CN117795091A - 用于快速多重筛选和监测npm1突变的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于NPM1突变的可靠分子监测的组合物和方法。该方法能够实现先发制人的治疗,这对于了解AML疾病状态、告知治疗选择、监测治疗效果和改善患者预后至关重要。该方法同时筛选和量化具有主要NPM1突变体亚型的样品。在一些形式中,用于检测和测量样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的方法包括将标记的序列探针与样品中的NPM1基因杂交以形成标记的探针‑核酸缀合物,扩增探针‑核酸缀合物,并通过测量附着于探针的一种或多种标记的水平来检测标记的探针‑核酸缀合物。该方法任选地记录样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2021年8月5日提交的美国申请号63/229,657的优先权,其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上针对用于核酸测序和表征的分子系统,特别是与白血病相关的原癌基因突变的同时筛选和绝对定量。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是由骨髓中未成熟的白细胞(粒细胞或单核细胞)引发的血癌,是成人中最常见的白血病形式之一。AML占所有癌症的约1%,在美国每年有约20,000例新病例。核磷蛋白1(NPM1)基因突变发生在三分之一的AML患者和约50%的细胞遗传学正常的AML患者中(Papaemmanuil,et al.,N Engl J Med.2016;374(23):2209-21;Ley,et al.,N Engl J Med.2013;368(22):2059-74;以及Patel,et al.N Engl J Med.2012;366(12):1079-89)。NPM1基因的外显子12上有超过50种不同的突变被描述,然而超过95%的病例涉及三种称为A型、B型和D型的移码突变中的一种(Falini,et al.,Blood.2007;109(3):874-85;Rau and Brown,Hematol Oncol.2009;27(4):171-81)。FMS样酪氨酸激酶3内部串联重复(FLT3-ITD)或DNMT3A突变发生在约66%的患有NPM1突变的AML的患者中,并且与预后不良相关,在符合条件的患者中,是同种异体造血干细胞移植(HSCT)的常见适应症。目前的治疗方案包括在符合条件的患者中进行同种异体造血干细胞移植(HSCT)以及化疗(Schlenk,et al.,N Engl J Med.2008;358(18):1909-18;Ley,et al,N Engl J Med.2010;363(25):2424-33;Metzeler,et al.,Leukemia.2012;26(5):1106-7;Gale,et al.,J ClinOncol.2015;33(18):2072-83;Peterlin,et al.,Haematologica.2015;100(5):e196-9)。然而,诱导或巩固化疗后NPM1突变转录本的继续存在与高复发率相关(Ivey,et al.,NEngl J Med.2016;374(5):422-33;Balsat,et al.,J Clin Oncol.2017;35(2):185-93)。在接受同种异体HSCT的高风险NPM1突变AML患者中,HSCT前可测量的残留病灶(MRD)阳性与HSCT后复发的高风险相关(Dillon,et al.,Blood.2020;135(9):680-8)。因此,新的分子监测策略和先发制人的治疗对改善患者的预后是必要的。
当前的分子监测策略受到其灵敏度、对RNA质量的依赖、周转时间(TAT)和成本的限制。此外,还缺乏允许主要突变亚型的同时筛选和量化的平台。传统的检测和分类(或筛选)方法需要高度劳动和时间密集型的Sanger法测序。此外,由于该系统需要人工检查原始序列数据,因而结果经常被误解。在诊断时,下一代测序(NGS)通常用于定量大量附加基因的突变。该方法价格昂贵,并且不是后续微小残留病灶(MRD)监测的有效手段。
基于实时聚合酶链式反应(PCR)的商业选择没有成本效益,并且需要来自患者的大量潜在不稳定的核糖核酸(RNA)作为可用的输入材料。此外,由于严格的RNA质量要求,这些系统的灵敏度有限,并且不够特异,无法在诊断时有效地提供突变亚分型(参见美国专利号10,526,650;欧洲专利号2518164B1;国际公开号WO 2017201276;Bacher,et al.,British Journal of Haematology 167,710–714,2014(doi:10.1111/bjh.13038);Mencia-Trinchant,etal.,The Journal of Mol Diagnostics 19,537–548,2017,doi:10.1016/j.jmoldx.2017.03.005)。
有必要开发出更敏感、更特异、更划算的方法来检测AML中的NPM1突变。还需要高通量测定方法,用于定量具有高灵敏度和特异性的NPM1突变,这需要RNA作为输入材料。
因此,本发明的目的是提供用于AML中NPM1突变的敏感、自动检测并具有提高的准确性的组合物及其使用方法。
另一个目标是提供同时筛选和绝对定量四种主要NPM1突变亚型的组合物和方法。
本发明的进一步目的是提供基于DNA作为输入材料的快速、高通量筛选NPM1突变的组合物和方法。
另一个目的是提供用于与下一代测序结果直接比较的组合物和方法,其节省了用于确定微小残留病灶(MRD)监测的基线值的额外时间和成本。
发明概述
用于检测NPM1基因突变的基于多重探针的PCR系统已经开发出来。描述了相对于野生型NPM1同时筛选和绝对定量三种主要NPM1突变亚型(A、B和D)的组合物和方法。该系统采用掺入锁核酸(LNA)的改良的寡核苷酸探针,以提供筛选的提高的准确性。
提供了用于检测和/或测量样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的方法。该方法包括以下步骤:(a)将标记序列探针与样品中的NPM1基因杂交以形成探针-核酸缀合物;(b)扩增探针-核酸缀合物;和(c)检测扩增的探针-核酸缀合物。在一些形式中,该方法包括一个或多个附加步骤(d)记录样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
在一些形式中,步骤(a)中的杂交过程包括(i)在引物延伸条件下将一组寡核苷酸引物与样品在反应混合物中结合;(ii)向反应混合物中添加一个或多个标记的序列探针。引物包括与NPM1基因互补的序列并且被配置为产生包含NPM1基因的全部或部分的延伸产物。
在优选的形式中,每个探针包括一个或多个锁核酸(LNA)。探针具有与NPM1基因或NPM1基因的突变体互补的核酸序列;和可检测的标记,优选报告基因染料和淬灭剂染料对。通常,与NPM1基因互补的序列在预定位置退火至延伸产物。在一些形式中,试剂在单一反应混合物中进行。在一些形式中,该方法在单个反应容器内进行。
在优选的形式中,NPM1基因的突变是NPM1基因中的一个或多个移码突变。示例性移码突变包括NPM1的A型NPM1突变、B型NPM1突变和D型NPM1突变。在一些形式中,在步骤(a)(i)中获得的延伸产物包括人类NPM1基因的内含子12的全部或部分。在一些形式中,一组寡核苷酸引物包括分别具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的两个寡核苷酸引物。在其他形式中,一组寡核苷酸引物包括分别具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列的两个寡核苷酸引物。
在优选的形式中,扩增(b)中的探针-核酸缀合物包括使用实时PCR、数字PCR或微滴数字PCR在反应混合物中进行聚合酶链式反应(PCR)以形成扩增子。在一些形式中,样品包括核酸质粒,该质粒包含NPM1基因、基因组DNA、cDNA的全部或部分。在一些形式中,该方法包括使用一个或多个对照。例如,在一些形式中,在(d)中确定样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平包括将来自样品的结果与从一个或多个对照获得的结果进行比较。在优选的形式中,一个对照包括对应于野生型NPM1、A型NPM1突变、B型NPM1突变或D型NPM1突变的核酸序列。
在一些形式中,标记序列探针包括四种探针,包括具有与野生型NPM1的核酸序列互补的核酸序列的第一探针,具有与A型NPM1突变的核酸序列互补的核酸序列的第二探针,具有与B型NPM1突变的核酸序列互补的核酸序列的第三探针,以及具有与D型NPM1突变的核酸序列互补的核酸序列的第四探针。在一些形式中,一种报告基因染料与一种突变缔合。示例性报告基因染料包括FAM、HEX、TAMRA、ROX、ATTO550、TEX615、Cy5和TYE665。优选地,一种或多种探针包括SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22和23中的一个或多个核酸序列。
通常,步骤(c)中的检测需要存在100个拷贝,或少于100个拷贝的靶NPM1核酸。在一些形式中,步骤(c)中的检测需要10个拷贝,或少于10个拷贝的靶NPM1核酸。在特定形式中,步骤(c)中的检测需要5个拷贝,或少于5个拷贝的靶NPM1核酸。
在特定形式中,受试者被诊断为患有急性髓系白血病(AML)或被鉴定为处于AML的风险中。在一些形式中,该方法还包括向受试者施用治疗剂或手术的一个或多个步骤。示例性治疗剂包括化疗剂和抗生素剂。示例性手术程序包括造血干细胞疗法(HSCT)。因此,在一些形式中,受试者正在接受或者适合接受化疗。在其他形式中,受试者正在接受或者适合接受造血干细胞疗法(HSCT)。在一些形式中,该方法用于检测或量化受试者中的可测量的残留病灶(MRD)。
还提供了用于检测和测量样品中NPM1基因的存在、缺失和/或突变水平的试剂盒。示例性试剂盒包括一种或多种试剂,包括(i)寡核苷酸引物;和(ii)一个或多个标记的序列探针。试剂盒任选地进一步包括(iii)用于检测和测量样品中NPM1基因的存在、缺失和/或突变水平的方法的说明。
通常,引物包括与NPM1基因互补的核酸序列,并被配置为产生包括NPM1基因的全部或部分的延伸产物。
通常,探针包括与野生型NPM1或NPM1突变体互补的核酸序列,其在预定位置退火至延伸产物;和报告基因染料和淬灭剂。优选地探针包括锁核酸(LNA)。
附图说明
图1A是NPM1基因野生型和突变体的示意图。图1B是使用四个或更多通道配置检测AML中NPM1突变的基于多重探针的PCR系统示意图。图1C是用于检测AML中NPM1突变的双通道配置基于探针的PCR系统示意图。用靶向A型NPM1突变(称为突变A或Mut A)、B型NPM1突变(称为突变B或Mut B)和D型NPM1突变(称为突变D或Mut D)的多重LNA探针进行的NPM1突变检测测定使用基因组NPM1 DNA或从RNA制备的NPM1转录本进行描述。两组PCR引物(半箭头)被描述为分别用于DNA和RNA样品。设计了4种靶向相应的NPM1突变体的探针,其在5’末端具有不同的报告基因染料标记,在3’末端具有不同的淬灭剂。图1D显示了锁核酸的结构。
图2A-2F是显示了使用4重实时(RT)PCR的LNA探针的扩增图。图分别显示了对应于突变体A、突变体B、突变体D和野生型特异性探针的路径的ΔRn循环数,分别针对突变体A(FAM)通道(图2A);突变体B(TAMRA)通道(图2B);野生型(HEX)通道(图2C-2D);和突变体D(ROX)通道(图2E-2F)中的每个。
图3A-3E是显示了使用4重实时(RT)PCR的探针扩增的图。图分别显示了对应于突变体A、突变体B、突变体D和野生型特异性探针的路径的ΔRn循环数,分别针对突变体A(FAM)通道(图3A);突变体B(FAM)通道(图3B);野生型(HEX)通道(图3C);以及突变体D(FAM)通道(图3D)和突变体D(ROX)通道(图3E)中的每个。
图4A-4C是显示了总体质粒对照和患者样品中野生型NPM1和三种类型突变体的阳性事件(荧光强度,RFU)的2D可视化的散点图,分别针对突变体A(Mut A)(图4A);突变体B(Mut B)(图4B);和突变体D(Mut D)(图4C)中的每个。指示了每个图中针对野生型和针对每个突变体的阳性事件的位置。
图5A-5C是一组散点图,显示了使用突变体A-FAM、突变体B-TAMARA、突变体D-ROX和野生型-HEX探针以及参考检测器,对来自两名患者(A和B)各自的样品进行的测定的各个数字PCR孔中获得的数据。
图6是散点图,显示了从使用突变体A(Mut A);突变体B2(Mut B2);突变体B3(MutB3);突变体D(Mut D);和野生型(WT+)FAM探针进行的测定的数字PCR中获得的数据。
图7是一组散点图,显示了当用突变体B(Mut B)或突变体D(Mut D)质粒装载并用突变体B2(Mut B2);突变体B3(Mut B3)、突变体D(Mut D);和野生型(WT+)FAM或HEX探针探测时,在每个FAM或HEX通道中获得的振幅随事件数的变化。
图8A-8D是2D散点图,显示了当分别用突变体B2(Mut B2)径向多重(图8A);突变体B3(Mut B3)径向多重(图8B);或突变体D(Mut D)径向多重(图8C);和野生型(WT)径向多重(图8D)装载时,每个FAM和HEX通道的通道1振幅与通道2振幅的对比。
图9A-9C分别是显示了野生型(图9A)、突变体B3(图9B)和突变体A(图9C)NPM1各自的计算丰度(Ct值)与增加的稀释度(量)的对数线性标准曲线的图,如通过实时PCR所测定。
图10是分别显示了4个测试孔(A3-D3)中的每一个中突变体A(Mut A)和NPM1野生型(NPM1 Wt)的绝对计数的条形图。数据以表格形式列于表2中。
图11A-11C是显示了突变体B(Mut B)(图11A)、突变体D(Mut D)(图11B)和NPM1野生型(NPM1 Wt)(图11C)各自的浓度(拷贝/μl)的柱状图,分别在4个分区(10%、1%、0.5%和0.1%)中的每个。数据以表格形式列于表3中。
图12A-12C分别显示了突变体B2(Mut B)(图12A)、Mut B3(图12B)和突变体D(MutD)(图12C)中的每个的测量的突变负荷(%)与预期突变负荷(%)的对比,在ddPCR上使用质粒对照模拟患者DNA。
图13A-C显示了通过dPCR/ddPCR在DNA水平上的突变体A丰度与使用实时PCR的RNA丰度的相关性研究。
图14A显示了患者B的连续时间点,显示了DNA和RNA中的分子监测和检测应用。图14B显示了在QX200上运行的患者B(DNA)的连续时间点。
图15显示了与复发或难治性治疗的患者相比,处于稳定状态或缓解的患者中的NPM1的突变负荷。
图16A-16C是显示了针对突变体A信号(图16A)、突变体B信号(图16B)和突变体D信号(图16C)的单独的dPCR孔的DNA可视化踪迹的图。
图16D是显示了非ABD患者在复发时的突变体B信号的RNA可视化踪迹的图。
图17A和17B是显示了在QX200上使用突变体B的探针对所有突变体探针进行LOD测试的结果的图,并且在DNA水平的200拷贝/μL的WT对照中可以检测到低至1%的突变体拷贝。
发明详述
I.定义
术语“NPM1”或“NPM1基因”是指人核磷蛋白1基因。人核磷蛋白1基因的示例性核酸序列在GenBank登录号NC_000005.10(区域171387116..171410900)中列出。NPM1基因的外显子12的片段在SEQ ID NO:1中列出。
术语“NPM1突变体”或“NPM1突变”是指人NPM1基因中与急性髓系白血病(AML)相关的三种最常见的移码突变之一。这些包括被称为“A”、“B”和“D”的突变。突变体A、B和D各自的示例性核酸序列分别包括SEQ ID NO:2、3和4。
术语“锁核酸”或“LNA”是指修饰的RNA单体,其具有将RNA戊糖环的2’氧与4’碳连接的亚甲基桥键。该桥键将戊糖环固定在3’-内构象中。
术语“核酸样品”是指含有或怀疑含有核酸分子的组合物,例如溶液。
术语“DNA样品”是指含有或怀疑含有脱氧核糖核酸分子的组合物,例如溶液。
术语“核苷酸”是指含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通过它们的磷酸部分和糖部分连接在一起,形成核苷间键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(a)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性实例是3’-AMP(3’-腺苷单磷酸)或5’-GMP(5’-鸟苷单磷酸)。本领域中可获得的和本文中可获得的这些类型的分子有许多变种。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”是包括多个核苷酸亚基的合成或分离的核酸聚合物。
术语同源性和同一性与相似性含义相同。因此,例如,如果在两个非天然序列之间使用同源性一词,则应理解这不一定表明这两个序列之间的进化关系,而是着眼于它们的核酸序列之间的相似性或相关性。许多用于确定两个进化相关的分子之间同源性的方法通常应用于任何两个或更多个核酸或蛋白质,目的是测量序列的相似性,而不管它们是否进化相关。
术语“治疗”或“预防”是指改善、减少或以其他方式阻止疾病、病症或病况在可能易患疾病、病症和/或病况但尚未被诊断为患有其的动物中发生或进展;抑制疾病、病症或病况,例如,阻碍其进展;以及缓解该疾病、病症或病况,例如,导致所述疾病、病症和/或病况的消退。治疗疾病或病况包括改善该疾病或病况的至少一种症状,即使潜在的病理生理不受影响,例如通过施用镇痛剂治疗受试者的疼痛,即使这种药剂不治疗疼痛的原因。治疗的理想效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改善预后。例如,如果与癌症相关的一种或多种症状得到缓解或消除,则个体被成功“治疗”,这包括但不限于降低和/或抑制肿瘤细胞增殖/生长的速度,提高那些患有这种疾病的人的生活质量,减少治疗疾病所需的其他药物的剂量,延缓疾病的进展,和/或延长个体的生存时间。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用,并且是指哺乳动物,包括但不限于小鼠、猿类、人类、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。
本文使用的淬灭剂是能够从荧光团(如荧光染料)吸收能量并将能量的大部分以热(在暗淬灭剂的情况下)或可见光(在荧光淬灭剂的情况下)的形式重发射的物质。Dabcyl是暗淬灭剂的实例,TAMRA是荧光淬灭剂的实例。
II.组合物
已经证明,基于多重探针的PCR系统可以同时检测并有效量化AML中的NPM1突变。该系统采用掺入锁核酸(LNA)的改进的探针,以提供筛查的提高的准确性。在一个实施方案中,基于多重探针的PCR系统使用DNA作为输入材料。该系统可以使用实时聚合酶反应(PCR)、基于微滴的数字PCR(ddPCR)和基于纳米片的数字PCR(dPCR)来实现。为了完整性和比较的目的,基于多重探针的PCR系统可以任选地使用RNA作为输入材料。
该系统鉴定了NPM1的Mut A、Mut B和Mut D突变,这些突变占该基因座上超过90%的移码突变。因此,在一些形式中,该系统包括靶向野生型NPM1、A型NPM1突变体(被称为MutA)、B型NPM1突变体(被称为Mut B)和D型NPM1突变体(被称为Mut D)的4种探针,用于突变筛查。通常,这些探针汇集在单个PCR反应孔中,并共享通用的PCR引物扩增。在一些形式中,该系统监测受试者体内的可测量的残留病灶(MRD)。因此,在一些形式中,该系统仅采用检测患者中鉴定的野生型(WT)和突变体(Mut)的探针。可测量的残留病灶(MRD;以前称为微小残留病灶)是急性髓系白血病(AML)中独立的诊断后预后指标,对于风险分层和治疗计划非常重要,在诊断时与其他完善的临床、细胞遗传学和分子数据评估结合。
描述了对突变Mut A、Mut B或Mut D特异性的寡核苷酸探针的组合物。探针包括锁核酸(LNA)。这些探针对DNA或RNA具有特异性,并且分别在当DNA或RNA作为输入材料时使用。
A.NPM1
该系统可鉴定核磷蛋白(NPM1)基因的Mut A、Mut B和Mut D突变,是普遍表达的核仁蛋白,参与核糖体生物发生、基因组完整性的维持和ARF-p53肿瘤抑制途径的调节以及多种其他功能。相应基因的突变会导致NPM1蛋白的细胞质错位。这些突变是急性髓系白血病(AML)所特有的,这是一种以克隆性扩增、受损的分化和骨髓中髓系细胞的增殖为特征的疾病(Zarka,et al.,Genes 2020,11,649;doi:10.3390/genes11060649)。
NPM1基因产物包含294个氨基酸,分子量为37kDa。NPM1基因在人类、啮齿动物、鸡和鱼之间高度保守。人类NPM1位于染色体5q35上,由12个外显子组成,大小范围为58至358个碱基对(bp)。规则剪接的NPM1基因有11个外显子,编码成熟蛋白的294个氨基酸。Genbank登录号NC_000005(区域171387116..171410900)中提供了人核磷蛋白的示例性基因组核酸序列。
1.NPM1突变
NPM1突变在AML中相对常见,根据2016年世界卫生组织(WHO)分类,具有突变NPM1基因的AML是独特的亚型,这是由于其特异的突变谱、免疫表型、临床表现以及与其他反复出现的基因组改变的相互排斥性。
NPM1突变在整个AML病程中持续存在,并随着病情缓解而消失。这一发现强调了它们的临床意义以及在治疗后监测微小或可测量的残留病灶(MRD)的用途。MRD提供了强大的预后信息,并且越来越多地纳入AML的常规管理中。可检测到的MRD始终与增加的复发风险和恶化的长期结果相关。
常见的NPM1突变几乎只在外显子12中存在,迄今为止仅在骨髓恶性肿瘤中而没有在任何其他肿瘤中被鉴定。它们通常由核苷酸960和961之间的4bp插入或重复组成。它们导致最后7个氨基酸(WQWRKSL)被11个不同的残基替换。与AML相关的“常见”NPM1突变有三种类型:A、B和D。这些NPM1突变的位置如图1A所示。
在80%的病例中检测到的A型突变涉及“TCTG”(核苷酸956-959)的重复,在位置960处产生插入。B型和D型是第二和第三最常见的突变,接着是一些其他罕见的突变。所有这些突变都会影响NoLS所在的Trp-289和Trp-290,从而导致蛋白的细胞质定位。细胞质NPM1(NPM1c)仅在具有NPM1突变基因(NPM1c)的AML中检测到,并且没有NPM1保留在核仁中的NPM1突变。NPM1突变是纯杂合的,这意味着NPM1c能够与野生型NPM1形成二聚体,将其募集到细胞质并扰乱其正常功能(Zarka,et al.,Genes 2020,11,649;doi:10.3390/genes11060649)。
提供了用于检测和区分NPM1基因的野生型(WT)和突变体形式的组合物。
在一些形式中,野生型(WT)核磷蛋白(外显子12区域)的核酸序列是:
在一些形式中,突变体A核磷蛋白(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:2)。与突变相关的残基以粗体文本突出显示,并加下划线。
在一些形式中,突变体B核磷蛋白(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:3)。与突变相关的残基以粗体文本突出显示,并加下划线。
在一些形式中,突变体D核磷蛋白(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:4)。与突变相关的残基以粗体文本突出显示,并加下划线。
B.用于扩增NPM1 DNA的寡核苷酸引物
描述了用于延伸与最常见突变相关的NPM1基因区域的寡核苷酸引物。在一些形式中,寡核苷酸引物延伸对应于所有SEQ ID No:1-4的人NPM1基因的片段。
在一些形式中,寡核苷酸引物延伸DNA,例如基因组DNA。用于延伸与最常见突变相关的NPM1 DNA区域的示例性寡核苷酸引物包括一组具有以下正向核酸序列:5’TATGAAGTGTTGTGGTTCCTTAAC 3’(SEQ ID NO:5)
和反向核酸序列:5’TGTTACAGAAATGAAATAAGACGGA 3’(SEQ ID NO:6)的引物,分别是寡核苷酸。
在优选的形式中,寡核苷酸引物被配置为产生包括野生型或突变体NPM1 DNA序列的扩增子。因此,在一些形式中,寡核苷酸引物被配置为延伸和扩增包括NPM1基因的突变A、B和D区域的DNA片段。例如,在一些形式中,寡核苷酸引物被配置为产生包括SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的序列的扩增子。
在一些形式中,由DNA延伸产生的扩增子的长度在约145至149个碱基对之间。
C.用于扩增NPM1 cDNA的寡核苷酸引物
在一些形式中,寡核苷酸引物延伸cDNA,例如从RNA的RT PCR产生的cDNA。用于延伸与最常见突变相关的NPM1区域的cDNA的示例性寡核苷酸引物包括一组具有以下正向核酸序列:5’GACTGACCAAGAGGCTATTCA 3’(SEQ ID NO:7)
和反向核酸序列:5’TGTTACAGAAATGAAATAAGACGGA 3’(SEQ ID NO:8)的引物,分别是寡核苷酸。
因此,在一些形式中,寡核苷酸引物被配置为产生包括野生型或突变体NPM1 cDNA序列的扩增子。在一些形式中,寡核苷酸引物被配置为延伸和扩增包括NPM1基因的突变A、B和D区域的cDNA片段。在一些形式中,由cDNA延伸产生的扩增子的长度在约109至113个碱基对之间。
D.NPM1 DNA的核酸质粒
描述了包括来自人NPM1基因的一个或多个序列的核酸质粒。在一些形式中,质粒可用作鉴定和定量样品中NPM1突变的系统和方法的对照。
在一些形式中,野生型(WT)核磷蛋白(外显子12区域)的核酸序列是:
在一些形式中,核磷蛋白突变体A(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:10)。与突变相关的残基以粗体文本显示,并加下划线。
在一些形式中,核磷蛋白突变体B(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:11)。与突变相关的残基以粗体文本显示,并加下划线。
在一些形式中,核磷蛋白突变体D(外显子12区域)的核酸序列是:
(SEQ ID NO:12)。与突变相关的残基以粗体文本显示,并加下划线。
在一些形式中,NPM1基因的WT或突变体A、B或D的核酸序列组合在核酸质粒内。例如,核酸质粒可用作鉴定和定量样品中NPM1突变体的对照。因此,在一些形式中,核酸质粒包括SEQ ID No:1-4中的任何一个或多个。
或者,合成的双链DNA片段例如gBlock DNA片段也可用作如本文所述的系统和方法的对照。
E.NPM1 cDNA的核酸质粒
在一些形式中,NPM1 WT和突变的核酸序列是互补DNA(cDNA)的形式,例如从样品内的RNA制备的cDNA。因此,在一些形式中,野生型(WT)核磷蛋白(外显子12区域)cDNA的cDNA序列是:
在一些形式中,核磷蛋白突变体A(外显子12区域)cDNA的核酸序列是:
(SEQ ID NO:14)。与突变相关的残基以粗体文本突出显示。
在一些形式中,核磷蛋白突变体B(外显子12区域)cDNA的核酸序列是:
(SEQ ID NO:15)。与突变相关的残基以粗体文本突出显示。
在一些形式中,核磷蛋白突变体D(外显子12区域)cDNA的核酸序列是:
(SEQ ID NO:16)。与突变相关的残基以粗体文本显示,并加下划线。
在一些形式中,NPM1基因的WT或突变体A、B或D的核酸序列组合在核酸质粒内,用作样品中NPM1突变体的鉴定和/或定量的对照。因此,在一些形式中,核酸质粒包括SEQ IDNo:13-16中的任何一个或多个。
或者,合成的双链DNA片段例如gBlock DNA片段也可用作如本文所述的系统和方法的对照。
F.NPM1野生型或突变体序列探针
用于鉴定和定量NPM1突变体的系统使用差异杂交来检测和区分NPM1多态性。描述了包含可检测标记、优选地包含一种或多种染料的NPM1DNA结合探针。通常,该探针选择性结合包括三种常见突变体(A、B或D)之一或野生型NPM1(非突变)DNA的人类NPM1 DNA。该探针具有高度选择性,不会非特异性结合NPM1 DNA。这些探针可用于鉴定和定量样品中的NPM1突变。在一些形式中,这些探针包括含有锁核酸(LNA)残基和一个或多个染料部分的残基序列。这些探针被设计为选择性地与PCR扩增的DNA(扩增子)杂交,其中包括野生型或突变体NPM1的核酸序列。然后通过检测附着在探针上的荧光染料来鉴定和定量探针-扩增子复合物。表1提供了示例性探针序列和配置。
1.探针序列
通常,探针被设计为与野生型或突变体A、B或D NPM1 DNA特有的残基特异性序列相互作用。
野生型NPM1探针的示例性序列是:
5’ACTG+CCA+G+A+GATC 3’(SEQ ID NO:17)
突变体A NPM1探针的示例性序列是:
5’TG+CCA+G+A+CA+GA 3’(SEQ ID NO:18)
突变体B NPM1探针的示例性序列是:
5’TG+CC+A+T+GC+AGA 3’(SEQ ID NO:19)
突变体B NPM1探针的示例性序列是:
5’TGCC+A+T+GC+A+GA 3’(SEQ ID NO:20)
突变体D NPM1探针的示例性序列是:
5’TGCCA+G+G+CAGA 3’(SEQ ID NO:21)
野生型NPM1探针的另一个示例性序列是:
5’TG+C+CA+G+A+GAT 3’(SEQ ID NO:22)
突变体A NPM1探针的另一个示例性序列是:
5’CT+GCCA+G+A+CA+GA 3’(SEQ ID NO:23)
通常,探针序列是高度选择性的,并且在正确的解链温度下不会相互错配。
2.锁核酸
在一些形式中,探针包括锁核酸(LNA)。在一些形式中,探针包括2、3、4、5或6个LNA。锁核酸是修饰的RNA单体。他们名字的“锁定”部分来自将2’氧与RNA戊糖环的4’碳链接起来的亚甲基桥键。该桥键在3’-内构象中固定戊糖环(图1D)。当这些碱基与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基混合时,遵循Watson-Crick碱基配对规则。
当用于寡核苷酸探针时,LNA单体可提供增强的结构稳定性,从而导致升高的杂交解链温度(Tm)。Tm的升高意味着锁核酸qPCR探针被设计为比标准探针更短的长度,这能够更有效地淬灭并具有更高的信噪比。因此,它们更加灵敏,无论序列GC含量如何,都能提供强烈的靶标检测。与传统qPCR探针相比,LNA探针还表现出更大的错配辨别力。这提高了它们区分突变或单核苷酸多态性(SNP)的能力。(Davalieva,et al.(2014).J VirolMethods,196:104–112)。加号(+)用于指定核酸序列中的LNA修饰(参见例如,Thayer,etal.,Scientific Reports,9(3566)(2019),figure 1,therein)。当寡核苷酸在同一分子中含有标准核苷酸和LNA核苷酸时,有时会引用术语“混合体”来更恰当地描述它们的性质。在描述混合体的序列时,一种惯例是使用小写字母表示标准核苷酸,使用大写字母表示LNA核苷酸,而另一种惯例是在大写字母前面放置a+符号来表示LNA核苷酸。例如,引物gctGcacgTcatcgatcATCtcatgc(SEQ ID NO:24),在位置4、9、18、19和20处具有LNA的26聚体,也可写为GCT+GCACG+TCATCGATC+A+T+CTCATGC(SEQ ID NO:25)。相比之下,该引物的非LNA形式被写为gctgcacgtcatcgatcatctcatgc(SEQ ID NO:26)(或大写字母)(RobertE.FarrellJr.Ph.D,in RNA Methodologies(Fourth Edition),2010)。在设计含有LNA的寡核苷酸时,要注意LNA的位置和数量。例如,典型的18聚体最好包含最多7-8个LNA;避免超过4-5个连续LNA的延伸,这将导致该区域的杂交非常紧密;避免LNA延伸应避免靠近寡核苷酸的3’末端,等。
3.可检测标记
优选的可检测标记是一种或多种染料,以能够检测和定量探针/扩增子杂交体。在一些形式中,探针包括至少一种可检测标记,优选例如,位于探针序列5’末端的标记染料。标记染料通常是荧光染料。在一些形式中,靶标特异性探针在一端用荧光标记进行标记,在另一端用淬灭剂进行标记。在一些形式中,探针还包含内部淬灭剂。在一些形式中,检测附着在探针上的荧光染料以鉴定和定量样品中的NPM1 DNA。所谓的FRET(荧光共振能量转移)探针是基于发射报告基团并吸收邻近淬灭剂的原理。只有当报告基团和淬灭剂之间存在距离时,发射才能被完全检测到。
在一些形式中,荧光标记是Integrated DNA Technologies(IDT)的FREEDOMTM染料。FREEDOMTM染料是荧光团,不受IDT或第三方公司的许可限制。因此,它们可以免费用于商业或诊断应用。Freedom染料包括IDT专有的荧光团,可用于常用的染料波长。名称中的数值表示染料附接到寡核苷酸上时的发射波长。
用于探针的示例性标记荧光染料包括6-FAM(荧光素)、荧光素dT、Cy3TM、TAMRATM染料(例如,5(6)-羧基四甲基罗丹明、TMR、TRITC)、JOE、Cy5TM、MAX、TETTM、TEX615、TYE665、6-ROX、Cy5.5TM、YAKIMA YELLOWTM、TEX615、TYE665、TYE705、SUN、ATTO488、ATTO532、ATTO550、ATTO565、ATTORHO101、ATTO590、ATTO633、ATTO647N、HEX和Alexa Fluor染料。
优选地设计探针,使得如果特定靶标不存在,则淬灭剂和荧光团总是保持紧密接近,而如果存在,则广泛分开。因此,观察到荧光信号表明靶标的存在,缺乏荧光信号表明靶标不存在。
在一些形式中,探针还包括至少一种暗淬灭、非荧光染料,例如,位于探针序列的3’末端。暗淬灭剂是没有天然荧光的染料,可以进行多重检测(当两个或多个报告基团-淬灭剂探针一起使用时)。非荧光暗淬灭剂可以淬灭生物测定中染料的荧光,减少背景。
用于探针的示例性淬灭剂染料包括IOWARQ淬灭剂、IOWA/>FQ淬灭剂、IAbRQSp、Dabsyl(二甲基氨基偶氮苯磺酸)、Black Hole淬灭剂、Qxl淬灭剂、IRDyeQC-1和内部/>淬灭剂。
标记探针的方法是已知的。例如,TaqMan探针用发射不同波长的两种荧光染料进行标记(图3.4)。探针序列旨在在两个PCR引物之间的感兴趣的DNA靶区域中特异性杂交。通常,探针被设计为具有比PCR引物稍高的退火温度,以便当引物开始延伸(聚合)时探针将杂交。有时在TaqMan探针3’-末端附近使用小沟结合剂,以便能够使用具有比同等长度序列预期的更高的退火温度的较短序列。“报告基因”(R)染料附接在探针序列的5’-末端,而“淬灭剂”(Q)染料在3’-末端合成。流行的染料组合是FAM或VIC作为报告基因染料,TAMRA作为淬灭剂染料。当探针完整且报告基因染料非常接近淬灭剂染料时,由于两种染料之间的能量转移抑制了报告基因荧光,因此几乎不会产生荧光。
在聚合过程中,链合成将开始取代任何已与靶序列杂交的TaqMan探针。使用的TaqDNA聚合酶具有5’-核酸外切酶活性,因此将开始吞噬其路径中的任何序列(即,那些已与靶序列退火的探针)。当报告基因染料分子从探针中释放并且不再靠近淬灭剂染料时,它可以开始发出荧光。结果,由于游离报告基因荧光染料的逐渐积累,报告基因荧光染料的荧光信号将变得可检测到,并且在连续的PCR循环期间进一步增加。
III.使用方法
NPM1突变的可靠分子监测方法已经建立。这些方法能够实现先发制人的治疗,这对于了解AML疾病状态、告知治疗选择、监测治疗效果和改善患者预后至关重要。该方法同时筛选和量化具有主要NPM1突变亚型的样品。
在一些形式中,用于检测和测量样品中NPMl基因突变的存在、缺失和/或水平的方法包括以下一个或多个步骤:
(a)将标记的序列探针与样品中的NPM1基因杂交,以形成探针-核酸缀合物。
(b)使探针-核酸缀合物经历扩增步骤。扩增通常包括聚合酶链式反应(PCR)。PCR通常使用实时-PCR,和/或数字PCR,或数字微滴PCR系统进行。
(c)检测扩增产物。检测通常是通过测量附着在探针上的一种或多种荧光标记的水平来进行的。
该方法还任选地包括一个或多个步骤用于
(d)记录样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。突变的鉴定,及其定量可以根据步骤(c)中检测所采用的方法进行。
该方法可以在所有步骤中使用一个或多个对照。
在一些形式中,对照是包括从已知具有突变体NPM1基因或野生型NPM1基因的受试者获得的DNA的样品。在特定形式中,对照包括含有SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:9-16中的一个或多个的核酸质粒。
A.将标记的序列探针与样品中的NPM1基因杂交,以形成探针-核酸缀合物
该方法包括将标记的序列探针与对应于样品内NPM1基因片段的DNA杂交的一个或多个步骤。因此,该方法包括提供用于筛选的样品。该方法中使用的示例性样品包括从受试者或从合成来源获得的DNA或RNA样品。DNA样品包括纯化的基因组DNA及其片段,或从获自受试者的RNA制备的cDNA。合成DNA样品包括质粒、粘粒以及单链或双链DNA,例如来自文库的DNA。
杂交包括形成探针-NPM1核酸缀合物。在一些形式中,探针-NPM1核酸缀合物的形成在单个反应容器中进行,例如,用于同时筛选所有三种突变体,或用于筛选一种或两种突变体。在一些形式中,该方法在同一反应中进行样品内的NPM1 DNA的扩增和探针的结合。因此,在一些形式中,该方法包括以下一个或多个步骤:
(i)在引物延伸条件下在反应混合物中将一组引物与样品合并。一组引物通常包括两个引物(一个反向引物和一个正向引物),用于扩增NPM1 DNA。
引物包括与NPM1基因互补的序列并且被配置为产生包含NPM1基因的全部或部分的延伸产物。DNA样品的示例性引物组在SEQ ID NO:5-6中列出。cDNA样品的示例性引物组在SEQ ID NO:7-8中列出。
在一些形式中,该方法包括以下一个或多个步骤:
(ii)向反应混合物中添加一个或多个标记的序列探针。
每个探针通常包含具有与NPM1基因或NPM1基因突变体互补的序列的锁核酸(LNA);报告基因染料和淬灭剂。通常,与NPM1基因互补的序列在预定位置与延伸产物退火。
B.扩增探针-核酸缀合物。
该方法包括用于扩增探针-核酸缀合物的一个或多个步骤。扩增缀合物的步骤可以通过本领域已知的方法进行。扩增通常包括使用实时-PCR的聚合酶链式反应(PCR)和/或数字PCR或数字微滴PCR系统。在一些形式中,根据该方法的探针的缀合和扩增,使用含有所有引物和探针以及PCR所需的样品DNA和试剂的单一反应混合物进行。
在示例性形式中,该方法使用靶向野生型NPM1、A型NPM1突变体、B型NPM1突变体和D型NPM1突变体的4种探针来筛选突变。该方法将探针汇集在单个PCR反应孔中,并使用共享通用PCR引物的PCR扩增DNA/探针缀合物。
使用本领域已知的PCR仪器实施该方法。可用于实施该方法的示例性PCR仪器包括以下仪器:Step One Plus(SOP)实时PCR系统、Bio-Rad QX200ddPCR系统、QiagendPCR系统、Roche LC480II实时PCR仪器和ThermoFisher Quantstudio 3DdPCR系统。
在一些形式中,每个样品都作为技术重复进行测试和分析。根据该方法使用实时PCR进行的不同突变的示例性检测如图2A-2F所示。
在示例性方法中,最佳PCR条件包括引物800nM,其中4种探针的每种为400nM,在最终体积为40μL的dPCR反应或20μL的ddPCR和Real Time PCR反应中。示例性PCR条件使用SEQID NO:5和6的寡核苷酸引物,并且包括初始加热至95℃持续20秒,随后进行40个循环的95℃持续1秒至30秒和60℃持续5秒至1分钟,取决于PCR机器。
C.检测可检测标记。
该方法包括通常通过检测可检测标记例如荧光来检测扩增步骤的结果的一个或多个步骤,其中可检测标记是荧光染料。检测步骤通常是通过测量附着于探针的一种或多种荧光标记的水平。因此,在一些形式中,该方法测量和/或记录附着至探针缀合物的荧光标记的存在和数量。在一些形式中,该方法在实时PCR系统中实施,并且实时进行和显示荧光标记的测量和/或记录,例如以在计算机上实施的视觉显示的形式。
在一些形式中,将一种类型的DNA模板加载到每个孔中,例如,Mut A/B/D/WT NPM1的质粒对照或患者DNA(该患者DNA先前已知携带Mut和WT NPM1)。在其他形式中,每个4重孔加载不同类型的模板,并且在Mut A和WT通道中获得正确的阳性信号,而在加载Mut B和MutD质粒对照的孔中没有假阳性信号。在示例性方法中,当加载Mut A模板时,在Mut AFAM通道中观察到明显的扩增,其由与绿色水平阈值紧密重叠和相交的两条S形曲线标记,例如,如图2A中所示。在优选的形式中,Mut A的LNA探针提供了期望的特异性,不与任何其他突变体或WT NPM1结合,并且其他通道不显示高于截止阈值的信号,这表明。在优选的形式中,WTNPM1的LNA探针显示了仅在WT荧光通道中检测到的期望阳性信号,例如,如图2C-2D中所示。
如上所述,在一些形式中,该方法包括对照。示例性对照包括含有阳性对照和阴性对照的DNA样品。在优选的形式中,在无DNA模板或加入了不正确类型的质粒的对照孔中没有检测到假阳性信号,并且在每一个野生型、突变体A、突变体B和突变体D NPM1中的阳性对照孔中检测到了阳性信号。
D.记录样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
该方法任选地包括用于记录NPM1突变的鉴定和定量的一个或多个步骤。通常,根据步骤(c)中检测所采用的方法进行鉴定。通常,该方法能够基于少至1000个拷贝的NPM1DNA或少于100个拷贝的NPM1 DNA的存在来检测和定量NPM1突变体,例如,100个拷贝或更少、10个拷贝或更少、5个拷贝或更少,或一个拷贝。通常,方法的检测限取决于所采用的PCR扩增平台的方法。例如,在一些形式中,当采用实时PCR时,该方法能够基于少至100个NPM1DNA拷贝或少于100个NPM1 DNA拷贝的存在来检测和定量NPM1野生型或突变体DNA。在其他形式中,当采用数字PCR时,该方法能够基于少至10个拷贝的NPM1 DNA或少于10个拷贝的NPM1 DNA的存在来检测和定量NPM1野生型或突变体DNA。
所描述的用于确定NPM1突变的存在和数量的方法可用于诊断受试者中与NPM1突变相关的疾病和病症。因此,在一些形式中,该方法包括诊断和/或监测受试者中的疾病或病症的状态的一个或多个步骤。在一些形式中,该方法鉴定并测量受试者中的可测量的残留病灶(MRD)。示例性疾病是急性髓系白血病(AML)。
E.选择样品
在一些形式中,该方法包括鉴定需要监测NPM1突变的受试者并从该受试者获得合适的样品的一个或多个步骤。通常,受试者是患有白血病的个体。
在一些形式中,该方法在患有白血病的受试者中表征肿瘤和/或表征肿瘤微环境。例如,在一些形式中,该方法将肿瘤细胞和/或肿瘤浸润细胞或肿瘤相关细胞鉴定为具有NPM1突变。
还公开了用于评估化疗剂的抗癌功效的方法或其他程序。在一些形式中,该方法包括在测量来自受试者的样品中的NPM1基因突变之前和之后评估受试者中的疾病状态的步骤。例如,在一些形式中,在描述的用于检测和定量NPM1突变的方法之前和之后对来自癌症患者的血液样品进行表征,以便监测疾病的变化作为与治疗方案相关的表型和/或遗传变化。
通常,受试者是患有血癌的受试者,并且当前或之前已经接受癌症治疗,并且其中通过这些方法鉴定在施用治疗后实现的抗癌反应。
这些方法对于监测以NPM1基因突变为特征的急性髓系白血病(AML)特别有效。在优选的形式中,组合物和方法可有效诊断或监测一种或多种类型的白血病。
所描述的所有方法可包括鉴定受试者和/或从受试者获得生物样品的一个或多个步骤。从受试者获得生物样品以及从生物样品获得纯化的RNA或DNA的合适方法是本领域已知的。在一些形式中,该方法包括在一段时间内从受试者采集多个样品。例如,在一些形式中,例如根据治疗方案,在预定的时间段内从同一受试者获取多个样品。在示例性形式中,在癌症诊断、癌症治疗或癌症缓解评估的一项或多项之后,从同一受试者获取多个样品以监测NPM1基因中突变的存在或缺失或数量。在一些形式中,样品是从死亡受试者获得的。在一些形式中,获得样品以测量受试者体内的残留病灶,例如在造血干细胞疗法(HSCT)之后。如果样品包含RNA,则该方法包括一个或多个反转录步骤以制备纯化的cDNA。
IV.试剂盒
还公开了试剂盒。用于检测和测量样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的试剂盒包括一种或多种试剂,包括(i)寡核苷酸引物;和(ii)一种或多种标记的序列探针。该试剂盒任选进一步包括(iii)检测和测量样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的方法的说明书。通常,引物包括与NPM1基因互补的核酸序列并且被配置为产生包括NPM1基因的全部或部分的延伸产物。通常,探针包括与野生型NPM1或NPM1基因突变体互补的核酸序列,其在预定位置与延伸产物退火;以及报告基因染料和淬灭剂染料。优选地,探针包括锁核酸(LNA)。该试剂盒可以包括例如单独提供的试剂(例如,冻干的)或以预组装的混合物形式提供的试剂。活性剂可以是适合于通过混合与单个或多个样品立即使用的量,或者处于在施用之前应该被稀释的储备液中。在一些形式中,该试剂盒包括一批包装在单独小瓶中的缓冲液和溶质。该试剂盒还可以包括用于从受试者获得生物样品的装置,例如注射器,和/或用于从生物样品纯化DNA,或用于从RNA样品制备cDNA。该试剂盒可包括用于以上述方法施用化合物的印刷的说明书。
通过以下实施例可以进一步理解所公开的组合物和方法。
实施例
实施例1:使用实时PCR筛选NPM1基因突变
方法
用于突变筛选目的的特异性测试
4重和2重PCR系统在实时PCR(SOP)、ddPCR(QX200)和dPCR(QIAcuity One 4-Plex系统)上进行了测试作为原理验证。
Mut A、Mut B和Mut D占该基因座超过90%的移码突变(图1A),该方法能够鉴定大多数常见报道的NPM1突变。
该方法的突变和测定设计如图1A-1C所示。
引物设计
这些探针对MutA、Mut B和MutD具有特异性,没有检测到这3种类型的突变的假阳性。设计了两套PCR引物,一套作为输入材料用于DNA,另一套用于RNA。四种靶向NPM1的LNA探针被设计为特异性区分WT NPM1与Mut A、Mut B或Mut D。表1列出了为该方法设计的引物和探针序列,列出了完美匹配和错配的解链温度(Tm)。
在PCR过程中,所有突变体A、B和D探针均成对使用,但每个突变体探针在5’末端用不同的报告基因染料标记,并在3’末端用不同的淬灭剂染料标记。
表1用报告基因染料和淬灭剂染料的不同组合标记的PCR引物和探针序列
*染料组合(报告基因+淬灭剂)
**优选实施方案
用于当前测试的4重PCR探针用4种不同的荧光染料FAM、TAMRA、ROX和HEX标记,分别靶向NPM1 mut A、B、D和野生型NPM1。
对照
除了用于测试的合成质粒对照之外,还使用了四名AML患者,其中两名患有NPM1 A型突变体(患者A),两名患有B型突变体(患者B),来测试该平台。这些患者之前在其他实验室使用下一代测序进行了基因分型。然而,来自Mut D患者的DNA由于其稀有性而无法用于测试,因此Mut D的合成DNA被用作替代品。对于对照实验,合成突变体质粒对照和WT质粒包括在内。
四个质粒载体pUCIDT-AMP与基因组WT或Mut A、Mut B或Mut D NPM1的内含子11-12和外显子12的部分一起克隆。在DNA水平筛选突变时,这四种质粒或gBlock片段对照可作为相应基因型的阳性对照。它们还用作通过dPCR和ddPCR以及实时PCR的系列稀释标准品的后续MRD应用的阳性对照。表2中提供了插入序列。类似地,用NPM1外显子9-12的cDNA克隆了另外四个对照,用作RNA样品的合成对照。对于RNA样品的PCR,在实际PCR之前,首先将RNA样品反转录成cDNA。
输入核酸
除了用于测试的合成质粒对照之外,还使用了四名AML患者,其中两名患有NPM1 A型突变体(患者A),两名患有B型突变体(患者B),来测试该平台。这些患者之前在其他实验室使用下一代测序进行了基因分型。然而,来自Mut D患者的DNA由于其稀有性而无法用于测试,因此Mut D的合成DNA被用作替代品。对于对照实验,合成突变体质粒对照和WT质粒包括在内。
PCR
为了进行突变筛选,将靶向野生型NPM1、A型NPM1突变体(被称为Mut A)、B型NPM1突变体(被称为Mut B)和D型NPM1突变体(被称为Mut D)的4种探针汇集在单个PCR反应孔中并共享通用的PCR引物扩增。
该方法在以下仪器上进行了测试:Step One Plus(SOP)实时PCR系统、Bio-RadQX200 ddPCR系统和Qiagen Qiacuity dPCR系统。该系统与其他实时PCR仪器(例如RocheLC480 II)或dPCR仪器(例如ThermoFisher Quantstudio 3D dPCR系统)兼容。
每个样品都作为技术重复进行测试和分析。使用实时PCR进行不同突变的检测,如图2A-2F所示。
结果
经过几轮优化,最优的PCR条件包含800nM引物,其中四种探针中的每一种为400nM,在最终体积为40μL的dPCR反应或20μL的实时PCR反应中。
PCR条件涉及初始加热95℃(20秒),然后进行40个循环的95℃(15秒)和60℃(30秒)。在第一轮测试期间,每个孔中仅加载一种类型的DNA模板,即Mut A/B/D/WT NPM1的质粒对照或患者DNA(该患者DNA先前已知携带Mut和WT NPM1)。
在加载不同类型模板的每个4重孔中,在Mut A和WT通道中获得正确的阳性信号,在加载Mut B和Mut D质粒对照的孔中没有出现假阳性信号;当加载Mut A模板时,在MutAFAM通道中观察到明显的扩增,其由两条与绿色水平阈值紧密重叠和相交的S形曲线标记(图2A)。其他通道没有显示高于截止阈值的信号,这表明Mut A的LNA探针提供了期望的特异性,且不与任何其他突变体或WT NPM1结合。同样,WT NPM1的LNA探针显示了仅在WT HEX通道中检测到的期望阳性信号(图2C-2D)。当加载Mut B时,Mut B的信号比预期弱,并且观察到强烈的假阳性信号,这表明该探针(NPM1-MutB)应替换为NPM1-MutB-2或NPM1-MutB-3(图2B)。Mut B探针显示出与其他类型质粒的交叉反应性,因此TAMRA通道中出现假阳性信号。
为了进一步测试新的Mut B探针和复杂模板加载情况下的系统,使用HEX标记的WT探针和FAM标记的突变体探针进行双重PCR。在每个孔中,WT探针与一种类型的突变探针混合,并加载100,000个拷贝的WT或突变体质粒对照。额外的孔中加入了不正确的突变体质粒,以测试假阳性。(图3A-3E)。对于WT和Mut A探针,当加入不同的突变体质粒时,每次表现都与之前的运行相同,且没有假阳性信号。对于新的Mut B探针,两种探针均观察到最佳信号强度,且没有假阳性。对于Mut D探针,来自FAM和ROX通道的信号均被恢复,并且没有记录到假阳性。所有这些数据表明了所有探针都是基因型筛选的最佳选择。
实施例2:使用数字PCR(dPCR)筛选NPMI基因突变
方法
为了测试dPCR系统(QIAGEN)中的4重系统,使用相同的PCR条件,只是将反应体积增加至40μL,以与/>系统的26k纳米板兼容。dPCR更加灵敏,并允许通过分区扩增单个模板DNA。数据证实了这种检测所有三种突变体并将其与WT NPM1区分开来的能力。在显示了所有样品的集体数据的二维(2-D)散点图中,阳性信号聚集并且与阴性信号不同;加载相同类型模板的所有孔的集体数据表明了期望的探针特异性,除了Mut D显示了整体较弱的需要进一步优化的信号强度(图4A-4C)。
当研究加载不同类型的突变体质粒的单孔加入到20000个恒定拷贝数的野生型NPM1时,1-D散点图显示突变体在相应的荧光检测器通道上的明显且特异的阳性信号(图5)。单孔结果表明,当加载正确类型的模板质粒对照或患者gDNA时,Mut A、Mut D和WT都产生了高度特异性的信号。然而,Mut B探针需要用MutB-2或MutB-3代替,因为在两个加载有错配的患者DNA(患者A)的孔中观察到明显的干扰。
WT和Mut A的总体强度足够高[相对荧光单位(RFU)>150],并且具有已知Mut A的患者(患者A)的DNA显示了与质粒对照相当的强度。此外,如所期望的,在含有Mut B和D合成对照或具有Mut B的患者(患者B)的DNA的孔中没有观察到非特异性信号。
Mut B和D的信号强度相当低,但仅在具有Mut B质粒或具有已知Mut B(F4053)的患者骨髓DNA的孔中观察到Mut B特异性信号。在F3241和F3242中未检测到阳性事件,这两个分别是来自具有已知Mut B的患者的配对的骨髓(BM)和外周血(PB)。该患者接受了一系列治疗,外部实验室PCR结果显示骨髓中只有0.14%的归一化突变负荷。考虑到与骨髓相比,外周血的敏感性较低,这是意料之中的。然而,Mut B和D的背景干扰需要通过LNA探针修饰和染料选择进一步优化,以提高信号强度和非特异性扩增。
与无法放大Mut D的实时PCR相比,DPCR的结果明显更好。在图2A-2F和图3A-3E中,在2-D和1-D散点图中都观察到了所有三个突变体和WT NPM1的阳性事件的四个离散簇。这也表明,Mut D的探针可以检测到Mut D质粒对照的存在。Mut A和WT的探针显示出期望的特异性,但MUT B的探针显示出归因于非特异性的显著干扰事件。由于MUT D的低信号强度(RFU<50),在此无法得出Mut D探针的特异性。与目前用于标记探针D的ROX染料相比,当使用具有相同发射波长但量子产率更高的更亮的荧光染料获得更强的阳性信号时,应确定该探针的特异性。
使用FAM标记的新探针Mut B2、B3和Mut D,在系统中测试探针特异性,观察到最佳特异性(见图6)。尽管当分别加载Mut D和WT质粒时,Mut D和WT通道中的雨(弱信号)标志着轻微的PCR失效,但探针显示出期望的特异性。还设计了一个额外的WT探针。同样,还设计了一个额外的Mut A2探针。
实施例3:使用数字微滴PCR(ddPCR)筛选NPMI基因突变
最初设计的Mut A探针被证实在SOP和系统中都是最佳的。由于最初设计的Mut A探针在SOP和Qiacuity系统中均得到了最佳测试,而在这两个系统上测试时,Mut B探针需要更换为新的探针设计,因此在进行QX200 ddPCR系统时不再测试Mut A和Mut B探针。使用两种FAM染料标记的Mut B2、B3和Mut D探针在QX200数字微滴PCR系统上与带有HEX标记的WT进行双重测试。
为了模拟人类基因组DNA,每个孔都加载了20,000个恒定拷贝的WT质粒和可变拷贝的突变对照或加入错配突变质粒。当加载Mut B或D质粒时,即使存在丰富的WT质粒,也可以在每个FAM或HEX通道中观察到突变体特异性信号。在没有DNA模板(NTC)或加入有不正确类型质粒的孔中未检测到假阳性信号(图7)。因此,如所期望的,尽管观察到雨滴(弱)信号传导,但观察到了Mut B2、Mut B3和Mut D探针的正确特异性。为了解决这个问题,有必要优化QX200上的探针浓度。
对于非ABD突变体,筛选这些患者的特异性在DNA水平上进行了更广泛的测试,并在RNA水平上进行了简要测试,主要目的是将其与典型的NPM1突变区分开来。正如预期和图16A-D所示,尽管在DNA和RNA水平上都使用了dPCR分析,但具有非ABD突变的患者未显示出信号强度或信号强度非常差。这表明即使1-mer错配也会显著降低探针结合效率,从而阻碍PCR。
对于QX200上的基因型筛选,采用径向多重方法对探针进行了进一步测试,以便在最终设计中适应2通道检测系统上的4重检测。每个探针均用FAM和HEX标记,并以1:1的比例与等比例的HEX标记的WT探针混合。使用QX200的两个通道(FAM和HEX),通过以1:1的比例混合FAM和HEX标记探针并与HEX标记的WT混合来进一步测试Mut B和Mut D。正如预期的那样,在图8A-8D所示的2D散点图中,突变体信号的阳性簇存在对角线移动。这一结果为在QX200或任何只有两个检测通道的平台上的单个反应孔中进一步优化Mut A、B、D和WT的4重奠定了坚实的基础。
实施例4:定量和敏感性测试
突变体和WT NPM1的绝对拷贝数通过实时PCR上的标准曲线方法(使用连续稀释的质粒对照)或通过基于泊松分布而不需要标准曲线的dPCR/ddPCR来确定。如上所述,这些平台目前共享相同的PCR条件用于特异性。然后将突变体的百分比计算为NPM1突变体与总NPM1(突变体+WT)拷贝数的比率,并通过将该比率与诊断期间/可用的最早日期收集的基线样品进行比较来确定MRD。图9A-9C总结了实时PCR优化,并显示了随着Mut A、B和野生型NPM1稀释度的增加,计算的丰度(Ct值)的对数线性。观察到系列稀释质粒的理想线性,但基于当前的优化检测限仅为100个拷贝。该测定的计算灵敏度为至少100个拷贝。然而,由于实时PCR扩增失败,且等待重复或使用FAM标记的Mut D探针,无法确定Mut D的灵敏度。
在测试dPCR Qiacuity系统的灵敏度时,Mut A定量的主要焦点是与使用RNA作为实时PCR平台上的输入的内部结果的相关性。另一方面,Mut B和D的定量重点关注当将减少百分比的突变质粒加入恒定量的WT NPM1中时的灵敏度。如图10和表2所示,在MRD水平方面,与商用RNA实时PCR试剂盒(Ipsogen NPM1 Mut APCR试剂盒)完全一致。然而,由于RNA和DNA定量之间的技术差异,无法以类似的方式比较突变负荷。由于dPCR纳米板理论上能够分隔约26 000个DNA拷贝,因此测得的突变体拷贝数加上WT拷贝数低于预期,并且需要进一步优化模板加载。预计增加DNA输入会增加分区加载,从而进一步提高定量的灵敏度。
表2使用人DNA样品对Mut A进行dPCR的灵敏度测试,以及与使用商业RNA实时PCR试剂盒确定的内部MRD的相关性
对于TAMRA标记的Mut B和ROX标记的Mut D(在初始测试期间表现出次优特异性)的灵敏度测试,通过在WT NPM1存在下检测突变体NPM1来进行定量和灵敏度测试。这模仿了由白血病细胞和正常细胞组成的实际患者DNA,从而产生具有Mut和WT NPM1基因的DNA样品(图11A-11C和表3)。
表3.使用模拟dPCR系统(Qiacuity)患者DNA的质粒对照的针对Mut B和D的dPCR灵敏度测试
有效分隔 | 阳性 | 检测限 | |
B 10% | 25463 | 478 | |
B 1% | 24756 | 5 | |
B 0.5% | 25466 | 1 | |
B 0.1% | 25436 | 1 | 3.93E-05 |
D 10% | 25323 | 789 | |
D 1% | 25443 | 35 | |
D 0.5% | 24973 | 13 | |
D 0.1% | 24785 | 5 | 2.02E-04 |
即使仅将0.1%(22个拷贝)的突变体加入22000个拷贝的WT NPM1中,也能对两种突变体的微小拷贝进行一致的阳性检测并成功计数。在实现恒定量的WT拷贝的情况下,观察到绝对计数与实际加入拷贝的对数线性。这表明,即使当WT DNA丰富且可能主导PCR反应时,WT探针也没有或不存在显著的突变体探针抑制。类似地,当在QX200上测试Mut B2、B3和D探针时,当不同拷贝的Mut B或D与恒定WT质粒(20000拷贝)混合(范围从50%、33%至10%)时,观察到一致的突变负荷检测(图12A-12C)。所有这些结果都支持使用LNA探针量化NPM1突变以实现MRD的原理验证。使用新的Mut B探针,所有Mut探针的LOD在QX200上进一步测试,在DNA水平的200拷贝/μL WT对照中可以检测到低至1%的突变体拷贝。由于QX200是数字PCR技术的黄金标准,数据显示所公开的测试系统的Mut A的LOD为10%,Mut B和D的LOD为1%(图17A和17B)。
为了测试DNA平台是否可以替代RNA测定(RNA对患者样品有更严格的要求),通过该内部探针组研究了配对的DNA和RNA,并与商业Ipsogen RNA定量测定进行比较。图13使用QX200和Qiacuity,两个数字PCR平台之间具有良好的相关性,但DNA拷贝数与归一化至ABL的RNA水平的归一化拷贝数没有显著相关性。预计这种差异是由于dPCR平台比实时PCR具有更高的灵敏度以及dPCR而非实时PCR采用的泊松分布统计方法所致。
由于DNA和RNA测定之间的相关性不显著(已知dPCR更为敏感),因此采用了其他方法进行下游验证。这包括对选定患者进行连续样品分析以及仅使用数字PCR平台进行分组分析。
为了测试该测定方法在检测患者早期分子复发方面是否具有预期的灵敏度,对几名观察到复发的患者进行了DNA和RNA水平的研究。患者B具有罕见的Mut B,其中9个时间点显示了DNA和RNA早期分子复发监测的应用。9个时间点中只有4个时间点被证明具有早幼粒细胞计数的高百分比或检测到母细胞的存在。图14显示,在母细胞或早幼粒细胞存在的9个时间点中的4个中,可以在DNA和RNA中检测到NPM1的拷贝数,其中DNA比RNA表现出更高的灵敏度。如图14A和14B之间的比较所示,两种不同dPCR系统之间的测定性能具有可比性。
如图15所示,患者DNA样品被分为两组,并研究NPM1突变是否赋予任何临床意义:(1)响应时间点或缓解期间以及(2)对包括化疗和HSCT在内的治疗的复发和难治性。正如预测的那样,患者在缓解或稳定状态下的时间点具有较低的NPM1拷贝数,而在疾病复发期间拷贝数较高。这些数据共同支持dPCR作为MRD工具的应用,并且DNA和RNA都可以使用。
结论
为了有效筛选同时具有特异性和灵敏度的三种突变体,开发了一组探针序列,可以在dPCR中检测低至5个拷贝的突变体,在实时PCR中检测低至100个拷贝的突变体。每个突变体探针的最佳特异性提供了实时PCR和dPCR在DNA水平上筛选所需的特异性。显示ddPCR的灵敏度与dPCR相当。使用更多DNA模板并修改相同探针序列的LNA碱基位置来优化实时PCR的灵敏度。实时PCR的应用可以通过每个探针的单重PCR来实现,由于WT探针占主导地位,因此突变体探针受到限制,特别是对于低突变负荷样品。
对于DNA水平的基因型筛查,dPCR清楚地表明4重PCR系统可以作为NPM1突变的强大筛查工具。FAM标记的新探针Mut B2和B3以及突变体D解决了实时PCR中检测Mut B的探针特异性欠佳以及筛选Mut D的灵敏度的问题。为了提高实时PCR基因分型的灵敏度,可以使用单重PCR;然而,RNA测定已经被引入。在染料修饰方面,针对Mut B、D和野生型NPM1的更强的替代染料组合分别是ATTO550、TYE665和Yakima Yellow。Mut A的FAM已经是一种强染料,因此Mut A探针优化将集中在LNA修饰上。还可以使用其他更强的染料。
为了与具有有限荧光检测器(例如绿色和黄色检测器)的dPCR或ddPCR设备兼容,还修改了4色系统以提供另一个版本,仅使用两种荧光染料FAM和HEX/Yakima Yellow用于绿色和黄色检测器,遵循径向多重方法。对于该方法,将分别用FAM和HEX/Yakima Yellow标记的两个探针用于突变体B和D。在PCR过程中,这四个探针以不同的比例(分别为1:3和3:1比例)与FAM探针一起混合用于Mut A,与HEX探针一起混合用于WT NPM1。因此,通过共享MutA和WT NPM1的相同检测器,可以检测Mut B和D的混合信号,而在dPCR或ddPCR系统中的2-D散点图上没有重叠位置。
用于筛选NPMI基因突变的系统还设计了衍生版本,其中正向PCR引物结合外显子11末端,而反向引物跨越外显子12下游至突变。这使得能够使用从RNA转化的cDNA作为筛选目的的输入来检测突变。与DNA测定类似,具有一致的特异性和灵敏度,因此强烈推荐作为MRD工具应用,替代使用未修饰探针的传统实时PCR和dPCR测定。
通过以下编号的段落将进一步理解本发明。
1.检测样品中NPM1基因的外显子12中的突变的存在、缺失和/或水平的方法,所述方法包括:
(a)将标记的序列探针与样品中NPM1基因的外显子12的核酸杂交,以形成探针-核酸缀合物,
其中所述杂交包括:
(i)在引物延伸条件下,将两组寡核苷酸引物与所述样品在反应混合物中结合,
其中所述引物各自包含与所述NPMl基因的核酸序列互补的核酸序列并且各自被配置为产生包含所述NPM1基因外显子12的全部或部分的延伸产物,
(ii)向所述反应混合物中添加一种或多种标记的序列探针,
其中每个探针包含(1)与所述野生型NPM1基因或所述NPM1基因突变体的核酸序列互补的核酸序列,(2)一个或多个锁核酸(LNA)残基,和(3)可检测标记,
其中与所述NPM1基因互补的探针的核酸序列在仅存在于所述野生型NPM1基因或所述NPM1基因突变体中的预定位置处退火至所述延伸产物;
和
(b)检测所述可检测标记,
其中所述可检测标记的检测告知所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
2.段落1所述的方法,其中所述NPM1基因的突变是选自所述NPM1基因的A型、B型和D型突变的一种或多种移码突变。
3.段落1或段落2所述的方法,其中所述延伸产物包含SEQ ID NO:1-4中的一个的全部或部分。
4.段落1-3中任一项所述的方法,其中两个寡核苷酸引物组包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列。
5.段落1-3中任一项所述的方法,其中两个寡核苷酸引物组包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列。
6.段落1-5中任一项所述的方法,其中所述引物延伸步骤包括在所述反应混合物中进行聚合酶链式反应(PCR)以使用实时PCR,或数字PCR,或微滴数字PCR形成扩增子。
7.段落1-6中任一项所述的方法,其中所述样品包含核酸载体,所述核酸载体包含所述NPM1基因、基因组DNA、cDNA或其组合的全部或部分。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法,其进一步包括
(d)记录所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
9.段落8所述的方法,其中所述方法还包括使用一个或多个对照样品。
10.段落9所述的方法,其中记录所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平包括将来自所述样品的结果与从所述一个或多个对照获得的结果进行比较。
11.段落9所述的方法,其中将所述结果与四个对照进行比较,所述四个对照包含对应于野生型NPM1的第一对照核酸序列、对应于A型NPM1突变的第二对照核酸序列、对应于B型NPM1突变的第三对照核酸序列,以及D型NPM1突变第四对照核酸序列。
12.段落9或10所述的方法,其中所述对照包含SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:9-12中的一个或多个核酸序列。
13.段落1-12中任一项所述的方法,其中所述可检测标记包含荧光染料和淬灭剂。
14.段落13所述的方法,其中所述荧光染料附接至所述探针的5’末端,并且所述暗淬灭剂附接至所述探针的3’末端。
15.段落13或段落14所述的方法,其中所述荧光染料选自下组:6-FAM、荧光素dT、Cy3TM、5(6)-羧基四甲基罗丹明、JOE、Cy5TM、MAX、TETTM、TEX615、TYE665、6-ROX、Cy5.5TM、YAKIMAYELLOWTM、TEX615、TYE665、TYE705、SUN、ATTO488、ATTO532、ATTO550、ATTO565、ATTORHO101、ATTO590、ATTO633、ATTO647N、HEX和Alexa Fluor染料。
16.段落1-15中任一项所述的方法,其中所述标记的序列探针包含一个、两个、三个或四个探针,其中所述探针选自与野生型NPM1的核酸选择性杂交的第一探针,与A型NPM1突变的核酸选择性杂交的第二探针,与B型NPM1突变的核酸选择性杂交的第三探针,以及与D型NPM1突变的核酸选择性杂交的第四探针。
17.段落16所述的方法,其中所述第一探针的核酸序列包含SEQ ID NO:17或SEQID NO:22,其中所述第二探针的核酸序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23,其中所述第三探针的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,并且其中所述第四探针的核酸序列包含SEQ ID NO:21。
18.段落1-17中任一项所述的方法,其中所述方法需要至少100个拷贝,或少于100个拷贝的NPM1 DNA。
19.段落18所述的方法,其中所述方法需要至少10个拷贝,或少于10个拷贝的NPM1DNA。
20.段落19所述的方法,其中所述方法需要至少5个拷贝,或少于5个拷贝的NPM1DNA。
21.段落1-20中任一项所述的方法,其中所述样品来自患有白血病的个体,或被鉴定为处于白血病风险中的个体。
22.段落21所述的方法,其中所述受试者患有急性髓系白血病(AML),或被鉴定为处于AML的风险中。
23.段落21或段落22所述的方法,其进一步包括向所述受试者施用治疗剂或程序的步骤。
24.段落21至23中任一项所述的方法,其中所述受试者正在经历或适合造血干细胞疗法(HSCT)。
25.段落1-24中任一项所述的方法,其中所述方法用于检测或定量所述受试者中的可测量的残留病灶(MRD)。
26.标记的序列探针,其用于段落1-25中任一项所述的方法中。
27.用于检测样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的试剂盒,其包含
(i)寡核苷酸引物,
其中所述引物各自包含与所述NPM1基因的核酸序列互补的核酸序列,并且各自被配置为产生包含所述NPM1基因的全部或部分的延伸产物;和
(ii)一种或多种标记的序列探针,
其中所述探针各自包含具有与所述NPM1基因或所述NPM1基因突变体的核酸序列互补的序列的锁核酸(LNA)、报告基因染料和暗淬灭剂,
其中与所述NPM1基因互补的核酸序列在预定位置处退火至所述延伸产物;和
(iii)用于权利要求1所述的方法的说明书。
Claims (27)
1.检测样品中NPM1基因的外显子12中突变的存在、缺失和/或水平的方法,所述方法包括:
(a)将标记的序列探针与样品中所述NPM1基因的外显子12的核酸杂交,以形成探针-核酸缀合物,
其中所述杂交包括:
(i)在引物延伸条件下将一组两个寡核苷酸引物与所述样品在反应混合物中组合,
其中所述引物各自包含与所述NPM1基因的核酸序列互补的核酸序列并且各自被配置为产生包含所述NPM1基因的外显子12的全部或部分的延伸产物,
(ii)向所述反应混合物中添加一种或多种标记的序列探针,
其中每个探针包含(1)与所述野生型NPM1基因或所述NPM1基因突变体的核酸序列互补的核酸序列,(2)一个或多个锁核酸(LNA)残基,和(3)可检测标记,
其中与所述NPM1基因互补的所述探针的核酸序列在仅存在于所述野生型NPM1基因或所述NPM1基因突变体中的预定位置处退火至所述延伸产物;
和
(b)检测所述可检测标记,
其中所述可检测标记的检测告知所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
2.权利要求1所述的方法,其中所述NPM1基因的突变是选自所述NPM1基因的A型、B型和D型突变的一种或多种移码突变。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述延伸产物包含SEQ ID NO:1-4中的一个的全部或部分。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述两个寡核苷酸引物组包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列。
5.权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述两个寡核苷酸引物组包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法,其中在(b)中扩增所述探针-核酸缀合物包括使用实时PCR,或数字PCR,或微滴数字PCR在所述反应混合物中进行聚合酶链式反应(PCR)以形成扩增子。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述样品包含核酸载体,所述核酸载体包含所述NPM1基因、基因组DNA、cDNA或其组合的全部或部分。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法,其进一步包括
(d)记录所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平。
9.权利要求8所述的方法,其中所述方法进一步包括一个或多个对照样品的使用。
10.权利要求9所述的方法,其中记录所述样品中NPM1突变的存在、缺失和/或水平包括将来自所述样品的结果与从所述一个或多个对照获得的结果进行比较。
11.权利要求9所述的方法,其中将所述结果与四个对照进行比较,所述对照包括对应于野生型NPM1的第一对照核酸序列、对应于A型NPM1突变的第二对照核酸序列、对应于B型NPM1突变的第三对照核酸序列,以及D型NPM1突变第四对照核酸序列。
12.权利要求9或10所述的方法,其中所述对照包含SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:9-12中的一个或多个的核酸序列。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述可检测标记包含荧光染料和淬灭剂。
14.权利要求13所述的方法,其中所述荧光染料附接至所述探针的5’末端,并且所述暗淬灭剂附接至所述探针的3’末端。
15.权利要求13或权利要求14所述的方法,其中所述荧光染料选自6-FAM、荧光素dT、Cy3TM、5(6)-羧基四甲基罗丹明、JOE、Cy5TM、MAX、TETTM、TEX615、TYE665、6-ROX、Cy5.5TM、YAKIMAYELLOWTM、TEX615、TYE665、TYE705、SUN、ATTO488、ATTO532、ATTO550、ATTO565、ATTORHO101、ATTO590、ATTO633、ATTO647N、HEX和Alexa Fluor染料。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述标记的序列探针包含一个、两个、三个或四个探针,其中所述探针选自与野生型NPM1的核酸选择性杂交的第一探针,与A型NPM1突变的核酸选择性杂交的第二探针,与B型NPM1突变的核酸选择性杂交的第三探针,以及与D型NPM1突变的核酸选择性杂交的第四探针。
17.权利要求16所述的方法,其中所述第一探针的核酸序列包含SEQ ID NO:17或SEQID NO:22,其中所述第二探针的核酸序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23,其中所述第三探针的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,并且其中所述第四探针的核酸序列包含SEQ ID NO:21。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述方法需要至少100个拷贝,或少于100个拷贝的NPM1 DNA。
19.权利要求18所述的方法,其中所述方法需要至少10个拷贝,或少于10个拷贝的NPM1DNA。
20.权利要求19所述的方法,其中所述方法需要至少5个拷贝,或少于5个拷贝的NPM1DNA。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述样品来自患有白血病的个体,或被鉴定为处于白血病风险中的个体。
22.权利要求21所述的方法,其中所述受试者患有急性髓系白血病(AML),或被鉴定为处于AML的风险中。
23.权利要求21或权利要求22所述的方法,其进一步包括向所述受试者施用治疗剂或程序的步骤。
24.权利要求21至23中任一项所述的方法,其中所述受试者正在经历或适合造血干细胞疗法(HSCT)。
25.权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述方法用于检测或定量所述受试者中的可测量的残留病灶(MRD)。
26.标记的序列探针,其用于权利要求1-25中任一项所述的方法中。
27.用于检测样品中NPM1基因突变的存在、缺失和/或水平的试剂盒,其包含
(i)寡核苷酸引物,
其中所述引物各自包含与所述NPM1基因的核酸序列互补的核酸序列,并且各自被配置为产生包含所述NPM1基因的全部或部分的延伸产物;和
(ii)一种或多种标记的序列探针,
其中所述探针各自包含具有与所述NPM1基因或所述NPM1基因突变体的核酸序列互补的序列的锁核酸(LNA)、报告基因染料和暗淬灭剂,
其中与所述NPM1基因互补的核酸序列在预定位置处退火至所述延伸产物;和
(iii)用于权利要求1所述的方法的说明书。
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