CN103911427A - 一种基于数字pcr平台检测基因点突变的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体为一种检测基因点突变的方法及试剂盒；以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条标记不同类型荧光的TaqMan探针对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型及其数量和比例。

Description

一种基于数字PCR平台检测基因点突变的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测基因点突变的方法及其试剂盒。
背景技术
点突变是基因变异中常见的类型，会给微生物、植动物的生物性状和人类的生理性状带来很多变化；包括蛋白质功能的部分或全部失活，形成无活性的片段等，也有可能改变生物体的基因调控等其他功能。基因突变的研究对生物的遗传、进化和改造具有重要意义。
目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下：
Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2－3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。
ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory MutationSystem，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。
ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。
上述现有技术存在以下问题：
1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测，或者定量分析误差较大。
2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。
3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。
发明内容
本发明旨在提供一种基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒及方法。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条不同的TaqMan探针（标记不同类型荧光）对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型。
本发明技术方案为，
一种检测基因点突变的方法，步骤包括：
1.将待测样品DNA模板、点突变位置的上下游PCR扩增引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针；两者均为为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且所含的荧光基团的种类不同。优选的，荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国LifeTechnologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国LifeTechnologies）。
数字PCR混合液中，所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：
a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL，优选为0.5ng/μL；
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM，优选为600nM；
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM，优选为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM，优选为300nM。
2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应。
优选的PCR扩增条件为，93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。
更优选的PCR扩增条件为，94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。
3.收集信号并进行结果判断：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有发生点突变的DNA模板，还可确定其中发生基因点突变的DNA模板的数量和含量。
可用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。
一种基于数字PCR平台检测基因点突变的TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针。优选的，这种数字PCR平台检测基因点突变的TaqMan探针由与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针组成。
与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针均为为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且所含的荧光基团的种类不同。
荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国LifeTechnologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国LifeTechnologies）。
上述的TaqMan探针可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测基因是否点突变。
本发明将带有不同类型荧光基团、且分别与突变型DNA模板以及野生型DNA模板结合的TaqMan探针，用作制备基于数字PCR平台检测基因缺失突变的试剂盒，或者基于数字PCR平台检测基因缺失突变。
一种检测基因点突变的试剂盒，包含以下物质：
（1）与突变型DNA模板结合的TaqMan探针；
（2）与野生DNA模板结合的TaqMan探针，且上述两种TaqMan探针均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，所含的荧光基团类型不同。
荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国LifeTechnologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国LifeTechnologies）。
与现有技术比较，本发明的优点在于：
1.结果判读方式：以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。
2.结果描述的方式：以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量极低的情况下，定量分析的误差也很小。
3.检测灵敏度（数值越小灵敏度越好）：以前技术方法的灵敏度一般在1％－50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，能达到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。
附图说明
图1为实施例1中，不同含量EGFR外显子21上L858R点突变样本的荧光检测结果。
图2为实施例2中，不同含量EGFR外显子20上T790M点突变样本的荧光检测结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。
所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)：
实施例1EGFR（人表皮生长因子受体）基因外显子21上L858R点突变
（1）准备样品：含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子21上L858R点突变的突变阳性DNA与野生型DNA混合的样本（其中突变体与野生型的含量比分别为1/1、1/100、1/1000、1/2500）。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。其中，突变DNA模板来源于携带EGFR外显子21上L858R点替换突变的细胞系（经PCR测序鉴定），其中突变的位点在EGFR外显子21上c.2573位。
（2）室温融解PCR引物及对应TaqMan探针。
正向和反向PCR引物的序列为：
F1:5’-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3’
R1:5’-CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’
TaqMan探针的序列为：
与野生型DNA结合的TaqMan探针PW1上连接的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB，其核苷酸部分序列为：5’-TTGGCCAGCCCAA-3’。
与突变型DNA结合的TaqMan探针PM1上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB，其核苷酸部分序列为：PM15’-TTGGCCCGCCCAA-3’。
（3）按照以下配比制备PCR反应液：2×数字PCR预混液（Biorad，#186-3022）与正向及反向PCR引物、与野生型DNA模板结合的TaqMan探针、与突变型DNA模板结合的TaqMan探针及与待检测DNA（10ng）混合，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配制成数字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分别为600nM，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针以及与突变型DNA模板结合的TaqMan探针分别为300nM。
（4）配制好的20μL数字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板内，然后加入60μL液滴制作油到制作板用于制备PCR微反应液滴（QX200微滴发生器）。
（5）将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
（6）将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：
94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
（7）PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪（QX200微滴荧光信号收集系统）中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号。用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析结果如图1。可进行定量分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对于总DNA的比例。
以上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子21上L858R点突变，检出限达到1/2500。
突变体与野生型的含量不同的样品检测结果中，突变阳性信号数（FAM）与总信号数（FAM和VIC）如下：
1/1样品：5570/11274，计算值突变/野生=0.976/1，误差2.4%
1/100样品87/9012，计算值突变/野生=0.00975/1，误差2.5%
1/1000样品：22/19782，计算值突变/野生=0.0011/1，误差10%
1/2500样品：5/12582，计算值突变/野生=0.000397/1，误差0.1%。
定量分析的结果显示，误差一般在0.5%～4%，不超过10%。
使用以下各组之一的PCR引物时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量分析的误差一般在0.1%～5%。
（1）正向F2:5’-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3’，
反向R2:5’-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3’，或者，
（2）正向F3:5’-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3’，
反向R3:5’-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’，或者，
（3）正向F4:5’-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3’，
反向R4:5’-TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3’，或者，
（4）正向F5:5’-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3’，
反向R5:5’-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3’。
使用的TaqMan探针核苷酸部分改为以下各组序列之一时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量分析的误差一般不超过5%。
（1）PW2:5’-TTGGGCTGGCCAA-3’，
PM2:5’-TTTGGCCCGCCCA-3’，或者，
（2）PW3:5’-TTTGGGCTGGCCAAA-3’，
PM3:5’-GTTTGGCCCGCCC-3’，或者，
（3）PW4:5’-TGGGCTGGCCAAA-3’，
PM4:5’-AGTTTGGCCCGCC-3’，或者，
（4）PW5:5’-GGGCTGGCCAAACTG-3’，
PM5:5’-TGGCCCGCCCAAA-3’。
根据现有文献记载，使用其他方法如荧光定量PCR法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。
实施例2EGFR基因外显子20上T790M点突变
采用与实施例1相同的条件和操作方法，区别在于使用以下的PCR引物及TaqMan探针：
正向和反向PCR引物的序列为：
正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’
反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’
与野生型DNA结合的TaqMan探针上连接的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB，其核苷酸部分序列为：PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’。
与突变型DNA结合的TaqMan探针上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB，其核苷酸部分序列为：PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’。
结果如图2，以上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子20上T790M点突变，检出限达到1/2500。定量分析误差一般在0.01%～1%，突变体与野生型的含量不同的样品检测结果中，突变阳性信号数（FAM）与总信号数（FAM和VIC）如下：
1/1样品5365/10756，计算值突变/野生=0.995/1，误差0.5%
1/100样品105/10564，计算值突变/野生=0.010/1
1/1000样品21/19691，计算值突变/野生=0.00107/1，误差7%
1/2500样品7/17523计算值突变/野生=0.000399/1。
使用以下各组之一的PCR引物时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。
（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’
（2）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’
反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’
（3）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’
反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’
（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’，
反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。
使用的TaqMan探针的核苷酸部分改为以下各组之一时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。
（1）PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’
PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’；
（2）PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’，
PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’。
使用荧光定量PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。

Claims (10)

1.一种基于数字PCR平台检测基因点突变的方法，其特征在于，
（1）数字PCR混合液制备：将待测的DNA模板、PCR引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针；所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且两者所含的荧光基团不同；
（2）用数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
PCR扩增条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应；
（3）信号收集与结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有点突变的DNA模板及其数量和含量。
2.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
3.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，所述的TaqMan探针由与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针组成。
4.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，PCR扩增条件为，93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。
5.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，PCR扩增条件为，94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
6.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：
a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL；
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM；
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM。
7.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：
a.DNA模板，含量为0.5ng/μL；
b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为600nM；
c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为300nM。
8.TaqMan探针用于制备基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针。
9.TaqMan探针用于基于数字PCR平台检测基因点突变，其特征在于，所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针。
10.一种基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，包含以下物质：
（1）与突变型DNA模板结合的TaqMan探针；
（2）与野生DNA模板结合的TaqMan探针；
且上述两种TaqMan探针均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，所含的荧光基团类型不同。
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