式中，(b)是在DNA多核苷酸的存在下进行。在一些实施方式中，(b)包括从延伸的引物产生双链cDNA。在一些实施方式中，(c)包括使延伸的引物和DNA多核苷酸与选自激酶、连接酶、转座子、聚合酶和测序接头的试剂接触。
在一些实施方式中，多个多核苷酸是无细胞的。在一些实施方式中，多个多核苷酸获自选自血清、间质液、淋巴液、脑脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼泪的样品。
一些实施方式包括用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)使多个多核苷酸与多个引物杂交，其中所述多个多核苷酸包含RNA和DNA；(b)用逆转录酶延伸所杂交的引物；和(c)从所延伸的引物和所述DNA产生核酸文库。
在一些实施方式中，多个多核苷酸是无细胞的。在一些实施方式中，多个多核苷酸获自选自血清、间质液、淋巴液、脑脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼泪的样品。
在一些实施方式中，多个引物包含不同的序列。在一些实施方式中，每个引物包含不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含大于10,000种不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含大于100,000种不同的序列。在一些实施方式中，多个引物包含随机六聚体序列。
在一些实施方式中，逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。在一些实施方式中，逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
在一些实施方式中，(b)是在DNA多核苷酸的存在下进行。在一些实施方式中，(b)包括从延伸的引物产生双链cDNA。在一些实施方式中，(c)包括使延伸的引物和DNA多核苷酸与选自激酶、连接酶、转座子、聚合酶和测序接头的试剂接触。
一些实施方式包括一种识别核酸样品中的核酸的方法，其包括：(i)从由核酸样品通过前述方法中的任一种制备的核酸文库获得序列数据；和(ii)识别包含标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的RNA多核苷酸的序列。一些实施方式还包括(iii)识别包含标签的多核苷酸序列中的变体。在一些实施方式中，变体选自单核苷酸多态性(SNP)、缺失、插入、置换、易位、重复和基因融合。一些实施方式还包括识别包含标签的多核苷酸序列中的逆转录错误。一些实施方式还包括将包含标签的多核苷酸序列与参比序列进行比较。在一些实施方式中，参比序列衍生自核酸文库的DNA多核苷酸。在一些实施方式中，样品包含无细胞核酸。在一些实施方式中，RNA多核苷酸是选自以下的RNA：mRNA、tRNA、核糖体RNA、非编码RNA、piRNA、siRNA、lncRNA、shRNA、snRNA、miRNA、snoRNA、病毒RNA、细菌RNA和核酶。
一些实施方式还包括一种用于制备核酸文库的试剂盒，其包括：逆转录酶；和包含标签的多个引物，其中每个引物是不同的。在一些实施方式中，多个引物包含相同的标签。一些实施方式还包括选自激酶、RNA酶、连接酶、转座子、聚合酶和测序接头的组分。在一些实施方式中，逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。在一些实施方式中，逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
附图说明
图1是用于从RNA和DNA制备核酸文库并对其进行测序的实施方式的示意图。
图2是来自各种患者的样品中某些核酸的浓度的图。
图3是从通过具有(RT计数)或不具有(模拟RT计数)逆转录步骤的方法制备的文库获得的某些序列的数量的图。
图4是对于在NSCLC V1组中测试的某些基因区域，通过具有逆转录步骤(RT)的方法相对于不具有逆转录步骤(模拟RT)的方法制备的文库的覆盖率的图。
图5是在用逆转录步骤制备的文库中发现的频率增加的突变的数量的图。
图6是从采用逆转录酶(A)或不采用逆转录酶(B)用标签化的随机六聚体制备的文库的读取的数量的图。
具体实施方式
本文提供的方法和组合物的实施方式涉及衍生自RNA和DNA的核酸文库的制备和用途。在一些实施方式中，可以通过标签化衍生自RNA的多核苷酸来制备核酸文库。
体液如血清、眼泪、尿液和汗液包含无细胞核酸。这样的核酸可以包含疾病生物标志物。但是，这样的生物标志物在这些液体中的频率或浓度可以极低。一些实施方式包括从RNA和DNA制备核酸文库，其增加了检测某些核酸(包括疾病生物标志物)的灵敏度。
一些实施方式包括用引物来逆转录RNA而制备核酸文库，所述引物包含标签且将所述标签的序列引入衍生自所述RNA的多核苷酸。因此，标签可以识别衍生自所述RNA的序列。在一些实施方式中，区分核酸序列的来源可用于确定变体是否可以是文库制备的结果，例如逆转录步骤。在一些实施方式中，区分核酸序列的来源可用于识别剪接变体、组织特异性变体、非编码RNA、和某些基因融合体。非编码RNA(例如长非编码RNA(lncRNA))可用于识别和表征某些癌症类型。参见，例如，Yan,X.等,(2015)“Comprehensive GenomicCharacterization of Long Non-coding RNAs across Human Cancers”,Cancer Cell28:529-540，其全部内容通过引用并入本文。由于二级结构，无细胞lncRNA在血浆中可以比其他RNA(例如蛋白质编码RNA)更稳定。
如本文所用，“多核苷酸”可以指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的结构也可以通过其指示多核苷酸的方向性的5'或3'端或末端来提及。单链的多核苷酸中的相邻核苷酸通常通过其3'和5'碳之间的磷酸二酯键来连接。然而，也可以使用不同的核苷酸间连接，例如包含亚甲基的连接，氨基磷酸酯连接等。这意味着相应的5'和3'碳可以在多核苷酸的任一端暴露，这可以称为5'和3'端或末端。5'和3'端也可以因为连接至这些端的化学基团而分别称为磷酰基(PO4)和羟基(OH)端。术语多核苷酸也指双链和单链分子两者。多核苷酸的实例包括基因或基因片段，基因组DNA，基因组DNA片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，非编码RNA(ncRNA)，例如PIWI相互作用RNA(piRNA)，小干扰RNA(siRNA)，和长非编码RNA(lncRNA)，小发夹(shRNA)，小核RNA(snRNA)，微RNA(miRNA)，小核仁RNA(snoRNA)和病毒RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支化多核苷酸，质粒，载体，具有任何序列的分离的DNA，具有任何序列的分离的RNA，核酸探针，前述任一项的引物或扩增拷贝。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，包括具有非天然碱基的核苷酸，具有修饰的天然碱基的核苷酸，例如氮杂-或脱氮-嘌呤(deaza-purine)。多核苷酸可以由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)。当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)也可以例如作为胸腺嘧啶的天然替代物存在。尿嘧啶也可用于DNA。因此，术语“序列”是指多核苷酸或任何核酸分子的字母表示，包括天然和非天然碱基。
如本文所用，“RNA分子”或核糖核酸分子可以指具有核糖糖(sugar)而不是脱氧核糖糖并且通常具有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶作为嘧啶碱基之一的多核苷酸。RNA分子通常是单链的，但也可以是双链的。在来自RNA样品的RNA分子的背景下，RNA分子可包括在细胞核、线粒体、叶绿体或细菌细胞中从DNA转录的单链分子，其具有与从其转录的DNA链互补的核苷酸碱基的线性序列。
如本文所用，“杂交”、“杂交”或其语法等同物可指其中一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，所述复合物至少部分地通过核苷酸残基的碱基之间的氢键合来形成。氢键合可通过Waston-Crick碱基配对，Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可具有形成双链体结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单一自杂交链，或其任何组合。除氢键合外，链还可交联或通过力以其他方式结合。
如本文所用，“延伸”、“延伸”或其任何语法等同物可指通过延伸酶例如聚合酶将dNTP添加至引物、多核苷酸或其他核酸分子。例如，在本文公开的一些方法中，所得延伸的引物包含RNA的序列信息。尽管一些实施方式被讨论为使用聚合酶例如DNA聚合酶或逆转录酶进行延伸，但是延伸可以以本领域众所周知的任何其他方式进行。例如，延伸可以通过将随机寡核苷酸的短片段连接在一起来进行，例如已经与感兴趣的链杂交的寡核苷酸。
如本文所用，“逆转录”可以指将RNA分子的核苷酸序列复制到DNA分子中的过程。逆转录可通过使RNA模板与RNA依赖性DNA聚合酶(也称为逆转录酶)接触来完成。逆转录酶是将单链RNA转录为单链DNA的DNA聚合酶。取决于所用聚合酶，逆转录酶也可以具有用于后续RNA模板降解的RNA酶H活性。
如本文所用，“互补DNA”或“cDNA”可以指通过逆转录酶的作用从RNA逆转录的合成DNA。cDNA可以是单链或双链的，并且可以包括具有与RNA序列的一部分基本上相同或与RNA序列的一部分互补的序列或其两者的链。
如本文所用，“cDNA文库”可以指从RNA序列产生的DNA序列的集合。cDNA文库可以代表存在于从其提取RNA的原始样品中的RNA。在一些实施方式中，cDNA文库可以代表存在于无细胞核酸样品中的RNA。在一些实施方式中，cDNA文库可以代表在一个细胞或细胞群中产生的给定细胞或细胞群的全部或部分转录组，包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和其他非编码RNA(ncRNA)。
如本文所用，“连接”或“连接”或其其他语法等同物可指通过磷酸二酯键连接两条核苷酸链。这样的反应可以通过连接酶催化。连接酶是指通过ATP或类似的三磷酸酯的水解催化该反应的一类酶。
如本文所用，当涉及核酸序列时使用，“衍生的”可以指从其获得核酸的来源。例如，序列可以获自衍生自样品中的RNA分子的核酸。然而，衍生自特定来源或源的核酸分子尽管如此可以随后复制或扩增。所得拷贝或扩增子的序列可以被称为已经衍生自来源或源。
制备核酸文库
一些实施方式包括制备核酸文库的方法。一些这样的实施方式可以包括获得包含多个多核苷酸的样品，所述多核苷酸包含RNA和DNA；使所述多个多核苷酸与多个引物杂交；和用逆转录酶延伸所杂交的引物。在一些这样的实施方式中，引物包含标签。一些实施方式还包括从所延伸的引物和所述DNA产生核酸文库。
在一些实施方式中，样品可以包含无细胞核酸，例如RNA和DNA。如本文所用，“无细胞的”在涉及核酸时可以指体内从细胞移除的核酸。核酸的移除可以是自然过程，例如坏死或凋亡。无细胞核酸可获自血液或其部分，例如血清。可以从其他体液或组织获得无细胞核酸，实例包括间质液、淋巴液、脑脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼泪。
一些实施方式包括引物的使用。如本文所用，“引物”可以指通常具有游离3'-OH基团的短多核苷酸，其通过与靶标或模板杂交结合存在于样品中的靶标或模板多核苷酸，并随后促进引物延伸以形成与靶标或模板互补的多核苷酸。引物可包括范围为5-1000或更多个核苷酸的多核苷酸。在一些实施方式中，引物具有至少4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸或前述长度中任意两个的范围内的长度。
引物可以包含随机核苷酸序列。如本文所用，“随机核苷酸序列”可以指核苷酸的变化序列，当其与多核苷酸群体中的其他随机核苷酸序列组合时，代表具有给定核苷酸长度的所有或基本上所有可能的核苷酸组合。例如，由于在任何给定位置存在的四个可能的核苷酸，所以长度为两个随机核苷酸的序列具有16种可能的组合，长度为三个随机核苷酸的序列具有64种可能的组合，或者长度为四个随机核苷酸的序列具有265种可能的组合。随机核苷酸序列具有杂交样品中的任何靶多核苷酸的潜力。引物中的随机序列可以包含多个连续核苷酸，并且具有至少4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸的长度或前述长度中任意两个的范围内的长度。在一些实施方式中，多个引物可包括包含不同随机序列的引物。一些实施方式包括使用多个引物。在一些实施方式中，每个引物包含不同的序列。在一些实施方式中，多个引物可包括至少1000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000种不同的序列，或在前述数字中的任意两个之间的范围内的数量的不同的序列。
引物可以包含标签。如本文所用，“标签”可以指连接至引物或探针或掺入多核苷酸的核苷酸序列，其允许在方法或过程中的后续反应或步骤中识别、追踪或分离连接的引物、探针或多核苷酸。还可以选择标签的核苷酸组成，以便允许互补探针的杂交，例如固体支持物上的探针，例如阵列表面，或者杂交用于选择性扩增靶序列的互补引物。标签可以包含多个连续的核苷酸，并且具有至少3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸的长度，或前述长度中任何两个的范围内的长度。标签可以是在引物的5'端，在引物的3'端的序列，或可以是引物内的序列。在一些实施方式中，标签是在引物的3'端的序列。在一些实施方式中，多个引物可以各自具有不同的标签。在一些实施方式中，多个引物可以各自具有相同的标签。
一些实施方式包括逆转录酶的使用。逆转录酶包括RNA依赖性DNA聚合酶。逆转录酶的实例包括禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。在一些实施方式中，逆转录酶可以缺乏DNA依赖性聚合酶活性。在一些实施方式中，逆转录酶可以在存在或不存在DNA的情况下延伸与RNA杂交的引物。与RNA杂交的引物的延伸产生单链cDNA。这样，可以从核酸样品中的RNA产生cDNA文库。一些实施方式还包括使用DNA依赖性DNA聚合酶和核苷酸从延伸的引物产生双链cDNA。
一些实施方式包括从包含含有标签的延伸引物的靶核酸产生核酸文库。在一些这样的实施方式中，靶核酸还可包含含有标签的延伸引物和DNA，例如无细胞DNA。从靶核酸产生核酸文库的实例方法包括转座子介导标签化(tagmentation)。如本文所用，“转座子介导标签化”可以指转座子插入靶核酸中，使得转座子切割靶核酸，并向切割的靶核酸的端添加接头序列。转座子介导标签化的实例方法在美国专利号9,115,396；9,080,211；9,040,256；美国专利申请公布2014/0194324中公开，其全部内容各自通过引用并入本文。另一实例方法包括用连接酶将接头序列连接至靶核酸的端。基于连接的文库制备方法通常利用接头设计，所述设计可在初始连接步骤中引入测序引物位点、扩增引物位点和/或索引序列，并且通常可用于制备用于单读取测序、成对端测序和多重测序的样品。例如，靶核酸可通过补平反应、外切核酸酶反应或其组合来末端修复。在一些实施方式中，然后可以将所得平末端修复的核酸延伸单个核苷酸，其与接头/引物的3'端上的单个核苷酸突出端互补。任何核苷酸均可用于延伸/突出端核苷酸。在一些实施方式中，核酸文库制备包括连接接头寡核苷酸。接头寡核苷酸通常与流动池锚互补，并且有时用于将核酸文库固定在固体支持物上。在一些实施方式中，接头寡核苷酸包含标识符，一个或多个测序引物杂交位点，例如与通用测序引物互补的序列，单端测序引物，成对端测序引物，多重测序引物，等等，或其组合，例如接头/测序、接头/标识符、接头/标识符/测序。
在一些实施方式中，核酸文库或其部分可以使用接头序列中的扩增引物位点来扩增。核酸文库可以通过基于PCR的方法或等温扩增方法来扩增。不同类型的扩增方法的实例包括多重PCR、数字PCR(dPCR)、拨出(dial-out)PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、连接介导PCR、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、巢式PCR、定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、固相PCR，连接酶链反应，链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利号8,003,354所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，可以用连接至固相的扩增引物发生扩增。利用两种连接至表面的引物的形式通常被称为桥式扩增，因为双链扩增子在位于已复制的模板序列的两翼的两个表面连接的引物之间形成了桥样结构。可用于桥式扩增的实例试剂和条件在美国专利号5,641,658；美国专利公布号2002/0055100；美国专利号7,115,400；美国专利公布号2004/0096853；美国专利公布号2004/0002090；美国专利公布号2007/0128624；和美国专利公布号2008/0009420中描述，其各自通过引用并入本文。用于扩增核酸的其他方法可以包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)和寡核苷酸连接测定(OLA)。参见例如，美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907，其全部内容各自通过引用并入本文。可以被专门设计以扩增感兴趣的核酸的引物延伸和连接引物的实例公开于美国专利号7,582,420和7,611,869，其全部内容各自通过引用并入本文。实例等温扩增方法包括多重置换扩增(MDA)，其公开于Dean等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；等温链置换核酸扩增，其公开于美国专利号6,214,587，前述参考文献的全部内容各自通过引用并入本文。扩增反应、条件和组分的另外描述在美国专利号7,670,810的公开内容中详细阐述，其全部内容通过引用并入本文。
一些实施方式可以包括对核酸进行测序。测序技术的实例包括合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板的延伸，以确定模板中的核苷酸的序列。作为基础的化学过程可以是聚合。在特定的基于聚合酶的SBS实施方式中，添加荧光标记的核苷酸以以模板依赖性方式延伸引物，使得可以使用对添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测以确定模板的序列。可以对一个或多个扩增的核酸进行SBS或其他涉及在循环中重复递送试剂的检测技术。例如，为了启动第一个SBS循环，可以使一个或多个标记核苷酸、DNA聚合酶等流入/通过容纳一个或多个扩增的核酸分子的水凝胶珠。可以检测到引物延伸导致掺入标记核苷酸的那些位点。任选地，核苷酸还可以包括可逆的终止性质，一旦将核苷酸添加至引物，该可逆的终止性质终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得后续延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方式，可以在检测发生之前或之后将解封闭剂递送至流通池。可以在各个递送步骤之间进行洗涤。然后可以重复该循环n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
一些SBS实施方式包括检测在将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于对释放的质子的检测的测序可以使用电检测器和可商购的相关技术。这样的测序系统的实例是焦磷酸测序，例如来自Roche的子公司454Life Sciences的可商购平台；使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序，例如来自Pacific Biosciences的可商购平台；和使用质子检测的测序，例如来自Life Technologies的子公司Ion Torrent的可商购平台。
焦磷酸测序检测在特定核苷酸被掺入新生核酸链中时无机焦磷酸酯(PPi)的释放。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且可以通过荧光素酶产生的质子来检测生成的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。焦测序程序不需要用于基于荧光的检测系统的激发辐射源。
一些实施方式可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用、或通过零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。另一种有用的测序技术是纳米孔测序。在一些纳米孔实施方式中，靶核酸或从靶核酸除去的个体核苷酸穿过纳米孔。随着核酸或核苷酸穿过纳米孔，可以通过测量孔的电导率的波动来识别每种核苷酸类型。
实施方式可包括使用各种试剂对核酸的分离、扩增和测序。这样的试剂可包括例如溶菌酶；蛋白酶K；随机六聚体；聚合酶，例如Φ29DNA聚合酶，Taq聚合酶，Bsu聚合酶；转座酶，如Tn5；引物，如P5和P7接头序列；连接酶；脱氧核苷酸三磷酸；缓冲液；或二价阳离子，例如镁阳离子。接头可包含测序引物位点、扩增引物位点、和索引。如本文所用，“索引”可以包括核苷酸序列，其可以用作分子标识符和/或条形码以标记核酸，和/或识别核酸的来源。在一些实施方式中，索引可用于识别单个核酸或核酸亚群。
图1描绘了制备核酸文库的方法的实例实施方式。如图1所示，提供了包含无细胞RNA和无细胞DNA的样品。包含随机六聚体序列和标签序列的引物杂交至RNA。使用逆转录酶将杂交的引物延伸以产生第一cDNA链。可以从第一cDNA链合成第二cDNA链以产生双链cDNA。前述步骤可以在无细胞DNA的存在下进行。核酸文库可以从双链cDNA和无细胞DNA产生。步骤可以包括核酸分子的末端修复、核酸分子的A-尾、接头的连接、通过PCR扩增文库，以及对文库进行测序。可以通过包含标签序列来识别衍生自无细胞RNA的序列。可以通过缺少标签序列来识别衍生自无细胞DNA的序列。
一些实施方式包括识别核酸样品中的核酸。一些这样的实施方式可包括通过本文提供的方法从由核酸样品制备的核酸文库获得序列数据，并识别包含标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自RNA多核苷酸的序列。一些实施方式还可包括识别包含标签的多核苷酸序列中的变体。变体的实例包括单核苷酸多态性(SNP)、缺失、插入、置换、易位、复制、和基因融合。一些实施方式还包括识别包含标签的多核苷酸序列中的逆转录错误。例如，逆转录酶可以将错误引入cDNA。因此，识别序列来源可用于确定变体是否可以是逆转录的结果。在一些实施方式中，衍生自RNA的多核苷酸序列可与参比序列进行比较，如核酸文库的DNA多核苷酸的序列。
试剂盒
本文提供的一些实施方式包括试剂盒。试剂盒可包括用于从包含RNA的样品制备核酸文库的试剂。这样的试剂盒可包括逆转录酶和包含标签的多个引物。试剂盒还可以包括产生双链cDNA的试剂，例如DNA聚合酶和核苷酸。试剂盒还可以包括试剂，例如激酶、RNA酶、连接酶、转座子、聚合酶、和测序接头。
实施例
实施例1—血清中的RNA/DNA分子
液滴数字PCR(ddPCR)用于测量来自癌症患者和对照受试者的血清中编码磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)和B-Raf(BRAF)的核酸的浓度。在扩增之前，用和不用逆转录步骤制备核酸，以提供含有DNA或DNA和逆转录RNA(cDNA)的样品。对于PIK3CA分析，使用用FAM标记的PIK3CA(dHsaCP2506262)的外显子20的79nt扩增子(BIO-RAD，Hercules，CA)。对于BRAF分析，使用用HEX标记的BRAF(dHsaCP2500366)的66nt外显扩增子(BIO-RAD，Hercules，CA)。
对于编码PIK3CA和BRAF外显子的DNA分子的数量，以及编码PIK3CA和BRAF外显子的DNA和RNA分子总共的数量，测定初始血清浓度。图2是来自癌症患者(癌症1、2和3)和对照受试者(正常1、2和3)的血清中编码PIK3CA和BRAF的核酸的浓度的图。已用逆转录步骤处理以计算外显子初始浓度的核酸样品标记为“DNA+RNA”。未用逆转录步骤处理以计算外显子初始浓度的核酸样品标记为“DNA”。
图2中总结的结果证明，样品中的BRAF RNA水平显著高于PIK3CA水平，并且DNA:RNA种类的相对浓度在受试者之间变化。
实施例2—用RT步骤制备的文库的全基因组测序
用和不用逆转录步骤从包含DNA和RNA的核酸的无细胞样品制备核酸文库。使用Truseq RNA Access Library试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备该文库，而不进行富集。对文库进行测序，将序列与总转录组进行比对。图3证明，来自用逆转录步骤制备的文库的序列(RT序列)中与已知基因对齐的序列的数量显著大于未用逆转录步骤制备的文库的序列(模拟RT序列)。另外，RT序列的与外显子例如GNAQ基因的外显子4和5以及LINC00152非编码基因的外显子对齐的序列的数量显著大于模拟RT序列(数据未显示)。
实施例3–用RT步骤制备的文库的靶向测序
用和不用逆转录步骤从包含来自癌症患者的DNA和RNA的核酸的无细胞样品制备核酸文库。使用Truseq RNA Access Library试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备该文库，使用从非小细胞肺癌(NSCLC)V1组设计的探针对文库进行富集。将序列与NSCLC V1组中包括的靶向基因进行比对。图4是对于在NSCLC V1组中测试的某些基因区域，通过具有逆转录步骤(RT)的方法相对于不具有逆转录步骤(模拟RT)的方法制备的文库的覆盖率的图。图4显示RT序列的NSCLC V1组中的至少12个基因的覆盖率超过模拟RT序列的两倍。当文库制备中包括逆转录时，对至少12个基因的检测灵敏度显著提高。
进一步分析了BRAF基因变体和CD44-FGFR2基因融合变体的测序数据。各个变体的分析结果分别总结于表1和表2。对于这两种变体，从用逆转录步骤制备的文库分析的RT序列的检测灵敏度与从不用逆转录步骤制备的文库分析的模拟RT序列相比显著提高。
表1
Figure BDA0002345886870000151
表2
样品 CD44-FGFR2融合频率
模拟RT 0％
RT 0.2％
实施例4—仅在用RT步骤制备的文库中检测到的突变
用和不用逆转录步骤从来自15位癌症患者的包含DNA和RNA的核酸的无细胞样品制备核酸文库。使用Truseq RNA Access Library试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备该文库，使用从NSCLC V1组设计的探针对文库进行富集。该文库通过靶向测序进行测序，将序列与靶向基因组进行比对。图5是在用逆转录步骤制备的文库中发现的频率增加的突变的数量的图。
实施例5—制备仅标签化衍生自RNA的cDNA的文库
在标签化的随机六聚体的存在下，在逆转录酶的存在或不存在下，从包含DNA和RNA的核酸的无细胞样品制备核酸文库。使用Truseq RNA Access Library试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备该文库，使用从NSCLC V1组设计的探针对文库进行富集。对文库进行测序，确定每个文库的标签化序列的读取的数量。图6是从采用逆转录酶(A)或不采用逆转录酶(B)用标签化的随机六聚体制备的文库的读取的数量的图。图6说明，标签化序列存在于用逆转录酶制备的文库中，在不用逆转录酶制备的文库中检测到标签化序列的非实质性背景水平。这证明使用标签可以容易地识别衍生自RNA的cDNA的序列，并且可以将其与未标签化的序列区分开。
如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于……”同义，并且是包括性的或开放性的，不排除另外的、未记载的要素或方法步骤。
以上描述公开了本发明的多种方法和材料。本发明容许方法和材料的改变，以及制造方法和设备的改变。通过考虑本文公开的本发明的该公开内容或实践，这样的改变对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限制于本文公开的特定实施方式，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有改变和替代。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公布和未公布的申请、专利和文献参考，其全部内容均通过引用并入本文，并因此成为本说明书的一部分。对于通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的程度，本说明书旨在代替和/或优先于任何这样的相矛盾的内容。

Claims (43)

1.一种用于制备核酸文库的方法，其包括：
(a)使多个多核苷酸与包含标签的多个引物杂交，其中所述多个多核苷酸包含RNA和DNA；
(b)用逆转录酶延伸所杂交的引物；和
(c)从所延伸的引物和所述DNA产生核酸文库。
2.权利要求1所述的方法，其还包括(d)测序所述核酸文库。
3.权利要求2所述的方法，其还包括(e)识别包含所述标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的RNA多核苷酸的序列。
4.权利要求3所述的方法，其还包括识别缺少所述标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的DNA多核苷酸的序列。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含不同的序列。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中每个引物包含不同的序列。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含大于10,000种不同的序列。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含大于100,000种不同的序列。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含随机六聚体序列。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含相同的标签。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中(b)是在所述DNA多核苷酸的存在下进行。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中(b)包括从所述延伸的引物产生双链cDNA。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中(c)包括使所述延伸的引物和DNA多核苷酸与选自激酶、连接酶、转座子、聚合酶、和测序接头的试剂接触。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸是无细胞的。
17.权利要求16所述的方法，其中所述多个多核苷酸获自选自血清、间质液、淋巴液、脑脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼泪的样品。
18.一种用于制备核酸文库的方法，其包括：
(a)使多个多核苷酸与多个引物杂交，其中所述多个多核苷酸包含RNA和DNA；
(b)用逆转录酶延伸所杂交的引物；和
(c)从所延伸的引物和所述DNA产生核酸文库。
19.权利要求18所述的方法，其中所述多个多核苷酸是无细胞的。
20.权利要求18或19所述的方法，其中所述多个多核苷酸获自选自血清、间质液、淋巴液、脑脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼泪的样品。
21.权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含不同的序列。
22.权利要求18-21中任一项所述的方法，其中每个引物包含不同的序列。
23.权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含大于10,000种不同的序列。
24.权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含大于100,000种不同的序列。
25.权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述多个引物包含随机六聚体序列。
26.权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。
27.权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
28.权利要求18-27中任一项所述的方法，其中(b)是在所述DNA多核苷酸的存在下进行。
29.权利要求18-28中任一项所述的方法，其中(b)包括从所述延伸的引物产生双链cDNA。
30.权利要求18-29中任一项所述的方法，其中(c)包括使所述延伸的引物和DNA多核苷酸与选自激酶、连接酶、转座子、聚合酶、和测序接头的试剂接触。
31.一种识别核酸样品中的核酸的方法，其包括：
(i)从由核酸样品通过权利要求1-30中任一项所述的方法制备的核酸文库获得序列数据；和
(ii)识别包含标签的多核苷酸序列，从而识别衍生自所述多个多核苷酸的RNA多核苷酸的序列。
32.权利要求31所述的方法，其还包括(iii)识别所述包含标签的多核苷酸序列中的变体。
33.权利要求32所述的方法，其中所述变体选自单核苷酸多态性(SNP)、缺失、插入、置换、重复、易位和基因融合。
34.权利要求31-33中任一项所述的方法，其还包括识别所述包含标签的多核苷酸序列中的逆转录错误。
35.权利要求31-34中任一项所述的方法，其还包括将所述包含标签的多核苷酸序列与参比序列进行比较。
36.权利要求35所述的方法，其中所述参比序列衍生自所述核酸文库的DNA多核苷酸。
37.权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述样品包含无细胞核酸。
38.权利要求31-37中任一项所述的方法，其中所述RNA多核苷酸是选自以下的RNA：mRNA、tRNA、核糖体RNA、非编码RNA、piRNA、siRNA、lncRNA、shRNA、snRNA、miRNA、snoRNA、病毒RNA、细菌RNA和核酶。
39.一种用于制备核酸文库的试剂盒，其包括：
逆转录酶；和
包含标签的多个引物，其中每种引物是不同的。
40.权利要求39所述的试剂盒，其中所述多个引物包含相同的标签。
41.权利要求39或40所述的试剂盒，其还包括选自激酶、RNA酶、连接酶、转座子、聚合酶和测序接头的组分。
42.权利要求39-41中任一项所述的试剂盒，其中所述逆转录酶缺乏DNA依赖性聚合酶活性。
43.权利要求39-42中任一项所述的试剂盒，其中所述逆转录酶选自：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、人免疫病毒(HIV)逆转录酶、马传染性贫血病毒(EIAV)逆转录酶、劳斯相关病毒-2(RAV2)逆转录酶、C.hydrogenoformansDNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性变体。
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