JP2002348254A - 神経系腫瘍治療剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Hu蛋白質、Hu蛋白質のアミノ酸配列に１
又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入さ
れたアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はこれらの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を有効成分とする神経
系腫瘍治療剤。 【効果】 神経芽細胞腫の新たな治療法が提供できた。
又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入さ
れたアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はこれらの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を有効成分とする神経
系腫瘍治療剤。 【効果】 神経芽細胞腫の新たな治療法が提供できた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は神経芽細胞腫等の神
経系腫瘍の治療剤に関する。
経系腫瘍の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】神経芽
細胞腫（ニューロブラストーマ）は、通常３歳までに発
症し、多くの場合不幸な転帰をとる神経節神経細胞の小
児悪性腫瘍である。神経芽細胞腫は小児の固形腫瘍では
最も発生頻度が高く、自然治癒する症例は多いが、N-my
cの増幅を伴い悪性例も少なくない。患者が小児である
こともあって、有効な治療薬がなく、新規な治療法の開
発が望まれている。
細胞腫（ニューロブラストーマ）は、通常３歳までに発
症し、多くの場合不幸な転帰をとる神経節神経細胞の小
児悪性腫瘍である。神経芽細胞腫は小児の固形腫瘍では
最も発生頻度が高く、自然治癒する症例は多いが、N-my
cの増幅を伴い悪性例も少なくない。患者が小児である
こともあって、有効な治療薬がなく、新規な治療法の開
発が望まれている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は分化した神経
細胞に特異的な発現を示すRNA結合蛋白質であるHu蛋白
質に着目し、神経芽細胞腫であるSH-SY系細胞に、Hu蛋
白質遺伝子を導入してHu蛋白質を過剰発現させたとこ
ろ、アポトーシスを誘導し、顕著に細胞増殖を停止させ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
細胞に特異的な発現を示すRNA結合蛋白質であるHu蛋白
質に着目し、神経芽細胞腫であるSH-SY系細胞に、Hu蛋
白質遺伝子を導入してHu蛋白質を過剰発現させたとこ
ろ、アポトーシスを誘導し、顕著に細胞増殖を停止させ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】すなわち、本発明は、Hu蛋白質、Hu蛋白質
のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、
付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、又はこれらのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
有効成分とする神経系腫瘍治療剤を提供するものであ
る。
のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、
付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、又はこれらのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
有効成分とする神経系腫瘍治療剤を提供するものであ
る。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の医薬の有効成分であるHu
蛋白質は、肺小細胞癌に伴うニューロパチーの際に出現
する自己抗体が認識する抗原として同定された蛋白質で
ある。Hu蛋白質は分化した神経細胞に特異的な発現を示
すRNA結合蛋白質であり、標的mRNAの3'UTR側に存在する
AU-rich element(ARE)に結合することにより、標的遺伝
子産物の発現を、転写後レベルで調節する機能があるこ
とが知られているが、神経芽腫に対する作用については
全く知られていない。
蛋白質は、肺小細胞癌に伴うニューロパチーの際に出現
する自己抗体が認識する抗原として同定された蛋白質で
ある。Hu蛋白質は分化した神経細胞に特異的な発現を示
すRNA結合蛋白質であり、標的mRNAの3'UTR側に存在する
AU-rich element(ARE)に結合することにより、標的遺伝
子産物の発現を、転写後レベルで調節する機能があるこ
とが知られているが、神経芽腫に対する作用については
全く知られていない。
【０００６】Hu蛋白質は、それが存在する細胞から分離
することもできるが、Hu蛋白質をコードする遺伝子がす
でにクローニングされているので、DNA組み換え技術、
すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを
利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
することもできるが、Hu蛋白質をコードする遺伝子がす
でにクローニングされているので、DNA組み換え技術、
すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを
利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
【０００７】またHu蛋白質は、分化した神経細胞で発現
している蛋白質そのものでもよいが、同様の性質を有す
る限り、その一部のアミノ酸配列が改変されたものでも
よい。例えばHu蛋白質のアミノ酸配列の１又は複数個が
置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有
するポリペプチドも使用し得る。これらの置換、欠失、
付加もしくは挿入の程度及びそれらの位置は、改変され
たアミノ酸配列がHu蛋白質と同様の性質を有するもので
あれば特に制限されない。これらの改変ポリペプチドも
また、Hu蛋白質同様にDNA組み換え技術により調製でき
る。
している蛋白質そのものでもよいが、同様の性質を有す
る限り、その一部のアミノ酸配列が改変されたものでも
よい。例えばHu蛋白質のアミノ酸配列の１又は複数個が
置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有
するポリペプチドも使用し得る。これらの置換、欠失、
付加もしくは挿入の程度及びそれらの位置は、改変され
たアミノ酸配列がHu蛋白質と同様の性質を有するもので
あれば特に制限されない。これらの改変ポリペプチドも
また、Hu蛋白質同様にDNA組み換え技術により調製でき
る。
【０００８】また、本発明においては、Hu蛋白質又は上
記改変ポリペプチドをコードする遺伝子を投与し、体内
で当該蛋白質又は改変ポリペプチドを生成させる遺伝子
治療を採用してもよい。これらの遺伝子も既知にクロー
ニングされているのでそれを利用するのが好ましい。
記改変ポリペプチドをコードする遺伝子を投与し、体内
で当該蛋白質又は改変ポリペプチドを生成させる遺伝子
治療を採用してもよい。これらの遺伝子も既知にクロー
ニングされているのでそれを利用するのが好ましい。
【０００９】後記実施例に示すように、神経芽細胞腫由
来のSH-SY系細胞に、Hu蛋白質遺伝子を導入しHu蛋白質
を過剰発現させると、当該SH-SY系細胞はアポトーシス
をおこす。また同様にHu蛋白質を過剰発現したSH-SY系
細胞は、細胞増殖を停止する。従って、Hu蛋白質又はHu
蛋白質遺伝子は、神経芽細胞腫等の神経系腫瘍治療剤と
して有用である。
来のSH-SY系細胞に、Hu蛋白質遺伝子を導入しHu蛋白質
を過剰発現させると、当該SH-SY系細胞はアポトーシス
をおこす。また同様にHu蛋白質を過剰発現したSH-SY系
細胞は、細胞増殖を停止する。従って、Hu蛋白質又はHu
蛋白質遺伝子は、神経芽細胞腫等の神経系腫瘍治療剤と
して有用である。
【００１０】また、SH-SY系細胞におけるHu蛋白質によ
る細胞増殖抑制効果にはp27の発現上昇が、アポトーシ
ス誘導効果にはBcl-2の発現抑制が関与していると考え
られる。さらにまた、Hu蛋白質遺伝子がbcl-2 mRNAの3'
UTR部分に存在するAU-richelementに結合することによ
り、mRNAの安定性を低下させ、Bcl-2の発現を低下させ
たと考えられる。そして、アポトーシス抑制機能のある
Bcl-2の発現低下が、SH-SY系細胞のアポトーシス刺激に
対する感受性を亢進させ、アポトーシスが亢進されたと
考えられる。
る細胞増殖抑制効果にはp27の発現上昇が、アポトーシ
ス誘導効果にはBcl-2の発現抑制が関与していると考え
られる。さらにまた、Hu蛋白質遺伝子がbcl-2 mRNAの3'
UTR部分に存在するAU-richelementに結合することによ
り、mRNAの安定性を低下させ、Bcl-2の発現を低下させ
たと考えられる。そして、アポトーシス抑制機能のある
Bcl-2の発現低下が、SH-SY系細胞のアポトーシス刺激に
対する感受性を亢進させ、アポトーシスが亢進されたと
考えられる。
【００１１】本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与す
るには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加え
て、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。
かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬
学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、
安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これ
らの医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化す
るが、Hu蛋白質量又はHu蛋白質遺伝子量として０．１μ
g〜１０mg／日程度であろう。
るには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加え
て、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。
かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬
学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、
安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これ
らの医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化す
るが、Hu蛋白質量又はHu蛋白質遺伝子量として０．１μ
g〜１０mg／日程度であろう。
【００１２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
が、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００１３】実施例１ SH-SY5Y細胞に、マウス由来のHuB蛋白質をコードする遺
伝子のN末端側にFLAG-tagを付加したものを哺乳類細胞
で強制発現させるためのベクターpCXN2に組み込んだプ
ラスミド(Akamatsu et al. PNAS 1999)を、Lipofectami
ne Plus(BRL)を用いて導入した。Poly-L-lysineでコー
トしたカバーグラスを入れた12well dish中で培養を行
った。導入48時間後にHuBを導入した細胞をFLAG-tagに
対する抗体で免疫染色を行い同定したところ、ヘキスト
染色で核濃縮を示す細胞が、HuBが導入された細胞に多
数存在した（図1a-c）。HuBを導入した細胞の一部は、
神経突起を進展し、神経細胞様の形態をしていたが、ho
echst染色で核濃縮が確認されるものも存在した(図1d〜
f)。TUNEL法により、導入細胞のTUNEL陽性率を算出し
た。HuBを導入した細胞ではコントロール（GFP-Myc）に
比べ約４倍の細胞がTUNEL陽性であり、アポトーシスが
亢進していた（図2）。G418を添加し、導入細胞を選択
し７日間観察を行ったが、神経突起を更に進展し分化し
た細胞や、増殖し続けコロニーを形成する細胞は確認で
きなかった。
伝子のN末端側にFLAG-tagを付加したものを哺乳類細胞
で強制発現させるためのベクターpCXN2に組み込んだプ
ラスミド(Akamatsu et al. PNAS 1999)を、Lipofectami
ne Plus(BRL)を用いて導入した。Poly-L-lysineでコー
トしたカバーグラスを入れた12well dish中で培養を行
った。導入48時間後にHuBを導入した細胞をFLAG-tagに
対する抗体で免疫染色を行い同定したところ、ヘキスト
染色で核濃縮を示す細胞が、HuBが導入された細胞に多
数存在した（図1a-c）。HuBを導入した細胞の一部は、
神経突起を進展し、神経細胞様の形態をしていたが、ho
echst染色で核濃縮が確認されるものも存在した(図1d〜
f)。TUNEL法により、導入細胞のTUNEL陽性率を算出し
た。HuBを導入した細胞ではコントロール（GFP-Myc）に
比べ約４倍の細胞がTUNEL陽性であり、アポトーシスが
亢進していた（図2）。G418を添加し、導入細胞を選択
し７日間観察を行ったが、神経突起を更に進展し分化し
た細胞や、増殖し続けコロニーを形成する細胞は確認で
きなかった。
【００１４】実施例２ HuBを導入したSH-SY5Y細胞を導入36時間後から12時間、
ブロモデオキシウリジン(BrdU)を培地に添加し、S期の
細胞をラベルした。導入48時間後に、抗BrdU抗体と抗FL
AGまたはMyc抗体を用いて免疫染色を行い（図3a,b）、
導入細胞におけるBrdUの陽性率を算出した（図4）。そ
の結果、HuBを導入したSH-SY5Y細胞は、コントロールに
比べ、約50％のBrdUの取り込み減少を認めた。すなわ
ち、HuBの過剰発現が、SH-SY5Y細胞の細胞増殖を停止さ
せた。
ブロモデオキシウリジン(BrdU)を培地に添加し、S期の
細胞をラベルした。導入48時間後に、抗BrdU抗体と抗FL
AGまたはMyc抗体を用いて免疫染色を行い（図3a,b）、
導入細胞におけるBrdUの陽性率を算出した（図4）。そ
の結果、HuBを導入したSH-SY5Y細胞は、コントロールに
比べ、約50％のBrdUの取り込み減少を認めた。すなわ
ち、HuBの過剰発現が、SH-SY5Y細胞の細胞増殖を停止さ
せた。
【００１５】実施例３ Bcl-2は、SH-SY5Y細胞の分化に伴い上昇することが知ら
れている分化マーカーである。HuBを導入したSH-SY5Y細
胞を導入24時間後に、Bcl-2の抗体で免疫染色を行っ
た。結果を図5a及びbに示す。HuB導入細胞（FLAG陽性細
胞）では、白矢印で示したBcl-2の発現が減少してい
た。点線は個々の細胞の外周を示す。次に、HuB,HuC,コ
ントロール(GFP-Myc)を導入したSH-SY5Y細胞を、Bcl-2
と、Hu蛋白質が結合することが報告されているp27の抗
体でイムノブロットを行った(図6)。NIH-imageを用いて
定量した結果、HuCを導入した細胞では、p27,Bcl-2とも
ほとんど変化がなかったが、HuBを導入した細胞ではp27
は約40%増加、Bcl-2は35%の減少を示していた。定量の
コントロールにはチューブリンに対する抗体を用いた。
HuBの細胞増殖抑制効果は、p27の発現上昇、細胞死誘導
効果はBcl-2の発現抑制が関与していることが示唆され
た。
れている分化マーカーである。HuBを導入したSH-SY5Y細
胞を導入24時間後に、Bcl-2の抗体で免疫染色を行っ
た。結果を図5a及びbに示す。HuB導入細胞（FLAG陽性細
胞）では、白矢印で示したBcl-2の発現が減少してい
た。点線は個々の細胞の外周を示す。次に、HuB,HuC,コ
ントロール(GFP-Myc)を導入したSH-SY5Y細胞を、Bcl-2
と、Hu蛋白質が結合することが報告されているp27の抗
体でイムノブロットを行った(図6)。NIH-imageを用いて
定量した結果、HuCを導入した細胞では、p27,Bcl-2とも
ほとんど変化がなかったが、HuBを導入した細胞ではp27
は約40%増加、Bcl-2は35%の減少を示していた。定量の
コントロールにはチューブリンに対する抗体を用いた。
HuBの細胞増殖抑制効果は、p27の発現上昇、細胞死誘導
効果はBcl-2の発現抑制が関与していることが示唆され
た。
【００１６】実施例４ ヒトbcl-2遺伝子は、全長5.5kbにも及ぶ長いUTR部分を
持ち、その中にAU-richelement(ARE)が存在する。961-1
020bpの間のAREの存在が、bcl-2 mRNAの安定性を低下さ
せることが報告されている（Schiavone et al. FASEB J
2000 Jan;14(1):174-84）。図7のようにAREを含む部分
（UTR-1,UTR-2）、含まない部分(UTR-3)、それぞれ300-
400bpをサブクローニングした。
持ち、その中にAU-richelement(ARE)が存在する。961-1
020bpの間のAREの存在が、bcl-2 mRNAの安定性を低下さ
せることが報告されている（Schiavone et al. FASEB J
2000 Jan;14(1):174-84）。図7のようにAREを含む部分
（UTR-1,UTR-2）、含まない部分(UTR-3)、それぞれ300-
400bpをサブクローニングした。
【００１７】実施例５ RRM2中のRNP1の中のバリン、フェニルアラニン、フェニ
ルアラニンをアスパラギン酸に置換した変異体を作製し
た（図8）。この形の変異体は、同じHuファミリーであ
るHuBにおいて標的RNAに対する結合能がなく、分化誘導
機能がないことが確認されている。
ルアラニンをアスパラギン酸に置換した変異体を作製し
た（図8）。この形の変異体は、同じHuファミリーであ
るHuBにおいて標的RNAに対する結合能がなく、分化誘導
機能がないことが確認されている。
【００１８】実施例６ pGEX-HuB,HuB-R2mtを大腸菌BL21で発現させ、グルタチ
オンセファロースで精製を行った。200ngの精製蛋白質
を、32P-UTPでラベルしたbcl-2 mRNA 3'UTR-1,2,3と混
和し、ストラトリンカー(Stratlinker)にて１分間のUV-
クロスリンを行った。12.5%-SDS-PAGEゲルで泳動し、BA
S-5000にて検出を行った（図9）。HuBは、UTR-1およびU
TR-2に結合を示したが、AU-リッチエレメントを含まな
いUTR-3では、結合を示さなかった。HuB-R2は、UTR1-3
のいずれにも結合を示さなかった。HuBは、AU-rich部分
を含むbcl-2のmRNAに結合し、その結合はRRM2に点変異
を導入すると失われることが明らかになった。
オンセファロースで精製を行った。200ngの精製蛋白質
を、32P-UTPでラベルしたbcl-2 mRNA 3'UTR-1,2,3と混
和し、ストラトリンカー(Stratlinker)にて１分間のUV-
クロスリンを行った。12.5%-SDS-PAGEゲルで泳動し、BA
S-5000にて検出を行った（図9）。HuBは、UTR-1およびU
TR-2に結合を示したが、AU-リッチエレメントを含まな
いUTR-3では、結合を示さなかった。HuB-R2は、UTR1-3
のいずれにも結合を示さなかった。HuBは、AU-rich部分
を含むbcl-2のmRNAに結合し、その結合はRRM2に点変異
を導入すると失われることが明らかになった。
【００１９】以上の実施例からSH-SY細胞にHu蛋白質を
過剰発現させると、アポトーシスが誘導される。同じ神
経堤由来の細胞株であるPC12細胞では、神経突起の進展
・細胞増殖の停止という表現型を示し、分化誘導を示し
たが、SH-SY細胞では分化を示さなかった。むしろ、分
化マーカーであるBcl-2の発現は減少を示した。Hu蛋白
質がbcl-2 mRNAの3'UTR部分に存在するAU-リッチエレメ
ントに結合し、mRNAの安定性を低下させ、Bcl-2の発現
を低下させたと考えられる。アポトーシス抑制機能のあ
るBcl-2の発現低下が、SH-SY細胞のアポトーシス刺激に
対する感受性を亢進させ、アポトーシスが亢進されたと
考えられる。
過剰発現させると、アポトーシスが誘導される。同じ神
経堤由来の細胞株であるPC12細胞では、神経突起の進展
・細胞増殖の停止という表現型を示し、分化誘導を示し
たが、SH-SY細胞では分化を示さなかった。むしろ、分
化マーカーであるBcl-2の発現は減少を示した。Hu蛋白
質がbcl-2 mRNAの3'UTR部分に存在するAU-リッチエレメ
ントに結合し、mRNAの安定性を低下させ、Bcl-2の発現
を低下させたと考えられる。アポトーシス抑制機能のあ
るBcl-2の発現低下が、SH-SY細胞のアポトーシス刺激に
対する感受性を亢進させ、アポトーシスが亢進されたと
考えられる。
【００２０】
【発明の効果】本発明により治療が困難であった神経芽
細胞腫の新たな治療法が提供された。
細胞腫の新たな治療法が提供された。
【図１】HuBを導入したSH-SY5Y細胞の顕微鏡写真（a及
びd）、免疫染色結果（b及びe）及びhoechst染色結果
（c及びf）を示す図である。
びd）、免疫染色結果（b及びe）及びhoechst染色結果
（c及びf）を示す図である。
【図２】HuBを導入したSH-SY5Y細胞及びコントロールの
TUNEL陽性率（％）〔TUNEL陽性細胞／FLAG（又はMyc）
陽性細胞〕を示す図である。
TUNEL陽性率（％）〔TUNEL陽性細胞／FLAG（又はMyc）
陽性細胞〕を示す図である。
【図３】HuBを導入48時間後のSH-SY5Y細胞の抗BrdU抗体
と抗FLAG抗体又は抗Myc抗体を用いた免疫染色結果を示
す図である（aはBrdU抗体による染色、bはFLAG抗体によ
る染色）。
と抗FLAG抗体又は抗Myc抗体を用いた免疫染色結果を示
す図である（aはBrdU抗体による染色、bはFLAG抗体によ
る染色）。
【図４】HuB導入細胞とGFP（コントロール）とのBrdU陽
性率を示す図である。
性率を示す図である。
【図５】HuB導入SH-SY5Y細胞のBcl-2抗体の免疫染色結
果を示す（aはBcl-2抗体による染色、bはFLAG抗体によ
る染色）。
果を示す（aはBcl-2抗体による染色、bはFLAG抗体によ
る染色）。
【図６】p27抗体によるイムノブロットの結果を示す図
である。
である。
【図７】ヒトbcl-2遺伝子のUTR-1、UTR-2、UTR-3のサブ
クローニングストラテジーを示す。
クローニングストラテジーを示す。
【図８】RRM2中の点変異のストラテジーを示す。
【図９】bcl-2 mRNA3'UTR-1、2、3とHuBとの結合性を示
す図である。
す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 Hu蛋白質、Hu蛋白質のアミノ酸配列に１
又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入さ
れたアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はこれらの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を有効成分とする神経
系腫瘍治療剤。 - 【請求項２】 神経系腫瘍が、神経芽細胞腫である請求
項１記載の神経系腫瘍治療剤。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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