ES2379297T3

ES2379297T3 - Perfil de expresión de cáncer de próstata

Info

Publication number: ES2379297T3
Application number: ES08006028T
Authority: ES
Inventors: Mark A. Rubin; Arul M. Chinnaiyan; Arun Sreekumar
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 2001-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2012-04-24
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: US20030175736A1; US20060211017A1; EP1511855A4; NZ530954A; JP2005518522A; AU2002355852B2; US7767393B2; WO2003012067A2; CA2456184A1; CA2456184C; EP2003213B1; US7229774B2; AU2002355852C1; EP1511855A2; WO2003012067A3; JP4251357B2; EP2003213A3; EP2003213A2; ATE538215T1

Abstract

Un procedimiento para caracterizar tejido de próstata in vitro o ex vivo que comprende: a) proporcionar una muestra de tejido de próstata de un sujeto;b) detectar un nivel de expresión de un marcador en dicha muestra; y c) caracterizar dicha muestra de tejido de próstata, en el que dicho marcador comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº : 95 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, en el que dicha muestra de tejido de próstata se caracteriza como cáncer de próstata cuando dicho nivel de expresión es elevado con respecto a un tejido de próstata no canceroso.

Description

Perfil de expresión de cáncer de próstata

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos para el diagnóstico del cáncer que incluyen, pero no se limitan a, marcadores de cáncer. En particular, la presente invención proporciona perfiles de expresión génica asociados a cánceres de próstata. La presente invención proporciona además marcadores novedosos útiles para el diagnóstico, la caracterización y el tratamiento de cánceres de próstata.

Antecedentes de la invención

Aquejando a uno de cada nueve hombres de más de 65 años, el cáncer de próstata (PCA) es una causa frecuente de muerte relacionada con el cáncer masculino, sólo comparable al cáncer de pulmón (Abate-Shen y Shen, Genes Dev 14:2410 [2000]; Ruijter y col., Endocr Rev, 20:22 [1999]). La Sociedad americana del cáncer estima que a aproximadamente 184.500 americanos se les diagnosticará cáncer de próstata y 39.200 morirán en 2001.

El cáncer de próstata se diagnostica normalmente con un examen rectal digital y/o cribado de antígenos específicos de la próstata (PSA). Un nivel de PSA en suero elevado puede indicar la presencia de PCA. El PSA se usa como marcador para cáncer de próstata debido a que sólo es secretado por las células de la próstata. Una próstata sana producirá una cantidad estable, normalmente inferior 4 nanogramos por mililitro, o una lectura de PSA de “4” o menos, mientras que las células cancerosas producen cantidades crecientes que se corresponden con la gravedad del cáncer. Un nivel entre 4 y 10 puede producir una sospecha del médico de que un paciente tiene cáncer de próstata, mientras que cantidades superiores a 50 pueden mostrar que el tumor se ha diseminado a cualquier parte en el cuerpo.

Cuando el PSA o las pruebas digitales indican una fuerte probabilidad de que el cáncer está presente, se usa un ultrasonido transrectal (TRUS) para mapear la próstata y mostrar cualquier área sospechosa. Se usan biopsias de diversos sectores de la próstata para determinar si el cáncer de próstata está presente. Las opciones de tratamiento dependen del estado del cáncer. Hombres con una esperanza de vida de 10 años o menos que tienen un número de Gleason bajo y cuyo tumor no se ha diseminado más allá de la próstata son frecuentemente tratados con espera vigilada (sin tratamiento). Las opciones de tratamiento para cánceres más agresivos incluyen tratamientos quirúrgicos tales como prostatectomía radical (PR), en la que la próstata es completamente extirpada (con o sin técnicas de preservación de los nervios) y radiación, aplicada por un haz externo que dirige la dosis a la próstata desde el exterior del cuerpo o por semillas radiactivas a baja dosis que son implantadas dentro de la próstata para destruir localmente células cancerosas. La terapia con hormona antiandrogénica también se usa, sola o conjuntamente con cirugía o radiación. La terapia hormonal usa análogos de las hormonas liberadoras de hormona luteinizante (LH-RH) que bloquean que la pituitaria produzca hormonas que estimulan la producción de testosterona. Los pacientes deben ponerse inyecciones de análogos de LH-RH durante el resto de sus vidas.

Aunque los tratamientos quirúrgicos y hormonales son frecuentemente eficaces para PCA localizado, la enfermedad avanzada sigue siendo esencialmente incurable. La ablación androgénica es la terapia más común para PCA avanzado, conduciendo a apoptosis masiva de células malignas dependientes de andrógenos y regresión del tumor temporal. En la mayoría de los casos, sin embargo, el tumor vuelve a emerger con ganas y puede proliferar independiente de señales androgénicas.

La aparición del cribado de antígenos específicos de la próstata (PSA) ha conducido a una detección precoz de PCA y a la reducción significativa de fatalidades asociadas al PCA. Sin embargo, el impacto del cribado de PSA sobre la mortalidad específica de cáncer es todavía desconocido en espera de los resultados de estudios de cribado al azar prospectivos (Etzioni y col., J. Natl. Cancer Inst., 91:1033 [1999]; Maattanen y col., Br. J. Cancer 79:1210 [1999]; Schroder y col., J. Natl. Cancer Inst., 90:1817 [1998]). Una limitación principal de la prueba de PSA en suero es una falta de sensibilidad y especificidad al cáncer de próstata especialmente en el intervalo intermedio de detección de PSA (4-10 ng/ml). Frecuentemente se detectan niveles de PSA en suero elevados en pacientes con afecciones no malignas tales como hiperplasia prostática benigna (HPB) y prostatitis, y proporcionan poca información sobre la agresividad del cáncer detectado. Coincidiendo con el aumento de la prueba de PSA en suero ha habido un espectacular aumento en el número de biopsias por punción de próstata realizadas (Jacobsen y col., JAMA 274:1445 [1995]). Esto ha producido una ola de biopsias por punción de próstata ambiguas (Epstein y Potter J. Urol.,

166:402 [2001]). Por tanto, se necesita el desarrollo de biomarcadores de suero y tejido adicionales para complementar el cribado de PSA.

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a composiciones y procedimientos para el diagnóstico del cáncer que incluyen, pero no se limitan a, marcadores de cáncer. En particular, la presente invención proporciona perfiles de expresión génica asociados a cánceres de próstata. La presente invención proporciona además marcadores novedosos útiles para el diagnóstico, la caracterización y el tratamiento de cánceres de próstata.

La presente invención proporciona además un procedimiento para caracterizar cáncer de próstata en un sujeto que comprende proporcionar una muestra tumoral de un sujeto diagnosticado con cáncer de próstata; y detectar el aumento de la expresión con respecto a un tejido de próstata no canceroso del marcador de cáncer EZH2, en el que el aumento de la expresión es diagnóstico de cáncer de próstata metastásico. En algunas realizaciones, la detección comprende detectar tres o más marcadores. En otras realizaciones, la detección comprende detectar cinco o más marcadores. En todavía otras realizaciones, la detección comprende detectar diez o más marcadores.

La presente invención proporciona un procedimiento para caracterizar tejido de próstata in vitro o ex vivo que comprende:

a) proporcionar una muestra de tejido de próstata de un sujeto; b) detectar un nivel de expresión de un marcador en dicha muestra; y c) caracterizar dicha muestra de tejido de próstata, en el que dicho marcador comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, en el que dicha muestra de tejido de próstata se caracteriza como cáncer de próstata cuando dicho nivel de expresión es elevado con respecto a un tejido de próstata no canceroso.

La presente invención proporciona además un modulador para inhibir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95, o un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico, en una célula para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata, en el que dicho modulador se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un dúplex de ARN y un fármaco.

La presente invención proporciona un procedimiento para caracterizar tejido de próstata en un sujeto que comprende proporcionar una muestra de tejido de próstata de un sujeto; y detectar la presencia o ausencia de expresión de EZH2 en la muestra, caracterizándose así la muestra de tejido de próstata. En algunas realizaciones, detectar la presencia de expresión de EZH2 comprende detectar la presencia de ARNm de EZH2 (por ejemplo, que incluye, pero no se limita a, exponer el ARNm de hepsina a una sonda de ácido nucleico complementaria al ARNm de hepsina). En otras realizaciones, detectar la presencia de expresión de EZH2 comprende detectar la presencia de un polipéptido de EZH2 (por ejemplo, que incluye, pero no se limita a, exponer el polipéptido de EZH2 a un anticuerpo específico para el polipéptido de EZH2 y detectar la unión del anticuerpo al polipéptido de EZH2). En algunas realizaciones, el sujeto comprende un sujeto humano. En algunas realizaciones, la muestra comprende tejido tumoral. En algunas realizaciones, caracterizar el tejido de próstata comprende identificar una fase de cáncer de próstata en el tejido de próstata. En ciertas realizaciones, la fase se selecciona del grupo que incluye, pero no se limitan a, neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, hiperplasia prostática benigna, carcinoma de próstata y carcinoma de próstata metastásico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la fase de proporcionar un pronóstico para el sujeto (por ejemplo, un riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico).

La presente invención proporciona un procedimiento de cribar compuestos que comprende:

a) proporcionar

i) una muestra de células de la próstata; y ii) uno o más compuestos de prueba; y

b) poner en contacto dicha muestra de células de la próstata con dicho compuesto de prueba in vitro o ex vivo; y c) detectar un cambio en la expresión de un marcador en dicha muestra de células de la próstata en presencia de dicho compuesto de prueba con respecto a la ausencia de dicho compuesto de prueba, en el que dicho marcador es una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos.

En todavía otras realizaciones, la presente invención proporciona un procedimiento de cribar compuestos que comprende proporcionar una muestra de células de la próstata; y uno o más compuestos de prueba; y poner en contacto la muestra de células de la próstata con el compuesto de prueba; y detectar un cambio en la expresión de EZH2 en la muestra de células de la próstata en presencia del compuesto de prueba con respecto a la ausencia del compuesto de prueba. En algunas realizaciones, la detección comprende detectar ARNm de EZH2. En otras realizaciones, la detección comprende detectar polipéptido de EZH2. En algunas realizaciones, la célula es in vitro; mientras que en otras realizaciones la célula es in vivo. En algunas realizaciones, el compuesto de prueba comprende un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el compuesto de prueba comprende un fármaco.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un perfil de expresión génica de muestras de cáncer de próstata. La Figura 1a muestra un dendrograma que describe la vinculación de las muestras. La Figura 1b muestra un diagrama por grupos de los grupos de muestras comparados con el conjunto de próstata adyacente normal como referencia. La Figura 1c muestra un diagrama por grupos de los grupos de muestras comparados con la referencia del conjunto de próstata comercial. La Figura 2 muestra agrupaciones funcionales de genes diferencialmente expresados en cáncer de próstata. La Figura 3 muestra la expresión de hepsina en muestras de cáncer de próstata como se ha determinado por análisis de transferencia Northern e inmunohistoquímica. La Figura 3a muestra análisis de transferencia Northern de hepsina humana (arriba) y normalización con GAPDH (abajo). NAP indica tejido de próstata adyacente normal y PCA indica cáncer de próstata. La Figura 3b muestra micromatrices de tejido usadas para el análisis de hepsina. La Figura 3c muestra un histograma de la expresión de la proteína de hepsina por tipo de tejido. Hiperplasia prostática benigna (HPB). Neoplasia intraepitelial de alto grado (NIP-AG). Cáncer de próstata localizado (PCA). Cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal (MET). La Figura 3d muestra análisis de Kaplan-Meier. La Figura 4 muestra la expresión de pim-1 en muestras de cáncer de próstata como se ha determinado por análisis de transferencia Northern e inmunohistoquímica. La Figura 4a muestra un histograma de la expresión de la proteína de pim-1 por tipo de tejido como se evalúa a partir de 810 elementos de micromatrices de tejido. Neoplasia intraepitelial de alto grado (NIP-AG). Cáncer de próstata localizado (PCA). La Figura 4b muestra un análisis de Kaplan-Meier. La línea superior representa pacientes con tinción de pim-1 fuerte. La línea inferior representa pacientes con expresión de pim-1 ausente/débil. La Figura 5 muestra una comparación de perfiles de expresión génica para tejido de próstata adyacente normal y referencia de tejido de próstata normal. La Figura 6 muestra una agrupación centrada de genes relacionados con cáncer de próstata. La Figura 7 muestra los datos para la selección de genes basándose en estadísticas de la t por ordenador para los conjuntos de PAB y CP. La Figura 8 muestra una visión general de genes diferencialmente expresados en cáncer de próstata. La Figura 9 describe números de acceso y números de ID de secuencias para genes modo de ejemplo de la presente invención. La Figura 10 proporciona secuencias a modo de ejemplo de algunos genes de la presente invención. La Figura 11 es una visión general del descubrimiento y la caracterización de AMACR en cáncer de próstata utilizado en algunas realizaciones de la presente invención. La Figura 12 describe un microanálisis de ADN de la expresión de AMACR en cáncer de próstata. La Figura 13 describe un análisis de niveles de transcritos y de proteínas de AMACR en cáncer de próstata. La Figura 14 describe un análisis de la expresión de proteínas de AMACR usando micromatrices de tejido de cáncer de próstata. La Figura 15 muestra expresión génica relativa de AMACR en varias muestras. La Figura 16 muestra la expresión de proteínas de AMACR en PCA. La Figura 19A muestra la expresión de proteínas de AMACR en PCA sin tratamiento previo hormonal localizado. La Figura 19B muestra la fuerte expresión de AMACR en una metástasis de ganglio linfático sin tratamiento previo. Las barras de error representan el IC del 95% de la expresión media del cáncer de próstata sin tratamiento previo primario y metástasis de ganglio linfático correspondientes. La Figura 17 muestra el efecto hormonal sobre la expresión de AMACR. La Figura 17A muestra PCA que demuestra el fuerte efecto hormonal debido al tratamiento antiandrogénico. La Figura 17B muestra análisis de transferencia Western que representa la expresión de AMACR de referencia en diferentes líneas de células de la próstata (izquierda) y análisis de transferencia Western de células LNCaP para expresión de AMACR y PSA después del tratamiento con un andrógeno o un antiandrógeno durante 24 h y 48 horas (derecha). La Figura 18 muestra la expresión en exceso de AMACR en múltiples tumores. La expresión de proteínas de AMACR se evaluó por inmunohistoquímica en una micromatriz de múltiples tumores y de tejido de cáncer de mama. El porcentaje de casos con tinción positiva (intensidad de tinción moderada y fuerte) se resume en el eje Y. La barra izquierda representa tinción negativa o débil y la barra derecha representa tinción moderada o fuerte. La Figura 19 muestra los resultados de microdisección por captura láser (LCM) y amplificación por RT-PCR de AMACR en cáncer de próstata. Se usó LCM para aislar cáncer de próstata puro y glándulas benignas y la expresión génica de AMACR se caracterizó por RT-PCR en 2 prostatectomías radicales. Se usó un gen constitutivamente expresado, GAPDH, como control cuantitativo del ARNm de entrada. La expresión de AMACR es apenas detectable en glándulas benignas, y es elevada en cáncer de próstata. La Figura 20 describe la identificación y la validación de la expresión en exceso de EZH2 en cáncer de próstata metastásico. La Figura 20a muestra un diagrama por grupos que representa genes que distinguen molecularmente cáncer de próstata metastásico (MET) de cáncer de próstata clínicamente localizado (PCA). La Figura 20b muestra un análisis de micromatrices de ADN de cáncer de próstata que revela la regulación por aumento de EZH2 en cáncer de próstata metastásico. La Figura 20c muestra análisis de RT-PCR del transcrito de EZH2 en tejido y líneas de células de la próstata. La Figura 20d muestra el aumento de la expresión de la proteína EZH2 en cáncer de próstata. La Figura 21 muestra que los niveles de proteína EZH2 establecen una correlación con la progresión letal y la agresividad del cáncer de próstata. La Figura 21a muestra análisis de micromatrices de tejido de la expresión de EZH2. La expresión de proteínas de EZH2 media para los tejidos de próstata indicados se resume usando las barras de error con intervalos de confianza del 95%. La Figura 21b muestra un análisis de Kaplan-Meier que demuestra que los pacientes con cánceres de próstata clínicamente localizados que tienen alta expresión de EZH2 (tinción moderada/fuerte) tienen un mayor riesgo de reaparición del cáncer de próstata después de la prostatectomía (prueba del orden logarítmico, p= 0,03). La Figura 22 muestra la función de EZH2 en la proliferación de células de la próstata. La Figura 22a muestra un análisis de inmunotransferencia de ARN interferente usando dúplex de ARNip que eligen como diana la secuencia de EZH2 en células de la próstata. La Figura 22b muestra que el ARN interferente de EZH2 disminuye la proliferación celular como se evalúa por el ensayo de recuento de células. La Figura 22c muestra que el ARN interferente de EZH2 inhibe la proliferación celular como se evalúa por ensayo de WST. La Figura 22d muestra que el ARN interferente de EZH2 induce la detención de G2/M de células de la próstata. La Figura 23 muestra que EZH2 sirve de represor transcripcional en células de la próstata. La Figura 23a muestra un diagrama esquemático de construcciones de EZH2 usadas en análisis de transfección/transcriptoma. ER, dominio de unión a ligando modificado del receptor de estrógenos. H-1 y H-2, dominios de homología 1 y 2 que comparten similitud entre EZH2 y E(z). CYS, dominio rico en cisteína. SET, dominio SET. TAG, marca del epítope myc. NLS, señal de localización nuclear. La Figura 23b muestra la confirmación de la expresión de construcciones de EZH2 usadas en a. Se usó un anticuerpo anti-myc. La Figura 23c muestra un diagrama por grupos de genes que están significativamente reprimidos por la expresión de EZH2 en exceso. La Figura 23d muestra análisis de SAM de perfiles de expresión génica de células transfectadas con EZH2 en comparación con células transfectadas con EZH2.SET. La Figura 23e muestra un modelo para posibles interacciones funcionales de EZH2 como se aclara por análisis de transcriptoma y se pone en el contexto de interacciones previamente informadas. +, inducción. -, represión. La Figura 24 muestra la detección de AMACR en líneas celulares de PCA. La Figura 25 muestra la detección de la proteína de AMACR en suero por cuantificación de datos de micromatrices. La Figura 26 muestra un análisis de inmunotransferencia de suero de pacientes con antígeno PSA tanto negativo como positivo. La Figura 27 muestra un análisis de inmunotransferencia de la presencia de AMACR en muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga (mujeres) o cáncer de vejiga y PSA elevado (hombres). La Figura 28 muestra datos representativos de una respuesta humoral por análisis de micromatrices de proteínas. La Figura 29 muestra el análisis de inmunotransferencia de la respuesta humoral de AMACR. La Figura 29a muestra un análisis de inmunotransferencia de la respuesta humoral a AMACR. La Figura 29b muestra un experimento de control en el que se bloqueó la respuesta humoral. La Figura 30 muestra niveles de transcritos de GP73 en cáncer de próstata. La Figura 30a muestra el nivel de GP73 en muestras individuales después del análisis de micromatrices. La Figura 30b muestra el resultado de transcritos de GP73 determinado por análisis de micromatrices de ADN de 76 muestras de próstata agrupadas según el tipo de muestra y promediadas. La Figura 31 muestra que la proteína GP73 está regulada por aumento en cáncer de próstata. La Figura 31a muestra análisis de transferencia Western de la proteína GP73 en cáncer de próstata. La Figura 31b muestra un análisis de inmunotransferencia de la proteína residente en Golgi golgina 97. La Figura 32 muestra el análisis de inmunotransferencia de células epiteliales normales y de cáncer de próstata. La Figura 33 muestra la expresión de ADNc de miembros seleccionados de la familia de genes de anexina. La Figura 34 muestra una representación en mapa de calor de la expresión génica de la familia de la anexina a lo largo de cuatro estudios de perfilado de cáncer de próstata. La expresión en exceso y en defecto al nivel de los transcritos se representa por tonos de rojo y verde, respectivamente. El tono gris indica que estuvieron disponibles datos insuficientes. Cada cuadrado representa una muestra de tejido individual. La Figura 35 muestra la expresión de proteínas CtBP en especímenes de PCA. La Figura 36 muestra el análisis de micromatrices de tejido de CtBP en cáncer de próstata que sugiere la localización incorrecta durante la progresión del cáncer de próstata. La Figura 37 muestra el fraccionamiento subcelular de células LNCaP. La Figura 38 muestra un análisis de Kaplan-Meier de datos de micromatrices de tejido de cáncer de próstata.

Descripción general

La invención se define en las reivindicaciones. La exploración del sistema de circuito molecular que diferencia PCA inactivo de PCA agresivo tiene la posibilidad de conducir al descubrimiento de marcadores pronósticos y dianas terapéuticas novedosas. La comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis de próstata también se deduce por un enfoque molecular global tal. Similar al cáncer de mama (Lopez-Otin y Diamandis, Endor. Rev., 19:365 [1998]), el PCA se desarrolla en un medio complejo de factores genéticos y medioambientales en los que la señalización de las hormonas esteroides desempeña una función central. La lesión precursora primaria del PCA, la neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (NIP-AG), tiene varias características similares a otros carcinomas invasivos precoces (es decir, anomalías cromosómicas y características citológicas). La pérdida de regiones cromosómicas específicas (por ejemplo, 8p21, 10q, 13q, 17p), junto con pérdidas y mutaciones de genes supresores de tumores tales como Nkx3.1, PTEN, Rb y p53, participan en la iniciación y la progresión del cáncer de próstata (Abate-Shen y Shen, arriba). Con la aparición de estrategias de perfilado global, ahora es posible un análisis sistemático de genes implicados en PCA. La tecnología de micromatrices de ADN está revolucionando la forma en la que se tratan cuestiones biológicas fundamentales en la era posgenómica. En vez del enfoque tradicional de basarse en un gen cada vez, las metodologías a escala genómica permiten conseguir una perspectiva global. La potencia de este enfoque se basa en su capacidad para analizar comparativamente patrones de genoma amplio de expresión de ARNm (Brown y Botstein, Nat. Gent., 21:33 [1999]). La obtención de perfiles de expresión génica a gran escala de tumores permite la identificación de subconjuntos de genes que sirven de marcadores pronósticos de enfermedad o factores pronósticos biológicos de respuesta terapéutica (Emmert-Buck y col., Am. J. Pathol., 156:1109 [2000]). Golub y col. usaron matrices de ADN en la clasificación molecular de leucemias agudas (Golub y col., Science 286:531 [1999], que demuestra la viabilidad del uso de micromatrices para identificar nuevas clases de cáncer (descubrimiento de clases) y para asignar tumores a clases conocidas (predicción de clases)). Usando un enfoque similar, Alizadeh y col. mostraron que el linfoma de linfocitos B grande difuso podría diseccionarse en dos categorías pronósticas por perfilado de expresión génica (Alizadeh y col., Nature 403:503 [2000]). Proporcionaron pruebas de que los linfomas que poseen una firma de expresión génica característica de linfocitos B del centro germinal tenían un pronóstico más favorable que aquellos que expresaban genes característicos de linfocitos B periféricos activados. Se han realizado clasificaciones a gran escala similares de cáncer de mama y melanoma y, al igual que con los otros estudios, la clasificación molecular fue el foco primario (Alizadeh y col., arriba).

Por consiguiente, la presente invención está relacionada con un análisis de perfiles de expresión génica en tejido de próstata benigno y maligno. Tres genes candidatos, AMACR, hepsina y pim-1, identificados por análisis de micromatrices de ADN de PCA, se caracterizaron al nivel de las proteínas usando micromatrices de tejido de PCA. El análisis de los perfiles de expresión génica diferenciales de próstata normal y neoplásica ha conducido a la identificación de un conjunto seleccionado de genes que definen una firma molecular para PCA. Los experimentos de perfilado de la expresión de la presente invención demuestran una función para múltiples alteraciones génicas de la expresión colectiva que se manifiesta por último lugar como el fenotipo neoplásico. Haciendo hibridaciones comparativas directas de tejidos normales y neoplásicos se identifican genes que distinguen molecularmente tejido benigno de maligno.

La a-metilacil-CoA racemasa (AMACR) es una enzima que desempeña una función importante en la biosíntesis del ácido biliar y la �-oxidación de ácidos grasos de cadena ramificada (Ferdinandusse y col., J. Lipid Res., 41:1890 [2000]; Kotti y col., J. Biol. Chem., 275:20887 [2000]). Se ha mostrado que las mutaciones del gen AMACR producen neuropatía motora sensorial de aparición en adultos (Ferdinandusse y col., Nat. Genet., 24:188 [2000]). En casos de biopsias de próstata diagnósticamente problemáticas, los anatomopatólogos frecuentemente emplean los marcadores de células basales 34�E12 o p63, que tiñen la capa de células basales de glándulas benignas que no están presentes en glándulas malignas. Por tanto, en muchos especímenes de biopsia, el anatomopatólogo debe basarse en la ausencia de tinción para hacer el diagnóstico final de cáncer de próstata. Los experimentos realizados durante el desarrollo de la presente invención identificaron AMACR como un marcador expresado en tejido de biopsia cancerosa. Por tanto, la utilidad clínica de AMACR en biopsias por punción de próstata es grande. Por ejemplo, en el Centro médico de la Universidad de Michigan, al año se realizan aproximadamente 400 biopsias por punción de próstata y aproximadamente el 20% requieren el uso de un marcador específico de células basales para evaluar lesiones difíciles caracterizadas por una pequeña cantidad de glándulas atípicas. Por consiguiente, se contempla que, en combinación con marcadores específicos de células basales tales como 34�E12 o p63, el cribado para la expresión de AMACR mediante los procedimientos de la presente invención produce menos casos diagnosticados como “atípicos sin un diagnóstico definitivo”.

La identificación de la expresión en exceso de AMACR en cáncer de próstata tiene utilidad clínica más allá de los usos diagnósticos. Los experimentos realizados durante el desarrollo de la presente invención revelaron que el único tejido no canceroso que expresa niveles significativos de la proteína de AMACR es el hígado humano. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que se requiere la actividad de AMACR para el crecimiento de cáncer de próstata y en virtud de su especificidad sirve de diana terapéutica.

Experimentos adicionales relacionados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención investigaron la expresión de AMACR en diferentes grupos de cáncer de próstata, que incluyen el aspecto de la supresión hormonal neoadyuvante en enfermedad localizada. Se encontró que la expresión de AMACR era independiente de hormonas en experimentos en cultivo celular. El PSA, un gen conocido por ser regulado por andrógenos, demostró alteraciones relacionadas con hormonas en la expresión bajo las mismas condiciones. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que estos hallazgos proporcionan pruebas de que AMACR no es regulado por la ruta de andrógenos. Se contempla adicionalmente que la disminución de la expresión de AMACR en tejido resistente al tratamiento hormonal permite el uso de AMACR como biomarcador para resistencia a hormonas. También se contempla que, dado el hecho de que el tratamiento hormonal en el significado de supresión hormonal no afectó la expresión de AMACR en el cultivo celular, algún otro mecanismo distinto de la ruta de andrógenos es responsable de la regulación por disminución de AMACR en la integridad del tejido con cáncer.

La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que, alternativamente, AMACR se expresa en exceso en el desarrollo de cáncer, desempeñando quizás una función importante en proporcionar energía para las células neoplásicas. Sin embargo, como los tumores se desdiferencian, ya no requieren estas fuentes de energía. Se contempla que tumores poco diferenciados puedan apoderarse de otras rutas para realizar esta misma actividad de oxidación de ácidos grasos ramificados. No hay asociación con la tasa proliferativa de las células tumorales y la expresión de AMACR.

La expresión de AMACR también se examinó en otros cánceres. El examen de otros tumores demostró que el cáncer de colon tiene la mayor expresión de AMACR. Como no se sabe que los cánceres colorrectales estén hormonalmente regulados, el hecho de que la desdiferenciación y la disminución de la expresión de AMACR guardaran relación con PCA soporta adicionalmente la hipótesis de que la desdiferenciación conduce a una diminución de la expresión de AMACR en el PCA metastásico resistente al tratamiento hormonal. El tratamiento hormonal también es una terapia de primera línea en el cáncer de próstata metastásico, pero se sabe que pierde eficacia, seleccionando clones insensibles a hormonas. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que este fenómeno explica la observación de que el fuerte efecto del tratamiento hormonal está de acuerdo con la disminución de la expresión de AMACR debido a la selección de células potencialmente más desdiferenciadas.

El producto génico de AMACR es una enzima que desempeña una función importante en la biosíntesis de ácidos biliares y la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena ramificada (Kotti y col., J. Biol. Chem. 275:20887 [2000]; Ferdinandusse y col., J Lipid Res 42:137 [2001]). La expresión en exceso de AMACR se produce en tumores con un alto porcentaje de lípidos tales como PCA y cáncer colorrectal. La relación entre consumo de ácidos grasos y cáncer es un asunto controvertido en el desarrollo de PCA y cáncer colorrectal (Moyad, Curr Opin Urol 11:457 [2001]; Willett, Oncologist 5:393 [2000]). Se ha demostrado una función esencial para AMACR en la oxidación de productos intermedios de ácidos biliares. AMACR codifica una enzima que cataliza la racemización de tioésteres de la coenzima A carboxílicos ramificados con alfa-metilo y está localizado en peroxisomas y mitocondrias (Schmitz y col., Eur J Biochem 231:815 [1995]). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que, como AMACR participa en el metabolismo de lípidos, esto conduce a alteraciones en el equilibrio oxidante de una célula. Se contempla adicionalmente que estos cambios están asociados a lesión de ADN, transformación maligna y otros parámetros de alteraciones de las células.

Experimentos adicionales realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención demostraron que el ARNm de AMACR y el producto de proteínas se expresan en exceso en varios adenocarcinomas que incluyen colorrectal, próstata, mama y ovario, y melanoma. El adenocarcinoma de colorrecto y próstata demostró expresión en exceso de AMACR coherente (92% y 83% de tumor, respectivamente). Por tanto, AMACR es útil en el diagnóstico de neoplasia colónica. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, AMACR se usa en el diagnóstico de displasia. Específicamente, en el establecimiento de enfermedad inflamatoria del intestino (EII), cuando la identificación de displasia puede ser diagnósticamente problemática, se evalúan lesiones putativas para la intensidad de expresión de proteínas de AMACR. En algunas realizaciones, esto se realiza conjuntamente con el análisis del gen adenomatous polyposis coli, ya que también se cree que mutaciones en este gen se producen pronto en el desarrollo de neoplasia colorrectal (Kinzler y Vogelstein, Cell 87:159 [1996]; Tsao y Shibata, Am J Pathol 145: 531 [1994]).

Los adenomas colónicos (Kinzler y Vogelstein, arriba; Tsao y Shibata, arriba) y NIP de alto grado (McNeal y Bostwick, Hum Pathol 17:64 [1986]; McNeal y col., Lancet 1:60 [1986]) son precursores muy conocidos de cáncer colónico invasivo y de próstata, respectivamente. Los experimentos realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención demostraron que AMACR se expresa en exceso en adenomas colorrectales (75%) y NIP de alto grado (64%). Otra expresión de AMACR secundaria en lesiones neoplásicas tempranas fue la presencia de expresión de AMACR focal en algunas lesiones de próstata atróficas. Algunas lesiones atróficas (es decir, atrofia inflamatoria proliferativa e hiperplasia posatrófica) se han reconocido recientemente como de naturaleza proliferativa con alteraciones moleculares sugerentes de cambios neoplásicos tempranos (De Marzo y col., Am J Pathol 155:1985 [1999]; Shah y col., Am J Pathol 158:1767 [2001]). También se observó que algunas próstatas morfológicamente benignas tienen tinción de AMACR moderada focal. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que AMACR puede tener una función en las fases tempranas del desarrollo del cáncer.

Varios cánceres que están asociados a expresión en exceso de AMACR, que incluyen cáncer colorrectal, de próstata y de mama, se han ligado a una dieta rica en grasas. El mecanismo exacto de cómo la dieta rica en grasas contribuye a la tumorigénesis en estos sistemas de órganos es desconocido, pero pruebas emergentes sugieren que la ruta mediada por el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) desempeña una función crítica (Debril y col., J. Mol. Med. 79:30 [2001]). Se ha mostrado que los ácidos grasos de la dieta sirven de proliferadores de peroxisomas y se unen a y activan PPAR (Zomer y col., J. Lipid Res. 41:1801 [2000]), una familia de factores de transcripción de receptores nucleares. Las rutas mediadas por la activación de PPAR controlan a su vez la proliferación y diferenciación celular. Además, también pueden alterar el equilibrio oxidante celular (Yeldandi y col., Mutat. Res. 448:159 [2000]). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que estos efectos actúan de forma concertada para contribuir a la tumorigénesis de varios cánceres. Esta hipótesis está soportada por los hallazgos de que los proliferadores de peroxisomas, cuando se administran a ratones, potencian el desarrollo de pólipos adenomatosos de colon en ratones (Saez y col., Nat. Med. 4:1058 [1998]). Además, los PPAR se expresan en varias líneas de células de cáncer de próstata y sus ligandos, y los proliferadores de peroxisomas, cuando se añaden al cultivo, afectan el crecimiento de estas líneas celulares (Shappell y col., Cancer Res. 61:497 [2001]; Mueller y col., PNAS 97:10990 [2000]). Un ensayo clínico de fase II también mostró que la troglitazona, un activador de PPARy, podría estabilizar el nivel de PSA en pacientes con cáncer de próstata (Kubota y col., Cancer Res. 58:3344 [1998]; Hisatake y col., Cancer Res. 60:5494 [2000]).

AMACR participa en la �-oxidación de ácido pristánico (Ferdinandusse y col., J. Lipid. Res. 41:1890 [2000]). El ácido pristánico puede actuar de activador de PPAR a y promover el crecimiento celular (Zomer y col., J. Lipid Res. 41:1801 [2000]). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que el funcionamiento excesivo de la ruta de �-oxidación conduce al agotamiento de moléculas reductoras y altera el estado del oxidante celular (Yeldandi y col., Mutat. Res. 448:159 [2000]).

La presente invención está relacionada con procedimientos que eligen como diana AMACR como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer. Expresado en exceso en un alto porcentaje de colorrectal, próstata, mama y melanoma, pero no en tejidos normales adyacentes, el AMACR es elegido como diana usando inhibidores de anticuerpos o de enzimas. Se espera que la toxicidad no sea un asunto importante debido a que los individuos con ausencia congénita de esta enzima no tienen o tienen manifestaciones clínicas insignificativas (Clayton y col., Biochem. Soc. Trans. 29:298 [2001]).

Los experimentos realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención demostraron adicionalmente que AMACR está presente en el suero de pacientes con cáncer de próstata. Además, se identificó una respuesta humoral a AMACR basándose en la presencia de anticuerpos para AMACR en el suero de pacientes con cáncer de próstata.

Las anexinas son un grupo de proteínas de unión a calcio estructuralmente relacionadas que tienen un dominio que se une a fosfolípidos y un dominio del extremo amino que determina la especificidad (Smith y col., Trends. Genet.

10:241 [1994]; Mailliard y col., J Biol. Chem. 271:719 [1996]). Las anexinas participan en la regulación del tráfico de la membrana, adhesión celular y posible tumorigénesis. Los experimentos realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención usaron micromatrices de ADNc para estudiar los patrones de expresión de múltiples miembros de la familia de las anexinas en un amplio intervalo de muestras de tejido de próstata con el fin de determinar su función en la progresión de PCA. Se empleó el meta-análisis de datos de expresión génica para ayudar adicionalmente a validar la expresión de los hallazgos de las matrices de ADNc. Finalmente se usaron micromatrices de tejido de alta densidad para evaluar los niveles de expresión de la proteína por inmunohistoquímica.

Se evaluaron ocho anexinas para sus niveles de expresión de ARNm en muestras de tejido prostático benigno, de PCA sin tratamiento previo hormonal localizado y de PCA resistentes al tratamiento hormonal metastásico. Cinco anexinas (1, 2, 4, 7 y 11) demostraron una regulación por disminución progresiva al nivel de los transcritos que iba desde el tejido prostático benigno hasta PCA localizado hasta PCA resistente al tratamiento hormonal. Con el fin de validar la expresión del hallazgo de matrices de ADNc de estos 5 miembros de la familia de las anexinas se realizó un meta-análisis que confirmó que cuando se miraba a través de los 4 estudios en los que al menos dos estudios informaron resultados, la anexina 1, 2, 4 y 6 estuvo significativamente reguladas por disminución en muestras de PCA localizado cuando se comparó con tejido prostático benigno. Por tanto, el meta-análisis confirma resultados sobre la anexina 1, 2 y 4. En estos ejemplos, la estadística de resumen a través de todos los conjuntos de datos encontró que estas anexinas estaban significativamente reguladas por disminución al nivel de ADNc. Sin embargo, no todos de los 4 estudios tuvieron regulación por disminución significativa. La anexina 4, por ejemplo, se reguló significativamente por disminución en dos de los cuatro estudios, pero la estadística de resumen resultante, que también tiene en cuenta el número de muestras evaluadas, fue estadísticamente significativa. No se encontró que las anexinas 7, 8 y 13 estuvieran significativamente expresadas por disminución. Como se demuestra en la Figura 1, la anexina 7 no disminuye significativamente cuando se compara con PCA localizado y PCA metastásico.

Los niveles de expresión de proteínas de las cinco anexinas anteriores probadas fueron estadísticamente significativamente disminuidos en muestras de PCA resistente al tratamiento hormonal cuando se compararon con tanto PCA localizado como tejido de próstata benigno. Cuatro de las 5 anexinas también demostraron una disminución en la expresión de proteínas en PCA clínicamente localizado con respecto a tejido de próstata benigno. Sin embargo, en ninguno de estos casos se encontró que la expresión de proteínas fuera significativamente disminuida. Este segundo procedimiento de validación al nivel de las proteínas confirmó los datos de la matriz de expresión de ADNc para anexina 1, 2, 4, 7 y 11.

Basándose en los datos de la matriz de expresión génica descritos en este documento, células de PCA localizado regulan por disminución sus niveles de ARNm de anexinas, pero mantienen los niveles de expresión de proteínas correspondientes. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que la alteración postraduccional puede compensar la disminución de ARNm, produciendo suficiente proteína para mantener niveles observados con muestras benignas. Como las anexinas desempeñan una función importante en el mantenimiento de la adhesión celular, una vez las células pierden eventualmente esta capacidad, puede producirse la progresión del tumor. Por tanto, como podría anticiparse, los niveles de expresión de anexina disminuyeron significativamente en las muestras de PCA resistente al tratamiento hormonal avanzado. Esto se confirmó al nivel de las proteínas por una disminución significativa como se demuestra por inmunohistoquímica.

Se observó una regulación por disminución secuencial de anexinas en tanto niveles transcripcionales como traduccionales en muestras de PCA metastásico. La anexina 1, también llamada lipocortina, se ha descrito como un inhibidor de la fosfolipasa A2 y sirvió de sustrato del receptor del factor de crecimiento epidérmico (Pepinsky y col., Nature 321:81 [1986]; Wallner y col., Nature 320:77 [1986]). La reducción significativa del nivel de proteínas se ha mostrado en células de tumor esofágico y de próstata (Paweletz y col., Cancer Res. 60:6293 [2000]). La anexina 2, también llamada p36, parece ser un sustrato eficiente de la proteína cinasa C y Src pp60 (Hubaishy y col., Biochemistry 34:14527 [1995]). La anexina 4, llamada endonexina, regula el flujo de Cl- mediando en la actividad de la calmodulina cinasa II (CaMKII) (Chan y col., J. Biol. Chem. 269:32464 [1994]). La anexina 7, sinexina, participa en la distrofia muscular de Duchenne (Selbert y col. Exp. Cell. Res. 222:199 [1996]). Su gene se localiza sobre el cromosoma humano 10q21 y su expresión de proteínas fue reducida en células tumorales resistentes al tratamiento hormonal. En conclusión, los resultados de los experimentos realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención sugieren que la regulación por disminución de varios miembros de la familia de las anexinas puede desempeñar una función en el desarrollo del fenotipo de PCA letal.

Experimentos adicionales realizados durante el transcurso del desarrollo de la presente invención identificaron marcadores adicionales que presentaron expresión alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) en cáncer de próstata. Marcadores adicionales incluyen, pero no se limitan a, BZH2, anexinas 1, 2, 4, 7 y 11, CTBP 1 y 2, GP73, ABCC5 (MDR5), ASNS, TOP2A y Vav2. En particular, EZH2 se identificó como un marcador que se expresó en exceso en cáncer de próstata y, en particular, en cáncer de próstata metastásico. Se identificó adicionalmente que EZH2 guardaba relación con fracaso clínico (por ejemplo, aumento de los niveles de PSA). Además, la inhibición de ARNip de EZH2 produjo una disminución en la proliferación celular de una línea de células de cáncer de próstata.

Por tanto, la presente invención identifica marcadores y dianas para agentes de diagnóstico y terapéuticos en una variedad de cánceres.

Definiciones

Para facilitar un entendimiento de la presente invención, a continuación se definen varias expresiones y frases.Las expresiones “epítope” como se usa en este documento se refiere a la porción de un antígeno que se pone en contacto con un anticuerpo particular.

Si una proteína o fragmento de una proteína se usa para inmunizar un animal huésped, numerosas regiones de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos que se unen específicamente a una región dada o estructura tridimensional sobre la proteína; estas regiones o estructuras se denominan en lo sucesivo “determinantes antigénicos”. Un determinante antigénico puede competir con el antígeno intacto (es decir, el “inmunogén” usado para provocar la respuesta inmunitaria) para unirse a un anticuerpo.

Las expresiones “unión específica” o “que se une específicamente” cuando se usan en referencia a la interacción de un anticuerpo y una proteína o péptido significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el determinante antigénico o epítope) sobre la proteína; en otras palabras, el anticuerpo está reconociendo y se une a una estructura de proteína específica en vez de a proteínas en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítope “A”, la presencia de una proteína que contiene el epítope A (o A sin marcar libre) en una reacción que contiene “A” marcado y el anticuerpo reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

Como se usa en este documento, la expresión “unión no específica” y “unión de referencia” cuando se usan en referencia a la interacción de un anticuerpo y una proteína o péptido se refieren a una interacción que no depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el anticuerpo está uniéndose a proteínas en general más que a una estructura particular tal como un epítope).

Como se usa en este documento, la expresión “sujeto” se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero) que incluye, pero no se limita a, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, las expresiones “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente en este documento en referencia a un sujeto humano.

Como se usa en este documento, la expresión “sujeto del que se sospecha que tiene cáncer” se refiere a un sujeto que presenta uno o más síntomas indicativos de un cáncer (por ejemplo, un bulto o masa perceptible) o que está siendo cribado para un cáncer (por ejemplo, durante un examen físico rutinario). Un sujeto del que se sospecha que tiene cáncer puede también tener uno o más factores de riesgo. Un sujeto del que se sospecha que tiene cáncer generalmente no ha sido probado para cáncer. Sin embargo, un “sujeto del que se sospecha que tiene cáncer” engloba un individuo que ha recibido un diagnóstico inicial (por ejemplo, un barrido de CT que muestra una masa o aumento del nivel de PSA), pero para el que no se conoce la fase de cáncer. La expresión incluye adicionalmente personas que han tenido alguna vez cáncer (por ejemplo, un individuo en remisión).

Como se usa en este documento, la expresión “sujeto en riesgo de cáncer” se refiere a un sujeto con uno o más factores de riesgo para desarrollar un cáncer específico. Los factores de riesgo incluyen, pero no se limitan a, sexo, edad, predisposición genética, exposición medioambiental, incidentes previos de cáncer, enfermedades no cancerígenas preexistentes y estilo de vida.

Como se usa en este documento, la expresión “caracterizar cáncer en el sujeto” se refiere a la identificación de una

o más propiedades de una muestra de cáncer en un sujeto que incluyen, pero no se limitan a, la presencia de tejido benigno, precanceroso o canceroso, la fase del cáncer y el pronóstico del sujeto. Los cánceres pueden caracterizarse por la identificación de la expresión de uno o más genes marcadores de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de cáncer desvelados en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión “caracterizar tejido de próstata en un sujeto” se refiere a la identificación de una o más propiedades de una muestra de tejido de próstata (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, la presencia de tejido canceroso, la presencia de tejido precanceroso que probablemente va a convertirse en canceroso y la presencia de tejido canceroso que probablemente va a metastatizar). En algunas realizaciones, los tejidos se caracterizan por la identificación de la expresión de uno o más genes marcadores de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de cáncer desvelados en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión “genes marcadores de cáncer” se refiere a un gen cuyo nivel de expresión, solo o en combinación con otros genes, guarda relación con cáncer o pronóstico de cáncer. La correlación puede referirse tanto a un aumento como una disminución de la expresión del gen. Por ejemplo, la expresión del gen puede ser indicativa de cáncer, o la falta de expresión del gen puede guardar relación con un mal pronóstico en un paciente con cáncer. La expresión de marcadores del cáncer puede caracterizarse usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, aquellos descritos en los Ejemplos ilustrativos 115 más adelante.

Como se usa en este documento, la expresión “un reactivo que detecta específicamente niveles de expresión” se refiere a reactivos usados para detectar la expresión de uno o más genes (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de cáncer de la presente invención). Ejemplos de reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, sondas de ácido nucleico que pueden hibridarse específicamente con el gen de interés, cebadores de PCR que pueden amplificar específicamente el gen de interés y anticuerpos que pueden unirse específicamente a proteínas expresadas por el gen de interés. Otros ejemplos no limitantes pueden encontrarse en la descripción y los ejemplos más adelante.

Como se usa en este documento, la expresión “detectar una disminución o aumento de la expresión con respecto a control de próstata no cancerosa” se refiere a medir el nivel de expresión de un gen (por ejemplo, el nivel de ARNm

o proteína) con respecto al nivel en una muestra de control de próstata no cancerosa. La expresión génica puede medirse usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, aquellos descritos en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión “detectar un cambio en la expresión génica (por ejemplo, hepsina, pim-1 o AMACR) en dicha muestra de células de la próstata en presencia de dicho compuesto de prueba con respecto a la ausencia de dicho compuesto de prueba” se refiere a medir un nivel de expresión alterado (por ejemplo, disminuido o aumentado) en presencia de un compuesto de prueba con respecto a la ausencia del compuesto de prueba. La expresión génica puede medirse usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, aquellos descritos en los Ejemplos 1-5 más adelante.

Como se usa en este documento, la expresión “instrucciones para usar dicho kit para detectar cáncer en dicho sujeto” incluye instrucciones para usar los reactivos contenidos en el kit para la detección y la caracterización de cáncer en una muestra de un sujeto. En algunas realizaciones, las instrucciones comprenden además la declaración de uso previsto requerida por la Dirección federal de fármacos y alimentos (FDA) en el etiquetado de productos de diagnóstico in vitro. La FDA clasifica in vitro diagnósticos como dispositivos médicos y requiere que sean aprobados por el procedimiento 510(k). La información requerida en una solicitud bajo 510(k) incluye: 1) el nombre del producto de diagnóstico in vitro que incluye la marca o nombre registrado, el nombre común o usual y el nombre de clasificación del dispositivo; 2) el uso previsto del producto; 3) el número de registro del establecimiento, si procede, del propietario u operador que envía el informe de 510(k); la clase en la que el producto de diagnóstico in vitro se dispuso bajo la sección 513 del acta FD&C, si se conoce, su panel apropiado, o, si el propietario u operador determina que el dispositivo no ha sido clasificado bajo tal sección, un informe de esa determinación y la base para la determinación de que el producto de diagnóstico in vitro no se clasifica así; 4) etiquetas propuestas, etiquetado y anuncios suficientes para describir el producto de diagnóstico in vitro, su uso previsto e indicaciones para su uso. Si procede, deben suministrarse fotografías o dibujos de ingeniería; 5) un informe que indica que el dispositivo es similar a y/o diferente de otros productos de diagnóstico in vitro de tipo comparable en distribución comercial en los EE.UU., acompañado por los datos para soportar el informe; 6) un resumen de 510(k) de los datos de seguridad e eficacia en los que se basa la determinación de equivalencia sustancial; o se pondrá a disposición un informe de la información de seguridad y eficacia de 510(k) que soporta el hallazgo de la FDA de equivalencia sustancial para cualquier persona en el plazo de 30 días desde una petición escrita; 7) un informe de que la persona que lo presenta cree, al leal saber de su conocimiento, que todos los datos e información presentada en la notificación previa a la comercialización son veraces y precisos y que no se ha omitido ningún hecho relevante; 8) cualquier información adicional referente al producto de diagnóstico in vitro solicitada que sea necesaria para la FDA para hacer una determinación de equivalencia sustancial. Información adicional está disponible en la página web de internet de la FDA de los EE.UU.

Como se usa en este documento, la expresión “mapa del perfil de expresión de cáncer de próstata” se refiere a una presentación de niveles de expresión de genes en un tipo de tejido de próstata particular (por ejemplo, tejidos de próstata primarios, metastásicos y pre-cancerosos). El mapa puede presentarse como una representación gráfica (por ejemplo, sobre papel o en una pantalla de ordenador), una representación física (por ejemplo, un gel o matriz) o una representación digital guardada en la memoria del ordenador. Cada mapa se corresponde con un tipo particular de tejido de próstata (por ejemplo, primario, metastásico y pre-canceroso) y, por tanto, proporciona una plantilla para la comparación con una muestra de paciente. En realizaciones preferidas, los mapas se generan a partir de muestras reunidas que comprenden muestras de tejido de una pluralidad de pacientes con el mismo tipo de tejido.

Como se usa en este documento, las expresiones “memoria del ordenador” y “dispositivo de memoria del ordenador” se refieren a cualquier medio de almacenamiento legible por un procesador de ordenador. Ejemplos de memoria del ordenador incluyen, pero no se limitan a, RAM, ROM, chips de ordenador, disco de vídeo digital (DVD), discos compactos (CD), controladores de disco duro (HDD) y cinta magnética.

Como se usa en este documento, la expresión “medio legible por ordenador” se refiere a cualquier dispositivo o sistema para almacenar y proporcionar información (por ejemplo, datos e instrucciones) a un procesador de ordenador. Ejemplos de medios legibles por ordenador incluyen, pero no se limitan a, DVD, CD, controladores de disco duro, cinta magnética y servidores para transferir medios mediante redes.

Como se usa en este documento, las expresiones “procesador” y “unidad de procesamiento central” o “CPU” se usan indistintamente y se refieren a un dispositivo que puede leer un programa de una memoria del ordenador (por ejemplo, ROM u otra memoria del ordenador) y realizar un conjunto de etapas según el programa.

Como se usa en este documento, la expresión “fase de cáncer” se refiere a una evaluación cualitativa o cuantitativa del nivel de avance de un cáncer. Los criterios usados para determinar la fase de un cáncer incluyen, pero no se limitan a, el tamaño del tumor, si el tumor se ha diseminado a otras partes del cuerpo o no y si el cáncer se ha diseminado o no (por ejemplo, dentro del mismo órgano o región del cuerpo o a otro órgano).

Como se usa en este documento, la expresión “proporcionar un pronóstico” se refiere a proporcionar información referente al impacto de la presencia del cáncer (por ejemplo, como se ha determinado por los procedimientos de diagnóstico de la presente invención) sobre la salud futura de un sujeto (por ejemplo, morbilidad o mortalidad esperada, la probabilidad de tener cáncer y el riesgo de metástasis).

Como se usa en este documento, la expresión “recidiva del antígeno específico de la próstata” se refiere al desarrollo de altos niveles de antígeno específico de la próstata en un paciente tras la terapia contra el cáncer de próstata (por ejemplo, cirugía). Véanse los Ejemplos 3 y 4 para ejemplos de cómo se determina la recidiva del antígeno específico de la próstata. Como se usa en este documento, la expresión “riesgo de desarrollar recidiva del antígeno específico de la próstata” se refiere a un riesgo relativo del sujeto (por ejemplo, la probabilidad en porcentaje o una puntuación relativa) de desarrollar recidiva del antígeno específico de la próstata tras la terapia contra el cáncer de próstata.

Como se usa en este documento, la expresión “tejido tumoral posquirúrgico” se refiere a tejido canceroso (por ejemplo, tejido de próstata) que ha sido extirpado de un sujeto (por ejemplo, durante cirugía).

Como se usa en este documento, la expresión “sujeto diagnosticado con un cáncer” se refiere a un sujeto que ha sido probado y se ha encontrado que tiene células cancerosas. El cáncer puede diagnosticarse usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, biopsia, rayos X, análisis de sangre y los procedimientos de diagnóstico de la presente invención.

Como se usa en este documento, la expresión “diagnóstico inicial” se refiere a los resultados del diagnóstico de cáncer inicial (por ejemplo, la presencia o ausencia de células cancerosas). Un diagnóstico inicial no incluye información sobre la fase del cáncer del riesgo de recidiva del antígeno específico de la próstata.

Como se usa en este documento, la expresión “tejido de biopsia” se refiere a una muestra de tejido (por ejemplo, tejido de próstata) que se extirpa de un sujeto con el fin de determinar si la muestra contiene tejido canceroso. En alguna realización, el tejido de biopsia se obtiene debido a que se sospecha que un sujeto tiene cáncer. Entonces se examina el tejido de biopsia (por ejemplo, por microscopía) para la presencia o ausencia de cáncer.

Como se usa en este documento, la expresión “tejido de biopsia inconcluyente” se refiere a tejido de biopsia para el que el examen histológico no ha determinado la presencia o ausencia de cáncer.

Como se usa en este documento, la expresión “marcador de células basales” se refiere a un marcador (por ejemplo, un anticuerpo) que se une a proteínas presentes en la capa de células basales de próstata benigna. Marcadores de células basales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, 34 �E12 y p63 (véase, por ejemplo, O'Malley y col., Virchows Arch. Pathol. Anat. Histopathol., 417:191 [1990]; Wojno y col., Am. J. Surg. Pathol., 19:251 [1995]; Googe y col., Am. J. Clin. Pathol., 107:219 [1997]; Parsons y col., Urology 58:619; y Signoretti y col., Am. J. Pathol., 157:1769 [2000]).

Como se usa en este documento, la expresión “animales no humanos” se refiere a todos los animales no humanos que incluyen, pero no se limitan a, vertebrados tales como roedores, primates no humanos, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc.

Como se usa en este documento, la expresión “sistema de transferencia de genes” se refiere a cualquier medio de administración de una composición que comprende una secuencia de ácidos nucleicos a una célula o tejido. Por ejemplo, los sistemas de transferencia de genes incluyen, pero no se limitan a, vectores (por ejemplo, retrovíricos, adenovíricos, víricos adenoasociados y otros sistemas de administración basados en ácido nucleico), microinyección de ácido nucleico desnudo, sistemas de administración basados en polímeros (por ejemplo, sistemas basados en liposomas y basados en partículas metálicas), inyección biolística y similares. Como se usa en este documento, la expresión “sistema de transferencia de genes víricos” se refiere a sistemas de transferencia de genes que comprenden elementos víricos (por ejemplo, virus intactos, virus modificados y componentes víricos tales como ácidos nucleicos o proteínas) para facilitar la administración de la muestra a una célula o tejido deseado. Como se usa en este documento, la expresión “sistema de transferencia de genes de adenovirus” se refiere a sistemas de transferencia de genes que comprenden virus intactos o alterados que pertenecen a la familia Adenoviridae.

Como se usa en este documento, la expresión “secuencias diana de recombinación específica de sitio” se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que proporcionan secuencias de reconocimiento para factores de recombinación y la localización en la que tiene lugar la recombinación.

Como se usa en este documento, la expresión “molécula de ácido nucleico” se refiere a cualquier molécula que contenga ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, ADN o ARN. La expresión engloba secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN que incluyen, pero no se limitan a, 4acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxicético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxicético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6diaminoporina.

La expresión “gen” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt). El polipéptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante mientras que se retengan la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimática, unión a ligando, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.) de la longitud completa o fragmento. La expresión también engloba la región codificante de un gen estructural y las secuencias localizadas adyacentes a la región codificante en tanto los extremos 5' como 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cualquier extremo de forma que el gen se corresponda con la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias localizadas en 5' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan en lo sucesivo secuencias no traducidas de 5'. Las secuencias localizadas en 3' o en la dirección 3' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan en lo sucesivo secuencias no traducidas de 3'. La expresión “gen” engloba tanto ADNc como formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes llamadas “intrones” o “regiones intervinientes” o “secuencias intervinientes”. Los intrones son segmentos de un gen que son transcritos en ARN nuclear (ARNnh); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se eliminan del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm sirve durante la traducción para especificar la secuencia u orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Como se usa en este documento, la expresión “gen heterólogo” se refiere a un gen que no está en su entorno natural. Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen de una especie introducida en otra especie. Un gen heterólogo también incluye un gen nativo para un organismo que se ha alterado de alguna forma (por ejemplo, mutado, añadido en múltiples copias, ligado a secuencias reguladoras no nativas, etc.). Los genes heterólogos se diferencian de los genes endógenos en que las secuencias de genes heterólogos están normalmente unidas a secuencias de ADN que no se encuentran naturalmente asociadas a las secuencias del gen en el cromosoma o están asociadas a porciones del cromosoma no encontradas en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci en los que el gen no está normalmente expresado).

Como se usa en este documento, la expresión “expresión génica” se refiere al procedimiento de convertir información genética codificada en un gen en ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt o ARNnp) mediante “transcripción” del gen (es decir, por la acción enzimática de una ARN polimerasa) y, para genes que codifican proteína, en proteína mediante “traducción” de ARNm. La expresión génica puede regularse en muchas fases en el procedimiento. La “regulación por aumento” o “activación” se refiere a la regulación que aumenta la producción de productos de expresión génica (es decir, ARN o proteína), mientras que la “regulación por disminución” o “represión” se refiere a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción) que participan en la regulación por aumento o la regulación por disminución se llaman frecuentemente “activadores” y “represores”, respectivamente.

Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también puede incluir secuencias localizadas en tanto el extremo 5' como 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan en lo sucesivo secuencias o regiones “flanqueantes” (estas secuencias flanqueantes se localizan 5' o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante de 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante de 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, escisión postranscripcional y poliadenilación.

La expresión “natural” se refiere a un gen o producto génico aislado de una fuente que se produce naturalmente. Un gen natural es el que se observa más frecuentemente en una población y, por tanto, se designa arbitrariamente la forma “normal” o “natural” del gen. A diferencia, la expresión “modificado” o “mutante” se refiere a un gen o producto génico que muestra modificaciones en la secuencia o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico natural. Se observa que pueden aislarse mutantes que se producen naturalmente; éstos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas (incluyendo secuencias de ácidos nucleicos alteradas) cuando se comparan con el gen o producto génico natural.

Como se usa en este documento, la expresión “molécula de ácido nucleico que codifica,” “secuencia de ADN que codifica” y “ADN que codifica” se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena del polipéptido (proteína). Por tanto, la secuencia de ADN codifica la secuencia de aminoácidos.

Como se usa en este documento, la expresión “un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen” y “polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen” significan una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la región codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un producto génico. La región codificante puede estar presente en una forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Si está presente en una forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser monocatenario (es decir, la hebra codificante) o bicatenario. Elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de corte y empalme, señales de poliadenilación, etc., pueden disponerse en estrecha proximidad a la región codificante del gen si se necesita para permitir la apropiada iniciación de la transcripción y/o el procesamiento correcto del transcrito de ARN primario. Alternativamente, la región codificante utilizada en los vectores de expresión de la presente invención puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de corte y empalme, secuencias intervinientes, señales de poliadenilación, etc., o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.

Como se usa en este documento, la expresión “oligonucleótido” se refiere a una cadena de polinucleótidos monocatenaria de longitud corta. Los oligonucleótidos tienen normalmente menos de 200 residuos de longitud (por ejemplo, entre 15 y 100), sin embargo, como se usa en este documento, la expresión también pretende englobar cadenas de polinucleótidos más largas. Los oligonucleótidos se refieren frecuentemente por su longitud. Por ejemplo un oligonucleótido de 24 residuos se denomina en lo sucesivo un “24-mero”. Los oligonucleótidos pueden formar estructuras secundarias y terciaria autohibridándose o hibridándose con otros polinucleótidos. Tales estructuras pueden incluir, pero no se limitan a, dúplex, horquillas, cruciformes, giros y tríplex.

Como se usa en este documento, las expresiones “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados con las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “A-G-T” es complementaria a la secuencia “T-C-A.” La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases de ácidos nucleicos se aparean según las reglas de apareamiento de bases. O puede haber complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la intensidad de la hibridación entre hebras de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en reacciones de amplificación, además de en procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

La expresión “homología” se refiere a un grado de complementariedad. Puede ser homología parcial u homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una molécula de ácido nucleico que inhibe al menos parcialmente una molécula de ácido nucleico completamente complementaria de la hibridación con un ácido nucleico diana y es “sustancialmente homóloga”. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria con la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en disolución y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia sustancialmente homóloga o sonda competirá por e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una molécula de ácido nucleico completamente homóloga con una diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no es decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la unión no específica; condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede probarse por el uso de una segunda diana que es sustancialmente no complementaria (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 30% de identidad); en ausencia de unión no específica la sonda no se hibridará con la segunda diana no complementaria.

Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácidos nucleicos bicatenaria tal como un ADNc o clon genómico, la expresión “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que pueda hibridarse a una cualquiera o a ambas hebras de la secuencia de ácidos nucleicos bicatenaria en condiciones de baja rigurosidad como se ha descrito anteriormente.

Un gen puede producir múltiples especies de ARN que se generan por corte y empalme diferencial del transcrito de ARN primario. Los ADNc que son variantes de corte y empalme del mismo gen contendrán regiones de identidad de secuencias u homología completa (que representan la presencia del mismo exón o porción del mismo exón en ambos ADNc) y regiones de identidad no completa (por ejemplo, que representan la presencia del exón “A” en el ADNc 1 en el que el ADNc 2 contiene en su lugar el exón “B”). Debido a que los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencias, no se hibridarán con una sonda derivada del gen entero o porciones del gen que contienen secuencias encontradas en ambos ADNc; las dos variantes de corte y empalme son, por tanto, sustancialmente homólogas a una sonda tal y entre sí.

Si se usa en referencia a una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, la expresión “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que pueda hibridarse con (es decir, es el complemento de) la secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria en condiciones de baja rigurosidad como se ha descrito anteriormente.

Como se usa en este documento, la expresión “hibridación” se usa en referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la intensidad de la hibridación (es decir, la intensidad de la asociación entre los ácidos nucleicos) es impactada por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado y la relación de G:C dentro de los ácidos nucleicos. Una única molécula que contiene apareamiento de ácidos nucleicos complementarios dentro de su estructura se dice que está “autohibridada”.

Como se usa en este documento, la expresión “Tm” se usa en referencia a la “temperatura de fusión”. La temperatura de fusión es la temperatura a la que la mitad de una población de moléculas de ácidos nucleicos bicatenarios se disocia en hebras individuales. La ecuación para calcular la Tm de ácidos nucleicos es muy conocida en la técnica. Como se indica por referencias convencionales, un simple cálculo estimado del valor de Tm puede calcularse por la ecuación: Tm = 81,5 + 0,41 (% de G + C) cuando un ácido nucleico está en disolución acuosa en NaCl 1 M (véase, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization in Nucleic Acid Hybridization [1985]). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que tienen en cuenta características estructurales, además de características de secuencias, para el cálculo de Tm.

Como se usa en este documento, la expresión “rigurosidad” se usa en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica y la presencia de otros compuestos tales como disolventes orgánicos bajo las cuales se realizan las hibridaciones de ácidos nucleicos. Bajo “condiciones de baja rigurosidad”, una secuencia de ácidos nucleicos de interés se hibridará con su complemento exacto, secuencias con desapareamientos de una única base, secuencias estrechamente relacionadas (por ejemplo, secuencias con el 90% de homología o superior) y secuencias que tienen sólo homología parcial (por ejemplo, secuencias con el 50-90% de homología). Bajo “condiciones de rigurosidad media”, una secuencia de ácidos nucleicos de interés se hibridará sólo con su complemento exacto, secuencias con desapareamientos de una única base y secuencias estrechamente relacionadas (por ejemplo, el 90% de homología

o superior). Bajo “condiciones de alta rigurosidad”, una secuencia de ácidos nucleicos de interés se hibridará sólo con su complemento exacto y (dependiendo de condiciones tales como una temperatura) secuencias con desapareamientos de una única base. En otras palabras, en condiciones de alta rigurosidad, la temperatura puede elevarse de manera que se excluya la hibridación con secuencias con desapareamientos de una única base.

“Condiciones de alta rigurosidad” cuando se usa en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 x H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5% de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1X SSPE, 1,0% de SDS a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

“Condiciones de rigurosidad media” cuando se usa en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 x H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5% de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 1,0X SSPE, 1,0% de SDS a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

“Condiciones de baja rigurosidad” comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 x H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,1% de SDS, 5X reactivo de Denhardt [50X Denhardt contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (tipo 400, Pharmacia), 5 g de BSA (fracción V; Sigma)] y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 5X SSPE, 0,1% de SDS a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

La materia conoce bien que pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes que comprenden condiciones de baja rigurosidad; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presentes en disolución o inmovilizadas, etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la disolución de hibridación puede variarse para generar condiciones de hibridación a baja rigurosidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones anteriormente enumeradas. Además, la materia conoce condiciones que promueven la hibridación en condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, aumentando la temperatura de las etapas de hibridación y/o lavado, el uso de formamida en la disolución de hibridación, etc.) (véase la definición anterior para “rigurosidad”).

La “amplificación” es un caso especial de replicación de ácidos nucleicos que implica especificidad por molde. Debe compararse con la replicación del molde no específica (es decir, replicación que es dependiente del molde, pero no dependiente de un molde específico). La especificidad por molde se diferencia aquí de la fidelidad de la replicación (es decir, la síntesis de la secuencia de polinucleótidos apropiada) y la especificidad por (ribo- o desoxirribo-) nucleótidos. La especificidad por molde se describe frecuentemente en expresiones de especificidad “diana”. Las secuencias diana son “dianas” en el sentido de que se buscan para separarlas del otro ácido nucleico. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta separación.

La especificidad por molde se logra en la mayoría de las técnicas de amplificación por la elección de enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, en las condiciones en las que se usan, sólo procesarán secuencias de ácido nucleico específicas en una mezcla heterogénea de ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de Q replicasa, el ARN de MDV-1 es el molde específico para la replicasa (Kacian y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]). Otros ácidos nucleicos no se replicarán por esta enzima de amplificación. Similarmente, en el caso de T7 ARN polimerasa, esta enzima de amplificación tiene una especificidad rigurosa por sus propios promotores (Chamberlin y col., Nature 228:227 [1970]). En el caso de la T4 ADN ligasa, la enzima no se ligará a los dos oligonucleótidos o polinucleótidos, ya que hay un desapareamiento entre el sustrato de oligonucleótido o polinucleótido y el molde en la unión de ligación (Wu y Wallace, Genomics 4:560 [1989]). Finalmente, se encuentra que las Taq y Pfu polimerasas, en virtud de su capacidad para funcionar a alta temperatura, muestran alta especificidad por las secuencias unidas y, por tanto, definidas por los cebadores; la alta temperatura produce condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación de cebadores con las secuencias diana y no la hibridación con secuencias no diana (H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989]).

Como se usa en este documento, la expresión “ácido nucleico amplificable” se usa en referencia a ácidos nucleicos que pueden amplificarse por cualquier procedimiento de amplificación. Se contempla que “ácido nucleico amplificable” comprenderá normalmente “molde de muestra”.

Como se usa en este documento, la expresión “molde de muestra” se refiere a ácido nucleico que se origina a partir de una muestra que se analiza para la presencia de “diana”. A diferencia, “molde de referencia” se usa en referencia a ácido nucleico distinto de molde de muestra que puede o puede no estar presente en una muestra. El molde de referencia es casi siempre inadvertido. Puede ser el resultado de remanente, o puede ser debido a la presencia de contaminantes de ácido nucleico buscados para ser purificados de la muestra. Por ejemplo, ácidos nucleicos de organismos distintos de aquellos que van a detectarse puede estar presentes como referencia en una muestra de prueba.

Como se usa en este documento, la expresión “cebador” se refiere a un oligonucleótido, tanto si se produce naturalmente como en un digesto de restricción purificado como si se produce sintéticamente, que puede actuar de punto de iniciación de la síntesis cuando se pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuado). El cebador es preferentemente monocatenario para la máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores que incluyen temperatura, fuente de cebador y el uso del procedimiento.

Como se usa en este documento, la expresión “sonda” se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos), tanto si se produce naturalmente como en un digesto de restricción purificado como si se produce sintéticamente, recombinantemente o por amplificación por PCR, que puede hibridarse con al menos una parte de otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención se marcará con cualquier “molécula indicadora” de manera que sea detectable en cualquier sistema de detección que incluye, pero no se limita a, enzima (por ejemplo, ELISA, además de ensayos histoquímicos basados en enzimas), sistemas fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a ningún sistema o marca de detección particular.

Como se usa en este documento, la expresión “porción” en referencia a una secuencia de nucleótidos (como en “una parte de una secuencia de nucleótidos dada”) se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden oscilar en tamaño de cuatro nucleótidos a toda la secuencia de nucleótidos menos un nucleótido (10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.).

Como se usa en este documento, la expresión “diana” se refiere a la región de ácido nucleico unida por los cebadores. Por tanto, se busca separar la “diana” de otras secuencias de ácidos nucleicos. Un “segmento” se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia diana.

Como se usa en este documento la expresión “reacción en cadena de la polimerasa” (“PCR”) se refiere al procedimiento de las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 4.683.202 y 4.965.188 de K.B. Mullis que describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótidos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se hibridan luego con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Tras la hibridación, los cebadores se extienden con una polimerasa de manera que se forme un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión de la polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un “ciclo”; puede haber numerosos “ciclos”) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores los unos con respecto a los otros y, por tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud de repetir el aspecto del procedimiento, el procedimiento se denomina en lo sucesivo la “reacción en cadena de la polimerasa” (denominado en lo sucesivo “PCR”). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en texpresiones de concentración) en la mezcla, se dicen que están “amplificados por PCR”.

Con la PCR es posible amplificar una única copia de una secuencia diana específica en ADN genómico a un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados seguido de detección del conjugado de avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de desoxinucleótido marcados con 32P tales como dCTP o dATP en el segmento amplificado). Además de ADN genómico, cualquier oligonucleótido o secuencia de polinucleótidos pueden amplificarse con el conjunto apropiado de moléculas de cebadores. En particular, los segmentos amplificados creados por el procedimiento de PCR son, por sí mismos, moldes eficientes para las posteriores amplificaciones por PCR.

Como se usa en este documento, las expresiones “producto de PCR”, “fragmento de PCR” y “producto de amplificación” se refieren a la mezcla resultante de compuestos después de que se completen dos o más ciclos de las fases de PCR de desnaturalización, hibridación y extensión. Estas espresiones engloban el caso en el que ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias diana.

Como se usa en este documento, la expresión “reactivos de amplificación” se refiere a aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, tampón, etc.) necesarios para la amplificación, excepto los cebadores, molde de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Normalmente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción se disponen y están contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropocillo, etc.).

Como se usa en este documento, las expresiones “endonucleasas de restricción” y “enzimas de restricción” se refieren a enzimas bacterianas cada una de las cuales corta ADN bicatenario en o próximo a una secuencia de nucleótidos específica.

Las expresiones “en combinación operable”, “en orden operable” y “operativamente ligado” como se usa en este documento se refiere al enlace de secuencias de ácidos nucleicos de una manera tal que se produzca una molécula de ácido nucleico que puede dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. La expresión también se refiere al enlace de secuencias de aminoácidos de una manera tal que se produzca proteína funcional.

La expresión “aislado” cuando se usa en relación con un ácido nucleico como en “un oligonucleótido aislado” o “polinucleótido aislado” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se identifica y se separa de al menos uncomponente o contaminante con el que generalmente está asociado en su fuente natural. �?cido nucleico aislado es aquél que está presente en una forma o posición que es diferente de en la que se encuentra en la naturaleza. A diferencia, los ácidos nucleicos no aislados como los ácidos nucleicos tales como ADN y ARN encontrados en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula huésped en proximidad de genes vecinos; secuencias de ARN tales como una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína dada incluye, a modo de ejemplo, tal ácido nucleico en células que generalmente expresan la proteína dada en la que el ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales, o está flanqueada de otro modo por una secuencia de ácidos nucleicos diferente a la encontrada en la naturaleza. El ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria

o bicatenaria. SI va a utilizarse un ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá como mínimo la hebra sentido o codificante (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser monocatenario), pero puede contener tanto las hebras sentido como las no codificantes (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser bicatenario).

Como se usa en este documento, la expresión “purificado” o “para purificar” se refiere a la eliminación de componentes (por ejemplo, contaminantes) de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos se purifican mediante eliminación de proteínas de no inmunoglobulina contaminantes; también se purifican por la eliminación de inmunoglobulina que no se une a la molécula diana. La eliminación de proteínas de no inmunoglobulina y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen a la molécula diana produce un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas reactivas con diana en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos recombinantes se expresan en células huésped bacterianas y los polipéptidos se purifican por la eliminación de proteínas de células huésped; así se aumenta el porcentaje de polipéptidos recombinantes en la muestra.

“Secuencia de aminoácidos” y expresiones tales como “polipéptido” o “proteína” no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada a la molécula de proteína citada.

La expresión “proteína nativa” se usa en este documento para indicar que una proteína no contiene residuos de aminoácidos codificados por secuencias de vectores; es decir, la proteína nativa sólo contiene aquellos aminoácidos encontrados en la proteína cuando se produce en la naturaleza. Una proteína nativa puede producirse por medios recombinantes o puede aislarse de una fuente que se produce naturalmente.

Como se usa en este documento, la expresión “porción” en referencia a una proteína (como en “una parte de una proteína dada”) se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden oscilar en tamaño de cuatro residuos de aminoácidos a toda la secuencia de aminoácidos menos un aminoácido.

La expresión “transferencia Southern” se refiere al análisis de ADN sobre geles de agarosa o acrilamida para fraccionar el ADN según tamaño seguido de transferencia del ADN del gel a un soporte sólido tal como nitrocelulosa

o una membrana de nailon. Entonces, el ADN inmovilizado se sonda con una sonda marcada para detectar especies de ADN complementarias a la sonda usada. El ADN puede escindirse con enzimas de restricción antes de la electroforesis. Tras la electroforesis, el ADN puede despurinarse y desnaturalizarse parcialmente antes de o durante la transferencia al soporte sólido. Las transferencias Southern son una herramienta convencional de biólogos moleculares (J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pág. 9.31

9.58 [1989]).

La expresión “transferencia Northern” como se usa en este documento se refiere al análisis de ARN por electroforesis de ARN sobre geles de agarosa para fraccionar el ARN según tamaño seguido de transferencia del ARN del gel a un soporte sólido tal como nitrocelulosa o una membrana de nailon. Entonces, el ARN inmovilizado se sonda con una sonda marcada para detectar especies de ADN complementarias a la sonda usada. Las transferencias Northern son una herramienta convencional de biólogos moleculares (J. Sambrook y col., arriba, pág. 7.39-7.52 [1989]).

La expresión “transferencia Western” se refiere al análisis de proteína(s) (o polipéptidos) inmovilizados sobre un soporte tal como nitrocelulosa o una membrana. Las proteínas se ejecutan sobre geles de acrilamida para separar las proteínas, seguido de transferencia de la proteína del gel a un soporte sólido tal como nitrocelulosa o una membrana de nailon. Entonces, las proteínas inmovilizadas se exponen a anticuerpos con reactividad contra un antígeno de interés. La unión de los anticuerpos puede detectarse por diversos procedimientos que incluyen el uso de anticuerpos radiomarcados.

La expresión “transgén” como se usa en este documento se refiere a un gen extraño que se coloca en un organismo, por ejemplo, introduciendo el gen extraño en óvulos recientemente fecundados o casi embriones. La expresión “gen extraño” se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de gen) que se introduce en el genoma de un animal por manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias de genes encontradas en ese animal aunque el gen introducido no resida en la misma localización que el gen que se produce naturalmente.

Como se usa en este documento, la expresión “vector” se usa en referencia a moléculas de ácidos nucleicos que transfieren segmento(s) de ADN de una célula a otra. La expresión “vehículo” se usa algunas veces indistintamente con “vector”. Los vectores se derivan frecuentemente de plásmidos, bacteriófagos, o virus de plantas o animales.

La expresión “vector de expresión” como se usa en este documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ácidos nucleicos apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en procariotas normalmente incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, frecuentemente junto con otras secuencias. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, potenciadores y señales de terminación y de poliadenilación.

Las expresiones “expresión en exceso” y “que expresa en exceso” y equivalentes gramaticales se usan en referencia a niveles de ARNm para indicar un nivel de expresión aproximadamente 3 veces superior (o mayor) al observado en un tejido dado en un animal de control o no transgénico. Los niveles de ARNm se miden usando distintas técnicas conocidas para aquellos expertos en la materia que incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Northern. Controles apropiados están incluidos en la transferencia Northern para controlar diferencias en la cantidad de ARN cargado de cada tejido analizado (por ejemplo, la cantidad de ARNr 28S, un transcrito de ARN abundante presente a esencialmente la misma cantidad en todos los tejidos, presente en cada muestra puede usarse como medio de normalización o estandarización de la señal específica de ARNm observada en transferencias Northern). Se cuantifica la cantidad de ARNm presente en la banda correspondiente en tamaño al ARN del transgén correctamente cortado y empalmado; otras especies menores de ARN que se hibridan con la sonda del transgén no se consideran en la cuantificación de la expresión del ARNm transgénico.

La expresión “transfección” como se usa en este documento se refiere a la introducción de ADN extraño en células eucariotas. La transfección puede llevarse a cabo mediante una variedad de medios conocidos en la técnica que incluyen co-precipitación de ADN con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplastos, infección retrovírica y biolística.

La expresión “co-precipitación con fosfato de calcio” se refiere a una técnica para la introducción de ácidos nucleicos en una célula. La captación de ácidos nucleicos por células es potenciada cuando el ácido nucleico se presenta como un co-precipitado de fosfato de calcio-ácido nucleico. La técnica original de Graham y van der Eb (Graham y van der Eb, Virol., 52:456 [1973]) ha sido modificada por varios grupos para optimizar las condiciones para tipos particulares de células. La materia es muy consciente de estas numerosas modificaciones.

La expresión “transfección estable” o “establemente transfectado” se refiere a la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. La expresión “transfectante estable” se refiere a una célula que ha integrado establemente ADN extraño en el ADN genómico.

La expresión “transfección transitoria” o “transitoriamente transfectado” se refiere a la introducción de ADN extraño en una célula en la que el ADN extraño fracasa en integrarse en el genoma de la célula transfectada. El ADN extraño persiste en el núcleo de la célula transfectada durante varios días. Durante este tiempo, el ADN extraño está sometido a los controles reguladores que gobiernan la expresión de genes endógenos en los cromosomas. La expresión “transfectante transitorio” se refiere a células que han captado ADN extraño, pero que han fracaso en integrar este ADN.

Como se usa en este documento, la expresión “marcador de selección” se refiere al uso de un gen que codifica una actividad enzimática que confiere la capacidad de cultivarse en medio que carece de lo que de otro modo sería un nutriente esencial (por ejemplo, el gen HIS3 en células de levadura); además, un marcador de selección puede conferir resistencia a un antibiótico o fármaco en la célula en la que el marcador de selección se expresa. Los marcadores de selección pueden ser “dominantes”; un marcador de selección dominante codifica una actividad enzimática que puede detectarse en cualquier línea celular eucariota. Ejemplos de marcadores de selección dominantes incluyen el gen bacteriano aminoglucósido 3' fosfotransferasa (también denominado en lo sucesivo el gen neo) que confiere resistencia al fármaco G418 en células de mamífero, el gen bacteriano higromicina G fosfotransferasa (hyg) que confiere resistencia al antibiótico higromicina y el gen bacteriano xantina-guanina fosforribosiltransferasa (también denominado en lo sucesivo el gen gpt) que confiere la capacidad de cultivarse en presencia de ácido micofenólico. Otros marcadores de selección no son dominantes, por lo que su uso debe ser conjuntamente con una línea celular que carece de la actividad enzimática relevante. Ejemplos de marcadores de selección no dominantes incluyen el gen timidina cinasa (tk) que se usa conjuntamente con líneas celulares tk-, el gen CAD que se usa conjuntamente con células deficientes en CAD y el gen de mamífero hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (hprt) que se usa conjuntamente con líneas celulares hprt-. Una revisión del uso de marcadores de selección en líneas celulares de mamífero se proporciona en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989) pág. 16.9-16.15.

Como se usa en este documento, la expresión “cultivo celular” se refiere a cualquier cultivo de células in vitro. Incluido dentro de esta expresión están líneas celulares continuas (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), cultivos celulares primarios, líeas celulares transformadas, líneas celulares finitas (por ejemplo, células no transformadas) y cualquier otra población de células mantenida in vitro.

Como se usa, la expresión “eucariota” se refiere a organismos distinguibles de “procariotas”. Se pretende que la expresión englobe todos los organismos con células que presentan las características usuales de eucariotas tales como la presencia de un núcleo verdadero unido por una membrana nuclear dentro de la que se encuentran los cromosomas, la presencia de orgánulos unidos a la membrana y otras características comúnmente observadas en organismos eucariotas. Por tanto, la expresión incluye, pero no se limita a, organismos tales como hongos, protozoos y animales (por ejemplo, seres humanos).

Como se usa en este documento, la expresión “in vitro” se refiere a un entorno artificial y a procedimientos o reacciones que se producen dentro de un entorno artificial. Los entornos in vitro pueden consistir en, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivo celular. La expresión “in vivo” se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a procedimientos o reacción que se producen dentro de un entorno natural.

Las expresiones “compuesto de prueba” y “compuesto candidato” se refieren a cualquier entidad química, fármaco farmacéutico y similares que sea un candidato para su uso para tratar o prevenir una enfermedad, dolencia, padecimiento o trastorno de la función corporal (por ejemplo, cáncer). Los compuestos de prueba comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Puede determinarse que un compuesto de prueba es terapéutico cribando usando los procedimientos de cribado de la presente invención. En algunas realizaciones de la presente invención, los compuestos de prueba incluyen compuestos antisentido.

Como se usa en este documento, la expresión “muestra” se usa en su sentido más amplio. En un sentido pretende incluir un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, además de muestras biológicas y medioambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales (incluyendo seres humanos) y engloban fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen hemoderivados tales como plasma, suero y similares. Las muestras medioambientales incluyen material medioambiental tal como materia superficial, tierra, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, tales ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a composiciones y procedimientos para el diagnóstico del cáncer que incluyen, pero no se limitan a, marcadores de cáncer. En particular, la presente invención proporciona perfiles de expresión génica asociados a cánceres de próstata. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento de caracterizar tejidos de próstata, además de aplicaciones de cribado de fármacos.

La presente invención proporciona además un procedimiento de cribar compuestos que comprende:

a) proporcionar

I. Marcadores para cáncer de próstata

La presente invención proporciona marcadores cuya expresión es específicamente alterada en tejidos de próstata cancerosos. Tales marcadores se usan en el diagnóstico y la caracterización de cáncer de próstata.

A. Identificación de marcadores

Los experimentos realizados durante el desarrollo de la presente invención produjeron la identificación de genes cuyo nivel de expresión estaba alterado (por ejemplo, aumentado o disminuido) en PCA. Los procedimientos utilizaron micromatrices de ADNc en portaobjetos de vidrio que incluyeron aproximadamente 5000 genes con nombre conocidos, 4400 EST y 500 elementos de control, además de tejido de próstata normal y canceroso. Los genes diferencialmente expresados se dividieron en agrupaciones funcionales. La expresión de genes relevantes se confirmó usando análisis de transferencia Western. La expresión de proteínas en tejidos de próstata se midió para varios genes de interés.

Los procedimientos de la presente invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2) se usaron para identificar agrupaciones de genes que fueron regulados por aumento o por disminución en PCA, tejido de próstata benigno, tejido precanceroso y próstata normal. A partir de estas agrupaciones, dos genes, hepsina y pim-1, se identificaron como genes que fueron de relevancia particular. La inmunohistoquímica (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4) se usó para caracterizar la presencia de las proteínas de hepsina y pim-1 en tejido de próstata. Se encontró que la hepsina se teñía fuertemente en tejido precanceroso (NIP-AG). Además, se encontró que la hepsina se teñía menos fuertemente en tejidos de PCA de hombre que se encontró que tenían un riesgo elevado de metástasis como se mide por la recidiva de PSA (PSA elevado tras la cirugía), confirmándose así la utilidad del diagnóstico de hepsina. Además, también se encontró que la disminución de la expresión de pim-1 en tejido de PCA estaba asociada a un aumento del riesgo de recidiva de PSA. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de detección y caracterización de tejidos de próstata.

Los procedimientos relacionados de la presente invención identificaron otro gen, la alfa-metil-CoA racemasa (AMACR), que se encontró que se expresaba en PCA, pero no en tejido de próstata benigno (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). Se encontró que AMACR estaba presente en el suero y la orina de pacientes con cáncer de próstata o de vejiga. Además, se identificó una respuesta humoral a AMACR. En todavía otras realizaciones, los procedimientos de la presente invención se usaron para caracterizar el gen EZH2. Se encontró que EZH2 se regulaba por aumento en cáncer de próstata metastásico. La inhibición de la expresión de EZH2 en células de la próstata inhibió la proliferación celular in vitro, además de inducir la represión transcripcional de una variedad de genes. Los procedimientos de la presente invención identificaron adicionalmente que CtBP1 y CTBP2, además de GP73, se expresaban en exceso en cáncer de próstata metastásico con respecto a cáncer de próstata localizado y tejido benigno.

En todavía otras realizaciones, los procedimientos de la presente invención identificaron que las anexinas 1, 2, 4, 7 y 11 estaban significativamente disminuidas en PCA resistente al tratamiento hormonal cuando se compararon con PCA sin tratamiento previo hormonal localizado. El análisis de micromatrices de tejido reveló una disminución significativa en la expresión de proteínas para las anexinas 1, 2, 4, 7 y 11 en PCA resistente al tratamiento hormonal con respecto a PCA localizado. No se detectaron diferencias significativas entre el PCA clínicamente localizado y tejidos de próstata no cancerosos.

B. Detección de marcadores

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para la detección de la expresión de marcadores de cáncer (por ejemplo, marcadores de cáncer de próstata). En realizaciones preferidas, la expresión se mide directamente (por ejemplo, al nivel de ARN o de las proteínas). En algunas realizaciones, la expresión se detecta en muestras de tejido (por ejemplo, tejido de biopsia). En otras realizaciones, la expresión se detecta en fluidos corporales (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, plasma, suero, sangre completa, moco y orina). La presente invención proporciona además paneles y kits para la detección de marcadores. En realizaciones preferidas, la presencia de un marcador de cáncer se usa para proporcionar un pronóstico para un sujeto. Por ejemplo, la detección de hepsina o pim-1 en tejidos de próstata es indicativa de un cáncer que es probable que metastatice y la expresión de hepsina es indicativa de un tejido precanceroso que es probable que se vuelva canceroso. Además, la expresión de AMACR es indicativa de tejido canceroso. La información proporcionada también se usa para dirigir el transcurso del tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que un sujeto tiene un marcador indicativo de un tumor altamente metastatizante, pueden iniciarse terapias adicionales (por ejemplo, terapias hormonales o radioterapia) en un momento temprano cuando es más probable que sean eficaces (por ejemplo, antes de la metástasis). Además, si se encuentra que un sujeto tiene un tumor que no es sensible a terapia hormonal, puede evitarse el gasto y las molestias de tales terapias.

Puede utilizarse cualquier procedimiento adecuado para identificar y caracterizar marcadores de cáncer adecuados para su uso en los procedimientos de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en los Ejemplos ilustrativos 1-15 más adelante. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los marcadores identificados como que son regulados por aumento o por disminución en PCA usando los procedimientos de micromatrices de expresión génica de la presente invención se caracterizan adicionalmente usando micromatriz de tejido, inmunohistoquímica, análisis de transferencia Northern, inhibición de ARNip o ARN antisentido, análisis de mutaciones, investigación de la expresión con desenlace clínico, además de otros procedimientos desvelados en este documento.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un panel para el análisis de una pluralidad de marcadores. El panel permite el análisis simultáneo de múltiples marcadores que guardan relación con carcinogénesis y/o metástasis. Por ejemplo, un panel puede incluir marcadores identificados como que guardan relación con tejido canceroso, cáncer metastásico, cáncer localizado que es probable que metastatice, tejido precanceroso que es probable que se vuelva canceroso y tejido precanceroso que no es probablemente que se vuelva canceroso. Dependiendo del sujeto, los paneles pueden analizarse solos o en combinación con el fin de proporcionar el mejor diagnóstico y pronóstico posible. Los marcadores para inclusión en un panel se seleccionan cribando para su valor predictivo usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, aquellos descritos en los ejemplos ilustrativos más adelante.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un mapa del perfil de expresión que comprende perfiles de expresión de cánceres de diversas fases o pronósticos (por ejemplo, probabilidad de futuras metástasis). Tales mapas pueden usarse para comparación con muestras de paciente. En algunas realizaciones, las comparaciones se hacen usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Sin embargo, la presente invención no se limita al procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Puede utilizarse cualquier procedimiento adecuado que incluya, pero no se limite a, comparación por ordenador de datos digitalizados. Los datos de comparación se usan para proporcionar diagnósticos y/o pronósticos a pacientes.

1. Detección de ARN

En algunas realizaciones preferidas, la detección de marcadores de cáncer de próstata (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en este documento) se detecta midiendo la expresión de ARNm correspondiente en una muestra de tejido (por ejemplo, tejido de próstata). La expresión de ARNm puede medirse por cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, los desvelados más adelante.

En algunas realizaciones, el ARN es detectado por análisis de transferencia Northern. El análisis de transferencia Northern implica la separación de ARN y la hibridación de una sonda marcada complementaria. Un procedimiento a modo de ejemplo para el análisis de transferencia Northern se proporciona en el Ejemplo 3.

En otras realizaciones, la expresión del ARN se detecta por escisión enzimática de estructuras específicas (ensayo INVADER, Third Wave Technologies; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.846.717, 6.090.543; 6.001.567; 5.985.557; y 5.994.069). El ensayo INVADER detecta secuencias de ácido nucleico específicas (por ejemplo, ARN) usando enzimas específicas de estructura para escindir un complejo formado por la hibridación de sondas de oligonucleótidos solapantes.

En todavía otras realizaciones, el ARN (o ADNc correspondiente) se detecta por hibridación con una sonda de oligonucleótidos. Están disponibles una variedad de ensayos de hibridación usando una variedad de tecnologías para la hibridación y detección. Por ejemplo, en algunas realizaciones se utiliza el ensayo TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.962.233 y 5.538.848). El ensayo se realiza durante una reacción de PCR. El ensayo TaqMan explota la actividad de la 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD. Una sonda que consiste en un oligonucleótido con un colorante indicador en 5' (por ejemplo, un colorante fluorescente) y un colorante extintor de la fluorescencia en 3' se incluye en la reacción de PCR. Durante la PCR, si la sonda está unida a su diana, la actividad nucleolítica en 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el colorante indicador y el extintor de la fluorescencia. La separación del colorante indicador del colorante extintor de la fluorescencia produce un aumento de la fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorímetro.

En todavía otras realizaciones se usa PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la expresión de ARN. En la RT-PCR, el ARN se convierte enzimáticamente en ADN complementario o “ADNc” usando una enzima transcriptasa inversa. Entonces, el ADNc se usa como molde para una reacción de PCR. Los productos de PCR pueden detectarse por cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, electroforesis en gel y tinción con un tinte específico de ADN o hibridación con una sonda marcada. En algunas realizaciones se utiliza la PCR cuantitativa con transcriptasa inversa con mezclas normalizadas del procedimiento de moldes competitivos descrito en las patentes de EE.UU. 5.639.606, 5.643.765 y 5.876.978.

2. Detección de proteína

En otras realizaciones, la expresión génica de marcadores de cáncer se detecta midiendo la expresión de la proteína

o polipéptido correspondiente. La expresión de proteínas puede detectarse por cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, las proteínas se detectan por el procedimiento inmunohistoquímico del Ejemplo 4. En otras realizaciones, las proteínas se detectan por su unión a un anticuerpo producido contra la proteína. La generación de anticuerpos se describe más adelante.

La unión de anticuerpos se detecta por técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (por ejemplo, usando oro coloidal, marcas de enzima o radioisótopo, por ejemplo), transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación, etc.), ensayos de fijación a complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos con proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.

En una realización, la unión de anticuerpos se detecta detectando una marca sobre el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen muchos procedimientos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones se utiliza un ensayo de detección automatizado. Los procedimientos para la automatización de inmunoensayos incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. 5.885.530, 4.981.785,

6.159.750 y 5.358.691. En algunas realizaciones, el análisis y la presentación de resultados también están automatizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones se utiliza software que genera un pronóstico basado en la presencia o ausencia de una serie de proteínas correspondiente a marcadores de cáncer.

En otras realizaciones, el inmunoensayo se describió en las patentes de EE.UU. 5.599.677 y 5.672.480.

3. Análisis de datos

En algunas realizaciones se usa un programa de análisis basado en ordenador para traducir los datos brutos generados por el ensayo de detección (por ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de un marcador o marcadores dados) en datos de valor predictivo para un profesional clínico. El profesional clínico puede acceder a los datos predictivos usando cualquier medio adecuado. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona el beneficio adicional de que el profesional clínico, que probablemente no está formado en genética o biología molecular, no necesita entender los datos brutos. Los datos se presentan directamente al profesional clínico en su forma más útil. Entonces, el profesional clínico puede utilizar inmediatamente la información con el fin de optimizar el cuidado del sujeto.

La presente invención contempla cualquier procedimiento que pueda recibir, procesar y transmitir la información a y de laboratorios que realizan los ensayos, proporciona información, personal médico y sujetos. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, una muestra (por ejemplo, una biopsia o una muestra de suero o de orina) se obtiene de un sujeto y se presenta a un servicio de perfilado (por ejemplo, laboratorio clínico en un centro médico, empresa de perfilado genómico, etc.) localizado en cualquier parte del mundo (por ejemplo, en un país diferente del país en el que reside el sujeto o en el que la información se usa en último lugar) para generar datos brutos. Si la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica, el sujeto puede visitar un centro médico para que obtenga la muestra y la envíe al centro de perfilado, o los sujetos pueden recoger la muestra por sí mismos (por ejemplo, una muestra de orina) y enviarla directamente a un centro de perfilado. Si la muestra comprende información biológica previamente determinada, el sujeto puede enviar directamente la información al servicio de perfilado (por ejemplo, una tarjeta de información que contiene la información puede ser escaneada por un ordenador y transmitirse los datos a un ordenador del centro de perfilado usando un sistema de comunicación electrónica). Una vez recibida por el servicio de perfilado, la muestra se procesa y se produce un perfil (es decir, los datos de expresión) específico para la información de diagnóstico o de pronóstico deseada para el sujeto.

Entonces, los datos del perfil se preparan en una forma adecuada para interpretación por un profesional clínico tratante. Por ejemplo, en vez de proporcionar datos de expresión brutos, la forma preparada puede representar una evaluación de diagnóstico o de riesgo (por ejemplo, probabilidad de metástasis o recidiva de PSA) para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden mostrarse al profesional clínico por cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el servicio de perfilado genera un informe que puede ser imprimido por el profesional clínico (por ejemplo, en el punto de cuidado) o visualizado por el profesional clínico en un monitor de ordenador.

En algunas realizaciones, la información se analiza primero en el punto de cuidado o en un centro regional. Entonces, los datos brutos se envían a un centro de procesamiento central para el análisis adicional y/o para convertir los datos brutos en información útil para un profesional clínico o paciente. El centro de procesamiento central proporciona la ventaja de privacidad (todos los datos se almacenan en un centro central con protocolos de seguridad uniformes), velocidad y uniformidad del análisis de datos. El centro de procesamiento central puede entonces controlar la suerte de los datos siguiendo el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, usando un sistema de comunicación electrónica, el centro central puede proporcionar datos al profesional clínico, al sujeto o investigadores.

En algunas realizaciones, el sujeto puede acceder directamente a los datos usando el sistema de comunicación electrónica. El sujeto puede elegir adicionalmente la intervención u orientación basándose en los resultados. En algunas realizaciones, los datos se usan para uso de investigación. Por ejemplo, los datos pueden usarse para optimizar adicionalmente la inclusión o eliminación de marcadores como indicadores útiles de una afección particular

o fase de enfermedad.

4. Kits - Referencia

En todavía otras realizaciones, la presente invención está relacionada con kits para la detección y la caracterización de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, los kits contienen anticuerpos específicos para un marcador de cáncer, además de reactivos y tampones de detección. En otras realizaciones, los kits contienen reactivos específicos para la detección de ARNm o ADNc (por ejemplo, sondas de oligonucleótidos o cebadores). En realizaciones preferidas, los kits contienen todos los componentes necesarios para realizar un ensayo de detección, incluyendo todos los controles, instrucciones para realizar los ensayos y cualquier software necesario para el análisis y presentación de resultados.

5. Obtención de imágenes in vivo

En algunas realizaciones, las técnicas de obtención de imágenes in vivo se usan para visualizar la expresión de marcadores de cáncer en un animal (por ejemplo, un mamífero humano o no humano). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ARNm o proteína marcador de cáncer se marca usando un anticuerpo marcado específico para el marcador de cáncer. Un anticuerpo específicamente unido y marcado puede detectarse en un individuo usando un procedimiento de obtención de imágenes in vivo que incluye, pero no se limita a, obtención de imágenes de radionúclidos, tomografía de emisión de positrones, tomografía axial computarizada; procedimiento de obtención de imágenes por rayos X o de resonancia magnética, detección de fluorescencia y detección quimioluminiscente. Los procedimientos para generar anticuerpos para los marcadores de cáncer de la presente invención se describen más adelante.

Los procedimientos de obtención de imágenes in vivo de la presente invención son útiles en el diagnóstico de cánceres que expresan los marcadores de cáncer de la presente invención (por ejemplo, cáncer de próstata). La obtención de imágenes in vivo se usa para visualizar la presencia de un marcador indicativo de cáncer. Tales técnicas permiten diagnosticar sin el uso de una biopsia desagradable. Los procedimientos de obtención de imágenes in vivo de la presente invención también son útiles para proporcionar pronósticos para pacientes con cáncer. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de un marcador indicativo de cánceres que probablemente metastaticen. Los procedimientos de obtención de imágenes in vivo de la presente invención pueden usarse adicionalmente para detectar cánceres metastásicos en otras partes del cuerpo.

En algunas realizaciones, los reactivos (por ejemplo, anticuerpos) específicos para los marcadores de cáncer de la presente invención están fluorescentemente marcados. Los anticuerpos marcados se introducen en un sujeto (por ejemplo, por vía oral o parenteralmente). Los anticuerpos fluorescentemente marcados se detectan usando cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, usando el aparato descrito en la patente de EE.UU. 6.198.107).

En otras realizaciones, los anticuerpos están radiactivamente marcados. El uso de anticuerpos para diagnóstico in vivo es muy conocido en la técnica. Sumerdon y col. (Nucl. Med. Biol 17:247-254 [1990] han descrito un quelante de anticuerpos optimizado para la obtención de imágenes radioinmunoescintográficas de tumores usando indio-111 como marca. Griffin y col. (J Clin Onc 9:631-640 [1991]) han descrito el uso de este agente en la detección de tumores en pacientes de los que se sospecha que tienen cáncer colorrectal recurrente. El uso de agentes similares con iones paramagnéticos como marcas para la obtención de imágenes de resonancia magnética se conoce en la técnica (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 [1991]). La marca usada dependerá de la modalidad de obtención de imágenes elegida. Pueden usarse marcas radiactivas tales como indio-111, tecnecio-99m o yodo131 para barridos planos o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). También pueden usarse marcas emisoras de positrones tales como flúor-19 para tomografía de emisión de positrones (PET). Para MRI pueden usarse iones paramagnéticos tales como gadolinio (III) o manganeso (II).

Metales radiactivos con semividas que oscilan de 1 hora a 3,5 días están disponibles para conjugación con anticuerpos tales como escandio-47 (3,5 días), galio-67 (2,8 días), galio-68 (68 minutos), tecnecio-99m (6 horas) e indio-111 (3,2 días), de los que se prefieren galio-67, tecnecio-99m e indio-111 para la obtención de imágenes por gammacámara, el galio-68 es preferible para tomografía de emisión de positrones.

Un procedimiento útil de marcado de anticuerpos con tales radiometales es por medio de un agente quelante bifuncional tal como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) como se describe, por ejemplo, por Khaw y col. (Science 209:295 [1980]) para In-111 y Tc-99m, y por Scheinberg y col. (Science 215:1511 [1982]). También pueden usarse otros agentes quelantes, pero el 1-(p-carboximetoxibencil)EDTA y el anhídrido carboxicarbónico de DTPA son ventajosos debido a que su uso permite la conjugación sin afectar sustancialmente la inmunorreactividad de anticuerpos.

Otro procedimiento para acoplar DPTA a proteínas es usando el anhídrido cíclico de DTPA como se describe por Hnatowich y col. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982]) para marcar albúmina con In-111, pero que puede adaptarse para marcar anticuerpos. Un procedimiento adecuado de marcado de anticuerpos con Tc-99m que no usa quelación con DPTA es el procedimiento de pretinción de Crockford y col. (patente de EE.UU. nº 4.323.546).

Un procedimiento preferido de marcar inmunoglobulinas con Tc-99m es el descrito por Wong y col. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251 [1978]) para proteína del plasma, y recientemente aplicado satisfactoriamente por Wong y col.

(J. Nucl. Med., 23:229 [1981]) para marcar anticuerpos.

En el caso de los radiometales conjugados con el anticuerpo específico, es asimismo deseable introducir una proporción tan alta como sea posible de la radiomarca en la molécula de anticuerpo sin destruir su inmunoespecificidad. Otra mejora puede lograrse efectuando el radiomarcado en presencia del marcador de cáncer específico de la presente invención para asegurar que se protegerá el sitio de unión a antígeno sobre el anticuerpo. El antígeno se separa después del marcado.

En todavía otras realizaciones, la obtención de imágenes biofotónicas in vivo (Xenogen, Almeda, CA) se utiliza para la obtención de imágenes in vivo. Esta obtención de imágenes in vivo en tiempo real utiliza luciferasa. El gen luciferasa se incorpora en células, microorganismos y animales (por ejemplo, como una proteína de fusión con un marcador de cáncer de la presente invención). Si es activo, conduce a una reacción que emite luz. Se usa una cámara CCD y software para capturar la imagen y analizarla.

II. Anticuerpos

La presente invención se refiere a anticuerpos aislados. En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido aislado que consiste en al menos cinco residuos de aminoácidos de los marcadores de cáncer descritos en este documento (por ejemplo, hepsina, pim-1, AMACR, EZH2, CTBP). Estos anticuerpos se usan en los procedimientos de diagnóstico descritos en este documento.

Un anticuerpo contra una proteína de la presente invención puede ser cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal, siempre que pueda reconocer la proteína. Los anticuerpos pueden producirse usando una proteína de la presente invención como antígeno según un procedimiento de preparación convencional de anticuerpos o antisueros.

La presente invención contempla el uso de tanto anticuerpos monoclonales como policlonales. Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para generar los anticuerpos usados en los procedimientos y composiciones de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en este documento. Por ejemplo, para la preparación de un anticuerpo monoclonal, proteína como tal o junto con un vehículo o diluyente adecuado se administra a un animal (por ejemplo, un mamífero) en condiciones que permitan la producción de anticuerpos. Para potenciar la capacidad de producción de anticuerpos puede administrarse adyuvante completo o incompleto de Freund. Normalmente, la proteína se administra una vez cada 2 semanas a 6 semanas, en total, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces. Los animales adecuados para su uso en tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, primates, conejos, perros, cobayas, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc.

Para preparar células productoras de anticuerpos monoclonales se selecciona un individuo animal cuyo título de anticuerpos se ha confirmado (por ejemplo, un ratón), y 2 días a 5 días después de la inmunización final, su bazo o ganglio linfático se recoge y las células productoras de anticuerpos contenidas en su interior se fusionan con células de mieloma para preparar el hibridoma productor de los anticuerpos monoclonales deseados. La medición del título de anticuerpos en antisuero puede llevarse a cabo, por ejemplo, haciendo reaccionar la proteína marcada, como se describe en lo sucesivo, y el antisuero y luego medir la actividad del agente de marcado unido al anticuerpo. La fusión de células puede llevarse a cabo según procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento descrito por Koehler y Milstein (Nature 256:495 [1975]). Como promotor de la fusión se usa, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o el virus Sendai (HVJ), preferentemente PEG.

Ejemplos de células de mieloma incluyen NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 y similares. La proporción del número de células productoras de anticuerpos (células del bazo) y el número de células de mieloma que va a usarse es preferentemente aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1. Preferentemente se añade PEG (preferentemente PEG 1000-PEG 6000) en concentración de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80%. La fusión de células puede llevarse a cabo eficientemente incubando una mezcla de ambas células a aproximadamente 20ºC a aproximadamente 40ºC, preferentemente aproximadamente 30ºC a aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente 1 minuto a 10 minutos.

Pueden usarse diversos procedimientos para cribar un hibridoma que produce el anticuerpo (por ejemplo, contra un antígeno de tumor o autoanticuerpo de la presente invención). Por ejemplo, un sobrenadante del hibridoma se añade a una fase sólida (por ejemplo, microplaca) a la que el anticuerpo se adsorbe directamente o junto con un vehículo y luego se añade un anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina (si se usan células de ratón en la fusión de células se usa anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina de ratón) o proteína A marcada con una sustancia radiactiva o una enzima para detectar el anticuerpo monoclonal contra la proteína unida a la fase sólida. Alternativamente, un sobrenadante del hibridoma se añade a una fase sólida a la que se adsorbe un anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina o proteína A y luego la proteína marcada con una sustancia radiactiva o una enzima se añade para detectar el anticuerpo monoclonal contra la proteína unida a la fase sólida.

La selección del anticuerpo monoclonal puede llevarse a cabo según cualquier procedimiento conocido o su modificación. Normalmente se emplea un medio para células animales al que se añade HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Puede emplearse cualquier medio de selección y de crecimiento siempre que el hibridoma pueda cultivarse. Por ejemplo, puede usarse medio RFMI 1640 que contiene 1% al 20%, preferentemente 10% al 20%, de suero bovino fetal, medio GIT que contiene 1% de suero bovino fetal al 10%, un medio libre de suero para el cultivo de un hibridoma (SFM-101, Nissui Seiyaku) y similares. Normalmente, el cultivo se lleva a cabo a 20ºC a 40ºC, preferentemente a 37ºC, durante aproximadamente 5 días a 3 semanas, preferentemente 1 semana a 2 semanas, bajo aproximadamente 5% de gas CO2. El título de anticuerpos del sobrenadante de un cultivo de hibridomas puede medirse según el mismo modo que se ha descrito anteriormente con respecto al título de anticuerpos de la antiproteína en el antisuero.

La separación y purificación de un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, contra un marcador de cáncer de la presente invención) puede llevarse a cabo según el mismo modo que aquellos de anticuerpos policlonales convencionales tales como separación y purificación de inmunoglobulinas, por ejemplo, precipitación por sales, precipitación alcohólica, precipitación en el punto isoeléctrico, electroforesis, adsorción y desorción con intercambiadores iónicos (por ejemplo, DEAE), ultracentrifugación, filtración en gel o un procedimiento de purificación específico en el que sólo un anticuerpo se recoge con un adsorbente activo tal como una fase sólida de unión a antígeno, proteína A o proteína G y disociando la unión para obtener el anticuerpo.

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido o modificaciones de estos procedimientos que incluyen obtener anticuerpos de pacientes. Por ejemplo, se prepara un complejo de un inmunogén (un antígeno contra la proteína) y una proteína transportadora y un animal se inmuniza por el complejo según el mismo modo que se describe con respecto a la preparación de anticuerpos monoclonales anterior. Un material que contiene el anticuerpo se recupera del animal inmunizado y el anticuerpo se separa y se purifica.

En cuanto al complejo del inmunogén y la proteína transportadora que va a usarse para la inmunización de un animal, cualquier proteína transportadora y cualquier proporción de mezcla del vehículo y un hapteno puede emplearse siempre que produzca eficientemente un anticuerpo contra el hapteno, que está reticulado sobre el vehículo y se usa para inmunización. Por ejemplo, albúmina de suero bovino, cicloglobulina bovina, hemocianina de lapa californiana, etc. puede acoplarse a un hapteno en una relación en peso de aproximadamente 0,1 partes a aproximadamente 20 partes, preferentemente aproximadamente 1 parte a aproximadamente 5 partes por 1 parte del hapteno.

Además, pueden usarse diversos agentes de condensación para el acoplamiento de un hapteno y un vehículo. Por ejemplo, con la presente invención se usan glutaraldehído, carbodiimida, éster activado de maleimida, reactivos de éster activados que contienen grupo tiol o grupo ditiopiridilo y similares. El producto de condensación como tal o junto con un vehículo o diluyente adecuado se administra a un sitio de un animal que permite la producción del anticuerpo. Para potenciar la capacidad de producción de anticuerpos puede administrarse adyuvante completo o incompleto de Freund. Normalmente, la proteína se administra una vez cada 2 semanas a 6 semanas, en total, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces.

El anticuerpo policlonal se recupera de sangre, ascitis y similares de un animal inmunizado mediante el procedimiento anterior. El título de anticuerpos en el antisuero puede medirse según el mismo modo que se ha descrito anteriormente con respecto al sobrenadante del cultivo de hibridomas. La separación y purificación del anticuerpo puede llevarse a cabo según el mismo procedimiento de separación y de purificación de inmunoglobulina que se ha descrito con respecto al anticuerpo monoclonal anterior.

La proteína usada en este documento como inmunogén no se limita a ningún tipo particular de inmunogén. Por ejemplo, como inmunogén puede usarse un marcador de cáncer de la presente invención (que incluye adicionalmente un gen que tiene una secuencia de nucleótidos parcialmente alterada). Además, pueden usarse fragmentos de proteína. Los fragmentos pueden obtenerse mediante cualquier procedimiento que incluya, pero no se limite a, expresar un fragmento del gen, procesar enzimáticamente la proteína, síntesis química; y similares.

III. Cribado de fármacos

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona ensayos de cribado de fármacos (por ejemplo, para cribar para fármacos anticancerígenos). Los procedimientos de cribado de la presente invención utilizan marcadores de cáncer identificados usando los procedimientos de la presente invención (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, hepsina, pim-1; AMACR, EZH2 y CTBP). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de cribar un compuesto que altera (por ejemplo, aumenta o disminuye) la expresión de genes marcadores de cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos candidatos son agentes antisentido (por ejemplo, oligonucleótidos) dirigidos contra marcadores de cáncer. Véase la Sección IV más adelante para una discusión de la terapia antisentido. En otras realizaciones, los compuestos candidatos son anticuerpos que se unen específicamente a un marcador de cáncer de la presente invención.

En un procedimiento de cribado, los compuestos candidatos se evalúan para su capacidad para alterar la expresión de marcadores de cáncer poniendo en contacto un compuesto con una célula que expresa un marcador de cáncer y luego ensayando el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión. En algunas realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión de un gen marcador de cáncer se ensaya detectando el nivel de ARNm marcador de cáncer expresado por la célula. La expresión de ARNm puede detectarse por cualquier procedimiento adecuado. En otras realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión de genes marcadores de cáncer se ensaya midiendo el nivel de polipéptido codificado por los marcadores de cáncer. El nivel de polipéptido expresado puede medirse usando cualquier procedimiento adecuado que incluye, pero no se limita a, los desvelados en este documento.

Específicamente, la presente invención proporciona procedimientos de cribado para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a marcadores de cáncer de la presente invención, tienen un efecto inhibidor (o estimulante) sobre, por ejemplo, la expresión de marcadores de cáncer o la actividad de marcadores de cáncer, o tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión o la actividad de un sustrato marcador de cáncer. Por tanto, los compuestos identificados pueden usarse para modular la actividad de productos génicos diana (por ejemplo, genes marcadores de cáncer) tanto directamente como indirectamente en un protocolo terapéutico para elaborar la función biológica del producto génico diana o para identificar compuestos que perturban las interacciones de genes diana normales. Los compuestos que inhiben la actividad o expresión de marcadores de cáncer son útiles en el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo, cáncer, particularmente cáncer de próstata metastásico (por ejemplo, independiente de andrógenos).

En una realización, la invención proporciona ensayos para cribar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de una proteína o polipéptido marcador de cáncer o una porción biológicamente activa de los mismos. En otra realización, la invención proporciona ensayos para cribar compuestos candidatos o de prueba que se unen a o modulan la actividad de una proteína o polipéptido marcador de cáncer o una porción biológicamente activa de los mismos.

Los compuestos de prueba de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica que incluyen bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un novedoso esqueleto de no péptido que son resistentes a degradación enzimática pero que sin embargo siguen siendo bioactivos; véase, por ejemplo, Zuckennann y col., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]); bibliotecas en fase sólida o en fase de disolución paralelas espacialmente direccionables; procedimientos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el procedimiento de bibliotecas de 'una perla-un compuesto'; y procedimientos de bibliotecas sintéticas usando selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de biblioteca biológica y biblioteca de peptoides se prefieren para su uso con bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de oligómeros peptídicos, no peptídicos o de moléculas pequeñas de compuestos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la materia, por ejemplo, en: DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]; Erb y col., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho y col., Science 261:1303 [1993]; Carrell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; y Gallop y col., J. Med. Chem. 37:1233 [1994].

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]) o en perlas (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), chips (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bacterias o esporas (patente de EE.UU. nº 5.223.409; incorporada en este documento por referencia), plásmidos (Cull y col., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992]) o en fago (Scott y Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404406 [1990]; Cwirla y col., Proc. NatI. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]).

En una realización, un ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa una proteína marcadora de cáncer o porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba, y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad del marcador de cáncer. Determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad del marcador de cáncer puede llevarse a cabo monitorizando, por ejemplo, cambios en la actividad enzimática. La célula puede ser, por ejemplo, de origen mamífero.

También puede evaluarse la capacidad del compuesto de prueba para modular la unión del marcador de cáncer a un compuesto, por ejemplo, un sustrato marcador de cáncer. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, acoplando el compuesto, por ejemplo, el sustrato, con un radioisótopo o marca enzimática tal que la unión del compuesto, por ejemplo, el sustrato, a un marcador de cáncer pueda determinarse detectando el compuesto marcado, por ejemplo, sustrato, en un complejo.

Alternativamente, el marcador de cáncer se acopla a un radioisótopo o marca enzimática para monitorizar la capacidad de un compuesto de prueba para modular la unión del marcador de cáncer a un sustrato marcador de cáncer en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, sustratos) pueden marcarse con 125I, 35S 14C o 3H, tanto directamente como indirectamente, y detectarse el radioisótopo por recuento directo de radioemisión o por recuento por centelleo. Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y detectarse la marca enzimática por determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.

Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato marcador de cáncer) para interaccionar con un marcador de cáncer con o sin el marcado de cualquiera de los interactuantes. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con un marcador de cáncer sin el marcado de tanto el compuesto como el marcador de cáncer (McConnell y col. Science 257:1906-1912 [1992]). Como se usa en este documento, un “microfisiómetro” (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la tasa a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico direccionable por la luz (LAPS). Los cambios en esta tasa de acidificación pueden usarse como indicador de la interacción entre un compuesto y marcadores de cáncer.

En otra realización más se proporciona un ensayo libre de células en el que una proteína marcadora de cáncer o porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se evalúa la capacidad del compuesto de prueba para unirse a la proteína marcadora de cáncer o porción biológicamente activa de la misma. Porciones biológicamente activas preferidas de las proteínas marcadoras de cáncer que van a usarse en ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en interacciones con sustratos u otras proteínas, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad superficial.

Los ensayos libres de células implican preparar una mezcla de reacción de la proteína del gen diana y el compuesto de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formándose así un complejo que puede eliminarse y/o detectarse.

La interacción entre dos moléculas también puede detectarse, por ejemplo, usando transferencia de energía de fluorescencia (FRET) (véase, por ejemplo, Lakowicz y col., patente de EE.UU. nº 5.631.169; Stavrianopoulos y col., patente de EE.UU. nº 4.968.103). Se selecciona una marca de fluoróforo de forma que la energía fluorescente emitida por una primera molécula donante sea absorbida por una marca fluorescente sobre una segunda molécula 'aceptora', que a su vez puede fluorescer debido a la energía absorbida.

Alternativamente, la molécula de proteína 'donante' puede utilizar simplemente la energía fluorescente natural de residuos de triptófano. Se eligen marcas que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de forma que la marca de la molécula 'aceptora' pueda diferenciarse de la del 'donante'. Como la eficiencia de la transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produzca la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de la molécula 'aceptora' en el ensayo debería ser máxima. Puede medirse convenientemente un acontecimiento de unión de FRET mediante medios de detección fluorométricos convencionales muy conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro).

En otra realización, determinar la capacidad de la proteína marcadora de cáncer para unirse a una molécula diana puede llevarse a cabo usando análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA) (véase, por ejemplo, Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 [1991] y Szabo y col. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 [1995]). La “resonancia de plasmones superficiales” o “BIA” detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BlAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativa de un acontecimiento de unión) producen alteraciones del índice de refracción de la luz próxima a la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmones superficiales (SPR)), produciendo una señal detectable que puede usarse como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

En una realización, el producto génico diana o la sustancia de prueba está anclado sobre una fase sólida. Los complejos de producto génico diana/compuesto de prueba anclados sobre la fase sólida pueden detectarse al final de la reacción. Preferentemente, el producto génico diana puede anclarse sobre una superficie sólida, y el compuesto de prueba (que no está anclado) puede marcarse tanto directamente como indirectamente con marcas detectables tratadas en este documento.

Puede desearse inmovilizar marcadores de cáncer, un anticuerpo marcador anti-cáncer o su molécula diana para facilitar la separación de formas complejadas de no complejadas de una o ambas de las proteínas, además de para tener en cuenta la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una proteína marcadora de cáncer, o interacción de una proteína marcadora de cáncer con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede llevarse a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas de las proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión marcadoras de cáncer glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/diana pueden adsorberse sobre perlas de glutatión-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y tanto la proteína diana no adsorbida como la proteína marcadora de cáncer, y la mezcla se incuba en condiciones propicias para la formación de complejos (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para sal y pH). Tras la incubación, las perlas o los pocillos de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente sin unir, la matriz se inmoviliza en el caso de perlas, el complejo se determina tanto directamente como indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz y determinarse el nivel de unión o actividad de marcadores de cáncer usando técnicas convencionales. Otras técnicas para inmovilizar tanto proteína marcadora de cáncer como una molécula diana sobre matrices incluyen usar conjugación de biotina y estreptavidina. Puede prepararse proteína marcadora de cáncer biotinilada o moléculas diana a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, EL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical).

Con el fin de realizar el ensayo, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de completarse la reacción, los componentes sin reaccionar se eliminan (por ejemplo, lavando) en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede llevarse a cabo de varias formas. Si el componente previamente no inmovilizado está pre-marcado, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron complejos. Si el componente previamente no inmovilizado no está premarcado, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede estar directamente marcado o indirectamente marcado con, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra IgG marcada).

Esta ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con proteína marcadora de cáncer o moléculas diana, pero que no interfieren con la unión de la proteína marcadora de cáncer con su molécula diana. Tales anticuerpos pueden derivatizarse a los pocillos de la placa, y atraparse la diana o proteína marcadora de cáncer sin unir en los pocillos por conjugación de anticuerpos. Los procedimientos para detectar tales complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína marcadora de cáncer o molécula diana, además de ensayos ligados a enzima que se basan en detectar una actividad enzimática asociada a la proteína marcadora de cáncer o molécula diana.

Alternativamente pueden realizarse ensayos libres de células en una fase líquida. En un ensayo tal, los productos de reacción se separan de componentes sin reaccionar por distintas técnicas convencionales que incluyen, pero no se limitan a: centrifugación diferencial (véase, por ejemplo, Rivas y Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7 [1993]); cromatografía (cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico); electroforesis (véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York); e inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York). Tales resinas y técnicas cromatográficas son conocidas para un experto en la materia (véanse, por ejemplo, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl 699:499525 [1997]). Además, la transferencia de energía de fluorescencia también puede utilizarse convenientemente como se describe en este documento para detectar la unión sin más purificación del complejo de la disolución.

El ensayo puede incluir poner en contacto la proteína marcadora de cáncer o porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une al marcador de cáncer para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteína marcadora de cáncer, en la que determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteína marcadora de cáncer incluye determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferencialmente a marcadores de cáncer o porción biológicamente activa de los mismos, o modular la actividad de una molécula diana, con respecto al compuesto conocido.

Hasta el punto de que los marcadores de cáncer puedan interaccionar in vivo con una o más macromoléculas celulares o extracelulares tales como proteínas, los inhibidores de una interacción tal son útiles. Puede usarse un ensayo homogéneo para identificar inhibidores.

Por ejemplo, se prepara un complejo preformado del producto génico diana y el producto del componente de unión celular o extracelular interactivo de forma que se marquen tanto los productos génicos diana como sus componentes de unión, pero la señal generada por la marca se inactive debido a la formación de complejos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.109.496 que utiliza este enfoque para inmunoensayos). La adición de una sustancia de prueba que compite con y desplaza una de las especies del complejo preformado producirá la generación de una señal por encima de la referencia. De esta forma pueden identificarse sustancias de prueba que perturban la interacción del producto génico diana-componente de unión. Alternativamente, la proteína marcadora de cáncer puede usarse como “proteína cebo” en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.283.317; Zervos y col., Cell 72:223-232 [1993]; Madura y col., J. Biol. Chem. 268,1204612054 [1993]; Bartel y col., Biotechniques 14:920-924 [1993]; Iwabuchi y col., Oncogen 8:1693-1696 [1993]; y Brent documento WO 94/10300) para identificar otras proteínas que se unen a o interaccionan con marcadores de cáncer (“proteínas de unión a marcador de cáncer” o “pu a marcador de cáncer”) y que participan en la actividad de marcadores de cáncer. Tales pu a marcador de cáncer pueden ser activadores o inhibidores de señales por las proteínas marcadoras de cáncer o dianas como, por ejemplo, en los elementos aguas abajo de una ruta de señalización mediada por marcadores de cáncer.

También pueden identificarse moduladores de la expresión de marcadores de cáncer. Por ejemplo, una célula o mezcla libre de células se pone en contacto con un compuesto candidato y la expresión del ARNm o proteína marcador de cáncer se evalúa con respecto al nivel de expresión de ARNm o proteína marcador de cáncer en ausencia del compuesto candidato. Si la expresión del ARNm o proteína marcador de cáncer es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión de ARNm o proteína marcador de cáncer. Alternativamente, si la expresión de ARNm o proteína marcador de cáncer es menos (es decir, estadísticamente significativamente menos) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de ARNm o proteína marcador de cáncer. El nivel de expresión de ARNm o proteína marcador de cáncer puede determinarse mediante procedimientos descritos en este documento para detectar ARNm o proteína marcador de cáncer.

Puede identificarse un agente modulador usando un ensayo basado en células o libre de células, y la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína marcadora de cáncer puede confirmarse in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para una enfermedad (por ejemplo, un animal con cáncer de próstata o cáncer de próstata metastásico; o un animal que alberga un xenoinjerto de un cáncer de próstata de un animal (por ejemplo, ser humano) o células de un cáncer resultante de metástasis de un cáncer de próstata (por ejemplo, para un ganglio linfático, hueso o hígado), o células de una línea de células de cáncer de próstata.

La presente invención se refiere adicionalmente a agentes novedosos identificados por los ensayos de cribado anteriormente descritos (véase, por ejemplo, más adelante la descripción de terapias contra el cáncer). Por consiguiente, está dentro del alcance de la presente invención usar adicionalmente un agente identificado como se describe en este documento (por ejemplo, un agente modulador marcador de cáncer, una molécula de ácido nucleico marcadora de cáncer antisentido, una molécula de ARNip, un anticuerpo específico marcador de cáncer, o un componente de unión a marcador de cáncer) en un modelo animal apropiado (tal como aquellos descritos en este documento) para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismo de acción del tratamiento con un agente tal. Además, los agentes novedosos identificados por los ensayos de cribado anteriormente descritos pueden usarse, por ejemplo, para los tratamientos que se describen en este documento.

IV. Terapias contra el cáncer

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de un modulador para inhibir la expresión de EZH2 para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata.

A. Terapias antisentido

En algunas realizaciones, la presente invención se centra en la expresión de marcadores de cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención emplea composiciones que comprenden compuestos antisentido oligoméricos, particularmente oligonucleótidos (por ejemplo, aquellos identificados en los procedimientos de cribado de fármacos descritos anteriormente), para su uso en modular la función de moléculas de ácidos nucleicos que codifican marcadores de cáncer de la presente invención, por último lugar modular la cantidad de marcador de cáncer expresado. Esto se lleva a cabo proporcionando compuestos antisentido que se hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican marcadores de cáncer de la presente invención. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos que se hibridan específicamente con él se denomina generalmente en lo sucesivo “antisentido”. Las funciones del ADN que van a interferirse incluyen replicación y transcripción. Las funciones del ARN que van a interferirse incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalización del ARN al sitio de traducción de proteínas, traducción de proteína del ARN, corte y empalme del ARN para dar una o más especies de ARNm y actividad catalítica que puede introducirse en o facilitarse por el ARN. El efecto global de tal interferente con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de marcadores de cáncer de la presente invención. En el contexto de la presente invención, “modulación” significa tanto un aumento (estimulación) como una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. Por ejemplo, la expresión puede inhibirse para prevenir potencialmente la proliferación del tumor.

Se prefiere elegir como diana ácidos nucleicos específicos para antisentido. “Elegir como diana” un compuesto antisentido para un ácido nucleico particular en el contexto de la presente invención es un procedimiento de múltiples etapas. El procedimiento empieza normalmente con la identificación de una secuencia de ácidos nucleicos cuya función va a modularse. Esto puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o estado de enfermedad particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, la diana es una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador de cáncer de la presente invención. El procedimiento de elección de diana también incluye la determinación de un sitio

: o sitios dentro de este gen para que se produzca la interacción antisentido de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la detección o modulación de la expresión de la proteína. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico preferido es la región que engloba el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Como el codón de iniciación de la traducción es normalmente 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina en lo sucesivo el “codón AUG”, el “codón de iniciación” o el “codón de iniciación AUG”. Una minoría de genes tiene un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y se ha mostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por tanto, las expresiones “codón de iniciación de la traducción” y “codón de iniciación” pueden englobar cualquier secuencia de codones, aún cuando el aminoácido iniciador en cada caso sea normalmente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de iniciación alternativos, pudiendo utilizarse preferencialmente uno cualquiera para la iniciación de la traducción en un tipo de célula particular

: o tejido, o bajo un conjunto de condiciones particulares. En el contexto de la presente invención, “codón de iniciación” y “codón de iniciación de la traducción” se refieren al codón o codones que se usan in vivo parar iniciar la traducción de una molécula de ARNm transcrita a partir de un gen que codifica un antígeno de tumor de la presente invención, independientemente de la(s) secuencia(s) de tales codones.

El codón de terminación de la traducción de un gen puede tener una de tres secuencias (es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA; las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente). Las expresiones “región del codón de iniciación” y “región del codón de iniciación de la traducción” se refieren a una parte de un ARNm o gen tal que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') de un codón de iniciación de la traducción. Similarmente, las expresiones “región del codón de terminación” y “región del codón de terminación de la traducción” se refieren a una parte de un ARNm o gen tal que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') de un codón de terminación de la traducción.

El marco de lectura abierto (ORF) o “región codificante”, que se refiere a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede elegirse eficazmente como diana. Otras regiones diana incluyen la región sin traducir de 5' (5' UTR), con referencia a la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de iniciación de la traducción e incluyendo así nucleótidos entre el sitio de tapa 5' y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen, y la región sin traducir de 3' (3' UTR), con referencia a la porción de un ARNm en la dirección 3' del codón de terminación de la traducción e incluyendo así nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen. La tapa de 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina metilado en N7 unido a la mayor parte del residuo en 5' del ARNm por un enlace trifosfato 5'-5'. La región de tapa en 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura de tapa en 5', además de los 50 primeros nucleótidos adyacentes a la tapa. La región de tapa también puede ser una región diana preferida.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas son directamente traducidos, muchos contienen una o más regiones, conocidas como “intrones”, que se escinden de un transcrito antes de que sea traducido. Las restantes regiones (y, por tanto, traducidas) se conocen como “exones” y son cortadas y empalmadas juntas para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de corte y empalme de ARNm (es decir, uniones de intrón-exón) también pueden ser regiones diana preferidas y son particularmente útiles en situaciones en las que el corte y empalme anómalo participe en enfermedad, o cuando una producción en exceso de un producto de corte y empalme de ARNm particular participa en la enfermedad. Las uniones por fusión anómalas debidas a transposiciones o deleciones también son dianas preferidas. También se ha descubierto que los intrones también pueden ser eficaces y, por tanto, regiones diana preferidas para compuestos antisentido elegidos como diana, por ejemplo, para ADN o pre-ARNm.

En algunas realizaciones, los sitios diana para la inhibición antisentido se identifican usando programas de software comercialmente disponibles (por ejemplo, Biognostik, Gottingen, Alemania; software SysArris , Bangalore, India; Antisense Research Group, Universidad de Liverpool, Inglaterra; GeneTrove, Carlsbad, CA). En otras realizaciones, los sitios diana para inhibición antisentido se identifican usando el procedimiento de sitios accesibles descrito en la patente de EE.UU. WO0198537A2.

Una vez se han identificado uno o más sitios diana, se eligen oligonucleótidos que son suficientemente complementarios a la diana (es decir, se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad) para dar el efecto deseado. Por ejemplo, en realizaciones preferidas de la presente invención, los oligonucleótidos antisentido son elegidos como diana en o cerca del codón de iniciación.

En el contexto de la presente invención, “hibridación”, con respecto a composiciones y procedimientos antisentido, significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inversos, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarios. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Se entiende que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser el 100% complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto con la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana produciendo una pérdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido con secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica (es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos).

Los compuestos antisentido se usan comúnmente como reactivos y diagnósticos de investigación. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, que pueden inhibir la expresión génica con especificidad, pueden usarse para aclarar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido también se usan, por ejemplo, para distinguir entre funciones de diversos miembros de una ruta biológica.

La especificidad y sensibilidad de antisentido también se aplica a usos terapéuticos. Por ejemplo, se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de estados de enfermedad en animales y el hombre. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y actualmente están en marcha numerosos ensayos clínicos. Por tanto, se establece que los oligonucleótidos son modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en las pautas de tratamiento para tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

Aunque los oligonucleótidos antisentido son una forma preferida de compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos que incluyen, pero no se limitan a, miméticos de oligonucleótidos tal como se describen más adelante. Los compuestos antisentido según la presente invención comprenden preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 bases ligadas), aunque con la presente invención pueden usarse secuencias tanto más largas como más cortas. Compuestos antisentido particularmente preferidos son oligonucleótidos antisentido, incluso más preferentemente aquellos que comprenden de aproximadamente 12 a aproximadamente 25 nucleobases.

Ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles con la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleosídicos no naturales. Como se define en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto de internucleósidos también pueden considerarse que son oligonucleósidos.

Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquilfosfonatos que incluyen 3'alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos ligados en 2'-5' de éstos, y aquellos que tiene polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están ligados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en su interior tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico (es decir, el esqueleto) de las unidades de nucleótido se reemplazan por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto de ácido nucleico diana apropiado. Un compuesto oligomérico tal, un mimético de oligonucleótido que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina en lo sucesivo un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte amida del esqueleto. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº: 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Más enseñanza de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen y col., Science 254:1497 (1991).

La mayoría de las realizaciones preferidas de la invención son oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomo, y en particular -CH2, -NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [conocidos como un esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- [en las que el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa -O-P-O-CH2-] de la patente de EE.UU. nº

5.489.677 anteriormente citada, y los esqueletos de amida de la patente de EE.UU. nº 5.602.240 anteriormente citada. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino de la patente de EE.UU. nº 5.034.506 anteriormente citada.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S

o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo C2 a C10 y alquinilo sustituido o sin sustituir. Particularmente se prefieren O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 en las que n y m son de 1 a aproximadamente

10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo C1 a C10 inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo saliente de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta 78:486 [1995]), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi (es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2), también conocido como 2'-DMAOE, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi(2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi(2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-flúor (2'-F). También pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos ligados en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos del azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar del pentofuranosil-azúcar.

Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la materia simplemente “base”). Como se usa en este documento, nucleobases “sin modificar” o “naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Otras nucleobases incluyen las desveladas en la patente de EE.UU. nº 3.687.808. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos dela invención. Éstas incluyen pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas con N-2, N-6 y O-6 que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico 0,6-1,2ºC y actualmente son las sustituciones de bases preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietil-azúcar.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la presente invención implica ligar químicamente al oligonucleótido uno

o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales restos incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter (por ejemplo, hexil-S-tritiltiol), un tiocolesterol, una cadena alifática (por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo), un fosfolípido, (por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio), una cadena de poliamina o de polietilenglicol o ácido adamantanoacético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Un experto en la materia relevante sabe cómo generar oligonucleótidos que contienen las modificaciones anteriormente descritas. La presente invención no se limita a los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente. Puede utilizarse cualquier modificación o sustitución adecuada.

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén uniformemente modificadas y, de hecho, más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede incorporarse en un único compuesto o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido “quiméricos” o “quimeras” en el contexto de la presente invención son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, representando cada una al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido se modifica de manera que se confiera al oligonucleótido un aumento de la resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular y/o aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir de sustrato para enzimas que pueden escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por tanto, la activación de RNasa H produce la escisión de la ARN diana, potenciándose así enormemente la eficiencia de la inhibición de oligonucleótidos de la expresión génica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana. La escisión del ARN diana puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si fuera necesario, asociarse a técnicas de hibridación de ácidos nucleicos conocidas en la técnica.

Los compuestos antisentido quiméricos de la presente invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos antisentido de la presente invención como se describen más adelante.

B. Terapias genéticas

La presente invención contempla el uso de cualquier manipulación genética para su uso en modular la expresión de marcadores de cáncer de la presente invención. Ejemplos de manipulación genética incluyen, pero no se limitan a, inactivación de genes (por ejemplo, eliminación del gen marcador de cáncer del cromosoma usando, por ejemplo, recombinación), la expresión de construcciones antisentido con o sin promotores inducibles y similares. La administración de la construcción de ácido nucleico a células in vitro o in vivo puede realizarse usando cualquier procedimiento adecuado. Un procedimiento adecuado es uno que introduce la construcción de ácido nucleico en la célula de forma que se produzca el acontecimiento deseado (por ejemplo, la expresión de una construcción antisentido).

La introducción de moléculas que llevan información genética en células se logra por cualquiera de diversos procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, inyección dirigida de construcciones de ADN desnudo, bombardeo con partículas de oro cargadas con dichas construcciones y transferencia de genes mediada por macromoléculas usando, por ejemplo, liposomas, biopolímeros y similares. Los procedimientos preferidos usan vehículos de administración de genes derivados de virus que incluyen, pero no se limita a, adenovirus, retrovirus, virus de la variolovacuna y virus adeno-asociados. Debido a la mayor eficiencia con respecto a los retrovirus, los vectores derivados de adenovirus son los vehículos de administración de genes preferidos para transferir moléculas de ácidos nucleicos en células huésped in vivo. Se ha mostrado que los vectores adenovíricos proporcionan transferencia de genes in vivo muy eficiente en una variedad de tumores sólidos en modelos animales y en xenoinjertos de tumor sólido humano en ratones inmunodeficientes. Ejemplos de vectores adenovíricos y procedimientos para la transferencia de genes se describen en las publicaciones PCT WO 00/12738 y WO 00/09675 y las solicitudes de patente de EE.UU. nº 6.033.908, 6.019.978, 6.001.557, 5.994.132, 5.994.128, 5.994.106, 5.981.225, 5.885.808, 5.872.154, 5.830.730 y 5.824.544.

Los vectores pueden administrarse al sujeto en una variedad de formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, los vectores se administran a tumores o tejido asociados a tumores usando inyección directa. En otras realizaciones, la administración es por la circulación sanguínea o linfática (véase, por ejemplo, la publicación PCT 99/02685). Niveles de dosis a modo de ejemplo del vector adenovírico son preferentemente 108 a 1011 partículas de vector añadidas al perfundido.

C. Terapia con anticuerpos - Referencia

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos que eligen como diana tumores de próstata que expresan un marcador de cáncer de la presente invención (por ejemplo, hepsina, pim-1, EZH2, anexina, CTBP, GP73 y AMACR). Puede utilizarse cualquier anticuerpo adecuado (por ejemplo, monoclonal, policlonal o sintético) en los procedimientos terapéuticos desvelados en este documento. En realizaciones preferidas, los anticuerpos usados para la terapia contra el cáncer son anticuerpos humanizados. Los procedimientos para humanizar anticuerpos son muy conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.180.370, 5.585.089, 6.054.297 y 5.565.332).

En algunas realizaciones, los anticuerpos terapéuticos comprenden un anticuerpo generado contra un marcador de cáncer de la presente invención (por ejemplo, hepsina, pim-1, EZH2, anexina, CTBP, GP73 y AMACR), en el que el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico. En tales realizaciones se genera un agente terapéutico específico de tumor que no elige como diana células normales, reduciéndose así muchos de los efectos secundarios perjudiciales de la quimioterapia tradicional. Para ciertas aplicaciones se prevé que los agentes terapéuticos sean agentes farmacológicos que servirán de agentes útiles para la unión a anticuerpos, particularmente agentes citotóxicos o de otro modo anticelulares que tienen la capacidad de destruir o suprimir el crecimiento o la división celular de células endoteliales. La presente invención contempla el uso de cualquier agente farmacológico que pueda conjugarse con un anticuerpo y administrarse en forma activa. Agentes anticelulares a modo de ejemplo incluyen agentes quimioterapéuticos, radioisótopos y citotoxinas. Los anticuerpos terapéuticos de la presente invención pueden incluir una variedad de restos citotóxicos que incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, yodo-131, yodo-123, tecnecio-99m, indio-111, renio-188, renio-186, galio-67, cobre-67, itrio-90, yodo125 o astatina-211), hormonas tales como un esteroide, antimetabolitos tales como citosinas (por ejemplo, arabinósido, fluorouracilo, metrotrexato o aminopterina; una antraciclina; mitomicina C), alcaloides de la vinca (por ejemplo, demecolcina; etopósido; mitramicina) y agente alquilante antitumoral tal como clorambucilo o melfalan. Otras realizaciones pueden incluir agentes tales como un coagulante, una citocina, factor de crecimiento, endotoxina bacteriana o el resto del lípido A de endotoxina bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes terapéuticos incluirán toxina derivada de plantas, hongos o bacterias tales como toxinas de la cadena A, una proteína inactivante de ribosomas, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, toxina de la difteria o exotoxina de pseudomonas, sólo por mencionar algunos ejemplos. En algunas realizaciones preferidas se utiliza la cadena A de ricina desglicosilada.

En cualquier caso, se propone que agentes tales como estos puedan conjugarse satisfactoriamente, si se desea, con un anticuerpo de un modo que permita su elección como diana, internalización, liberación o presentación a componentes de la sangre en el sitio de las células tumorales elegidas como diana según se requiera usando tecnología de conjugación conocida (véase, por ejemplo, Ghose y col., Methods Enzymol., 93:280 [1983]).

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona inmunotoxinas que eligen como diana un marcador de cáncer de la presente invención (por ejemplo, hepsina, pim-1, EZH2, anexina, CTBP, GP73 y AMACR). Las inmunotoxinas son conjugados de un agente que elige diana específico, normalmente un anticuerpo o fragmento dirigido a tumor, con un agente citotóxico, tal como un resto de toxina. El agente que elige diana dirige la toxina a, y así destruye selectivamente, células que llevan el antígeno elegido como diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos terapéuticos emplean ligadores cruzados que proporcionan alta estabilidad in vivo (Thorpe y col., Cancer Res., 48:6396 [1988]).

En otras realizaciones, particularmente aquellas que implican tratamiento de tumores sólidos, los anticuerpos se diseñan para tener un efecto citotóxico o de otro modo anticelular contra la vasculatura del tumor, suprimiendo el crecimiento o la división celular de las células endoteliales vasculares. Este ataque pretende conducir a un colapso vascular localizado en el tumor, privando a las células tumorales, particularmente a aquellas células tumorales distales de la vasculatura, de oxígeno y nutrientes, conduciendo en último lugar a la muerte celular y necrosis tumoral.

En realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos basados en anticuerpos se formulan como composiciones farmacéuticas como se describen más adelante. En realizaciones preferidas, la administración de una composición de anticuerpo de la presente invención produce una disminución medible en cáncer (por ejemplo, disminución o eliminación de tumor).

D. Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas (por ejemplo, que comprenden los compuestos antisentido o de anticuerpo descritos anteriormente). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y a membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares.

Las composiciones y formulaciones para administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, promotores de la penetración, compuestos de vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos al (a los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente los principios activos a vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero no se limitan a, comprimidos, cápsulas, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.

En una realización de la presente invención, las composiciones farmacéuticas pueden formularse y usarse como espumas. Espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, cremas, geles y liposomas. Aunque básicamente similar en naturaleza, estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final.

También pueden añadirse agentes que potencian la captación de oligonucleótidos al nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, lípidos catiónicos tales como lipofectina (patente de EE.UU. nº 5.705.188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas tales como polilisina (documento WO 97/30731) también potencian la captación celular de oligonucleótidos.

Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes complementarios convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención tales como colorantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir demasiado con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionan perjudicialmente con el (los) ácido(s) nucleico(s) de la formulación.

Ciertas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o varios agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, fármacos antineoplásicos como daunorubicina, dactinomicina, doxorubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrógeno, clorambucilo, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptoporina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metrotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). También pueden combinarse fármacos antiinflamatorios que incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivíricos que incluyen, pero no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir en las composiciones de la invención. Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también están dentro del alcance de la presente invención. Dos o más compuestos combinados pueden usarse juntos o secuencialmente.

La dosificación depende de la gravedad y la sensibilidad del estado de enfermedad que va a tratarse, durando el transcurso del tratamiento de varios días a varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado de enfermedad. Pueden calcularse programas de dosificación óptimos a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. El médico que administra puede determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales, y generalmente puede estimarse basándose en las CE50 encontradas que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo o basándose en los ejemplos descritos en este documento. En general, la dosificación es de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o más al día, semanalmente, mensualmente o anualmente. El médico práctico puede estimar las tasas de repetición para la dosificación basándose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio puede desearse que el sujeto se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la reaparición del estado de enfermedad, en la que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento que oscilan de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o más veces al día, a una vez cada 20 años.

V. Animales transgénicos que expresan genes marcadores de cáncer - Referencia

La presente invención contempla la generación de animales transgénicos que comprenden un gen marcador de cáncer exógeno de la presente invención o mutantes y variantes del mismo (por ejemplo, truncaciones o polimorfismos de un único nucleótido). En realizaciones preferidas, el animal transgénico muestra un fenotipo alterado (por ejemplo, aumento o disminución de la presencia de marcadores) con respecto a animales naturales. Los procedimientos para analizar la presencia o ausencia de tales fenotipos incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en este documento. En algunas realizaciones preferidas, los animales transgénicos muestran adicionalmente un aumento o disminución del crecimiento de tumores o pruebas de cáncer.

Los animales transgénicos de la presente invención se usan en cribados de fármacos (por ejemplo, terapia contra el cáncer). En algunas realizaciones, los compuestos de prueba (por ejemplo, un fármaco que se sospecha que es útil para tratar cáncer) y los compuestos de control (por ejemplo, un placebo) se administran a los animales transgénicos y los animales de control y se evalúan los efectos.

Los animales transgénicos pueden generarse por una variedad de procedimientos. En algunas realizaciones, células embrionarias en diversas fases de desarrollo se usan para introducir transgenes para la producción de animales transgénicos. Se usan diferentes procedimientos dependiendo de la fase de desarrollo de la célula embrionaria. El cigoto es la mejor diana para micro-inyección. En el ratón, el pronúcleo macho alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro que permite la inyección reproducible de 1-2 picolitros (p1) de disolución de ADN. El uso de cigotos como diana para la transferencia de genes tiene una ventaja importante porque en la mayoría de los casos el ADN inyectado se incorporará en el genoma huésped antes de la primera escisión (Brinster y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 [1985]). Como consecuencia, todas las células del animal no humano transgénico llevarán el transgén incorporado. En general, esto también se reflejará en la transmisión eficiente del transgén a la descendencia del fundador ya que el 50% de las células germinativas albergarán el transgén. La patente de EE.UU. nº 4.873.191 describe un procedimiento para la micro-inyección de cigotos; la divulgación de esta patente se incorpora en este documento en su totalidad.

En otras realizaciones se usa infección retrovírica para introducir transgenes en un animal no humano. En algunas realizaciones, el vector retrovírico se utiliza para transfectar ovocitos inyectando el vector retrovírico en el espacio perivitelino del ovocito (patente de EE.UU. nº 6.080.912). En otras realizaciones, el embrión humano en desarrollo puede cultivarse in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para infección retrovírica (Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]). La infección eficiente de los blastómeros se obtiene por tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Hogan y col., en Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1986]). El sistema de vector vírico usado para introducir el transgén es normalmente un retrovirus defectuoso en la replicación que lleva el transgén (Jahner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927 [1985]). La transfección se obtiene fácilmente y eficientemente cultivando los blastómeros sobre una monocapa de células productoras de virus (Stewart, y col., EMBO J., 6:383 [1987]). Alternativamente, la infección puede realizarse en una fase posterior. El virus o las células productoras de virus pueden inyectarse en el blastocele (Jahner y col., Nature 298:623 [1982]). La mayoría de los fundadores serán mosaicos para el transgén ya que la incorporación sólo se produce en un subconjunto de células que forman el animal transgénico. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovíricas del transgén en diferentes posiciones en el genoma que generalmente se segregarán en la descendencia. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal, aunque con baja eficiencia, por infección retrovírica intrauterina del embrión a la mitad de la gestación (Jahner y col., arriba [1982]). Medios adicionales de uso de retrovirus o vectores retrovíricos para crear animales transgénicos conocidos en la técnica implican la micro-inyección de partículas retrovíricas o células tratadas con mitomicina C que producen retrovirus en el espacio perivitelino de óvulos fecundados o embriones prematuros (solicitud internacional PCT WO 90/08832 [1990], y Haskell y Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]).

En otras realizaciones, el transgén se introduce en citoblastos embrionarios y los citoblastos transfectados se utilizan para formar un embrión. Se obtienen células ES cultivando embriones de pre-implantación in vitro bajo condiciones apropiadas (Evans y col., Nature 292:154 [1981]; Bradley y col., Nature 309:255 [1984]; Gossler y col., Proc. Acad. Sci. USA 83:9065 [1986]; y Robertson y col., Nature 322:445 [1986]). Los transgenes pueden introducirse eficientemente en las células ES por transfección de ADN mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen co-precipitación con fosfato de calcio, fusión de protoplastos o esferoplastos, lipofección y transfección mediada por DEAE-dextrano. Los transgenes también pueden introducirse en células ES por transducción mediada por retrovirus o por micro-inyección. Tales células ES transfectadas pueden después colonizar un embrión tras su introducción en el blastocele de un embrión en fase de blastocisto y contribuir a la línea germinal del animal quimérico resultante (para revisión véase Jaenisch, Science 240:1468 [1988]). Antes de la introducción de células ES transfectadas en el blastocele, las células ES transfectadas pueden someterse a diversos protocolos de selección para enriquecer en células ES que han integrado el transgén suponiendo que el transgén proporciona un medio para tal selección. Alternativamente, la reacción en cadena de la polimerasa puede usarse para cribar células ES que han integrado el transgén. Esta técnica obvia la necesidad de crecimiento de las células ES transfectadas bajo condiciones selectivas apropiadas antes de transferirse al blastocele.

En todavía otras realizaciones se utiliza recombinación homóloga para inactivar la función del gen o crear mutantes de deleción (por ejemplo, mutantes de truncación). Los procedimientos para recombinación homóloga se describen en la patente de EE.UU. nº 5.614.396.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de las mismas.

En la divulgación experimental que sigue se aplican las siguientes abreviaturas: N (normal); M (molar); mM (milimolar); μM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); μg (microgramos); ng (nanogramos); l (litros); ml (mililitros); μl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μm (micrómetros); nm (nanómetros); y ºC (grados centígrados).

Ejemplo 1

Preparación de ARN total y conjuntos de referencia

Los especímenes quirúrgicos de próstata se obtuvieron del Programa de investigación especializado en cáncer de próstata de la Universidad de Michigan (S.P.O.R.E.) Tumor Bank con la aprobación del Comité de ética médica. Las muestras de tumor se derivaron de pacientes con cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal clínicamente localizado y avanzado. La Tabla 1 muestra las muestras usadas en los presentes estudios. Todos los pacientes se operaron entre 1993 y 1998 de cáncer de próstata clínicamente localizado como se ha determinado por PSA preoperatorio, examen rectal digital y biopsia por punción de próstata. Además, un subconjunto de pacientes recibió

barridos óseos y de CAT para evaluar la posibilidad de diseminación metastásica. Todos los pacientes recibieron prostatectomía radical como monoterapia (es decir, sin terapia hormonal o radioterapia). Los tumores de próstata avanzados se recogieron de una serie de 12 autopsias rápidas realizadas en la Universidad de Michigan de hombres que murieron de cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal. En resumen, la mayoría de estos pacientes 5 tuvo tanto cáncer de próstata ampliamente metastásico que se trató con terapia hormonal seguida de quimioterapia como pacientes que presentaron enfermedad clínicamente localizada que progresó y luego se trataron con tanto terapia hormonal como quimioterapia. La mayoría de los casos tenía múltiples lesiones metastásicas en numerosos sitios. Todas las autopsias se realizaron en el plazo de 4-6 horas después de la muerte. Recientemente se ha informado de los hallazgos clínicos y patológicos de estos casos (Rubin y col., Clin. Cancer Res., 6:1038 [2000]).

10 Todas las muestras usadas para el estudio de micromatrices de tejido se fijaron en 10% de formalina.

Los tejidos se homogeneizaron usando un homogeneizador Polytron (Brinkman Instruments) en trizol (Gibco BRL) y el ARN total se aisló según el protocolo de trizol convencional. El ARN total obtenido se sometió adicionalmente a una ronda adicional de extracción con fenol-cloroformo, se precipitó y se resuspendió en agua libre de ARNsa. El ARN total se cuantificó por absorbancia espectrofotométrica (260/280 nm) y la integridad se juzgó por electroforesis

15 en gel de agarosa con formaldehído desnaturalizante. El ARN total de cuatro tejidos normales se combinó en concentraciones iguales para obtener el conjunto de referencia. El ARN total de próstata humana usado en el conjunto de referencia comercial se obtuvo de Clontech, Inc.

Tabla 1. Muestras empleadas en el estudio. Designando el nivel de PSA en ng/ml, fuentes de órganos y puntuaciones de Gleason. Próstata adyacente normal (NAP), hiperplasia prostática benigna (HPB), cáncer de 20 próstata localizado (PCA) y cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal metastásico (MET). NA se refiere a “no aplicable”.

Tabla 1 Muestras de próstata

ID: Nivel de PSA Tejido Puntuación de Gleason

HPB-201: 6,2 Próstata NA

HPB-202: 3,9 Próstata NA

HPB-203: 3,9 Próstata NA

HPB-204: 4,6 Próstata NA

HPB-205: 4,6 Próstata NA

HPB-206: 4,6 Próstata NA

HPB-207: 4,8 Próstata NA

HPB-208: 13,6 Próstata NA

HPB-209: 9,8 Próstata NA

HPB-210: 4,6 Próstata NA

HPB-211: 2,6 Próstata NA

HPB-212: 7,1 Próstata NA

HPB-214: Próstata NA

HPB-215: 5,4 Próstata NA

Prostatitis: 9,8 Próstata NA

NAP-101: 4,6 Próstata NA

NAP-102: 9,8 Próstata NA

NAP-104: 7 Próstata NA

NAP-105: 0,09 Próstata NA

NAP-107: 4,7 Próstata NA

(continuación) (continuación)

Tabla 1 Muestras de próstata

ID: Nivel de PSA Tejido Puntuación de Gleason

PCA-401: 5,2 Próstata 4+4

PCA-402: 22 Próstata 4+3

PCA-403: 4,7 Próstata 3+3

PCA-404: 8,5 Próstata 3+3

PCA-405: 4,6 Próstata 3+3

PCA-406: 7,8 Próstata 3+3

PCA-407: 7,8 Próstata 3+3

PCA-408: 5,4 Próstata 3+3

PCA-409: 7 Próstata 3+3

PCA-410: 44,6 Próstata 4+4

PCA-414: Próstata 3+4

PCA-416: 24,1 Próstata 4+4

PCA-417: 12,4 Próstata 4+4

PCA-420: Próstata 3+3

PCA-421: 13,6 Próstata 3+4

MET-301: Pulmón NA

MET-302: Hígado NA

MET-303: Hígado NA

MET-304: Estómago NA

MET-305: Suprarrenal NA

MET-306: Próstata NA

MET-307: Ganglio linfático NA

MET-308: Ganglio linfático NA

MET-309: Ganglio linfático NA

MET-310: Hígado NA

MET-311: Tejido blando NA

MET-312: Hígado NA

MET-313: Tejido blando NA

MET-314: Tejido blando NA

MET-315: Tejido blando NA

MET-316: Tejido blando NA

Tabla 1 Muestras de próstata

ID: Nivel de PSA Tejido Puntuación de Gleason

MET-317: Hígado NA

MET-318: Hueso NA

MET-319: Hueso NA

MET-320: Hueso NA

Ejemplo 2

Análisis de micromatrices

5 Este ejemplo describe el uso de análisis de micromatrices para identificar genes que demuestran un nivel de expresión alterado en tejidos de próstata cancerosos o benignos.

A. Procedimientos experimentales

El análisis de micromatrices de la expresión génica se realizó esencialmente como se describe por los laboratorios de Brown y Derisi (disponible en el sitio de internet www.microarrays.org). Los clones de ADNc verificados por 10 secuencia en la micromatriz de ADNc humano están disponibles del sitio web de Research Genetics. Basándose en el último grupo Unigene, la micromatriz de ADNc humano de 10K usada abarca aproximadamente 5520 genes con nombre conocido y 4464 EST. Todos los chips tienen diversos elementos de control que incluyen ADN genómicos humanos, de rata y de levadura, SSC, genes de levadura y “genes de mantenimiento”, entre otros. Además, se usaron 500 ADNc relacionados con cáncer y apoptosis de Research Genetics que sirvieron de controles

15 independientes para el rastreo de clones y sirven de duplicados para el control de calidad. También se perfilaron tres líneas de células de cáncer de próstata metastásico: DU-145, LnCAP y PC3 para expresión génica.

Se preparó ADNc fluorescentemente marcado (Cy5) a partir de ARN total de cada muestra experimental. Las dos muestras de referencia usadas en este estudio se marcaron usando un segundo colorante fluorescente distinguible (Cy3) y se incluyó un conjunto de tejido de próstata adyacente normal (NAP) de cuatro pacientes (distinto de 20 aquellos usados en las muestras experimentales) y un conjunto comercial de tejidos de próstata normales (CP). Además de minimizar la variación paciente a paciente, las comparaciones con conjuntos de tejido de próstata normal facilitan el descubrimiento de genes que distinguen molecularmente neoplasias de próstata. Los dos conjuntos de referencia son diferentes en que uno comprende tejido de próstata adyacente normal, que puede estar influenciado por efectos paracrinos mediados por PCA, y además se expone a los mismos factores medioambientales y

25 genéticos que el PCA adyacente. A diferencia, el conjunto de CP se deriva de 19 individuos con patología de próstata no conocida y también representa un recurso de referencia renovable comercialmente disponible.

Los productos de PCR purificados, generados usando los insertos de clon como molde, se aplicaron en puntos sobre portaobjetos de microscopio recubiertos con poli-L-lisina usando un robot para la fabricación de micromatrices Omnigrid (GeneMachines, CA) equipado con agujas de tipo púa (Majer Scientific, AZ). Una ejecución de impresión

30 completa generó aproximadamente 100 micromatrices de ADN. Los protocolos para la impresión y el procesamiento posterior de matrices son muy conocidos en la técnica.

B. Análisis de datos

El análisis primario se hizo usando el paquete de software Genepix. Las imágenes de micromatrices escaneadas se dispusieron en rejillas y se ligaron a una lista de impresión de genes. Inicialmente, los datos fueron visualizados 35 como un diagrama de dispersión de intensidades de Cy3 frente a Cy5. Las relaciones de Cy3 con respecto a Cy5 se determinaron para los genes individuales junto con diversos otros parámetros de control de calidad (por ejemplo, intensidad con respecto a la referencia local). El paquete de análisis del software Genepix marca con banderas puntos como ausentes basándose en características de puntos (se refiere al sitio web de Axon Instruments, Inc.). Los puntos o áreas malas de la matriz con defectos obvios se marcan manualmente con banderas. Se desecharon

40 puntos con diámetros pequeños (< 50 micrómetros) y puntos con bajas intensidades de señal < 350 unidades de intensidad de fluorescencia con respecto a la referencia local en el canal más intenso. Los puntos marcados con banderas no se incluyeron en análisis posteriores. Los datos se escalaron de forma que el valor de la mediana de la relación promedio para todos los puntos se normalizara a 1,0 por matriz.

Entonces, estos archivos se importaron a una base de datos de Microsoft Access. Los datos para los experimentos requeridos se extrajeron de la base de datos en forma de una única tabla representando cada fila un elemento de matriz, cada columna una hibridación y cada celda la mediana normalizada de las relaciones para el elemento de matriz de la hibridación apropiada. Antes del agrupamiento, la mediana normalizada de los valores de relaciones de los genes se transformó en logaritmos de base 2 y se filtró para la presencia a través de matrices y se seleccionó para niveles de expresión y patrones dependiendo del conjunto experimental como se establece. Se aplicó la agrupación jerárquica de enlaces promedio de una matriz de similitud de correlación de Pearson no centrada usando el programa Cluster (Eisen y col., PNAS 95:14863 [1998]) y los resultados se analizaron y las figuras se generaron con el programa TreeView. TreeView y Cluster están disponibles del laboratorio de Michael Eisen en Lawrence Berkeley National Lab.

C. Resultados

Se usaron más de cuarenta micromatrices de ADNc humano de 10K para evaluar la expresión génica en cuatro estados clínicos de tejidos derivados de próstata en relación con dos conjuntos de referencia distintos de especímenes normales. La Figura 1 proporciona una visión general de la variación en la expresión génica a través de los diferentes especímenes de tejido analizados. Se empleó un algoritmo de agrupación jerárquica para agrupar genes y muestras experimentales basándose en similitudes de patrones de expresión génica con respecto a todos los otros genes y muestras probados, respectivamente.

1. Dendrogramas de expresión

Las relaciones entre las muestras experimentales se resumen como dendrogramas (Figura 1a), en los que el patrón y la longitud de las ramas reflejan la vinculación de las muestras. La Figura 1a muestra dendrogramas que revelan la variación en el patrón de expresión génica entre muestras experimentales con las dos referencias empleadas. Las muestras individuales en cada grupo están indicadas por las ramas del mismo color por las cuales MET están en azul oscuro, PCA localizados en naranja, NAP en azul claro, HPB en gris y las líneas celulares en rosa. El asterisco (*) indica una muestra que se documentó inicialmente como HPB, pero que posteriormente se confirmó que tenía 5% de tejido canceroso. Los detalles de las muestras metastásicas usadas en este estudio son del siguiente modo: MET 301 de pulmón; MET 302 y 303 de hígado; MET 304 de estómago; MET 305 de glándula suprarrenal; MET 306 de próstata; y MET 307 fue de ganglio linfático. La agrupación jerárquica de los datos identificados distingue patrones de expresión génica entre los diversos grupos analizados. Cada fila representa un único gen con 1520 genes representados en b, y 1006 genes representados en c. Los resultados representan la relación de la hibridación de sondas de ADNc fluorescentes preparadas a partir de cada ARNm experimental con respecto a los conjuntos de referencia respectivos. Estas relaciones son una medida de la expresión génica relativa en cada muestra experimental y se representan según la escala de color en la izquierda abajo. Los colores rojo y verde en la matriz representan genes que están regulados por aumento y por disminución, respectivamente, con respecto al conjunto de referencia empleado. Las líneas negras en la matriz representan niveles de transcritos que están sin cambiar, mientras que las líneas grises significan datos técnicamente inadecuados o ausentes (NP, no presentes). La saturación del color refleja la magnitud de la relación con respecto a la mediana para cada conjunto de muestras.

La Figura 1b muestra un diagrama por grupos de los diversos grupos de muestra en comparación con el conjunto de próstata adyacente normal como referencia. Los datos obtenidos en los experimentos de perfilado de la expresión incluyeron el número del índice CBCR-t, clon, ID, ID de agrupación Unigen, ID de acceso, NID, símbolo del gen y campos de nombre para cada gen usado en la matriz. El campo de nombre contiene genes que tienen homología parcial o completa basándose en las búsquedas de homología. Además, los datos contienen la diferencia numérica en niveles de expresión en comparación con el conjunto de referencia para cada gen. Antes de la agrupación de enlaces promedio jerárquica, los datos se filtraron para al menos un cambio de 2 veces en la relación de expresión y las mediciones de relaciones presentes en el 50% de las muestras. Por este procedimiento, 1520 genes se seleccionaron del conjunto de datos de referencia de NAP. Indicadas por barras verticales a la izquierda (b1 a b6) de la Figura 1b están regiones identificadas con firmas de expresión génica características. Las agrupaciones b1 y b5 muestran genes regulados por aumento en PCA localizado, pero no en PCA metastásico. Las agrupaciones b2 y b4 destacan genes regulados por disminución en PCA metastásico y las líneas celulares DU145 y LnCAP. La agrupación b3 identifica genes regulados por disminución en tanto PCA localizado como PCA metastásico. La agrupación b6 destaca genes que están principalmente regulados por aumento en PCA metastásico solo. Porciones de agrupaciones b4 y b6 se muestran ampliadas con genes seleccionados mostrados usando la nomenclatura de genes de la Organización del genoma humano (HUGO).

La Figura 1c muestra un diagrama por grupos de los diversos grupos de muestra comparados con la referencia del conjunto de próstata comercial. Antes de la agrupación de enlaces promedio jerárquica, los datos se filtraron para al menos un cambio de 3 veces en la relación de expresión y mediciones de relaciones presentes en el 75% de las muestras produciendo un total de 1006 genes. Las regiones con distintos patrones (c1-c6) están indicadas por barras verticales a la derecha de la Figura 1c. La agrupación c1 representa genes regulados por disminución en tanto PCA localizado como PCA metastásico. La agrupación c2 representa genes regulados por disminución sólo en PCA metastásico. La agrupación c3 muestra genes que están altamente representados en el conjunto comercial. La agrupación c4 destaca genes que están regulados por aumento en PCA localizado y en PCA metastásico. La agrupación c5 representa genes con una baja representación en el conjunto comercial. La agrupación c6 representa genes que se regulan por disminución en PCA metastásico, pero que están regulados por aumento en todas las otras muestras usadas.

Condiciones benignas de la próstata tales como HPB y NAP se agrupan por separado de líneas de células de PCA malignas o tejidos, independientemente del conjunto de referencia usado. Dentro de la agrupación de PCA también es evidente que el PCA metastásico y el PCA clínicamente localizado formaron subgrupos distintos. Similarmente, en la agrupación “benigna”, la HPB tendió a distinguirse por sí misma de la NAP. De forma interesante, una de las muestras de “HPB” se agrupó inicialmente con el grupo de PCA localizado. Sin embargo, tras la revisión histopatológica adicional, se descubrió que esta muestra contenía un pequeño foco de tejido neoplásico (~5%), explicándose así su clasificación errónea inicial (ahora se designa PCA+HPB en la Figura 1a).

También se presentan formas de la matriz de Eisen (Eisen y col., arriba) de la variación en la expresión génica (Figura 1b y 1c). Con una perspectiva global de los datos, es evidente que el PCA metastásico domina el análisis y tiene la mayor variación en la expresión génica de las muestras probadas. Las barras a la izquierda o derecha de cada matriz representan agrupaciones de genes coordinadamente expresados que destacan interrelaciones entre especímenes. Por ejemplo, las agrupaciones b3 y c1 representan genes regulados por disminución en tanto PCA localizado como metastásico (Figuras 1b y 1c). Por el contrario, las agrupaciones b6 y b4 destacan genes que están específicamente regulados por aumento y por disminución en PCA metastásico, respectivamente (Figura 1b). El supresor tumoral IGFBP-5, DAN1, FAT y RAB5A son ejemplos de genes que se regulan específicamente por disminución en PCA metastásico y también tienen una función propuesta en oncogénesis (regiones “ampliadas”, Figura 1b). Similarmente, los genes relacionados con el cáncer que están regulados por aumento en PCA metastásico incluyen MTA-1 (1 asociado a metástasis), MYBL2 y FLS353 (preferencialmente expresados en cáncer colorrectal). Muchos genes en esta agrupación “específica de met” son compartidos por tanto el tejido de PCA metastásico como por las dos líneas de células de PCA DU145 y LnCAP.

También se obtuvieron datos del perfilado de la expresión de especímenes de tejido de próstata adicionales perfilados contra un conjunto de referencia de próstata comercial (CPP). Un total de 53 especímenes de próstata se perfilaron contra el conjunto comercial. Incluyen 4 tejidos de próstata adyacentes normales (NAP), 14 hiperplasias prostáticas benignas (HPB), 1 prostatitis, 14 cánceres de próstata localizados (PCA) y 20 PCA resistentes al tratamiento hormonal metastásico (MET). Antes de la agrupación de enlaces promedio jerárquica, los datos se filtraron para cambios de al menos 3 veces en las relaciones de Cy5/Cy3 y mediciones presentes en el 75% de las muestras. Por este procedimiento se seleccionaron 1325 genes. Los datos se amplían en la Figura 1c con 40 muestras adicionales que incluyen todas las de la Figura 1b, y también incluye 28 especímenes de próstata adicionales.

2. Agrupaciones centradas

Los datos se evaluaron a continuación examinando grupos funcionales de genes con nombre conocidos. Las agrupaciones funcionales relacionadas con el cáncer se definieron arbitrariamente incluyendo crecimiento celular/muerte celular, adhesión celular, antiproteasa/proteasa, secuestrantes de radicales libres, inflamación/inmunidad, fosfatasa/cinasa, transcripción y diversos (Figuras 2 y 6).

Se usó uno de los varios procedimientos disponibles de la selección de genes para crear un conjunto más limitado de genes para la futura exploración. En un procedimiento, las estadísticas de la t (basadas en MET/PCA frente a benigno) se calcularon para cada gen. Las muestras de las líneas celulares se excluyeron del análisis. Por tanto, los genes y EST que tenían datos ausentes del 20% de las muestras se excluyeron del análisis. Las estadísticas de la t se clasificaron de dos formas. Primero, se clasificaron por magnitud absoluta, que tiene en cuenta la variabilidad entre muestras en las relaciones de expresión. Segundo, se clasificaron por la magnitud del numerador de la estadística de la prueba, que se basa en la diferencia biológica en relaciones de expresión y se designa “tamaño del efecto” (para MET/PCA frente a benigno). Entonces se representó un diagrama de dispersión de los genes con los 200 mayores tamaños del efecto y las 200 mayores estadísticas de la t (véase la Figura 7). La Figura 7 muestra la selección de genes basándose en estadísticas de la t por ordenador para cada gen. Se usaron dos grupos en el análisis: PCA/MET y benigno (NAP/HPB). La Figura 7a muestra análisis de datos del conjunto de NAP. La Figura 7b muestra análisis de datos del conjunto de CP. Se nombran los genes seleccionados y se muestran 200 genes para cada conjunto de datos. Se muestra la selección de genes basándose en cada procedimiento. Se muestran los nombres o símbolos de genes seleccionados (como se especifica por la Nomenclatura de genes de la Organización del genoma humano (HUGO)).

Los genes que crearon ambas listas también se consideraron por separado con el fin de identificar posibles genes candidatos. La implementación de esta metodología en ambos conjuntos de datos del conjunto de referencia (NAP y CP) dio genes que incluyeron hepsina, pim-1, IM/ENIGMA, TIMP2, hevina, rig y trombospondina-1, entre otros. Varios genes identificados usando los procedimientos de selección de genes se describen en más detalle en el contexto de agrupaciones “funcionales” descritas en la Figura 2.

La Figura 2 muestra la expresión diferencial de agrupaciones funcionales de genes seleccionados en cáncer de próstata. Se muestran los nombres o símbolos de los genes (como se especifica por la nomenclatura de genes de la Organización del genoma humano (HUGO)). Se usó la misma convención para representar cambios en niveles de transcritos que en la Figura 1. El orden de las muestras de la Figura 1 se conservó por claridad.

La Figura 8 muestra una agrupación centrada de genes relacionados con PCA. Se usó la misma convención para representar cambios en niveles de transcritos que en la Figura 1. Esta agrupación de 231 genes se generó seleccionando una variación 3,5 veces en al menos 2 de cualquier clase, y las mediciones de relaciones presentes en el 75% de las muestras. Clases incluidas: PCA frente a NAP, MET frente a NAP, PCA frente a CP y MET frente a CP.

La fiabilidad de los resultados de la agrupación jerárquica se evaluó usando tres procedimientos separados: el de Calinski y Harabasz (1974), Hartigan (1975) y Krzanowski y Lai (1985). El número de agrupaciones “estables” estimadas por todos estos procedimientos es dos. En el conjunto de datos del conjunto de CP, esto provocaría una agrupación benigna válida (NAP y HPB) y una agrupación maligna (PCA y MET).

Muchos de los genes identificados en estas agrupaciones “centradas” participan directamente o indirectamente como biomarcadores de cáncer o mediadores de carcinogénesis. Se ha mostrado que varios son desregulados en PCA. Por ejemplo, el gen supresor tumoral PTEN se reguló por disminución, mientras que el proto-oncogén myc se reguló por aumento en el análisis de micromatrices de PCA (Figura 2) (Abate-Shen y Shen, arriba). Asimismo, se observó la expresión disminuida de E-cadherina y el aumento de la expresión de la ácido graso sintasa, habiéndose mostrado que ambas estaban desreguladas en PCA (Tomita y col., Cancer Res., 60:3650 [2000] y Shurbaji y col., Hum. Pathol., 27:917 [1996]). Además de las marcas de secuencia expresadas sin caracterizar (EST), hay numerosos genes que se identificaron por el cribado, pero no se sabía previamente que se asociaban a PCA. Se contempla que se usan como marcadores de cáncer.

Secuencias de ácidos nucleicos a modo de ejemplo para algunos de los genes identificados en agrupaciones centradas se muestran en las Figuras 9 y 10. La presente invención no se limita a las secuencias de ácidos nucleicos particulares descritas en las Figuras 9 y 10. Un experto en la materia reconoce que variantes, homólogos y mutantes adicionales de las secuencias descritas se usan en la práctica de la presente invención.

3. Comparación entre conjuntos de NAP y CP

También se hizo una comparación directa entre el conjunto de NAP y CP y fueron fácilmente evidentes notables diferencias en la expresión génica. La Figura 5 muestra una comparación entre los conjuntos de NAP y CP. Se usó la misma convención para representar cambios en niveles de transcritos que en la Figura 1. La agrupación se obtuvo seleccionando genes con al menos una variación de 2,5 veces en dos cualesquiera de las muestras de cada clase, concretamente los tejidos normales frente al conjunto de NAP y tejido normal frente al conjunto de CP en un filtro del 50%. De los genes analizados, 59 se seleccionaron con este criterio. Los genes que se encontraron que se regularon por aumento en el conjunto de NAP en comparación con el conjunto de CP incluyeron factor de crecimiento de tejido conjuntivo, EGR-1 (respuesta 1 de crecimiento temprano), matrilisina (MMP7), CFLAR/I-FLICE (regulador de la apoptosis similar a caspasa 8 y FADD), lumican, cinasa regulada por glucocorticoide del suero, factor de crecimiento derivado de epitelio del cristalino, PAI1 (Inhibidor del activador de plasminógeno tipo I), JUN y FOS B, entre otros. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), específica de la detención del crecimiento (GAS 1), colecistoquinina (CCK), proteína de unión a amilorida (ABP1), estuvieron entre los genes regulados por disminución en el conjunto de próstata adyacente normal cuando se comparó con el conjunto comercial. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que las diferencias de la expresión génica entre próstata normal adyacente a PCA (NAP) y tejido de próstata normal de individuos sin patología de próstata (CP) puede ser atribuible al “efecto de campo” inducido por el propio PCA.

Ejemplo 3

Análisis de transferencia Northern

Se resolvieron treinta microgramos de ARN total por gel de agarosa con formaldehído desnaturalizante y se transfirieron sobre membrana Hybond (Amersham) por un sistema de transferencia capilar. Las hibridaciones se realizaron mediante el procedimiento descrito por Church y Gilbert, 1984. La señal se visualizó y se cuantificó por un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad. Para la estimación de las veces relativas se calculó la relación entre las señales obtenidas de sondas de hepsina y GAPDH.

Los genes seleccionados identificados por análisis de micromatrices se corroboraron por análisis Northern. Por ejemplo, se mostró que hevina, proteína del dominio 4-1/2 LIM y gelsolina estaban 3,2, 3,2 y 1,9 veces reguladas por disminución, respectivamente por micromatriz, y 8,8, 4,5 y 3,5 veces regulados por disminución por análisis Northern. Similarmente, la hepsina estuvo 4,3 veces regulada por aumento por micromatriz y 11,3 veces regulada por aumento por análisis Northern (Figura 3a). Como la hepsina es una serina proteasa de la superficie celular con expresión de transcritos precisamente restringida a PCA localizado y metastásico, su expresión se examinó en más detalle al nivel de las proteínas (véase el Ejemplo 4 más adelante).

Ejemplo 4

Análisis de tejido

Este ejemplo describe el análisis de expresión de proteínas en tejidos de próstata normales y cancerosos.

A. Construcción de micromatrices de tejido

Kononen y col. han descrito un procedimiento para evaluar tejidos tumorales en grandes números sobre un único portaobjetos de vidrio (Kononen y col., Nat. Med., 4:844 [1998]). Estas micromatrices de tejido de alta densidad permiten el análisis de hasta 1.000 muestras de tejido sobre un único portaobjetos. Estos portaobjetos pueden evaluarse por microscopía óptica rutinaria sobre portaobjetos preparados y teñidos inmunohistoquímicamente con hematoxilina y eosina (H&E). Por tanto, los biomarcadores de cáncer candidatos identificados por metodologías de expresión génica pueden evaluarse al nivel de las proteínas con respecto a un gran número de especímenes de tumor clínicamente estratificados.

Los tejidos de próstata usados en el análisis de micromatrices incluyen 4 HPB, 8 NAP, 1 conjunto comercial de tejido de próstata normal (de 19 individuos), 1 prostatitis, 11 PCA localizados y 7 especímenes de PCA metastásico. Las micromatrices de tejido (TMA) de alta densidad se ensamblaron usando una perforadora/matriz de tejido manual (Beecher Instruments, Silver Springs, MD) como se ha descrito previamente (Kononen y col., Nat. Med., 4:844 [1998]; Perrone y col., J. Natl. Cancer Inst., 92:937 [2000]). El instrumento consiste en agujas de acero inoxidable de pared delgada con un diámetro interno de aproximadamente 600 μm y estilete usadas para transferir y vaciar los contenidos de agujas. El ensamblaje se mantiene en una guía de posición X-Y que se ajusta manualmente por micrómetros digitales. Pequeñas biopsias son recuperadas de regiones seleccionadas de tejido de donante y se disponen en matrices en un nuevo bloque de parafina. Los núcleos de tejido tuvieron 0,6 mm de diámetro y oscilaron en longitud de 1,0 mm a 3,0 mm dependiendo de la profundidad del tejido en el bloque de donante. Se adquirieron múltiples muestras de núcleo duplicadas de normal, HGPIN y PCA de cada bloque de tejido de cada caso. Los núcleos se insertaron en un bloque de receptor de 45 x 20 x 12 mm y se separaron a una distancia de 0,8 mm. La clasificación de tumores de próstata se realizó usando el sistema descrito por Gleason (Gleason, Cancer Chemother Rep., 50:125 [1966]). Las fases patológicas para las prostatectomías radicales se determinaron usando el sistema de estadificación de TNM (Schroder y col., Prostate Suppl., 4:129 [1992]). Los márgenes quirúrgicos se evaluaron por separado y no están incluidos en la estadificación de tumores.

B. Inmunohistoquímica

Las secciones de TMA se cortaron a intervalos de cinco micrómetros de grosor para inmunohistoquímica. Las secciones iniciales se tiñeron para hematoxilina y eosina para verificar la histología. Los portaobjetos de TMA preparados a partir de tejido incorporado en parafina fijado con formalina se calentaron durante 0,5 - 1 horas a 60º centígrados. Todos los portaobjetos se colocaron en tampón citrato 10 milimolar (pH 6,0) y se calentaron en microondas durante 5 minutos. Se realizó inmunohistoquímica convencional del complejo de biotina-avidina. El anticuerpo de conejo policlonal purificado por afinidad contra hHepsina se usó a una dilución 1:40 (concentración original 0,2 mg/ml) para este estudio. La intensidad de inmunotinción se puntuó por un anatomopatólogo genitourinario especializado como ausente, débil, moderada o fuerte. La puntuación se realizó usando un sistema de telepatología en un modo ciego sin conocimiento de la puntuación de Gleason global (por ejemplo, grado de tumor), tamaño del tumor o desenlace clínico (Perrone y col., arriba). Se examinaron un total de 738 muestras de tejido benigno (n=205), NIP de alto grado (n=38), cáncer de próstata localizado (n=335) y cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal (n=160).

Similarmente, pim-1 se analizó usando dos bloques de TMA de un total de 810 muestras de PCA de 135 pacientes. Se evaluaron seis muestras de PCA de cada caso y se calculó una mediana de la puntuación. Además, se examinó un pequeño número de muestras con tejidos prostáticos benignos (por ejemplo, epitelio benigno y atrofia) y NIP-AG. La inmunohistoquímica se realizó como antes usando un anticuerpo policlonal de conejo contra el extremo N de pim1 (Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:100. Pim-1 demostró tinción citoplásmica y se clasificó como tanto negativa, débil, moderada como fuerte. Todas las muestras se revisaron de forma ciega con respecto a todos los datos de patología y clínicos relacionados.

C. Procedimientos estadísticos

Se empleó una prueba de ANOVA no paramétrica (Mann-Whitney [dos categorías]) para evaluar si las muestras de próstata expresaron hepsina y pim-1 a diferentes niveles basándose en diversos parámetros (tipo de tejido, puntuación de Gleason y tamaño del tumor). Se usó análisis de Kaplan-Meier para estimar el porcentaje acumulado de progresión libre de PSA (“supervivencia”). Se empleó la prueba del orden logarítmico para evaluar las diferencias en la inmunotinción con hepsina para la progresión libre de enfermedad. Se usó regresión de riesgo proporcional de Cox para análisis multifactorial. Para este estudio se usó el software comercial de SPSS (Chicago, IL).

D. Resultados

1. Hepsina - Referencia

Las micromatrices usadas en este estudio se muestran en la Figura 3b. Más de 700 tejidos de próstata benignos y malignos se perfilaron inmunohistoquímicamente sobre micromatrices de tejido (Figura 3c-e) usando un anticuerpo de péptido de hepsina purificado por afinidad (Tsuji y col., J. Biol. Chem., 266:16948 [1991]). La Figura 3 muestra la expresión en exceso de hepsina, una serina proteasa de transmembrana, en cáncer de próstata. La Figura 3a muestra un análisis de transferencia Northern de hepsina humana (arriba) y normalización con GAPDH (abajo). NAP indica tejido de próstata adyacente normal y PCA indica cáncer de próstata. La Figura 3b muestra micromatrices de tejido usadas para el análisis de hepsina. La tinción se hizo con hematoxilina y eosina para verificar la histología.

Las tinciones inmunohistoquímicas demostraron tinción ausente o débil de próstata benigna (c1), tinción fuerte en cáncer de próstata localizado (c2-6) y tinción fuerte en un tumor de próstata de alto grado (se usó un aumento de 100X para todas las imágenes, medida de muestras 0,6 mm de diámetro). Las próstatas benignas demuestran expresión débil en las células luminales secretoras y tinción fuerte de células basales. En áreas en las que se observan cáncer de próstata y próstata benigna se observan diferencias significativas de tinción de hepsina. Los cánceres de próstata infiltrantes (d3-4) demuestran fuerte expresión de la proteína de hepsina. El aumento de todas las imágenes fue 400X. La Figura 3c muestra un histograma de expresión de la proteína de hepsina por tipo de tejido. Hiperplasia prostática benigna (HPB). Neoplasia intraepitelial de alto grado (NIP-AG). Cáncer de próstata localizado (PCA). Cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal (MET). La intensidad relativa de la tinción de hepsina se evaluó cualitativamente y se clasificó. El porcentaje de tinción de hepsina por categoría se muestra en el eje y. La Figura 3d muestra análisis de Kaplan-Meier. La supervivencia libre de PSA se estratificó por nivel de expresión de la proteína de hepsina en dos categorías expresión ausente/baja (círculos) frente a expresión moderada/fuerte (cuadrados).

Los controles internos mostraron que el tejido de hígado, como se describe previamente, se tiñó fuertemente para hepsina. En conjunto, la hepsina presentó predominantemente tinción de membrana y se expresó preferencialmente en próstata neoplásica con respecto a próstata benigna (prueba de Mann-Whitney, p<0,0001). Y, lo que es más importante, la lesión precursora de PCA, NIP-AG, tuvo la expresión de hepsina más fuerte, y casi nunca tuvo tinción ausente (Mann-Whitney, p<0,0001). La mayoría de los casos de tinción baja o ausente de hepsina se observaron en especímenes de próstata benignos. Además, los cánceres metastásicos resistentes al tratamiento hormonal fueron intermedios en intensidad de tinción entre tumores de próstata localizados y próstata benigna.

Los hombres que desarrollaron niveles de PSA elevados tras la prostatectomía radical tienen un alto riesgo de desarrollar metástasis distantes y mueren debido a cáncer de próstata (Pound y col., JAMA, 281:1591 [1999]. Por tanto, para evaluar la utilidad de la hepsina como un posible biomarcador de PCA, la recidiva de PSA se definió como una elevación de PSA superior a 0,2 ng/ml tras la prostatectomía radical. El análisis se realizó en 334 muestras de cáncer de próstata localizado tratando cada una como una muestra independiente. La elevación de PSA tras la prostatectomía radical estuvo significativamente asociada a inmunotinción de hepsina ausente y baja con una tasa de recidiva de PSA del 28% (46/119 muestras), a diferencia de la tasa de recidiva de PSA del 17% (28/141 muestras) para tumores con expresión de hepsina moderada a fuerte (Figura 3d, prueba del orden logarítmico P=0,03). Se realizó análisis multifactorial para examinar si estos resultados fueron independientes de la puntuación de Gleason, un sistema de clasificación histológico bien establecido para PCA (Gleason, Hum. Pathol.,

23:273 [1992]). Basándose en los resultados del ajuste de un modelo de riesgo proporcional de Cox, hay una asociación de la expresión de la proteína de hepsina débil o ausente en PCA con aumento del riesgo de elevación de PSA tras la prostatectomía, similar a alta puntuación de Gleason (las relaciones de riesgo correspondientes fueron 2,9 (p=0,0004) y 1,65 (p=0,037), respectivamente). La expresión de hepsina débil o ausente también se asoció a cánceres de próstata grandes; la mediana de la dimensión del tumor para tumores de próstata con expresión moderada a fuerte fue 1,3 cm, pero 1,5 cm para tumores con tinción ausente o débil (prueba del orden de Mann-Whitney, p=0,043). En conjunto, la expresión de la proteína de hepsina en PCA guarda una relación inversamente a las medidas del pronóstico del paciente.

La hepsina es una proteína transmembrana de 51 kDa con la mayor expresión en el hígado y, como el PSA, es una serina proteasa (Kurachi y col., Methods Enzymol., 244:100 [1994]). El dominio de proteasa de hepsina tiene acceso al espacio extracelular y posiblemente puede activar otras proteasas o degradar componentes de la matriz extracelular. La función de hepsina se entiende poco. Se ha propuesto que tiene una función en controlar el crecimiento celular (Torres-Rosado y col., PNAS, 90:7181 [1993], la morfología celular y activar la ruta de coagulación extrínseca sobre la superficie celular, conduciendo a la formación de trombina (Kazama y col., J. Biol. Chem., 270:66 [1995]). Adicionalmente, se ha mostrado que los niveles de ARNm de hepsina son elevados en carcinomas de ovario (Tanimoto y col., Cancer Res., 57:2884 [1997]). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que la alta expresión de hepsina en NIP-AG, y no próstata benigna, sugiere que la hepsina desempeña una función en el establecimiento de NIP o en la transición de NIP-AG a carcinoma. Disminuciones posteriores en la expresión de hepsina observadas en cánceres localizados grandes y cánceres resistentes a tratamiento hormonal sugieren una disminución del requisito de esta proteasa en fases tardías de PCA. Alternativamente, los pacientes con PCA avanzado desarrollan frecuentemente coagulación intravascular diseminada (DIC) (Riddell y col., J. Nucl. Med., 37:401 [1996]), por lo que la hepsina puede desempeñar una función importante.

2. Pim-1 - Referencia

El crecimiento tumorigénico de la próstata depende de la evasión de mecanismos de control homeostáticos normales en los que la proliferación celular supera la muerte celular (Bruckheimer y Kyprianou, Cell Tissue Res.,

301: 153 [2000]). Aunque es muy conocido que el oncogén myc se expresa en exceso en muchos PCA (Buttyan y col., Prostate 11:327-37 [1987]; Abate-Shen y Shen, arriba), la presente invención demuestra que el proto-oncogén pim-1 cinasa está similarmente regulado por aumento (agrupación de crecimiento celular/muerte celular, Figura 2). Estudios previos sugieren que la interacción cooperativa entre pim-1 y myc puede inducir transformación de células linfoides, promoviendo la progresión del ciclo celular y bloqueando la apoptosis (Shirogane y col., Immunity 11:709 [1999]). El presente análisis soporta una regulación co-transcripcional similar (o amplificación génica) de pim-1 y myc que posiblemente media en un efecto oncogénico sinérgico en PCA.

La expresión de proteínas cinasas pim-1 en PCA también se exploró usando TMA de alta densidad. La Figura 4 muestra la expresión en exceso de pim-1 en cáncer de próstata. Las tinciones inmunohistoquímicas demostraron tinción ausente o débil de próstata benigna, y tinción citoplásmica fuerte en cáncer de próstata localizado. La próstata benigna demostró expresión ausente o débil en las células luminales secretoras. Los cánceres de próstata infiltrantes demostraron fuerte expresión de la proteína de pim-1. El aumento para todas las imágenes 1000X. La Figura 4a muestra un histograma de la expresión de la proteína de pim-1 por tipo de tejido como se evalúa a partir de 810 elementos de micromatrices de tejido. Neoplasia intraepitelial de alto grado (NIP-AG). Cáncer de próstata localizado (PCA). La intensidad relativa de la tinción de pim-1 se representa en la leyenda incluida. Porcentaje de tinción de pim-1 por categoría mostrado en el eje y. La Figura 4b muestra el análisis de Kaplan-Meier que demuestra que los pacientes con PCA que tienen expresión de pim-1 de negativa a débil (línea inferior) tienen un mayor riesgo de desarrollar recidiva de PSA tras la prostatectomía (orden logarítmico p=0,04). La supervivencia libre de PSA se estratificó por nivel de expresión de la proteína de pim-1 en dos categorías expresión ausente/débil (línea inferior) frente a expresión moderada/fuerte (línea superior).

Se encontró que la proteína pim-1 estaba marcadamente expresada en exceso en PCA (Figura 4). La expresión de la proteína de pim-1 de negativa a débil se observó en la mayoría de muestras epiteliales prostáticas benignas (97%), de atrofia prostática (73%) y de NIP de alto grado (82%) (Figura 4a). A diferencia, la expresión de pim-1 de moderada a fuerte se observó en aproximadamente la mitad de las muestras de PCA (51%) (Figura 4a). El análisis de Kaplan-Meier para supervivencia libre de PSA demostró extensión extraprostática positiva, invasión de la vesícula seminal, puntuación de Gleason superior a 7 y disminución de la expresión de pim-1 que estaba asociada a una mayor tasa acumulada de recidiva de PSA (Figura 4b). Por modelos de Cox unifactoriales se encontró que la expresión de pim-1 es un fuerte valor pronóstico de la reaparición de PSA (razón de riesgo (HR)= 2,1 (IC del 95% 1,2-3,8, p=0,01)).

Entre las variables examinadas, valores pronósticos significativos de reaparición de PSA fueron puntuación de Gleason (HR=1,8 (IC del 95% 1,1-3,0), p=0,03), patrón de Gleason 4/5 PCA (HR=3,9 (IC del 95% 1,8-8,3), p<0,001), estado de la extensión extraprostática (HR=2,6 (IC del 95% 1,6-4,2), p<0,0001), estado del margen quirúrgico (HR=2,6 (IC del 95% 1,2-5,6), p=0,01), estado de la vesícula seminal (HR=3,5 (IC del 95% 2,0-6,2), p<0,0001), el logaritmo natural del nivel de PSA preoperatorio (HR=2,5 (IC del 95% 1,6-3,8), p<0,001), HR=2,4, p<0,001) y la dimensión máxima del tumor (HR=2,7 (IC del 95% 1,6-4,7), p<0,0001). La presencia de patrón de Gleason 4/5 PCA (HR=3,8 (IC del 95% 1,4-10,0), p<0,01), Ln(PSA) (HR=2,1 (IC del 95% 1,1-3,9), p=0,02) y la disminución de expresión de la proteína de pim-1 (HR=4,5 (IC del 95% 1,6-15,2), p=0,01) se encontraron que eran ambos valores pronósticos significativos de la reaparición de PSA por un modelo de Cox multifactorial. Por tanto, incluso más que la hepsina, la disminución de la expresión de pim-1 cinasa en PCA guardó una relación significativa con las medidas de un mal desenlace del paciente.

La pim-1 cinasa es un proto-oncogén que está regulado por receptores de citocinas (Matikainen y col., Blood 93:1980 [1999]). Se describió por primera vez como un sitio común de integración provírica en linfomas de linfocitos T inducidos por retrovirus murino (Cuypers y col., Cell 37:141 [1984]), y previamente se creyó que participaba exclusivamente en tumores malignos hematopoyéticos (Breuer y col., Nature 340:61 [1989]). La regulación cotranscripcional de pim-1 y myc se observó en los experimentos descritos en este documento (Figura 2, agrupación de crecimiento celular/muerte celular). Las expresión en exceso crónica de myc en la próstata ventral de ratones transgénicos indujo anomalías epiteliales similares a NIP de bajo grado, pero nunca se observó la progresión a adenocarcinoma en este modelo (Zhang y col., Prostate 43:278 [2000]). La presente invención no se limita a un mecanismo cualquiera. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que la expresión en exceso de pim-1 puede potenciar carcinogénesis de próstata inducida por myc.

La Figura 8 proporciona una visión general esquemática de genes representativos diferencialmente expresados en PCA identificados por análisis de micromatrices de ADN. Los genes se agrupan funcionalmente y las flechas representan regulación por aumento o por disminución en PCA resistente al tratamiento hormonal metastásico (MET) y/o PCA localizado (PCA) con respecto a epitelio de próstata normal. Véase la Figura 2 para los niveles de expresión génica.

Ejemplo 5

Análisis de la expresión de AMACR - Referencia

El ejemplo describe el análisis de los datos de expresión génica descritos en los Ejemplos 1-4 anteriores para identificar que AMACR se expresa coherentemente en exceso en cáncer de próstata.

A. Muestras de tejido

Con el fin de examinar el intervalo más amplio de especímenes de cáncer de próstata se tomaron muestras clínicas de las series de prostatectomía radical en la Universidad de Michigan y del programa Rapid Autopsy. Ambos programas son parte del Programa especializado en cáncer de próstata de la Universidad de Michigan de excelencia en la investigación (S.P.O.R.E.) Tissue Core.

Los casos de prostatectomía para la matriz de resultados de la micromatriz de tejido (TMA) se seleccionaron de una cohorte de 632 pacientes que se sometieron a prostatectomía retropúbica radical en la Universidad de Michigan como monoterapia (es decir, sin terapia hormonal o radioterapia) para cáncer de próstata clínicamente localizado entre los años 1994 y 1998. Los datos clínicos y de patología para todos los pacientes se adquirieron con la aprobación del Comité de ética médica en la Universidad de Michigan. Los datos clínicos, de patología y de TMA detallados se mantienen en una base de datos relacional segura (Manley y col., Am. J. Pathol., 159:837 [2001]).

El procesamiento de los especímenes de próstata empezó en el plazo de aproximadamente 15-20 minutos después de la resección quirúrgica. Las próstatas se muestrearon parcialmente y se usó aproximadamente el 50% del tejido para la investigación. Este protocolo se ha evaluado en un estudio formal para asegurar que el muestreo parcial no afecta la estadificación y evaluación precisa de los márgenes quirúrgicos (Hollenbeck y col., J. Urol., 164:1583 [2000]). Brevemente, secciones alternas de la próstata se sometieron a revisión histológica. El resto de las secciones se congelaron y se guardaron en el SPORE Tissue Core. Estas muestras sólo se recogieron de pacientes que habían firmado un consentimiento informado aprobado por el IRB. Las muestras se congelaron criogénicamente en medios incorporados en OCT a -80ºC y se guardaron en un área de mantenimiento hasta que se finalizó el informe de patología. Estas muestras congeladas no estuvieron disponibles para los investigadores hasta que se realizó un diagnóstico y estadificación adecuado. Todas las muestras usadas para el análisis de matrices de expresión de ADNc y RT-PCR fueron evaluadas por los anatomopatólogos del estudio. Todas las muestras se recortaron aproximadamente de forma que más del 95% de la muestra representara la lesión deseada (por ejemplo, cáncer de próstata, HPB o próstata benigna). A las muestras con cáncer de próstata también se les asignó una puntuación de Gleason basándose en la muestra usada para el análisis molecular.

Con el fin de estudiar el cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal se usó un protocolo de Rapid Autopsy que representa una fuente valiosa de tumores de próstata metastásicos. Modelado después de los protocolos desarrollados en la Universidad de Washington (Seattle, WA) y la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD), este programa permite que hombres con cáncer de próstata avanzado consientan una autopsia inmediatamente después de su muerte. Hasta la fecha se han realizado 23 autopsias completas con una mediana de tiempo de 2 horas desde la muerte hasta la autopsia. Este procedimiento se ha descrito previamente en detalle (Rubin y col., Clin. Cancer Res., 6:1038 [2000]). En resumen, a pacientes diagnosticados con cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal se les pidió que tomaran parte en un programa de donantes de tejido póstumo. Los objetivos y procedimientos para la donación de tejidos se explicaron al paciente. Habiendo decidido participar en este programa de donantes de tumores aprobado por el IRB, el permiso para la autopsia se obtiene antes de la muerte, con el consentimiento proporcionado por el paciente, o por el familiar inmediato. Las muestras de cáncer de próstata primario resistente al tratamiento hormonal y metastásico se recogieron usando nitrógeno líquido. Las muestras duplicadas de la misma lesión se dispusieron en 10% de formalina tamponada. Las muestras fijadas se incorporaron en parafina y se usaron para el desarrollo de TMA. Al igual que con las muestras de prostatectomía, el anatomopatólogo del estudio revisó los portaobjetos de vidrio, rodeó con círculos áreas de cáncer de próstata viable, a la vez que evitó áreas de necrosis, y usó estos portaobjetos como molde para la construcción de TMA.

B. Patología y evaluación

Las próstatas se tiñeron antes de la evaluación de márgenes quirúrgicos. Los márgenes quirúrgicos del vértice y la base se cortaron perpendicularmente al eje uretral prostático. Las vesículas seminales se cortaron perpendicularmente a su entrada en la próstata y se presentaron como el margen de la vesícula seminal. Las próstatas para este estudio se incorporaron todas parcialmente, tomando secciones completas alternas del vértice, el medio y la base. Los informes detallados de la patología de la prostatectomía incluyeron la presencia o ausencia de implicación de margen quirúrgico por tumor (estado del margen quirúrgico), la presencia de extensión extraprostática e invasión de la vesícula seminal. Los tumores se representaron usando el sistema de TNM, que incluye extensión extraprostática e invasión de la vesícula seminal, pero que no tiene en cuenta el estado del margen quirúrgico (Bostwick y col., Simin. Urol. Oncol., 17:222 [1999]). Los tumores se clasificaron usando el sistema de clasificación de Gleason (Gleason, Cancer Chemother. Rep., 50:125 [1966]; Gleason, The Veterans Administration Cooperative Urological Research Group. Histologic Grading and Clinical Staging of Prostate Carcinoma. En: Tannenbaum M, editor. Urologic Pathology: The Prostate. Filadelfia: Lea & Febiger; 1977. pág. 17198).

Como preparación para la construcción de TMA, todos los portaobjetos de vidrio se volvieron a examinar para identificar áreas de próstata benigna, atrofia prostática, neoplasia intraepitelial prostática de alto grado y cáncer de próstata. Para optimizar la transferencia de estos tejidos diseñados a las matrices, el área de implicación del tumor se rodeó con un círculo sobre el molde del portaobjetos de vidrio tan estrechamente alrededor de cada lesión como fue posible. Se evitaron áreas con tumor infiltrante adyacente a las glándulas benignas.

C. RT-PCR

La integridad del ARN total se juzgó por electroforesis en gel de agarosa con formaldehído desnaturalizante. Se preparó ADNc usando 1 μg de ARN total aislado de especímenes de tejido de próstata. Los cebadores usados para amplificar productos génicos específicos fueron: AMACR sentido, 5' CGTATGCCCCGCTGAATCTCGTG-3' (SEC ID Nº: 100); AMACR antisentido, 5'-TGGCCAATCATCCGTGCTCATCTG-3' (SEC ID Nº: 101); GAPDH sentido, 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3' (SEC ID Nº: 102); y GAPDH antisentido, 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC -3' (SEC ID Nº: 103). Las condiciones de PCR para AMACR y GAPDH comprendieron 94ºC durante 5 min, 28 ciclos de 95ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min (hibridación) y 72ºC durante 1 min, y una etapa de extensión final de 72ºC durante 7 min. Las reacciones de PCR usaron un volumen de 50 μl, con 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL). Los productos de amplificación (5 μl) se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por luz ultravioleta.

D. Análisis de inmunotransferencia

Se usaron especímenes de tejido de próstata representativos para el análisis de transferencia Western. Los tejidos se homogeneizaron en tampón de lisis NP-40 que contenía 50 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,4, 1% de Nonidet P-40 (Sigma, St. Louis. MO) y mezcla inhibidora de proteinasa completa (Roche, IN, EE.UU.). Quince μg de extractos de proteína se mezclaron con tampón de muestra SDS y se sometieron a electroforesis sobre un gel de 10% de SDSpoliacrilamida bajo condiciones reductoras. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La membrana se incubó durante 1 hora en tampón de bloqueo (solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween (TBS-T) y 5% de leche desnatada en polvo). El anticuerpopara AMACR (obtenido del Dr. R Wanders, Universidad de �?msterdam) se aplicó a 1:10.000 diluido en tampón de bloqueo durante la noche a 4ºC. Después de lavar tres veces con tampón TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpo dirigido contra IgG de conejo ligada a peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron con el sistema de detección ECL (Amersham Pharmacia biotech, Piscataway, NJ) y autorradiografía.

Para las transferencias Western de �-tubulina, la membrana sondada con el anticuerpo para AMACR se eliminó con el tampón Western Re-Probe (Geno-tech, St. Louis, MO) y se bloqueó en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween (TBS-T) con 5% de leche desnatada en polvo y se incubó con anticuerpos de conejo anti-�-tubulina (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) a 1:500 durante dos horas. Entonces, las transferencias Western se procesaron como se ha descrito anteriormente.

E. Inmunohistoquímica

Se realizó inmunohistoquímica (IHC) indirecta convencional para evaluar la expresión de proteínas de AMACR usando un anticuerpo anti-AMACR policlonal. La expresión de proteínas se puntuó como negativa (puntuación=1), débil (puntuación 2), moderada (3) y fuerte (4). Con el fin de evaluar si la expresión de proteínas de AMACR se asoció o no a proliferación de cáncer de próstata, se evaluó un subconjunto de muestras usando el anticuerpo IgG Mib-1 de ratón monoclonal para Ki-67 (dilución 1:150, Coulter-Immunotech, Miami, Fl). El pretratamiento con microondas (30 minutos a 100ºC en tampón Tris-EDTA) para la recuperación de antígeno se realizó usando tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina como cromógeno. Como control se usó tejido de ganglio linfático con positividad para Ki-67 alta conocida.

F. Construcción de micromatrices de tejido, captura de imágenes digitales y análisis

Para este estudio se usaron cinco TMA. Tres contuvieron tejido de la serie de prostatectomía y dos contuvieron cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal del programa Rapid Autopsy. Las TMA se ensamblaron usando el robot para la fabricación de micromatrices de tejido manual (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) como se ha descrito previamente (Kononen y col., Nat. Med., 4:844 [1998]; Perrone y col., J. Natl. Cancer Inst.,

92:937 [2000]). Los núcleos de tejido de las áreas rodeadas con un círculo (como se ha descrito anteriormente) se eligieron como diana para la transferencia a los bloques de matriz de receptor. De cada uno de los tipos de tejido seleccionados se muestrearon cinco núcleos de tejido. Los núcleos de TMA de 0,6 mm de diámetro se separaron cada uno 0,8 mm de centro de núcleo a centro de núcleo. Después de la construcción se cortaron secciones de 4 μm y se realizó tinción con H&E sobre los portaobjetos iniciales para verificar la histología.

Las imágenes de H&E de TMA se adquirieron usando el sistema de obtención de imágenes BLISS (Bacus Labs, Lombard, IL). La expresión de proteínas de AMACR se evaluó en un modo ciego. Todas las imágenes se puntuaron para la intensidad de la expresión de proteínas de AMACR. Además, a todas las muestras de TMA se les asignó un diagnóstico (es decir, benigna, atrofia, neoplasia intraepitelial prostática de alto grado y cáncer de próstata). Se recomienda esto debido a que los tejidos elegidos como diana pueden no ser lo que fueron cuando realmente se transfirieron. Por tanto, la verificación se realizó en cada etapa. Los portaobjetos de TMA se evaluaron para el índice de proliferación usando un sistema de análisis de células CAS200 (Bacus Labs). Las áreas seleccionadas se evaluaron bajo el objetivo de 40X. Las mediciones se registraron como el porcentaje de área nuclear total que se tiñó positivamente. Se midió toda la tinción nuclear positiva, independientemente de la intensidad. Se seleccionaron sitios para el análisis para minimizar la presencia de células del estroma y basales; sólo se evaluó epitelio del tumor. Los especímenes se evaluaron para la expresión de Ki-67 como se ha descrito previamente (Perrone y col., J. Natl. Cancer Inst. 92:937 [2000]). Cada medición se basó en aproximadamente 50-100 núcleos epiteliales. Debido al tamaño fijo de las muestras de TMA, el máximo alcanzable fue 5 mediciones no solapantes de repetición.

G. Análisis de biopsias por punción de próstata

Con el fin de evaluar la utilidad de la expresión de AMACR en biopsias por punción de calibre 18 de diagnóstico, 100 biopsias consecutivas con cáncer de próstata o atipia que requirieron procesamiento adicional se probaron para la expresión de AMACR. Todos los casos se inmunotiñeron usando dos marcadores específicos de células basales (34�E12 y p63) y AMACR. Los casos se evaluaron para sensibilidad a y especificidad por cáncer. Veintiséis de estos casos se observaron en interconsulta con un anatomopatólogo y se consideraron diagnósticamente difíciles, requiriendo revisión por el experto y caracterización adicional.

H. Resultados

La Figura 11 muestra un esquema del paradigma de micromatrices de ADN y de tejido que conduce al descubrimiento y la caracterización de AMACR en cáncer de próstata. A) Progresión del cáncer de próstata como se adapta de Abate-Shen y Shen (Genes Dev., 14:2410 [2000]). En cada fase de progresión del cáncer de próstata se producen distintos cambios moleculares que pueden ser estudiados usando micromatrices de ADN o tecnología de “chips”. B) El ADNc generado de muestras de tumor (cáncer de próstata) y de referencia (tejido de próstata benigno) está marcado con colorantes fluorescentes distinguibles y se interroga con una micromatriz de ADN que puede monitorizar miles de genes en un experimento. C) Después de la hibridación, la micromatriz de ADN se analiza usando un escáner y las relaciones de fluorescencia determinadas para cada gen (en este caso cáncer de próstata/ tejido benigno). D) Las relaciones se depositan en una base de datos informática y posteriormente se analizan usando diversos algoritmos estadísticos. Un procedimiento a modo de ejemplo de inspeccionar los datos (Eisen y col., PNAS 95:14863 [1998]) asigna intensidad de color a las relaciones de expresión génica. En este caso, los tonos de rojo representan genes que están regulados por aumento en cáncer de próstata (por ejemplo, una relación de 4,0) y los tonos de verde representan genes que están regulados por disminución (por ejemplo, relación de 0,1). Los genes que son invariables entre tejidos de tumor y benignos se representan por un color negro y los elementos ausentes por un color gris. E) Los genes que se identifican por micromatriz de ADN pueden entonces validarse al nivel de los transcritos (por ejemplo, transferencia Northern, RT-PCR) o al nivel de las proteínas (por ejemplo, inmunotransferencia). F) La construcción de micromatrices de tejido de cáncer de próstata facilita el estudio de cientos de pacientes (en vez de cientos de genes). G) Cada portaobjetos de micromatrices de tejido contiene cientos de especímenes de cáncer de próstata clínicamente estratificados ligados a bases de datos clínicas y de patología (no mostradas). H) Entonces, los portaobjetos de micromatrices de tejido pueden analizarse usando diversos procedimientos moleculares o bioquímicos (en este caso inmunohistoquímica). I) Tanto los datos de micromatrices de ADN como de tejido tienen aplicaciones clínicas. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a: 1. Uso de perfiles de expresión génica para predecir el pronóstico de pacientes, 2. identificación de marcadores clínicos y 3. desarrollo de dianas terapéuticas novedosas.

La Figura 12 resume los niveles de transcritos de AMACR como se ha determinado por análisis de micromatrices de ADN en más 57 especímenes de cáncer de próstata. Las muestras (Dhanasekaran y col., Nature 412: 822 [2001]) se agruparon según tipo de tejido y se promediaron. La muestra experimental se marcó en el canal de Cy5 mientras que la muestra de referencia (conjunto de tejido de próstata benigno) se marcó en el canal de Cy3. La representación de cajas demuestra el intervalo de la expresión de AMACR dentro de cada grupo. Los tejidos se agruparon en las siguientes clases benigno (tejido de próstata adyacente normal), hiperplasia prostática benigna (HPB), cáncer de próstata clínicamente localizado y cáncer de próstata metastásico. En relación con tejidos de próstata benignos, el cáncer de próstata localizado y el cáncer de próstata metastásico estuvieron 3,1 (prueba de Mann-Whitney, p<0,0001) y 1,67 (prueba de Mann-Whitney, p<0,004) veces regulados por aumento, respectivamente (representado como relaciones de Cy5/Cy3).

Los resultados de las micromatrices de ADN de niveles de ARNm de AMACR se validaron usando una metodología experimental independiente. Se generaron cebadores específicos de AMACR y se realizaron las RT-PCR en las diversas muestras de ARN de 28 especímenes de tejido de próstata y 6 líneas de células de la próstata (Figura 13A). El GAPDH sirvió de control de carga. Conjunto se refiere a ARN de tejidos de próstata normales obtenidos de una fuente comercial. NAP, tejido de próstata adyacente normal de un paciente que tiene cáncer de próstata. 3+3, 3+4, 4+4, se refiere a los patrones de Gleason principales y secundarios del cáncer de próstata clínicamente localizado (PCA) examinado. MET, cáncer de próstata metastásico. También se examinan diversas líneas de células de la próstata. La RT-PCR sin enzima sirvió de control negativo. Se observó claramente un producto de RT-PCR en 20 muestras de cáncer de próstata localizado, pero no en las muestras benignas examinadas. El cáncer de próstata metastásico y las líneas de células de la próstata mostraron niveles variables de transcrito de AMACR con respecto a cáncer de próstata localizado.

Con el fin de calcular niveles de proteínas de AMACR, el análisis de inmunotransferencia se realizó en extractos de tejido de próstata (Figura 13B), la �-tubulina sirvió de control para la carga de muestra. Similar al transcrito de 5 AMACR, la expresión en exceso de la proteína de AMACR se observó en tejido de próstata maligno con respecto a tejido de próstata benigno.

Con el fin de validar la expresión de proteínas de AMACR in situ se usó una cohorte separada de muestras de próstata de las usadas en el análisis de matrices de expresión de ADNc. Estas muestras de próstata se tomaron del SPORE de próstata de la Universidad de Michigan Tissue Core y se ensamblaron sobre micromatrices de tejido de alta densidad (ilustradas esquemáticamente en la Figura 11F-H). La expresión de proteínas de AMACR de moderada a fuerte se observó en muestras de cáncer de próstata clínicamente localizado con localización predominantemente citoplásmica. Se observó un gran contraste en los niveles de AMACR en epitelios malignos con respecto a epitelios benignos adyacentes. La neoplasia intraepitelial prostática (NIP) y algunas lesiones atróficas, que se cree que son posiblemente lesiones pre-cancerosas (Putzi y col., Urology 56:828 [2000]; Shah y col., Am. J.

15 Pathol., 158:1767 [2001]), demostraron tinción citoplásmica de AMACR. El cáncer de próstata de alto grado también demostró fuerte tinción citoplásmica. Sin embargo, no se identificó asociación con la intensidad de tinción de AMACR y la puntuación de Gleason (tumor). Muchas de las muestras de cáncer de próstata metastásico sólo demostraron una débil expresión de AMACR. Las muestras metastásicas mostraron inmunotinción de PSA uniforme, confirmando la inmunogenicidad de estas muestras de autopsia.

Con el fin de evaluar la expresión de proteínas de AMACR con respecto a cientos de especímenes de próstata, se cuantificaron los datos de micromatrices de tejido. La próstata benigna, próstata atrófica, NIP, cáncer de próstata localizado y cáncer de próstata metastásico demostraron intensidad de tinción de proteínas de AMACR media de 1,0 (EE 0), 2,0 (EE 0,1), 2,5 (EE 0,1), 3,0 (EE 0) y 2,5 (EE 0,1), respectivamente (ANOVA, valor de p <0,0001). Estos datos se resumen gráficamente usando las barras de error que representan el intervalo de confianza del 95% para

25 cada categoría de tejido (Figura 14).

La correlación de niveles de AMACR con proliferación del tumor se investigó a continuación usando Ki-67 (Perrone y col., arriba). No hubo asociación significativa entre la expresión de AMACR y la expresión de Ki-67 con un coeficiente de correlación de 0,13 (valor de p=0,22). Además, no se identificaron asociaciones significativas entre la expresión de proteínas de AMACR y parámetros de patología tales como prostatectomía radical, puntuación de Gleason, fase del tumor, tamaño del tumor (cm) o estado del margen quirúrgico. Los niveles de proteínas de AMACR se evaluaron a continuación para la asociación con reaparición de PSA tras cirugía en 120 casos de prostatectomía con una mediana del tiempo de seguimiento de 3 años. No se identificó asociación estadísticamente significativa. AMACR demostró expresión uniforme de moderada a fuerte en cáncer de próstata clínicamente localizado con una alta sensibilidad para tumor y una especificidad igualmente alta. Además, un estudio preliminar

35 de tejidos normales que incluye ovario, hígado, ganglios linfáticos, bazo, testículos, estómago, tiroides, colon, páncreas, cerebro y músculo estriado reveló una significativa expresión de proteínas de AMACR en solo hígado normal.

La gran diferencia en los niveles de proteínas de AMACR entre células epiteliales secretoras normales y células malignas proporciona un uso clínico para probar la expresión de AMACR en biopsia por punción de especímenes de próstata. En casos diagnósticamente problemáticos, los anatomopatólogos frecuentemente emplean los marcadores de células basales 34�E12 (O'Malley y col., Virchows Arch A Pato. Anat. Histopathol., 417:191 [1990]; Wojno y col., Am. J. Surg. Pathol., 19:251 [1995]; Googe y col., Am. J. Clin. Pathol., 107:219 [1997] o p63 (Parson y col., Urology

58:619 [2001]; Signoretti y col., Am. J. Pathol., 157:1769 [2000]), que tiñen la capa de células basales de glándulas benignas. Esta segunda capa de células basales está ausente en glándulas malignas. En muchos especímenes de

45 biopsia sospechosos, el anatomopatólogo quirúrgico debe basarse en la ausencia de tinción para hacer el diagnóstico de cáncer de próstata final. Se evaluó la utilidad clínica de la inmunotinción de AMACR en 94 biopsias por punción de próstata. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La sensibilidad y especificidad se calcularon como el 97% y el 100%, respectivamente. Estos resultados incluyeron 26 casos en los que el diagnóstico final requirió el uso de un marcador inmunohistoquímico específico de células basales (es decir, 34 �E12 o p63).

Este ejemplo demostró que AMACR está asociado a PCA y que la expresión de AMACR en biopsias de próstata es útil para el diagnóstico de cáncer en muestras de biopsia inconcluyentes.

Tabla 2 Utilidad clínica de la evaluación de proteína AMACR en biopsias por punción de próstata (n=94)

Sensibilidad (TP/(TP+FN)): Especificidad (TN/(TN+FP)) Valor predictivo positivo (TP/(TP+FP)) Valor predictivo negativo (TN/(TN+FN))

97% ((68/(2+68)): 100% ((24/(24+0)) 100% ((68/(68+0)) 92% ((24/24+2))

Ejemplo 6

Regulación hormonal de AMACR - Referencia

Este ejemplo describe estudios que indican que la expresión de AMACR es independiente de hormonas.

A. Recogida de muestras, matriz de ADN y construcción y evaluación de TMA

Se tomaron muestras clínicas de la serie de prostatectomía radical y del programa Rapid Autopsy en la Universidad de Michigan. Ambos son parte del Programa especializado en cáncer de próstata de la Universidad de Michigan de excelencia en la investigación (S.P.O.R.E.). El PCA primario de casos metastásicos, además de metástasis de ganglio linfático, se aportaron en colaboración de la Universidad de Ulm, Alemania. Se adquirieron datos de análisis clínicos y de expresión detallados, además de TMA, y se mantuvieron en una base de datos relacional segura según el protocolo del Comité de ética médica de ambas instituciones. La obtención de tejido para el análisis de la expresión al nivel del ARN se describe en los ejemplos anteriores. Para el desarrollo de TMA, las muestras se incorporaron en parafina. El anatomopatólogo del estudio revisó los portaobjetos de todos los casos y redondeó con círculos áreas de interés. Estos portaobjetos se usaron como molde para la construcción de las seis TMA usadas en este estudio. Todas las TMA se ensamblaron usando un robot para la fabricación de micromatrices de tejido manual (Beecher Instruments, Silver Spring, MD). Al menos tres núcleos de tejido se muestrearon de cada bloque de donante. El diagnóstico histológico de los núcleos de tejido se verificó por tinción con hematoxilina y eosina (H&E) convencional del portaobjetos de TMA inicial. Se realizó inmunohistoquímica (IHC) convencional del complejo debiotina-avidina usando un anticuerpo anti-AMACR convencional (Ronald Wanders, Universidad de �?msterdam). Las imágenes digitales se adquirieron usando el sistema de obtención de imágenes BLISS (Bacus Lab, Lombard, IL). La intensidad de la tinción se puntuó como negativa (puntuación=1), débil (puntuación 2), moderada (3) y fuerte (4). Para la exploración del efecto del tratamiento por medio de supresión hormonal antes de la prostatectomía radical se usaron portaobjetos convencionales para regular la tinción con H&E y secciones consecutivas para la detección de la expresión de AMACR. Con el fin de probar la expresión de AMACR en cánceres de colon poco diferenciados se usaron casos de una cohorte de tumores de colon bien descritos. Además de cánceres de colon bien diferenciados se usó un subconjunto recientemente descrito de carcinomas de colon poco diferenciados con un aspecto histopatológico distintivo llamado carcinomas mínimamente diferenciados de células grandes. Estos carcinomas de colon poco diferenciados tuvieron una alta frecuencia del fenotipo de inestabilidad de microsatélites.

B. Cultivo celular y análisis de inmunotransferencia

Se obtuvieron líneas de células de la próstata (RWPE-1, LNCaP, PC3 y DU145) de la Colección americana de cultivos tipo. Las células se mantuvieron en RPMI-1640 con 8% de suero bovino fetal descomplementado, 0,1% de glutamina y 0,1% de penicilina y estreptomicina (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células se cultivaron al 75% de confluencia y luego se trataron durante 24 y 48 con el antiandrógeno bicalutamida (CASODEX, Zeneca Pharmaceuticals, Plankstadt, Alemania) a una concentración final de 20 μM o con metiltrienolona (andrógeno sintético (R1881); NEN, Life Science Products, Boston, MA) a una concentración final de 1 nM. Las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis NP-40 que contenía 50 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,4, 1% de Nonidet P-40 (Sigma, St. Louis, MO) y mezcla inhibidora de proteinasa completa (Roche, IN, USA). 15 μg de extractos de proteína se mezclaron con tampón de muestra SDS y se sometieron a electroforesis sobre un gel de 10% de SDSpoliacrilamida bajo condiciones reductoras. Después de la transferencia, las membranas (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) se incubaron durante 1 hora en tampón de bloqueo (solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween y 5% de leche desnatada en polvo). El anticuerpo para AMACR se aplicó a 1:10.000 diluido en tampón de bloqueo durante la noche a 4ºC. Después de tres lavados con tampón TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpo de burro dirigido contra IgG de conejo ligada a peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron con el sistema de detección ECL (Amersham Pharmacia biotech, Piscataway, NJ). Para transferencias de �-tubulina, las membranas se eliminaron con tampón Western Re-Probe (Geno-tech, St. Louis, MO) y se bloquearon en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween con 5% de leche desnatada en polvo y se incubaron con anticuerpos de conejo anti-�-tubulina (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) a 1:500 durante dos horas. Para la expresión de PSA, las membranas se volvieron a sondar del modo descrito con anticuerpo para PSA (policlonal de conejo; DAKO Corporation, Carpinteria, CA) a dilución 1:1000 y se procesaron adicionalmente.

C. Análisis estadístico

El análisis primario de los datos de expresión de ADNc se hizo con el software Genepix. El análisis de agrupaciones con el programa Cluster y la generación de figuras con TreeView se realizaron como se ha descrito anteriormente. La expresión de proteínas de AMACR se evaluó estadísticamente usando el resultado de puntuación medio para cada tipo de tejido de próstata (es decir, próstata benigna, cáncer de próstata localizado sin tratamiento previo o avanzado, cáncer de próstata tratado con hormona y resistente al tratamiento hormonal). Para probar diferencias significativas en la expresión de proteínas de AMACR entre todos los tipos de tejido se realizó una prueba de ANOVA unilateral. Para determinar diferencias entre todos los pares se aplicó un análisis a posteriori usando el método de Scheffé como se ha descrito anteriormente. Para la comparación de primarios sin tratamiento previo con sus metástasis de ganglio linfático correspondientes con respecto a la expresión de proteínas de AMACR se realizó un análisis no paramétrico (prueba de Mann Whitney). Para comparar la intensidad de la expresión de AMACR con el efecto hormonal puntuado de casos de cáncer de próstata localizado tratado se aplicó la prueba de la chi al cuadrado de Mantel-Haenszel. Las puntuaciones de la expresión de AMACR se presentan en una forma gráfica usando barras de erros con intervalos de confianza del 95%. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

D. Resultados

Agrupación jerárquica de 76 tejidos de próstata incluyendo benigno, HPB, PCA localizado y PCA metastásico y filtrando sólo aquellos genes con una diferencia de expresión de 1,5 veces o superior, agrupadas las muestras en grupos histológicamente distintos como se ha descrito anteriormente. Como se demuestra por una presentación de TreeView de estos datos (Figura 15), AMACR fue uno de varios genes que demostró expresión en exceso al nivel de ADNc de muestras de PCA con respecto a tejido de próstata agrupado benigno. El mayor nivel de la expresión en exceso por análisis de ADNc estuvo en los casos de PCA clínicamente localizado.

Con el fin de investigar adicionalmente la función de la expresión de proteínas de AMACR en muestras con diferenciación variable y exposición a tratamiento antiandrogénico se construyeron varias TMA con un amplio intervalo de PCA: se evaluaron un total de 119 muestras de próstata benigna, 365 muestras de PCA sin tratamiento previo hormonal primario, 37 metástasis de ganglio linfático por cáncer de próstata sin tratamiento previo y 41 muestras de PCA metastásico resistente al tratamiento hormonal. Se examinaron 49 cánceres de próstata primarios tratados con hormona adicionales (incluyendo 22 sobre portaobjetos convencional) para cambios histológicos asociados al tratamiento antiandrogénico y la expresión de proteínas de AMACR. Los niveles de expresión de proteínas de AMACR medios para cada categoría de tejido se presentan en la Figura 16. Próstata benigna, cáncer de próstata primario sin tratamiento previo, cáncer primario tratado con hormona y tejido metastásico resistente al tratamiento hormonal tuvieron una intensidad de tinción media de 1,28 (error estándar EE 0,038, intervalos de confianza del 95% IC 1,20-1,35), 3,11 (EE 0,046, IC 3,02-3,20), 2,86 (EE 0,15, IC 2,56-3,15) y 2,52 (EE 0,15, IC 2,22-2,28), respectivamente). Los análisis de ANOVA unilaterales revelaron un valor de p de <0,0001. Para examinar específicamente la diferencia entre diferentes tipos de tejido se realizó una comparación por emparejamiento a posteriori. El PCA clínicamente localizado demostró una expresión de proteínas de AMACR significativamente más fuerte con respecto a tejido de próstata benigno (análisis a posteriori usando el método de Scheffé, diferencia media =1,83, p<0,0001, IC 1,53-2,13). Se observó una disminución significativa en la expresión de proteínas de AMACR en las muestras de PCA resistentes al tratamiento hormonal metastásico con respecto a PCA clínicamente localizado (0,59, p=0,002, IC 0,15-1,03). Los primarios tratados con hormona tuvieron una expresión de AMACR media de 2,86, que estaba entre los niveles de expresión de primarios sin tratamiento previo (3,11) y casos resistentes al tratamiento hormonal (2,52) (análisis a posteriori usando el método de Scheffé, p=0,51, CI -0,66-0,16 y p=0,56, IC -0,23-0,91). No hubo diferencia significativa en la expresión de AMACR en las 37 muestras de próstata primarias sin tratamiento previo y metástasis de ganglio linfático derivadas del mismo paciente (prueba de Mann Whitney, p=0,8). En otras palabras, los primarios de correspondencia y las metástasis de ganglio linfático mostraron patrón de expresión de AMACR similar.

Se examinó un subconjunto de 22 casos de PCA en el que los pacientes recibieron cantidad variable y tipos de tratamiento antiandrogénico antes de la cirugía. Estos casos se evaluaron en un modo ciego con respecto al protocolo de tratamiento para pruebas histológicas del tratamiento hormonal (portaobjetos de H&E) y la expresión de proteínas de AMACR. El efecto hormonal visible sobre los portaobjetos de H&E se clasificó de 1 a 4 representando 1 “sin efecto” y mostrando 4 un “efecto muy fuerte”. 13 casos demostraron o ningún efecto hormonal o efecto hormonal moderado, y 9 casos tuvieron un efecto hormonal muy fuerte. El análisis estadístico reveló una diferencia significativa entre estos dos grupos con respecto a la intensidad de la expresión de AMACR (Figura 17, chi al cuadrado de Mantel-Haenszel, p=0,009). La Figura 17 presenta un ejemplo de un caso de PCA tratado antes de cirugía con antiandrógenos que tiene un fuerte efecto hormonal apreciado en H&E y disminución de la expresión de proteínas de AMACR (Figura 17A). En este conjunto de datos no hubo una correlación ni entre la duración del tratamiento ni el tipo de tratamiento (monoterapia o supresión hormonal completa para deprivación de hormonas) y la expresión de AMACR.

Para la exploración adicional del efecto hormonal sobre la expresión de AMACR se realizaron experimentos de cultivos celulares primarios y análisis de transferencia Western. Como se demuestra en la Figura 17, Panel B, las células LNCaP, derivadas de una lesión metastásica, pero consideradas sensibles a hormonas, mostraron una mayor expresión de AMACR de referencia con respecto a células PC3 y DU-145, que son ambas líneas celulares independientes de hormonas derivadas de lesiones metastásicas. Una línea celular benigna, RWPE-1 (Bello y col., Carcinogenese 18:1215 [1997]), mostró expresión de AMACR casi ausente, que está de acuerdo con los datos de expresión de proteínas in situ. Para estimular un tratamiento antiandrogénico, la línea celular LNCaP sensible a hormonas se trató con bicalutamida en una concentración final de 20 μM durante un periodo de tiempo de 24 y 48 horas. La expresión de AMACR en lisados celulares de células LNCaP no cambió en ningún momento de tiempo cuando se expuso a terapia con antiandrógeno. Bajo las mismas condiciones, el PSA, un gen conocido por ser regulado por el receptor de andrógenos, mostró una disminución de la expresión de proteínas. Además, cuando las células LNCaP se expusieron al andrógeno sintético R1881, no se observó aumento en la expresión de AMACR (Figura 17, Panel B). Por tanto, estos experimentos de cultivos celulares proporcionan pruebas de que la expresión de AMACR no está regulada por la ruta de andrógenos.

La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que otra explicación para estas observaciones era la de la expresión en exceso de AMACR producido en PCA, pero como estos tumores se diferenciaron poco, como en el PCA resistente al tratamiento hormonal, la expresión de AMACR se reguló por disminución tanto directamente como indirectamente debido al procedimiento de desdiferenciación. Para elucidar esta posible correlación se examinaron muestras de cáncer de colon para la expresión de AMACR (véase el Ejemplo 7). La expresión de proteínas de AMACR también se observa en algunos otros tipos de tumores, con la mayor expresión global en cánceres colorrectales. No se sabe que los cánceres colorrectales se regulen por andrógenos y, por tanto, se usaron como control para probar esta hipótesis. Se eligieron cuatro muestras de cáncer de colon bien diferenciadas y siete anaplásicas. Los tumores poco diferenciados tienen distintas alteraciones moleculares que los distingue de los tumores colorrectales comunes de bien a moderadamente diferenciados (Hinoi y col., Am. J. Pathol. 159:2239 [2001]). Se observó la fuerte expresión de proteínas de AMACR en un cáncer de colon moderadamente diferenciado. Este tumor todavía forma estructuras grandulares bien definidas. El tejido colónico benigno circundante no expresa AMACR. Los cánceres de colon anaplásicos demostraron expresión de proteínas de AMACR débil. Los datos revelaron principalmente expresión de AMACR positiva en 4/4 casos bien diferenciados, pero sólo 4/7 cánceres colónicos anaplásicos. Tres de los cánceres de colon anaplásicos tuvieron expresión de débil a moderada. El PCA metastásico resistente al tratamiento hormonal demostró expresión de proteínas de AMACR débil en micromatrices de tejido.

Ejemplo 7

Expresión de AMACR en una variedad de cánceres - Referencia

A. Análisis de base de datos EST y SAGE en línea

El Proyecto de anatomía genómica del cáncer del Instituto nacional del cáncer (CGAP) tiene varias bases de datos de expresión génica disponibles en línea para comparar la expresión génica a través de múltiples muestras (véase el sitio web de internet del Instituto nacional del cáncer). Ambas bases de datos EST y SAGE ofrecen transferencias Virtual Northern que permiten que los usuarios visualicen y comparen el nivel de expresión de un gen particular entre múltiples muestras. La base de datos SAGE incluye más de 5 millones de marcas de 112 bibliotecas de múltiples tejidos benignos y malignos.

B. Selección de casos de estudio

Se seleccionaron un total de 96 casos de cánceres de diferentes sitios para la construcción de una micromatriz de tejido de múltiples tumores. La micromatriz de tejido se construyó para realizar un amplio estudio de múltiples tipos de tumor comunes. Para cada caso se tomó un mínimo de tres núcleos de tejido (0,6 mm de diámetro). Los tumores estudiados incluyeron adenocarcinoma colorrectal (n=15 casos), carcinoma de células renales (6), adenocarcinoma prostático (6), carcinoma urotelial (4), carcinoma del cuello uterino de células escamosas (6), carcinoma de pulmón de células no pequeñas (4), linfoma (15), melanoma (9) y varios otros tipos de cáncer. Se tomó tejido adyacente normal cuando estuvo disponible. La micromatriz de tejido de próstata se construyó a partir de pacientes seleccionados que se sometieron a prostatectomías radicales como monoterapia para cáncer de próstata clínicamente localizado. Esta micromatriz de tejido contuvo un espectro de tejido prostático que incluyó atrofia prostática, neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (NIP) y cáncer de próstata clínicamente localizado. Además, se usaron portaobjetos convencionales para confirmar resultados para cáncer de colon. Se seleccionaron veinticuatro casos de adenocarcinoma colorrectal (16 carcinomas de bien a moderadamente diferenciados y 8 carcinomas mínimamente diferenciados de células grandes) y 8 adenomas colorrectales endoscópicamente derivados para inmunotinción para AMACR. Para carcinoma de mama se usó una TMA de 52 casos de carcinoma ductal invasivo. Los especímenes se recogieron y se analizaron según las pautas del Comité de ética médica.

C. Inmunohistoquímica

Se usó inmunohistoquímica convencional del complejo de avidina-biotina. El pre-tratamiento se realizó empañando los portaobjetos durante 10 minutos en tampón citrato de sodio en un horno microondas. Entonces, los portaobjetos se incubaron secuencialmente con anticuerpo primario (dilución 1:2000, anticuerpo de conejo policlonal anti-AMACR), anticuerpo secundario biotinilado, complejo de avidina-biotina y sustrato cromogénico 3,3'diaminobencidina. Los portaobjetos se evaluaron para la adecuidad usando un microscopio de campo brillante convencional. Entonces se adquirieron imágenes digitales usando el sistema de obtención de imágenes BLISS (Bacus Lab, Lombard, IL) y se evaluaron por dos anatomopatólogos. La expresión de proteínas se puntuó como tinción negativa, débil (tinción citoplásmica apenas visible o tinción apical granular), moderada (tinción citoplásmica granular difusa) y fuerte (tinción citoplásmica intensa difusa). Sólo se consideró tinción positiva la tinción moderada y la fuerte.

D. Microdisección por captura láser

Se congelaron secciones de 2 muestras de prostatectomía radical en OCT según un protocolo del Comité de ética médica. Las secciones congeladas (5 μm de espesor) se fijaron en alcohol al 70% durante 10 minutos y luego se tiñeron en hematoxilina y eosina. Se diseccionaron próstata de cáncer de próstata y benigna en un microdiseccionador de captura láser μCUT (MMI GmbH, Heidelberg, Alemania). Se recogieron aproximadamente 6000 células. Se aisló ARN total usando el kit de microaislamiento Qiagen (Qiagen, San Diego, CA). Se realizó transcripción inversa usando tanto oligo dT como cebadores de hexámero al azar. Los cebadores usados para amplificar productos génicos específicos fueron: AMACR sentido, 5'-CGTATGCCCCGCTGAATCTCGTG-3' (SEC ID Nº: 104); AMACR antisentido, 5'-TGGCCAATCATCCGTGCTCATCTG-3' (SEC ID Nº: 105); GAPDH sentido, 5'AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' (SEC ID Nº: 106); y GAPDH antisentido, 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' (SEC ID Nº: 107). Las condiciones de PCR para AMACR y GAPDH fueron: desnaturalización por calor a 94ºC durante 5 min, ciclos de 94ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min (32 ciclos para GAPDH, 40 ciclos para AMACR) y una fase de extensión final a 72ºC durante 5 min. Entonces, los productos de PCR se separaron sobre 2% de gel de agarosa y se visualizaron por iluminación UV.

E. Resultados

Usando la herramienta Virtual Northern del programa CGAP en línea, la expresión de AMACR se estudió en dos bases de datos, las bibliotecas EST y SAGE. Se encontró que AMACR se expresaba en un amplio intervalo de tejidos, que incluyen sistema nervioso central y periférico, colon, riñón, mama, páncreas, próstata y sangre. En comparación con sus homólogos normales, varios cánceres tienen elevada expresión de AMACR, que incluyen tumores que se producen en médula ósea, mama, colon, aparato genitourinario, pulmón, ganglio linfático, sistema nervioso, páncreas, próstata, tejido blando y útero.

Para confirmar los datos de expresión génica se realizó inmunohistoquímica de AMACR en una matriz de tejido de múltiples tumores que incluía algunos de los cánceres más comunes de sitios múltiples. El nivel de proteínas de AMACR aumentó en muchos cánceres, que incluyen cánceres colorrectal, de próstata, de ovario, de pulmón, linfoma y melanoma (Figura 18). En particular, la expresión en exceso de AMACR se observó en el 92% y el 83% de cáncer colorrectal y de próstata, respectivamente. Usando una micromatriz de tejido de cáncer de mama se encontró que la expresión en exceso de AMACR estaba presente en el 44% de carcinomas ductales invasivos. La expresión en exceso de AMACR no se observó en carcinoma del cuello uterino femenino de células escamosas (6 casos).

Para caracterizar adicionalmente la expresión de AMACR en un espectro de lesiones de próstata proliferativas se utilizó una micromatriz de tejido de próstata, que incluía cáncer de próstata, NIP de alto grado y glándulas atróficas. La tinción de AMACR positiva (tinción moderada y fuerte) se observó en el 83% y el 64% de cáncer de próstata clínicamente localizado y NIP de alto grado, respectivamente. La expresión de AMACR focal se observó en el 36% de las lesiones atróficas y en glándulas morfológicamente benignas raras. Para confirmar que la expresión en exceso de las proteínas de AMACR era el resultado de un aumento de la transcripción de genes se usó microdisección por captura láser para aislar glándulas prostáticas cancerosas y benignas. Se realizó RT-PCR para evaluar la expresión de ARNm de AMACR. Las glándulas benignas tuvieron muy baja expresión de referencia (Figura 19). A diferencia, el cáncer de próstata tuvo un nivel de ARNm mucho mayor, confirmando que el aumento de la transcripción del gen AMACR conduce a una expresión en exceso de proteínas elevada en cáncer de próstata.

Se estudió la expresión de AMACR en 24 adenocarcinomas colorrectales que incluían 16 adenocarcinomas de células grandes de bien a moderadamente diferenciados y 8 poco diferenciados. En conjunto, el 83% (20/24) demostró expresión de proteínas de AMACR positiva. Todos los casos (16/16, 100%) de carcinoma de bien a moderadamente diferenciado tuvieron tinción positiva en comparación con el 64% (5/8) de carcinoma poco diferenciado. La expresión de AMACR se examinó en 8 biopsias de adenoma colorrectal obtenidas por colonoscopia. La tinción moderada estuvo presente en 6 (75%) casos. En comparación con los adenocarcinomas bien diferenciados, los adenomas normalmente mostraron tinción más focal (10-60% de las células) y menos intensa.

Ejemplo 8

Caracterización de la expresión de EZH2 en cáncer de próstata

A. Análisis de SAM

Se realizó análisis de SAM comparando perfiles de expresión génica de 7 muestras de cáncer de próstata metastásico con 10 muestras de cáncer de próstata clínicamente localizado. Los datos se normalizaron por matriz por multiplicación por un factor para ajustar la relación agregada de medianas a uno, luego se transformaron en logaritmo en base 2 y se centró la mediana. Estos datos normalizados se dividieron en dos grupos para comparación usando una prueba de la t para datos independientes de dos clases. Los valores críticos para el análisis incluyen: iteraciones = 500, semilla de números aleatorios 1234567, un corte en el cambio de veces de 1,5 y un corte delta de 0,985, produciendo la mediana final más grande de la tasa de descubrimientos falsos del 0,898% para los 535 genes seleccionados como significativos (55 relativamente regulados por aumento y 480 relativamente por disminución entre MET y PCA). Estos 535 genes se analizaron usando Cluster (Eisen y col., PNAS 95:14863 [1998]) implementando la agrupación jerárquica de enlaces promedio de genes. La salida se visualizó por Treeview (Eisen y col., [1998], arriba).

B. RT-PCR

La transcripción inversa y la amplificación por PCR se realizaron con 1 μg de ARN total aislado de los tejidos y líneas de células de la próstata aislados. Se usaron los cebadores EZH2 directo humano (5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3' (SEC ID Nº: 108)), inverso (5'-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-3' (SEC ID Nº: 109)) y GAPDH sentido (5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT- 3' (SEC ID Nº: 110)), antisentido 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' (SEC ID Nº: 111)). El ADN amplificado se resolvió en geles de agarosa y se visualizó con bromuro de etidio.

C. Análisis de inmunotransferencia

Se separaron extractos de tejido de próstata por SDS-PAGE y se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. Se usaron anticuerpos policlonales anti-EZH2 (Sewalt y col., Mol. Cell. Biol. 18:3586 [1998]), anti-EED (Sewalt y col., arriba) y anti-tubulina (Santa Cruz Biotechnology) a dilución 1:1000 para análisis de inmunotransferencia. Los anticuerpos primarios se detectaron usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada como se describe por el fabricante (Amersham-Pharmacia).

D. Análisis de micromatrices de tejido

Las micromatrices de tejido de cáncer de próstata clínicamente estratificadas usadas en este estudio se han descrito previamente (véanse los ejemplos anteriores). Los tejidos utilizados fueron de la serie de prostatectomía radical en la Universidad de Michigan y del programa Rapid Autopsy, que son ambos parte del Programa especializado en cáncer de próstata de la Universidad de Michigan de excelencia en la investigación (S.P.O.R.E.) Tissue Core. Se obtuvo la aprobación del Comité de ética médica para conseguir y analizar los tejidos usados en este estudio.

La expresión de proteínas de EZH-2 se evaluó en un amplio intervalo de tejido de próstata para determinar la intensidad y el grado in situ. Se realizó inmunohistoquímica en tres micromatrices de tejido (TMA) que contenían muestras de próstata benigna, atrofia prostática, neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (NIP), cáncer de próstata clínicamente localizado (PCA) y cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal metastásico (MET-RH). Se realizó inmunohistoquímica (IHC) convencional del complejo de biotina-avidina para evaluar la expresión de proteínas de EZH2 usando un anticuerpo policlonal anti-EZH2. La expresión de proteínas se puntuó como negativa (puntuación=1), débil (puntuación 2), moderada (3) y fuerte (4).

Se evaluaron aproximadamente 700 muestras de TMA (0,6 mm de diámetro) para este estudio (3-4 núcleos de tejido por caso). Las TMA se ensamblaron usando un robot para la fabricación de micromatrices de tejido manual (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) como se ha descrito previamente (véanse los ejemplos anteriores). Se muestrearon cuatro núcleos de tejido duplicados de cada uno de los tipos de tejido seleccionados. Después de la construcción se cortaron secciones de 4 μm y se realizó tinción con hematoxilina y eosina sobre los portaobjetos iniciales para verificar el diagnóstico histológico. Las imágenes de hematoxilina y eosina de TMA se adquirieron usando el sistema de obtención de imágenes BLISS (Bacus Lab, Lombard, IL). La expresión de proteínas de EZH2 se evaluó de un modo ciego por el anatomopatólogo del estudio usando una herramienta basada en web validada (Manley y col., Am. J. Pathol. 159:837 [2001]; Bova y col., Hum. Pathol. 32:417 [2001]) y se usó la mediana del valor de todas las mediciones de un único paciente para el posterior análisis.

E. Análisis de resultados clínicos

Para evaluar variables individuales para el riesgo de reaparición se realizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y se generó un modelo de riesgo proporcional de Cox unifactorial. La reaparición de PSA se definió como 0,2 ng/ml tras la prostatectomía radical. Las covariables incluyeron suma de Gleason, PSA preoperatorio, dimensión máxima del tumor, fase del tumor y estado del margen quirúrgico. Para evaluar la influencia de varias variables simultáneamente que incluían la expresión de proteínas de EZH2 se generó un modelo de riesgo proporcional de Cox multifactorial final de covariables estadísticamente significativas. La significancia estadística en los modelos de Cox unifactoriales y multifactoriales se determinó por la prueba de Wald. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

F. Construcciones de EZH2

Se usó EZH2-pCMV marcado con myc. El fragmento myc-EZH2 se liberó con la digestión doble de BamHI/XhoI y se subclonó en el vector de expresión de mamífero pCADN3 (Invitrogen). Se generó una construcción de expresión de fusión en marco de EZH2-ER reemplazando el fragmento FADD liberado por la digestión doble de Kpn I/Not I de la construcción de FADD-ER (originalmente derivada de myc-ER (Littlewood y col., Nuc. Acids. Res. 23:1686 [1995]) con el EZH2 humano amplificado por PCR que carece de su codón de terminación. El ADN mutante de EZH2.SET se amplificó usando los cebadores 5'GGGGTACCATGGGCGGCCGCGAACAAAAGTTGATT 3' (SEC ID Nº: 112) y 5'GGGGAATTCTCATGCCAGCAATAGATGCTTTTT3' (SEC ID Nº: 113) y posteriormente se subclonó en pCADN3 utilizando los sitios KpnI/EcoRI construidos. La expresión de estas construcciones se verificó por análisis de inmunotransferencia de las proteínas expresadas usando anticuerpos tanto anti-myc HRP (Roche, Inc) como anti-EZH2.

G. ARN interferente

Se sintetizaron químicamente oligonucleótidos de ARN sentido y antisentido de 21 nucleótidos (Dharmacon Research Inc.) y se hibridaron para formar dúplex. El ARNip empleado en el estudio se eligió como diana para la región correspondiente de 85 a 106 del EZH2 humano indicado (NM004456). El dúplex de ARNip de control eligió como diana luciferasa, lamina y AMACR (NM014324). La línea de células de la próstata transformada humana RWPE (Webber y col., Carcinogenese 18:1225 [1997]) y PC3 se sembraron en placa a 2x105 células por pocillo en una placa de 12 pocillos (para análisis de inmunotransferencia, recuentos de células y análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)) y 1,5x104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos (para ensayos de proliferación de WST-1). Doce horas después de la siembra, las células se transfectaron con 60 picomoles de oligonucleótidos sentido o antisentido del dúplex de ARNip (que eligen como diana EZH2) usando oligofectamina (Invitrogen). Se realizó una segunda transfección idéntica 24 horas después. Cuarenta y ocho horas después de la primera transfección, las células se lisaron para análisis de inmunotransferencia y se tripsinaron para la estimación del número de células o análisis de FACS. La viabilidad celular se evaluó 60 horas después de la transfección inicial.

H. Ensayos de proliferación celular

La proliferación celular se determinó con el ensayo colorimétrico de viabilidad celular basándose en la escisión de la sal de tetrazolio WST-1 por deshidrogenasas mitocondriales según las instrucciones del fabricante (Roche, Inc.). La absorbancia del colorante formazano formado, que establece directamente una correlación con el número de células metabólicamente activas en el cultivo, se midió a 450 nm (Bio-Tek instruments) una hora después de la adición del reactivo. Las cifras de células se estimaron por tripsinación de células y análisis por contador de células Coulter.

I. Análisis de citometría de flujo

Las células tripsinadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el número de células se determinó usando un contador de células Coulter. Para análisis de FACS, las células lavadas se fijaron en etanol al 70% durante la noche. Antes de la tinción con yoduro de propidio, las células se lavaron de nuevo con PBS y se analizaron por citometría de flujo (Becton Dickinson).

J. Análisis de micromatrices de células transfectadas con EZH2

La prueba inicial de este sistema de análisis de transfección/transcriptoma transitorio demostró que la expresión en exceso transitoria de TNFR1 (p55), un receptor para factor de necrosis tumoral, indujo perfiles de expresión similares a los observados con incubación de células con TNF (Kumar-Smith y col., J. Biol. Chem. 24:24 [2001]). Otras moléculas se han probado similarmente con este enfoque. Las células se transfectaron con diferentes construcciones de EZH2 y la eficiencia de la transfección se monitorizó por ensayo de beta-galactosidasa y fue aproximadamente el 30-50%. Las muestras que expresan el mutante EZH2 .SET se compararon con las muestras que expresan EZH2 usando el paquete de análisis SAM (Tusher y col., PNAS 98:5116 [2001]). Los datos se procesaron previamente por multiplicación por un factor de normalización para ajustar la relación agregada de medianas a uno, se transformaron en logaritmo en base 2 y la mediana se centró para cada matriz, individualmente. Estos datos previamente procesados se dividieron en 2 grupos para comparación usando una prueba de la t para datos independientes de dos clases. Los valores críticos para el análisis incluyen: iteraciones = 5000 (720 en la convergencia), semilla de números aleatorios 1234567, un cambio de veces de 1,5 y un corte delta de 0,45205, produciendo la mediana final más grande de la tasa de descubrimientos falsos del 0,45% para los 161 genes seleccionados como significativos. Estos 161 genes se complementaron por los valores para EZH2 y luego se analizaron usando Cluster implementando la agrupación jerárquica de enlaces promedio de genes. La salida se visualizó en Treeview. Los genes seleccionados identificados como que estaban reprimidos por EZH2 (por ejemplo, EPC y cdc27) se volvieron a secuenciar para confirmar la identidad.

La identidad molecular de una célula se determina por los genes que expresa (y reprime). La embriogénesis y la diferenciación celular dependen íntimamente del mantenimiento de ciertos genes “encendidos” y otros genes “apagados”. Si la “memoria” transcripcional de una célula está perturbada, esto puede conducir a graves defectos del desarrollo (Jacobs y col., Semin. Cell Dev. Biol. 10:227 [1999]; Francis y col., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2:409 [2001]). La falta de diferenciación, o anaplasia, es un distintivo del cáncer, que resulta de que las células normales “olvidan” su identidad celular. Por tanto, no es sorprendente que la desregulación del sistema de mantenimiento transcripcional pueda conducir a tumor maligno (Francis y col., arriba; Jabobs y col., Nature 397:164 [1999]; Beuchle y col., Development 128:993 [2001]).

Los estudios en Drosophila melanogaster han sido decisivos en el entendimiento de las proteínas implicadas en el mantenimiento de la transcripción (Beuchle y col., [[2001], arriba; Strutt y col., Mol. Cell. Biol. 17:6773 [1997]; Tie y col., Development 128:275 [2001]). Dos grupos de proteínas participan en el mantenimiento de la expresión génica homeótica e incluyen las proteínas del grupo polycomb (PcG) y tritorax (trxG) (Mahmoudi y col., Oncogene 20:3055 [2001]; Lajeunesse y col., Development 122:2189 [1996]). Las proteínas PcG actúan en grandes complejos y se cree que reprimen la expresión génica, mientras que las proteínas trxG se definen operacionalmente como antagonistas de proteínas PcG y, por tanto, activan la expresión génica (Francis y col., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2:409 [2001]; Mahmoudi y col., arriba). Hay al menos veinte proteínas PcG y trxG en Drosophila; y muchas tienen homólogos mamíferos. Se ha encontrado en tumores malignos humanos que las proteínas PcG y trxG están principalmente desreguladas en células de origen hematopoyético (Yu y col., Nature 378:505 [1995]; Raaphorst y col., Am. J. Pathol., 157:709 [2000]; van Lohuizzen y col., Cell 65:737 [1991). EZH2 es el homólogo humano de la proteína de Drosophila potenciador de Zeste (E(z)) ((Laible y col., Embo. J. 16:3219 [1997]), para el que los datos genéticos definen como una proteína PcG con propiedades de trxG adicionales (LaJeunesse y col., arriba). E(z) y EZH2 comparten homología en cuatro regiones que incluyen dominio I, dominio II, una extensión de aminoácidos rica en cisteína y un dominio SET del extremo C (Laible y col., arriba). El dominio SET es un dominio altamente conservado encontrado en reguladores asociados a cromatina de la expresión génica que frecuentemente modulan las rutas de crecimiento celular (Jenuwein y col., Cell. Mol. Life Sci. 54:80 [1998]). Se cree que EZH2 funciona en un complejo de proteína PcG constituido por EED, YY1 y HDAC2 (Satijn y col., Biochim. Biophys. Acta. 1447:1 [1999]). La rotura del gen EZH2 en ratones produce letalidad embrionaria que sugiere una función crucial en el desarrollo (O'Carroll y col., Mol. Cell. Biol. 21:4330 [2001]).

En estudios previos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1), el gen en la parte superior de la “lista” de genes significativamente regulados por aumento en cáncer de próstata metastásico fue EZH2, que tenía una puntuación d (Tusher y col. PNAS 98:5116 [2001]) de 4,58 y una FDR específica de genes de 0,0012 (también llamado un “valor q” que es análogo a los valores de p, pero adaptado a múltiples escenarios de inferencia. La Figura 20a muestra los 55 genes regulados por aumento identificados por este enfoque. La Figura 20b resume la expresión génica de EZH2 en 74 especímenes de tejido de próstata analizados sobre micromatrices de ADN constituidas por elementos de 10

K. El transcrito de EZH2 fue significativamente elevado en cáncer de próstata metastásico con respecto a cáncer de próstata clínicamente localizado (prueba de Mann-Whitney, p=0,001) y próstata benigna (p=0,0001).

Como validación experimental independiente de resultados de micromatrices de ADN, la RT-PCR se realizó en 18 muestras y líneas de células de la próstata. Como era de esperar, los niveles de transcrito de ARNm de EZH2 fueron elevados en muestras de próstata maligna con respecto a benigna (Fig. 20c). Para determinar si EZH2 está regulado por aumento al nivel de las proteínas en cáncer de próstata metastásico, extractos de tejido se examinaron por inmunotransferencia. En las muestras examinadas por análisis de inmunotransferencia, la proteína de EZH2 era marcadamente elevada en cáncer de próstata metastásico con respecto a cáncer de próstata localizado o próstata benigna (Fig. 20d).

Y, lo que es más importante, EED, una proteína PcG que forma un complejo con EZH2 (van Lohuizen y col., arriba; Sewalt y col., arriba), junto con una proteína no relacionada, �-tubulina, no presentó desregulación de proteínas similar. La expresión de proteínas de EZH2 se evaluó en un amplio intervalo de tejidos de próstata (más de 700 elementos de micromatrices de tejido) para determinar la intensidad y el grado de expresión in situ (Fig. 21 a,b). Cuando se expresó altamente, la expresión de EZH2 se observó principalmente en el núcleo como se ha sugerido previamente (Raaphorst y col., arriba). La intensidad de la tinción aumentó de benigno, atrofia prostática, neoplasia intraepitelial prostática (NIP), a cáncer de próstata clínicamente localizado con mediana de la intensidad de la tinción de 1,7 (error estándar [EE], 0,1; intervalo de confianza del 95% [IC], 1,5-1,9), 1,7 (EE, 0,2; IC del 95%, 1,3-2,0), 2,3 (EE, 0,2.; IC del 95%, 1,9-2,7) y 2,6 (EE, 0,1; IC del 95%, 2,4-2,8), respectivamente (Fig. 24b). La expresión de proteínas de EZH2 más fuerte se observó en cáncer de próstata metastásico resistente al tratamiento hormonal con una mediana de la intensidad de la tinción de 3,3 (EE, 0,3; IC del 95%, 2,7-3,9). Hubo una diferencia estadísticamente significativa en la intensidad de la tinción de EZH2 entre tejido de próstata benigno y cáncer de próstata localizado (diferencia media del análisis a posteriori de ANOVA 0,9, p<0,0001). Aunque el cáncer de próstata metastásico tuvo un mayor nivel de expresión medio que el cáncer de próstata localizado, la diferencia no alcanzó la significancia estadística (diferencia media del análisis a posteriori de ANOVA 0,7, p=0,3). Estos hallazgos sugieren que a medida que la neoplasia de próstata progresaba había una tendencia hacia el aumento de la expresión de proteínas de EZH2, imitando lo observado por el análisis de matrices de expresión de ADN. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que esta observación sugiere que los niveles de EZH2 pueden indicar cómo de agresivo es un cáncer de próstata del individuo dado que el mayor nivel de expresión se observó en cáncer de próstata metastásico resistente al tratamiento hormonal. Por tanto, para probar esta hipótesis se examinó la utilidad de los niveles de proteínas de EZH2 para predecir el desenlace clínico en hombres tratados con cirugía para cáncer de próstata clínicamente localizado.

Se interrogaron doscientos veinticinco (225) especímenes de sesenta y cuatro pacientes (3-4 muestras duplicadas por paciente) con seguimiento clínico sobre una única micromatriz de tejido. Estos hombres tuvieron una mediana de la edad de 61 años (intervalo 43-76 años) y una mediana de 7,3 ng/ml de antígeno específico de la próstata (PSA) en suero preoperatorio (intervalo 0,8-21,0 ng/ml). El examen patológico de sus especímenes de prostatectomía indicó que el 77% tenía enfermedad confinada al órgano (fase pT2) y el 72% tenía márgenes quirúrgicos negativos. Las características demográficas de los pacientes y las fases del tumor fueron representativas de los más de 1500 pacientes con prostatectomía radical. Con el fin de probar la utilidad de EZH2 como posible biomarcador de tejido para cáncer de próstata, el desenlace clínico de estos 64 casos se examinó teniendo en cuenta parámetros clínicos y patológicos. El fracaso clínico se definió como tanto una elevación de PSA de 0,2 ng/ml como la reaparición de enfermedad tras la prostatectomía (por ejemplo, desarrollo de enfermedad metastásica). Por análisis de Kaplan-Meier (Fig. 21 c), la intensidad de la tinción de EZH2 de 3 y superior estuvo significativamente asociada a fracaso clínico en el 31% (10/32) de los pacientes, a diferencia del 9% (3/32) de los pacientes con niveles de proteínas de EZH2 inferiores a 3 (orden logarítmico, p=0,03). No hubo correlación significativa entre niveles de EZH2 y puntuación de Gleason (<7 frente a =7), fase del tumor (pT2 frente a pT3) o estado del margen quirúrgico (negativo frente a positivo). Hubo una correlación significativa (p=0,048), aunque débil (coeficiente de Pearson =0,33), entre los niveles de proteínas de EZH2 y el índice de proliferación in situ como se evalúa por el índice de marcado de Ki

67. El análisis de regresión del riesgo de Cox multifactorial reveló que la expresión de proteínas de EZH2 (=3 frente a <3) fue el mejor valor pronóstico de desenlace clínico con una relación de reaparición de 4,6 (IC del 95% 1,2-17,1, p=0,02), que fue significativamente mejor que el estado del margen quirúrgico, la dimensión máxima del tumor, la puntuación de Gleason y el PSA pre-operatorio. Por tanto, la monitorización de niveles de proteínas de EZH2 en especímenes de próstata puede proporcionar información pronóstica adicional no discernible con los presentes parámetros clínicos y de patología solos.

Para arrojar luz sobre la función funcional de EZH2 en la progresión del cáncer de próstata, la expresión de EZH2 en células de la próstata transformadas in vitro se perturbó usando ARN interferente. T. Tuschl y colaboradores informaron recientemente que los dúplex de ARN de 21 nucleótidos (ARNip) median en el ARN interferente en células de mamífero cultivadas en un modo específico de gen (Elbashir y col., Nature 411:494 [2001]). El ARN interferente se ha usado eficazmente en líneas de células de insecto para “silenciar” la expresión de proteínas específicas debido a la degradación de ARN mediada por ARN bicatenario específico de secuencia (Hammond y col., Nature 404:293 [2000]). Los ARNip son potentes mediadores del silenciamiento de genes, varios órdenes de magnitud más potentes que los enfoques antisentido o de ribozima convencionales (Macejak y col., Hepatology

31:769 [2000]). Por tanto, una extensión de 21 nucleótidos de la molécula de EZH2 se eligió como diana usando los criterios proporcionados por Elbashir y col. (arriba), y se sintetizaron comercialmente oligonucleótidos de ARN. Después de que los oligonucleótidos de ARN se hibridaran para formar dúplex de ARNip, se probaron en la línea de células de la próstata sensibles a andrógeno transformada RWPE (Webber y col., Carcinogenese 18:1225 [1997]; Bello y col., Carcinogenese 18:1215 [1997]), además de la línea de células de cáncer de próstata metastásico PC3. Cuarenta y ocho horas después de transfección con dúplex de ARNip, los niveles de proteína EZH2 endógena se cuantificaron. Cuando la proteína EZH2 se reguló específicamente por disminución en líneas de células de la próstata, los niveles de la proteína de control sin relacionar, �-tubulina, permanecieron invariables (Fig. 22a). Los oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden el dúplex de EZH2, además del dúplex de ARNip sin relacionar, no afectaron los niveles de proteínas de EZH2 (Fig. 22a, paneles central y derecho), verificando la especificidad del enfoque de ARNip en ambas líneas de células de la próstata.

A continuación se examinó el fenotipo de células de la próstata “silenciadas” por EZH2. Por microscopía de contraste de fase se observó que los ARNip dirigidos contra EZH2 inhibieron marcadamente el número de células/confluencia con respecto al control de tampón. Los recuentos de células tomados 48 h después de la transfección con ARNip mostraron un 62% de inhibición del crecimiento de células RWPE mediado por el dúplex de ARNip de EZH2, que es a diferencia de los oligonucleótidos de EZH2 sentido y antisentido correspondientes o dúplex de control (que eligen como diana luciferasa y lamina) que presentaron inhibición mínima (Fig. 22b). La línea de células de cáncer de próstata, PC3, demostró una inhibición similar del crecimiento mediado por ARNip de EZH2, sugiriendo que los hallazgos no son una peculiaridad de la línea de células RWPE (Fig. 22b). Usando un reactivo de proliferación celular comercialmente disponible WST-1 que mide la actividad de deshidrogenasa mitocondrial se observó una disminución en la proliferación celular mediada por el dúplex de ARNip de EZH2, pero no por el dúplex sin relacionar (Fig. 22c). En el marco de tiempo considerado (48 h), el ARN interferente de EZH2 no indujo apoptosis como se evalúa por tinción con yoduro de propidio de núcleos o escisión de PARP. De acuerdo con esto, el inhibidor de la caspasa de amplio espectro, z-VAD-fmk, fracasó en atenuar la inhibición inducida por ARNip de EZH2 de la proliferación celular (Fig. 22c). Por tanto, la activación de la ruta de la apoptosis no explica la disminución en el número de células observado por el ARN interferente de EZH2.

Se ha sugerido que diversas proteínas del grupo PcG desempeñan una función en la progresión del ciclo celular (Jacobs y col., Nature 397:164 [1999]; Visser y col., Br. J. Hematol. 112:950 [2001]; Borck y col. Curr. Opin. Genet. Dev. 11:175 [2001]). El análisis de citometría de flujo de células de la próstata tratadas con ARNip de EZH2 demostró detención del ciclo celular en la fase G2/M (Fig. 22d). El dúplex de ARNip de control sin relacionar fracasó en inducir una desregulación similar del ciclo celular. Estuvieron presentes pocas células apoptósicas (células sub-G1) en cualquiera de las muestras experimentales probadas como se evalúa por citometría de flujo (Fig. 22d). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que estas observaciones sugieren que EZH2 desempeña una función en la proliferación de células de la próstata mitigando la transición G2/M.

Para entender adicionalmente la función funcional de EZH2 en células de la próstata se generó una versión de EZH2 natural marcada con epítope y un mutante de deleción de EZH2 al que le faltaba el dominio SET conservado en el vector de expresión eucariota pADNc3 (Fig. 23a). También se generó una versión “inducible” de EZH2 creando una proteína de fusión con un receptor de estrógenos murinos modificados (ER) (Fig. 26a) (Littlewood y col., Nuc. Acid. Res. 23:1686 [1995]; Juin y col., Genes Dev. 13:1367 [1999]). La fusión EZH2-ER se expresó en células (Fig. 26b) y es supuestamente inactivada por el secuestro/unión a hsp90 y otras proteínas (Littlewood y col., arriba). Tras el tratamiento de células con 4-hidroxitamoxifeno, hsp90 se disocia de la fusión de ER y libera su actividad. La expresión de las construcciones de EZH2 marcadas con epítope se confirmó por transfección en 293 (Fig. 23b), RWPE y en otras líneas celulares de mamífero.

Se ha propuesto que las proteínas PcG median en sus funciones por represión de genes diana (Laible y col., arriba; Jacobs y col., Semin Cell Dev. Biol. 10:227 [1999]). Para empezar a probar esta hipótesis, células de la próstata RWPE se transfectaron transitoriamente con EZH2 natural y las alteraciones de la expresión génica globales se monitorizaron usando micromatrices de ADN. Aunque el ARN de la línea celular experimental (transfectada) se marcó con un colorante fluorescente, la muestra de referencia emparejada se marcó con un segundo colorante fluorescente distinguible. Las diferencias moleculares entre las muestras se observaron haciendo comparaciones directas entre líneas celulares transfectadas con “gen” y líneas celulares transfectadas con vector de control. Cuando EZH2 se expresó en exceso en células RWPE o células de carcinoma de mama SUM149, hubo una coherente represión de una cohorte de genes (Fig. 23c, d). Esta represión exclusiva de genes fue única en comparación con otras moléculas probadas en este sistema que incluyen c-myc y TNFR1, entre otras. Cuando se comparó con células transfectadas con vector, el único gen que se reguló significativamente por aumento en células transfectadas con EZH2 fue el propio EZH2 (Fig. 23c).

La represión transcripcional mediada por EZH2 dependió de un dominio SET intacto (Fig. 23c), ya que la deleción de este dominio no produjo un fenotipo represivo y en algunos casos genes “desrreprimidos”. Se ha mostrado que EZH2 interacciona con histona desacetilasa 2 (HDAC2) por la proteína EED (van der Vlag y col., Nat. Genet. 23:474 [1999]). En los experimentos descritos anteriormente, el silenciamiento de genes mediado por EZH2 dependió de la actividad de HDAC, ya que el inhibidor de HDAC comúnmente usado, tricostatina A (TSA), derogó completamente los efectos de EZH2 (Fig. 23c). Por tanto, la función de EZH2 requiere tanto un dominio SET intacto, además de actividad de HDAC endógena.

Para identificar genes que son significativamente reprimidos por EZH2, células transfectadas con EZH2 naturales se compararon con células transfectadas con EZH2 .SET. Usando este enfoque, 163 genes se reprimieron coherentemente, aunque no se activaron genes a una FDR de 0,0045 (Fig. 23d). El examen de la lista de genes significativos identificó la proteína del grupo PcG EPC, que es el homólogo humano de la proteína de Drosophila potenciador de Polycomb (E(Pc)) como se reprime coherentemente por EZH2 (Fig. 23c). De las proteínas PcG de Drosophila, E(Pc) y E(z) están relacionadas, ya que ambas actúan de supresores de variegación (Su(var)) (Sinclair y col., Genetics 148:211 [1998]) y son las únicas proteínas PcG que tienen homólogos de levadura, enfatizando la conservación evolutiva de este par de PcG. Además de EPC, un huésped de otros reguladores/activadores transcripcionales se silenciaron transcripcionalmente por EZH2 que incluye MADN, RNF5, RNF15, ZNF42, ZNF262, ZNFN1A1, RBM5, SPIB y FOXF2, entre otros (Fig. 23c). MADN, también conocido como antígeno de la diferenciación nuclear de células mieloides, medió en la represión transcripcional interaccionando con el factor de transcripción YY1, que es un homólogo de PcG de Pho de Drosophila, y mostró ser parte del complejo EZH2/EED de proteínas (Satijin y col., Mol. Cell. Biol. 21:1360 [2001]).

Además de la represión transcripcional en células de la próstata, los resultados también soportan una función para EZH2 en la regulación del crecimiento celular (Fig. 23). También se observó la represión transcripcional de cdc27 (dos clones de Unigen independientes). Cdc27 es parte del complejo promotor de la anafase (APC) que media en la ubicuitinación de ciclina B1, produciendo la degradación del complejo ciclina B/cdk (Jorgensen y col., Mol. Cell. Biol.

18:468 [1998]). Otra familia de proteínas que se reprimió cuando EZH2 se eligió como diana fueron los transportadores de soluto. Se mostró que se reprimieron al menos 5 miembros distintos (es decir, SSLC34A2, SLC25A16, SLC25A6, SLC16A2 y SLC4A3).

Ejemplo 9

Expresión de AMACR en suero y orina - Referencia

Este ejemplo describe la expresión de AMACR en suero y orina. AMACR se detectó por inmunotransferencia convencional y por micromatriz de proteína usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-AMACR. Los resultados se muestran en las Figuras 24-27. La Figura 24 muestra la detección de proteína de AMACR en líneas celulares de PCA por cuantificación de datos de micromatrices. DUCAP, DU145, y VCAP son líneas de células de cáncer de próstata. RWPE es una línea de células de la próstata benigna. PHINX es una línea de células de riñón embrionario humano.

La Figura 25 muestra la detección de la proteína de AMACR en suero por cuantificación de datos de micromatrices. P1-P7 representan suero de pacientes con cáncer de próstata. NS2 y NS3 representan suero de pacientes que no tienen PCA. SNS2 y SNS3 representan suero de pacientes que no tienen PCA que ha sido enriquecido con proteína de AMACR. La Figura 26 muestra un análisis de inmunotransferencia de suero de pacientes con el antígeno PSA tanto negativo como positivo. La Figura 27 muestra un análisis de inmunotransferencia de la presencia de AMACR en muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga (mujeres) o cáncer de vejiga y cáncer de próstata asociado (hombres). Los resultados demuestran que AMACR puede detectarse en el suero y orina de pacientes con cáncer de vejiga o cáncer de vejiga y cáncer de próstata.

Ejemplo 10

AMACR como antígeno tumoral - Referencia

Este ejemplo describe la presencia de una respuesta inmunitaria contra AMACR en suero. La Figura 28 muestra datos representativos de una respuesta humoral por análisis de micromatrices de proteínas. Los antígenos de tumor que incluyen AMACR, PSA, CEA, HSP se aplicaron en puntos sobre portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa. Los portaobjetos se incubaron con sueros de diferentes pacientes para detectar una respuesta humoral. Entonces, la micromatriz se lavó. Se usó un anticuerpo de cabra marcado con Cy5 dirigido contra IgG humana para detectar la respuesta humoral. Entonces, los portaobjetos se cribaron usando un escáner de micromatrices (Axon). Después de la normalización de datos, la intensidad de los puntos refleja la presencia, ausencia o intensidad de la respuesta humoral a antígeno de tumor específico. Se detectó una respuesta humoral específica a AMACR en pacientes con cáncer, pero no en controles. Cáncer se refiere a sueros de pacientes con cáncer de próstata. HPB se refiere a sueros de pacientes con hiperplasia prostática benigna.

La Figura 29 muestra análisis de inmunotransferencia de la respuesta humoral a AMACR. La Figura 29A muestra un gel de SDS-PAGE que contiene MBP recombinante (proteína de control =M) y AMACR-MBP recombinante (A) que se ejecutó y se transfectó a papel de nitrocelulosa. Entonces, cada transferencia en tira se incubó con sueros humanos. Se detectó una respuesta humoral a AMACR usando un anticuerpo anti-humano conjugado con HRP. Sólo se detectaron AMACR y fragmentos de AMACR en sueros de pacientes con cáncer de próstata y no en controles. La Figura 29B muestra un experimento de control por el que la respuesta humoral se bloquea con AMACR recombinante (extinguido) y, por tanto, muestra la especificidad de la respuesta.

Este ejemplo demuestra que AMACR sirve de antígeno de tumor en suero humano de pacientes con cáncer de próstata. Se generó una respuesta inmunitaria específica a AMACR en el suero de pacientes con PCA, pero no en controles.

Ejemplo 11

Expresión de GP73 en cáncer de próstata - Referencia

Este ejemplo describe la asociación de GP73 con cáncer de próstata.

A. Procedimientos

Se realizaron análisis de micromatrices, RT-PCR, transferencia Western e inmunohistoquímica como se ha descrito en los ejemplos anteriores.

B. Resultados

La Figura 30 muestra niveles de transcritos de GP73 en cáncer de próstata. La Figura 30a muestra el nivel de GP73 en muestras individuales después del análisis de micromatrices. La gráfica muestra los valores de la relación de Cy5 frente a Cy3 en la que el ARN de muestras de tejido de cáncer de próstata se marcó con colorante fluorescente Cy5, mientras que la muestra de referencia (conjunto de ARN de tejido benigno) se marcó con colorante fluorescente Cy3. Se representa un total de 76 experimentos individuales de diferentes tejidos de próstata y se clasifican como tipos benigno, de cáncer de próstata y de cáncer metastásico. La Figura 30b muestra el resultado de transcritos de GP73 determinado por análisis de micromatrices de ADN de 76 muestras de próstata agrupadas según el tipo de muestra y promediadas. Las muestras experimentales se marcaron con colorante fluorescente Cy5, mientras que la muestra de referencia (conjunto de muestra de tejido benigno) se marcó con colorante fluorescente Cy3. El diagrama de cajas demuestra el intervalo de expresión de GP73 dentro de cada grupo. La barra horizontal central indica medianas de valores; límites superior e inferior de las cajas, intervalos de intercuartiles; y las barras de error, intervalos de confianza del 95%. La Figura 30c demuestra que los niveles de transcritos de GP73 son elevados en cáncer de próstata. Se usó RT-PCR para detectar niveles de transcritos de GP73 en preparaciones de ARN de extractos de tejido de próstata. GAPDH sirvió de control de carga.

La Figura 31 muestra que la proteína GP73 está regulada por aumento en cáncer de próstata. La Figura 31a muestra análisis de transferencia Western de proteína GP73 en cáncer de próstata. Las proteínas de tejido totales de tejidos benignos, de cáncer y metastásicos (10 μg) se analizaron usando antisuero anti-GP73. La -tubulina sirve de control para la carga de muestras. La Figura 31b muestra un análisis de inmunotransferencia de la proteína residente en Golgi la golgina 97. Los niveles de proteína golgina 97 se analizaron en la muestra de tejido de próstata para indicar el nivel de estructura de Golgi en tejido normal y de próstata canceroso. La �-tubulina sirve de control para la carga de muestras.

También se realizó el análisis de micromatrices de tejido de proteína de GP73 en tejido de próstata normal y canceroso. La expresión de proteínas de GP73 se analizó por análisis inmunohistoquímico convencional de biotinaavidina usando un anticuerpo de ratón policlonal para GP73. La expresión de proteínas se evaluó en un amplio intervalo de tejido de próstata usando micromatrices de tejido de alta densidad. Se observaron altos niveles de tinción en tejido de cáncer de próstata. Algunas células epiteliales normales no tiñeron para GP73 en una subregión de tejido de cáncer de próstata.

La Figura 32 muestra análisis de inmunotransferencia de células epiteliales normales y de cáncer de próstata. Las células epiteliales se aislaron de tejido de próstata normal y tejido canceroso para aislar específicamente la proteína de célula epitelial para el análisis de inmunotransferencia de GP73. Para este fin se usaron muestras microdiseccionadas por captura con láser. Western de actina sirve de control.

Ejemplo 12

Marcadores letales y dianas

Este ejemplo describe la identificación de marcadores letales. Los marcadores sirven de posibles dianas

5 terapéuticas. Los marcadores se identificaron por guardar relación con el número de muestras con parámetros clínicos y expresión génica. Específicamente, el presente estudio identificó marcadores que tienen un perfil de expresión similar a EZH2 que sirve de biomarcador letal prototípico de cáncer de próstata. Estos genes se identificaron por un sistema de puntuación que tiene en cuenta si el cáncer de próstata localizado se ha repetido o no se ha repetido. Además, se identificaron genes que tienen expresión altamente correlacionada con EZH2 que

10 pueden servir de marcadores para complementar EZH2.

Total: 16 13 16 6 20

media: desv alto hpb_recuento pca_recuento pcau_recuento pcar_recuento met_recuento puntuación UNIQID NOMBRE

-0,024: 0,3725 0,7206 0 4 5 6 16 18 5814 NULL EST Hs.30237

-0,306: 0,1707 0,0351 0 0 3 3 14 17 2506 HN1

-0,348: 0,2394 0,1312 0 2 1 4 14 16 5112 CSF2

0,0623: 0,1578 0,3779 0 1 2 3 13 15 6053 ASNS

-0,246: 0,1689 0,0921 0 2 0 2 15 15 1520 NULL EST Hs.16304

-0,212: 0,1386 0,0648 0 2 0 2 15 15 8273 PRC1

-0,3521: 0,1458 -0,06 0 3 7 3 14 14 34 GPAA1

-0,292: 0,2538 0,2153 0 0 1 3 10 13 5239 KIAA1691

-0,141: 0,1572 0,1729 0 2 5 3 12 13 8562 NULL Clon humano 23614

-0,21: 0,1083 0,0067 0 4 4 2 15 13 3351 Proteína hipotética FLJ11715

-0,22: 0,1846 0,1495 0 5 4 5 13 13 2715 NULL EST

-0,638: 0,2696 -0,099 1 5 4 3 15 13 9556 Proteína hipotética FLJ12443

-0,142: 0,1396 0,1371 0 0 2 2 10 12 1158 TGFBI

-0,124: 0,1606 0,1967 0 1 1 3 10 12 5292 NULL EST

-0,444: 0,2474 0,0504 0 1 2 2 11 12 3689 Proteína hipotética NUF2R

-0,205: 0,2362 0,2674 0 2 1 2 12 12 1219 ABCC5

-0,09: 0,2214 0,3526 0 4 2 4 12 12 1360 MEN1

-0,241: 0,1541 0,0673 0 5 3 2 15 12 8476 SARM y HEAT/ motivo Armadillo

-0,874: 0,3367 -0,201 0 1 4 2 10 11 3747 H2BFB

-0,196: 0,254 0,3122 0 2 1 3 10 11 4941 VAV2

(continuación)

Total: 16 13 16 6 20

-0,166: 0,1486 0,1307 0 2 4 2 11 11 8636 NULL EST Hs.23268

0,0255: 0,1542 0,3338 0 3 3 3 11 11 280 TOP2A

-0,226: 0,2536 0,2812 0 4 3 4 11 11 2156 EZH2

-0,031: 0,1826 0,3346 0 4 4 2 13 11 1979 NULL EST Hs.268921

-0,48: 0,2967 0,1131 0 2 0 2 10 10 906 Proteína hipotética MGC5627

-0,243: 0,1421 0,0411 0 2 8 2 10 10 3728 NULL EST

-0,133: 0,1806 0,2279 0 2 2 2 10 10 8759 RAB24

-0,192: 0,1782 0,1645 0 3 2 2 11 10 2029 Proteína hipotética FLJ12876

-0,617: 0 -0,617 0 3 2 2 10 9 3928 DGKD

0,1079: 0,1132 0,3343 0 3 2 2 10 9 5372 ODF2

-0,288: 0,1221 -0,043 0 4 3 3 10 9 7193 KIAA0602

-0,167: 0,2278 0,2883 0 4 2 2 11 9 8535 EHM2

-0,95: 0,3504 -0,249 0 4 2 2 11 9 9824 SLC19A1

-0,314: 0,187 0,06 1 4 2 2 11 9 9447 LIG1

0,1366: 0,1883 0,5132 1 4 3 2 10 8 327 NULL EST

-0,586: 0,2952 0,0044 0 5 2 2 11 8 1269 DGKZ

media: expresión media en HPB desv: desviación estándar en HPB alto: 2 DE por encima de la media (umbral) hpb: nº de muestras de HPB > umbral pca: nº de muestras de PCA > umbral (>1 año sin repetición) pcau: nº de muestras de PCA > umbral (<1 año de seguimiento) pcar: nº de muestras de PCA > umbral (repetición) met: nº de muestras metastásicas > umbral puntuación: = met + pcar - pca Total: nº de muestras en categoría

Marcadores letales a modo de ejemplo identificados usando los procedimientos anteriores incluyen ABCC5 (MDR5). Este gen de resistencia a múltiples fármacos bombea activamente nucleótidos cíclicos y otras moléculas pequeñas

5 fuera de las células. Un estudio no relacionado encontró que esta enzima es posiblemente inhibida por inhibidores de la fosfodiesterasa, que incluyen sildenafilo (viagra). La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no se requiere un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que el sildenafilo puede ser útil en el tratamiento de PCA agresivo.

Otro marcador letal identificado es la asparagina sintetasa (ASNS). Los agentes terapéuticos actuales para la 10 inhibición de ASNS incluyen asparaginasa, una enzima que destruye asparagina en el cuerpo. Se ha mostrado que los cánceres que expresan la sintetasa son resistentes. Están siendo desarrollados análogos para inhibir la sintetasa.

La Top2A (topoisomerasa 2) y el oncogén Vav2 también se identificaron usando los procedimientos de la presente invención. Vav2 se requiere para la diseminación de células, pero depende de src. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no se requiere un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que los inhibidores de src puedan detener la diseminación de células mediada por vav2.

Este ejemplo describe la identificación de marcadores de cáncer expresados en exceso en cánceres de próstata. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que compuestos terapéuticos que inhiben estos marcadores letales son útiles en el tratamiento de cáncer de próstata.

Ejemplo 13

Caracterización de la expresión de anexina en cáncer de próstata - Referencia

Este ejemplo describe la expresión de anexinas en cáncer de próstata.

A. Materiales y procedimientos

Recogida de muestras de próstata

Los tejidos de próstata se tomaron de la serie de prostatectomía radical y el programa Rapid Autopsy disponibles mediante el Programa especializado en cáncer de próstata de la Universidad de Michigan de excelencia en la investigación (S.P.O.R.E.) Tissue Core. Este programa está aprobado por el Comité de ética médica en la Universidad de Michigan.

Se tomaron muestras de PCA clínicamente localizado sin tratamiento previo con hormona usadas para este estudio de una cohorte de hombres que se sometieron a prostatectomía retropúbica radical como monoterapia (es decir, sin terapia hormonal o radioterapia) para PCA clínicamente localizado entre los años 1994 y 1998. El procesamiento de los tejidos prostáticos empezó en el plazo de 20 minutos después de la resección quirúrgica. Las próstatas se muestrearon parcialmente y se usó aproximadamente el 50% del tejido para la investigación. Este protocolo se ha evaluado en un estudio formal para asegurar que el muestreo parcial no afecta la estadificación y evaluación de los márgenes quirúrgicos (Hollenbeck y col., J. Urol. 164:1583 [2000]). Todas las muestras congeladas criogénicamente usadas para el análisis de matrices de expresión de ADNc fueron evaluadas por uno de los anatomopatólogos del estudio. Todas las muestras se recortaron aproximadamente para garantizar que más del 95% de la muestra representara la lesión deseada.

Se recogieron muestras de PCA resistente al tratamiento hormonal del programa Rapid Autopsy (Rubin y col., [2000], arriba). Las muestras congeladas criogénicamente se usaron para análisis de matrices de expresión de ADNc. Las muestras duplicadas de la misma lesión se dispusieron en 10% de formalina tamponada. Las muestras fijadas se incorporaron en parafina. Al igual que con las muestras de prostatectomía, el anatomopatólogo del estudio revisó los portaobjetos de vidrio, rodeó con círculos áreas de cáncer de próstata viable, evitando áreas de necrosis, y usó estos portaobjetos como molde para la construcción de micromatrices de tejido. En este estudio, veinte (20) PCA resistentes al tratamiento hormonal metastásicos se extrajeron de 15 casos de autopsia rápida realizados de 1997 a 2000. Las edades de los pacientes oscilaron de 53 a 84 y el tiempo desde el diagnóstico hasta la muerte osciló de 21 a 193 meses. Los 15 pacientes murieron de PCA ampliamente metastásico después de tratamiento extensivo que incluyó antiandrógenos y quimioterapia.

Se evaluaron muestras de prostatectomía para la presencia o ausencia de implicación de margen quirúrgico por el tumor (estado del margen quirúrgico), la presencia de extensión extraprostática e invasión de la vesícula seminal. Los tumores se clasificaron usando el sistema de TNM que incluye extensión extraprostática e invasión de la vesícula seminal, pero no tiene en cuenta el estado del margen quirúrgico (Bostwick y col., Semin. Urol. Oncol.

17:222 [1999]). Los tumores se clasificaron usando el sistema de clasificación de Gleason (Gleason, [1966], arriba).

Inmunohistoquímica

Después de la eliminación de parafina y la hidratación, los portaobjetos de micromatrices de tejido se sumergieron en tampón citrato 10 mM dispuesto en una cámara de olla a presión y se calentaron en el microondas durante 10 minutos para la recuperación óptima de antígeno. La inmunotinción se realizó usando un teñidor automático Dako (DAKO, Carpinteria, CA). El anticuerpo primario se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente y un anticuerpo secundario marcado con biotina durante 30 minutos. El procedimiento de amplificación de estreptavidina-LSA (DAKO K0679) se llevó a cabo durante 30 minutos, seguido de peroxidasa/sustrato de diaminobencidina/Chromagen. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina. Los anticuerpos policlonales dirigidos contra el extremo N de la anexina 1 (dilución 1:50), la anexina 2 (dilución 1:100), la anexina 4 (dilución 1:100), la anexina 7 (dilución 1:500) y la anexina 11 (dilución 1:100) se obtuvieron de una fuente de señales (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). La expresión de proteínas como se ha determinado por dos anatomopatólogos por inmunohistoquímica se puntuó como negativa (puntuación=1), débil (puntuación 2), moderada

(3) o fuerte (4) usando el sistema descrito anteriormente.

Construcción de micromatrices de tejido, captura de imágenes digitales y análisis

Se construyeron micromatrices de tejido como se ha descrito previamente para evaluar la expresión de proteínas en un amplio intervalo de muestras que oscila de tejido de próstata benigno tomado de las muestras de prostatectomía a PCA resistente al tratamiento hormonal. Se usaron tres micromatrices de tejido para este estudio que consistieron en próstata benigna, PCA localizados y PCA resistente al tratamiento hormonal. Las micromatrices de tejido se ensamblaron usando el robot para la fabricación de micromatrices de tejido manual (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) como se ha descrito previamente (Kononen y col., [1998], arriba; Perrone y col., [2000], arriba). Los núcleos de tejido de las áreas rodeadas con un círculo de interés se eligieron como diana para la transferencia a los bloques de matriz de receptor. Los núcleos de micromatrices de tejido de 0,6 mm de diámetro se separaron cada uno 0,8 mm de centro de núcleo a centro de núcleo. Las imágenes de micromatrices de tejido se adquirieron usando el sistema de obtención de imágenes BLISS (Bacus Lab, Lombard, IL).

Análisis estadísticos

Para investigar la significancia estadística asociada a la expresión diferencial de anexinas a través de 4 estudios de expresión génica independientes se usaron procedimientos convencionales (Hedges y col., Statistical Methods for Meta-analysis. Orlando, Academic Press 1985, pág. xxii, 369) para combinar los resultados. Para cada uno de los estudios se calculó una estadística de la t (siendo los dos grupos tejido benigno en comparación con cáncer de próstata localizado) y los valores de p asociados se transformaron usando una transformación logarítmica negativa. Entonces, estos números se duplicaron y se sumaron juntos para llegar a una medida resumen de expresión génica diferencial a través de los tres estudios. Para evaluar la significancia estadística asociada a esta medida resumen se adoptó un enfoque basado en la permutación (Hedges y col., arriba). Concretamente, los tipos de tejido se permutaron dentro de los estudios, y la medida resumen se calculó para los datos permutados. Se calculó un valor de p usando la distribución de permutaciones de la medida resumen. Entonces se plantea la cuestión de si las estadísticas de la t de los tres estudios son comparables o no.

La expresión de las proteínas de anexina se evaluó estadísticamente usando los resultados de la puntuación media de cada muestra de micromatriz de tejido para cada tipo de tejido de próstata (es decir, benigno, PCA localizado y PCA resistente al tratamiento hormonal). Para determinar las diferencias entre todos los pares (por ejemplo, cáncer de próstata localizado frente a benigno) se realizó un ANOVA con un análisis a posteriori usando el método de Scheffé (Scheffae y col., arriba). Las puntuaciones de expresión media para todos los casos examinados se presentaron en una forma gráfica usando barras de error con intervalos de confianza del 95%.

B. Resultados

El análisis de matrices de expresión reveló una desregulación significativa de miembros de la familia de las anexinas con progresión de PCA. La expresión del ADNc de las anexinas 1, 2, 4, 7 y 11 fue significativamente reducida en las muestras de PCA resistente al tratamiento hormonal con respecto a muestras de PCA sensible a hormona localizado con una disminución de 2,2, 1,5, 1,3, 1,4 y 1,8 veces, respectivamente (todos los valores de p < 0,01) (Tabla 3 y Figura 33). Las anexinas 1 y 4 mostraron disminución significativa de la expresión de ARNm en muestras de PCA localizado con respecto a muestras benignas. No hubo diferencias significativas entre PCA sin tratamiento previo hormonal localizado y las muestras benignas para anexina 2, 7 y 11. No se observó desregulación de ADNc entre las muestras de próstata probadas y las anexinas 8 y 13. La anexina 6 demostró una ligera disminución en la expresión de ADNc entre muestras de PCA localizado y benignas, que no era estadísticamente significativa (Tabla 3).

Con el fin de validar de forma cruzada los resultados de la expresión de ADNc para estos miembros de la familia de las anexinas se realizó un meta-análisis de expresión génica. Los resultados de la expresión de ADNc de miembros de la familia de las anexinas se evaluaron usando una serie de conjuntos de datos (Welsh y col., Cancer Res. 61:5974 [2001]; Luo y col., Cancer Res. 61:4683 [2001]; Magee y col., Cancer Res. 61:5692 [2001]). El análisis evalúa anexinas para cada uno de los estudios individuales, además de realizar una estadística resumen teniendo en cuenta la significancia de la expresión génica a través de los 4 estudios. El meta-análisis compara diferencias entre tejido de PCA clínicamente localizado y de próstata benigno ya que no todos los estudios tuvieron PCA resistente al tratamiento hormonal metastásico. El meta-análisis (Tabla 4 y Figura 34) demostró que las anexinas 1, 2, 4 y 6 estuvieron significativamente reguladas por disminución a través de estudios independientes. La anexina 6 se reguló por disminución a un nivel significativo en 4 de 4 estudios. La anexina 1 demostró regulación por disminución en 3 de 4 estudios. Las anexinas 2 y 4 se regularon por disminución en 2 estudios y en conjunto se consideró que estaban significativamente expresadas por disminución por el meta-análisis. No se encontró que la anexina 7 estuviera significativamente expresada por disminución en ninguno de los 4 estudios al nivel de transcritos.

Se realizó inmunohistoquímica para confirmar estos resultados al nivel de las proteínas (Tabla 5). Por inmunohistoquímica se identificó una disminución significativa en la expresión de proteínas para las anexinas 1, 2, 4, 7 y 11 en muestras de PCA resistente al tratamiento hormonal con respecto a muestras de PCA localizado con una disminución de 2,5 (mediana de la expresión de 3,8 frente a 1,5), 2,4 (mediana de la expresión de 4 frente a 1,7), 3,6 (mediana de la expresión de 4 frente a 1,1) y 3,3 (mediana de la expresión de 4 frente a 1,2) veces, respectivamente (prueba de Kruskal Wallis, todos los valores de p< 0,05). No se observó diferencia estadísticamente significativa entre muestras benignas y de PCA localizado en ninguna de las anexinas probadas.

Tabla 3: Expresión génica de anexinas seleccionadas

Anexina: Benigna HPB1 PCA loc2 PCA met3 Relación PCA/met Valor de p*

Recuento: Mediana Recuento Mediana Recuento Mediana Recuento Mediana

1: 5 1,56 16 1,35 16 0,69 20 0,31 2,23 <0,001

2: 5 0,79 16 0,69 16 0,74 20 0,49 1,51 0,009

4: 5 0,91 16 0,97 16 0,9 20 0,69 1,30 0,001

6: 5 1,2 16 1,29 16 1,05 20 1,15 0,91 0,377

7: 5 0,8 16 0,88 16 0,88 20 0,62 1,42 <0,001

8: 5 1,14 16 1,06 16 0,99 20 1,19 0,83 0,156

11: 5 0,99 16 0,76 16 0,94 20 0,52 1,81 <0,001

13: 5 1,08 16 1,35 16 1,03 20 0,94 1,10 0,393

* Prueba de Kruskal Wallis. 1, HPB, hiperplasia prostática benigna. 2, PCA loc, cáncer de próstata localizado. 3, PCA met, cáncer prostático resistente al tratamiento hormonal metastásico. Relación PCA/met, relación de expresión de PCA localizado con respecto a PCA resistente al tratamiento hormonal.

Tabla 4: Meta-análisis de estudios de expresión génica de próstata de ADNc para miembros de la familia de las anexinas

Anexina: Presente estudio Welsh y col. Luo y col. Magee y col. Valor de p resumen

6: 0,024 0,0001 0,0001 0,026 0,0001

1: 0,0001 0,031 0,0007 0,23 0,0001

2: NA 0,0001 NA 0,002 0,0001

11: NA 0,010 NA 0,6 0,17

7: 0,25 0,48 0,38 0,088 0,20

4: 0,33 0,023 0,0093 0,58 0,011

13: 0,177 NA 1,00 NA 0,48

8: 0,79 NA 0,104 NA 0,29

Tabla 5: Expresión de proteínas de micromatrices de tejido para anexinas por tipo de tejido

Anexina: Benigna PCA loc2 PCA met3 PCA/MET Valor de p*

Recuento: Mediana Recuento Mediana Recuento Mediana

1: 37 2,59 360 2,45 162 1,46 1,68 <0,001

2: 57 3,95 82 3,62 214 1,47 2,46 <0,001

4: 23 3,65 357 3,96 141 1,57 2,52 <0,001

7: 26 3,77 350 3,97 126 1,32 3,01 <0,001

11: 23 4,00 360 3,99 163 1,30 3,01 <0,001

* Prueba de Kruskal Wallis. 1, HPB, hiperplasia prostática benigna. 2, PCA loc, cáncer de próstata localizado. 3, PCA met, cáncer prostático resistente al tratamiento hormonal metastásico.

Ejemplo 14

Asociación de CtBP con cáncer de próstata - Referencia

5 Este ejemplo describe la expresión de las proteínas 1 y 2 de unión al extremo C (CtBP1 y CtBP2) en cáncer de próstata. Se realizaron análisis de micromatrices, transferencias Western, inmunohistoquímica y análisis estadístico como se describe en los ejemplos anteriores.

Se encontró que el transcrito de CtBP se regulaba por aumento en cáncer de próstata metastásico (Figura 38). Se usaron extractos de tejido para validar este hallazgo al nivel de las proteínas usando un anticuerpo que reconoce

10 CtBP1 y CtBP2 (Sewalt y col., Mol. Cell. Biol. 19:777 [1999]. Los resultados se muestran en la Figura 35. La Figura 35 muestra la expresión de proteínas CtBP en especímenes de PCA. Los extractos de especímenes de próstata seleccionados se evaluaron para la expresión de proteínas de CtBP y PcG por análisis de inmunotransferencia. El nivel de proteínas se igualó en cada extracto antes de la carga y las transferencias se tiñeron con Ponceau S para confirmar carga igual. Como proteína de control se usó �-tubulina.

15 Ambas CtBP se expresaron en exceso en cáncer de próstata metastásico con respecto a cáncer de próstata localizado y tejido benigno. La proteína EZH2 también fue elevada en cáncer de próstata metastásico con respecto a cáncer de próstata localizado o próstata benigna (Figura 35). EED, una proteína PcG que forma un complejo con EZH2, junto con una proteína no relacionada, �-tubulina, no presentó desregulación de proteínas similar. Por tanto, ambos represores transcripcionales (CtBP y EZH2) están erróneamente expresados en cáncer de próstata

20 metastásico.

Para determinar la expresión in situ de CtBP se realizó inmunohistoquímica de secciones de tejido de próstata usando micromatrices de tejido de próstata. Los epitelios prostáticos benignos presentaron exclusivamente tinción nuclear de acuerdo con la función de CtBP como represor transcripcional. Tanto el cáncer de próstata clínicamente localizado como el metastásico también presentaron tinción nuclear. La mayoría de los casos de cáncer de próstata

25 metastásico y una fracción de los casos de cáncer de próstata localizado presentaron tinción citoplásmica distinta de CtBP.

La Figura 36 muestra el análisis de micromatrices de tejido de CtBP en cáncer de próstata que sugiere la localización incorrecta durante la progresión del cáncer de próstata. La expresión de proteínas CtBP media para los tejidos de próstata indicados y compartimento subcelular se resume usando las barras de error con intervalos de 30 confianza del 95%. La Figura 37 muestra el fraccionamiento subcelular de células LNCaP. Los resultados muestran un aumento del nivel de CtBP1 en el citoplasma con respecto al núcleo. CtBP2 se expresa débilmente en las líneas celulares y no es fácilmente evidente. La �-tubulina, que no se expresa en el núcleo, se proporciona como control. La Figura 38 muestra un análisis de Kaplan-Meier de datos de micromatrices de tejido de cáncer de próstata. Los resultados demuestran que la presencia de CtBP citoplásmica puede asociarse a un mal desenlace clínico. La 35 mediana del tiempo de seguimiento para todos los pacientes fue 1 año (oscila de 2 meses a 6,5 años). Durante este tiempo de seguimiento, el 38% de los pacientes desarrollaron una reaparición o elevación de PSA superior a 0,2 ng/ml. Los tumores de próstata de 97 pacientes demostraron expresión de proteínas nucleares casi uniforme para CTBP. La expresión citoplásmica fue variable demostrando 85 de los 97 casos (88%) tinción citoplásmica débil y 12 (12%) expresión de CTBP de moderada a fuerte. Hubo una asociación significativa con el aumento de la intensidad 40 de la tinción citoplásmica de CTBP y la reaparición o presencia de PSA de enfermedad recurrente tras la prostatectomía con un riesgo relativo de 1,7 (análisis de regresión de Cox, p=0,034). Los datos presentados demuestran un análisis de Kaplan-Meier de resultado estratificado por tinción de CTBP citoplásmica negativa/débil y tinción moderada/fuerte. La expresión citoplásmica de CTBP predijo la reaparición incluso cuando se tuvo en cuenta la puntuación de Gleason en un modelo multifactorial, sugiriendo que CTBP es un valor pronóstico de mal desenlace

[riesgo relativo de Gleason 1,4 (p=0,005) y cCTBP rr 1,6 (p=0,042)].

Se ha mostrado que CtBP se une a la óxido nítrico sintasa (NOS), que se cree que desplaza la localización de CtBP del compartimento nuclear al compartimento citoplásmico (Riefler y col., J. Biol. Chem. 276:48262 [2001]). Weigert y colaboradores han propuesto una función citoplásmica para CtBP en la inducción de la fisión de la membrana de Golgi (Weigart y col., Nature 402:429 [1999]). Para soportar adicionalmente los hallazgos inmunohistoquímicos preliminares, células de cáncer de próstata LNCaP (metastásicas) se fraccionaron y se encontró que los niveles de CtBP eran mayores en el citosol con respecto al núcleo (Figura 38).

Ejemplo 15

Procedimientos de caracterización de marcadores de cáncer

Este ejemplo describe a modo de ejemplo procedimientos para la caracterización de nuevos marcadores de cáncer de la presente invención. Estos procedimientos, en combinación con los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores, se usan para caracterizar nuevos marcadores de cáncer e identificar nuevas dianas de diagnóstico y terapéuticas.

A. Determinación de niveles de transcritos de ARNm cuantitativos de marcadores de cáncer en especímenes de cáncer de próstata

En algunas realizaciones, los marcadores que revelaron que estaban expresados en exceso o en defecto en micromatrices de cáncer (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 para una descripción de micromatrices) se cuantifican usando PCR en tiempo real (Wurmbach y col., J. Biol. Chem. 276:47195 [2001]).

En realizaciones preferidas está disponible el ADNc de más de 100 muestras de próstata para muestras de ADNc archivadas y datos clínicos asociados (véase el Ejemplo 1). El nivel de expresión en la micromatriz se compara con el obtenido por PCR en tiempo real. Para identificar genes con desregulación de la expresión se realizan análisis de PCR en tiempo real de ADNc generado a partir de epitelios de cáncer de próstata y epitelios benignos microdiseccionados por captura láser.

B. Detección de transcritos erróneamente localizados

En algunas realizaciones, con el fin de determinar si un marcador de cáncer normalmente presente en el núcleo de una célula (por ejemplo, un represor transcripcional) está erróneamente localizado en el citoplasma (u otras localizaciones erróneas) en cáncer, la expresión del marcador se examina en extractos de tejido de preferentemente al menos 20 muestras de próstata benignas, 20 especímenes de cáncer de próstata y 20 especímenes de próstata metastásica. También se examina la expresión del marcador en líneas de células de la próstata benigna (RWPE), células epiteliales prostáticas primarias (Clonetics, Inc.) y un panel de células de cáncer de próstata que incluye células LNCaP, DU145, PC3, DUCaP y VCaP. Una vez se ha establecido la expresión global de líneas de células de la próstata y tejidos, la localización celular del marcador se determina por 2 procedimientos. En el primer procedimiento, los extractos de células y de tejido se fraccionan en una fracción nuclear y una fracción citosólica (NE-PER, Pierce-Endogen; Orth y col., J. Biol. Chem. 271:16443 [1996]). Entonces, la proteína cuantificada se analiza por inmunotransferencia. Los niveles relativos de marcador de cáncer citosólico y nuclear se determinan por densitometría. Para verificar el limpio fraccionamiento se usan anticuerpos para �-tubulina y PCNA (o lamina A) para evaluar fracciones citosólicas y nucleares, respectivamente.

En el segundo procedimiento, las células se inmunotiñen con anticuerpos para el marcador de cáncer, seguido de detección usando anticuerpo secundario anti-FITC de conejo. La microscopía confocal (U of M Anatomy and Cell Biology Core Facility) se usa para examinar la localización in situ de los marcadores de cáncer.

En algunas realizaciones, la localización incorrecta se investiga adicionalmente por secuenciación del gen en células que contienen el transcrito erróneamente localizado (por ejemplo, casos metastásicos) para mutaciones.

C. Correlación de marcadores de cáncer con desenlace clínico

En algunas realizaciones preferidas se investiga la asociación de expresión o la localización incorrecta de un marcador de cáncer con desenlace clínico. Primero se determina la relación de marcador de cáncer total con respecto a �-tubulina por análisis de inmunotransferencia de extractos de tejido de cáncer de próstata y se asocia a parámetros de desenlace clínico. Para marcadores de los que se sospecha que están erróneamente localizados en cáncer (por ejemplo, CtBP), la relación de marcador citoplásmico con respecto a marcador nuclear se determina a continuación por análisis de inmunotransferencia de extractos de tejido de cáncer de próstata y se asocia a parámetros de desenlace clínico. Por ejemplo, se contempla que una alta relación de marcador de cáncer citoplásmico/nuclear puede presagiar un mal desenlace clínico. En algunas realizaciones (por ejemplo, si se sospecha que un marcador de cáncer está erróneamente localizado), la inmunohistoquímica de micromatrices de tejido de cáncer de próstata se usa para determinar si la presencia del marcador citoplásmico establece una correlación con mal desenlace clínico. Se preparan micromatrices de tejido y se realiza como se describe en los ejemplos anteriores.

Brevemente, se construyen micromatrices de tejido (TMA) de alta densidad como se ha descrito previamente (Perrone y col., arriba; Kononen y col., arriba). La intensidad de la inmunotinción se puntúa por un anatomopatólogo genitourinario como ausente, débil, moderada o fuerte (o alternativamente se analiza por separado como para tinción citoplásmica y nuclear). La puntuación se realiza usando un sistema de telepatología en un modo ciego sin conocimiento de la puntuación de Gleason global (por ejemplo, grado de tumor), tamaño del tumor o desenlace clínico (Perrone y col., arriba). Las muestras tumorales se derivan de pacientes con cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal avanzado clínicamente localizado y PCA metastásico sin tratamiento previo. Los casos de cáncer de próstata clínicamente localizado se identifican del S.P.O.R.E. de próstata de la Universidad de Michigan Tumor Bank. Todos los pacientes se operaron entre 1993 y 1998 para cáncer de próstata clínicamente localizado como se ha determinado por PSA preoperatorio, examen rectal digital y biopsia por punción de próstata. Todos los tejidos usados se recogen con la aprobación del Comité de ética médica. Los tumores de próstata avanzados se recogen de una serie de 23 autopsias rápidas realizadas en la Universidad de Michigan en hombres que murieron de cáncer de próstata resistente al tratamiento hormonal. Se ha informado de los hallazgos clínicos y patológicos de estos casos (Rubin y col., [2000], arriba).

El análisis estadístico de los datos de matrices se usa para establecer una correlación entre las mediciones de la proteína marcadora de cáncer sobre la TMA y los desenlace clínicos tales como tiempo para la reaparición de PSA y tiempo de supervivencia. Este análisis implica procedimientos de análisis de supervivencia para correlacionar las mediciones con estos tiempos de respuesta censurados. Se representan curvas de Kaplan-Meier para fines descriptivos. El análisis unifactorial se realiza usando el modelo de Cox que asocia el biomarcador con el tiempo de supervivencia. Además, el análisis de represión de Cox multifactorial se realiza para probar si el biomarcador añade cualquier información pronóstica o no por encima de la disponible de marcadores pronósticos conocidos (es decir, puntuación de Gleason, fase del tumor, estado del margen, nivel de PSA antes de la cirugía).

D. ARN interferente

En algunas realizaciones, el ARN interferente de marcadores de cáncer se usa para investigar la función del marcador de cáncer en cultivo celular y también para la aplicación como tratamiento terapéutico contra el cáncer (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8 para un ejemplo de ARN interferente). Los ARN de 21 nucleótidos (ACEip-ARNi) se sintetizan por un vendedor comercial (Dharmacon Research, Inc.). El ARN interferente se ha usado en células de mamífero (Elbashir y col., Nature 411:494 [2001]). Se diseñan varios dúplex de ARNip y controles para cada marcador. El diseño del dúplex de ARNip usa criterios proporcionados por Elbashir y col. (Elbashir y col., arriba) y Dharmacon Research que incluyen: empezar con aproximadamente 75 bases en la dirección 3’ del codón de iniciación, localizar un dímero de adenina-adenina, mantener el contenido de G/C aproximadamente al 50% y realizar una búsqueda en BLAST por comparación con bases de datos de EST para garantizar que sólo un gen es elegido como diana. Se diseñan múltiples (por ejemplo, dos) dúplex de ARNip para cada molécula de interés ya que si el dúplex de ARNip es funcional es un procedimiento relativamente empírico. Además, se contempla que usando dos dúplex de ARNip puede proporcionarse un efecto de “silenciamiento” combinado. Como control se diseña un ARNip “mezclado”, en el que se aleatoriza el orden de nucleótidos, para cada molécula de interés. Los oligonucleótidos se compran desprotegidos y se desalan. Tras la recepción, los oligonucleótidos se hibridan para formar un dúplex usando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Para probar la eficacia de cada dúplex de ARNip, líneas de células de la próstata (RWPE, DU145, LnCAP y PC3) se transfectan con el reactivo OLIGOFECTAMINE como se describe (Elbashir y col., arriba). Las células se ensayan para el silenciamiento de genes 48 h después de la transfección por inmunotransferencia con anticuerpos respectivos. Se incluyen varios controles: controles de tampón, oligonucleótido de ARNip sentido solo, oligonucleótido de ARNip antisentido solo, dúplex de ARNip mezclado y dúplex de ARNip dirigido contra proteínas sin relacionar. Si no se aprecia silenciamiento significativo después de una única transfección, se realiza transfección secuencial y la inhibición se monitoriza en momentos de tiempo posteriores (es decir, 8 días después) como se sugiere por otros (Breiling y col., Nature. 412: 51 [2001]). Esto puede ser necesario con proteínas que tienen una larga semivida.

Además de la expresión transitoria de ARNip se usa un procedimiento para la expresión estable de ARNip en células de mamífero (Brummelkamp y col., Science 296:550 [2002]). Se generan líneas de células de cáncer de próstata que expresan ARNip que elige como diana marcadores de cáncer usando el sistema pSUPER. El ARNip mezclado se usa como control. Las líneas celulares facilitan en la dirección 3' la caracterización de marcadores de cáncer que puede ser incómoda usando dúplex transitoriamente. Si se encuentra que la inhibición de un marcador de cáncer específico es tóxica para las células, el casete pSUPER que contiene ARNip para el marcador se clona en un sistema de vector inducible (por ejemplo, Tet encendido/apagado).

E. Generación de mutantes

Para estudiar la función de marcadores de cáncer de la presente invención, los mutantes de marcadores de cáncer se generan en vectores de expresión eucariotas. Las versiones marcadas con el epítope myc de mutantes de marcadores de cáncer se generan en tanto pcDNA3 como pcDNA3-ER (un dominio de unión a ligando de receptor de estrógenos modificado). En el caso de las construcciones de ER, los vectores producen una proteína de fusión en marco con ER modificado, generándose así un vector pos-transcripcionalmente inducible (Littlewood y col., Nucleic Acids Res. 23: 686 [1995]). El dominio del ligando de ER está mutado y fracasa en unirse a estrógeno endógeno, aunque puede activarse por 4-hidroxitamoxifeno (Littlewood y col., arriba). Las proteínas de fusión de ER se inactivan en ausencia de ligando supuestamente debido a la unión de proteínas tales como hsp90. En presencia de 4-hidroxitamoxifeno exógenamente añadido, las fusiones de ER se liberan. Usando un sistema de vector inducible todavía pueden aislarse líneas celulares que expresan una versión “tóxica” o inhibidora del crecimiento de un marcador de cáncer.

Se generan diversos mutantes de deleción del extremo N y extremo C que engloban dominios de función del marcador de cáncer (por ejemplo, PXDLS, deshidrogenasa y dominios de unión a PDZ de CtBP; Chinnadurai, Mol Cell. 9: 213 [2002]). Se contempla que algunas de las versiones de mutante de los marcadores de cáncer de la presente invención actúan de inhibidores negativos dominantes de la función de marcadores de cáncer endógenos. La expresión de marcadores de cáncer marcados con epítope y mutantes se evalúa por transfección transitoria de células renales embrionarias humanas (usando FUGENE) y posterior transferencia Western.

F. Establecimiento de líneas celulares estables que expresan marcadores de cáncer y mutantes

En algunas realizaciones se generan líneas celulares que expresan establemente marcadores de cáncer de la presente invención para su uso en el análisis en la dirección 3'. Se usa FUGEN para transfectar transitoriamente líneas de células de la próstata (RWPE, DU145, LnCAP y PC3) con marcadores de cáncer y fusiones o mutantes usando los vectores anteriormente mencionados y selección con G418 apropiada. Se usan líneas de células de la próstata con niveles de expresión variados de proteína marcadora de cáncer endógena. Se derivan tanto clones individuales como poblaciones agrupadas y la expresión de marcadores de cáncer y mutantes se evalúa por inmunotransferencia para la marca de epítope. Usando un sistema inducible también pueden aislarse clones que expresan versiones tóxicas de marcadores de cáncer o mutantes.

G. Estudios de proliferación celular y apoptosis

En algunas realizaciones, la función de la expresión de marcadores de cáncer en la proliferación de células de la próstata se investiga usando un enfoque de múltiples facetas que incluye 1. ARN interferente, 2. transfección transitoria de marcadores de cáncer y posibles mutantes negativos dominantes, y 3. comparación de transfectantes estables de marcadores de cáncer y mutantes. Las siguientes predicciones se prueban usando estos procedimientos: 1. si la inhibición de marcadores de cáncer bloqueará o no el crecimiento celular y 2. si la expresión en exceso de marcadores de cáncer potenciará o no la proliferación celular.

La proliferación celular se evalúa contando las células (contador Coulter) durante un transcurso de tiempo en cultivo usando el reactivo WST-1 (Roche, Inc.), que es una alternativa no radiactiva a la incorporación de [3H]-timidina y análoga al ensayo de MTT. La tasa de incorporación del colorante de marcado de ADN bromodesoxiuridina (BrdU) también se medirá como se ha descrito previamente (Jacobs y col., Nature. 397:164 [1999]). La posible detención del ciclo celular inducida por ARNip o inhibidores negativos dominantes se determina por procedimientos de citometría de flujo convencionales. Usando líneas celulares estables que “activan” marcadores de cáncer y mutantes en un modo dependiente de 4-hidroxitamoxifeno, las alteraciones de la proliferación celular y el ciclo celular se monitorizan en un sistema in vitro altamente controlado. Para confirmar que la expresión en exceso o la inhibición de marcadores de cáncer no activa la ruta de apoptosis se usan varios ensayos que incluyen tinción con yoduro de propidio de núcleos, ensayo TUNEL y activación de caspasas.

Si se encuentra que un marcador de cáncer es un regulador de la proliferación celular en células de la próstata, se diseñan estudios para tratar cómo los componentes de la maquinaria del ciclo celular se modulan por el marcador de cáncer. Por tanto, con el fin de estudiar efectos mediados por marcadores de cáncer sobre la maquinaria del ciclo celular de células de la próstata, las funciones de marcadores de cáncer se modulan con las herramientas anteriormente mencionadas (es decir, ARNip, inhibición negativa dominante, etc.) y se monitorizan los niveles de expresión (transcrito y proteína) de ciclinas (ciclina D1, E, A), cinasas dependientes de ciclinas (cdk2, cdk4, cdk6) e inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas (p21CIP1, p27KIP1, p45SKP2, p16INK4).

H. Adhesión celular y ensayos de invasión

Si se sospecha que un marcador de cáncer altera la adhesión celular (por ejemplo, la represión transcripcional de un programa de genes epiteliales tal como E-cadherina), los procedimientos descritos anteriormente se usan para investigar si la expresión en exceso del marcador de cáncer produce un aumento o disminución de la adhesión celular. Se prueba la adhesión a los componentes de la matriz extracelular, endotelio de médula ósea humana (HBME), además de a células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se prueban adicionalmente marcadores de cáncer para su capacidad para modular la invasión de PCA.

Se usan procedimientos conocidos en estos estudios (Cooper y col., Clin. Cancer Res. 6:4839 [2000]). Brevemente, placas de cultivo de tejido de 96 pocillos separadas repentinamente se recubren con matrices de hueso y riñón crudo. Las placas se incuban durante la noche a temperatura ambiente bajo condiciones estériles y se guardan a 4ºC hasta que se necesiten. Las placas de ensayo también se recubren con componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno I humano, fibronectina humana, laminina I de ratón) y transferrina humana a diversas concentraciones según la instrucción del fabricante (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Las células endoteliales (HBME o HUVEC) se siembran sobre matrices de hueso o sustratos de plástico a una concentración de 900 células/μl y se cultivan a confluencia. Las células tumorales se sacan del matraz por un tratamiento de 15-20 minutos con EDTA 0,5 mM en solución salina equilibrada con Hank. Una vez se ha eliminado la solución de EDTA, las células se resuspenden en medio de adhesión (por ejemplo, medio esencial mínimo (MEM) con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) complementado con 10 uCi de sal sódica de 51Cr (NEN, Boston, MA)) durante 1 hora a 37ºC. Entonces, las células se lavan tres veces en medio libre de isótopo y 1 x 105 células tumorales marcadas con radio se resuspenden en medio de adhesión y se depositan en capas sobre una capa confluente de células endoteliales durante 30 min a 37ºC. Además, las células tumorales marcadas con radio se aplican a matrices de hueso crudo. De nuevo, las placas se lavan tres veces en solución salina tamponada con fosfato y la adhesión se determina contando pocillos individuales en un contador gamma. La adhesión celular se informa con respecto a la adhesión de controles (células PC-3 sobre plástico), que se fija a 100.

Los ensayos de invasión celular se realizan usando un ensayo de cámara de Boyden clásico. Se evalúan tanto estrategias para inhibir como para expresar en exceso marcadores de cáncer. Informes previos han establecido una relación entre un aumento de la migración de células en un sistema de cámara de Boyden con un aumento de las propiedades invasivas in vivo (Klemke y col., J Cell Biol. 140:61 [1998]. Se usan cámaras de invasión de 24 pocillos comercialmente disponibles (por ejemplo, BD Biosciences, Chemicon International).

I. Supresión transcripcional en células de cáncer de próstata

En algunas realizaciones se evalúa el efecto de los marcadores de cáncer sobre el silenciamiento de genes en células de la próstata. El silenciamiento de genes se ensaya de varias formas. Primera, las alteraciones de la expresión génica inducidas por transfección transitoria de marcadores de cáncer y mutantes en líneas de células de la próstata (RWPE, DU145, LnCAP y PC3) se ensayan usando FUGENE. Doce a 48 horas después de la transfección, las células se recogen y una parte se procesa para confirmar la expresión de los transfectantes por inmunotransferencia. Usando células transfectadas con vector como muestra de referencia, el ARN total de células transfectadas se evalúa entonces en micromatrices de ADNc de 20K.

Además de transfecciones transitorias se generan líneas celulares estables que expresan en exceso marcadores de cáncer y mutantes de marcadores de cáncer. Los patrones de expresión génica de líneas celulares que expresan marcadores de cáncer y mutantes de marcadores de cáncer se comparan con controles del mismo vector con el fin de identificar un gen o grupo genes que sea reprimido por un marcador de cáncer dado. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, se contempla que genes identificados como reprimidos por un marcador de cáncer dado aumentarán (desrreprimirán) tras el silenciamiento del marcador de cáncer (por ejemplo, por inhibición de ARNip).

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para caracterizar tejido de próstata in vitro o ex vivo que comprende:

a) proporcionar una muestra de tejido de próstata de un sujeto; b) detectar un nivel de expresión de un marcador en dicha muestra; y c) caracterizar dicha muestra de tejido de próstata, en el que dicho marcador comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, en el que dicha muestra de tejido de próstata se caracteriza como cáncer de próstata cuando dicho nivel de expresión es elevado con respecto a un tejido de próstata no canceroso.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos es un ARNm.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha detección comprende exponer dicho ARNm a un ácido nucleico que se hibrida específicamente con dicho ARNm.
4.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende detectar dicho polipéptido.
5.

El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha detección comprende exponer dicho polipéptido a un anticuerpo específico para dicho polipéptido y detectar la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido.
6.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho tejido de próstata es de un sujeto humano.
7.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha muestra comprende tejido tumoral.
8.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha caracterización de dicha muestra de tejido de próstata comprende identificar una fase de cáncer de próstata en dicha muestra de tejido de próstata.
9.

El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha fase se selecciona del grupo que consiste en neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, hiperplasia prostática benigna, carcinoma de próstata y carcinoma de próstata metastásico.
10.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además la fase de c) proporcionar un pronóstico para dicho sujeto.
11.

El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho pronóstico comprende un riesgo de desarrollar cáncer de próstata metastásico.
12.

Un procedimiento de cribar compuestos que comprende:

a) proporcionar

i) una muestra de células de la próstata; y ii) uno o más compuestos de prueba; y

b) poner en contacto dicha muestra de células de la próstata con dicho compuesto de prueba in vitro o ex vivo; y c) detectar un cambio en la expresión de un marcador en dicha muestra de células de la próstata en presencia de dicho compuesto de prueba con respecto a la ausencia de dicho compuesto de prueba, en el que dicho marcador es una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos.
13.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho ácido nucleico es un ARNm.
14.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha detección comprende detectar dicho polipéptido.
15.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto de prueba comprende un compuesto antisentido.
16.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto de prueba comprende un fármaco.
17.

Un modulador para inhibir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 95, o un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico en una célula para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata, en el que dicho modulador se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un dúplex de ARN y un fármaco.