CN110669840B - 一种npm1突变检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种NPM1突变检测试剂盒，涉及生物技术领域，该试剂盒包括上游引物、下游引物、特异性探针、RT‑PCR反应酶体系、RT‑PCR预混液、DEPC H2O、dNTPs和质控品。其中，上游引物为：5’‑ATTGCTTCCGGATGACTG‑3’；下游引物为：5’‑CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG‑3’；特异性探针为：5’‑FAM‑CCTCCAGATCTCTGTCTGGCAGTGGAGG‑BHQ1‑3’，该试剂盒具有灵敏度高、准确度好以及特异性强的优点，通过该试剂盒的检测方法，即样品提取、PCR扩增以及PCR荧光检测，能够快速检测出NPM1‑A型突变。

Description

一种NPM1突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种NPM1突变检测试剂盒。
背景技术
NPM1是一种广泛在核仁表达的蛋白，它可以在细胞核和细胞质之间穿梭，参与核糖体蛋白的组装和运输，调控中心体的复制以及调控肿瘤抑制因子ARF的表达，通常，NPM1的突变会导致该蛋白从细胞核转移到细胞质，引发急性髓细胞白血病。NPM1的突变目前已发现55种左右变异体，绝大多数涉及第12号外显子上的插入突变，尤其是4个碱基的插入，其中，最为频繁的为A型突变(插入TCTG)，约占突变的77％-80％。NPM1突变发生频率高，存在NPM1突变的病患通常缓解率高、生存周期长且病情稳定，因此NPM1突变是预后良好的指标。目前，NPM1突变的检测方法包括Sanger测序法、CAPs法、PCR技术、高效液相色谱分析、毛细管液相色谱法以及高分辨熔解曲线方法等。在众多检测方法中，PCR技术包括原位PCR、反转录PCR、实时荧光定量PCR以及巢式PCR等类别，其特异性强、灵敏度高且操作简便，被国内外研究者广泛使用。
中国专利CN107893108A公开了一种急性髓系白血病NPM1突变基因分型检测试剂盒，通过设计NPM1突变基因mutA、mutB、mutD和野生型的一对共有引物和一条共用FAM标记探针，使用本试剂盒提供的PCR扩增及熔解曲线方法，可依据熔解曲线的峰值对A型、B型、D型突变进行检测与分型，灵敏度为1％，即野生型背景下，100个细胞中有1个突变细胞也可检出。本发明建立的探针熔解曲线法可用于筛查NPM1-A型、-B型及-D型的NPM1突变基因，具有快速、稳定、准确、检测费用低的优点，有助于临床上NPM1突变阳性病人的诊断分型和治疗指导。但该试剂盒价格相对较高，且不易找到本底值较低的探针，在分型检测时易出现误差。
中国专利CN105950775B公开了一种检测NPM1基因突变分型的试剂盒，该试剂盒包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。该试剂盒应采用一步法实时荧光PCR反应模式，并对特异性探针进行LNA修饰，能超敏快速检测急性髓性白血病患者骨髓及外周血样本中的NPM1基因12外显子突变，最低检出量为0.2ng，同时根据不同通道信号值可对A型、B型、D型突变进行分型，同时加入内标控制系统可检测样本提取效果，可广泛应用于急性髓性白血病化疗效果的预估。但该试剂盒灵敏度相对较低，且容易产生假阳性或假阴性的情况。
针对NPM1突变检测存在的成本高、结果容易出现误差等问题，本发明提供了一种NPM1突变检测试剂盒，该试剂盒灵敏度以及准确度较高，特异性较强，能够快速检测出NPM1的A型突变。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种NPM1突变检测试剂盒，该试剂盒灵敏度以及准确度较高，特异性较强，能够快速检测出NPM1的A型突变。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种NPM1突变检测试剂盒，包括上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、DEPC H2O、dNTPs和质控品；
所述RT-PCR预混液包括：12-15mmol/LMgCl2、100-120mmol/LKCl、5-8mmol/L磷酸三钙、3-5mmol/L龙胆二糖、0.5-0.8mmol/L甲状旁腺激素和30-40mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系；
所述RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸；
所述上游引物为：5’-ATTGCTTCCGGATGACTG-3’；
所述下游引物为：5’-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3’；
所述特异性探针为：5’-FAM-CCTCCAGATCTCTGTCTGGCAGTGGAGG-BHQ1-3’。
进一步地，所述上游引物和下游引物的浓度均为0.12-0.45μmol/L，所述特异性探针的浓度为0.12-0.2μmol/L。上游引物、下游引物及特异性探针序列详细信息见本发明序列表。
优选地，所述RT-PCR预混液包括：13-14.5mmol/LMgCl2、105-115mmol/LKCl、6-7.5mmol/L磷酸三钙、3-4mmol/L龙胆二糖、0.6-0.7mmol/L甲状旁腺激素和32-38mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系。
进一步优选地，所述RT-PCR预混液包括：14mmol/LMgCl2、110mmol/LKCl、7mmol/L磷酸三钙、3.2mmol/L龙胆二糖、0.68mmol/L甲状旁腺激素和35mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系。
进一步地，所述RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸。
进一步地，所述Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸的重量比为1:2:1.6-2.4。
优选地，所述Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸的重量比为1:2:2。
进一步地，所述dNTPs浓度为10mmol/L。
进一步地，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为NPM1突变A型基因的体外转录RNA，所述阴性质控品为去离子水。
进一步地，所述甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为5-10:30-50:15-25。
优选地，所述甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为8:40:22。
进一步地，所述磷酸三钙、龙胆二糖和甲状旁腺激素的摩尔比为2-3:1:0.2-0.3。
进一步地，所述RT-PCR预混液的pH为7.5-8.8。
本发明还提供了一种上述试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品提取：使用核酸提取试剂盒提取全血或骨髓样本中的RNA；
(2)PCR扩增：将上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、dNTPs和DEPC H2O充分混合后，加入步骤(1)中得到的RNA，以同样的方法设置阳性对照组和阴性对照组，分别加入阳性质控品和阴性质控品进行扩增；循环条件为50℃35min，1-2个循环；94-95℃2min，1个循环；94-95℃15-30s、60-65℃30-40s，3-8个循环；94-95℃10-15s、50-60℃30-40s、63-65℃20-35s，40个循环；
(3)荧光检测：对PCR进行荧光检测，根据最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若PT-PCR反应物的荧光检测为阳性，则表明发生NPM1基因A型突变。
进一步地，步骤(2)中所述循环条件为50℃35min，1-2个循环；94-95℃2min，1个循环；94-95℃22s、62-64℃36s，3-8个循环；94-95℃12s、52-55℃35s、64℃28s，40个循环。
进一步地，步骤(2)中所述阳性质控品、阴性质控品以及待检测RNA的加入量均为2μL。进一步地，步骤(2)中所述RT-PCR检测的反应体系包括0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.25μL特异性探针、2μL RT-PCR反应酶体系、8.75μL RT-PCR预混液、8μL DEPC H2O和3μLdNTPs。
本发明所取得的技术效果是：
1.本申请试剂盒通过甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS以及HCl之间的组成配比，能够增强试剂盒的灵敏度，同时通过在预混液中加入磷酸三钙，与甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系共同作用，提高本申请试剂盒的准确度；
2.本申请试剂盒的灵敏度、准确度较高，特异性强，能够快速而准确地对NPM1的A型突变进行检测。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种NPM1突变检测试剂盒，包括上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、DEPC H2O、dNTPs和质控品；
其中，RT-PCR预混液包括：14mmol/LMgCl2、110mmol/LKCl、7mmol/L磷酸三钙、3.2mmol/L龙胆二糖、0.68mmol/L甲状旁腺激素和35mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系；RT-PCR预混液的pH为8；
上游引物为：5’-ATTGCTTCCGGATGACTG-3’；
下游引物为：5’-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3’；
特异性探针为：5’-FAM-CCTCCAGATCTCTGTCTGGCAGTGGAGG-BHQ1-3’。
其中，上游引物和下游引物的浓度均为0.35μmol/L，探针的浓度为0.18μmol/L；
RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸，三者的重量比为1:2:2；
质控品包括阳性质控品和阴性质控品，该阳性质控品为NPM1突变A型基因的体外转录RNA，该阴性质控品为去离子水；
甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为8:40:22。
该试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品提取：使用核酸提取试剂盒提取骨髓样本中的RNA；
(2)PCR扩增：将上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、dNTPs和DEPC H2O充分混合后，加入步骤(1)中得到的RNA，以同样的方法设置阳性对照组和阴性对照组，分别加入阳性质控品和阴性质控品进行扩增；循环条件为50℃35min，1个循环；95℃2min，1个循环；95℃22s、64℃36s，5个循环；95℃12s、55℃35s、64℃28s，40个循环；
(3)荧光检测：对PCR进行荧光检测，根据最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若PT-PCR反应物的荧光检测为阳性，则表明发生NPM1基因A型突变。
表1为检测时各个成分用量，反应体系总量为25μL。
表1
试剂成分 用量
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
特异性探针 0.25μL
RT-PCR反应酶体系 2μL
RT-PCR预混液 8.75μL
DEPC H<sub>2</sub>O 8μL
dNTPs(10mmol/L) 3μL
阴性质控品/阳性质控品/RNA 2μL
实施例2
与实施例1的区别仅在于，RT-PCR预混液包括：12mmol/LMgCl2、100mmol/LKCl、5mmol/L磷酸三钙、3mmol/L龙胆二糖、0.5mmol/L甲状旁腺激素和30mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系，RT-PCR预混液的pH为7.5；上游引物和下游引物的浓度均为0.12μmol/L，探针的浓度为0.12μmol/L；甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为5:30:15。RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸，三者的重量比为1:2:1.6。此外，将上述试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法中循环条件为：50℃35min，1个循环；94℃2min，1个循环；94℃30s、60℃40s，3个循环；94℃15s、50℃40s、63℃35s，40个循环。
实施例3
与实施例1的区别仅在于，RT-PCR预混液包括：15mmol/LMgCl2、120mmol/LKCl、8mmol/L磷酸三钙、5mmol/L龙胆二糖、0.8mmol/L甲状旁腺激素和40mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系，RT-PCR预混液的pH为8.8；上游引物和下游引物的浓度均为0.45μmol/L，探针的浓度为0.2μmol/L；甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为10:50:25。RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸，三者的重量比为1:2:2.4。此外，将上述试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法中循环条件为：50℃35min，2个循环；95℃2min，1个循环；95℃15s、65℃30s，8个循环；95℃10s、60℃30s、65℃20s，40个循环。
实施例4
与实施例1的区别仅在于，RT-PCR预混液包括：13mmol/LMgCl2、105mmol/LKCl、6mmol/L磷酸三钙、3mmol/L龙胆二糖、0.6mmol/L甲状旁腺激素和32mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系；上游引物和下游引物的浓度均为0.2μmol/L，探针的浓度为0.15μmol/L；甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为6:32:17。RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸，三者的重量比为1:2:1.6。此外，将上述试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法中循环条件为：50℃35min，1个循环；94℃2min，1个循环；94℃30s、60℃40s，3个循环；94℃15s、50℃40s、63℃35s，40个循环。
实施例5
与实施例1的区别仅在于，RT-PCR预混液包括：14.5mmol/LMgCl2、115mmol/LKCl、7.5mmol/L磷酸三钙、4mmol/L龙胆二糖、0.7mmol/L甲状旁腺激素和38mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系；上游引物和下游引物的浓度均为0.4μmol/L，探针的浓度为0.2μmol/L；甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为9:45:24。RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸，三者的重量比为1:2:2.4。此外，将上述试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法中循环条件为：50℃35min，2个循环；95℃2min，1个循环；95℃15s、65℃30s，8个循环；95℃10s、60℃30s、65℃20s，40个循环。
对比例1
实施例1的区别仅在于，RT-PCR预混液包括：10mmol/LMgCl2、125mmol/LKCl、3mmol/L磷酸三钙、6mmol/L龙胆二糖、0.3mmol/L甲状旁腺激素和42mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系。
对比例2
实施例1的区别仅在于，甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为3:52:14(甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系的总量与实施例1相同)。
对比例3
实施例1的区别仅在于，磷酸三钙、龙胆二糖和甲状旁腺激素的摩尔比为1:1:0.5(磷酸三钙、龙胆二糖和甲状旁腺激素的总量与实施例1相同)。
对比例4
实施例1的区别仅在于，Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸的重量比为1:2:3(Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸的总量与实施例1相同)。
对比例5
实施例1的区别仅在于，循环条件为50℃35min，3个循环；90℃2min，1个循环；90℃12s、58℃28s，10个循环；90℃8s、45℃28s、60℃18s，40个循环。
一、试剂盒准确度试验
找寻30名NPM1发生A型突变的急性髓性白血病患者，分别采用本申请中实施例1-5和对比例1-5中试剂盒对患者进行检测，将试剂盒所检测出的阴性、阳性人数及对应的准确率统计至表2中。
表2
Figure BDA0002254320890000071
Figure BDA0002254320890000081
由表2可知，实施例1-5试剂盒能够准确地检测出NPM1发生A型突变的急性髓性白血病患者，准确率可达90％以上，其中，实施例1的准确率最高可达100％。而实施例1-5试剂盒测试结果的准确率均小于实施例1，由此可知，在本发明中，RT-PCR预混液的组成配比、反应酶体系的组成以及扩增条件均能够影响试剂盒测试的准确率。
二、试剂盒灵敏度试验
采用本申请实施例1-5和对比例1-5中试剂盒进行检测，考察不同试剂盒对不同浓度NPM1-A型突变样本的检测情况，得到表3。
表3
Figure BDA0002254320890000082
注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。
由表3可知，本申请试剂盒能够检测出较低浓度的NPM1-A型突变样本，其中，实施例1-3最低可检测出浓度为0.15ng/mL的样本，实施例4-5最低可检测出浓度为1ng/mL的样本，表明本申请试剂盒对NPM1-A型突变样本有良好的检出能力，最低检出限为0.15ng/mL，而对比例1-5则最低可检测出浓度为1或2ng/mL的样本。
三、试剂盒特异性试验
采用本申请实施例1中试剂盒对乳腺癌、肠道病毒、禽流感病毒以及前列腺癌等样品进行检测，结果均呈现阴性(100％)，表明本申请的试剂盒对NPM1-A型突变具有良好的特异性。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司
<120> 一种NPM1突变检测试剂盒
<130> DI19-1053-F
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attgcttccg gatgactg 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgttacaga aatgaaataa gacg 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctccagatc tctgtctggc agtggagg 28

Claims (7)

1.一种NPM1突变检测试剂盒，其特征在于：包括上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、DEPC H2O、dNTPs和质控品；
所述RT-PCR预混液包括：12-15mmol/L MgCl2、100-120mmol/L KCl、5-8mmol/L磷酸三钙、3-5mmol/L龙胆二糖、0.5-0.8mmol/L甲状旁腺激素和30-40mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系；
所述RT-PCR反应酶体系包括：Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸；
所述上游引物为：5’-ATTGCTTCCGGATGACTG-3’；
所述下游引物为：5’-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3’；
所述特异性探针为：5’-FAM-CCTCCAGATCTCTGTCTGGCAGTGGAGG-BHQ1-3’；
所述Taq酶、逆转录酶和磷脂酰丝氨酸的重量比为1:2:1.6-2.4；
所述甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系中甘氨酸、MOPS和HCl的摩尔比为5-10:30-50:15-25；
所述磷酸三钙、龙胆二糖和甲状旁腺激素的摩尔比为2-3:1:0.2-0.3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述上游引物和下游引物的浓度均为0.12-0.45μmol/L，所述特异性探针的浓度为0.12-0.2μmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR预混液包括：13-14.5mmol/LMgCl2、105-115mmol/L KCl、6-7.5mmol/L磷酸三钙、3-4mmol/L龙胆二糖、0.6-0.7mmol/L甲状旁腺激素和32-38mmol/L甘氨酸-MOPS-HCl缓冲体系。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为NPM1突变A型基因的体外转录RNA，所述阴性质控品为去离子水；
所述NPM1突变A型基因是指在NPM1基因第12号外显子上发生了TCTG四个碱基插入突变的NPM1突变基因。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR预混液的pH为7.5-8.8。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品提取：使用核酸提取试剂盒提取全血或骨髓样本中的RNA；
（2）PCR扩增：将所述上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR反应酶体系、RT-PCR预混液、dNTPs和DEPC H2O充分混合后，加入步骤（1）中得到的RNA，以同样的方法设置阳性对照组和阴性对照组，分别加入阳性质控品和阴性质控品进行扩增；循环条件为50℃ 35min，1-2个循环；94-95℃ 2min，1个循环；94-95℃ 15-30s、60-65℃ 30-40s，3-8个循环；94-95℃10-15s、50-60℃ 30-40s、63-65℃ 20-35s，40个循环；
（3）荧光检测：对PCR进行荧光检测，根据最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若PT-PCR反应物的荧光检测为阳性，则表明发生NPM1基因A型突变；
所述NPM1基因A型突变是指在NPM1基因第12号外显子上发生了TCTG四个碱基插入突变。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述循环条件为50℃35min，1-2个循环；94-95℃ 2min，1个循环；94-95℃ 22s、62-64℃ 36s，3-8个循环；94-95℃ 12s 、52-55℃ 35s、64℃ 28s，40个循环。
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