KR20170071525A - 중간엽 줄기세포를 구별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 중간엽 줄기세포(MSC)를 구별하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에서는 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC 집단의 순도를 증가시키는 방법이 제공된다. 추가로, 본원에서는 염증성 환경에서 더 반응성인 MSC 집단을 단리시키는 방법이 제공된다. 상기 방법들은 각각 EphA2의 마커에 의해서 세포를 분류하는 단계를 포함한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 태반-관련 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)를 구별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 태반-관련 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC 집단의 순도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 염증성 환경에서 더욱 반응성인 MSC 집단을 단리하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
중간엽 줄기 또는 간질 세포(MSC)는 섬유모세포-유사 형태를 갖는 배아 중배엽 기원의 다능성 세포이다. 이들 세포는 자극 및 배양 조건에 따라서 다른 세포 타입 중에서도 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경 계통 세포(neural lineage cell), 및 근세포로 분화할 수 있다. 비록, hMSC의 가소성 및 조직 복구 및 재생에서의 이들의 역할이 광범위하게 연구되었지만, 그것은 최근에 가장 관심을 받고 있는 이들의 면역학적 영양 특성이다[50-51]. 인간 중간엽 줄기세포는 다양한 조직으로부터 단리되었다. MSC의 가장 흔하게 사용되는 공급원은 골수(BM)이다. 그러나, 단리 절차가 극도로 침습적이다. 침습적 단리 절차를 피하기 위해서, 인간 탯줄 및 태반과 같은 조직이 양호한 후보로 고려되었는데, 그 이유는 이들이 출산 후에 일반적으로 폐기되기 때문이다. 탯줄 또는 태반으로부터의 hMSC의 단리는 이전의 연구에 의해서 효율적인 것으로 입증되었다[49].
MSC는 중간엽 조직에 함유된 간질 세포의 더욱 복잡한 세포 조성의 부분모집단(subpopulation)이다. 이질적 본질 및 중간엽 줄기세포에 특이적인 공지된 바이오마커의 부재로 인해서, MSC 표현형 및 특성을 정의하는 것이 도전적인 과제이다[52-54]. MSC 기능들의 원인인 분자 성분, 특히, 혈장 막에 대한 것들은 대체로 알려져 있지 않다. 또한, 특이적 세포 표면 마커의 결여가 세포 배양을 다른 세포 유형, 특히, 반대로 중간엽 조직에 풍부한 섬유모세포와 같은 성숙한 간질 세포에 의한 잠재적인 오염 위험에 처하게 한다[52-54]. 태반-유래된 조직으로부터의 MSC의 단리 과정에서, 섬유모세포, 태반-유래된 상피 세포, 및 태반-유래된 망상 세포를 포함한 비-MSC는 흔히 시험관내 배양 동안에 MSC와 동시-존재한다. 특히, 섬유모세포는 오염의 주된 공급원이다.
섬유모세포는 연결조직에 특히 풍부한 성숙한 중간엽 세포인 것으로 여겨진다. 따라서, 이들 세포는 많은 세포 배양 시스템에 존재하는 가장 빈번한 오염 세포 표현형이다. 배양물로부터 섬유모세포를 성공적으로 제거하는 기술을 적용하기가 어려울뿐만 아니라, 동일한 배양물에서 섬유모세포로부터 MSC를 구별하기가 또한 특히 복잡하다. 섬유모세포 및 MSC는 극히 유사한 형태학적 외관을 지니고 있고; 이들은 둘 모두가 잘 증식하며 많은 동일한 세포 표면 마커를 공유한다[55, 56]. MSC는 현재 International Society of Cellular Therapy(ISCT)에 의해서 조혈 마커 CD14, CD34 및 CD45에 대해서 CD73, CD90, CD105 및 음성을 발현하는 가소성 부착, 다능성 섬유모세포-유사 세포로서 정의된다. 그러나, 이들 특성 및 마커는 또한 섬유모세포에 의해서 공유된다. 따라서, ISCT에 의해서 제안된 현재의 정의는 포괄적인 섬유모세포로부터의 MSC를 구별할 수 없다. 현재까지, 섬유모세포로부터 MSC를 구별하는 최상의 방법은 이들 두 종류의 세포의 기능적 특성의 분석을 기반으로 하고 있고; MSC는 다능성 줄기세포능 및 면역조절 성능을 보유하는 반면에, 섬유모세포는 이들 기능적 특성의 둘 모두에서 더 제한된 듯하다.
MSC의 동정에서의 Friedenstein의 선구자적인 업적 이래로, 섬유모세포로부터 생체외 배양-팽창된 MSC를 일관되게 그리고 명백하게 구별하는 배양-유도 방법학, 형태학 및 유전자 발현 특징에서의 특별한 차이가 없다[57-60]. 현재, 섬유모세포로부터 MSC를 분리하기 위한 용인된 기준 또는 단일 세포-표면 마커가 없다. 섬유모세포가 태반에서 유래되는 때의 MSC 배양물에서 공통의 오염 세포 집단이라는 사실로 인해서, 섬유모세포로부터 MSC를 구별하기 위한 바이오마커로서의 신규한 표면 단백질이 태반-유래된 MSC의 일차 배양물의 균질성을 확실히 하기에 중요하다.
인간 에리트로포이에틴-생성 간세포(human erythropoietin-producing hepatocellular: Eph) 수용체는 가장 큰 패밀리(largest family)의 수용체 티로신 카나아제(receptor tyrosine kinase: RTK)를 포함하는 경막 단백질을 포함한다. Eph 수용체의 첫번째 동정된 기능은 액손 안내에서의 복잡하고 세련된 기전에서의 이들의 역할이었다[4]. Eph 수용체는 배아 발생 및 현재 암 및 혈관 복잡화와 같은 병리 조건 동안의 세포 위치설정 및 조직 패턴화에서 연루된 넓은 범위의 세포-투-세포 통신 사건(cell-to-cell communication event)을 조절하는 것으로 공지되어 있다[1-5]. 또한, 이들 수용체는 시냅스 가소성, 인슐린 분비, 골 재형성, 상피 항상성뿐만 아니라, 염증 및 면역 반응에서 분화된 세포 기능의 중요한 조절자이다[1, 2, 6]. 이들은 뉴런, 혈관 세포, 상피 세포, 염증 세포, 면역 세포, 및 암 줄기세포를 포함한 종양 세포와 같은 광범위하게 다양한 세포 유형에 의해서 발현된다[7-10].
EphA2 유전자는 단백질-티로신 키나아제 패밀리의 Eph 수용체 서브패밀리에 속한다. 이전의 연구는 발생 사건을 매개하는데 있어서, 특히 신경계에서의 EphA2의 기능과 연구되었다[4]. 발생 동안에, EphA2는 패턴 형성의 독특한 양태에서 기능하고, 후속적으로, 혈관형성, 신경관 발생, 축성 중배엽 형성, 조기 마름뇌 형성(early hindbrain development), 뉴런 분화, 세포 이동의 조절, 파골세포형성(osteoclastogenesis) 및 골아세포형성(osteoblastogenesis)의 조절을 통한 골 재형성, 유선 상피 세포 증식 및 유선 발생 동안의 분지적 형태발생(branching morphogenesis)을 포함한 몇몇의 태아 조직의 발생에서 기능한다[11]. 특히, 뉴런이 정확한 표적에 도달하도록 액손을 보내는 과정을 포함한, 신경계 배아 발생에서의 EphA2의 역할은 잘 정의되어 있다[12].
Eph 수용체의 역할은, 배아 발생 동안에와 성숙한 줄기세포 적소에서의 둘 모두에서, 최근에서야 줄기세포 생물학에 연루되었다. Eph 수용체는 대부분의 성숙한 줄기세포 적소에서 발현된다. 줄기세포는 분화된 조직 장소 내의 줄기세포 풀(stem cell pool)의 자기-재생 및 분화를 조정하는 세포 및 미세 환경적 결정자의 조합으로서 정의된 분화된 미세환경, 적소에 위치된다. 배아 발생 및 조직 항상성 동안의 Eph 수용체 및 ephrin 리간드의 발현은 발생 동안 그리고 성숙한 조직 항상성에서의 줄기세포 조절에서의 이들의 연루와 일치한다[13, 15]. Eph/ephrin 시스템이 줄기세포 침묵, 자기-재생 및 분화 사이의 균형에서 시공간적 조절 기능(spatio-temporal regulatory function)을 수행하는 것으로 제안되었다[14]. 그러나, 줄기세포 적소 유지에서의 Eph의 기전 및 줄기세포를 조절하는데 있어서의 이의 역할은 잘 이해되지 않는다. EphA2는 배아 줄기세포에서 고도로 발현된다[16]. 그럼에도 불구하고, 줄기세포에서의 EphA2 기능 연구 대부분은 신경계에 대해서 촛점이 맞춰져 있다. 뉴런 및 신경교 계통에서의 전구체를 포함한, EphA2는 CNS에서 고도로 발현된다[12, 15]. 최근의 연구는 ephrin-A1이 EphA2-양성 심장 줄기세포의 이동성을 촉진하여, 심근 경색 후의 향상된 재생 및 심장 기능을 유도한다는 증거를 제공한다[17]. 이들 발견 외에, 줄기세포 과학에서의 EphA2의 발현 프로필 및 기능은 아직 잘 밝혀지지 않았다.
Eph 수용체 및 ephrin 리간드는 줄기세포/간세포의 자기-재생 및 종양 진행 둘 모두를 조절한다[14]. 비변형 줄기세포/간세포와 암 세포 사이의 고도의 유사성이 또한 알려져 있다. 근래에, 최대 25%의 암 세포 집단을 포함하는, "암 줄기세포" 컴파트먼트("cancer stem cell" compartment)가 잠복된 다양한 암의 개념이 설명되었다[14]. 이들 세포는 동물 숙주에서 종양을 유도하고, 자기-재생하며, 팽창하는 종양 세포 덩어리에서 더 분화된 세포를 발생시키는 이들의 능력 때문에 종양-전파 세포(tumor-propagating cell: TPC)로 정의되었다[14]. 최근에는, Eph/ephrin 신호는 암 세포 탈분화 및 줄기-유사 특성의 조절과 연관되었다[9, 18, 19]. 그러나, 암 줄기세포는 실제로 관련 기술에서 일반적으로 일컬어지는 (다능성) "줄기세포"가 아님을 주지해야 한다.
특이적 ephrin 리간드의 하향-조절과 결부된 Eph의 과발현이 몇몇의 암에서 보고되었고 종양 공격 및 더 높은 등급과 연관되었다[19-22]. EphA2 발현은 유방암, 난소암, 및 폐암뿐만 아니라, 신경아교종 및 흑색종에서 상승되며, EphA2의 높은 수준은 불량한 환자 생존율과 관련된다[20, 23-29]. 그러나 암세포에서의 Eph 수용체의 역할 및 발현은 절대적으로 맥락-의존적(context-dependent)이다. 역 발현 패턴이 또한, 후생 침묵(epigenetic silencing) 또는 돌연변이를 통한 낮은 Eph 수용체 발현이 불량한 예후와 연관되는, 유방암, 결장직장암, 및 급성 림프성 백혈병을 포함한 일부 종양에서 발견되었다[30]. 다수의 인간 부신피질 암종, 선종 및 건강한 부신피질 조직에 의한 전사 관련 정보 수집의 연구에서, EphA2 발현은 건강한 부신 피질 조직과 비교할 때 인간 부신 피질 종양 조직에서 하향-조절되었다[31]. 그런 이유로, 비록, 특정의 Eph 및 ephrin의 발현 패턴은 많은 종양 발생 경우에서 전조 마커로서 작용할 수 있지만, 실질적인 양의 연구 보고서에서의 역 현상이 또한 관찰되었다. Eph/ephrin의 발현은 임계적으로 세포/종양-맥락-특이적 및 맥락-의존적이다.
아교모세포종(glioblastoma: GBM)에 대한 최근의 연구는 TPC의 큰 서브-집단이 잠복된 종양이 EphA2 및 EphA3의 증가된 발현을 입증함을 나타냈다. EphA2 수용체가 인간 아교모세포종 암 줄기세포(CSC)에서 과발현되고, EphA2 발현이 이러한 특이적 유형의 종양에서 CSC의 크기 및 종양-개시 능력과 긍정적으로 관련되어 있다[9]. 이들 Eph 수용체는 중추 신경계 발생을 조절하는 반면에, 이들의 탈조절된 발현 및 체세포 돌연변이는 신경계 종양의 성장, 진행 및 전이와 관련되어 있다[32-36].
다른 한편으로, GBM, 결장직장암, 유방암, 전립선암 및 피부암에서의 종양 억제 효과를 지니는 EphA 신호전달의 리간드-의존적 활성화가 또한 보고되었다[27, 38-43]. 실질적인 GBM 연구에서, ephrinA1에 의한 EphA2 키나아제의 활성화는, 가능하게는 EphA2 및 FAK 활성의 하향-조절을 통해서, 항-증식 효과를 갖는 것으로 보고되었다[27, 38, 44]. EphA2 녹아웃 마우스는 증가된 종양 세포 증식 및 ERK 포스포릴화를 나타낸다[45]. EphA2의 리간드 자극이 또한 감소된 세포 증식 및 이동과 연관되는 EGF-매개된 ERK 포스포릴화를 감쇠시킨다[46, 47]. 모두 합쳐, 흥미롭게도, 이들 발견은 종양 성장-억제 및 침습-억제 EphA2/ephrinA1 신호전달을 뒷받침한다. ephrin-Eph 상호작용의 결과가 상이한 맥락으로 두드러지게 갈라진다.
2012년에 Vescovi 그룹에 의해서 공개된 연구 논문[9]은 (1) hGBM에서의 줄기-유사 종양-전파 세포(tumor-propagating cell: TPC)가 EphA2 수용체를 고도로 발현하고, (2) 높은 EphA2 발현은 TPC에서의 미분화된 상태 및 자기-재생을 뒷받침하고, (3) TPC 함량 및 종양형성이 EphA2[Low] hGBM 세포보다 EphA2[High]에서 더 높다는 것을 입증하고 있다. 상기 기재된 관찰 사실에도 불구하고, EphA2[Low] hGBM는 여전히 유의한 종양-개시 능력을 가지고 있다. EphA2이 상이한 종양 또는 상이한 유형의 세포에서는 고사하고 hGBM에서도 진정한 TPC 마커를 제시하는지를 논의해볼 수 있다. 달리 설명하면, 당업자는 EphA2가 TPC에 대한 특이적 및 보편적 마커이며, 다능성 줄기 세포에 대해서는 훨씬 덜 특이적 및 보편적 마커라는 것을 알지 못할 것이다. 동일한 그룹이 또한 줄기세포, 바람직하게는, 포유동물 줄기세포, 더욱 특히, 인간 또는 마우스 줄기세포의 동정 및 단리를 위한 세포 표면 마커로서 EphA2의 사용을 청구하는 특허출원을 하였다 [37, EP 2733206 A1]. 그러나, Vescovi의 연구가 인간 아교모세포종(hGBM)에 전적으로 그리고 유일하게 촛점을 맞췄다는 것과 EphA2[Low] hGBM가 여전히 유의한 종양-개시 능력을 가지고 있다는 사실을 때문에, 당업자는 EphA2가 다능성 줄기세포를 동정하는데 특이적 마커 성분이라는 것을 결코 인식하지 못할 것이다. 추가로, Vescovi는 또한 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 다능성 줄기세포를 구별하는 방법에 대해서는 언급이 없다.
발명의 간단한 요약
중간엽 줄기세포(MSC)가 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 특정의 표면 마커, 즉, EphA2의 이들의 발현 수준을 기반으로 하여 구별될 수 있다는 것이 본 발명에서 예상치 못하게 밝혀진다.
따라서, 본 발명은 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC를 구별하는 방법으로서. EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC 집단의 순도를 증가시키는 방법으로서, EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 제공한다.
추가의 양태로, 본 발명은 염증성 환경에서 더욱 반응성인 MSC 집단을 단리시키는 방법으로서, EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 섬유모세포, 태반-유래된 상피 세포, 태반-유래된 망상 세포, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 집단으로부터 MSC를 구별하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 방법은 섬유모세포로부터 MSC를 구별하기 위해서 사용된다.
본 발명에 따르면, 태반-관련된 조직은 양막, 융모막 디스크(chorionic disk), 융모막, 및 탯줄로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 분류 단계는 공지된 또는 본 기술분야에서 개발되는 기술, 예를 들어, 항체-기반 또는 누클레오티드-기반 단리 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포는 MSC를 위한 배양 배지에서 배양된다.
특정의 실시형태에 따르면, 단리된 MSC 집단은 TNF-α 신호전달 또는 TNF-α-의존성 신호전달에 더욱 반응성이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 본 발명을 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 상기 요약뿐만 아니라, 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 결부시켜 읽는 때에 더욱 우수하게 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 현재 바람직한 도면 구체예로 나타내어져 있다.
도면에서,
도 1은 EphA2 전사물의 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 정량화를 나타낸다. 태반-유래된 MSC에서의 EphA2의 전사 수준은 섬유모세포에서의 EphA2의 발현과 비교한 농축 배수(fold enrichment)에 의해서, 즉, MSC에서의 EphA2 mRNA 수준 대 섬유모세포에서의 EphA2 수준(MSC/섬유모세포)의 비교에 의해서 평가되었다. MSC에서의 EphA2의 전사 수준은 공여자 #12, #17, #21 및 #28로부터의 샘플에 의해서 입증되었다. 결과는 EphA2가 시험관내 섬유모세포에 비해서 MSC에서 고도로 농축되었음을 나타냈다. D= 공여자. AM= 양막; CD= 융모막 디스크; CM= 융모막; 및 UC= 탯줄. BS= 소 태아 혈청. P1= 통로1. P3= 통로3.
도 2는 MSC 및 섬유모세포의 혼합된 집단의 흐름 세포측정 분석(Flow Cytometry analysis)의 결과를 나타낸다. 공여자 #23으로부터의 탯줄(UC)로부터 유래된 MSC가 상이한 비율로 섬유모세포와 혼합되었다. 결과는 흐름 세포측정법에 의해서 검출된 EphA2+ 집단의 백분율이 증가된 섬유모세포 집단에 대한 반응에 비례적으로 감소했음이 입증되었다. FB= 섬유모세포.
도 3은 qPCR에 의해서 평가된 EphA2 RNA 수준을 나타낸다. 상이한 개별적 세포 집단에서의 전체 RNA 발현 수준이 내인성 GAPDH 발현 수준에 의해서 정규화되었다. "스크램블(Scramble)"은 shRNA 녹다운 실험(shRNA knockdown experiment)에서의 스크램블 대조군으로서 표현된다. 보통의 야생형 UC-유래된 MSC에서의 EphA2 전사 발현 수준과 비교함으로써, qRT-PCR 결과가 sh-EphA2 녹-다운 효율을 확인시켰다. D= 공여자. UC= 탯줄.
도 4a 및 도 4b는 트랜스-웰 이동 분석(trans-well migration assay) 및 세포 생존율 검출(cell viability detection)의 결과를 나타낸다. 도 4a에서, 생존 이동 세포는 CellTiter-Glo® 발광 신호 세기로서 표현된다. 도 4b에서, 생존 이동 세포는 0.2% FBS 대조군에서의 야생형 MSC에 비한 상대적인 비율로서 표현된다.
도면에서,
도 1은 EphA2 전사물의 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 정량화를 나타낸다. 태반-유래된 MSC에서의 EphA2의 전사 수준은 섬유모세포에서의 EphA2의 발현과 비교한 농축 배수(fold enrichment)에 의해서, 즉, MSC에서의 EphA2 mRNA 수준 대 섬유모세포에서의 EphA2 수준(MSC/섬유모세포)의 비교에 의해서 평가되었다. MSC에서의 EphA2의 전사 수준은 공여자 #12, #17, #21 및 #28로부터의 샘플에 의해서 입증되었다. 결과는 EphA2가 시험관내 섬유모세포에 비해서 MSC에서 고도로 농축되었음을 나타냈다. D= 공여자. AM= 양막; CD= 융모막 디스크; CM= 융모막; 및 UC= 탯줄. BS= 소 태아 혈청. P1= 통로1. P3= 통로3.
도 2는 MSC 및 섬유모세포의 혼합된 집단의 흐름 세포측정 분석(Flow Cytometry analysis)의 결과를 나타낸다. 공여자 #23으로부터의 탯줄(UC)로부터 유래된 MSC가 상이한 비율로 섬유모세포와 혼합되었다. 결과는 흐름 세포측정법에 의해서 검출된 EphA2+ 집단의 백분율이 증가된 섬유모세포 집단에 대한 반응에 비례적으로 감소했음이 입증되었다. FB= 섬유모세포.
도 3은 qPCR에 의해서 평가된 EphA2 RNA 수준을 나타낸다. 상이한 개별적 세포 집단에서의 전체 RNA 발현 수준이 내인성 GAPDH 발현 수준에 의해서 정규화되었다. "스크램블(Scramble)"은 shRNA 녹다운 실험(shRNA knockdown experiment)에서의 스크램블 대조군으로서 표현된다. 보통의 야생형 UC-유래된 MSC에서의 EphA2 전사 발현 수준과 비교함으로써, qRT-PCR 결과가 sh-EphA2 녹-다운 효율을 확인시켰다. D= 공여자. UC= 탯줄.
도 4a 및 도 4b는 트랜스-웰 이동 분석(trans-well migration assay) 및 세포 생존율 검출(cell viability detection)의 결과를 나타낸다. 도 4a에서, 생존 이동 세포는 CellTiter-Glo® 발광 신호 세기로서 표현된다. 도 4b에서, 생존 이동 세포는 0.2% FBS 대조군에서의 야생형 MSC에 비한 상대적인 비율로서 표현된다.
본 발명은 표면 마커 EphA2에 의한 세포 분류를 통해서 중간엽 줄기세포(MSC)가 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 구별될 수 있다는 예측하지 못한 발견을 기반으로 한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 태반-관련된 조직로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC를 구별하는 방법으로서, EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC 집단의 순도를 증가시키는 방법으로서, EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
EphA2-분류된 MSC는 미분류된 MSC 또는 MSC 유사 세포에 비해서 염증성 환경에서 우수한 반응성을 나타냄이 또한 입증된다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 염증성 환경 또는 미세환경에서 더욱 반응성인 MSC 집단을 단리시키는 방법으로서, EphA2의 표면 마커에 의해서 세포를 분류함을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 가지 실시형태에서, 단리된 MSC 집단은 TNF-α 신호전달 또는 TNF-α-의존성 신호전달에 더욱 반응성이다.
MSC들은 다양한 시토카인에 의한 활성화 후의 T- 및 B-세포 반응을 억제시킴으로써 면역억제 기능을 입증하고 있다. 이들은 또한 TNF-α 및 IFN-γ의 작용으로 인한 급성 염증성 환경의 존재하에 전-염증 효과(pro-inflammatory effect)를 발휘하도록 유도될 수 있다. 류마티스 관절염과 같은 염증성 관절 질환에서, 골수 중의 MSC가 TNF-α-의존성 기전에 의해서 관절로 이동하고 부분적으로 질환 과정의 원인일 수 있다. MSC는 또한 골관절염에서의 관절주위 조직에서의 증가된 수를 입증했으며, 이는 관절 복구 또는 재생의 시도를 반영할 수 있다[6]. 염증성 환경에서 방출된 TNF-α가 MSC의 TNF-R1에 결합하고 MSC에서의 NF-κB 경로를 활성화시킴으로써 면역억제 특성을 MSC에 부여하여 MSC를 염증조절에서 역할을 발휘한다는 것이 제안되었다[62].
본 발명에 따르면, 세포는 본 기술분야에서 공지된 원안, 예를 들어, Fukuchi 등의 원안에 따라서 태반-관련된 조직으롭터 새롭게 유래되거나, 얻거나, 수집된다. 특정의 바람직한 실시형태에서, 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포는 이어서 MSC를 위한 배양 배지에서 배양된다. MSC를 위한 표준 배지는 (상이한 변형 버전을 갖는) 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), 소태아 혈청(FBS) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 포함한다[49, 64-68].
본 발명에 따르면, 방법은 섬유모세포, 태반-유래된 상피 세포, 태반-유래된 망상 세포 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 집단으로부터 MSC를 구별하기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 섬유모세포로부터의 MSC를 구별하기 위해서 사용된다.
태반-관련된 조직은 양막, 융모막 디스크, 융모막, 및 탯줄로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물의 배양물이 EphA2에 의한 세포 분류에 주어진다. 세포 분류는 공지된 또는 본 기술분야에서 개발되는 기술, 예를 들어, 항체-기반 또는 누클레오티드-기반 단리 방법을 통해서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분류는 항체-기반 자기 세포 분류에 의해서 수행된다. 예를 들어, MACS 방법(MACS® Technology, Miltenyi Biotec). 또한, 세포 분류는 흐름 세포측정 방법, 예를 들어, 항체-기반 또는 누클레오티드-기반 흐름 세포측정법을 통해서 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, "반응성"은 TNF-α 신호전달 또는 TNF-α-의존성 신호전달을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 염증 관련된 신호전달 경로에 반응하는 MSC의 세포 거동(예, 이동성)을 나타낸다.
본 발명은 추가로 제한하기보다는 입증을 목적으로 제공되는 하기 실시예에 의해서 예시된다.
실시예
실시예
1: 태반-
유래된
중간엽
줄기세포(
MSC
) 및
섬유모세포의
면역 표면형 특성화
만삭 태반(n=8)을 공여자로부터 서면 동의를 얻은 후에 수집하였다. MSC는 양막(AM), 융모막 디스크(CD), 융모막(CM), 및 탯줄(UC)로부터 유래되었다. 태반-유래된 세포를 37℃, 포화된 습도 및 5% CO2에서 FBS와 염기성 FGF를 함유한 α-MEM에서 배양하고, 팽창시키고, 유지시켰고, 세포가 80% 컨플루언스(confluence)에 도달된 때에 서브-배양한 후에, 흐름 세포측정법에 의해서 표현형적으로 특성화시켰다. 흐름 세포측정에 주어진 면역염색의 과정에서, 세포를 제조자 지시에 따른 항체와 함께 인큐베이션하였다. 상응하는 부류의 비특이적 IgG가 음성 대조군을 역할을 했다. 세포 현탁액을 Flowjo 7.6.1가 구비된 흐름 세포측정기(flow cytometer)(BD Biosciences FACSCanto II)상에서 분석하였다.
본 발명자들은 CD11b, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, HLA-DR, 및 EphA2의 발현을 분석하였다. 태반의 다양한 위치로부터 단리된 모든 MSC의 흐름 세포측정 분석이 CD73, CD90, CD105, EphA2에 대해서 양성이었고, CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR에 대해서 음성이었다. 섬유모세포(인간 포피 섬유모세포, 신생아, PC501A-HFF, SBI)의 흐름 세포측정 분석은 CD73, CD90, CD105에 대해서 양성이었고, CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR에 대해서 음성이었고, EphA2에 대해서 음성이거나 낮았다. 독특한 패턴이 태반-유래된 MSC와 섬유모세포 사이의 EphA2에 대해서 주지되었다: MSC는 높은 백분육의 EphA2-양성 세포를 나타낸 반면에, 섬유모세포는 역전을 나타냈다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
표 1: 태반-유래된 중간엽 줄기세포와 섬유모세포의 면역표현형(흐름 세포측정에 대한 양성 세포의 백분율)
AM= 양막; CD= 융모막 디스크; CM= 융모막; 및 UC= 탯줄. 음성 칵테일(Negative Cocktail)은 CD11b, CD19, CD34, CD45, 및 HLA-DR에 대항하는 항체를 포함한다(Human MSC Analysis Kit, BD Stemflow™, 카탈로그 번호 562245). 태반-유래된 중간엽 줄기세포의 면역표현형은 P0에서 공여자 #12 및 공여자 #17로부터의 샘플에 의해서 입증되었다. 흐름 세포측정 분석은 MSC의 집단이 P0에서 9.3~99.7% CD73 양성, 77.8~99.8% CD90 양성, 75.9~98.0% CD 105 양성, 및 45.0~80.7% EphA2임을 나타냈다. 대조적으로, CD11b, CD19, CD34, CD45 및 HLA-DR와 같은 조혈 세포 계통-특이적 마커는 MSC에서 발현되지 않았다. 섬유모세포의 흐름 세포측정은 집단이 99.3% CD73 양성, 97.7% CD90 양성, 75.6% CD 105 양성, 및 18.6% EphA2 양성이었고; CD11b, CD19, CD34, CD45 및 HLA-DR와 같은 조혈 세포 계통-특이적 마커는 섬유모세포에서 발현되지 않았다는 것을 나타냈다.
실시예
2:
EphA2
-분류된 태반-
유래된
중간엽
줄기세포(
MSC
)의 면역표현형 특성화
a. 자기-활성화된 세포 분류(magnetic-activated cell sorting: MACS)에 의해서 분류된 EphA2-농축된 MSC의 흐름 세포측정 분석
MACS 방법MACS® Technology, Miltenyi Biotec)은 세포가 EphA2 표면 항원에 대항하는 항체로 코팅된 자기 나노입자와 함께 인큐베이션시킴으로써 분리되게 한다. 태반으로부터 유래된 MSC의 일차 배양물을 EphA2에 대항하는 형광 건쥬게이트된 항-인간 항체(fluorescence conjugated anti-human antibody)와 함께 인큐베이션하고, 제조자의 지시에 따른 R-피코이리트린(PE) 자기 입자(R-Phycoerythrin Magnetic Particle)에 의해서 분류하였다. P0에서의 MACS 분류된 MSC의 흐름 세포측정 분석은 세포 집단이 통로 0 이래로 100% CD73 양성, 97.2~99.5% CD90 양성, 96.0~99.9% CD 105 양성 및 96.6~100% EphA2 양성 발현에서 균질하게 되어(이하 표 2 참조), 항체 컨쥬게이트된 자기 비드를 통해서 분류되는 EphA2가 PO로부터 MSC 순도를 극적으로 개선시킬 수 있음을 입증함을 나타냈다. 농축된 EphA2-양성 MSC 집단은 추후 통로에 대한 시험관내 팽창을 잘 유지할 수 있다(이하 표 3 참조).
표 2: PO에서의 EphA2-분류된 태반-유래된 MSC의 면역표현형 특성화(흐름 세포측정에 대한 양성 세포의 백분율)
EphA2-분류된 MSC의 면역표현형 특성화가 P0에서의 공여자 #17로부터의 융모막 디스크(CD)로부터 유래된 MSC에 의해서 특성화되었다. 결과는 EphA2-양성 세포가, 또한, CD73 양성, CD90 양성 및 CD105 양성이었음을 나타냈다. D= 공여자. P= 통로.
표 3: 시험관내 팽창 동안의 EphA2-MACS-농축된 집단의 면역표현형 특성화(흐름 세포측정에 대한 양성 세포의 백분율)
추후 팽창에서의 EphA2-분류된 MSC의 면역표현형 특성화. 면역표현형은 공여자 #17로부터의 융모막 디스크(CD)로부터 유래된 MSC에 의해서 입증되었다. MSC를 P0에서의 EphA2-항체-컨쥬게이트된 자기 비드에 의해서 분류하였고, 시험관내 팽창 동안에 추후 통로에서 최적화된 MSC 배양 조건에서 유지시켰다. 결과는 세포 표현 마커 EphA2의 발현이 최적화된 MSC 배양 조건에서 추후 통로에서 잘 유지될 수 있음을 나타냈다.
b. 흐름 세포측정 세포 분류기(Flow Cytometry Cell Sorter: FCCS)에 의해서 분류된 EphA2-농축된 MSC의 흐름 세포측정 분석
태반으로부터 유래된 세포를 수확하고 PO에서의 JAZZ 세포 분류기(BD, USA)를 통해서 항-EphA2 항체에 의해서 분류하였다. EphA2-분류된 MSC의 흐름 세포측정 분석은 통로 2~6에서 99.5~100% CD73 & CD90 이중 양성, 99.6~100% CD105 & CD90 이중 양성, 99.5~100% EphA2 & CD90 이중 양성, 99.8~100% CD73 & EphA2 이중 양성, 99.5~100% CD105 & EphA2 이중 양성 및 99.7~100% CD73 & CD105 이중 양성 집단이 존재함을 나타냈다(이하 표 4 참조). 데이터는 EphA2 단백질은 추후 통로에서의 MSC 배양물에서 연속적으로 발현되고 유지될 수 있음을 나타냈다.
표 4: 시험관내 팽창 동안의 EphA2-FCCS-농축된 집단의 면역표현형 특성화
추후 팽창에서의 EphA2-농축된 MSC의 면역표현형 특성화.
면역표현형은 공여자 #7로부터의 탯줄(UC)로부터 유래된 MSC에 의해서 입증되었다. MSC를 P0에서 항-EphA2 항체에 의해서 분류하였고, 시험관내 팽창 동안의 추후 통로에서 최적화된 MSC 배양 조건에서 유지시켰다. 세포 표면 마커 EphA2의 발현이 추후 통로에서 잘 보존될 수 있다.
실시예
3: 태반-
유래된
중간엽
줄기세포
(MSC)
및
섬유모세포에서의
EphA2
전사의 정량적 실시간 PCR 평가
태반-유래된 세포(n = 8, 통로 1 및 통로 3을 포함함, 태반의 4가지의 상이한 부분, 즉, AM, CD, CM, UC로부터) 및 인간 포피 섬유모세포(신생아, PC501A-HFF, SBI)의 64 집단으로부터의 전체 RNA를 Direct-zol miniprep Kit (Zymo Research Corporation, CA, USA)를 사용하여 단리시켰다. 상보성 DNA(cDNA)를Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 합성하였다. 이어서, 정량적 RT-PCR을 제조자의 지시에 따라서 LightCycler480 II를 구비한 Roche Universal ProbeLibrary System(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 수행하였다
본 발명자들은 태반-유래된 다능성 MSC와 섬유모세포를 비교하기 위해서 정량적인 실시간 PCR에 의해서 EphA2의 발현을 분석하였다. 유전자 발현을 상이한 세포 집단에서의 내인성 유전자 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 발현에 대해서 정규화시켰다. MSC에서의 EphA2 전사의 발현이 섬유모세포에서의 EphA2의 발현에 비교하여 농축 배수(fold enrichment)에 의해서 계산하였다. 결과는 EphA2가 섬유모세포와 비교할 때에 MSC에서 고도로 발현되었음을 나타냈다(도 1).
실시예
4:
MSC와
섬유모세포의
혼합된
집단의
흐름 세포측정 분석
EphA2가 섬유모세포로부터 태반-유래된 MSC를 분리하기 위한 바이오마커(biomarker)로서 작용할 수 있음을 임증하기 위해서, 공여자 #23으로부터의 탯줄(UC)로부터 유래된 MSC를 다음 비율(세포수로의 MSC:섬유모세포)로 Eppendorf 튜브에서 섬유모세포와 혼합하였다: 2x105: 0, 2x105: 2x104, 2x105: 4x104, 2x105: 2x105, 2x105: 1x106, 2x105: 2x106 및 0: 2x105.. 이어서, 각각의 Eppendorf 튜브에서의 EphA2+ 집단을 흐름 세포측정법에 의해서 분석하였다. 도 2에 도시된 결과는 흐름 세포측정법을 통해서 항-EphA2 항체에 의해서 검출된 EphA2+ 집단의 백분율이 증가된 섬유모세포 짐답에 대한 반응으로 비례적으로 감소됨을 입증했다.
실시예
5:
렌티바이러스
형질도입(
lentiviral
transduction)에 의한
EphA2
녹다운
단리된 MSC 집단에서의 EphA2의 기능을 평가하기 위해서, 렌티바이러스 형질도입에 의한 shRNA(shEphA2) 녹다운 실험을 수행하였다. 각각의 구성물은 형질도입 효율을 모니터링하기 위한 EGFP 리포터를 가진다. 각각 3가지의 상이한 감염 다중도(Multiplicity Of Infection: MOI)(2, 5, 10)을 가지는 4개의 상이한 shRNA 서열을 시험하였고, 각각의 실험 조건은 삼중으로 수행되었다. 녹다운 효율을 qRT-PCR에 의해서 평가하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 50% 녹다운의 최상의 녹다운 효율이 달성될 수 있다.
실시예
6:
본 연구에서, 본 발명의 발명자들은 시험관내 TNF-α 신호와 같은 염증성 자극에 대한 반응에서의 MSC 중의 EphA2의 역할을 조사하였다. 본 발명의 발명자들은 염증화 동안의 MSC 이동과 연루된 EphA2의 효과에 촛점을 맞췄다. 기본 배양 조건하에 또는 TNF-α 염증성 자극의 존재하에 EphA2 high MSC 및 EphA2 low MSC의 이동성을 검사하였다.
a. EphA2-녹다운 MSC의 트랜스-웰 이동 분석
야생형 sh-스크램블 및 sh-EphA2 표적된 MSC를 8 μm 트랜스-웰에서 30,000 세포의 조건으로 배양하였다. 0.2% FBS 및 TNF-α를 하부 챔버에 첨가하여 MSC 이동을 활성화시켰다. 6시간 후에, 생존 이동 세포를 제조자 지시에 따른 CellTiter-Glo® 발광 시약을 통해서 검출하였다. 결과를 도 4a 및 도 4b에 도시한다. 데이터는 TNF-α 신호에 대해서 반응하는 능력 및 sh-EphA2 MSC의 이동이 EphA2 녹다운에 의해서 손상되었음을 나타냈다.
b. EphA2high MSC의 트랜스-웰 이동 분석
태반으로부터 유래된 세포의 일차 배양물을 EphA2에 대항하는 항-인간 항체에 의해서 컨쥬게이트된 자기 비드와 함께 인큐베이션하였고, 이어서, 제조자의 지시에 따라서 양성 선택에 의해서 분류하였다. 흐름 세포측정 분석은 MACS 분류 후의 EphA2+ MSC 및 EphA2- 세포 집단을 확인시켰다. 세포를 8 μm 트랜스-웰에서 30,000 세포의 조건으로 배양하였다. 0.2% FBS 및 TNF-α를 하부 챔버에서 첨가하여 MSC 이동을 활성화시켰다. 6시간 후에, 생존 이동 세포를 제조자 매뉴얼에 따른 CellTiter-Glo® 발광 시약을 통해서 검출하였다. 데이터는 TNF-α 신호에 대해서 반응하는 능력 및 MSC의 이동이 EphA2-농축된 집단에서 향상되었음을 나타냈다.
도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, MSC의 이동은 기본 배지에의 TNF-α의 첨가에 의해서 유의하게 영향을 받았다. TNF-α에 의한 MSC의 자극 후에, CellTiter-Glo® 발광 시약을 통해서 검출된 MSC의 이동이 TNF-α-도즈-의존 방식으로 증가되었다(도 4a 참조). 대조적으로, 세포의 이동성은 EphA2-녹다운 MSC 집단에서 또는 분류에 의한 EphA2- 세포에서 중단되었다. TNF-α 신호에 대한 반응에서의 MSC의 이동에서의 EphA2 분자의 효과는 발광 신호가 배수 변화(fold change)로 0.2% FBS 대조군 중의 이동된 야생형 MSC에 대한 이동된 세포 집단으로 전환되었을 때에 더욱 분명하다(도 4b 참조).
본 발명의 광범위한 발명의 개념을 벗어나지 않으면서 상기 기재된 실시형태에 대한 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에 의해서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정의 실시형태로 제한되지 않으며, 변형들은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다.
참고문헌:
Claims (21)
- 태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: (MSC)를 구별하는 방법으로서, 세포를 EphA2의 마커에 의해서 단리시킴을 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
섬유모세포, 태반-유래된 상피 세포, 태반-유래된 망상 세포, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 집단으로부터 MSC를 구별하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
섬유모세포로부터 MSC를 구별하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
태반-관련된 조직이 양막, 융모막 디스크(chorionic disk), 융모막(chorionic membrane), 및 탯줄(umbilical cord)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 청구항 1에 있어서,
단리 단계가 항체-기반 또는 누클레오티드-기반 단리 방법을 통해서 수행되는 방법. - 청구항 1에 있어서,
태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포가 MSC를 위한 배양 배지에서 배양되는 방법. - 청구항 5에 있어서,
항체-기반 단리 방법이 항체-기반 자기 세포 분류법(antibody-based magnetic cell sorting) 또는 항체-기반 흐름 세포측정법(antibody-based flow cytometry)인 방법. - 청구항 5에 있어서,
누클레오티드-기반 단리 방법이 누클레오티드-기반 흐름 세포측정법인 방법. - 태반-관련 조직으로부터 유래된 세포의 일차 배양물에서 MSC 집단의 순도를 증가시키는 방법으로서, EphA2의 마커에 의해서 세포를 단리시킴을 포함하는 방법.
- 청구항 9에 있어서,
태반-관련된 조직이 양막, 융모막 디스크, 융모막, 및 탯줄로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 청구항 9에 있어서,
단리 단계가 항체-기반 또는 누클레오티드-기반 단리 방법을 통해서 수행되는 방법. - 청구항 9에 있어서,
태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포가 MSC를 위한 배양 배지에서 배양되는 방법. - 청구항 9에 있어서,
MSC 집단의 순도가 단리 단계 후에 PO에서 적어도 95%인 방법. - 청구항 11에 있어서,
항체-기반 단리 방법이 항체-기반 자기 세포 분류법 또는 항체-기반 흐름 세포측정법인 방법. - 청구항 11에 있어서,
누클레오티드-기반 단리 플랫폼이 누클레오티드-기반 흐름 세포측정법인 방법. - 염증성 환경에서 더욱 반응성인 MSC 집단을 분리하는 방법으로서, EphA2의 마커에 의해서 세포를 단리함을 포함하는 방법.
- 청구항 16에 있어서,
단리 방법이 항체-기반 단리 방법 또는 누클레오티드-기반 단리 방법을 통해서 수행되는 방법. - 청구항 16에 있어서,
태반-관련된 조직으로부터 유래된 세포가 MSC를 위한 배양 배지에서 배양되는 방법. - 청구항 16에 있어서,
MSC 집단이 TNF-α 신호전달 또는 TNF-α-의존성 신호전달에 더욱 반응성인 방법. - 청구항 17에 있어서,
항체-기반 단리 방법이 항체-기반 자기 세포 분류법 또는 항체-기반 흐름 세포측정법인 방법. - 청구항 17에 있어서,
누클레오티드-기반 플랫폼이 누클레오티드-기반 흐름 세포측정법인 방법.
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