JP2008518207A - Ｅｐｈ受容体腫瘍バイオマーカー - Google Patents

Ｅｐｈ受容体腫瘍バイオマーカー Download PDF

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Abstract

正常脳と比較したＧＢＭ細胞およびヒトＧＢＭ腫瘍の双方におけるＥｐｈＡ２の特異的差次的発現が示される。ＥｐｈＡ２は、診断および予後などのかかる分野での癌の有用な分子マーカーとして有用である。さらに、ＥｐｈＡ２は、分子標的薬物送達などの腫瘍に関する新規治療法の開発で用いられる。

Description

本発明は、癌の診断および予後にとって重要な、バイオマーカーの信頼できる検出および同定を提供する。腫瘍細胞を有する患者のタンパク質／ペプチドプロファイルは、費用のかからない技術を用いて正常個体と区別される。これらの技術は、簡単であるが感度の高い、体液を用いる癌の診断法を提供する。
Ｅｐｈ受容体はチロシンキナーゼ受容体の最も大きなファミリーを備えており、これは例えば、増殖、遊走および分化を制御するものとして、細胞の重要なシグナル伝達経路の仲介において不可欠な膜貫通タンパク質の一群である。Ｅｐｈ受容体の１４種類のメンバーは、それらの細胞外ドメインの類似性と、それらの膜結合リガンドであるエフリンとの相互作用能力とに基づいて、ＡクラスおよびＢクラスに分類されている。これらの内因性リガンドが隣接する細胞の表面に係留されるという事実は、それらを受容体チロシンキナーゼの中で特有のものとし、一般に、表皮増殖因子（ＥＧＦ）および血管性内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの可溶性因子と結合する。
Ｅｐｈ受容体の大部分は、細胞間の接触依存型過程の仲介により神経成長中の軸索誘導で重要な役割を果たす。
（特に初期の）腫瘍の診断は診断が困難であり、ほとんどの場合、治療が困難である。問題としては、以下が挙げられる：（１）患者は通常、死亡前の６カ月〜１年に診断される。したがって、治療が開始される時期までに重度の腫瘤がすでに定着している。（２）癌細胞は正常組織に侵襲し、制限関門は設定されておらず、したがって、外科手術による残存腫瘍細胞除去は不完全なものとなる。（３）脳は血液脳関門によって外的環境から保護されている。この関門は脳の領域に影響を及ぼすが、さらに保護されている領域があり、その結果、化学療法の利用可能性が制限される。標準的化学療法の効力は、脳毛細管の毛細管内皮中の多剤耐性−１（ＭＤＲ）遺伝子によりコードされているＰ−糖タンパク質の発現によってさらに低下する。（４）多数の原発腫瘍が脳に転移して多重病変をもたらし、治療をさらに複雑なものとする。（５）脳腫瘍に関する基礎知識は他の種類の癌と比べると極めて少ない。このため、分子標的を限定し、また疾患の経過を予測することが困難となる。標準的治療は、外科的切除および術後放射線照射である。腫瘍位置によっては腫瘍の完全除去が出来ない場合があり、一部のグリオーマは完全に手術が不可能である。
したがって、当技術分野では、初期段階における腫瘍増殖の診断、および周囲の正常組織に影響を及ぼさず癌細胞を標的とする治療分子の同定が切望されている。
本発明は、対照被験体の試料と比較した場合に、癌罹患患者および／または癌関連疾患の試料中に差異的に存在する腫瘍バイオマーカーを提供する。また本発明は、これらのマーカーを検出することにより癌および／または癌関連疾患の診断の補助として使用可能な、高感度で迅速な方法およびキットを提供する。患者の試料において、単独で、または組み合わせてこれらのマーカーを測定することにより、診断医が癌の程度に関する推定診断（例えば、正常または癌に罹患していないなど）と相関させることができる情報を提供する。マーカーは、分子量によって特性決定されることができる。本マーカーは、種々の分画技術（例えば、質量分析と組み合わせたクロマトグラフィー分離）を用いることによって、または従来のイムノアッセイによって、試料中の他のタンパク質から分離可能である。好ましい実施形態では、分離方法には表面増強レーザー脱離イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）質量分析が含まれるが、その分析では、質量分析プローブの表面は本マーカーと結合する吸着剤を含んでいる。
好ましい実施形態では、癌の診断をさらに補助するため、様々な組成物が提供される。好ましいバイオマーカー組成物は、Ｅｐｈ受容体およびエフリン分子である。具体的なＥＰＨ受容体としては、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体が挙げられる。エフリン分子としては、これらに限定されるものではないが、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２およびエフリン−Ｂ３が挙げられる。Ｅｐｈ受容体バイオマーカーとしては、本受容体タンパク質の膜形態、およびそれらの特異的リガンドに結合する能力を保持する可溶性細胞外断片が挙げられる。組成物中の各マーカーは、精製されていることが好ましい。
別の好ましい実施形態では、本発明は、エフリンＡ１ポリペプチド、好ましくはエフリンＡ１ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換え型エフリンＡ１ポリペプチドを特徴とする。エフリンＡ１はＥｐｈＡ２に対する天然リガンドであり、治療送達用ベクターおよび治療薬発見候補としての役割を果たすことができる。好ましい実施形態では、本ポリペプチドは、そのＥｐｈＡ２受容体への結合に関係している生物活性を有しているが、それはＥｐｈＡ２受容体によるシグナル伝達をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることができる。ポリ本ペプチドは哺乳動物エフリンＡ１ポリペプチドと同一でもよく、あるいは、その配列に単に相同でもよい。例えば、本ポリペプチドは、好ましくはエフリンＡ１に少なくとも７０％の相同性のあるアミノ酸配列を有しているが、例えば、８０％、８５％、９０％または９５％の高い相同性の配列もまた考えられる。本ポリペプチドは、完全長エフリンＡ１タンパク質を含んでいてもよいか、そのタンパク質の断片からなっていてもよく、その断片は、例えば、少なくとも５、１０、２０、５０または１００個のアミノ酸長でもよい。本ポリペプチドはグリコシル化可能であり、あるいは、それを生産する発現系によって、またはグリコシル化を妨げるタンパク質配列の改変によって、低炭水化物類似体を提供することができる。同様に、内因性シグナル配列を欠失している（たとえ、これは本タンパク質のプロ体に存在している場合であっても一般に切断される）か、あるいは、ホスファチジルイノシトールの添加を妨げるようにホスファチジルイノシトール結合部位を欠失しているエフリンＡ１ポリペプチドも生成することができる。また、少なくとも最後の１５個のアミノ酸残基を欠失しているポリペプチド、およびいずれかの位置で切断されているポリペプチドも検討される。
さらに、本ポリペプチドはアゴニスト（例えば、模倣体）でもよいし、あるいは、本タンパク質の天然形態の生物活性のアンタゴニストでもよく、例えば、本ポリペプチドは、ＥｐｈＡ２受容体を発現する細胞の増殖および／または分化をモジュレートすることができる。
別の好ましい実施形態では、エフリン分子は、候補治療用化合物の標的リガンドであって、候補治療用化合物を同定するために用いられる。好ましい実施形態では、腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法は、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種を含む受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、候補治療薬を該培養細胞へ投与する工程と、候補治療薬の存在下または不在下での該受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較して場合と相関させる工程と、それにより、エフリン分子に結合する候補治療薬を同定する工程と、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える。好ましくは、候補治療薬が正常細胞および癌細胞に投与され、エフリン分子への結合についてアッセイされる。適当な対照が用いられ、例えば、候補治療薬のエフリン分子への結合が、前記治療薬の正常細胞および癌細胞への結合と比較される。エフリン分子に結合することにより有しているこれらの候補治療薬の作用は、Ｅｐｈ分子の発現および活性化と比較されるが、この場合、Ｅｐｈ分子の活性化は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較した場合のチロシン分子のリン酸化によって測定される。Ｅｐｈの発現は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較されることが好ましい。
好ましい実施形態では、エフリンＡ１ポリペプチドの少なくとも一種の生物活性を有するペプチドは、アミノ酸配列で相違してもよいが、しかし、かかる相違は、天然エフリンＡ１タンパク質と同様または類似の方法で機能するか、天然エフリンＡ１タンパク質と同様または類似の特性を有している改変タンパク質をもたらすものである。しかし、天然タンパク質の正常な生理学的役割にアンタゴニスト的な天然タンパク質の相同体も考えられる。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本願に記載されたポリペプチド組成物の変異体を提供する。本発明により一般に包含されるポリペプチド変異体は、典型的には、本願に記載されたポリペプチド配列に対して、その長さに（下記のようにして決定された）少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を示す。
他の好ましい実施形態では、比較のタンパク質プロファイルは、癌と診断された患者からの、および公知の腫瘍性癌に罹患していない患者からのマイクロアレイを用いて作製される。バイオマーカーのサブセットは、管理下の分析法から得られた共同研究的結果に基づいて選択される。分析法の例としては、例えば、Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ４．０（ＢＰＳ）（カリフォルニア州サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）所在）で実施されている、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ（ＣＡＲＴ）、およびＰｒｏＰｅａｋ（サウスカロライナ州３Ｚ インフォマティクス（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）所在）で実施されている、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＵＭＳＡ）法が挙げられる。
好ましい実施形態では、これらの分析法が個別に、およびクロス比較で用いられ、癌患者と対照の非癌患者の間の区別に対して最も寄与するピークについてスクリーニングされる。これらのマーカーの絶対的特性は未だ知られていないが、かかる知識は患者試料中に存在するマーカーを測定するのには必要ではない。なぜなら、マーカーは、例えば質量によって、および親和特性によって十分に特性決定されるためである。分子量および結合特性はこれらのマーカーの特徴的な特性であるが、検出または分離の手段を限定するものではないことに留意されたい。さらに、本マーカーの絶対的特性を、本願に記載された方法または当技術分野で周知の他の方法を用いて決定することができる。
癌を検出および診断するための好ましい方法は、被験体試料中の少なくとも一種または複数のタンパク質バイオマーカーを検出する工程と、一種または複数のタンパク質バイオマーカーの検出を癌の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの検出を考慮に入れる工程とを備える。
他の好ましい実施形態では、複数のバイオマーカーが検出され、好ましくは、少なくとも２種のバイオマーカーが検出され、さらに好ましくは、少なくとも３種のバイオマーカーが検出され、最も好ましくは、少なくとも４種のバイオマーカーが検出される。
一態様では、各バイオマーカーの量が被験体試料中で測定され、マーカー間の量の比が決定される。また好ましくは、癌病期を判断するために、被験体試料中の各バイオマーカーの量、およびバイオマーカーと公知の癌マーカーの間の量の比が決定される。
別の態様では、好ましくは、単一バイオマーカーが癌診断用の一種または複数の公知の癌バイオマーカーと組み合わされて用いられ、さらに好ましくは、複数のマーカーが癌診断用の一種または複数の公知の癌マーカーと組み合わされて用いられる。好ましい癌マーカーは、癌診断用の癌マーカー、例えばＥｐｈである。一種または複数のタンパク質バイオマーカーは、癌に罹患しやすい患者または癌罹患患者から得たタンパク質プロファイルを正常被験体と比較するのに用いられることが好ましい。
好ましい検出法には、バイオチップアレイの使用が含まれる。本発明で有用なバイオチップアレイには、タンパク質アレイおよび核酸アレイが含まれる。一種または複数のマーカーがバイオチップアレイ上に固定化され、レーザーイオン化に供されてマーカーの分子量が検出される。マーカーは、例えば、全イオン流に対して標準化されている閾値強度に対する一種または複数のマーカーの分子量により分析される。好ましくは、検出されたマーカーの数値を限定するためピーク強度範囲の低減に対数変換が用いられる。
別の好ましい方法では、前記バイオチップアレイをレーザーイオン化に供し、質量／変化率に関するシグナル強度を検出する工程と、データをコンピュータによる読取り可能な形態に変換する工程と、癌患者に存在するマーカーを表し、かつ対照の癌でない被験体に存在していないシグナルの検出に関して、ユーザインプットパラメーターに従ってデータを分類するアルゴリズムを実施する工程とによって、データがバイオチップアレイ上の固定化被験体試料で作成される。
好ましくは、バイオチップ表面は、例えばイオン性、アニオン性であり、固定化ニッケルイオンからなり、陽イオンおよび陰イオンの混合物からなり、一種または複数の抗体、１本鎖または２本鎖核酸を備え、タンパク質、そのペプチドまたは断片、アミノ酸プローブからなり、ファージ提示ライブラリーを備える。
他の好ましい方法では、一種または複数のマーカーは、そこに付着している吸着剤を含む質量分析計による使用に適したプローブを準備する工程と、被験体試料を吸着剤と接触させる工程と、一種または複数のマーカーをプローブから脱離させてイオン化する工程と、脱イオン化／イオン化マーカーを質量分析計で検出する工程とを備えるレーザー脱離／イオン化質量分析を用いて検出される。
好ましくは、レーザー脱離／イオン化質量分析は、そこに付着している吸着剤を含む基材を準備する工程と、被験体試料を吸着剤と接触させる工程と、そこに付着している吸着剤を含む質量分析計による使用に適したプローブを基材上に置く工程と、一種または複数のマーカーをプローブから脱離させてイオン化する工程と、脱離／イオン化した一種または複数のマーカーを質量分析計で検出する工程とを備える。
吸着剤は、例えば疎水性、親水性、イオン性、または金属性のキレート吸着剤、例えばニッケル、または抗体、一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、そのペプチドまたは断片でもよい。
別の実施形態では、バイオマーカーの精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィーにより一種または複数のタンパク質バイオマーカーを含む試料を分画し、一種または複数のバイオマーカーを含む分画を回収する工程、および／あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより一種または複数のバイオマーカーからなる試料を分画し、一種または複数のバイオマーカーを含む分画を回収する工程を備える。分画は、順相および固定化ニッケルアレイにおける純度についてモニターされる。アレイ上の固定化マーカー分画に関するデータ作成は、前記アレイをレーザーイオン化に供し、質量／変化率のシグナル強度を検出する工程と、データをコンピュータで読取り可能な形態に変換する工程と、癌患者に存在し、かつ対照の癌でない被験体に存在していないマーカーを表すシグナルの検出について、ユーザインプットパラメーターに従ってデータを分類するアルゴリズムを実施する工程とによって達成される。好ましくは、分画はゲル電気泳動法に供され、質量分析により作成されたデータと相関される。一態様では、有望なマーカーの代表的なゲルバンドを切り出されて酵素処理に供され、ペプチドマッピング用のバイオチップアレイに用いられる。
別の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２陽性腫瘍に罹患している被験体の治療方法は、エフリン、エフリンＡ１、そのペプチド、変異体および断片を含む治療上有効な量の医薬組成物をその治療を必要とする患者に投与する工程と、腫瘍におけるＥｐｈの発現をモジュレートする工程と、それによりＥｐｈＡ２陽性腫瘍を改善する工程とを備える。好ましくは、エフリン分子は、ＥｐｈＡ２受容体の結合、該受容体の活性化および／またはＥｐｈＡ２受容体の細胞内在化によるＥｐｈの発現をモジュレートする。
好ましい実施形態では、Ｅｐｈのモジュレーションは、治療上有効な量のエフリン分子またはＥｐｈ特異的抗体を投与することによる。好ましい範囲は、脊椎動物被験体の体重１キログラム当たり約０．１から約３００ミリグラムであり、さらに好ましくは、脊椎動物被験体の体重１キログラム当たり約０．２から約２００ミリグラムの範囲、さらに好ましくは、脊椎動物被験体の体重１キログラム当たり約０．５から約２０ミリグラムまでである。
別の好ましい実施形態では、Ｅｐｈ受容体の活性状態対不活性状態は、ＥｐｈＡ２分子のリン酸化状態を検出することにより測定される。実験の詳細は、以下の実施例部分に記載する。
別の好ましい実施形態では、エフリン分子は、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２およびエフリン−Ｂ３タンパク質、そのペプチド、変異体および断片である。
別の好ましい実施形態では、エフリンを含む医薬組成物は、化学療法剤の投与前、投与時、または投与後に患者に投与される。患者への医薬組成物および化学療法剤の投与は、静脈内投与、滑液嚢内投与、経皮投与、筋内投与、皮下投与または経口投与を含む。
別の好ましい実施形態では、本医薬組成物は、ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗体を含む。
別の好ましい実施形態では、腫瘍の悪性腫瘍または侵襲性を測定する方法は、被験体試料中の少なくとも一種または複数のＥｐｈバイオマーカーおよび／またはそのリガンドを検出する工程と、一種または複数のＥｐｈバイオマーカーおよび／またはそのリガンドの検出を悪性腫瘍の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの検出を考慮に入れ、Ｅｐｈバイオマーカーは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体、そのペプチドまたは断片の一種または複数であり、リガンドは、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片の少なくとも一種を含む工程と、一種または複数のバイオマーカーの検出を悪性腫瘍の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの検出を考慮に入れる工程とを備える。腫瘍の侵襲性を測定する方法は、下記の実施例で浸潤アッセイなどを詳述する。
別の好ましい実施形態では、Ｅｐｈバイオマーカーは不活性ＥｐｈＡ２であり、良性腫瘍および正常細胞と比較した場合の濃度増加で検出される。
また別の好ましい実施形態では、腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法は、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋまたはｎｕｋ受容体、そのタンパク質、ペプチド、断片および誘導体のいずれか一種を含む受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、候補治療薬を培養細胞へ投与する工程と、候補治療薬の存在下または不在下における受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較した場合と相関させる工程と、それにより、Ｅｐｈ発現を減少させ、Ｅｐｈ分子を活性化する候補治療薬を同定する工程と、それにより、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える。Ｅｐｈ分子の活性化は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較した場合のチロシン分子のリン酸化によって測定される。活性化またはリン酸化状態を測定するためのリン酸化アッセイは、下記の実施例において記載する。Ｅｐｈの発現は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較される。
別の好ましい実施形態では、本発明は、エフリン分子、エフリン特異抗体、そのペプチド、変異体および断片を含む、Ｅｐｈ受容体をモジュレートするための組成物を提供する。好ましくは、エフリン分子は、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片をさらに含んでいる。エフリン分子がＥｐｈへ結合するとＥｐｈが活性化され、細胞による受容体リガンド複合体の内在化が起こる。
さらに本発明は、基材に結合している吸着剤を含むキットであって、該吸着剤は一種または複数のバイオマーカーを保持する、癌の診断を補助するためのキットを提供する。
好ましい実施形態では、被験体の癌を診断するためのキットは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋのいずれか一種により特定される少なくとも一種のバイオマーカーと、損傷を受けた神経細胞を有している疑いのあるヒト被験者から単離した生体試料を保持するための基材と、バイオマーカーの少なくとも一種または複数を検出する抗体と、薬剤を生体試料または生体試料の一部と反応させ、生体試料中の少なくとも一種のマーカーの存在または量を検出するための印刷した取扱説明書とを備える。好ましくは、本キットは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋにより特定される複数のバイオマーカーを備える。
別の好ましい実施形態では、本キットは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋのいずれか一種に特異的な少なくとも一種の抗体を備える。
好ましくは、本キットは、癌検出用のキットの使用について記載した取扱説明書を備え、該取扱説明書は、試験試料を吸着剤と接触させること、および吸着剤により保持されている一種または複数のバイオマーカーを検出することを提供する。
本キットは、前記吸着剤の吸着を可能にする基材を提供する。好ましくは、該基材は、疎水性、親水性、荷電性、極性、金属イオンでもよい。
また本キットは、抗体、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、そのペプチドまたはその断片である吸着剤を提供する。
本キットを用いる一種または複数のタンパク質バイオマーカーの検出は、質量分析またはＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによる。
別の実施形態では、癌の診断をさらに補助するため、様々な組成物を提供する。好ましくは、組成物中の各マーカーは精製されている。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本願に記載されたポリペプチド組成物の変異体を提供する。本発明により一般に包含されるポリペプチド変異体は、典型的には、本願に記載されたポリペプチド配列に対して、その長さに、（下記のようにして決定された）少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を示す。
好ましい一実施形態では、本発明により提供されるポリペプチド断片および変異体は、抗体および／または完全長ポリペプチドと反応するＴ細胞と免疫学的に反応する。
別の好ましい実施形態では、本発明により提供されるポリペプチド断片および変異体は、好ましくは、本願に詳しく記載された完全長ポリペプチド配列により示したものの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、および最も好ましくは少なくとも約９０％以上の免疫原性活性をレベル示す。
他の好ましい実施形態では複数のバイオマーカーが検出され、好ましくは、少なくとも２種類のバイオマーカーが検出され、さらに好ましくは、少なくとも３種類のバイオマーカーが検出され、最も好ましくは、少なくとも４種類のバイオマーカーが検出される。
一態様では、各バイオマーカーの量は被験体試料中で測定され、マーカー間の量の比が決定される。好ましくは、被験体試料中の各バイオマーカーの量、およびバイオマーカー間の量の比が正常な健全個体と比較される。健全個体と癌に罹患している個体との間のバイオマーカー量の比の上昇は、癌の規模（臨床的関係データと比較した疾患の進行）を示す。
好ましくは、癌の異なる病期で検出されるバイオマーカーと臨床上の癌とを相関させて、解剖上の癌（細胞癌の種類）が評価される。どのバイオマーカーが癌のどの病期、程度で検出されるかをモニタリングすることにより、癌の機序における特定情報を提供し、癌の複数の細胞内部位を同定し、癌関連の癌に関与する複数の細胞型を同定し、癌の解剖上の位置を同定する、バイオマーカーのパネルが提供される。
別の態様では、好ましくは、癌、癌の位置、ならびに癌および／または癌関連疾患の進行を診断するために、単一のバイオマーカーが正常な健全個体由来の一種または複数のバイオマーカーと組み合わされて用いられ、さらに好ましくは、癌、癌の位置、ならびに癌および／または癌関連疾患の進行を診断するために、複数のマーカーが正常な健全個体由来の一種または複数のバイオマーカーと組み合わされて用いられる。一種または複数のタンパク質バイオマーカーは、癌および／または癌関連疾患に罹患しやすい患者、あるいは癌および／または癌関連疾患に罹患している患者から得たタンパク質プロファイルを正常な被験体と比較するのに用いられることが好ましい。
本発明の他の態様を以下に記載する。
本発明は、添付の請求項において詳細に説明される。本発明の前記の利点およびさらなる利点を、以下の説明と添付の図面とを併せて参照することによってさらに理解することができる。
本発明は、癌および／または癌関連疾患の診断薬であるバイオマーカーを同定する。また、本発明の異なるバイオマーカーの検出は、癌の重症度、関与している一種または複数の細胞、および疾患の予後の診断でもある。特に、本発明は、一種または複数のＥｐｈ受容体タンパク質の存在または量を癌の重症度および／または種類と相関させる工程を用いる。バイオマーカー、その断片または誘導体の量は、癌の予後、診断、腫瘍進行、特定の病期に直接関係している。
定義
特に断りのない限り、本願中のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同様な意味を有している。本発明の実施または試験で、本願に記載したものと類似または同等のすべての方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を本願に記載する。
本願では、「Ｅｐｈ受容体」または「Ｅｐｈ型受容体」という用語は、少なくとも１１個のパラロガス遺伝子を含む受容体チロシンキナーゼのクラスを意味するが、このクラスには、さらに多くのオーソログ（例えば、異種間の相同体）が存在する。Ｅｐｈ受容体は一般に、相同性により関連のある受容体の個別の群である。これらは、Ｎ末端の付近の特徴的位置のシステイン残基および２つのフィブロネクチンＩＩＩ型反復配列を含有する細胞外ドメインにより特性決定される。具体的なＥｐｈ受容体としては、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体が挙げられる。「ＥＰＨ受容体」という用語は、受容体タンパク質の膜形態、ならびに、それらの特異的リガンドを結合する能力を保持する可溶性細胞外断片を意味する。リガンドとしては、これらに限定されるものではないが、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３が挙げられる。さらに、「ｍｅｋ４／ｓｅｋ型受容体」はＥＰＨ受容体ファミリーに密接に関係するサブグループを意味しており、そのサブグループとしては、「ｍｅｋ４関連受容体」（例えば、ｍｅｋ４、ｃｅｋ４、ｈｅｋおよびｔｙｒｏ４）；「ｓｅｋ関連受容体」（例えば、ｓｅｋ、ｃｅｋ８、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｔｙｒｏ１およびｒｔｋ１）；ならびに、他の系統発生的に関連する相同体、例えばｅｅｋ、ｂｓｋ、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２およびｃｅｋ７が挙げられる。「オーソログ」という用語は、例えば、密接な関連があり、構造上および機能上の検討に基づいた共通の系統を有していることが想定される、分種化により相同体である遺伝子またはタンパク質を意味する。オーソロガスタンパク質は、異なる種においてすぐにわかる程度同様の活性として機能する。「パラログ」という用語は、遺伝子複製により相同体である遺伝子またはタンパク質（例えば、ゲノム内での遺伝子の複製変異体）を意味する。
「不活性Ｅｐｈ」は、不活性状態（例えば非チロシンリン酸化状態）のＥｐｈ受容体を意味する。分子のリン酸化状態の測定については、当技術分野では周知である。Ｅｐｈ受容体リン酸化の詳細な測定方法を以下の実施例部分に記載する。
「試料」は、本願ではその最も広い意味で使用される。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体等を含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性分画、または細胞を増殖させた培養物；細胞から単離または抽出した染色体、細胞器官または細胞膜；溶液中の、または基材に結合されているゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；フィンガープリント、皮膚または毛髪等を含むことができる。
本願では、「製薬上許容可能な」成分は、適切なリスク対効果比に相応の、過度の副作用（毒性、刺激およびアレルギー反応など）のない、ヒトおよび／または動物での使用において好適なものである。
本願で用いられる（例えば、「候補治療薬」または「試験化合物」における）「化合物」という用語は、外因的に添加した試験化合物、およびペプチドライブラリーから内生的に発現されたペプチドの両方を包むことを意味する。例えば、特定の実施形態では、試薬細胞はまた、スクリーニングされる試験化合物を産生する。例えば、試薬細胞は、例えば、受容体／チャンネル活性をモジュレートするその能力についてスクリーニングされる、試験ポリペプチド、試験核酸および／または試験炭水化物を産生可能である。かかる実施形態では、かかる試薬細胞の培養物は、選択および同定され得る受容体またはイオンチャネル機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズする、有望なエフェクター分子のライブラリーおよびそのライブラリーのメンバーをまとめて提供する。さらにまた、試薬細胞を用いて、対象の受容体またはチャンネルを介してシグナルを伝達する薬剤を検出することができることは明らかであろう。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホネート類、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）をはじめとするエチレンイミン類およびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）類；ナイトロジェンマスタード類、例えば、クロラムブチル、クロルナファジン、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルノマイシン（ｃａｒｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンティナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストルマイヤーズスイクイブオンコロジー社（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ニュージャージー州プリンストン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）所在）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローヌプーランローラ社（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）、仏国アントニー（Ａｎｔｏｎｙ）所在）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに、上述した任意のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類または誘導体が挙げられる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびに、上記の任意のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類または誘導体が含まれる。
「モジュレートする」という用語は、任意の記載した活性が、例えば、増加される、亢進される、増加される、アゴナイズされる（アゴニストとして作用する）、促進される、低下される、減少される、抑制される、遮断される、またはアンタゴナイズされる（アゴニストとして作用する）ことを意味する。モジュレーションは、基線値に対して、１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍等を超えて活性を上昇させることができる。またモジュレーションは、基線値より下方にその活性を低下させることができる。
「患者」または「個体」という用語は、本願では同義的に使用されており、治療する哺乳動物被験体を意味しており、ヒト患者であることが好ましい。場合によっては、本発明の方法は、これらに限定されるものではないが、マウス、ラットおよびハムスターをはじめとする齧歯動物；ならびに霊長類を含む、実験動物における、獣医学用途における、および癌の動物モデルの開発における使用が見出される。
「診断の」または「診断された」とは、病態の存在または性質を同定することを意味する。診断法は、それらの感度および特異性で異なる。診断アッセイの「感度」は、陽性のテスト結果が出る癌関連疾患個体の割合である（「真陽性」のパーセント）。アッセイにより検出されない癌関連疾患個体は「偽陰性」である。癌関連疾患でなく、アッセイにおいて陰性のテスト結果が出る被験体を「真陰性」と呼ぶ。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率で表されるが、この場合、「偽陽性」率は、陽性のテスト結果が出る癌を除いたそれらの比率として定義される。特定の診断法は、状態の決定的な診断を提供することはできないかもしれないが、その方法が診断を補助する明確な目安を提供する場合には十分である。
本願では、「改善された」または「治療」とは、例えば、ルーチンの統計的検査法を用いて測定した場合の正規化値と５０％未満で異なる、好ましくは、正規化値と約２５％未満で異なる、さらに好ましくは、正規化値と１０％未満で異なる、よりさらに好ましくは、正規化値とは有意に相違しない正規化値に近づいている症状を意味する。
「治療」は、疾患の発症を予防するか、あるいは疾患の病態または症状を改善する意図で行われる処置である。したがって、「治療」は、治療的手段および予防手段または再発防止手段の両方を意味する。治療を必要とするものには、すでに疾患に罹患しているもの、および疾患が予防されるべきものが含まれる。腫瘍（例えば癌）の治療では、治療薬は、腫瘍細胞の病態を直接縮小させることができるか、あるいは、他の治療薬（例えば照射線および／または化学療法）による治療に対して、腫瘍細胞の感受性を高めることができる。本願では、「改善された」または「治療」とは、例えば、ルーチンの統計的検査法を用いて測定した場合の正規化値（例えば、健常患者または個体で得られる値）と５０％未満で異なる、好ましくは、正規化値と約２５％未満で異なる、さらに好ましくは、正規化値と１０％未満で異なる、よりさらに好ましくは、正規化値とは有意に相違しない正規化値に近づいている症状を意味する。
「腫瘍性癌または腫瘍性細胞の治療」とは、以下の１つまたは複数の作用を起こすことができる候補治療薬を意味する：（１）（ｉ）緩徐化、および（ｉｉ）完全な増殖停止を含む、腫瘍増殖のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍の大きさの維持；（４）腫瘍の大きさの縮小；（５）末梢器官への腫瘍細胞浸潤の（ｉ）減少、（ｉｉ）緩徐化、または（ｉｉｉ）完全なる阻止を含む、阻害；（６）転移の（ｉ）減少、（ｉｉ）緩徐化、または（ｉｉｉ）完全なる阻止を含む、阻害；（７）（ｉ）腫瘍の大きさの維持、（ｉｉ）腫瘍の大きさの縮小、（ｉｉｉ）腫瘍の増殖の緩和、（ｉｖ）浸潤の縮小、遅延または阻止をもたらし得る、抗腫瘍免疫反応の増強；および／あるいは、（８）疾患に関連している一種または複数の症状の重症度または数値のある程度までの軽減。
本願では、「癌」は、哺乳動物で確認されているすべての種類の癌または腫瘍または悪性腫瘍を意味し、これらに限定されるものではないが、白血病、リンパ腫、黒色腫、上皮性腫瘍および肉腫が挙げられる。「癌」の例としては、脳腫瘍、乳癌、膵癌、頸癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫癌、中皮腫癌、卵巣癌、肉腫癌、胃癌、子宮癌および髄芽細胞腫癌がある。
「白血病」という用語は、造血器官の進行性の悪性癌を広く意味し、一般に、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の正常でない増殖および成長を特徴とする。一般に、白血病は以下に基づいて臨床的に分類される：（１）急性または慢性癌の期間および特徴；（２）関与している細胞の種類；骨髄系（骨髄性）、リンパ系（リンパ性）、または単球；および（３）白血病患者または非白血性患者（亜白血性患者）における異常細胞数の増加または非増加。したがって、本発明は、白血病を治療する方法、好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症白血病、好塩基性白血病、幼若細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球白血病、原始血球白血病、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ球様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥胖細胞性白血病、巨核球白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球白血病、骨髄性白血病、骨髄細胞顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血症、および未分化細胞白血病を治療する方法を含む。
「肉腫」という用語は、一般に、胎生結合組織のような物質から構成される腫瘍を意味し、一般には、繊維性物質または均質物質に包埋されている密集した細胞からなる。肉腫の例としては、これらに限定されるものではないが、軟骨肉腫、繊維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー（Ａｂｅｍｅｔｈｙ）肉腫、脂肪腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉種、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、繊維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫および毛細管拡張性肉腫が挙げられる。
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラノサイト系から発生する腫瘍を意味する。黒色腫としては、これらに限定されるものではないが、例えば、末端性黒子性黒色腫、無色性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子性黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、かつ転移を生じさせる傾向がある上皮細胞からなる悪性腫瘍を意味する。癌腫としては、これらに限定されるものではないが、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質の癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、基底細胞癌、基底細胞癌、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原生癌、脳状癌（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞性癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、コーパス癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱細胞癌、円柱細胞癌、腺管癌、硬性癌、胎児性癌、髄様癌、類表皮癌、アデノイド上皮癌腫、外向発育癌、潰瘍癌、線維性癌腫、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、コロイド腺癌、巨細胞癌、巨細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血性癌（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、ガラス体癌（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌、乳児胎児性癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌腫、クロムペシェル（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ）癌、クルチィツキー（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ）細胞癌、大細胞癌、水晶体癌、レンズ状癌、脂肪腫、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄性癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌、粘液性癌、粘液分泌性癌、印環細胞癌、粘液性類表皮癌、粘液癌、粘液性癌、粘液腫状癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、上皮内癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌（ｓｉｇｎｅｔ−ｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、単純癌、小細胞癌、ソライド（ｓｏｌａｎｏｉｄ）癌、回転楕円面細胞癌、紡錘体細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮癌、ストリング（ｓｔｒｉｎｇ）癌、毛細血管拡張性癌、毛細血管拡張様癌、移行上皮癌、結節癌、結節癌、疣状癌、および絨毛癌が挙げられる。
さらなる癌としては、例えば、ホジキン癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺癌、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓癌、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変、睾丸癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が挙げられる。
本願では、「細胞表面受容体」とは、細胞の表面に存在し、細胞外の環境と相互に作用し、特異的プロモーターの転写を最終的にモジュレートし、特異的遺伝子の転写をもたらすように環境に関する情報を細胞内に送達または伝達する分子を意味する。
「対立遺伝子」または「変異体」は、遺伝子の代替形態である。本発明で特に有用であるのは、Ｅｐｈ２をコードしている遺伝子の変異体である。変異体は、核酸配列の少なくとも１つの突然変異に起因していてもよく、改変ｍＲＮＡまたはポリペプチド（この構造または機能は改変されていても、改変されていなくてもよい）を生ずることができる。任意の特定の天然または組換え型遺伝子は、対立形質をまったく有していないか、１個または多数の対立形質を有していてもよい。変異体を生じさせる通常の突然変異変化は一般に、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換によるものとされる。これらの各タイプの変化は、単独で生じてもよく、または他と組み合わせて所与の配列で１回または複数回生じてもよい。
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列、またはこれらのうちのいずれかの断片であって、天然分子または合成分子を意味する。本願では、「断片」とは、好ましくは少なくとも１０〜約３０または５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、４０または５０個のアミノ酸長であるＥｐｈの断片を意味する。「アミノ酸配列」を、天然タンパク質分子のアミノ酸配列に言及するように記載している場合、「アミノ酸配列」および同類の用語は、そのアミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に関連した完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味するものではない。
本願の記載では、「核酸配列の断片」は、少なくとも約１０個または１５個の核酸残基（ヌクレオチド）、さらに好ましくは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０の、１００、１５０または２００個の核酸残基を含む。
本願では、「細胞外シグナル」には、直接的にまたは間接的にシグナルと相互作用する細胞表面タンパク質を介して細胞内に伝達される分子または環境の変化が含まれる。細胞外シグナルまたはエフェクター分子には、いくつかの方法で細胞表面タンパク質の活性を特異的に変えるすべての化合物または物質が含まれる。かかるシグナルの例としては、これらに限定されるものではないが、アセチルコリン、増殖因子およびホルモン（細胞表面および／または細胞内の受容体ならびにイオンチャネルに結合し、かかる受容体およびチャンネルの活性をモジュレートするもの）などの分子が挙げられる。
本願では、また「細胞外シグナル」には、細胞受容体の活性をモジュレートし、それにより細胞内の機能に影響を及ぼす、未確認の物質が含まれる。かかる細胞外シグナルは、特定の細胞表面受容体の活性をモジュレートすることにより特定の癌の治療に用いることができる有望な薬剤である。
「オーファン受容体」の意味は、特異的天然リガンドがこれまで記載されていない受容体に対して付与されている。
マーカーの「試験量」は、試験している試料中に存在するマーカーの量を意味する。試験量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかでよい。
マーカーの「診断量」は、癌および／または癌関連疾患の診断と一致している被験体試料中のマーカーの量を意味する。診断量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかでよい。
マーカーの「対照量」は、任意の量であるか、またはマーカーの試験量と比較されることになっている一連の量でよい。例えば、マーカーの対照量は、癌に罹患していない人のマーカーの量でよい。対照量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかでよい。
「プローブ」は、気相イオン分光計へ取り外し可能に挿入することができ、検出用のマーカー提示用の表面を有している基材を含む、デバイスを意味する。プローブは、単一の基材または複数の基材を含むことができる。
「基材」または「プローブ基材」は、吸着剤を（例えば結合、沈着などによって）提供することができる固相を意味する。
「吸着剤」は、マーカーを吸着し得るすべての材料を意味する。本願で用いる「吸着剤」という用語は、マーカーが曝露されている単一の材料（「モノプレックス吸着剤」）（例えば化合物または官能基）、およびマーカーが曝露されている複数の異なる材料（「マルチプレックス吸着剤」）の両方を意味する。マルチプレックス吸着剤中の吸着材料を「吸着剤種」と称する。例えば、プローブ基材上のアドレス可能位置は、異なる結合特性を有する様々な吸着剤種（例えば、陰イオン交換物質、金属キレート化剤、または抗体）を特徴とするマルチプレックス吸着剤を含むことができる。基材の材料それ自体もまた、マーカーの吸着に寄与し、「吸着剤」の一部と考えることができる。
「吸着」または「保持」とは、溶離剤（選択性閾値調節剤）または洗浄溶液による洗浄前または洗浄後の吸収性物質とマーカーの間の検出可能な結合を意味する。
「溶離剤」または「洗浄溶液」は、吸着剤へのマーカーの吸着を仲介するために使用可能な薬剤を意味する。溶離剤および洗浄溶液を「選択性閾値調節剤」と称する。溶離剤および洗浄溶液は、プローブ基材表面から未結合の材料を洗浄し除去するために用いられることができる。
「除去」、「分離」または「マーカーの分離」とは、試料中の少なくとも一種のマーカーを検出することを意味する。分離には、選別とその後の検出差異によって、試料中の複数のマーカーを検出することが含まれる。分離では、混合物中の他のすべての生体分子から一種または複数のマーカーを完全に選別することは必要ではない。むしろ、少なくとも一種のマーカーと他の生体分子を区別することができる任意の選別も十分であるとみなす。
「気相イオン分光計」は、試料が揮発しイオン化された場合に形成されるイオンの質量電荷比に変換可能なパラメータを測定する装置を意味する。一般に、対象のイオンは単一電荷を有しており、質量電荷比は単に質量として呼ばれることが多い。気相イオン分光計としては、例えば、質量分析計、イオン可動性分光計および全イオン電流計測デバイスが挙げられる。
「質量分析計」は、入口系統、イオン化源、イオン光学アッセンブリー、質量アナライザーおよび検出器を含む気相イオン分光計を意味する。
「レーザー脱離質量分析」は、分析物を脱離して揮発させ、イオン化する手段としてレーザーを用いる質量分析計を意味する。
「検出する」とは、検出する対象の存在、不在または量を同定することを意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するように本願で同義に用いられている。この用語は、一種または複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体または擬似体であるアミノ酸ポリマー、および天然アミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、例えば、炭水化物残基を添加して糖タンパク質を形成することにより修飾可能である。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語には、糖タンパク質、および非糖タンパク質が含まれる。
「検出可能な成分」または「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段値によって検出可能な組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般にＥＬＩＳＡで用いられるもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清またはモノクローナル抗体が利用できるハプテンおよびタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。多くの場合、検出可能な成分は、試料中の結合した検出可能な成分の量を定量するために使用することができる、測定可能なシグナル（例えば、放射性シグナル、発色性シグナルまたは蛍光性シグナルなど）を生じる。シグナルは、例えば、シンチレーション計数、濃度計測、またはフローサイトメトリーにより定量することができる。
「抗体」とは、一免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片によって実質的にコードされているポリペプチドリガンドを意味し、これはエピトープ（例えば抗原）に特異的に結合し認識する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κおよびλ軽鎖の定常域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖定常域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変部領域遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば、完全な免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって生じた多数の十分に特性決定された断片として存在する。これには、例えば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。また本願では、「抗体」という用語には、全抗体の改変によって産生されたか、あるいは組換ＤＮＡ手法を用いて新しく合成された抗体断片も含まれる。またこれには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または単鎖抗体も含まれている。抗体の「Ｆｃ」部分は、一種または複数の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含んでいない、免疫グロブリン重鎖の一部を意味する。
「イムノアッセイ」は、抗原（例えばマーカー）を特異的に結合するために抗体を用いるアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離させ、標的化し、かつ／または定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」という句、あるいは「〜と特異的に（または選択的に）免疫反応する」という句は、タンパク質またはペプチドを意味する場合、タンパク質の異種混合群中のタンパク質の存在および他のバイオロジーを決定するような結合反応を意味する。したがって、指定したイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、少なくとも２倍のバックグラウンドで特定タンパク質に結合するが、試料中に存在する他のタンパク質には実質的に有意な量で結合しない。かかる条件下での抗体への特異的結合には、特定タンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体が必要とされ得る。種々のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを慣用的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択する（例えば、特異的免疫反応性の測定に使用可能なイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については、ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）を参照されたい）。一般には、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナルまたはノイズであり、より一般には、１０〜１００倍を超えるバックグラウンドである。
「エネルギー吸収分子」または「ＥＡＭ」は、質量分析計中でイオン化源からエネルギーを吸収し、それによりプローブ表面からマーカーなどの分析物の脱離を援助する分子を意味する。分析物の大きさおよび性質によって、エネルギー吸収分子を任意に用いることができる。ＭＡＬＤＩで使用するエネルギー吸収分子は一般に「マトリックス」と呼ばれる。珪皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシ珪皮酸（「ＣＨＣＡ」）およびジヒドロキシ安息香酸は、一般に生物有機化学分子のレーザー脱離でエネルギー吸収分子として用いられている。
「実質的に精製した」とは、それらの自然環境から取り出され、単離または分離され、それらが自然的に関与している他の成分を少なくとも約６０％含まない、好ましくは約７５％含まない、最も好ましくは約９０％含まない、核酸分子またはタンパク質を意味する。
「基材」とは、核酸分子またはタンパク質が結合する硬質または半硬質のすべての支持体を意味し、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハー、繊維、磁気ビーズもしくは非磁気ビーズ、ゲル、キャピラリーまたは他の管材料、プレート、ポリマー、ならびにウェル、溝、ピン、チャンネルおよび細孔を含めた種々の表層形態を有する微粒子を含む。
Ｅｐｈおよびエフリンバイオマーカー
Ｅｐｈ受容体はチロシンキナーゼ受容体の最大のファミリーであり、これは例えば、増殖、遊走および分化を調節するものとして、細胞の重要なシグナル伝達経路の仲介において不可欠な一連の膜貫通タンパク質である。Ｅｐｈ受容体の１４種類のメンバーは、それらの細胞外ドメインの類似性と、それらの膜結合リガンド（エフリン）と相互作用するそれらの能力とに基づいて、ＡクラスおよびＢクラスに分類されている。Ｅｐｈ受容体の内因性リガンドは隣接する細胞の表面に係留され、それが受容体チロシンキナーゼの中で特有のものとしており、これは一般に、表皮増殖因子（ＥＧＦ）および血管性内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの可溶性因子に結合する。
Ｅｐｈ受容体の大部分は、細胞間の接触依存型過程の仲介により癌進行中の軸索誘導に重要な役割を果たす。しかし、ＥｐｈＡ２は通常、成体上皮細胞の表面上において低レベルで発現される。これは細胞間結合に局所的であり、そこでは、その受容体のすべてがそのリガンド（エフリンＡ１）により実質的に結合される。ＥｐｈＡ２は、結腸癌、乳癌および膵癌をはじめとする複数のヒト上皮癌で著しく過剰に発現される。この癌組織での不安定な細胞−細胞接着は、ＥｐｈＡ２が隣接する細胞上のエフリンＡ１と相互作用する能力を妨げる。その結果、受容体活性化ならびにエフリンＡ１誘導型ＥｐｈＡ２分解は著しく低下する。興味深いことに、これが悪性細胞状態（ＥｐｈＡ２の活性化が有意に低下し、同時に高度に過剰発現される）をもたらす。侵襲表現型および悪性表現型の癌の多くは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＥｐｈＡ２の過剰発現と直接的な相関関係がある。
本発明者らは以前のｃＤＮＡマイクロアレイの分析において、多形膠芽腫（ＧＢＭ）（星状膠起源の最も侵襲的で致死性の脳腫瘍）で最も一様に過剰発現された遺伝子の１つであるＥｐｈＡ２を見出した。癌に関連のあるすべてのＥｐｈＡ２の報告が上皮起源の悪性腫瘍にあるとこれまで考えられていたので、この知見は予期されなかった。正常組織と比較した場合にＧＢＭにおいてタンパク質レベルで特異的に過剰発現されたならば、ＥｐｈＡ２は新規の分子マーカーおよび治療標的である。具体的なＥＰＨ受容体としては、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体が挙げられる。リガンドとしては、これら限定されるものではないが、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３が挙げられる。
別の好ましい実施形態では、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種からなるエフリン分子は、癌のバイオマーカーである。
現在の既存の製品と比較した場合、本発明はいくつかの優れた利点および効果を提供する。第１に、腫瘍バイオマーカーの同定は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）などの既存の診断デバイスに比べて、癌重症度の診断がより迅速に、かつ安価に提供される。また本発明では、器官に対する損傷の定量的検出と高含量評価が可能である。また本発明は、罹患している特定の細胞の種類（例えば、ニューロン対膠）の同定が可能である。さらに、これらの腫瘍特異的タンパク質および腫瘍高濃度タンパク質のレベルは、市販の利用可能なものに比べて、癌の診断、予後および病期に関するより正確な情報を提供する。
別の好ましい実施形態では、被験体の癌の診断は、（ａ）腫瘍に罹患している疑いのある被験体から単離された生体試料を提供する工程と、（ｂ）一種または複数の腫瘍マーカーから選択した少なくとも一種のマーカーの存在または量を試料中で検出する工程と、（ｃ）マーカーの存在または量を被験体における腫瘍の存在または種類と相関させる工程とにより分析される。好ましくは、腫瘍細胞は、体内の任意の器官、組織などから得たものである。Ｅｐｈ受容体バイオマーカーを発現することができる腫瘍細胞の例は、中枢神経系および末梢神経系に存在するような細胞であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中の、または動物被験体のその部位の神経細胞、膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞または腫瘍幹細胞が挙げられ（「腫瘍特異的または腫瘍高濃度」タンパク質）；他の細胞の種類としては、心筋細胞、骨格筋中の筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、卵巣細胞、前立腺、精巣中の細胞が挙げられる。一部の実施形態では、試料は腫瘍細胞を含んでいることが好ましく、例えば、中枢神経系または末梢神経系組織のバイオプシーは、本発明での使用に好適な生体試料である。さらに、細胞の損傷が細胞膜を損なうと、これらの腫瘍タンパク質が、最初に細胞外液または細胞外空間に、および脳脊髄液に、最後には循環血液（損なわれた血液脳関門により助長された場合）および他のバイオ液体（例えば尿、汗、唾液など）に流出するに至る。したがって、他の好適な生体試料としては、これらに限定されるものではないが、かかる細胞またはこれらの細胞から分泌された液体が挙げられる。被験体から体液（脳脊髄液、血液、血漿、血清、唾液および尿など）を得ることは、固体組織バイオプシー試料を得るのに比べると一般にそれほど侵襲的ではなく、損傷することはない。したがって、体液である試料は本発明での使用に好ましい。特にＣＳＦは、それが神経系と直接接触があり、容易に取得可能であることから、被験体の腫瘍損傷の検出において好ましい。
生体試料を慣用の技術によって被験体から得ることができる。例えば、ＣＳＦを腰椎穿刺により得ることができる。血液を静脈穿刺によって得ることができ、一方、血漿および血清を公知の方法に従って全血を分画することにより得ることができる。固体組織試料を得るための外科技術は当技術分野では周知である。例えば神経系組織試料の取得方法は、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙなどの標準の神経外科テキスト：エフ マイヤー（Ｆ．Ｍｅｙｅｒ）、チャーチル リビングストン（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）、１９９９年によるＢａｓｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｃｒａｎｉａｌ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ；デビッド ジー ティー トーマス（Ｄａｖｉｄ Ｇ．Ｔ．Ｔｈｏｍａｓ）、ダブリュービーサンダース社（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．）、１９９３年によるＳｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ、第１版；ならびに、エル エヌ セカールおよびイー ド オリベイラ（Ｌ．Ｎ．Ｓｅｋｈａｒ ａｎｄ Ｅ．Ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ）によるＣｒａｎｉａｌ Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１版、ティーメメディカルパブリッシング（Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、１９９９年に記載されている。また、脳組織を取得し分析する方法もベライら（Ｂｅｌａｙ ｅｔ ａｌ．）、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５８巻：１６７３〜１６７８ページ、（２００１年）；およびセイジョーら（Ｓｅｉｊｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３８巻：３８９２〜３８９５ページ、（２０００年）に記載されている。
生体試料を得る被験体として、すべての動物を用いることができる。好ましくは、被験体は哺乳動物であり、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、霊長類、ラットまたはマウスである。さらに好ましくは、被験体はヒトである。特に好ましくは、癌患者である。
本発明のバイオマーカーは、任意の手段によって試料中で検出可能である。バイオマーカーを検出する方法を、以下の材料および方法、ならびに実施例で詳細に記載する。例えば、イムノアッセイとしては、これらに限定されるものではないが、ウェスタンブロットなどの技術を用いる競合的および非競合的アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散法、蛍光免疫検定法等が挙げられる。かかるアッセイは慣用のアッセイであり、当技術分野で周知である（例えば、オーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、ジョンワイリーアンドサンズインコーポレイティッド社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク所在（これについては、その全体を本願に援用する）を参照されたい。具体的なイムノアッセイはすぐ後に記載する（しかし限定することを意図するものではない）。
一般に免疫沈降プロトコルは、プロテインホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充した、ＲＩＰＡバッファー（１％ ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラジロール）などの溶解バッファーに細胞群を溶解させる工程、対象の抗体を細胞溶解物に加える工程、４℃で一定時間（例えば１〜４時間）インキュベートする工程、細胞溶解物へプロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを添加する工程、４℃で約１時間またはそれ以上インキュベートする工程、溶解バッファーでビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／試料バッファー中にビーズを再懸濁する工程を備える。抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力を、例えばウェスタンブロット解析により評価することができる。当業者は、抗原への抗体の結合を高め、バックグラウンドを低下させるように改変させることができるパラメータに関しては知識が豊富である（例えば、セファロースビーズによる細胞溶解物の事前除去）。免疫沈降プロトコルに関するさらなる記述については、例えば、オーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、ジョンワイリーアンドサンズインコーポレイティッド社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク所在の１０．１６．１を参照されたい。
一般にウェスタンブロット解析は、タンパク質試料を調製する工程、ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質試料の電気泳動（例えば、抗原分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルから膜（例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなど）に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは無脂肪乳を含むＰＢＳ）中で膜をブロッキングする工程、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−ツイーン２０）中で膜を洗浄する工程、ブロッキングバッファーで希釈した第１抗体（対象の抗体）で膜をブロッキングする工程、洗浄バッファーで膜を洗浄する工程、ブロッキングバッファーで希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合している第２抗体（これは第１抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）で膜をブロッキングする工程、洗浄バッファーで膜を洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工程を備える。当業者は、検出されたシグナルを拡大し、かつバックグラウンドノイズを低減するように変化させることができるパラメータに関しては知識が豊富である。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる記述については、例えばオーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、ジョンワイリーアンドサンズインコーポレイティッド社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク所在の１０．８．１を参照されたい。
ＥＬＩＳＡは、抗原（すなわち腫瘍バイオマーカー）を調製する工程、抗原で９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを被覆する工程、ウェルに、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合している対象の抗体を加える工程、一定の時間インキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を備える。ＥＬＩＳＡでは、対象の抗体は、検出可能な化合物に結合されている必要がなく、代わりに、検出可能な化合物に結合されている２次抗体（これは対象の抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、抗原でウェルを被覆する代わりに、ウェルに抗体を被覆することができる。この場合、検出可能な化合物に結合している２次抗体を、被覆したウェルに対象の抗原を添加した後に加えることができる。当業者は、検出されたシグナルを拡大するために変化させることができるパラメータ、ならびに当技術分野で周知のＥＬＩＳＡの他の変法に関しては知識が豊富である。ＥＬＩＳＡに関するさらなる記述については、例えばオーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、ジョンワイリーアンドサンズインコーポレイティッド社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク所在の１１．２．１を参照されたい。
新規マーカーの同定
好ましい実施形態では、生体試料は、腫瘍に罹患している患者から取得される。他の患者および対照被験体（すなわち、同年齢、性別、健康状態の正常な健全個体）由来のバイオマーカーを含む生体試料が比較として用いられる。生体試料は、上述のようにして抽出される。好ましくは、試料は、バイオマーカーの検出前に調製される。一般に、調製には、試料を分画する工程と、バイオマーカーを含有することを決定する画分を回収する工程とが含まれる。前分画の方法としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、連続抽出法、ゲル電気泳動法および液体クロマトグラフィーが挙げられる。また、分析物は検出前に改変可能である。これらの方法は、継続分析用の試料をシンプルにするのに有用である。例えば、分析の前の血液から、アルブミンなどの多量のタンパク質を除去するのに有用であることができる。
一実施形態では、試料は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、試料中のタンパク質の大きさに従って前分画されることができる。利用可能な試料が少量である生体試料については、サイズ選択スピンカラムを用いることが好ましい。一般に、カラムから溶出される最初の分画「（分画１」）は、高分子量のタンパク質を最も高い割合で有しており；分画２は、高分子量のタンパク質を低い割合を有しており；分画３は、高分子量のタンパク質をより低い割合で有しており；分画４は、大型タンパク質を最低量で有している等である。次いで、各分画は、マーカーを検出するため、イムノアッセイ、気相イオン分光測定等によって分析されることができる。
別の実施形態では、試料は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって前分画されることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、それらの電荷特性に従って、試料中のタンパク質を大ざっぱに前分画することができる。例えば、Ｑ陰イオン交換樹脂を用いることができ（例えばＱ Ｈｙｐｅｒ Ｄ Ｆ、バイオセプラ社（Ｂｉｏｓｅｐｒａ））、異なるｐＨ値を有する溶離剤で試料を連続して溶出することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、より負荷電の試料中のバイオマーカーを別の種類のバイオマーカーから分離することができる。ｐＨ値の高い溶離剤で溶出されるタンパク質は弱い負荷電であるようであり、ｐＨ値が低い溶離剤で溶出される分画は負荷電が強いようである。したがって、試料の複雑性を低減する他に、陰イオン交換クロマトグラフィーは、それらの結合特性に従ってタンパク質を分離する。
さらに別の実施形態では、試料は、ヘパリンクロマトグラフィーによって前分画されることができる。ヘパリンクロマトグラフィーもまた、ヘパリンと電荷特性との親和性相互作用に基づいて、試料中のマーカーを前分画することができる。硫酸化ムコ多糖のヘパリンは、正電荷分子を有するマーカーと結合し、異なるｐＨ値または塩濃度を有する溶離剤で連続して試料を溶出することができる。ｐＨ値が低い溶離剤で溶出されたマーカーは、弱く正の電荷に帯電しているようである。ｐＨ値が高い溶離剤で溶出されたマーカーは、強く正の電荷に帯電しているようである。したがって、ヘパリンクロマトグラフィーもまた、試料の複雑性を低減し、かつ、それらの結合特性に従ってマーカーを分離する。
さらに別の実施形態では、試料は、特有の特徴（例えば、グリコシル化）を有しているタンパク質を単離することにより前分画されることができる。例えば、ＣＳＦ試料は、レクチンクロマトグラフィーカラム（これは糖に対して高親和性である）上に試料を通過させることにより分画されることができる。グリコシル化タンパク質はレクチンカラムへ結合し、非グリコシル化タンパク質は流出により通過する。次いで、グリコシル化タンパク質を、糖（例えばＮ−アセチルグルコサミン）を含有する溶離剤でレクチンカラムから溶出させて、さらなる分析に利用することができる。
したがって、試料中のタンパク質の結合特性、または試料中のタンパク質の特徴に基づいて試料の複雑性を低減する方法が多数ある。
さらに別の実施形態では、試料は、連続抽出プロトコルを用いて分画されることができる。連続抽出では、試料は、試料から異なる種類のバイオマーカーを抽出するために一連の吸着剤に曝露する。例えば、特定のタンパク質を抽出する第１の吸着剤に試料をアプライし、非吸着性タンパク質（すなわち、第１の吸着剤に結合しなかったタンパク質）を含有している溶離剤を回収する。次いで、その分画を第２の吸着剤に曝露する。これによって、この画分から様々なタンパク質がさらに抽出される。次いで、この第２の分画が第３の吸着剤などに曝露される。
試料の連続抽出は、任意の好適な材料および方法を用いて実施されることができる。例えば、異なる吸着剤を含む一連のスピンカラムが用いられることができる。別の例では、そのボトムに異なる吸着剤を含んでいるマルチウェルを用いることができる。別の例では、連続抽出は、気相イオン分光計での使用に適したプローブ上で実施されることができる。この場合、プローブ表面は、バイオマーカー結合用の吸着剤を含んでいる。この実施形態では、プローブ上の第１の吸着剤に試料をアプライし、続いてこれを溶離剤で洗浄する。第１の吸着剤に結合しないマーカーを溶離剤で除去する。この分画にあるマーカーをプローブ上の第２の吸着剤等にアプライすることなどができる。気相イオン分光計プローブで連続抽出を行う利点は、連続抽出プロトコルのすべての段階で様々な吸着剤に結合するマーカーを、気相イオン分光計を用いて直接分析することができることである。
さらに別の実施形態では、試料中のバイオマーカーは、高分解能電気泳動（例えば１または２次元ゲル電気泳動）によって分離されることができる。マーカーを含有している分画を単離し、さらに、気相イオン分光測定によって分析することができる。好ましくは、２次元ゲル電気泳動を用いて、一種または複数のマーカーを含んでいるバイオマーカーの２次元配列のスポットを生成する。例えば、ユングブルートおよびシード（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ ａｎｄ Ｔｈｉｅｄｅ）、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．、１６巻：１４５〜１６２ページ、（１９９７年）を参照されたい。
２次元ゲル電気泳動は、当技術分野で周知の方法を用いて行われることができる。例えば、ドイッチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻を参照されたい。一般に、試料中のバイオマーカーは、例えば等電点電気泳動法により分離するが、その間、試料中のバイオマーカーは、それらがスポット（そこでは、それらの総電荷は０（すなわち等電点）である）に到着するまでｐＨ勾配中で分離される。この第１の分離工程により、バイオマーカーの１次元アレイが得られる。さらに１次元アレイのバイオマーカーは、第１の分離工程で用いた技術とは一般に異なる技術を用いて分離される。例えば、２次元において、等電点電気泳動法によって分離したバイオマーカーは、さらに、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などのポリアクリルアミドゲルを用いて分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、バイオマーカーの分子量に基づいてさらなる分離を行うことができる。一般に、２次元ゲル電気泳動は、複合混合物中にある１０００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子量の化学的に異なるバイオマーカーを分離することができる。
２次元アレイのバイオマーカーは、当技術分野で周知の任意の好適な方法を用いて検出されることができる。例えば、ゲル中のバイオマーカーを標識化または染色することができる（例えば、クーマシーブルまたは銀染色法）。ゲル電気泳動法が本発明の一種または複数のマーカーの分子量に対応するスポットを生成した場合、このスポットは、密度測定分析または気相イオン分光測定によりさらに分析されることができる。例えば、スポットをゲルから切り出し、気相イオン分光測定により分析することができる。あるいは、バイオマーカーを含有しているゲルを電場にアプライすることにより不活性膜に移すことができる。次いで、マーカーの分子量にほぼ対応する膜上のスポットを気相イオン分光測定により分析することができる。気相イオン分光測定では、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩなどの任意の好適な技術も用いてスポットを分析することができる。
気相イオン分光測定分析の前に、プロテアーゼ（例えばトリプシン）などの開裂試薬を用いて、スポットのバイオマーカーをより小さな断片へ開裂するのが望ましい。バイオマーカーを小さな断片へ消化することによりスポットのバイオマーカーの質量フィンガープリントが得られ、これは所望によりマーカーの同一性を決定するために用いることができる。
別の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、試料中のバイオマーカーの混合物を、それらの異なる物性（例えば、極性、電荷および大きさなど）に基づいて分離することができる。ＨＰＬＣ機器は一般に、移動相の貯蔵部、ポンプ、注入器、分離カラムおよび検出器からなる。試料中のバイオマーカーは、カラム上に試料のアリコートを注入することにより分離される。混合物中の異なるバイオマーカーは、流動性の液相と固相の間のそれらの分配挙動における差により、異なる速度でカラムを通過する。一種または複数のマーカーの分子量および／または物性に対応する分画を回収することができる。次いで、その分画は、気相イオン分光測定により分析してマーカーを検出することができる。
場合により、分析前にマーカーを改変し、その分離を改善、またはその同一性を決定することができる。例えば、分析前に、マーカーに対してタンパク分解性の消化を行うことができる。任意のプロテアーゼを用いることができる。トリプシンなどのプロテアーゼ（これらは、マーカーを個々の数の断片に開裂する可能性が高い）は特に有用である。消化によって得られた断片は、マーカーのフィンガープリントとして機能し、それによって、間接的にそれらを検出することができる。これは、当該マーカーと混同され得る同様の分子量を有するマーカーがある場合、特に有用である。また、質量分析により容易に小型マーカーが分離されるので、タンパク分解性の断片化は高分子量マーカーに有用である。別の例では、検出分離を向上させるためにバイオマーカーを改変することができる。例えば、ノイラミニダーゼを用いて糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去し、アニオン性吸着剤への結合を向上させ、検出分離を高めることができる。別の例では、マーカーを、分子マーカーに特異的に結合し、さらにそれらを区別する特定の分子量のタグを結合させることにより改変することができる。場合により、かかる改変マーカーを検出した後、マーカーの同一性をタンパク質データベース（例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）で、改変マーカーの物理的および化学的特性とマッチングさせることによりさらに決定することができる。
調製後、試料中のバイオマーカーは、一般に検出用の基材上で捕獲される。慣用の基材としては、抗体を被覆した９６ウェルプレートまたはニトロセルロース膜が挙げられ、これは続いてタンパク質の存在の探索に用いられる。好ましくは、バイオマーカーは、上述のイムノアッセイを用いて同定される。しかし、好ましい方法には、バイオチップの使用もまた含まれている。好ましくは、バイオチップは、タンパク質の捕捉および検出用のタンパク質バイオチップである。当技術分野では、多数のタンパク質バイオチップが報告されている。これらには、例えば、パッカードバイオサイエンス社（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）（コネチカット州メリデン（Ｍｅｒｉｄｅｎ）所在）、ザイオミックス社（Ｚｙｏｍｙｘ）（カリフォルニア州ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ）所在）、およびフィロス社（Ｐｈｙｌｏｓ）（マッサチューセッツ州レキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）所在）によって製造されたタンパク質バイオチップが含まれる。一般に、タンパク質バイオチップは、表面を有する基材を含んでいる。捕捉試薬または吸着剤は基材の表面に結合される。一般的に、表面は多数のアドレス可能な位置を含んでおり、その各位置は、その場所で結合される捕捉試薬を有している。捕捉試薬は、ポリペプチドまたは核酸などの生体分子でもよく、それは特定の方法で他のバイオマーカーを捕獲する。あるいは、捕捉試薬は陰イオン交換材料または親水性材料などのクロマトグラフィー材料でもよい。かかるタンパク質バイオチップの例は、以下の特許または特許出願書類に記載されている：米国特許第６２２５０４７号明細書（ハッチェンスおよびイップ（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）、「Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐｓ」、２００１年５月１日）、国際公開公報第９９／５１７７３号パンフレット（カイメリスおよびワーグナー（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ）、「Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ」、１９９９年１０月１４日）、国際公開公報第００／０４３８９号パンフレット（ワーグナーら（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「Ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０００年７月２７日）、国際公開公開公報第００／５６９３４号パンフレット（エングラートら（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ ａｒｒａｙｓ」、２０００年９月２８日）。
一般に、バイオマーカーを含有している試料は、結合し得るのに十分な時間、バイオチップの活性表面に置かれる。次いで、未結合の分子が好適な溶離剤を用いて表面から洗浄される。一般に、溶離剤がストリンジェントであるほど、タンパク質が洗浄後に担持されているように、より強固に結合させなければならない。現在、保持されたタンパク質バイオマーカーは適切な手段によって検出されることができる。
タンパク質バイオチップの表面上に捕獲されている分析物は、当技術分野で周知の任意の方法によって検出されることができる。これには、例えば、質量分析、蛍光、表面プラズモン共鳴、楕円偏光法および原子間力顕微鏡検査が含まれる。質量分析、特にＳＥＬＤＩ質量分析は、本発明のバイオマーカーの検出に特に有用な方法である。
好ましくは、本発明の実施形態では、レーザー脱離飛行時間型質量分析計を用いる。レーザー脱離質量分析では、マーカーを含む基材またはプローブが入口系へ注入される。マーカーは、イオン化源からのレーザーによって脱離し、気相中へイオン化される。生じたイオンはイオン光学アセンブリーによって回収され、次いで、飛行時間型質量分析計において、イオンが高電圧短フィールドを通って加速され、高真空チャンバーへ流れ込む。高真空チャンバーの遠端では、加速したイオンが異なる時間で高感度検出器の表面にあたる。飛行時間はイオンの質量の関数であることから、イオン形成とイオン検出器衝突との間の経過時間は、特定の質量対電荷比のマーカーの存在または不在を同定するのに用いることができる。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法、すなわちＭＡＬＤＩ−ＭＳは、プローブ表面から完全にタンパク質を脱離するために、一般にマトリックスと呼ばれるエネルギー吸収分子を使用する質量分析法である。ＭＡＬＤＩは、例えば、米国特許第５１１８９３７号明細書（ヒルレンカンプら（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．））および米国特許第５０４５６９４号明細書（ビービスおよびチェイト（Ｂｅａｖｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｉｔ））に記載されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは一般に、試料をマトリックス材料と混合し、不活性プローブの表面に置く。具体的なエネルギー吸収分子としては、珪皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシ珪皮酸（「ＣＨＣＡ」）およびジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。他の好適なエネルギー吸収分子は当業者に周知である。マトリックスは乾燥され、分析物分子をカプセル化した結晶を形成する。次いで、レーザー脱離／イオン化質量分析により分析物分子が検出される。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、上述の調製法を用いて実質的に試料の複雑性を低減する場合、本発明のバイオマーカーを検出するのに有用である。
表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析、すなわちＳＥＬＤＩ−ＭＳは、複合体混合物中の生体分子（例えばタンパク質）の分画および検出に関して、ＭＡＬＤＩに改良が加えられている。ＳＥＬＤＩは、タンパク質などの生体分子を、捕捉試薬を用いてタンパク質バイオチップの表面で捕捉してそこに結合する、質量分析法である。一般に、非結合分子は、調査前にプローブ表面から洗浄される。ＳＥＬＤＩは、例えば、以下に記載されている：米国特許第５７１９０６０号明細書（「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ」、ハッチェンスおよびイップ（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）、１９９８年２月１７日）、米国特許第６２２５０４７号明細書（「Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｐｓ」、ハッチェンスおよびイップ（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）、２００１年５月１日）、およびワインバーガーら（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、アール エー マイヤー（Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ）編、１１９１５〜１１９１８ページ、ジョンワイリーアンドサンズチチェシャー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｃｈｉｃｈｅｓｈｅｒ）、２０００年。
基材表面上のマーカーは、気相イオン分光測定を用いて、脱離してイオン化することができる。任意の好適な気相イオン分光計は、それが基材上のマーカーを分離することができる限り用いられることができる。好ましくは、気相イオン分光計はマーカーを定量することができる。
一実施形態では、気相イオン分光計は質量分析計である。典型的な質量分析計では、その表面上にマーカーを含んでいる基材またはプローブが質量分析計の入口系に注入される。次いで、レーザー、高速原子衝撃、高エネルギープラズマ、エレクトロスプレーイオン化、サーモスプレーイオン化、液体２次イオンＭＳ、電界脱離など脱離源によりマーカーが脱離される。生成された脱離揮発種は、予形成イオンまたはニュートラル（脱着現象の直接的な結果としてイオン化される）からなる。生成されたイオンはイオン光学アセンブリーによって回収され、次いで、質量アナライザーが通過イオンを分散させて分析する。質量アナライザーを出るイオンは検出器によって検出される。次いで、検出器は、検出したイオンの情報を質量対電荷比に翻訳する。マーカーまたは他の物質の存在の検出は一般に、シグナル強度の検出を含む。これは、言い換えると、基材に結合しているマーカーの量および特徴を表すことができる。質量分析計のすべての構成要素（例えば、脱離源、質量分析器、検出器など）は、本願に記載した他の好適な構成要素または本発明の実施形態における当技術分野で周知の他のものと組み合わせることができる。
別の実施形態では、イムノアッセイを用いて、試料中のマーカーを検出して分析することができる。この方法は、（ａ）マーカーに特異的に結合する抗体を提供する工程と、（ｂ）試料を抗体と接触させる工程と、（ｃ）試料中のマーカーに結合している抗体の複合体の存在を検出する工程とを備える。
マーカーに特異的に結合する抗体の調製には、精製マーカーまたはそれらの核酸配列を用いることができる。マーカーに関する核酸およびアミノ酸配列を、これらのマーカーをさらなる特性決定により取得することができる。例えば、各マーカーは、多数の酵素（例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）でマッピングされたペプチドでもよい。各マーカーからの消化断片の分子量は、様々な酵素により生成された消化断片の分子量とマッチする配列について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースなどのデータベースを検索するのに用いられることができる。この方法を用いると、他のマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、それらのマーカーがデータベース中の公知のタンパク質である場合、同定されることができる。
あるいは、本タンパク質を、タンパク質ラダーシーケンシングを用いてシークエンスすることができる。タンパク質ラダーを、例えば、分子を断片化し、断片を酵素消化に供することにより、または断片の末端から単一アミノ酸を連続して除去する別の方法により得ることができる。タンパク質ラダーの調製法は、例えば、国際公開公報第９３／２４８３４パンフレット（チェイトら（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．））および米国特許第５７９２６６４号明細書（チェイトら（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．））に記載されている。次いで、ラダーを質量分析により分析する。ラダー断片の質量における差異から分子末端から除去したアミノ酸を同定する。
マーカーがデータベース中の公知のタンパク質でない場合、核酸およびアミノ酸配列を、マーカーのアミノ酸配列の一部の情報により決定することができる。例えば、縮重プローブを、マーカーのＮ末端アミノ酸配列に基づいて作製することができる。次いで、これらのプローブを用いて、マーカーが最初に検出された試料から作製したゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。陽性クローンを同定、増幅することができ、それらの組換え型ＤＮＡ配列を、周知の技術を用いてサブクローニングすることができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（オーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）、グリーンパブリッシングアソーシエーション アンド ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、（サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、２００１年）を参照されたい。
精製マーカーまたはそれらの核酸配列を用いて、マーカーに特異的に結合する抗体を当技術分野で周知の任意の好適な方法を使用して調製することができる。例えば、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）；ならびに、コーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５〜４９７ページ、（１９７５年）を参照されたい。かかる技術としては、これらに限定されるものではないが、ファージまたは類似ベクター中の組換え型抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製、ならびに、ウサギまたはマウスの免疫化によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製が挙げられる（例えば、ヒューズら（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５〜１２８１ページ、（１９８９年）；ワードら（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：５４４〜５４６ページ、（１９８９年）を参照されたい）。
抗体が提供された後、マーカーを、当技術分野で周知の任意の好適な免疫学的結合アッセイを用いて検出および／または定量することができる（例えば、米国特許第４３６６２４１号明細書；同第４３７６１１０号明細書；同第４５１７２８８号明細書；および同第４８３７１６８号明細書を参照されたい）。有用なアッセイとしては、例えば、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイまたはスロットブロットアッセイが挙げられる。またこれらの方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３７巻（アサイ（Ａｓａｉ）編、１９９３年）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（スタイツおよびテア（Ｓｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ）編、第７版、１９９１年）；ならびにハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）（上掲）に記載されている。
一般に、被験体から得られた試料を、マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることができる。場合により、抗体を試料と接触させる前に、抗体を固相支持体に固定し、複合体の洗浄とその後の単離を促進させることができる。固相支持体の例としては、例えば、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズなどの形態のガラスまたはプラスチックが挙げられる。また抗体を、プローブ基材またはマイクロチップアレイに付着させることができる。好ましくは、試料は被験体から得られた体液試料である。体液試料の例としては、脳脊髄液、血液、血清、血漿、ニューロン細胞、組織、尿、涙、唾液などが挙げられる。好ましい実施形態では、体液は脳脊髄液を含む。試料を抗体に接触させる前に、試料を好適な溶離剤で希釈することができる。
試料を抗体とともにインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成された抗体マーカー複合体を検出することができる。これは、洗浄混合物を検出試薬とインキュベートすることにより達成することができる。この検出試薬は、例えば、検出可能な標識で標識化した２次抗体でもよい。具体的かつ検出可能な標識としては、マグネティックビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光染料、放射標識、酵素（例えば、西洋ワサビパーオキシド、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用されている他の酵素）、ならびに、コロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズなどの比色標識が挙げられる。あるいは、試料中のマーカーを、間接測定法（この場合、例えば、第２の標識抗体を用いて結合マーカー−特異抗体を検出する）を用いて検出することができ、かつ／あるいは競合アッセイまたは阻害アッセイ（この場合、例えば、マーカーの異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体を同時に混合物とインキュベートする）において検出することができる。
アッセイ中、試薬の各組合せの後には、インキュベーションおよび／または洗浄工程が必要とされる場合がある。インキュベーション工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間まで変えることができる。しかし、インキュベーション時間は、アッセイフォーマット、マーカー、溶液容量、濃度等によって決まる。通常、アッセイは室温で実施されるが、１０℃〜４０℃などの一連の温度範囲で実施されることができる。
イムノアッセイは、試料中のマーカーの存在または不在、および試料中のマーカーの量を測定するのに使用されることができる。まず、試料中のマーカーの試験量を上述のイムノアッセイ法を用いて検出することができる。マーカーが試料中に存在する場合、上述の好適なインキュベーション条件下で、マーカーに特異的に結合する抗体と抗体−マーカー複合体を形成する。抗体−マーカー複合体の量は、基準と比較することにより測定可能である。基準は、例えば、既知の化合物または試料中に存在することが知られている別のタンパク質でもよい。上述のように、測定単位を対照と比較することができる限り、マーカーの試験量を絶対単位で測定する必要はない。
試料中のこれらのマーカーの検出方法には多数の用途がある。例えば、一種または複数のマーカーを、脊髄損傷、脳損傷、ニューロン障害、アルコールおよび薬物乱用による損傷、腫瘍の程度、妊娠している母親によるアルコールおよび／または薬物乱用による胎児損傷の程度などの診断を補助するために測定することができる。別の例では、本マーカーの検出方法を、治療に対する被験体の応答をモニターするために用いることができる。別の例では、本マーカーの検出方法を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてこれらのマーカーの発現をモジュレートする化合物についてアッセイし、かつ化合物を同定するために用いることができる。
マーカーの脱離および検出により得られたデータを、任意の好適な手段を用いて分析することができる。一実施形態では、プログラム可能なデジタルコンピュータを使用してデータを分析する。コンピュータプログラムは一般に、コードを保管している可読媒体を含有している。特定のコードは、プローブ上の各特徴の位置、その特徴における吸着剤の特性、および吸着剤を洗浄するために使用する溶離条件が組み込まれているメモリーに供されることができる。またコンピュータは、インプットとして、プローブ上の特定のアドレス可能位置から受け取った様々な分子量のシグナル強度に関するデータを受け取るコードを有している。このデータは、各マーカーにより生じたシグナル強度をはじめとする、検出したマーカーの数値を示すことができる。
データ分析は、検出されたマーカーのシグナル強度（例えば、ピークの高さ）を測定する工程と、「外れ値」（所定の統計的分布に反するデータ）を除く工程とを含むことができる。観測されたピークを標準化することができるが、この工程により、いくつかのレファレンスに対する各ピークの高さが算出される。例えば、レファレンスは、目盛りで０として設定される、機器および化学物質（例えばエネルギー吸収分子）により生じたバックグラウンドノイズである可能性がある。次いで、各マーカーまたは他の生体分子について検出したシグナル強度を、所望の尺度での相対強度の形で示すことができる（例えば１００）。あるいは、基準（例えばＣＳＦタンパク質）を、基準から得たピークをレファレンスとして用いて、検出した各マーカーまたは他のマーカーについて観測したシグナルの相対強度が算出できるように、試料と一緒に加えることができる。
コンピュータは、表示用に、得られたデータを様々なフォーマットに変換することができる。あるフォーマットでは、「スペクトル画像または担持物質（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）マップ」と呼ばれる、基準スペクトル画像を表示することができるが、この場合、画像は、個々の特定の分子量で検出器に達しているマーカーの量を表す。別のフォーマットでは、「ピークマップ」と呼ばれ、ピークの高さと質量の情報のみがスペクトル画像から保持され、より鮮明な画像が得られるとともに、ほぼ同一の分子量を有するマーカーをより容易に確認できるようになる。さらに別のフォーマットでは、「ゲル画像」と呼ばれ、ピーク画像からの各質量を各ピークの高さに基づいた濃淡画像に変換することができ、その結果、電気泳動ゲル上のバンドに似た画面が得られる。さらに別のフォーマットでは、「３Ｄオーバーレイ」と呼ばれ、相対的なピーク高さの微妙な変化を研究するために数種類のスペクトルをオーバーレイすることができる。さらに別のフォーマットでは、「差異マップ画像」と呼ばれ、好適には、特異なマーカーおよび試料間でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるマーカーを強調して、２つ以上のスペクトルを比較することができる。任意の２種類の試料から得たマーカープロファイル（スペクトル）を目視により比較することができる。さらに別のフォーマットでは、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔを用いることができるが、この場合、検出されるマーカーをプロットでドットとして表示する（この場合、プロットの軸の１つが検出したマーカーの見掛けの分子量を表し、別の軸が検出したマーカーのシグナル強度を表す）。各試料については、検出されるマーカーおよび試料中に存在するマーカーの量はコンピュータの可読媒体に保存することができる。次いで、このデータを、対照（例えば、対照（例えば、腫瘍の検出が不可能な正常で健康な被験体）で検出されたマーカーのプロファイルまたは量）と比較することができる。
癌の診断
別の態様では、本発明は、一種または複数のマーカーを用いて、ヒト腫瘍および／または腫瘍障害の診断を補助する方法を提供する。例えば、Ｅｐｈ受容体、Ｅｐｈ受容体関連タンパク質、そのペプチド、断片および誘導体、ならびに、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種からなるエフリン分子である。これらのマーカーを単独で用いてもよく、あるいは、任意の一組として他のマーカーと組み合わせて用いることもできる（例えば、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２＋）。多数の腫瘍抗原が当技術分野で周知である。例えば、バン デン アインデ ビージェイ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ＢＪ）、バン デル ブルゲン ピー（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ．）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７年；９巻：６８４〜９３ページ；ハウフトン エーエヌ（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ＡＮ）、ガルト ジェイエス（Ｇｏｌｄ ＪＳ）、ブルゲン エヌイー（Ｂｌａｃｈｅｒｅ ＮＥ．）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１年；１３巻：１３４〜１４０ページ；バン デル ブルゲン ピー（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ）、チャン ワイ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）、ショー ピー（Ｃｈａｕｘ Ｐ）、シュトルーバン ブイ（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ Ｖ）、パニケリ シー（Ｐａｎｉｃｈｅｌｌｉ Ｃ）、シュルツ イーエス（Ｓｃｈｕｌｔｚ ＥＳ）、シャピロ ジェイ（Ｃｈａｐｉｒｏ Ｊ）、バン デン アインデ ビージェイ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ＢＪ）、ブラスール エフ（Ｂｒａｓｓｅｕｒ Ｆ）、ブーン ティー（Ｂｏｏｎ Ｔ．）、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２００２年；１８８巻：５１〜６４ページ（これらを本願に援用する）を参照されたい。あるいは、腫瘍抗原に対する多数の抗体が市販されている。
腫瘍抗原の例としては、これらに限定されるものではないが、突然変異による腫瘍抗原、例えば、α−アクチニン−４（肺癌）；ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）（慢性骨髄白血病）；ＣＡＳＰ−８（頭部および頚部扁平上皮癌）；β−カテニン（黒色腫）；Ｃｄｃ２７（黒色腫）；ＣＤＫ４（黒色腫）；ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質（骨髄性白血病）；伸長因子２（肺扁平上皮癌）；ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質（急性リンパ芽球性白血病）；ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質（黒色腫）；ＨＬＡ−Ａ２ｄの過剰発現（腎細胞癌）；ｈｓｐ７０−２（腎細胞癌）；ＫＩＡＡＯ２０５（膀胱癌）；ＭＡＲＴ２（黒色腫）；ＭＵＭ−１ｆ（黒色腫）；ＭＵＭ−２（黒色腫）；ＭＵＭ−３（黒色腫）；ｎｅｏ−ＰＡＰ（黒色腫）；ミオシンクラスＩ（黒色腫）；ＯＳ−９ｇ；（黒色腫）；ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質（前骨髄細胞白血病）；ＰＴＰＲＫ（黒色腫）；Ｋ−ｒａｓ（膵臓腺癌）；Ｎ−ｒａｓ（黒色腫）が挙げられる。分化腫瘍抗原の例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＥＡ（腸癌）；ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７（黒色腫）；カリクレイン４（前立腺）；γグロブリン−Ａ（乳癌）；Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（黒色腫）；ＰＳＡ（前立腺癌）；ＴＲＰ−１／ｇｐ７５（黒色腫）；ＴＲＰ−２（黒色腫）；チロシナーゼ（黒色腫）が挙げられる。過剰発現腫瘍抗原または低発現腫瘍抗原としては、これらに限定されるものではないが、ＣＰＳＦ（偏在）；ＥｐｈＡ３；Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ（胃、肝臓、膵臓）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；腸管カルボキシルエステラーゼ（肝臓、腸、腎臓）；α−フェトプロテイン（肝臓）；Ｍ−ＣＳＦ（肝臓、腎臓）；ＭＵＣｌ（腺上皮）；ｐ５３（偏在）；ＰＲＡＭＥ（精巣、卵巣、子宮内膜、副腎）；ＰＳＭＡ（前立腺、ＣＮＳ、肝臓）；ＲＡＧＥ−１（網膜）；ＲＵ２ＡＳ（精巣、腎臓、膀胱）；スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（偏在）；テロメラーゼ（精巣、胸腺、骨髄、リンパ節）；ＷＴ１（精巣、卵巣、骨髄、脾臓）；ＣＡ１２５（卵巣）が挙げられる。
Ｅｐｈバイオマーカーは、ヒト患者（例えば、ＧＢＭ罹患患者などの癌患者）および腫瘍の検出が不可能な正常被験体の試料中に差異的に存在している。例えば、一部のマーカーは、正常被験体と比べた場合、腫瘍および／または癌関連疾患に罹患しているヒト患者では高レベルで発現され、かつ／または高頻度で存在する。したがって、ヒトにおけるこれらの一種または複数のマーカーの検出は、ヒトが腫瘍および／または癌関連疾患に罹患している可能性に関する有用な情報を提供する。
本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト）で治療、予防、および／または診断することができる他の疾患としては、これらに限定されるものではないが、神経系損傷、ならびに、軸索切断、ニューロンの減少もしくは退化、または脱髄などを起こす疾患、障害および／または状態が挙げられる。本発明に従って患者（ヒトおよび非ヒト哺乳動物の患者を含む）で治療、予防および／または診断され得る神経系病変としては、これらに限定されるものではないが、中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の病変が挙げられる：（１）虚血性損傷、この場合、神経系の一部における酸素の欠乏でニューロンの損傷または死滅が起こり、これには、脳梗塞または脳虚血、または脊髄梗塞または、脊髄乏血が含まれる；（２）外傷性損傷、これには、人身事故によって生じた損傷、または外科手術（例えば、神経系の一部を切断する損傷）または圧迫傷に伴う損傷が含まれる；（３）悪性病変、この場合、神経系の一部が、神経系関連の悪性腫瘍または非神経系組織由来の悪性腫瘍のいずれかの悪性組織によって破壊または損傷されている；（４）感染性損傷、この場合、神経系の一部が、例えば、膿瘍による感染、あるいは、ヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹もしくは単純ヘルペスウイルス、またはライム病、結核、梅毒による感染の結果、破壊または損傷されている；（５）変性病変、この場合、神経系の一部が、これらに限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に随伴する変性をはじめとする、変性過程の結果、破壊または損傷されている；（６）栄養性疾患、障害および／または症状に随伴した病変、この場合、神経系の一部が、これらに限定されるものではないが、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、タバコアルコール性弱視、マルキアファーヴァービニャーミ病（脳梁の１次変性）およびアルコール中毒性小脳変性をはじめとする、栄養障害または代謝障害によって破壊または損傷している；（７）これらに限定されるものではないが、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺）、全身性紅斑性狼瘡、癌腫またはサルコイドーシスをはじめとする、全身性疾患に随伴する神経障害；（８）アルコール、鉛、特に神経毒をはじめとする、毒性物質によって生じた病変；および（９）脱髄病変、この場合、神経系の一部が、これらに限定されるものではないが、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルスに随伴する脊髄障害、横断脊髄障害または様々な病因、進行性多病巣性白質脳症、および橋中央ミエリン溶解をはじめとする、脱髄疾患によって破壊または損傷している。
したがって、本発明の実施形態は、（ａ）試料中の少なくとも一種のマーカーを検出する工程であって、該マーカーは、Ｅｐｈ受容体、Ｅｐｈ関連受容体、そのペプチド、断片および誘導体のいずれか一種から選択される工程と、（ｂ）一種または複数のマーカーの検出をヒトの腫瘍および／または癌関連疾患の可能性の高い診断と相関させる工程とを備える、ヒトの腫瘍および／または癌関連疾患の診断方法を含んでいる。相関は、（例えば、ヒト腫瘍が検出不可能な正常被験体における）対照の一種または複数のマーカーの量（一種または複数のマーカーのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）と比較した場合の試料中の一種または複数のマーカーの量を考慮に入れることができる。相関は、試験試料中のマーカーの存在または不在、および対照中の同一マーカーの検出頻度を考慮に入れることができる。相関は、被験体に腫瘍があるかどうかの決定を容易にするかかる要因、腫瘍の重症度、および損傷の細胞下の位置を考慮に入れてもよく、入れなくてもよい。
好適なすべての試料を、マーカーを検出するために被験体から取得することができる。好ましくは、試料は、被験体の血液試料および／または脳脊髄液試料である。所望であれば、マーカーの検出力を向上させるために、上述のようにして試料を調製することができる。例えば、マーカーの検出力を向上させるには、好ましくは、被験体の血清試料を、例えば、シバクロンブルーアガロースクロマトグラフィーおよび一本鎖ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等により分画することができる。前分画プロトコルなどの試料調製は任意であり、用いる検出方法によってはマーカーの検出力の向上に必要でない場合がある。例えば、マーカーに特異的に結合する抗体を試料中のマーカーの存在の検出に用いる場合、試料調製は不要となる可能性がある。
試料中の一種または複数のマーカーの検出に、好適なすべての方法を用いることができる。例えば、イムノアッセイまたは気相イオン分光測定を上述のように用いることができる。これらの方法を用いると、一種または複数のマーカーを検出することができる。好ましくは、試料は、複数のマーカーの存在について試験する。複数のマーカーの存在の検出は、単一マーカー単独の場合よりも、診断医により多くの情報を提供する。特に、試料中の複数のマーカーの検出は、真陽性と真陰性の診断率を向上させ、偽陽性または偽陰性の診断率を低下させる。
次いで、一種または複数のマーカーの検出を、腫瘍および／または癌関連疾患の可能性の高い診断と相関させる。一部の実施形態では、マーカーの量を定量しない、マーカーの単なる存在または不在の検出は有用であり、腫瘍および／または癌関連疾患の可能性の高い診断と相関させることができる。例えば、腫瘍タンパク質、その断片または誘導体（例えば、Ｅｐｈ２Ａなど）は、正常被験体に比べると癌患者で検出できる場合が多い。
他の実施形態では、マーカーの検出は、マーカーの検出を腫瘍の可能性の高い診断、腫瘍重症度、腫瘍障害の診断等と相関させるために、マーカーを定量することを含むことができる。したがって、試験している被験体で検出されたマーカーの量が対照の量と比べて高い場合、試験している被験体は腫瘍がある可能性が高い。
同様に、別の実施形態では、マーカーの検出は、マーカーが正常な被験体の血清試料よりも患者のＣＳＦまたは血清試料中に少量で存在する場合に、マーカーの検出を、腫瘍の可能性の高い診断、腫瘍重症度等と相関させるために、マーカーを定量することをさらに含むことができる。したがって、試験している被験体で検出されたマーカーの量が対照の量に比べて低い場合、試験している被験体は腫瘍がある可能性が高い。
マーカーを定量する場合、マーカーを対照と比較することができる。対照は、例えば、腫瘍が検出不可能である正常被験体の比較可能な試料中に存在するマーカーの平均値または中央値でもよい。対照量を、試験量を測定する場合と同じまたは実質的に同様な実験条件下で測定する。例えば、試験試料を被験体の脳脊髄液および／または血清試料から得て、マーカーを特定のプローブを用いて検出する場合、その後、マーカーの対照量を同じプローブを用いて患者の血清試料から測定することが好ましい。マーカーの対照量を、腫瘍および／またはニューロン障害に罹患していない正常被験体から得た多数の試料に応じて、それがその群におけるマーカー量の変化を反映するように測定することが好ましい。
次いで、質量分析によって得られたデータを、コンピュータソフトウェアにより分析することができる。ソフトウェアは、質量分析計からのシグナルをコンピュータの読取り可能な形態に変換するコードを含むことができる。またソフトウェアは、シグナルが本発明のマーカーに対応するシグナル中の「ピーク」を表すか、他の有用なマーカーを表すかどうかを測定するシグナル分析にアルゴリズムを適用するコードを含むことができる。またソフトウェアは、試験試料からのシグナルを「正常」およびヒト腫瘍の典型的なシグナル特性と比較するアルゴリズムを実施し、２つのシグナル間の適合の近さを測定するコードを含むことができる。またソフトウェアは、試験試料がどれに近いかを示し、それにより可能性の高い診断を提供するコードを含むことができる。
腫瘍バイオマーカーを検出するための抗体の産生
Ｅｐｈ＋腫瘍等に罹患している患者の試料から得られた腫瘍バイオマーカーを、上述のようにして調製することができる。さらに、腫瘍バイオマーカーに酵素消化を行い、ペプチド対全タンパク質に存在し得る異なる抗原エピトープに対する抗体を産生するためのバイオマーカーの断片またはペプチドを得ることができる。抗原エピトープは、例えば、特異的にエピトープに結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）の産生に有用である。抗原エピトープを、イムノアッセイで標的分子として用いることができる。（例えば、ウィルソンら（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ ３７巻：７６７〜７７８ページ（１９８４年）；サトクリフら（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９巻：６６０〜６６６ページ（１９８３年）を参照されたい）。
腫瘍バイオマーカーエピトープを、例えば、当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するのに用いることができる。（例えば、サトクリフら（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．）、上掲；ウィルソンら（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、上掲；チャウら（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２巻：９１０〜９１４ページ；および、ビットルら（Ｂｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻：２３４７〜２３５４ページ（１９８５年）を参照されたい。）一種または複数の免疫原性エピトープを含んでいる腫瘍ポリペプチドは、動物系（ウサギまたはマウスなど）に担体タンパク質（アルブミンなど）とともに抗体応答を引き出すために提供することができるか、ポリペプチドが十分な長さ（少なくとも約２５個のアミノ酸）である場合には、ポリペプチドを担体なしで提供することができる。しかし、８〜１０個のわずかなアミノ酸からなる免疫原性エピトープは、（例えばウェスタンブロッティングにおいて）変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに（少なくとも）結合可能な抗体を産生するのに十分であることが明らかとなっている。
本発明のエピトープを有するポリペプチドを、これらに限定されるものではないが、ｉｎ ｖｉｖｏにおおける免疫化、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫化、およびファージディスプレイ法をはじめとする、当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するのに用いることができる。例えば、サトクリフら（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．）、上掲；ウィルソンら（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、上掲、およびビットルら（Ｂｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２３４７〜２３５４ページ（１９８５年）を参照されたい。ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫化を用いる場合、動物を遊離ペプチドで免疫化することができる。しかし、抗ペプチド抗体価は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドなどの巨大分子担体にペプチドを結合することにより追加免疫することができる。例えば、システイン残基を含有しているペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）などのリンカーを用いて担体に結合させることができるが、他のペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的なカップリング剤を用いて担体に結合させることができる。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は、例えば、ペプチドまたは担体タンパク質約１００μｇ、フロイントアジュバントまたは免疫応答の刺激に関して周知の他のアジュバントを含有するエマルジョンを腹膜腔内注射および／または皮内注射することにより、遊離ペプチドまたは担体結合ペプチドで免疫化する。例えば、固体表面に吸着されている遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能な、抗ペプチド抗体の有用な力価を得るには、数種類のブースター注射が、例えば約２週の間隔で、必要であるかもしれない。免疫動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当技術分野で周知の方法に従って固相支持体上へペプチドを吸着させ、選択した抗体を溶離させることにより、高めることができる。
また核酸腫瘍バイオマーカーエピトープは、発現ポリペプチドの検出および精製を補助するため、エピトープタグ（例えば、ヘムアグルチニン（「ＨＡ」）タグまたはフラグタグ）として対象の遺伝子と再結合させることができる。例えば、ヤンクネヒトら（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．）によって記載されている系では、ヒト細胞系で発現した未変性融合タンパク質を容易に精製することができる（ヤンクネヒトら（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．）、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：８９７２〜８９７ページ）。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合するように、対象の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドへサブクローニングする。タグは、融合タンパク質においてマトリックス結合ドメインとして機能する。組換え型ワクシニアウイルスで感染させた細胞の抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸アガロースカラムに充填し、イミダゾールを含むバッファーでヒスチジンタグタンパク質を選択的に溶出させることができる。
本発明の抗体を、当技術分野で周知の任意の好適な方法により産生することができる。本発明の抗体はポリクローナル抗体を含むことができる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に周知である（ハーローら（Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、第２版（１９８８年）、これを本願に援用する）。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導するため、これらに限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどの様々な宿主動物に投与されることができる。本発明のポリペプチドの投与は、免疫剤の一種または複数の注射剤を必要とし、所望によりアジュバントが必要である。種々のアジュバントを、宿主種に応じて免疫応答を高めるために用いることができるが、これには、これに限定するものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全アジュバント）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル剤、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルブムなどの有用な可能性のあるヒトアジュバントが挙げられる。また、かかるアジュバントも当技術分野で周知である。本発明において、「免疫剤」とは、本発明のポリペプチド（その断片、変異体および／または誘導体を含む）として、さらに、本願に記載され得るような異種ポリペプチドおよび他の形態のポリペプチドとの融合物として定義されることができる。
一般に、免疫剤および／またはアジュバントは、頻回皮下注射または腹膜腔内注射によって哺乳動物に注射されるが、筋肉内投与またはＬＶ投与を行うこともできる。免疫剤は、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質または変異体を含むことができる。ポリペプチドの性質（すなわち、疎水率、親水率、安定性、総電荷、等電点など）に応じて、免疫化する哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質へ免疫剤を結合させることは有用である場合がある。かかる結合には、共有結合が形成されるように活性のある化学官能基を本発明のポリペプチドおよび免疫原性タンパク質の双方に誘導することによる化学結合、または融合タンパク質に基づく方法もしくは当業者に周知の他の方法による化学的結合が含まれる。かかる免疫原性タンパク質の例としては、これらに限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられる。様々なアジュバントを、宿主種に応じて免疫応答を高めるために用いることができるが、これには、これに限定するものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全アジュバント）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル剤、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルブムなどの有用性のあるヒトアジュバントが挙げられる。使用可能なアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピッドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート）が挙げられる。免疫化プロトコルは、当業者により不要な試験を行うことなく選択されることができる。
また本発明の抗体は、モノクローナル抗体も含むことができる。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法、例えば、コーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５ページ（１９７５年）、およびハーローら（Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．）による米国特許第４３７６１１０号明細書、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（コールドフプリングファーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、第２版、（１９８８年）、ハマーリングら（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ社（ニューヨーク州エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）所在、（１９８１年））に記載されているもの、または当業者に周知の他の方法を用いて調製することができる。モノクローナル抗体を産生するのに使用可能な他の方法の例としては、これらに限定するものではないが、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コスボルら（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．）、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４巻：７２ページ；コールら（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０巻：２０２６〜２０３０ページ）、およびＥＢＶハイブリドーマ法（コールら（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、アランアールリスインコーポレイティッド社（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、７７〜９６ページ）が挙げられる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスをはじめとする、すべての免疫グロブリンのクラスでもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養されることができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける高力価のｍＡｂｓの産生が、現在の好ましい産生方法となっている。
ハイブリドーマ法においては一般に、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系を有するマウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫化し、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。
免疫剤には一般に、腫瘍ポリペプチド、その断片または融合タンパク質が含まれる。通常、ヒト起源の細胞を所望の場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を用いるか、あるいは非ヒト哺乳動物起源を所望の場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞を用いる。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、（１９８６年）、５９〜１０３ページ）。不死化細胞系は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスのミエローマ細胞系を用いる。ハイブリドーマ細胞は、非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する一種または複数の物質を好ましくは含有している好適な培地中で培養することができる。例えば、親細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培地は、一般にヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する）を含む（「ＨＡＴ培地」）。
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現をサポートし、ＨＡＴ培地などの培地に対して感度が高いものである。より好ましい不死化細胞系はマウスのミエローマ系であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）所在、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ヴァージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）所在から入手することができる。本願の全体を通して推測されるように、ヒトミエローマ細胞系およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生についてすでに記載されている（コズボル（Ｋｏｚｂｏｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１ページ（１９８４年）；ブローダーら（Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、マルセルデッカーインコーポレイディッド社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、（１９８７年）、５１〜６３ページ）。
次いで、ハイブリドーマ細胞を培養した培地を、本発明の腫瘍ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などにより測定される。かかる技術は当技術分野で、また当業者に周知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えばｔｈｅ Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｔ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０ページ（１９８０年）により測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法方法によりサブクローニングし、標準法（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、前掲）によって増殖させることができる。この目的に好適な培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、哺乳動物内の腹水などｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製法によって、培地または腹水から単離または精製することができる。
当業者は、モノクローナル抗体の産生に多数の技術が当技術分野に存在すること、したがって、本発明がハイブリドーマにおけるそれらの単独産生に限定されるものではないことを理解するであろう。例えば、モノクローナル抗体を、米国特許第４８１６５６７号明細書に記載されているような組換えＤＮＡ法によって調製することができる。本願では、「モノクローナル抗体」という用語は、単一真核生物、ファージ、または原核生物クローン由来の抗体を意味する。本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡを、慣用の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト起源、ヒト化起源、または他の起源由来のかかる鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離、シークエンスすることができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として有用である。単離した後、ＤＮＡは発現ベクターに入れ、次いで、これを宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、それ以外に免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞など）に形質転換し、組換え型宿主細胞でモノクローナル抗体を合成することができる。
ハイブリドーマ技術を用いて特異抗体を産生しスクリーニングする方法は、慣用技術であり、当技術分野で周知である。例としては（これに限定するものではない）、マウスを、バイオマーカーポリペプチドまたはかかるペプチドを発現する細胞で免疫化することができる。免疫応答が検出されたなら（例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されたなら）、マウス脾臓を回収し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を、任意の好適なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０由来の細胞）に周知の技術を用いて融合する。ハイブリドーマを限界希釈により選択し、クローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞に関して当技術分野で周知の方法によりアッセイする。腹水（通常、高濃度の抗体を含有している）を、陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することによりを生成することができる。
したがって、本発明は、モノクローナル抗体の産生方法、ならびに、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程であって、この場合、好ましくは、該ハイブリドーマは、本発明の抗原をミエローマ細胞とともに免疫化したマウスから単離した脾細胞を融合することにより生成する工程と、次いで、本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関して融合物から得られたハイブリドーマをスクリーニングする工程とを備える方法により産生される抗体を提供する。腫瘍バイオマーカー、そのペプチドおよび誘導体を検出する抗体は、イムノアッセイで、および腫瘍の診断、損傷および／または神経系障害の重症度の診断で使用する新規腫瘍バイオマーカーを同定する他の方法で用いられることができる。
また、腫瘍バイオマーカー特異抗体の大規模な産生に他の方法を用いることもできる。例えば、抗体を、当技術分野で周知の様々なファージディスプレイ法を用いて産生することもできる。ファージディスプレイ法では、機能抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。特定の実施形態では、かかるファージは、レパートリーまたは組合せ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するのに利用されることができる。対象の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、抗原を用いて（例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されている抗原を用いて）、選択、同定されることができる。これらの方法で用いられるファージは一般に線状ファージであり、これには、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されているジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含むファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインが含まれる。本発明の抗体の作製に使用可能なファージディスプレイ法の例としては、ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２巻：４１〜５０ページ（１９９５年）；エイムズら（Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４巻：１７７〜１８６ページ（１９９５年）；ケットルボルフら（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４巻：９５２〜９５８ページ（１９９４年）；ペルシコら（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｅ １８７巻、９〜１８ページ（１９９７年）；バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７巻：１９１〜２８０ページ（１９９４年）；ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開公報第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開公報第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開公報第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開公報第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開公報第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開公報第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開公報第９５／２０４０１号パンフレット；ならびに米国特許第５６９８４２６号明細書；第５２２３４０９号明細書；第５４０３４８４号明細書；第５５８０７１７号明細書；第５４２７９０８号明細書；第５７５０７５３号明細書；第５８２１０４７号明細書；第５５７１６９８号明細書；第５４２７９０８号明細書；第５５１６６３７号明細書；第５７８０２２５号明細書；第５６５８７２７号明細書；第５７３３７４３号明細書および第５９６９１０８号明細書（これらの各文献を本願に援用する）に記載されているものが挙げられる。
本発明の抗体は様々な有用性を有している。例えば、かかる抗体は、試料中の本発明のポリペプチドの存在または量を検出する診断アッセイで用いられることができる。かかる診断アッセイは、少なくとも２工程を含むことができる。第１は、試料を抗体に供する工程（この場合、該試料は、組織（例えばヒト、動物など）、体液（例えば血液、尿、喀痰、精液、羊水、唾液など）、生物学的抽出物（例えば組織、細胞のホモジェネートなど）、タンパク質マイクロチップ（例えば、アレンコフ ピーら（Ａｒｅｎｋｏｖ Ｐ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７８（２）巻：１２３〜１３１ページ（２０００年）を参照されたい）、またはクロマトグラフィーカラムなどである）である。また第２の工程は、基材に結合している抗体の定量を含んでいる。あるいは、本方法は、さらに、抗体を固相支持体に、共有結合で、静電的に、または可逆的に結合させる第１の工程と、本願の上述および他の部分で定義したように、結合抗体を試料に供する第２の工程とを含んでもよい。
様々な診断アッセイ技術は、競合結合測定法、直接または間接サンドイッチアッセイ、および異種相または同種相のいずれかで実施される免疫沈降法など（ゾラ（Ｚｏｌａ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、シーアールシープレスインコーポレイティッド社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、（１９８７年）、ｌ４７〜１５８ページ）などが当技術分野で周知である。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な成分で標識化可能である。検出可能な成分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生産することができなければならない。例えば、検出可能な成分は、放射性同位元素、例えば２Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐもしくは１２５Ｉ、蛍光化合物もしくは化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン、または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどでもよい。検出可能な成分への抗体の結合に関する当技術分野で周知の任意の方法が使用可能であるが、これには、ハンターら（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５ページ（１９６２年）；ダビッドら（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３巻：１０１４ページ（１９７４年）；ペインら（Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４０巻：２１９ページ（１９８１年）；およびニーグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７ページ（１９８２年）により記載されている方法が含まれる。
腫瘍バイオマーカーを発現している核酸配列の同定
本発明の好ましい実施態様は、患者が癌であると診断された場合、遺伝子および／または変異体を同定し、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の作用を関連づけることである。感受性および抵抗性の個体を区別できる遺伝子の同定は、どの核酸配列が個体をＥｐｈに関連した癌に感受性にするかを区別するために重要である。
ＰＣＲによって個体から同定された遺伝子を増幅し、当該技術分野で周知の方法で配列を決定する。次いで、これらの核酸配列を、実施例ならびに材料および方法に記載されたアッセイに用いて、Ｅｐｈ＋腫瘍を有すると同定された遺伝子の配列を関連づける。さらに多くの遺伝子配列および遺伝子配列のアミノ酸配列が同定されるにつれて、Ｅｐｈ２の発現効果と異なる遺伝子配列間の相関が可能となる。
さらに多くの遺伝子またはそれら遺伝子変異体が同定されるにつれて、オリゴヌクレオチド配列あるいはオリゴヌクレオチド配列の断片が作成され、類似の配列を有する遺伝子の精製、分離および検出のプローブとして使用することができる。各々のユニークな核酸が一定の場所に位置してアレイを形成するように、基材表面へ核酸のライブラリーを固定化して、目的の生体分子に結合できる核酸配列を同定することができる。次いで、核酸への生体分子の結合に好適な条件下で、本アレイを生体分子に曝露する。所望の結合特異性レベルにより、穏やかな緩衝液からストリンジェントな緩衝液までの条件を用いて、非特異的に結合した生体分子を洗い流すことができる。次いで、核酸配列を分析して、どの核酸配列が生体分子に結合したかを決定する。生体分子は、結合した核酸の位置の検出に使用する蛍光標識を有することが好ましい。核酸配列の固定化したアレイを用いるアッセイを、未知の核酸の配列決定、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）分析、特定の種、組織、細胞型などからの遺伝子発現パターンの分析、遺伝子の同定その他に用いることができる。次いで、任意の配列は以下に記載されているマクロファージ生存率測定、または何か他の身体的表現型の基準、例えば局在化、ＭＡＰキナーゼ３裂開パターンなどで試験することができる。
個々の遺伝子およびまたはそれらの変異体、ならびにそれらの発現産物の寄与を決定する他の方法。遺伝子またはそれら遺伝子の変異体を分離することができる。任意の遺伝領域を所望の任意の変異に不活化または変更するために、特異的変異を染色体変異体に挿入する標的化相同組み替えを用いる技術を利用できる。相同な変更事象を検出する一つの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いて、相同的な挿入に関して形質転換体細胞のプールをスクリーニングし、次いで個々のクローンをスクリーニングする（キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、第１６巻、８８８７〜８９０３ページ、１９８８年；キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｅ、第１０３巻、２２７〜２３３ページ、１９９１年）。あるいは、相同的な挿入が生じた場合にのみ活性な標識遺伝子が作成され、これらの組換え体を直接選択できる正の遺伝的選択法が開発された（セジビら（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８６巻、２２７〜２３１ページ、１９８９年）。選択相同組換え体選択のために開発された最も一般的な方法の一つは、変更の直接的な選択が存在しない遺伝子に対して開発された、ポジティブネガティブセレクション法（ＰＮＳ）である（マンソウルら（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３３６巻、３４８〜３５２ページ、１９８８年；カペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、１２８８〜１２９２ページ、１９８９年；カペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．第５巻、７０〜７６ページ、１９８９年）。ＰＮＳ法は、標識遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するので、高レベルで発現されない遺伝子を標的にするためにより効率的である。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を用いて、そしてガンシクロビル（ＧＡＮＣ）またはＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル）のようなヘルペス薬剤を使用して、この遺伝子の非相同的な挿入に対する選択により、非相同組換え体が選択される。この対抗選択によって、生存する形質転換体内の相同組換え体の数を増やすことができる。以下に記載されているように、このような形質転換体を表現型と関連づけることができる。
治療用化合物および組成物の候補
これらの方法で、対象を先に述べたように選択し、本発明により同定されたＥｐｈの対立遺伝子変異体または他の遺伝子の属性を試験する。ＥｐｈおよびＥｐｈの対立遺伝子変異体、エフリン（エフリンＡ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、これらの変異体および断片の任意の１つを含む）をコードするポリヌクレオチドを診断に用いることができる。Ｅｐｈレベルを測定するための、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含む種々の手順が当分野において知られており、ＥｐｈまたはＥｐｈにコードされた産物を検出する基礎を提供する。
他の診断法には、種々の方法でのポリヌクレオチドの使用が含まれる。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならびにＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを、Ｅｐｈの発現が癌に対する感受性と相関し得る生検組織で、遺伝子発現を検出し定量化するために使用できる。診断検査法はＥｐｈの欠如、存在および過剰発現を測定し、治療的介入の間のＥｐｈレベルの調節をモニターするために使用することができる。
好ましい実施形態では、腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法は、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋまたはｎｕｋ受容体、そのタンパク質、ペプチド、断片および誘導体のいずれか一種を含む受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、候補治療薬を培養細胞へ投与する工程と、候補治療薬の存在下または不在下における受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較した場合と相関させる工程と、それにより、Ｅｐｈ発現を減少させ、Ｅｐｈ分子を活性化する候補治療薬を同定する工程と、それにより、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える。Ｅｐｈ分子の活性化は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較した場合のチロシン分子のリン酸化によって測定される。活性化またはリン酸化状態を測定するためのリン酸化アッセイは、下記の実施例において記載される。Ｅｐｈの発現は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較される。
診断および候補薬剤の発見のための他の適切な方法には、試験試料をＥｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子の断片、またはＥｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子断片の発現産物と接触させる工程と、試験試料のＥｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子断片、またはＥｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子断片の発現産物との相互作用を検出する工程とが含まれる。試験試料は、哺乳動物組織または液体（例えば血液）試料である。Ｅｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子断片、またはＥｐｈ遺伝子、対立遺伝子もしくは対立遺伝子断片の発現産物は、例えば蛍光または放射性成分で適切に検出可能な程度に標識されることができる。
他の好ましい実施態様においては、エフリン分子は、候補治療化合物の標的リガンドであり、候補治療化合物を同定するために使用される。好ましい実施態様では、腫瘍治療のための候補治療薬を同定する方法は、エフリンＡ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種を含む受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、候補治療薬を培養細胞へ投与する工程と、候補治療薬の存在下または不在下における受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較した場合と相関させる工程と、それにより、Ｅｐｈ発現を減少させ、Ｅｐｈ分子を活性化する候補治療薬を同定する工程と、それにより、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える。候補治療薬を正常細胞および癌細胞に投与し、エフリン分子への結合をアッセイすることが好ましい。例えば、エフリン分子への候補治療薬の結合を正常細胞および癌細胞への前記薬剤の結合と比較するような適切な対照が使用される。エフリン分子に対する結合によるこれらの候補治療薬の作用が、Ｅｐｈ分子の発現および活性化と比較される。ここでは、Ｅｐｈ分子の活性化は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈおよび候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較され、チロシン分子のリン酸化により定量される。Ｅｐｈの発現は、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較されることが好ましい。エフリンに結合する候補治療分子を同定する一つの例が、以下に示す実施例に記載されている。
一つの態様において、Ｅｐｈまたは密接に関連した分子をコードするゲノム配列を含む、ポリヌクレオチド配列を検出できるオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを、Ｅｐｈをコードする核酸配列を同定するために利用することができる。プローブが非常に特異的な領域、例えば５’制御領域から作成されるか、またはあまり特異的でない領域、例えば、保存されたモティーフから作成されるかというプローブの特異性、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーまたは増幅（最大、高、中、または低）により、プローブがただ天然に存在するＥｐｈをコードする配列、対立遺伝子変異体または関連した配列のみを同定するかどうかが決まる。
またプローブは、関連した配列の検出に利用可能であり、好ましくは、Ｅｐｈをコードする配列のいずれかに、少なくとも５０％の配列同一性または相同性を有し、より好ましくは、Ｅｐｈをコードする配列のいずれかに少なくとも約６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセントの配列同一性有するべきである（ＢＬＡＳＴプログラムの利用を含む、上述した配列同一性の決定）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく、本発明の配列またはプロモーター、エンハンサー、およびＥｐｈ遺伝子のイントロンを含むゲノム配列からから由来してもよい。
本願で用いられる「相同的な」とは、２つの重合体分子間、例えば２つのＤＮＡ分子などの２つの核酸分子間または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を意味する。２つの分子の双方のサブユニットの位置が同じ単量体のサブユニットで占められる（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンによって占められる場合）場合には、それらサブユニットはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は、一致しているかまたは相同な位置の数の１次関数である。例えば、２つの化合物の配列の位置１０個中５個が対合しているかまたは相同である場合、２つの配列は、５０％相同であり、１０個中９個が対合しているかまたは相同である場合は、２つの配列は９０％の相同性を有する。一例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’と３’ＴＴＴＣＣＧ５’とは５０％の相同性を有する。
ＥｐｈをコードするＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作成する方法は、ｍＲＮＡプローブ生成のために、ＥｐｈまたはＥｐｈの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローニングする工程を含む。このようなベクターは当分野において知られていて市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼおよび適切な標識したヌクレオチドを添加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために利用することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基、例えば３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性核種、またはアビジン−ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識、蛍光標識、その他によって標識可能である。
Ｅｐｈをコードするポリヌクレオチド配列を、サザン分析またはノーザン分析、ドットブロットまたは他膜ベースの技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック、ピンおよびマルチフォーマットＥＬＩＳＡ様アッセイならびに患者からの体液または組織を利用して、Ｅｐｈの変更した発現を検出するマイクロアレイで利用することができる。ゲルをベースとした移動度シフト分析が使用されてもよい。他の適切な定性的または定量的方法が当分野においてよく知られている。
遺伝子またはそれら遺伝子の変異体の同一性を、当該分野で周知の技術を用いて確認することができる。非限定例には、増幅遺伝子の核酸配列決定、一塩基多型分析（ＳＮＰ）などのハイブリダイゼーション技術、目的の分子がバイオチップ上で固定化されているマイクロアレイが含まれる。重複するｃＤＮＡクローンは、蛍光色素ターミネーターを用いるジデオキシチェーンリアクションおよびＡＢＩ配列決定装置（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）所在）により配列決定されることができる。一つの成分が固定化された任意のタイプのアッセイが、本発明の基質プラットフォームを用いて実施可能である。一つの固定化された成分を利用するバイオアッセイは、当該分野で周知である。一つの固定化された成分を利用するアッセイの例には、例えば免疫測定法、タンパク質間相互作用の分析、タンパク質−核酸相互作用の分析、核酸間相互作用の分析、受容体結合実験、酵素アッセイ、リン酸化アッセイ、疾病状態を判定するための診断アッセイ、薬剤適合性分析のための遺伝プロファイリング、ＳＮＰ検出その他が含まれる。
Ｅｐｈ受容体またはＥｐｈ受容体関連遺伝子とは、遺伝子およびその変異体が生み出すことができる種々のｍＲＮＡ転写物、ならびに明らかにされる可能性のあるさらに任意の遺伝子変異体を含む、遺伝子および現在既知のすべてのそれら遺伝子の変異体を意味する。例示的なＥＰＨ受容体には、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体が含まれる。リガンドには、これらに限定するものでないが、エフリンＡ−１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２およびエフリン−Ｂ３が含まれる。
しかしながら、一般にこのような変異体は、Ｅｐｈの配列に対して、かなりの相同性（配列同一性）を有し、例えば、変異体はＥｐｈの配列に対して、少なくとも約７０パーセントの相同性（配列同一性）を有し、より典型的には、Ｅｐｈの配列に対して、少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または、９９の相同性（配列同一性）を有する。ＢＬＡＳＴプログラムのような多くの標準的技術のいずれかにより、変異体の相同性を定量することができる。
各々のユニークな核酸が一定の場所に位置してアレイを形成するように、基材表面へ核酸のライブラリーを固定化して、目的の生体分子に結合できる核酸配列を同定することができる。次いで、核酸への生体分子の結合に好適な条件下で、本配列を生体分子に曝露する。所望の結合特異性レベルにより、穏やかな緩衝液からストリンジェントな緩衝液までの条件を用いて、非特異的に結合した生体分子を洗い流すことができる。次いで、核酸配列を分析して、どの核酸配列が生体分子に結合したかを決定する。生体分子は、結合した核酸の位置の検出に使用する蛍光標識を有することが好ましい。
核酸配列の固定化したアレイを用いるアッセイは、未知の核酸の配列決定、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）分析、特定の種、組織、細胞型などからの遺伝子発現パターンの分析、遺伝子の同定その他に用いることができる。
Ｅｐｈコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの他の診断用途には、ＰＣＲの使用が含まれてもよい。これらのオリゴマーは、化学的に合成可能であり、酵素的に作成可能であり、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成可能である。オリゴマーは、Ｅｐｈをコードするポリヌクレオチドの断片またはＥｐｈをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド断片を含むことが好ましく、特異的遺伝子の同定に最適な条件下で用いられる。また、オリゴマーは、密接に関連しているＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出または定量のためにストリンジェンシーの低い条件下で使用されてもよい。
高いストリンジェンシー条件が当分野において知られている。例えば、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編を参照のこと、この両方を参考として本願に組入れることとする。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。より長い配列が、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、チジュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」、（１９９３年）に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列に対するする熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的な核酸配列の５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン未満であり、代表的にはｐＨ７．０〜８．３で、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩類）であり、そして温度は、短い核酸配列（例えば１０〜５０のヌクレオチド）については、少なくとも約３０℃であり、そして長い核酸配列（例えば、５０のヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。またストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような脱安定剤の添加により達成可能である。
「ストリンジェントハイブリダイゼーション」という語句は、本願においては、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指すのに使用される。当業者に知られているように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実施し、次いで種々の、しかしより高いストリンジェンシーで洗浄される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーに対する言及は、このような洗浄条件に関するものである。本願で用いられる「中等度のストリンジェントハイブリダイゼーション」という語句は、標的ＤＮＡと約６０％の同一性を有する、好ましくは約７５％の同一性を有する、より好ましくは約８５％の同一性を有する相補的核酸に、標的ＤＮＡの結合を可能にする条件を意味する。標的ＤＮＡと約９０％以上の同一性を有するものが特に好ましい。好ましくは、中等度にストリンジェント条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中で、４２℃でのハイブリダイゼーション後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、６５℃での洗浄に相当する条件である。
「高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という語句は、例えば６５℃で、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが６５℃で、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定でない場合、ハイブリッドは高いストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高いストリンジェンシー条件を、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション後、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、６５℃での洗浄によって得ることができる。
「低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という語句は、１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、４２℃でのハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、５０℃での洗浄に相当する条件を指す。デンハルト溶液およびＳＳＰＥ（サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年を参照）は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に周知である。
さらなる実施態様では、本願に記載されている、Ｅｐｈのマウスまたはヒトポリヌクレオチド配列のいずれかから由来する、オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイで標的として用いることができる。マイクロアレイは、同時に多数の遺伝子および遺伝子転写物の同一性および／または発現レベルをモニターし、ＥｐｈまたはＥｐｈの産物が相互作用する遺伝子を同定するか、および／またはＥｐｈＡ２＋受容体腫瘍感受性を媒介する遺伝子の調節における候補治療薬の有効性を評価するために用いることができる。マイクロアレイを、例えばヒトまたは他の研究対象または臨床患者などの哺乳動物からの生体試料でＥｐｈＡ２腫瘍感受性を媒介する遺伝的変異体、変異、および遺伝子の多型を同定するために、診断検査法で特に有利になるように用いることができる。この情報を、遺伝子機能の判定ならびに治療薬の活性を開発およびモニターするために用いることができる。
他の実施態様においては、本願のポリヌクレオチド配列のいずれかから由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片（非限定的な様式で、ヒト配列を含む）およびそれらに隣接したゲノム配列を、例えばＥｐｈもしくは相同遺伝子群の一塩基遺伝子多型もしくは他の変動もしくは変異または相同遺伝子群、Ｅｐｈの増幅もしくは相同の核酸配列を検出する診断試薬、および核酸配列決定方法に用いる診断試薬として用いることができる。
当該分野で公知の方法を用いて、マイクロアレイを調製、使用、そして分析することができる。（ブレナンら（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、米国特許第５，４７４，７９６号明細書；スキナら（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻、１０６１４〜１０６１９ページ；ボルデスクワイラら（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、国際公開公報第９５／２５１１１６号パンフレット；シャロンら（Ｓｈａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、国際公開公報第９５／３５５０５号パンフレット；ヘラーら（Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９４巻、２１５０〜２１５５ページ、およびヘラーら（Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、米国特許第５，６０５，６６２号明細書を参照）
またＥｐｈに関する発現または活性レベルをも調べることができる。正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取した、体液または細胞抽出物を複合体形成に適切な条件下で、Ｅｐｈに対する抗体と組み合わせることにより、Ｅｐｈ発現に関する正常値または基準値が確立される。標準的複合体の形成量は、種々の方法によって、好ましくは測光手段で定量化可能である。対象、対照および生検組織からの疾病試料で発現するＥｐｈ量を基準値と比較した。標準値と被験者値との偏差からＥｐｈバイオマーカー発現に関するパラメータを確立する。検討したパラメータには、下記および本願を通じて記載されたパラメータが含まれるがそれに限定されない。
候補薬剤は多数の化学物質群を含むが、典型的にはそれらは、小さな有機化合物、オリゴヌクレオチドを含む核酸、およびペプチドを含む有機化合物である。小さな有機化合物は、例えば約４０または５０以上だが約２，５００未満の分子量を適切に有してもよい。候補薬剤は、タンパク質および／またはＤＮＡと相互作用する化学官能基を含んでもよい。
候補薬剤を、合成または天然化合物のライブラリーを含む様々な供給源から得ることができる。例えば様々な有機化合物およびランダム化したオリゴヌクレオチドの形質発現を含む生体分子のランダムなおよび誘導された合成に、多数の方法が利用可能である。あるいは、例えば細菌、菌類および動物の抽出液の形の自然化合物のライブラリーを利用、または容易に生成することができる。
本発明の治療薬アッセイは、適切には動物モデル、細胞に基づく方式および非細胞に基づく方式を含む。
好ましくは、Ｅｐｈ、変異体、断片、もしくは断片のオリゴペプチドを、例えば化合物のライブラリーをスクリーニングして、治療上重要な薬剤を同定するために使用するか、または別の種々の薬物スクリーニングあるいは分析技術のいずれかにより目的の化合物を同定するために使用する。このようなスクリーニングに使用されるＥｐｈ、対立遺伝子、断片、または断片のオリゴペプチドは溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定したものか、細胞表面に付着したものか、または細胞内に定着したものでもよい。Ｅｐｈと試験する薬剤間での結合複合体の形成を測定し、次いで試験することができる。
薬物スクリーニングの他の技術では、目的のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物の高処理能力のスクリーニングを提供する（例えば、ゲイセンら（Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８４年、国際公開公報第８４／０３５６４号パンフレットを参照）。この方法では多数の異なる小さな試験化合物が固体基質上で合成される。試験化合物は、ＥｐｈまたはＥｐｈの断片と反応し、そして洗い流される。次いで、当該技術分野で周知の方法で結合したＥｐｈが検出される。上述した薬物スクリーニング技術で使用のために、精製したＥｐｈはまた、プレート上へ直接コーティング可能である。あるいは非中和性抗体を、ペプチドを捕獲し個体支持体上にペプチドを固定するために使用することができる。
発現ベクター
上記したように、本発明で同定された核酸配列の好ましい用途は、腫瘍を改善する治療法の創出である。Ｅｐｈ受容体およびＥｐｈ−受容体に関連した遺伝子は、野生型、対立遺伝子、変異体、変異または遺伝子の断片をコードするＤＮＡ断片を含むベクターによって発現することができる。またＥｐｈ遺伝子の変異および対立遺伝子は、治療法用ベクターの作成に使用できることが好ましい。Ｅｐｈ２＋を発現する所望の核酸配列を含むベクターは、少なくとも一つのこのような核酸配列を有することが好ましい。あるいは、ベクターは２つ以上のこのような核酸配列または対立遺伝子変異体の組合せを含んでもよい。また、ベクターは異なる対立遺伝子変異体のカセットまたは野生型Ｅｐｈ遺伝子を含むことができる。
Ｅｐｈ受容体の細胞外ドメインの類似性に基づき、およびＥｐｈ受容体の膜結合型のリガンド（エフリン）と相互作用するＥｐｈ受容体の能力に基づき、Ｅｐｈ受容体の１４のメンバーをＡとＢのクラスに分割した。Ｅｐｈ受容体の内因性リガンドが隣接細胞の表面に固着して、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような一般的に可溶性因子を結合する受容体チロシンキナーゼの中で、Ｅｐｈ受容体をユニークなものにしている。
上記したように、細胞間の接触依存的な過程を介する癌の発症間の軸索の誘導に関して、大部分のＥｐｈ受容体は重要な役割を果たしている。しかしながら、通常、ＥｐｈＡ２は成人上皮細胞表面上で、低濃度で発現している。そしてＥｐｈＡ２は細胞間接合部に局在し、そこではほとんど全の受容体が、その受容体のリガンド（エフリンＡ１）と結合している。ＥｐｈＡ２は、結腸癌、乳癌、膵癌を含むいくつかのヒト上皮癌では有意に過剰発現している。癌組織での不安定な細胞間接触が、隣接細胞上のエフリンＡ１と相互作用するＥｐｈＡ２の能力を妨げる。その結果、受容体活性化ならびにエフリンＡ１誘導ＥｐｈＡ２分解が著しく減少する。興味深いことには、これは、ＥｐｈＡ２は著しく活性化されないで、同時に高レベルで過剰発現する悪性細胞における状況を生じる。癌の浸潤性のおよび悪性の表現型の多くが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＥｐｈＡ２の過剰発現と直接相関している。
本発明によれば、Ｅｐｈ遺伝子またはエフリンＡ１をコードするプラスミド上のコード配列が、タンパク質中にあるアミノ酸配列が存在することにより、発現タンパク質の特異的な細胞内局在化を生じるアミノ酸配列をコードするコード配列を提供する。
遺伝子、断片または断片の変異体の個体への導入には、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバントアシストＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルその他の使用が含まれてもよい。ベクターには国際公開公報９３／０４７０１号パンフレットで記載されているような標的部分（例えば細胞表面受容体に対するリガンド）を有する化学的結合体、ならびに核酸結合部分（例えばポリリジン）、ウイルスベクター（例えばＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えばプロタミン）を含む融合タンパク質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（国際公開公報第９５／２２６１８号パンフレット）で記載されているような融合タンパク質、プラスミド、ファージなどが含まれる。ベクターは、染色体性、非染色体性または合成でもよい。
Ｅｐｈおよび／またはエフリンＡ１をコードする好ましい核酸配列は、任意のＥｐｈ受容体およびＥｐｈ受容体のリガンド、およびＥｐｈに対しかなりの配列同一性を有する、例えば任意の１つもしくは複数のＥｐｈの配列に対し少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセントの配列同一性を有する配列を適切に含んでもよい。また改変されたＥｐｈａ２アミノ酸配列をコードする好ましい核酸配列には、正常な条件または高いストリンジェンシー条件下で（すぐ下に定義されているような条件）、任意のＥｐｈ遺伝子およびＥｐｈ遺伝子のリガンド例えば、エフリンＡ１とハイブリッドを形成する配列が含まれる。
好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的結合体が含まれる。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターを、選択した細胞に遺伝子を導入するために選択することができる。このようなベクターには、オルトポックスまたはアビポックスベクターなどの痘ベクター、単純疱疹Ｉウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（ゲラーら（Ｇｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．第６４巻、４８７ページ；リムら（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ディー グロバー（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、オックスフォード大学出版、オックスフォード、イギリス；ゲラーら（Ｇｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻、１１４９ページ）アデノウイルスベクター（レガル ラサルら（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５９巻、９８８ページ；ダビドソンら（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．第３巻、２１９ページ；ヤンら（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６９巻、２００４ページ）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（カプリットら（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．第８巻、１４８ページ）が含まれる。
痘ウイルスベクターは、細胞の細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期的発現のみを生ずる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが、神経細胞に核酸を導入するために好まれる。アデノウイルスベクターの発現期間（約２カ月）はアデノ関連ウイルスの発現期間（約４カ月）より短く、これはＨＳＶベクターよりも短い発現期間となる。ベクターを、標準的技術、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によって導入することができる。遺伝子導入の方法の例には、例えば裸のＤＮＡリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入およびウイルスベクターが含まれる。
基本的に所望の任意の標的細胞を標的にするために、ベクターを用いることができる。例えば定位的注入を用いて、ベクター（例えばアデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に導くことができる。使用できる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口的、腹腔内、および皮下注射、ならびに経口または既知の他の投与経路が含まれる。
他の好ましい方法はＤＮＡ免疫である。ＤＮＡ免疫には、特異的なＥｐｈタンパク質および／またはリガンド（例えばエフリンＡ１）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクターの皮下注射を用いる。ｐＤＮＡ配列は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれる。一旦細胞内に取り込まれると、ＤＮＡがコードするタンパク質が転写されて翻訳される。遺伝子構築物は、選択したＥｐｈ、エフリンＡ１核酸配列をコードする、ヌクレオチド配列を含み、遺伝子発現に必要な制御因子に作動可能に結合された細胞内輸送配列を含むことが好ましい。
細胞に取り込まれたとき、（１つまたは複数の）遺伝子構築物は、機能する染色体外分子としておよび／または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれて、細胞内に依然として存続できる。ＤＮＡは細胞に導入され、１つのプラスミドまたは複数のプラスミドの形態で、別個の遺伝物質として存続することができる。あるいは染色体に組み込むのに可能な線状ＤＮＡが細胞に導入されてもよい。細胞にＤＮＡを導入するとき、染色体へのＤＮＡの組込みを促進する試薬を添加してもよい。また組込み促進に有効なＤＮＡ配列がＤＮＡ分子に含まれていてもよい。あるいはＲＮＡが細胞に投与されてもよい。また動原体、テロメアおよび１つの複製開始点を含む直線状の小染色体として遺伝子構築物を提供することが企図される。遺伝子構築物は、弱毒化した生きた微生物または細胞内に生き続ける組換え型微生物ベクター中の遺伝物質の部分として存続してもよい。遺伝子構築物は、遺伝物質が細胞の染色体に組み込まれるか、または染色体外に存続する組換え型ウイルスワクチンのゲノムの部分でもよい。
遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な制御因子を含む。本因子は１つのプロモーター、１つの開始コドン、１つの終止コドン、および１つのポリアデニル化シグナルを含む。さらに選択した配列（例えば、Ｅｐｈ遺伝子、変異体または変異体の断片）の遺伝子発現に、エンハンサーを必要とする場合がある。これらの因子が、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に結合され、そして、制御因子が、投与された個体で作動可能であることが必要である。
開始コドンおよび終止コドンは、免疫原性の標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分であると一般に考えられている。しかしながら、これらの因子は遺伝子構築物が投与される個体で機能を有することが必要である。開始および終止コドンは、コード配列にインフレームでなければならない。
使用されたプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能を有しなければならない。
本発明を実施するために、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において有用なプロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）のようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーターのようなモロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが含まれるがそれに限定されない。
本発明を実施するための、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるがそれに限定されない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）所在）中のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれる、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。
ＤＮＡ発現のために必要とされる制御因子に加えて、他の因子もまた、ＤＮＡ分子中に含まれてもよい。このような付加的な因子はエンハンサーを含む。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来のエンハンサーのようなウイルスエンハンサーを含む群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
遺伝子構築物は、染色体外で構築物を維持するために哺乳類の複製開始点を有することができ、細胞内に構築物の多数のコピーを生成する。例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）所在）のプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、エプスタインバーウイルス複製開始点および組込みなしで高コピーエピソーム複製を生成する核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
タンパク質産生を最大にするために、構築物が投与される細胞中で遺伝子発現によく適合する制御配列を選択することができる。さらに細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は細胞で機能を有するＤＮＡ構築物を作成することができる。
本発明の方法は、個体の組織に核酸分子を投与するステップを含む。いくつかの好ましい実施態様において、核酸分子は、筋肉内に、鼻腔内に、腹腔内に、皮下に、皮内に、もしくは局所的にまたは膣、直腸、尿道、頬側および舌下からなる群から選択される粘膜組織に対する洗浄液によって投与される。
いくつかの実施態様では、核酸分子は促進剤の投与とともに細胞に送達される。促進剤はまた、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤と呼ばれる。促進剤は、例えば１９９４年１月２６日に出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号および１９９５年３月３０日に出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０４０７１号に記載されており、双方とも本願中に参考として援用される。核酸分子とともに投与される促進剤は、核酸分子との混合物として投与されてもよく、または核酸分子の投与前に、またはその後に、同時に、別々に投与されてもよい。
いくつかの好ましい実施態様において、本発明の遺伝子構築物は、例えば、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタンおよびそれらの塩酸塩（局所麻酔剤群のそれらの塩酸塩等）からなる群から選択される促進剤とともに製剤化されるか、または投与される。促進剤は、遺伝子構築物の前に、同時に、またはその後に投与される。促進剤および遺伝子構築物は同じ組成物中に製剤化されてもよい。
本発明のいくつかの実施例においては、個体は、遺伝子構築物の投与前にまず促進剤の注射をうける。すなわち、例えば遺伝子構築物の投与に先立つ約１週間から１０日までに、個体にまず促進剤が注射される。いくつかの実施態様では、個体に約１日から５日に促進剤が注射され、いくつかの実施態様では、遺伝子構築物の投与の前後の２４時間に促進剤が注射される。あるいは、もし使うのであれば促進剤は遺伝子構築物の投与と同時に、数分前に、または数分後に投与される。したがって促進剤および遺伝子構築物は、単一の医薬品組成物を形成するために組み合わされてもよい。
いくつかの実施態様では、遺伝子構築物は、促進剤なしで、すなわち促進剤を含まない製剤形態で、遺伝子構築が促進剤の投与とともに投与されない投与プロトコルを使用して投与される。
本発明によれば、細胞に送達される核酸分子は、予防的および／または治療的免疫剤として機能するタンパク質の遺伝的な鋳型として働くことができる。好ましい実施態様においては、核酸分子は動物細胞でコード領域の転写および翻訳に必要な制御配列を含む。
Ｅｐｈの関連する腫瘍に対する耐性を付与するために重要な核酸配列をさらに限定するために、本発明はＥｐｈの変異体および／もしくはエフリンＡ１を提供する。加えて選択したＥｐｈタンパク質をコードする核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで変異させて、翻訳、開始および／または終止配列を生成ならびに／または破壊するか、あるいはコード領域での変異を生成し、ならびに／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成もしくは既存のものを破壊して、ｉｎｖｉｔｒｏでのそれ以上の修飾を容易にすることができる。当分野において知られている突然変異誘発のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的変異誘発（ハッチンソンら（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９７８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５３巻、６５５１ページ；ゾラとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）、１９８４年、ＤＮＡ、第３巻、４７９〜４８８ページ；オリファントら（Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．）、１９８６年、Ｇｅｎｅ、第４４巻、１７７ページ；ハッチンソンら（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８３巻、７１０ページ；およびその他）を含むがこれに限定されない任意の技術を用いることができる。ＰＣＲ技術は、部位特異的突然変異誘発ために好ましい（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、１９８９年、「Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ」、ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、エイチ エールリッヒ（Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ）編、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、第６章、６１〜７０ページを参照）。
当業者には周知の種々の方法を用いて、ＥｐｈＡ２＋腫瘍に耐性を付与する核酸配列を発現しおよび作成することができる。例えば、同定して単離した遺伝子を、適切なクローニングベクターに挿入することができる。当分野において知られている多数のベクター−宿主系が使用可能である。可能なベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるがこれらに限定されるものではなく、該ベクター系は、用いた宿主細胞に適合するものでなければならない。ベクターの例には、大腸菌、バクテリオファージ（例えば、ラムダ誘導体）、またはプラスミド（例えばｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体（例えば、ＰＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなど））が含まれるがそれに限定されない。例えば、クローニングベクターへの挿入は、相補的粘着性末端を有するクローニングベクターに、ＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。しかしながら、ＤＮＡの分解に用いた相補的制限酵素認識部位がクローニングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変することができる。あるいは、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することにより、所望の任意の部位を作ることができる。これらの連結リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする化学的に合成された特異的オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔法などを介して宿主細胞に導入され、その結果、該遺伝子配列の多くのコピーが作成可能である。好ましくは、クローニングした遺伝子は、シャトルベクタープラスミド上に含まれ、クローニングした細胞（例えば、大腸菌）中で増殖され、望むならばその後適切な発現細胞系へ挿入するめに、精製を容易にすることが好ましい。例えば、２つ以上の生物種で複製できるベクターであるシャトルベクターは、酵母菌２μプラスミド由来の配列と大腸菌プラスミド由来の配列とを結合して、大腸菌および酵母で複製のために調製可能である。
別の方法では、所望の遺伝子を同定し、「ショットガン」法で、適したクローニングベクターに挿入後、単離することができる。例えば、クローニングベクターへの挿入の前に、サイズ分画、高度反復配列の除去、サブトラクティプハイプリダイゼーションかまたは別の選択的なハイブリダイゼーション、および当分野において知られている他の方法によって、所望の遺伝子を富化することが可能である。
Ｅｐｈタンパク質エフリンＡ１、機能を有する断片、誘導体または誘導体の類似体（それらのキメラタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質のコード配列の転写および翻訳のために必要な因子を含むベクターに挿入することができる。このような因子を本願では「プロモーター」と定義する。したがって、本発明のＥｐｈタンパク質をコードする核酸、または機能を有する断片、誘導体もしくはそれらの類似体は、本発明の発現ベクター中にプロモーターを操作可能に伴っている。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方をクローニングして、そのような制御配列の制御下で発現することができる。また発現ベクターは、複製開始点を含むことが好ましい。必要な転写および翻訳シグナルを、組換え型発現ベクター上に提供することができる。
可能な宿主ベクター系には、ウイルスに感染した哺乳類細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）、ウイルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）、酵母ベクターを含む酵母菌等の微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が含まれるがそれに限定されない。ベクターの発現因子は、因子の強度および特異性で異なる。利用する宿主ベクター系に応じて、多数の適切な転写および翻訳因子のいずれか一種が使用可能である。
本発明の組換え型Ｅｐｈタンパク質は、組換えによるコード配列の組込み後に染色体で発現されてもよい。この点に関しては、多くの増幅系のいずれを使用しても高レベルの安定な遺伝子発現を達成することができる（上述のサムブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、１９８９年を参照）。
Ｅｐｈタンパク質、エフリンＡ１をコードする核酸を含む組換えベクターを有する細胞を、細胞によりＥｐｈタンパク質が発現する条件下で、適切な細胞培養培地で培養する。
ＤＮＡ断片をクローニングベクターへ挿入する以前に記載したいずれかの方法を、適切な転写／翻訳の制御信号およびタンパク質コード配列の遺伝子を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの組換え（遺伝的組換え）が含まれてもよい。
Ｅｐｈタンパク質、エフリンＡ１の発現は、当分野において知られている任意のプロモーター／エンハンサー因子によって制御可能であるが、これらの制御因子は発現のために選択された宿主で機能を有しなければならない。
本発明のＥｐｈタンパク質、エフリンＡ１をコードする核酸を含む発現ベクターを、４つの一般的な方法によって検出または同定することができる。すなわち（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリッド形成、（ｃ）遺伝子機能選択マーカーの有無、および（ｄ）挿入配列の発現である。第１の方法では、核酸をＰＣＲにより増幅し、増幅産物を検出することができるようにする。第２の方法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入された標識遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いて、核酸ハイブリッド形成により検出することができる。第３の方法では、該ベクター中への外来遺伝子の挿入により生じる、ある「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の有無に基づき、組換えベクター／宿主系を同定して選択することができる。他の実施例では、Ｅｐｈタンパク質、エフリンＡ１をコードする核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列中に挿入される場合、Ｅｐｈタンパク質挿入断片を含む組換え型は、Ｅｐｈタンパク質遺伝子機能の喪失により同定可能である。
様々な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明のＤＮＡ配列の発現において用いることができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体のおよび合成のＤＮＡ配列断片から構成されてもよい。適切なベクターには、ＳＶ４０誘導体ならびに既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌のプラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、Ｇｅｎｅ、第６７巻、３１〜４０ページ）、ｐＭＢ９およびその誘導体のＲＰ４などのプラスミド）；ファージＤＮＡ（例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、ならびに他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ））；酵母菌プラスミド（例えば２μプラスミドまたはそれらの誘導体）；真核細胞で有用なベクター（例えば昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクター）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せ由来のベクター（例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するために改変されたプラスミド）；その他が含まれる。
例えば、バキュロウイルス発現系で、非融合転移ベクター、例えばこれらに限定するものでないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング部位；サマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ））、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩクローニング部位；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨ１クローニング部位；サマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ）および（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、とｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青色／白色の組換え型スクリーニング可能；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ならびに融合転移ベクター、例えばこれらに限定するものでないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１認識部位が開始コドンで始まるＢａｍＨ１およびＫｐｎＩクローニング部位；サマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じ、異なる読み枠を有する）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドロン開始コドンの３６塩基対下流のＢａｍＨ１クローニング部位；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１９５））、とｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３つの異なる読み枠、ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を有する、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用の１つのＮ末端のペプチド、およびプラークの青色／白色の組換え型スクリーニング；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（２２０））の両方のベクターを用いることができる。
本発明において使用することが意図されている哺乳類の発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、例えばＤＨＦＲ発現ベクターを有する任意の発現ベクターまたはＤＨＦＲ／メトトレキセート同時増幅ベクター（例えばｐＥＤ（クローニングした遺伝子およびＤＨＦＲを発現するベクターがもつ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位））などの誘導性プロモーターを有するベクターが含まれる。カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６巻、１２ページ（１９９１年）を参照。あるいは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシイミン同時増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ベクターがグルタミン合成酵素およびクローニングされた遺伝子を発現するＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩクローニング部位、セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））。別の実施形態においては、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームの発現を導くベクター、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成的なＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成的なｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択可能マーカー；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、Ｎｈｅｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性のメタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択可能マーカー；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択可能マーカー；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製可能でエンテロキナーゼで切断されるＮ末端のペプチド；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることができる。本発明において使用される選択可能な哺乳類の発現ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８で選択；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８で選択；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））などが含まれる。本発明で用いられるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（上述のカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、１９９１年を参照）には、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌで選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌで選択）、ならびにｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴで選択）が含まれるがそれに限定されない。
また本発明に従って、酵母菌発現系をＥｐｈポリペプチドの発現のために使用することができる。例えば２つの例を挙げると、本発明に従い非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、Ｎ末端のペプチドをＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製し、エンテロキナーゼで切断した；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることができる。
特定の組換えＤＮＡ分子を同定し、単離すると、当分野において知られているいくつかの方法を使用して、該分子を増殖することができる。一旦、適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え型発現ベクターを増殖して、大量に調製することができる。すでに説明したように使用しうる発現ベクターには、少数ながら列挙すると、下記のベクターまたはそれらの誘導体、すなわちヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターが含まれるがそれに限定されない。
本発明のための好ましいベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクターである。
当分野において知られている方法、例えば形質移入、電気穿孔法、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによってベクターを、所望の宿主細胞に導入する（例えば、ウーら（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．）、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻、９６３〜９６７ページ；ウーおよびウー（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ）、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６３巻、１４６２１〜１４６２４ページ；ハートムットら（Ｈａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．）、１９９０年３月１５日申請のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照）。
本発明の好ましい使用方法は、Ｅｐｈ陽性腫瘍を防ぐために哺乳動物を治療することである。上記のように種々の核酸およびアミノ酸配列を、この達成のために使用することができる。本願で用いられる治療的組成物に、例えば上記の任意のウイルス、またはＥｐｈ分子の完全な核酸配列を含むベクター、エフリン分子、変異体およびそれらの断片；Ｅｐｈ分子の改変された核酸配列；エフリン分子、Ｅｐｈ分子の完全なアミノ酸配列、エフリン分子またはそれらの断片；Ｅｐｈ分子の改変されたアミノ酸断片、エフリン分子、または本発明で例示される任意のペプチドを含むことができる。
治療的組成物を適切な担体で導入することができる。例えば、無菌の食塩水または無菌のリン酸緩衝食塩水。
他の好ましい方法は、上記のベクターまたは当該分野で周知の他のベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏで同等に使用に適した細胞または組織にベクターを導入するために用いることである。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し同じ患者に戻す自家移植のために、クローンとして増殖することができる。マクロファージも用いることができる。形質移入、リポゾーム法、またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達を、当分野において良く知られている方法を用いて達成することができる（例えば、ゴールドマンら（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、４６２〜４６６ページを参照）。
上述した任意の治療法を、例えば、家畜などの哺乳動物（例えばヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマ）、イヌ、ネコ、およびウサギなどのペット、好ましくはサルなどの霊長類、ならびに最も好ましくはヒト含むそのような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
動物への組成物の投与
ｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍細胞を標的にする場合には、上記の組成物を、任意の適切な製剤形態で、ヒトを含む動物に投与することができる。例えば、腫瘍細胞を標的にする組成物を、薬剤学的に許容し得る担体または生理食塩水などの希釈液または緩衝塩溶液に入れて製剤することができる。適切な担体および希釈液は、投与方式および経路ならびに標準的な製薬法を基にして選択されることができる。薬剤学的に許容し得る担体および希釈液の例ならびに医薬製剤についての説明は、この分野の標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵＳＰ／ＮＦに示されている。組成物を安定化および／または保存するために、他の物質を組成物に添加してもよい。
本発明の組成物は、任意の従来法によって動物に投与することができる。例えば組成物を内部標的部位もしくは外部標的部位への外科的送達によって、または血管から接近可能な部位へはカテーテルによって標的部位に直接投与することができる。他の送達法、例えばリポソーム送達または組成物を注入した装置からの拡散が当分野において知られている。組成物を単回のボーラス投与、複数回の注射、または例えば静脈内への連続注入の形で投与することができる。非経口投与の場合、発熱物質を含まない滅菌された形で組成物を処方することが好ましい。
製剤形態
抗体または抗体の断片を単独で投与することができるが、医薬製剤として提供する方が好ましい。局所投与用には、０．００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗまでの、例えば製剤形態の１重量％〜２重量％までの活性成分を含むことができる。しかし活性成分は製剤形態の１０％ｗ／ｗまで含むことができるが、製剤形態の５％ｗ／ｗを超えないことが好ましく、製剤形態の０．１％〜１％ｗ／ｗであることがより好ましい。本発明の局所用の製剤形態は、１つの活性成分を１つもしくは複数の許容可能な担体（一種または複数）および場合により任意の他の治療成分（一種または複数）と一緒に含有する。担体（一種または複数）は、製剤形態の他の成分と適合され、その受容者に有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。
局所投与に適した製剤形態には、治療が必要な部位へ皮膚を貫通するのに適した液体または半液体製剤、例えばリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および眼、耳または鼻への投与に適した滴剤を含む。本発明による滴剤は、滅菌した水性または油性溶液または懸濁液から構成されてもよく、殺菌剤および／または殺真菌薬剤および／または他の適切な保存剤を含む、好ましくは界面活性剤を含む適切な水溶液中に活性成分を溶解して調製してもよい。次いで得られた溶液を濾過によって清澄化し、滅菌して、無菌技術により容器に移す。滴剤中に含有するのに適した殺菌剤および殺真菌薬剤の例には、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）およびクロルヘキシジンアセテート（０．０１％）がある。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセリン、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。
本発明のローションは、皮膚または眼への適用に適したものを含む。眼ローションは、所望により殺菌剤を含有してもよい滅菌水溶液からなり、滴剤の調製と類似の方法により調製されることができる。また皮膚に適用されるローションまたはリニメント剤は、またアルコールもしくはアセトンのような乾燥を早めて皮膚を冷却するための薬剤および／または加湿剤、例えばグリセリンまたはヒマシ油もしくは落花生油などの油を含んでいてもよい。
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは、外部適用するための活性成分の半固体の製剤形態である。これらは、微細化または粉末形態の活性成分を単独または水性もしくは非水性流体中、溶液または懸濁液の形態で適当な機械を用いてグリース性または非グリース性基剤と混合することにより調製可能である。基剤は硬質、軟質もしくは流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸のような炭化水素、粘漿剤、アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油、オリーブ油のような天然の起源の油、羊毛脂もしくはその誘導体またはプロピレングリコールもしくはマクロゲルのようなアルコールとともにステアリン酸もしくはオレイン酸のような脂肪酸を含んでもよい。本製剤形態に、任意の適切な界面活性剤、例えばソルビタンエステルもしくはそのポリオキシエチレン誘導体のようなアニオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活性剤を配合してもよい。天然ゴム、セルロース誘導体または珪質土シリカなどの無機物質のような懸濁剤、およびラノリンのような他の成分も含むことができる。
キット
さらに別の態様において、本発明は腫瘍、腫瘍の病期診断などの助けとなるキットを提供し、本キットを本発明のマーカーを検出するために用いることができる。例えばキットを本願に記載の１つもしくは複数の任意のマーカーを検出するために用いることができ、マーカーは患者および健常被験者の試料に示差的に存在する。本発明のキットは多数の用途を有している。例えば対象が、他の腫瘍よりもＧＢＭの方を有しているかまたは診断は陰性であるかを識別するために使用されることでき、したがってニューロン損傷の診断の助けとなる。他の実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルで治療効果を測定するために、１つもしくは複数のマーカーの発現をモジュレートする化合物を同定するために本キットを用いることができる。他の実施例で、キットは１つの組成物またはバイオマーカーのパネルを提供する。例示的ＥＰＨバイオマーカーには、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体が含まれる。リガンドには、エフリンＡ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２およびエフリン−Ｂ３が含まれるがこれに限定されるものではない。
一つの実施態様では、キットは、（ａ）マーカーに特異的に結合する１つの抗体および（ｂ）検出試薬を含む。そのようなキットを上記の材料から調製することができ、そして材料（例えば、抗体、検出試薬、固定化する支持体など）に関する前の部分での記載が、このセクションに完全に適用可能であることから、ここでは繰り返さない。必要に応じて、本キットはさらに前分画スピンカラムを含んでもよい。いくつかの実施態様では、本キットは表示または独立した差込み文書の形で、適切な作動パラメータに関する使用説明書をさらに含んでもよい。
一つのさらなる実施態様で、本発明は本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングするための診断キットを含む。本診断キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実質的に単離した抗体、および抗体へのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の結合を検出する方法を含む。一つの実施態様では、抗体は固体支持体に付着される。特定の実施態様においては、本抗体はモノクローナル抗体でもよい。本キットの検出方法は、第２の標識モノクローナル抗体を含んでもよい。あるいは、またはさらに本検出方法は競合する標識化抗原を含んでもよい。
一つの診断の構成においては、本発明の方法によって得た表面に結合した抗原を有する固相試薬と試験血清を反応させる。試薬に対し特異的抗原抗体結合をさせ、洗浄して未結合血清成分を除去後、固体支持体上に結合した抗原抗体量に比例してリポーターを試薬に結合させるために、試薬をリポーター標識化抗ヒト抗体と反応させる。試薬を再洗浄して未結合の標識化抗体を除去し、反応物に付随するリポーター量を定量する。典型的には、リポーターは適切な蛍光、発光または比色基質の存在下で、固相をインキュベートすることにより検出される酵素である（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）。
上記のアッセイの固体表面は、ポリマーのビーズ、浸漬スティック、９６穴プレートまたは濾材のような固体支持体材料にタンパク質材料を付着する公知の技術により調製される。これらの付着方法には、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着、または固体支持体上の活性化されたカルボキシル基、ヒドロキシル基またはアルデヒド基などの化学反応性基への、通常は遊離アミン群を介するタンパク質の共有結合が一般に含まれる。あるいはストレプトアビジン被覆プレートを、ビオチン化抗原（１つまたは複数）とともに用いることができる。
場合によって、キットは、試験試料を対照情報基準と比較して、試料中に検出されたマーカーの試験量が癌の診断と一致する診断量であるかどうかを定量することができるようにする基準または対照情報および／または患者の治療効果をさらに含んでもよい。
別の実施態様では、キットは（ａ）その上に吸着剤を含み、吸着剤はマーカーを結合するために適切である基質、および（ｂ）吸着剤と試料を接触させることにより、マーカーまたは複数のマーカーを検出するための使用説明書および吸着剤により固定されたマーカーまたは複数のマーカーを検出することを含む。いくつかの実施態様では、キットは、ある溶離剤（ある代替物としてあるいは使用説明書と組み合わせて）または溶離剤を作成するための使用説明書を含んでいてもよく、気相イオンスペクトロメトリー（ｇａｓ ｐｈａｓｅ ｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、吸着剤と溶離剤の組合せによりマーカーの検出を可能にする。そのようなキットを上記の材料から調製でき、これらの材料（例えば、プローブ基質、吸着剤、洗浄液など）に関する前の部分での記載を、このセクションに完全に適用することができることから、ここでは繰り返さない。
別の実施態様においては、本キットは、その上に吸着剤（例えば、吸着剤で機能化されている粒子）を含む第１の基質、およびその上に第１の基質が気相イオンスペクトロメーターに着脱可能にはめ込みうるプローブを形成するために配置可能な第２の基質を含んでもよい。他の実施態様においては、本キットは、基質上に吸着剤とともに着脱可能にはめ込みうるプローブの形で単一の基質を含んでもよい。さらに別の実施態様では、キットは前分画スピンカラムをさらに含んでもよい（例えば、シバクロンブルーアガロースカラム、抗ＨＳＡアガロースカラム、サイズ排除カラム、Ｑ−アニオン交換スピンカラム、１本鎖ＤＮＡカラム、レクチンカラムなど）。
任意選択として、本キットは表示または独立した差込み文書の形で、適切な操作パラメータに関する説明書をさらに含むことができる。例えば本キットは、試料をプローブと接触後の、プローブの洗浄法を使用者に伝える標準説明書を有してもよい。他の実施例で、本キットは試料中のタンパク質の複雑さを減らすために、試料を前分画するための説明書を有してもよい。他の実施例では、本キットは分画または他の過程を自動化する説明書を有してもよい。
下記の実施例は、例示であってそれに限定されるものではない。特定の実施例が提供されるが、上述の説明は例示であり限定するものとしてみなされるべきでない。前述の実施態様の任意の１つもしくは複数の特徴は、任意の様式で本発明の任意の他の実施態様の１つもしくは複数の特徴と組み合わされることができる。さらにまた、本発明の数多くの変形形態が、本願をレビューすれば当業者に明らかになるであろう。このように、本発明の範囲は上述の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して決められるべきであり、その際、これと均等な全範囲を含むものである。
本出願で引用されたすべての出版物および特許文献は、これらの全体がすべての目的に同じ程度で各個々の出版物または特許文献が個々に引用されるように参考として援用される。本願の種々の参照文献の引用により、本出願人はあらゆる特定の文献が本発明に対する「先行技術」であることを認めない。
材料と方法
細胞系および組織
例えばＵ−８７ ＭＧ、ＳＮＢ−１９、Ｕ−２５１ ＭＧおよびＡ−ｌ７２などの細胞系を、アメリカンタイプカルチャーコレクション社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ヴァージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）所在）から得た。Ｇ−４８ａ細胞は、本研究機関で分離した初代ハイグレード星状細胞腫（ＨＧＡ）である。６Ｂ５３−１１細胞は、メイヨークリニック社（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）（ミネソタ州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在）のデビッド ジェイムス（Ｄａｖｉｄ Ｊａｍｅｓ）から戴いたものである。すべての細胞系を適切な培地に増殖させた。
ＧＢＭ腫瘍および正常脳組織を手術室から得て、直ちに凍結した。検査するまで−８０℃に保存した、スライドにマウントしたＧＢＭの１０ミクロン切片を解凍した。切片を解凍後、−２０℃のアセトン中で１０分間固定した。
免疫組織化学および免疫細胞化学
ＧＢＭ細胞系およびヒト外植片細胞を、適切な培地中、滅菌ガラススライド上で一夜増殖させた。スライドをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、−２０℃のアセトン中で２分間固定した。次いでスライドをＰＢＳで２回洗浄し、直ちに使用するかまたは使用するまで−８０℃で保存した。
ウサギポリクローナルＥｐｈＡ２抗体（１：１００）を、サンタクルスバイオテテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（カリフォルニア州サンタクルス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）所在）から購入した。マウスモノクローナルＥｐｈＡ２クローンＤ７抗体を、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入した。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロックした。１次抗体を１．５％ＮＧＳで希釈し、４℃で１夜インキュベートした。スライドをそれぞれ５分間、３回洗浄した。２次抗体は、ヤギ抗ウサギローダミン（１：２００）、ロバ抗ウサギローダミン（１：２００）（両方ともジャックソンイミュウノリサーチラボラトリィ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ウェストグローヴ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）所在から）またはヤギ抗マウス免疫グロブリンＧオレゴングリーン（１：２００）（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在）であった。スライドを、ＰＢＳでそれぞれ５分間、３回洗浄し、ゲルマウント（バイオメディア社（Ｂｉｏｍｅｄｉａ）、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）所在）でマウントした。スライドを、Ｈｏｅｓｃｈｔ Ｎｏ．３３２５８核対比染色剤（Ｈｏｅｓｃｈｔ Ｎｏ．３３２５８ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）（ＤＡＰＩ）で対比染色した。
すべての場合、顕微鏡写真を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎカメラで油浸レンズを用いて６３×倍率で撮影した。バックグラウンドを、１次抗体なしの試料に標準化した。画像は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０ＬＥで加工処理した。
ウェスタンブロット
細胞溶解物を、準密集培養（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から調製した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。凍結している間に非悪性腫瘍の脳およびＧＢＭ腫瘍組織を小片に細かく切り刻み、哺乳動物のプロテアーゼ阻害剤反応混液を用いてＲＩＰＡ緩衝液中で解凍した。溶解物を１８ゲージの針に通すことによりＤＮＡを剪断した。ＰＭＳＦを添加し、氷上で３０〜６０分間インキュベートした。不溶性残渣を、１０，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、上清を採取し、使用するまで−８０℃で保存した。また正常ヒト脳溶解物を、ケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州テメクラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）所在）およびクロンテクラボラトリー社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）所在）から購入した。溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに展開した。タンパク質をＰＶＤＦ膜へ移し、ｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳプラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で作成した５％粉ミルク）を用いて、少なくとも１時間ブロックした。振盪しながら４℃で一夜、ｂｌｏｔｔｏに希釈した１次抗体とともに、膜をインキュベートした。１次抗体には、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）からの抗マウスのＥｐｈＡ２（１：１００００および１：５０００）と抗マウスのβ−アクチン（１：５０，０００）、ならびにサンタクルスバイオテクノロジイ社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からの抗ウサギＥｐｈＡ２（１：１００）が含まれていた。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、３回洗浄後、膜を、１：５０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ）とともに、ｂｌｏｔｔｏ中で１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でそれぞれ５分間、３回洗浄し、ＥＣＬプラスウェスタンブロッティングディテクションシステム（ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（アメルシャム バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イギリス所在）を用いて検出を行った。膜を、オートラジオグラフィーフィルムＸ−ＯＭＡＴ ＡＲに様々な時間曝露した。
実施例１：ＥｐｈＡ２を培養のＧＢＭ細胞で過剰発現する
ＧＢＭ細胞におけるＥｐｈＡ２の分析では、この受容体はタンパク質レベルで過剰発現することを示した。ＥｐｈＡ２に対する特異的な染色が、ポリクローナル（細胞は赤色に）およびモノクローナル（細胞は緑色に）ＥｐｈＡ２抗体の両方を用いる免疫蛍光法によって観察された（図１）。特にＵ−２５１細胞のＥｐｈＡ２染色は、予想される細胞膜局在発現を示す特徴的な蜂窩織像を示した。また５つの異なるＧＢＭ株化細胞系および１つの形質転換したグリア細胞系統からの溶解物のウェスタンブロット分析は、ＥｐｈＡ２タンパク質の高い濃度を示した（図４）。興味深いことに、クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した正常ヒト脳タンパク質の混成および正常ヒトの前頭葉由来の組織は、ＥｐｈＡ２の発現をほとんど示さなかった（図４）。
実施例２：ＥｐｈＡ２はヒトＧＢＭ腫瘍に豊富に存在する
凍結ＧＢＭ切片のＥｐｈＡ２の免疫蛍光で、該受容体はヒトＧＢＭ腫瘍で有意なレベルで発現することが認められた（図２）。パラフィン包埋ヒトＧＢＭ組織および正常な脳の染色は、ＥｐｈＡ２がＧＢＭでは豊富であるが、正常な脳でほとんど存在しないことを例示した（図３）。ウェスタンブロット分析で示すように、ＥｐｈＡ２タンパク質はまた、正常ヒト脳ではなく、ＧＢＭ腫瘍に高濃度に存在する（図５）。
本発明者らは、ＧＢＭ細胞およびヒトＧＢＭ腫瘍の両方で、正常脳と比べてＥｐｈＡ２の特異的な示差的発現を実証した。したがって診断および予後などの分野で、ＥｐｈＡ２はＧＢＭの有用な分子的マーカーとして役立つ。さらにＥｐｈＡ２は、分子的な標的化薬物送達のようなＧＢＭの新たな治療の開発に使用することができる。
実施例３：多形性グリア芽細胞腫の新規の分子的マーカーおよび標的としてのＥｐｈＡ２
多形性グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）は、極度に浸潤性のアストログリア起源と考えられている血管に富む腫瘍（ｗｅｌｌ−ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ）である。この腫瘍は、約１２カ月の生存期間中央値を有し、すべての原発性の悪性脳腫瘍で最も一般的で致命的である。腫瘍の外科的切除、それに続く放射線および／または化学療法の標準治療にもかかわらず、生存率は過去３０年でわずかに増加しただけであった。ＧＢＭを有する患者の予後とクオリティオブライフとを改善するために、新規の治療が必要であることは明らかである。腫瘍細胞上で特異的に見いだされるかまたは悪性細胞上で、高レベルで過剰発現し、ほとんど正常細胞上には存在しない分子的マーカーは、標的化薬物送達のような方法のための魅力的な治療上の標的である。これらの方針に沿って、脳腫瘍関連癌／精巣腫瘍抗原（ＣＴＡ）で、非常に魅力的な治療上の標的であるインターロイキン１３（ＩＬ−１３）、ＩＬＲα２に対する受容体を、本発明者らはすでに同定した。
Ｅｐｈ受容体はチロシンキナーゼ受容体で最大のファミリーであり、細胞で重要なシグナル伝達経路、例えば増殖、遊走および分化を制御するシグナル伝達経路を媒介する際に重要である一群の膜貫通のタンパク質を含んでいる。Ｅｐｈ受容体の１４のメンバーは、受容体の細胞外ドメインの相同性に基づいてＡ型およびＢ型に分けられ、球状アミノ末端リガンド結合ドメインと、それに続くシステインに富むドメインおよび２つのフィブロネクチンＩＩＩ様反複とを一般的に含んでいる。すべてのＥｐｈ受容体の間で保存されるＣ末端の細胞内ドメインは、受容体の自己リン酸化活性に関わる２つのチロシン残基を含み、このドメインにチロシンキナーゼ触媒ドメインが続いている。細胞膜に隣り合う両方のチロシンのリン酸化および触媒領域のチロシンのリン酸化が、Ｅｐｈ受容体の生物活性を制御する。
Ｅｐｈ受容体の内在性のリガンド、エフリンが、隣接する細胞の表面と結合するという点で、Ｅｐｈ受容体はチロシンキナーゼ受容体の中ではユニークである。エフリンは、細胞表面に結合しているタンパク質の原形質膜との結合状態に基づく２つの型のファミリーである。エフリンＡリガンドは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を介して連結するのに対し、エフリンＢリガンドは、細胞膜への結合を媒介する細胞内ドメインを伴う膜貫通配列を有している。いくつかのエフリンには、２つ以上のＥｐｈ受容体に結合する混乱した状態があるが、すべてのエフリンは特異的なＥｐｈ受容体と相互作用する。
Ｅｐｈ受容体およびエフリンリガンドは、発生時に発現の特異的なパターンを示す。これらは、ボディープラン形成の間、細胞集団の境界を設定する複雑な過程に関係している。細胞間の接触依存的な過程を介する軸索誘導において、神経発生でＥｐｈ受容体およびそれらのリガンドがある重要な役割を果たすことが示された。胚発生の間、ＥｐｈＡ２は神経系に存在するが、大部分の他のＥｐｈ受容体と異なりＥｐｈＡ２は増殖性の成人上皮細胞表面上でも発現する。しかしながら、この発現は比較的低レベルであり、最も一般的には、皮膚、腸、肺および卵巣に限られている。特に、これらの細胞では、受容体は細胞と細胞の接触点に局在し、そのリガンド、エフリンＡ１により結合されている。
ＥｐｈＡ２は、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、例えば胸部、大腸、卵巣、前立腺および膵癌で有意に過剰発現している。ＥｐｈＡ２レベルのこの上昇は、一つには、リガンドに媒介される受容体の分解量の減少のせいであると考えられる。例えば、癌組織中の不安定な細胞間接触が、隣接細胞上のエフリンＡ１との相互作用することがＥｐｈＡ２の能力を妨げる可能性がある。その結果、受容体活性化ならびに引き続くＥｐｈＡ２の分解が著しく減少する。興味深いことには、このことにより、ＥｐｈＡ２の活性化が有意に低減し、同時に高レベルで過剰発現する形質転換した上皮細胞での状況を作り出す。ＥｐｈＡ２の活性化は、インテグリン媒介付着、細胞伝播および遊走をネガティブに制御する。活性化したＥｐｈＡ２はインテグリンの機能を抑制し、直接、限局的接着性キナーゼの脱リン酸化と、それに続く限局的接着性キナーゼからの解離とを生じる。さらにまた、ＥｐｈＡ２活性化は、細胞成長および増殖を抑制し、細胞と細胞外基質との接触を減少させる。したがってＥｐｈＡ２が不活性状態で存在する場合、ＥｐｈＡ２が発現している細胞は、運動性が大きく、浸潤性が高く、急速に増殖する傾向を備えている可能性がある。したがって本発明の一つの実施態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で不活性なＥｐｈＡ２の過剰発現を、上述の癌の浸潤性および悪性な表現型と関連づけることである。
また、ＥｐｈＡ２は、その内因性リガンド、エフリンＡ１との会合を介して、血管形成および腫瘍新血管新生に重要な役割はたしている。エフリンＡ１は、最初はＴＮＦ−α誘導性の内皮遺伝子産物として発表され、血管形成における重要な要素としてエフリンＡ１の役割が提案された（パンディ エー、セオ エイチ、マークス アールエム、ポルベリニ ピージェイとデクシット ヴイエム（Ｐａｎｄｅｙ Ａ，Ｓｈａｏ Ｈ，Ｍａｒｋｓ ＲＭ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ，ａｎｄ Ｄｉｘｉｔ ＶＭ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６８巻、５６７〜５６９ページ、１９９５年）。上皮細胞の状況とは対照的に、正常内皮細胞のＥｐｈＡ２を活性化するためのエフリンＡ１の不全は、血管内皮成長因子誘導の血管形成を抑制する。
細胞系および組織：ヒト多形性グリア芽細胞腫（Ｕ−８７ ＭＧ、Ｕ−２５１ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧおよびＡ−１７２ ＭＧ）、ヒト悪性グリオーマ（Ｈ４）および正常ヒト内皮（ＨＵＶＥＣ）由来の細胞系を、アメリカンタイプカルチャーコレクション社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ヴァージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）所在）から得た。Ｇ４８ａ細胞は、本研究所で分離した原発性のＧＢＭヒト外植片細胞培養であった。６Ｂ５３−１１ ＧＢＭ細胞は、メイヨークリニック社（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）（ミネソタ州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在）のデビッド ジェイムス博士（Ｄａｖｉｄ Ｊａｍｅｓ）から戴いたものである。６Ｂ５３−１１、Ａ−１７２ ＭＧおよびＨ４悪性グリオーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在）を含む、ダルベッコ改変イーグルの培地（Ｄ−ＭＥＭ）に増殖させた。Ｕ−８７ ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのグルタミン（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１００のμｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウムを含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に増殖させた。Ｇ４８ａ細胞を、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍＬのＬ−システイン（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０μｇ／ｍＬのＬ−プロリン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）、０．１μＭのナトリウムヒポキサンチンおよび０．０１６μＭのチミジン、５単位／ｍＬのペニシリンＧおよび５単位／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる１×ＨＴサプリメントを含むＲＰＭＩ−１６４０（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に増殖させた。ヒトＧＢＭおよび正常脳からの組織試料を手術室から得て、ホルマリン固定するか、あるいは直ちに凍結して−８０℃保存した。ＧＢＭの１０ミクロン切片をスライドに融解マウントし、分析するまで−８０℃に保存した。
ウェスタンブロット：細胞溶解物を準密集培養（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から調製した。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、哺乳動物のプロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を含むＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよび０．５％Ｉｇｅｐａｌ）中で溶解した。非悪性の脳および病理学者に確認されたＧＢＭ腫瘍組織を、凍結している間に小片に細かく切り刻み、哺乳動物のプロテアーゼ阻害剤反応混液（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））とともにＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズした。溶解物を１８ゲージの針に通すことによりＤＮＡを剪断し、氷上で６０分間インキュベートした。不溶性残渣を１０，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、上清を採取し、使用するまで−８０℃で保存した。正常ヒト脳溶解物を、ケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州テメクラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）所在）およびクロンテクラボラトリー社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）所在）から購入した。１０％または１５％のアクリルアミドを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは４〜１５％のトリス−ＨＣｌ勾配ゲル（バイオラドラボラトリー社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））を用いて、溶解物を分離した。次いで、タンパク質をＰＶＤＦ膜（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在）へ移し、ｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中５％ミルク）で少なくとも１時間ブロックした。膜を、ｂｌｏｔｔｏに希釈した１次抗体とともに、振盪しながら４℃で１夜インキュベートした。ウサギポリクローナルＥｐｈＡ２（１：１００）抗体およびエフリンＡ１（１：１５０）抗体を、サンタクルスバイオテテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（カリフォルニア州サンタクルス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）所在）から購入した。マウスモノクローナルＥｐｈＡ２クローンＤ７（１：５００）抗体、ホスホチロシンクローンＰＹ２０（１：１０００）抗体およびβ−アクチン（１：５０，０００）抗体を、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）から購入した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、３回洗浄後、膜を、１：５０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ）とともに、ｂｌｏｔｔｏ中で１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でそれぞれ５分間、３回洗浄し、ＥＣＬプラスウェスタンブロッティングディテクションシステム（ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（アメルシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イギリス所在）を用いて検出を行った。膜を、オートラジオグラフィーフィルムＸ−ＯＭＡＴ ＡＲに様々な時間曝露した。フィルムを６００×ｄｐｉで走査し、画像をＪａｓｃ Ｐａｉｎｔ Ｓｈｏｐ Ｐｒｏ ｖ６．０を使用して編集した。
蛍光抗体法および免疫組織化学：蛍光抗体法のために、ＧＢＭ細胞系およびヒト外植片細胞を、適切な培地中、滅菌ガラススライド上で一夜増殖した。スライドをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、２回洗浄し、−２０℃のアセトン中で２分間固定した。次いでスライドをＰＢＳで２回洗浄し、直ちに使用するか、または使用するまで−８０℃で保存した。凍結切片を解凍後、−２０℃のアセトン中で１０分間固定した。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロックした。１次抗体ＥｐｈＡ２ポリクローナル（１：２００）抗体もしくはモノクローナル（１：１０００）抗体またはエフリンＡ１ポリクローナル（１：２００）抗体を１．５％ＮＧＳに希釈し、４℃で１夜インキュベートした。抗体対照スライドを、１．５％ＮＧＳでインキュベートしなかった。スライドをそれぞれ、ＰＢＳで５分間、２回洗浄し、２次抗体とともに室温で４５分間インキュベートした。２次抗体には、ヤギ抗ウサギローダミン（１：２００）、ロバ抗ウサギローダミン（１：２００）（両方ともジャックソンイミュウノリサーチラボラトリィ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ウェストグローヴ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）所在から）またはヤギ抗マウスＩｇＧオレゴングリーン（１：２００）（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在）が含まれる。スライドを、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ Ｎｏ．３３２５８核対比染色剤（Ｈｏｅｓｃｈｔ Ｎｏ．３３２５８ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）（ＤＡＰＩ）で対比染色した。スライドを、ＰＢＳでそれぞれ５分間、２回洗浄し、ゲルマウント（バイオメディア社（Ｂｉｏｍｅｄｉａ）、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）所在）でマウントした。
免疫組織化学（ＩＨＣ）のために、腫瘍試料を緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ切片を切り取り、クロムアラムスライド上にマウントした。組織マイクロアレイを、サイブリ社（Ｃｙｂｒｄｉ，Ｉｎｃ．）（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）から得た。完全に乾燥した後、パラフィンが溶解するまでスライドを６５℃でベーキングした。スライドをキシレンで脱パラフィンし、アルコールで再水和した。抗原検索を、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、電子レンジでそれぞれ２回、５分間培地上で実施した。一旦冷却し、過酸化物／メタノール浴で３０分間スライドをインキュベートすることにより、内因性パーオキシダーゼ活性をクエンチした。スライドを、５分間かけてＰＢＳを３回取り替えて洗浄した。染色はＳｅｎｓｉＴｅｋ ＨＲＰ Ａｎｔｉ−Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔキット（シテックラボラトリー社（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ）所在）を用いて実施した。バックグラウンド染色を、５分間ＳｃｙＴｅｋ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを使ってブロッキングした。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで調製した１次抗体（ポリクローナルＥｐｈＡ２、１：２００またはエフリンＡ１ポリクローナル、１：２００）とともに、４℃で一夜インキュベートした。抗体対照スライドを、ＰＢＳでインキュベートしなかった。過剰量の抗体を、ＰＢＳで洗浄して除去した。次いでスライドを１５分間、希釈したＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＰＢＳで、１：１０）でブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。スライドをＳｃｙＴｅｋビオチン標識２次抗体で１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＳｃｙＴｅｋ Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰをスライドに塗布し、２０分間インキュベートし、スライドを蒸留水ですすいだ。ＳｃｙＴｅｋ ＡＥＣ／Ｃｈｒｏｍａｇｅｎによる視覚化を実施し、８〜１０分間進行させた。スライドを水道水ですすぎ、ヘマトキシリンで１分間、対比染色した。最後にスライドを水道水ですすぎ、Ｃｒｙｓｔａｌ−Ｍｏｕｎｔ（バイオメディア社（Ｂｉｏｍｅｄｉａ））を用いてマウントした。
顕微写真を、すべての場合、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎカメラを用いて、６３×倍率油浸レンズで撮影した。バックグラウンドを、１次の抗体なしの試料に標準化した。画像を、Ｊａｓｃ Ｐａｉｎｔ Ｓｈｏｐ Ｐｒｏ ｖ６．０１を用いて処理した。
足場非依存性の細胞増殖：２×１０３のＵ−２５１ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ、Ｕ−８７ ＭＧまたはＨ４細胞を、０．５％寒天添加増殖培地基層上に０．３５％寒天（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））添加増殖培地入りの６穴プレートに播種した。細胞に、組み換えマウスエフリンＡ１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を０．００１、０．０１、０．１、０．５、１μｇ／ｍＬ添加して、またはビヒクル単独で実施した（各濃度点で、３回反復して実施した）。エフリンＡ１を、プレーティングの３日後に新しい培地を使って補充し、コロニーを、１４日後に低倍率で計数した。ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧおよびＵ−２５１ ＭＧについては、７５細胞より大きなコロニー集団、またはＵ−８７ ＭＧおよびＨ４については、２５細胞より大きなコロニー集団（これらの後者の２細胞系は、軟寒天中であまり増殖しない）を、ランダムな１０視野で、低倍率で計数した。それぞれの実験条件を、アッセイごとに３回反復して実施した。
浸潤試験：ＢＤバイオコート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）（商標）マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）浸潤チャンバー、対照インサート、およびウェル（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）所在）を、５００／μＬの無血清培地で、３７℃で２時間、再水和した。細胞を、０．０１、０．１、０．５または１．０μｇ／ｍＬのエフリンＡ１−Ｆｃ、３７℃で１時間前処理し、トリプシン処理し、０．１％ＢＳＡを加えたＰＢＳでクエンチして計数した。再水和培地を除去後に、５％ＦＢＳ添加培地７５０μＬを２４穴プレートの各ウェルに加え、その後直ちに４×１０４細胞（適切な濃度のエフリンＡ１−Ｆｃをプラスした５００μＬの無血清培地中）を、それぞれのチャンバーおよび対照インサートに添加した。プレートを３７℃で２０〜２２時間インキュベートした。非浸潤性細胞を、綿棒で膜をこするって膜の上表面から除去した。膜下面の細胞を、ＤＩＦＦ ＱＵＩＫ染色キットを用いて染色した（ＩＭＥＢ社（ＩＭＥＢ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンマルコス（Ｓａｎ Ｍａｒｃｏｓ）所在）。マトリゲル膜および対照インサート膜を遊走した細胞の平均個数を得るために、ランダムな５つの視野の浸潤性細胞を、各細胞の種類および処理条件に用いた３つのマトリゲルインサートおよび対照インサートに関して（それぞれ３回反復して実施した）、４０×レンズで計数した。データを、対照膜を通っての遊走と比較したマトリゲルマトリックス基底膜のパーセント浸潤として表した。
免疫沈降：細胞溶解物を準密集培養から調製した。細胞をＰＢＳで洗浄し、哺乳動物のプロテアーゼ阻害剤反応混液（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を含むＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよび０．５％Ｉｇｅｐａｌ）および１ｍＭのナトリウムバナデート中で溶解した。約５００μｇの細胞溶解物を、５μｇのモノクローナルＥｐｈＡ２（クローンＤ７）と４℃で一夜、インキュベートした。充填されたタンパク質Ｇ−セファロースビーズ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）を、約３５μＬを含む７０μＬの５０％ＰＢＳ／ビーズスラリーを加えて４℃で最低１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離して回収し、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、６０μＬの３×ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した（ニューイングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））。試料を１００℃で５分間加熱した。上清を採取し、ウェスタンブロッティング用にＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離するまで−２０℃で保存した。
ＥｐｈＡ２受容体のリン酸化：Ｕ−２５１ ＭＧ細胞の準密集培養を１００ｍｍシャーレで一夜、血清欠乏状態にした。細胞を組み換えマウスエフリンＡ１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））またはマウスモノクローナルＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））で、指示された時間にわたって処理した。細胞溶解物を指示された時刻に調製し、ＥｐｈＡ２を用いる免疫沈降に使用し、次いでＰ−Ｔｙｒに対するウェスタンブロッティング、続いてＥｐｈＡ２に対するウェスタンブロッティングに使用した（上記参照）。
結果
ヒトＧＢＭ株化細胞系でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現：いくつかのＧＢＭ細胞系および正常な脳でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１タンパク質の濃度を、最初にウェスタンブロッティングにより測定した。５つの異なるＧＢＭ細胞系（Ａ−１７２ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ、Ｕ−２５１ ＭＧおよびＧ４８ａ）がＥｐｈＡ２タンパク質の非常に高い濃度を示し、１３０ｋＤａの予想さるサイズの免疫反応性バンドとして移動した（図７Ａ）。例外はＵ−８７ ＭＧ細胞であり、調べた他のＧＢＭ細胞系よりはるかに少ないＥｐｈＡ２を発現した（図７Ａ）。正常脳の前頭葉から分離した正常脳タンパク質の混成（図１Ａ、標準脳Ｉ）ならびにクロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（図７Ａ、標準脳ＩＩ）およびケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から入手した正常脳タンパク質の混成は、１３０ｋＤａの位置に、非常に弱い免疫反応性のバンドかまたはいかなるバンドも存在しないことを示した（図７Ａ）。特に、非腫瘍形成性の悪性グリオーマ細胞系、Ｈ４は、正常脳で観察される免疫反応性のＥｐｈＡ２濃度と同様な濃度を示した（図７Ａ）。
ＧＢＭ細胞系のエフリンＡ１リガンドに対する免疫ブロッティングは、ＥｐｈＡ２で観察された結果より著しく異なる結果を示した。ＥｐｈＡ２が大量に過剰発現している大部分の同じ細胞系で、例えばＡ−１７２ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧおよびＧ４８ａで、エフリンＡ１の予想されるサイズ（約２５ｋＤａ）で移動する免疫反応性のバンドを示す証拠はなかった（図７Ａ）。しかしながら、Ｕ−２５１ ＭＧ細胞で、弱いエフリンＡ１の免疫反応性バンドが観察された（図７Ａ）。さらに正常脳組織は、同じ正常脳組織試料で観察されるＥｐｈＡ２濃度と類似した免疫反応性のエフリンＡ１の非常に低い濃度を有していた（図７Ａ）。エフリンＡ１はＴＮＦ−α誘導性遺伝子産物なので、ＴＮＦ−αで剌激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、細胞溶解物中のエフリンＡ１検出の陽性対照としてその中に含めた（図７Ｂ）。
次に、ＧＢＭ細胞でＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現ならびに局在化をさらに研究するために、蛍光抗体法を実施した。モノクローナルおよびポリクローナルＥｐｈＡ２抗体の両方を用いて調べた、ＥｐｈＡ２に対する多量の特異的な染色が、すべてのＧＢＭ細胞系で観察された（図８Ａ）。集密状態の細胞で、受容体の予想される膜局在性の発現を示す染色の特徴的な蜂窩織像が明らかであった（図８Ａ、Ｕ−２５１ ＭＧ細胞）。いくつかの細胞質および核周囲の染色も見られた。１つのＧＢＭ細胞系、Ｕ−８７ ＭＧで、ＥｐｈＡ２免疫蛍光のレベルが、他のすべてのＧＢＭ細胞と比べ視認できる程に低いことが認められた（図８Ａ）。この所見は、ウェスタンブロッティングによりＵ−８７ ＭＧ細胞で見られた免疫反応性のＥｐｈＡ２タンパク質の低いレベルと一致する（図７Ａ）。
ＧＢＭでＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現をさらに研究するために、ＥｐｈＡ２に対して染色した同じＧＢＭ細胞で、エフリンＡ１に対して蛍光抗体法を実施した。非常に低濃度のエフリンＡ１に特異的な染色が見られ、そのほとんどがアッセイの検出限界に近いものであった。（図８Ｂ、６Ｂ５３−１１、Ｕ−３７３ ＭＧおよびＵ−８７ ＭＧ細胞）。
ヒトＧＢＭ試料におけるＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現：次に、ＧＢＭ試料および正常脳組織における受容体およびそのリガンドの発現を、ウェスタンブロッティングおよびＩＨＣによって検討した。ウェスタンブロッティング用には、全組織溶解物を、急速凍結したヒトＧＢＭからから調製するか、正常脳の前頭葉から調製するか、または市販品を購入した。調べたＧＢＭ腫瘍１４中１３で、免疫反応性のＥｐｈＡ２が正常脳でよりも上昇しているのに対して、６つの腫瘍がＥｐｈＡ２の大量の過剰発現を示すことが見出された（図９）。ＥｐｈＡ２が上昇した１３試料のうち９試料では、免疫反応性のエフリンＡ１は、著しく低い濃度で存在していた（図９、ＧＢＭ ６、１２、２３、１１４、１２１、１２５、２４、１１７および１０５）。残りの４試料すべてが、ＥｐｈＡ２および免疫反応性のエフリンＡ１の両方で、正常組織で見られものを上回る増加を示した（図９、ＧＢＭ １０２、１３５、４５、１１２）。ただ１つの腫瘍、ＧＢＭ ９９だけが、受容体およびリガンドの低い濃度を有するようであった（図９）。
ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現をさらに評価するために、蛍光抗体法を、ヒトＧＢＭ組織および非悪性の脳のいくつかの凍結切片で実施した。これらの試験で、ＧＢＭでＥｐｈＡ２に対する多量の染色と正常脳で検出可能な免疫反応性受容体の極めて低い濃度が認められた（図１０Ａ）。正常脳のいくつかの異なる試料をＥｐｈＡ２に対して染色したが、一貫して結果は陰性であった。ウェスタンブロッティングでエフリンＡ１についても高い濃度を示したＧＢＭ１０２（図９）を除くすべての同じ切片で、免疫蛍光エフリンＡ１が、ほとんどバックグラウンド濃度で存在していた（図１０Ｂ）。特に、凍結切片で観察されるＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫蛍光濃度は、ウェスタンブロッティングで見られる免疫反応性のタンパク質の量と一致した（図９、図１０Ａ、図１０Ｂ）。
ヒトＧＢＭのパラフィン包埋切片のＩＨＣで、ウェスタンブロッティングおよび蛍光抗体法で観察されたものと同様の、高程度のＥｐｈＡ２に対する染色が認められた（図１１Ａ）。巨細胞ＧＢＭを含む４つの異なる病理学者に確認されたＧＢＭ腫瘍試料で、グリア細胞および腫瘍血管内皮細胞を含む切片全体に及ぶ、濃い特異的なＥｐｈＡ２染色が観察された（図１１Ａ）。ここでもＥｐｈＡ２染色は、非悪性脳組織でのアッセイの検出限界に近かった（図１１Ａ）。ＥｐｈＡ２に対して観察された高程度の特異的な染色と異なり、エフリンＡ１は、ＧＢＭ試料の全体を通じて低い濃度で見出された（図１１Ｂ）。非悪性脳で、血管内皮細胞に特異的に極度に局在するエフリンＡ１染色が観察され（図１１Ｂ）、またわずかな度合いでＥｐｈＡ２に関してもこの現象が観察された（図１１Ａ）。興味深いことには、正常脳でのエフリンＡ１のこの特異的な血管内皮細胞局在化は、ＧＢＭではさほど明白ではないようであった（図１１Ｂ）。さらに、種々の脳腫瘍および正常脳のパラフィン包埋切片の６１個で構成される組織マイクロアレイで、一貫して高悪性度の（ＷＨＯグレードＩＩＩ〜ＩＶ）星状細胞腫中にＥｐｈＡ２に対する最も強い染色が認められ、これらの切片のエフリンＡ１染色では、リガンドの一様な同じ低い濃度が認められた。
ＧＢＭ細胞の足場非依存性増殖に及ぼすエフリンＡ１の効果：ＧＢＭ細胞系と腫瘍組織で観察されるＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の差次的な発現傾向に基づき、次に本発明者らは、ＧＢＭの受容体およびリガンド間の考えられる機能的な関連性を検討した。まず、高いＥｐｈＡ２を発現しているＧＢＭ細胞系の足場非依存性増殖に及ぼすエフリンＡ１の効果を、Ｕ−２５１ ＭＧおよびＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ細胞の、エフリンＡ１の共存下または非共存下で、軟寒天中でコロニーを形成する能力を評価することにより検討した。２つの細胞系の足場非依存性増殖に及ぼすエフリンＡ１の用量依存的な抑制効果が見出された（図１２Ａ）。可溶性エフリンＡ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥｐｈＡ２受容体を活性化することがすでに示されていたという事実により、エフリンＡ１の媒介するＥｐｈＡ２の活性化は、ＧＢＭ細胞の足場非依存性増殖に対し負の効果を有することを、本発明者らは提案する。この現象は、特異的にＥｐｈＡ２のエフリンＡ１に媒介された活性化を含むことを確認するために、同じ試験をＥｐｈＡ２の低い濃度を発現する２つの細胞系、Ｈ４およびＵ−８７ ＭＧを用いて実施した（図７Ａ）。調査した両方の細胞系において、エフリンＡ１の濃度増加とともに足場非依存性増殖の如何なる有意な用量依存的な抑制も本発明者らは観察できなかった（図１２Ｂ）。一般に、これらの細胞は軟寒天中でＥｐｈＡ２を高レベルで過剰発現する細胞よりも小さなコロニーを形成した。
ＧＢＭ細胞浸潤に及ぼすエフリンＡ１の効果：ＥｐｈＡ２受容体の活性化の欠如の結果として一部生じる可能性のある、ＧＢＭ細胞の他の増強した悪性な特徴は浸潤である。したがって、３つの異なるＧＢＭ細胞系の浸潤性に及ぼす外来性のエフリンＡ１の効果を検討した。ＥｐｈＡ２高レベル発現体であるＵ−２５１ ＭＧおよびＡ１７２ ＭＧ細胞は、エフリンＡ１の上昇する濃度とともに、実質的に用量依存的な浸潤性の減少を示した（図１２）。１．０μｇ／ｍＬのエフリンＡ１処理により、Ａ−１７２ ＭＧ細胞で８０％の浸潤の減少およびＵ−２５１ ＭＧ細胞で５２％の浸潤の減少を生じた（図１２）。これと対照的に、Ｕ−８７ ＭＧ細胞は、高レベルのＥｐｈＡ２を発現している細胞系よりも浸潤性が少なく、無処理の対照から１．０μｇ／ｍＬのエフリンＡ１処理までの間で、浸潤に関してわずか２０％の減少を本発明者らは観察した（図１２）。
ＧＢＭ細胞におけるＥｐｈＡ２受容体の活性化の状態。ＧＢＭにおけるエフリンＡ１発現の低いレベルは、これらの腫瘍のＥｐｈＡ２受容体は、活性化されていない模様であり、したがって非チロシンリン酸化状態で存在することを示唆している。この可能性を検討するために、いくつかのＧＢＭ細胞系および腫瘍からの溶解物の免疫沈降反応を、モノクローナルＥｐｈＡ２抗体を用いて実施した。図１４Ａに示したように、免疫反応性のＥｐｈＡ２は容易に認められるが、ＧＢＭ細胞系および腫瘍でチロシンがリン酸化されたＥｐｈＡ２は、殆どないかまたはまったく検出されなかった。特に２つのＧＢＭ腫瘍から免疫沈降した免疫反応性のＥｐｈＡ２の量は、ウェスタンブロッティングにより見いだされる量と直接関連している（図９）。検出可能なチロシンリン酸化の欠如は、ＥｐｈＡ２受容体は不活性であり、おそらくは隣接する細胞由来のエフリンＡ１による刺激が欠如しているためであることを示唆している。エフリンＡ１の処理に応じて、Ｕ−２５１ ＭＧ細胞で、チロシンがリン酸化したＥｐｈＡ２の濃度（エフリンＡ１媒介受容体の活性化の指標）が、時間とともに非常に増加した（図１４Ｂ）。ＩｇＧ１処理試料ではリン酸化したＥｐｈＡ２の増加はなかった（図１４Ｂ）。エフリンＡ１に誘導されるＥｐｈＡ２リン酸化が、処理後早くも１０分で生じ、６０分まで持続するのが認められた。エフリンＡ１刺激の２時間後に、リン酸化したＥｐｈＡ２がもはや検出されなかったので、受容体の活性化は、可逆性であるように考えられる（図１４Ｂ）。さらに、エフリンＡ１で処理した細胞溶解物中の全免疫反応性ＥｐｈＡ２の濃度が、処理の６０分後に減少し始めた（図１４Ｃ）。
本発明者らは、ＥｐｈＡ２は大量に存在し、ＧＢＭ細胞系およびヒトＧＢＭ腫瘍組織で特異的に過剰発現することを示した。医療介入の有力な分子標的としてＥｐｈＡ２を考慮する際に重要なことは、この受容体の発現は、正常脳では非常に低い濃度で検出されることである。さらに、本発明者らは、ＥｐｈＡ２を大量に過剰発現する細胞および腫瘍で、エフリンＡ１は平均してさらに低濃度で存在することを証明した。さらにまた本発明者らの所見は、ＧＢＭなどの腫瘍のＥｐｈＡ２とエフリンＡ１の間に機能的な関連性の存在を示唆している。本発明者らは、エフリンＡ１はＥｐｈＡ２を活性化し、受容体のチロシンリン酸化を介する腫瘍誘発性、例えば足場非依存性増殖および浸潤の負の調節をもたらすシグナルを誘発することを見いだした。
本発明者らの知る限りでは、これは、アストログリアが起源のヒト癌でＥｐｈＡ２受容体およびそのリガンド、エフリンＡ１の存在の意義および機能的意義を検討した最初の研究である。さらにＥｐｈ受容体ファミリーの他のメンバー、ＥｐｈＢ２は、遊走およびヒトグリオーマ細胞の浸潤で役割を果たすことが分かった。ＧＢＭでのＥｐｈＡ２の多量な過剰発現は、リガンド誘導のセプター分解量の減少の結果として生じる可能性がある。安定な細胞間接触を有する正常組織では、エフリンＡ１は、ＥｐｈＡ２に結合して活性化し、受容体−リガンド複合体の内部移行を生じる。続いてＥｐｈＡ２は、ｃ−Ｃｂｌと相互作用のため分解し、正常成人上皮組織では活性状態のＥｐｈＡ２は、低濃度で発現していることが見出されている。これとは対照的に、上皮癌で過剰発現したＥｐｈＡ２は、触媒キナーゼドメインのチロシンが非リン酸化した状態を保つ非活性化状態で主に見いだされる。本発明者らのこの結果は、この状況は悪性グリオーマについても当てはまることを示唆している。本発明者らは、ＧＢＭ細胞系および腫瘍でＥｐｈＡ２受容体のチロシンリン酸化の有意な量を検出できていないので、ＥｐｈＡ２は過剰発現するが、生物学的に不活性状態で存在することが示される。ＧＢＭ細胞および大部分の腫瘍組織でエフリンＡ１の濃度が非常に低いことが、ＥｐｈＡ２受容体活性化の欠如および結果として生じる持続的な過剰発現を少なくとも部分的に説明することができる。さらに受容体の遺伝子発現もＧＢＭで増加し、この疾病で増加した遺伝子産物が存在する原因であると考えられる。
ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の差次的な発現パターンは、細胞系だけでなくＧＢＭ腫瘍でもて認められた。ほとんど例外がないのは、一部にはたぶん腫瘍の不均一な性質に起因している。悪性腫瘍形質転換の１つの性質は、安定な細胞間接触量の減少である。したがって、エフリンＡ１は、いくつかの腫瘍で実際に存在するが、受容体の内在化と分解を誘発するには不十分な短命な様式でのみＥｐｈＡ２に結合できている可能性がある。あるいは大部分のエフリンＡ１は、悪性組織でＥｐｈＡ２に正常に結合できるおよび／またはＥｐｈＡ２を活性化できる様式でもはや存在しない可能性がある。例えば、エフリンＡ１は細胞表面から隔離され、ＥｐｈＡ２受容体を事実上結合しない可溶性の単量体の形式で細胞外環境に存在している可能性がある。どちらの予想される展開も、ＥｐｈＡ２の過剰発現を促進するだろう。
腫瘍新血管新生において、ＥｐｈＡ２が重要であることはすでに示されている。悪性グリオーマは、本質的に高度に血管の腫瘍である。血管新生促進因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍の微小環境に種々の濃度で存在する。したがって、ＧＢＭ腫瘍で存在するエフリンＡ１の濃度が、ある程度血管新生促進因子に対する腫瘍細胞応答に関連している可能性がある。あるいは腫瘍組織でのエフリンＡ１の存在は、正常血管系で発現しているエフリンＡ１に由来する可能性もある。特に本発明者らは、正常脳組織の血管内皮細胞にＧＢＭ試料では明白ではない特異的に局所化したエフリンＡ１を認めた。腫瘍の異なる領域で、すなわち中心に対し浸潤端部で、ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の異なる発現パターンを有する可能性がある。エフリンＡ１により活性化されたとき、ＥｐｈＡ２は細胞成長、遊走、増殖および浸潤の負の調節に関与する経路を介して情報伝達を行う。エフリンＡ１がＥｐｈＡ２のリン酸化を引き起こすばかりでなく、足場非依存性増殖およびＧＢＭ細胞の浸潤の減少と関連する受容体状態におけるこの変化も引き起こすことを本発明者らは見いだした。さらにまた、エフリンＡ１によりを引き起こされる細胞行動におけるこれらの変化は、低濃度のＥｐｈＡ２を発現している細胞系では変化が観察されないので、ＥｐｈＡ２発現の濃度に関連があると思われる。したがって不活性型で過剰発現したＥｐｈＡ２は、腫瘍の発達および／または維持を助長する許されない細胞内情報伝達を可能にすることから、ＧＢＭでＥｐｈＡ２／エフリンＡ１系は非常に重要な役割を果たす可能性をもっている。これらの可能性を検討する研究は、本発明者らの研究所で進行中である。
本発明者らは、ＥｐｈＡ２は高いレベルで過剰発現され、ＧＢＭの発癌性にとって機能的に重要であることを示した。本特許はＥｐｈＡ２／エフリンＡ１系を、高悪性度グリオーマに対する分子に基づく介入の開発目標として研究する将来研究の基礎となる。
実施例４：エフリン分子に結合する候補治療化合物の同定。
図１５Ａ〜１５Ｃは、大腸菌でのエフリンＡ１およびＤＴ３９０−エフリンＡ１組換えタンパク質の発現ならびにＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンの部分精製を示す。図１５Ａ：エフリンＡ１は、ＩＰＴＧ誘発に応じる主要な細菌タンパク質である。１、分子サイズのマーカー、２、前もって誘導した細胞の溶解物、３、細菌でエフリンＡ１のＥＰＴＧ誘導による産生（レーン１〜３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す）、４、前もって誘導した細胞の溶解物、５、細菌でＩＰＴＧ誘導によるエフリンＡ１の産生（レーン４〜５は、ウェスタンブロットを示す）。図１５Ｂ：ＤＴ３９０−エフリンＡ１は、ＩＰＴＧ誘発に応じる主要な細菌タンパク質である。Ｉ、分子サイズのマーカー、ＩＩ、前もって誘導した細胞の溶解物、ＩＩＩ、細菌でＩＰＴＧ誘導によるＤＴ３９０−エフリンＡ１の産生（レーンＩ〜ＩＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す、ＩＶ、部分的に精製したＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンの抗エフリンＡ１抗体用いたウェスタンブロット。図１５Ｃ：過剰量のエフリンＡ１−Ｆｃの不存在下または存在下で、ＤＴ３９０−エフリンＡ１（１５ｎＭ）を用いた、Ｕ−２１５ ＭＧ ＧＢＭ細胞の細胞増殖アッセイ。
他の実施態様
本発明について本発明の詳細な説明とともに説明してきたが、前述の説明が例示を目的とし、本発明の範囲を限定することを目的としないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および変更は特許請求の範囲内にある。
グリア芽腫細胞（ＧＢＭ）におけるＥｐｈＡ２の蛍光を示す図。 急速凍結したヒトＧＢＭ組織切片でのＥｐｈＡ２の蛍光で得た結果を示す図。 パラフィン包埋ヒトＧＢＭ組織切片における免疫細胞組織化学で得た結果を示す図。 ＧＢＭ細胞、形質転換グリア細胞および正常脳の免疫反応性ＥｐｈＡ２のウェスタンブロットを示す図。 ヒトＧＢＭ腫瘍および正常脳の免疫反応性ＥｐｈＡ２のウェスタンブロットを示す図。 ｃＤＮＡマイクロアレイで得られたＥｐｈＡ２の発現の結果を示す図。 ＧＢＭ細胞および正常脳でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫反応性を示す図。ＧＢＭ細胞系および２つの正常脳試料でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫反応性のウェスタンブロットである。５つのＧＢＭ細胞系（Ａ−１７２ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ、Ｕ−２５１ ＭＧ、Ｕ−８７ ＭＧ、Ｇ４８ａ）および１つの悪性グリオーマ（Ｈ４）を分析した。正常脳試料は、凍結したヒト正常脳（正常脳Ｉ）または正常脳タンパク質の混合（正常脳ＩＩ）の前頭葉組織から得た。 ＧＢＭ細胞および正常脳でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫反応性を示す図。非誘導および５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで誘導したＨＵＶＥＣを示すウェスタンブロットである。 ＧＢＭ細胞でＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫蛍光を示す図。７つのＧＢＭ細胞系（ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ、６Ｂ５３−１１、Ａ−１７２ ＭＧ、Ｇ４８ａ、Ｕ−２５１ ＭＧ、Ｕ−３７３ ＭＧおよびＵ−８７ ＭＧ）のＥｐｈＡ２に関する免疫蛍光を示す。 ＧＢＭ細胞でＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫蛍光を示す図。４つのＧＢＭ細胞系（Ｕ−２５１ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ、Ａ−１７２ ＭＧとＧ４８ａ）のエフリンＡ１に関する免疫蛍光を示す。赤色は、ポリクローナルＥｐｈＡ２抗体の使用を表し、縁色は、モノクローナルＥｐｈＡ２抗体の使用を表す。ＤＡＰＩ染色で、Ａ１エフリンについて染色した細胞核が認められる。 ヒトＧＢＭおよび正常脳組織でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の免疫反応性を示す図。ＧＢＭ腫瘍溶解物と正常脳で実施されるＥｐｈＡ２およびＡ１エフリン免疫反応性のウェスタンブロット。正常脳は図８Ａおよび図８Ｂと同じ供給源から得た。 ヒトＧＢＭおよび正常脳の凍結組織切片でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現を示す図。ＥｐｈＡ２に対する免疫蛍光で得られた結果を示す。核はＤＡＰＩで染色した。 ヒトＧＢＭおよび正常脳の凍結組織切片でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現を示す図。５つの急速凍結したヒトＧＢＭ組織試料および正常脳でのエフリンＡ１の免疫蛍光を示す。核はＤＡＰＩで染色した。 ヒトＧＢＭおよび正常脳のパラフィン包埋組織切片でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現を示す図。ＥｐｈＡ２の発現を示す。各切片の３つの代表な領域を示す。矢印は正常脳図１１Ｂの中でエフリンＡ１に対する特異的内皮細胞染色を示す。 ヒトＧＢＭおよび正常脳のパラフィン包埋組織切片でのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の発現を示す図。ＧＢＭおよび正常脳組織のパラフィン包埋切片でのエフリンＡ１ ＩＨＣを示す。各切片の３つの代表な領域を示す。矢印は正常脳図１１Ｂの中でエフリンＡ１に対する特異的内皮細胞染色を示す。 ＧＢＭ細胞の足場非依存性増殖に及ぼすエフリンＡ１の効果を示すグラフ。Ｕ−２５１ ＭＧおよびＵ−８７ ＭＧ細胞の軟寒天の中でコロニーを形成する能力を、最初の平板培養から１４日後、エフリンＡ１の各濃度について３つの独立したアッセイで、１０個のランダムな弱拡大視野における７５以上の細胞（Ｕ−２５１ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ）または２５以上の細胞（Ｈ４、Ｕ−８７ ＭＧ）の細胞集塊を計数し平均して定量化した。１μｇ／ｍＬのエフリンＡ１で処理した細胞のいくつかの視野では、７５細胞以上または２５細胞以上の視認できる細胞集塊は存在しなかった。垂直バーは、３つの独立したアッセイの標準偏差を表す。 ＧＢＭ細胞の足場非依存性増殖に及ぼすエフリンＡ１の効果を示すグラフ。ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧならびにＨ４およびＵ−８７ ＭＧ細胞の軟寒天の中でコロニーを形成する能力を、最初の平板培養から１４日後、エフリンＡ１の各濃度について３つの独立したアッセイで、１０個のランダムな弱拡大視野における７５以上の細胞（Ｕ−２５１ ＭＧ、ＤＢＴＲＧ−０５ ＭＧ）または２５以上の細胞（Ｈ４、Ｕ−８７ ＭＧ）の細胞集塊を計数し平均して定量化した。１μｇ／ｍＬのエフリンＡ１で処理した細胞のいくつかの視野では、７５細胞以上または２５細胞以上の視認できる細胞集塊は存在しなかった。垂直バーは、３つの独立したアッセイの標準偏差を表す。 ＧＢＭ細胞の浸潤性に及ぼすエフリンＡ１の効果を示すグラフ。エフリンＡ１の種々の濃度で処理したＧＢＭ細胞、Ａ−１７２−ＭＧの浸潤性。浸潤は対照膜と比較したマトリゲル膜を介して遊走した細胞のパーセンテージとして測定した。各パーセンテージは、各濃度のエフリンＡ１に対する３つの独立した浸潤チャンバアッセイの平均値を表し、垂直バーは標準偏差を示す。 ＧＢＭ細胞の浸潤性に及ぼすエフリンＡ１の効果を示すグラフ。エフリンＡ１の種々の濃度で処理したＧＢＭ細胞、Ｕ−２５１−ＭＧの浸潤性。浸潤は対照膜と比較したマトリゲル膜を介して遊走した細胞のパーセンテージとして測定した。各パーセンテージは、各濃度のエフリンＡ１に対する３つの独立した浸潤チャンバアッセイの平均値を表し、垂直バーは標準偏差を示す。 ＧＢＭ細胞の浸潤性に及ぼすエフリンＡ１の効果を示すグラフ。エフリンＡ１の種々の濃度で処理したＧＢＭ細胞、Ｕ−８７ ＭＧ（図１３Ｃ）の浸潤性。浸潤は対照膜と比較したマトリゲル膜を介して遊走した細胞のパーセンテージとして測定した。各パーセンテージは、各濃度のエフリンＡ１に対する３つの独立した浸潤チャンバアッセイの平均値を表し、垂直バーは標準偏差を示す。 ＧＢＭ細胞でのＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を示すウェスタンブロットを示す図。未処理のＧＢＭ細胞系および腫瘍試料でＥｐｈＡ２で免疫沈降後、ウェスタンブロッティングにより検出されたホスホチロシンおよびＥｐｈＡ２を示す。ＥＧＦで処理したＡ−４３１細胞を、ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）に対する陽性対照として用いた。本抗体は１７０ｋＤａで、リン酸化されたＥＧＦレセプターを検出する。 ＧＢＭ細胞でのＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を示すウェスタンブロットを示す図。定められた時間１μｇ／ｍＬのエフリンＡ１で処理したＵ−２５１ ＭＧ細胞または対照のＩｇＧ１アイソタイプを示す。ＥＧＦで処理したＡ−４３１細胞を、ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）に対する陽性対照として用いた。本抗体は１７０ｋＤａで、リン酸化されたＥＧＦレセプターを検出する。 ＧＢＭ細胞でのＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を示すウェスタンブロットを示す図。免疫沈降に関与しない、エフリンＡ１処理Ｕ−２５１ ＭＧ細胞における免疫反応性のＥｐｈＡ２を示す。ＥＧＦで処理したＡ−４３１細胞を、ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）に対する陽性対照として用いた。本抗体は１７０ｋＤａで、リン酸化されたＥＧＦレセプターを検出する。 エフリンＡ１およびＤＴ３９０−エフリンＡ１組換えタンパク質の大腸菌での発現、ならびにＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンの部分精製を示す図。ゲルおよびゲルのウェスタンブロットである。エフリンＡ１は、ＩＰＴＧの誘導に応じる主要な細菌タンパク質である。１、分子サイズマーカー、２、前もって誘導した細胞の溶解物、３、細菌でのＩＰＴＧ−誘導エフリンＡ１産生（レーン１〜３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す）、４、前もって誘導した細胞の溶解物、５、細菌でのＩＰＴＧ−誘導エフリンＡ１産生（レーン４〜５は、ウェスタンブロットを示す）。 エフリンＡ１およびＤＴ３９０−エフリンＡ１組換えタンパク質の大腸菌での発現、ならびにＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンの部分精製を示す図。ゲルおよびゲルのウェスタンブロットである。ＤＴ３９０−エフリンＡ１は、ＩＰＴＧの誘導に応じる主要な細菌タンパク質である。Ｉ、分子サイズマーカー、ＩＩ、前もって誘導した細胞の溶解物、ＩＩＩ、細菌でのＩＰＴＧ−誘導ＤＴ３９０−エフリンＡ１産生（レーンＩ〜ＩＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す）、ＩＶ、抗エフリンＡ１抗体を用いた、部分的に精製したＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンのウェスタンブロットを示す。 エフリンＡ１およびＤＴ３９０−エフリンＡ１組換えタンパク質の大腸菌での発現、ならびにＤＴ３９０−エフリンＡ１サイトトキシンの部分精製を示すグラフ。過剰量のエフリンＡ１−Ｆｃの不存在下または存在下で、ＤＴ３９０−エフリンＡ１（１５ｎＭ）を用いた、Ｕ−２１５ ＭＧ ＧＢＭ細胞の細胞増殖アッセイの結果を示す。

Claims (32)

  1. Ｅｐｈ受容体、Ｅｐｈ関連受容体、エフリン分子、それらのタンパク質、ペプチド、変異体、断片および誘導体を備える、癌の診断用組成物。
  2. Ｅｐｈ受容体がＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体からなる群から選択され、エフリン分子がエフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、それらの変異体および断片の少なくとも一種を備える、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｅｐｈ受容体が、ＥｐｈＡ２受容体、そのタンパク質、ペプチド、変異体、断片および誘導体をさらに備える、請求項１に記載の組成物。
  4. 被験体試料中の少なくとも一種または複数のタンパク質バイオマーカーを検出する工程、および一種または複数のタンパク質バイオマーカーの検出を癌の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの該検出を考慮に入れ、該一種または複数のタンパク質マーカーは、Ｅｐｈ受容体、ＥｐｈＡ２受容体、Ｅｐｈ関連受容体、エフリン分子、その断片および変異体である工程と、
    一種または複数のタンパク質バイオマーカーの該検出を癌の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較したときの各診断における一種または複数のタンパク質バイオマーカーの該検出を考慮に入れる工程とを備える、癌および／または癌関連疾患の検出および診断方法。
  5. 前記タンパク質バイオマーカーが、Ｅｐｈ受容体、ＥｐｈＡ２受容体、Ｅｐｈ関連受容体、その断片および変異体である、請求項４に記載の方法。
  6. Ｅｐｈ受容体がＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体、そのタンパク質、ペプチド、変異体、断片および誘導体からなる群から選択され、エフリン分子がエフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種を備える、請求項４に記載の方法。
  7. Ｅｐｈ受容体がＥｐｈＡ２受容体、そのタンパク質、ペプチド、変異体、断片および誘導体をさらに備える、請求項４に記載の方法。
  8. Ｅｐｈ受容体、ＥｐｈＡ２受容体、エフリンタンパク質、そのペプチド、変異体、断片および誘導体の量が癌病期と相関関係がある、請求項４に記載の方法。
  9. 一種または複数のタンパク質バイオマーカーを癌の診断に用いる、請求項４に記載の方法。
  10. 複数のタンパク質バイオマーカーを癌の診断に用いる、請求項４に記載の方法。
  11. ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋまたはｎｕｋ受容体、そのタンパク質、ペプチド、変異体、断片および誘導体のいずれか一種を備える受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、
    候補治療薬を該培養細胞へ投与する工程と、
    候補治療薬の存在下または不在下での該受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較した場合と相関させる工程と、
    それにより、Ｅｐｈ発現を低下させ、Ｅｐｈ分子を活性化する候補治療薬を同定する工程と、
    それによって、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える、腫瘍の治療用候補治療薬の同定方法。
  12. Ｅｐｈ分子の活性化が、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈおよび候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較した場合のチロシン分子のリン酸化によって測定される、請求項１１に記載の方法。
  13. Ｅｐｈの発現が、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較される、請求項１１に記載の方法。
  14. エフリン分子、エフリン特異抗体、そのペプチド、変異体および断片を備える、Ｅｐｈ受容体をモジュレートするための組成物。
  15. エフリン分子がエフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片をさらに備える、請求項１４に記載の組成物。
  16. エフリン、エフリンＡ１、そのペプチド、変異体および断片を備える治療上有効な量の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与する工程と、
    腫瘍におけるＥｐｈの発現をモジュレートする工程と、
    それにより、ＥｐｈＡ２陽性腫瘍を改善する工程とを備える、ＥｐｈＡ２陽性腫瘍に罹患している被験体の治療方法。
  17. エフリン分子が、前記ＥｐｈＡ２受容体への結合、該受容体の活性化かつ／または該ＥｐｈＡ２受容体の細胞内在化によりＥｐｈの発現をモジュレートする、請求項１６に記載の方法。
  18. Ｅｐｈ受容体の活性化が、ＥｐｈＡ２分子のリン酸化を検出することにより測定される、請求項１６に記載の方法。
  19. エフリン分子が、エフリンＡ１タンパク質、そのペプチド、変異体および断片である、請求項１６に記載の方法。
  20. エフリンを備える医薬組成物が化学療法剤と併用して患者に投与される、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記医薬組成物がＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗体を備える、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記医薬組成物が、静脈内投与、滑液嚢内投与、経皮投与、筋内投与、皮下投与または経口投与によって患者に投与される、請求項１６に記載の方法。
  23. 被験体試料中の少なくとも一種または複数のＥｐｈバイオマーカーおよび／またはそのリガンドを検出する工程、および一種または複数のＥｐｈバイオマーカーおよび／またはそのリガンドの該検出を悪性腫瘍の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの該検出を考慮に入れ、該Ｅｐｈバイオマーカーは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋおよびｎｕｋ受容体、そのペプチドまたは断片の一種または複数であり、該リガンドは、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片の少なくとも一種を備える工程と、
    一種または複数のバイオマーカーの該検出を悪性腫瘍の診断と相関させる工程であって、該相関は、正常被験体と比較した場合の各診断における一種または複数のバイオマーカーの該検出を考慮に入れる工程とを備える、腫瘍の悪性または侵襲性を測定する方法。
  24. 前記Ｅｐｈバイオマーカーが不活性ＥｐｈＡ２であり、良性腫瘍および正常細胞と比較した場合の濃度増加で検出される、請求項２３に記載の方法。
  25. ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋ、ｎｕｋ、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３のいずれか一種により特定される少なくとも一種のバイオマーカーと、
    損傷を受けた神経細胞を有している疑いのあるヒト被験体から単離した生体試料を保持するための基材と、
    該バイオマーカーの少なくとも一種または複数を検出する抗体と、
    該薬剤を該生体試料または該生体試料の一部と反応させ、該生体試料における少なくとも一種のマーカーの存在または量を検出するための、印刷された取扱説明書とを備える、被験体の癌を診断するためのキット。
  26. ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋ、ｎｕｋ、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３により特定される複数のバイオマーカーを備える、請求項２５に記載のキット。
  27. ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４およびＥｐｈＢ５、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｅｃｋ、ｓｅｋ、ｍｅｋ４、ｈｅｋ、ｈｅｋ２、ｅｅｋ、ｅｒｋ、ｔｙｒｏ１、ｔｙｒｏ４、ｔｙｒｏ５、ｔｙｒｏ６、ｔｙｒｏ１１、ｃｅｋ４、ｃｅｋ５、ｃｅｋ６、ｃｅｋ７、ｃｅｋ８、ｃｅｋ９、ｃｅｋ１０、ｂｓｋ、ｒｔｋ１、ｒｔｋ２、ｒｔｋ３、ｍｙｋ１、ｍｙｋ２、ｅｈｋ１、ｅｈｋ２、ｐａｇｌｉａｃｃｉｏ、ｈｔｋ、ｅｒｋ、ｎｕｋ、エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３のいずれか一種に特異的な少なくとも一種の抗体を備える、請求項２５に記載のキット。
  28. エフリン−Ａ１、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２またはエフリン−Ｂ３、その変異体および断片のいずれか一種を備える受容体を発現する単離細胞を培養する工程と、
    候補治療薬を該培養細胞への投与する工程と、
    候補治療薬の存在下または不在下での該受容体の発現レベルおよびリン酸化を、正常細胞、およびエフリン分子の存在下で培養した細胞と比較した場合と相関させる工程と、
    エフリン分子に結合する候補治療薬を同定する工程と、
    それにより、腫瘍治療用の候補治療薬を同定する工程とを備える、腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法。
  29. 候補治療薬が正常細胞および癌細胞に投与され、エフリン分子への結合についてアッセイされる、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記候補治療薬のエフリン分子への結合が、前記治療薬の正常細胞および癌細胞への結合と比較される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記候補治療薬のエフリン分子への結合が、Ｅｐｈ分子の発現および活性化と比較され、Ｅｐｈ分子の活性化が、正常細胞におけるＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈと比較した場合のチロシン分子のリン酸化によって測定される、請求項２８に記載の方法。
  32. Ｅｐｈの発現が、正常細胞でのＥｐｈ、そのエフリンリガンドの存在下でのＥｐｈ＋細胞、および候補治療薬の存在下でのＥｐｈ＋細胞と比較される、請求項３１に記載の方法。
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