CN105838780A - ddPCR技术监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种ddPCR技术监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法，及其在监控维罗非尼治疗黑色素瘤过程中的应用。本发明首先对黑色素瘤患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中NRAS的耐药突变位点Q61K的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆中NRAS基因耐药突变位点Q61K基因突变的方法及其在监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药性等方面的应用。
背景技术
黑色素瘤(melanoma)是一种能产生黑色素的高度恶性肿瘤。大多见于30岁以上成年人，发生于皮肤、粘膜和内脏器官。近年来，恶性黑色素瘤的发病率不断上升，给人类的健康带来了巨大的威胁。黑色素瘤发病早期的转移率高、致死性强，对单纯放化疗敏感性差，患者大多预后较差，晚期可有淋巴道及血液转移。
50％-60％的转移性黑色素瘤都存在BRAF V600E基因突变，临床上已批准的用于治疗BRAF突变黑色素瘤的靶向药物维罗非尼(vemurafenib)对黑色素瘤患者有很高的效率。BRAF突变抑制剂维罗非尼，能选择性阻断RAF/MEK/ERK通道的BRAF突变黑色素瘤细胞。维罗非尼对大部分BARF突变的转移性黑色素瘤患者都有疗效，可导致其肿瘤退化。但该药物在体内所产生的效应是短暂的，很多患者在不到1年内就产生了维罗非尼耐药。
在体外诱导的维罗非尼耐药细胞中发现了高活性的NRAS Q61K突变，同时在维罗非尼耐药的黑色素瘤患者转移的淋巴结中，也同样发现了NRAS Q61K突变。因此通过检测肿瘤中这一位点的突变情况，可预测患者对维罗非尼治疗的反应。然而传统的检测方法需要以肿瘤组织的基因组DNA为模板，这为患者在治疗过程中的多次检测和实时监控带来了困难。
血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。
研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。
然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、数字PCR)，仍难以准确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠癌患者中循环游离DNA的平均含量(4771ng/ml)与健康人的平均含量(0.85ng/ml)存在显著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原(CEA)的检测只有47％检测结果对诊断有意义。
因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。
综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关突变(如NRAS Q61K突变)的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够用非肿瘤组织(如血液或血浆样品)检测患者NRAS Q61K突变的方法。
本发明的第一方面，提供了一种对NRAS基因耐药突变位点进行检测的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和
(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出NRAS基因耐药突变位点的突变形式和/或比例。
在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：NRAS Q61K。
在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。
在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。
在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。
在另一优选例中，所述的预处理包括：
(a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管(如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝管))中；
(b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相(血浆)；
(c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提取DNA的检测样本。
在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：
(b-i)2000-5000rmp；
(b-ii)离心约1-15分钟；
(b-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。
在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：
(c-i)10000-15000rmp；
(c-ii)离心约5-30分钟；
(c-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50～100ng。
在另一优选例中，所述的突变是在SEQ ID NO.:5所示的核苷酸序列中，第26位的核苷酸从C→A。
在另一优选例中，所述的突变是在SEQ ID NO.:10所示的核苷酸序列中，第32位的核苷酸从C→A。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。
在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。
在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含NRAS Q61K突变位点的特异引物对。
在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。
在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；
或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。
在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:3所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:8所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中，所述的引物扩增的目标序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述的引物扩增的目标序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，NRAS Q61K的特异引物对(9μM)及探针(5μM)各1μl。
在另一优选例中，所述的样本来自于黑色素瘤患者。
在另一优选例中，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：
(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；
在另一优选例中，蛋白酶K的加入量为150-250(优选为200μg)/100微升检测样本。
在另一优选例中，(2a)中还包括：在消化结束后，对蛋白酶K进行灭活。
(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；
在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。
在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。
(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；
(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量为20-100ng/微升；和/或所述含洗脱DNA的洗脱液的体积为20-100微升。
在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的大小为100-250bp，更佳地为150-200bp。
在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。
在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。
在另一优选例中，所述的洗脱包括：AVE洗脱。
在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。
本发明的第二方面，提供了一种NRAS基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；
(b)RNA carrier；
(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法，
其中，所述的突变位点包括NRAS Q61K。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。
在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。
在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示。
本发明的第三方面，提供了一种NRAS基因耐药突变位点Q61K检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对，并且引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所示；
(b)RNA carrier；
(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法；
(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；
或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面或本发明第三方面所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对维罗菲尼的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用维罗菲尼进行治疗的试剂盒。
在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括黑色素瘤患者。
在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。
在另一优选例中，所述是检测包括在给予维罗菲尼之前、之中、或之后进行检测。
本发明的第五方面，提供了一种肿瘤患者维罗菲尼耐药性的检测方法，所述方法包括步骤：用如本发明第一方面所述的方法进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测；和
若检测结果为阳性，则判定患者对维罗菲尼耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对维罗菲尼敏感。
在另一优选例中，所述的肿瘤为黑色素瘤。
本发明的第六方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，所述方法包括步骤：
(a)用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测，并对检测结果为阴性的对象，采用维罗菲尼进行治疗；
(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象再次进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用维罗菲尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用维罗菲尼进行治疗。
在另一优选例中，在步骤(b)中还包括：记录首次检测到NRAS Q61K突变阳性的时间。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1实施例1中ddPCR检测微滴荧光信号分布区结果显示。图中蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中左图显示了NRAS Q61K突变阳性的检测结果，右图显示了NRAS Q61K突变阴性的检测结果。
图2实施例1中ddPCR检测微滴数目结果显示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了NRAS Q61K突变阳性的检测结果，图2B显示了NRAS Q61K突变阴性的检测结果。
图3为实施例1中的血浆游离DNA跑胶图。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，通过对于大量方法和试剂的筛选，意外地发现，通过改进的血浆样本制备和添加特定的富集剂(如RNA carrier)，并结合微滴式数字PCR技术和高特异性的引物序列和探针序列，居然可以用外周血浆样本高效地提取到的肿瘤相关性的DNA分子，从而高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中NRAS Q61K突变，从而可辅助判断患者是否对维罗非尼产生耐药。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“肿瘤相关突变”指与肿瘤的发生、进展、治疗、和/或预后相关的基因突变，尤其是与肿瘤治疗的耐药性相关的DNA突变。
如本文所用，术语“本发明突变”、“本发明的耐药性突变”或“NRAS Q61K突变”可互换使用，指NRAS蛋白的Q61K突变(在蛋白质水平，NRAS蛋白第61号氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K))以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变(基因水平)。研究表明，通过检测NRAS Q61K这一突变位点的突变情况，对于肿瘤患者是否采用或继续采用维罗非尼治疗，有指导作用。
如本文所用，术语“非肿瘤组织”指与肿瘤组织不同的组织。在本发明中，对于实体瘤而言，血液和血浆可视为“非肿瘤组织”。
如本文所用，术语“RNA Carrier”为一种市售的、用于协助分离RNA的试剂。其成分为ployG偶联到DNAmate一种高分子化合物。研究表明，RNA Carrier能特异吸附低浓度RNA，并且有助于减少提取过程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier对于常规双链DNA的提取无促进作用。
本发明的目的是提供一种用ddPCR技术通过检测黑色素瘤患者外周血浆中NRAS基因突变以判定患者对维罗非尼耐药的方法。
本发明的另一目的是提供根据NRAS基因突变推测黑色素瘤患者对维罗非尼产生继发耐药的时间的方法。
本发明的最终目的是利用ddPCR技术，检测黑色素瘤患者外周血浆中NRAS Q61K的突变情况，再根据检测结果判定患者是否对维罗非尼耐药，并推测患者对维罗非尼产生继发耐药的时间，为调整黑色素瘤患者治疗方案提供指导。
外周血样本中提取DNA模板
由于外周血样本中可用于有效检测肿瘤相关性的DNA的量非常少，因此需通过一定的富集手段对外周血游离DNA进行富集，以得到能够用于检测量的DNA。
本发明中，优选的DNA的抽提方法如下：
(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；
(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；
在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。
在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。
(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；
(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
完成上述抽提后，所得到的的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量通常为20-100ng/微升，所述含洗脱DNA的洗脱液的体积通常为20-100微升。
在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的平均大小通常为≤300bp(即基本由游离DNA组成)，较佳地为100-250bp，更佳地为150-200bp。
在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。
在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。
在另一优选例中，所述的洗脱包括：AVE洗脱。
在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。
NRAS基因耐药突变位点Q61K的检测
数字PCR(digital PCR，dPCR)技术被称为“第三代PCR”技术，是一项检测和定量核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计数，以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统(droplet digitalPCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目，特别适合拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。
在本发明中，优选的DNA模板是用外周血分离的血浆提取的，较佳地，在提取DNA模板前，将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆。
优选的本发明实施例中，DNA模板的提取方法如下：
(i)抽提血浆中的游离DNA；
(ii)对样本进行裂解、富集、过柱洗脱和AVE洗脱，得到待扩增的DNA模板；
任选地，所述方法还包括步骤：(iii)测试所述DNA模板的片段大小。
本申请的PCR方法中，所使用的引物对为包含NRAS Q61K突变位点的特异引物。所述的引物可以选择包含NRAS Q61K突变位点的区段进行设计，优选地，所述的区段为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10所示的区段。
在本发明的一个优选实施例中，所述的特异引物具有如SEQ ID NO:1，GTTGGACATACTGGATACAGC和SEQ ID NO:2，GACTTGCTATTATTGATGGC(对应于SEQ ID NO:5的扩增目标序列)所示的序列，或如SEQ ID NO:6，CTGTTTGTTGGACATACTGGATA和SEQ ID NO:7，TACACAGAGGAAGCCTTCG(对应于SEQ ID NO:10所示的扩增目标序列)所示的序列。所用探针包括一条用于检测突变型的突变型特异探针，和一条用于检测野生型的野生型特异探针。优选地，突变型探针类型为FAM探针(例如但并不限于SEQ ID NO:3，AGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCC)，所述的野生型探针类型为HEX探针(例如但并不限于SEQ ID NO:4，AGCTGGAAAAGAAGAGTACAGTGCC所示的序列)；或突变型探针类型为FAM探针(例如但并不限于SEQ ID NO:8，GGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAG)，所述的野生型探针类型为HEX探针(例如但并不限于SEQ ID NO:9，GGAAAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAG所示的序列)。
在本发明的一个优选例中，所述的微滴式数字PCR的反应液首先通过QX100微滴发生器生成纳升级别的油包水的液滴，然后再进行PCR反应，最后将PCR板转移到QX100微滴分析仪对所有样品孔进行荧光检测。
在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应所使用的反应体系每20μl组成如下：待测肿瘤组织DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，NRAS Q61K的特异引物及探针各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。
在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应的反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。
本发明的一个优选实施例中，检测ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果如图1所示，图中，蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中，图1A显示了NRAS Q61K突变阳性的检测结果，图1B显示了NRAS Q61K突变阴性的检测结果。
本发明的一个优选实施例中的ddPCR仪微滴数目检测结果如图2所显示。图中，深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了NRAS Q61K突变阳性的检测结果，图2B显示了NRAS Q61K突变阴性的检测结果。
维罗非尼耐药性判断
由于NRAS Q61K突变阳性与患者(优选为黑色素瘤患者)维罗非尼耐药性相关(NRAS蛋白第61号氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K))，因此，本发明的检测方法可以用于辅助判断患者是否对维罗非尼产生耐药。本申请利用ddPCR技术检测接受维罗非尼治疗的黑色素瘤患者外周血浆中NRAS Q61K的突变情况，根据检测结果判定患者是否对维罗非尼耐药，并推测患者对维罗非尼产生继发耐药的时间，为调整黑色素瘤患者治疗方案提供指导。
在本发明的优选实施例中，取患者外周血样本并提取基因组DNA，以待测外周血浆基因组DNA为模板，利用上述方法对NRAS基因的耐药突变位点Q61K进行检测，然后根据检测到NRAS基因的Q61K位点突变阳性的时间确定患者对维罗非尼产生耐药的时间。
由于本发明方法可以采用较易采样的外周血样本进行检测，因此，所述的检测可以多次进行，从而在患者的治疗过程中实时监控。
本发明方法既可以在用药前对患者的耐药性进行判断，也可以在用药过程中或之后判断患者是否已经产生耐药性，从而为后续治疗提供指导。在本发明的优选实施例中，所述的黑色素瘤患者可以是尚未使用维罗菲尼进行治疗的黑色素瘤患者，也可以是已经开始使用维罗非尼进行治疗的患者。
在本发明的一个优选例中，在每个治疗周期前后，取黑色素瘤患者外周血样本，分离血浆并提取基因组DNA，以待测外周血浆基因组DNA为模板，利用ddPCR技术对NRAS基因的耐药突变位点Q61K进行检测，然后根据检测到NRAS基因的Q61K位点突变的阳性或阴性，确定患者对维罗非尼是否产生耐药。
具体地，所述的判断检测方法如下：
提取黑色素瘤患者外周血浆基因组DNA；
以待测外周血浆基因组DNA为模板，用NRAS Q61K的特异探针进行ddPCR扩增；
根据ddPCR对目的基因位点突变情况的检测结果，分析患者对维罗非尼的耐药情况；
根据患者出现NRAS Q61K突变阳性或阴性，确定患者对维罗非尼是否产生耐药。
在本发明的一个优选实施例中，利用ddPCR技术通过检测外周血浆中基因突变以监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法包括如下步骤：
(1)提取黑色素瘤患者外周血浆基因组DNA。
(2)实验所用引物为包含NRAS Q61K突变位点的特异引物，所用探针包括一条突变型特异探针和野生型特异探针。突变型探针类型为FAM探针，野生型探针类型为HEX探针。
(3)进行ddPCR反应。
a.20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织DNA 50～100ng，2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，NRAS Q61K引物，突变型探针和野生型探针共2μl，无菌蒸馏水补足至20μl；
b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器(Bio-RadLaboratories，USA)生成纳升级别的油包水的液滴；
c.PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存；
d.PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories，USA)对所有样品孔进行荧光检测。
(4)结果分析
检测结果NRAS Q61K突变阴性，则患者对维罗非尼敏感；NRAS Q61K突变阳性，则患者对维罗非尼耐药。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
(1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度(0.001％)(即可以从10万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，仅需使用100ng的DNA模板即可完成检测。
(2)本发明的检测方法仅需使用检测对象的外周血浆游离DNA即可完成检测，无需采集肿瘤组织进行检测，操作简便，无创，可重复进行。
(3)使用本发明方法，可以准确地检测出由于肿瘤组织异质性导致的NRAS突变假阴性，仅需使用外周血样本即可完成检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
各实施例中，所使用的引物对序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，突变型探针为FAM探针，序列如SEQ ID NO:3中所示，所述的野生型探针为HEX探针，序列如SEQ ID NO:4中所示。
实施例1 利用ddPCR技术通过检测外周血浆中基因突变以监控黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法
(1)某黑色素瘤患者开始进行维罗非尼治疗开始前，采集其外周血，分离血浆并提取基因组DNA。
血浆分离方法如下：
将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆。
提取DNA的过程如下：
a、裂解
加入Proteinase K，使其终浓度为2mg/1ml血浆，在60℃的条件下裂解去除蛋白质从而将游离DNA释放出来。与此同时，加入ACL(carrier RNA)试剂，使DNase和RNase失活，并使得游离核酸完全从结合的蛋白上释放出来。
b、过柱纯化
在裂解好的血浆中加入的ACB溶液(QIAGEN)，使其终浓度为1.8ml/1ml血浆，冰浴5min后，用硅胶柱进行过柱纯化。
c、洗脱
过柱之后，加入相应的洗脱液对柱子进行洗涤，最后加入无水乙醇沉淀DNA分子。
d、溶解
在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE进行溶解，室温放置一段时间后,进行离心处理，得到纯化的基因组DNA。
e、对提取得到的血浆游离DNA进行质检，首先用Nanodrop检测其浓度，正常情况下2ml血浆可抽提出30～50ng/ul的血浆游离DNA。之后通过Agilentbioanalysis 2100检测其片段大小，以确定其为血浆游离DNA(<300bp)。图3为Agilent bioanalysis 2100质检图，横坐标为Marker大小(其中35bp和≈10000bp峰为外加标记物)，纵坐标为峰值强度，抽提得到的血浆游离DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。
(2)进行PCR扩增。
a.20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织DNA 50～100ng，2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，NRAS Q61K引物，突变型探针和野生型探针共2μl，无菌蒸馏水补足至20μl；
b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器(Bio-RadLaboratories，USA)生成纳升级别的油包水的液滴；
c.PCR反应条件为：95℃变性10分钟；随后94℃变性30秒，60℃退火60秒，进行40个循环；最后98℃延伸10分钟，4℃保存；
d.PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories，USA)对所有样品孔进行荧光检测。
(3)经检测，该黑色素瘤患者外周血浆游离DNA中NRAS Q61K突变阴性，患者对维罗非尼敏感，尚未出现耐药。
(4)该黑色素瘤患者开始进行维罗非尼治疗6个月后，采集其外周血，分离血浆并提取基因组DNA。
(5)进行PCR扩增。同(2)。
(6)经检测，该黑色素瘤患者外周血浆游离DNA中NRAS Q61K突变阴性，患者对维罗非尼敏感，尚未出现耐药。
(7)该黑色素瘤患者开始进行维罗非尼治疗12个月后，采集其外周血，分离血浆并提取基因组DNA。
(8)进行PCR扩增。同(2)。
(9)经检测，该黑色素瘤患者外周血浆游离DNA中NRAS Q61K突变阳性，患者已出现维罗非尼耐药。产生耐药的时间是在开始维罗非尼治疗第6个月到12个月之间。
检测结果微滴荧光信号分布区结果如图1所示，图中蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中上图为治疗前的检测结果，显示NRAS Q61K突变阴性，下图为用药6个月后的检测结果，显示NRAS Q61K突变阳性。
结果显示，该患者在治疗前无耐药现象，经过6个月的维罗非尼治疗，产生了NRAS Q61K突变，发生了继发耐药。
ddPCR检测微滴数目结果如图2所示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A为治疗前的检测结果，显示了NRAS Q61K突变阴性的检测结果，图2B为用药6个月后的检测结果，显示了NRAS Q61K突变阳性的检测结果。
结果显示，该患者在治疗前无耐药现象，经过6个月的维罗非尼治疗，产生了NRAS Q61K突变，发生了继发耐药。
实施例2 利用ddPCR技术检测外周血浆中特异性基因突变以判断肿瘤异质性黑色素瘤患者对维罗非尼耐药的方法
(1)某黑色素瘤使用维罗非尼进行2个疗程的治疗后发生近端转移，手术后取得患者原发灶和转移灶的组织各1例，并采集其外周血，分别对获得的组织和外周血进行基因组DNA和游离DNA的抽提，抽提方法与实施例1一致。
(2)对肿瘤组织进行PCR扩增和一代测序。
(3)经检测，该黑色素瘤患者原发灶组织DNA中NRAS Q61K突变阳性，但转移灶组织DNA中NRAS Q61K突变阴性。这说明，即使是癌组织本身，亦不能准确地检测出NRAS Q61K突变。
(4)对外周血浆抽提的基因组DNA进行PCR扩增
a.20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织DNA/血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，NRAS Q61K引物，突变型探针和野生型探针共2μl，无菌蒸馏水补足至20μl；
b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器(Bio-RadLaboratories，USA)生成纳升级别的油包水的液滴；
c.PCR反应条件为：95℃变性10分钟；随后94℃变性30秒，60℃退火60秒，进行40个循环；最后98℃延伸10分钟，4℃保存；
d.PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories，USA)对所有样品孔进行荧光检测。
(5)该黑色素瘤患者外周血浆游离DNA中NRAS Q61K突变阳性，可以判断患者对维罗非尼已出现耐药。
表1 同一患者不同来源样本的NRAS Q61K突变检测结果
| 样本类型 | 原发灶 | 转移灶 | 外周血浆 |
| 检测结果 | 阳性 | 阴性 | 阳性 |
结果表明，本发明的方法可以用外周血浆样本准确地检测出患者的NRASQ61K突变，从而判断出患者是否已经对维罗菲尼耐药。本发明的方法用外周血样本即可准确检测到该耐药突变，而这一突变甚至在癌组织的某些部位中也无法检测得到。这说明本发明方法有非常好的应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种对NRAS基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和
(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出NRAS基因耐药突变位点的突变形式和/或比例。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于黑色素瘤患者。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：
(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；
(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；
(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；
(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
5.一种NRAS基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；
(b)RNA carrier；
(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法，
其中，所述的突变位点包括NRAS Q61K。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。
7.一种NRAS基因耐药突变位点Q61K检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对，并且引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所示；
(b)RNA carrier；
(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法；
(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示。
8.一种如权利要求5或7所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对维罗菲尼的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用维罗菲尼进行治疗的试剂盒。
9.一种肿瘤患者维罗菲尼耐药性的检测方法，其特征在于，包括步骤：用如权利要求1-4任一所述的方法进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测；和
若检测结果为阳性，则判定患者对维罗菲尼耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对维罗菲尼敏感。
10.一种肿瘤患者治疗方法，其特征在于，包括步骤：
(a)用如权利要求1所述的方法，对所述对象进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测，并对检测结果为阴性的对象，采用维罗菲尼进行治疗；
(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如权利要求1所述的方法，对所述对象再次进行NRAS基因耐药突变位点Q61K检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用维罗菲尼进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用维罗菲尼进行治疗。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111206101A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-05-29 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | circRRM2B基因作为新靶点在筛选维罗非尼耐药的黑色素瘤治疗药物中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911427A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-09 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种基于数字pcr平台检测基因点突变的方法和试剂盒 |
| CN103923974A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-16 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法 |
-
2015
- 2015-01-13 CN CN201510017298.1A patent/CN105838780A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911427A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-09 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种基于数字pcr平台检测基因点突变的方法和试剂盒 |
| CN103923974A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-16 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| （美）珀西恩等著: "《分子微生物学：诊断原理与实践》", 31 August 2008, 中山大学出版社 * |
| FRED M. KAPLAN等: "SHOC2 and CRAF Mediate ERK1/2 Reactivation in Mutant", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| KERSTIN TRUNZER等: "Pharmacodynamic Effects and Mechanisms of Resistance to", 《JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY》 * |
| MULLIGAN G等: ""Homo sapiens neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog (NRAS),mRNA"", 《GENBANK DATABASE》 * |
| 贡成良，曲春香: "《生物化学与分子生物学实验指导》", 30 June 2010, 苏州大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111206101A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-05-29 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | circRRM2B基因作为新靶点在筛选维罗非尼耐药的黑色素瘤治疗药物中的应用 |
| CN111206101B (zh) * | 2020-03-12 | 2023-01-17 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | circRRM2B基因作为新靶点在筛选维罗非尼耐药的黑色素瘤治疗药物中的应用 |
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