KR102258977B1 - CDK1-Cyclin B1의 결합 억제제를 이용한 암 치료물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클린 B1(Cyclin B1), 사이클린-의존성 키나아제 1(Cyclin-dependent kinase 1; CDK1), 및 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)을 이용한 암 치료물질의 스크리닝 방법, 및 암 진단 또는 예후 예측용 조성물로서, 본 발명자들은 암의 진단 및 예후 예측을 위한 분자적 기작을 밝혀내기 위해 예의 연구한 결과, 암 유래 피검체에서 RARRES1과 CDK1 또는 Cyclin B1의 상호 결합정도에 따라 암세포의 유사분열의 정지 및 CDK1-Cyclin B1 복합체의 형성을 억제시키고 이들 단백질의 분해를 촉진시킴을 확인함으로써 RARRES1이 암 진단 및 예후 예측, 치료에 중요한 인자임을 확인하였는바, 이를 통해 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되고, 상기 RARRES1와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되며, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 안정성 또는 활성이 감소되는 암의 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CDK1-Cyclin B1의 결합 억제제를 이용한 암 치료물질의 스크리닝 방법{A method for screening a therapeutic agent for cancer using binding inhibitor of Cyclin-dependent kinase 1(CDK1) - Cyclin B1}

본 발명은 CDK1 - Cyclin B1의 결합 억제제를 이용한 암 치료물질의 스크리닝 방법, 및 암 진단 또는 예후 예측용 조성물로서, 보다 구체적으로는 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되고, RARRES1와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되며, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 치료물질의 스크리닝 방법, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

‘종양(tumor)’이라고 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리를 의미하며, 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 양성종양이 비교적 성장 속도가 느리고 전이(metastasis)되지 않는 것에 반해 악성종양은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 된다. 따라서 악성종양을 암과 동일한 의미로 생각할 수 있다. 신체를 구성하는 가장 작은 단위인 세포(cell)는 정상적으로는 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 이러한 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암(cancer)으로 정의할 수 있다.

이러한 암의 진단을 위해, X선검사는 폐암이나 골수종은 단순촬영 및 단층촬영 등으로 음영을 얻는 경우가 많으며 내장암은 조영제를 사용하여 여러 가지 음영을 관찰함으로써 진단의 실마리를 잡게 된다. 특히 위암 및 대장암 등에서는 이중조영법으로 점막의 상태를 점검하여 조기위암이나 대장암 등의 미세한 병변까지도 구별해 냄으로써 조기발견에 많은 도움을 주고 있다. 내시경검사로 경식 내시경은 오래 전부터 내장검사에 사용되어 왔으나 육안으로 볼 수 있는 범위가 한정되어 진단에 큰 도움을 못 주었다. 그리하여 현재는 S결장경만이 이용되고 있다. 마음대로 구부러질 수 있는 연식내시경(flexible fiberscope)의 발달은 각종 내장암에 대한 진단, 특히 조기진단에 큰 몫을 담당하게 되었다. 내시경을 통한 생검도 가능하여 확진에도 좋은 단서를 제공하며 일반적인 병원검사 외에도 집단검진에 사용할 수 있어서 위암 등에서는 더욱 유용하게 사용된다. 현재 임상에서 널리 사용되는 것으로 위내시경(flexible gastrofiberscope), 대장내시경(flexible colonofiberscope), 직장 및 S결장 내시경(sigmoidoscope) 등이 있고, 이 밖에도 복강경(peritoneoscope), 종격동 내시경(mediastino scope), 기관지경(bronchoscope) 등이 사용되고 있다. 세포진단으로 G.N.파파니콜로가 자궁 분비물의 도말표본에서 악성종양 세포의 특징을 찾아낸 이래로 자궁경부암의 집단검진과 진단 및 특히 조기진단에 획기적인 진보를 가져왔다. 현재 자궁암 이외에도 위 ·폐 ·전립선 ·유방 ·요로 ·췌장 등의 분비물에 이용되고 있으며 갑상선 ·유방 등의 천자에 의한 세포진단도 널리 이용되고 있다. 암의 확진은 생검(biopsy)을 통해 얻은 조직편의 병리조직학적인 현미경검사로 이루어진다. 이런 조직편은 내시경을 통한 방법, 유방·질 등 수술조작을 하며 얻는 방법이 있다. 이러한 진단을 통해 암을 진단할 수 있으나, 보통 암이 처음 진단되었을 때 이미 주변 조직으로 전이된 상태이거나 원격전이가 발생한 경우가 많으며, 암의 생존율은 늦게 발견될수록 그 예후가 좋지 않으므로, 조기진단이 매우 중요하다. 따라서, 암의 발병 및 진행에 대한 이해가 매우 중요하나, 발병을 유도하는 분자적 기작에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

한편, CDK1은 주요 세포주기 조절 인자이다. 효모에서 세포주기의 진행은 Saccharomyces cervisiae의 Cd28 및 Schizosaccharomyces pombe의 Cdc2로 알려진 단일 CDK에 의해 제어되며, 이는 세포주기의 다른 단계에서 특정 사이클린에 결합한다. 마우스의 유전 연구에 의해, 마우스 생식 세포계의 Cdks의 체계적 녹아웃은 Cdk2, Cdk4 및 Cdk6이 대부분의 세포 유형의 세포주기에 필수적이지 않다는 것을 보여 주었다. Cdk1의 제거만으로 2 세포 단계에서 세포주기 정지와 배아 사망을 유발한다. CDK1의 활성은 M 단계 시작과 종결을 제어한다. G2/M 전이에서 CDK1-cyclinB1 활성화는 염색체 응축, 핵막 파괴, 및 방추사 조립을 제어하는 다양한 단백질의 인산화로 이어진다. 후기에 CDK1-cyclin B1은 자매 염색분체를 함께 보유하는 응집체를 절단하는 단백질 분해 효소인 분리효소(separase)의 활성을 조절하여 이 현상을 일으킨다. CDK1 활성의 조절은 다수의 단계에 의해서 조절되는데, 예로 조절 서브유닛(cyclin A 및 B)과의 결합, 사이클린 의존성 키나아제 억제제(cyclin-dependent kinase inhibitor; CKIs)와의 상호 작용, 및 활성화 키나제 CAK(CDK 활성 키나아제) 또는 Wee1 및 Myt1을 포함하거나 phosphatase Cdc25를 포함하는 몇몇 억제제 키나아제에 의한 특정 잔기의 인산화 및 탈인산화를 들 수 있다. 종양의 진행과 관련이 있는 여러 단백질들 중, 유사 분열에서 CDK1의 조절 소단위인 Cyclin B1의 형질전환 마우스에서 종양 발생률이 높았다.

또한, 레티노산 수용체 반응인자 1(retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)은 처음에 합성 레티노이드인 타자로텐에 의한 피부 다수 양식(raft culture)에서 가장 상향 조절된 유전자로 확인되었다. 이 유전자는 포유류에서만 발견되며, 종 중에서 진화적으로 보존된 유전자이다. 인간에서는 염색체 3의 q arm 25.32 유전자좌에 국한되어 있다. 다른 방법으로 두 개의 별개의 아형(isoform)을 암호화하는 접합된 전사 유전적 변이(spliced transcript variants)(택일적으로 접합된 transcript 변이체)가 존재한다. 아형 1(RARRES1-1)은 6개의 엑손으로 이루어져 있고, 294개의 단백질을 암호화하고, 아형 2(RARRES1-2)는 5개의 엑손으로 이루어져 있고, 228개의 단백질을 암호화한다. C-말단과 3'-비 번역 영역(UTR)은 이 2 개의 아형 사이에서 상이한 형태였다. 전립선, 유방, 폐, 간, 결장암, 위암, 식도, 비 인두, 자궁 내막 및 두 경부암을 비롯한 다양한 종양 조직 및 세포주에서 RARRES1의 발현은 대부분 프로모터 영역의 과메틸화로 인해 흔히 사라지게 되거나, 침묵된다.

그러나, 아직까지 CDK1-Cyclin B1 및 RARRES1이 암의 진단, 암세포의 발병, 및 진행에 어떠한 영향을 미치는지 그 연관성에 대해서는 알려진 바가 없다.

대한민국공개공보 KR2013-0069924

본 발명자들은 암의 진단 및 예후 예측을 위한 분자적 기작을 밝혀내기 위해 예의 연구한 결과, 암 유래 피검체에서 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)와 사이클린-의존성 키나아제 1(Cyclin-dependent kinase 1; CDK1) 또는 사이클린 B1(Cyclin B1)의 상호 결합정도에 따라 암세포의 유사분열의 정지 및 CDK1-Cyclin B1 복합체의 형성을 억제시키고, 이들 단백질의 분해를 촉진시킴을 확인함으로써 암 진단 및 예후 예측, 치료에 중요한 인자임을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 (a) In vitro 상에서 피검체에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 피검체의 CDK1과 Cyclin B1의 결합 정도를 측정, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해, CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되는 후보물질, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 후보물질을 암 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RARRES1의 mRNA 또는 상기 mRNA가 코딩하는 펩티드 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 CDK1 및 Cyclin B1 간의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) In vitro 상에서 피검체에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 피검체의 CDK1과 Cyclin B1의 결합 정도를 측정, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해, CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되는 후보물질, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 후보물질을 암 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 (b)단계에서 상기 피검체의 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도를 측정하는 단계; 및 상기 (c)단계에서 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되고, 상기 RARRES1와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되는 후보물질을 암 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, CDK1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 것은 RARRES1와 CDK1의 결합 정도가 증가되어 리소좀(Lysosome)에서 CDK1의 분해가 증가되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피검체는 전립선 암, 폐암, 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되는 것은 Cyclin B1 단백질의 126번째 세린의 인산화가 억제되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Cyclin B1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 RARRES1와 CDK1의 결합 정도가 증가되는 것은 RARRES1 단백질 중 251~294번 아미노산을 포함하는 C-terminal부위에서 불활성화된 CDK1과 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 RARRES1 단백질 중 251~294번 아미노산은 서열번호 6의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 RARRES1의 mRNA 또는 상기 mRNA가 코딩하는 펩티드 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 RARRES1의 mRNA는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 나타낸 것일 수 있고, 바람직하게는, 서열번호 7의 염기서열의 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 RARRES1의 mRNA가 코딩하는 펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타낸 것일 수 있고, 바람직하게는, 서열번호 6의 아미노산 서열의 펩티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 CDK1 및 Cyclin B1 간의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 암은 전립선 암, 폐암, 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 CDK1 및 Cyclin B1 간의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CDK1 및 Cyclin B1 간의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 암 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 암의 진단 및 예후 예측을 위한 분자적 기작을 밝혀내기 위해 예의 연구한 결과, 암 유래 피검체에서 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)와 사이클린-의존성 키나아제 1(Cyclin-dependent kinase 1; CDK1) 또는 사이클린 B1(Cyclin B1)의 상호 결합정도에 따라 암세포의 유사분열의 정지 및 CDK1-Cyclin B1 복합체의 형성을 억제시키고 이들 단백질의 분해를 촉진시킴을 확인함으로써 RARRES1이 암 진단 및 예후 예측, 치료에 중요한 인자임을 확인하였다. 나아가, 이를 통해 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되고, 상기 RARRES1과 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되며, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 암의 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a, 1b 및 1c는 전립선암(1a), 폐암(1b), 및 유방암(1c) 세포주에서의 RARRES1 발현 양상을 RARRES1에 대한 아형-특이적 프라이머를 사용하여 실시예 1-2에 따른 RT-PCR로 측정한 RARRES1 전사 변이체의 내인성 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 전립선암(1a), 폐암(1b), 및 유방암(1c) 세포주에서 과메틸화에 의해 매개되는 RARRES1의 침묵을 나타낸 도이다.
도 3a는 일시적으로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염된 MDA-MB-231 세포에서 세포 성장에 대한 RARRES1 전사 변이체의 효과를 분석한 것을 나타낸 도이다.
도 3b는 표시된 실시예 1-4에 따라 siRNA를 실시예 1-1의 방법으로 형질 감염한 JIMT-1 세포에서 세포 성장에 대한 RARRES1 전사 변이체의 효과를 분석한 것을 나타낸 도이다.
도 4a는 MDA-MB-231 세포를 RARRES1 전사 변이체를 발현하는 벡터 또는 빈 벡터 pcDNA3.1을 대조군으로 하여 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시킨지 24 시간 후에 세포를 PI로 염색하고 DNA 내용물을 실시예 1-10에 따른 유동 세포 계측법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 RARRES1 각각 또는 모두의 아형이 과발현되었을 때 HEK293 세포에서 세포주기 분포를 FACS 분석에 의해 결정한 도이다.
도 5a는 세포주기를 통해 293 세포 진행에서 과발현된 GFP 빈 벡터 pcDNA3.1(Ctrl) 또는 GFP-RARRES1의 실시예 1-6에 따른 라이브 셀 이미징들을 나타낸 도이다.
도 5b는 형광-표지 세포를 72시간까지 시간-경과 현미경으로 모니터링하기 위한 실험설정을 나타낸 도이다.
도 5c는 각 293 세포의 형광을 추적하고 시간-경과 형광 현미경으로 0, 53 및 72 시간동안 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5d는 실시예 1-7에 따라 DTB로부터 방출된 후 지시된 시점(시간)에서, HEK293 세포의 세포주기 분포를 실시예 1-10에 따른 유동 세포 계측법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5e는 HEK293 세포를 DTB 방법으로 G1/S 경계에서 동기화시킨 후, 과발현 정도를 RT-PCR과 Western blot으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 pcDNA3.1(Ctrl) 또는 실시예 1-1의 방법에 따라 RARRES1로 형질 감염시킨 293 세포로부터 얻어진 세포용해물을 실시예 1-7에 따라 DTB 방출 후 표시된 시점에서 수득하고, 표시된 항체로 블로팅한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 사이클린 B1 mRNA와 단백질 수준을 실시예 1-2에 따른 RT-PCR과 실시예 1-8에 따른 면역 블로팅(IB)을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 RARRES1 및 GST-cyclin B1을 실시예 1-1의 방법에 따라 공동 형질 감염시킨 293 세포에 있는 용해액(투입물) 및 GST-IP의 GST, RARRES1, 및 CDK1를 웨스턴 블랏하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 RARRES1 및 실시예 1-1의 방법에 따라 GST-CDK1로 형질 감염된 HEK293 세포 및 세포 용해물을 GST 비드로 실시예 1-8에 따른 면역 침전(IP)시킨 후, GST, RARRES1, 및 사이클린 B1의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7c는 실시예 1-1의 방법에 따라 RARRES1-형질 감염된 293 세포를 nocodazole(50 ng/ml)으로 처리하거나 처리하지 않은 채로 두고, 세포 용해물을 항-RARRES1 항체로 실시예 1-8에 따른 면역 침전시킨 후, 표시된 항체로 면역 블로팅한 결과를 나타낸 도이다.
도 8a 및 8b는 20시간 동안 50ng/ml nocodazole으로 처리되거나 처리되지 않은 RARRES1을 코딩하는 실시예 1-3에 따른 플라스미드로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염된 HEK293 세포로부터 유래된 단백질을 항-RARRES1 항체로 실시예 1-8에 따른 면역 침전(IP)시킨 후, 사이클린 D, CDK4, 및 RARRES1(도 8a) 또는 cyclin A, CDK2, 및 RARRES1(도 8b)를 특정된 항체로 탐침한 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 RARRES1 단백질(아형1)에 대하여 아미노 말단으로부터 50개의 단백질들을 순차적으로 결손시킨 돌연변이체에 대한 모식을 나타낸 도이다.
도 9b는 도 9a에서 만든 돌연변이체의 RARRES1과 His가 결합 되어져 있는 Cdk1을 형질 감염시킨 HEK293 세포부터 니켈로 침전시킨 후, RARRES1과 Cdk1 항체로 면역 블로팅한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 리소좀 분해 억제제인 BafA1 및 E/P 와 프로테아좀 분해 억제제인 MG132를 세포에 처리했을 때 RARRES1에 의한 CDK1의 단백질의 양을 확인한 도이다.
도 11은 RARRES1 단백질이 세포주기 동안에 Cdk1 혹은 cyclin B1 단백질과의 결합을 통한 이들 단백질들의 불안정성을 야기시키고 또한 활성 억제를 통하여 암 발생을 억제시킨다는 모식도이다.

본 발명자들은 암의 진단 및 예후 예측을 위한 분자적 기작을 밝혀내기 위해 예의 연구한 결과, 암 유래 피검체에서 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)와 사이클린-의존성 키나아제 1(Cyclin-dependent kinase 1; CDK1) 또는 사이클린 B1(Cyclin B1)의 상호 결합정도에 따라 암세포의 유사분열의 정지 및 CDK1-Cyclin B1 복합체의 형성을 억제시키고 이들 단백질의 분해를 촉진시킴을 확인함으로써 RARRES1이 암 진단 및 예후 예측, 치료에 중요한 인자임을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 인간의 암 세포주에서 RARRES1이 비활성화 되는지 알아보기 위해, 전립선 암, 폐암, 및 유방암 세포주의 RARRES1 아형(isoforms)의 발현 수준을 분석한 결과 RARRES1의 발현은 침묵하였음을 확인하였고(도 1a 내지 도 1c), 프로모터 메틸화가 암 세포에서 RARRES1 발현의 침묵과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해, 5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-2-dC; 5, 25, and 100 uM)을 5일 간 DNA 메틸화의 억제제로 처리한 결과 대부분의 세포주에서 그 정도는 달랐으나 RARRES1의 발현이 용량 의존적으로 회복된 것을 확인할 수 있었는 바(도 2a 내지 2c), 전립선 암, 폐암, 및 유방암 세포주에서 RARRES1의 억제가 이 유전자의 메틸화에 의해 매개된다는 것을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, RARRES1이 종양 억제 유전자로 작용한다는 것을 알아보기 위해, 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 JIMT-1에서 실시예 1-5에 따른 세포 증식에 대한 RARRES1의 영향을 조사한 결과 RARRES1 아형 발현 벡터 둘 다 혹은 각각 일시적으로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염 후에 암세포 성장은 일정 기간 동안 점차적으로 억제되었으나(도 3a), JIMT-1 세포에서 RARRES1 변이체에 대한 실시예 1-4에 따라 특이적인 siRNA로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시킴으로써 RARRES1 mRNA 발현은 감소되었음을 확인할 수 있었으며, RARRES1가 결핍된 세포에서 암세포 생존력이 강화되었음을 확인할 수 있었는 바, RARRES1이 종양 억제 유전자로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, RARRES1의 과발현에 의해 암세포의 유사분열이 정지된다는 것을 확인하기 위하여, 암세포인 MDA-BM-231 및 HEK293 세포에서 RARRES1을 과발현시킨 후 실시예 1-10에 따른 유동 세포 계측법으로 확인한 결과 세포 사멸은 유발하지 않았으나(도 4a 및 도 4b), HEK293 세포에서 RARRES1 또는 빈 벡터(Ctrl)로 표지된 녹색 형광 단백질(GFP)을 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시키고 실시예 1-6에 따른 라이브 셀 이미징(live cell imaging)을 사용해 세포를 관찰한 결과 HEK293 세포에서 RARRES1를 과발현시킨 경우 유사 분열 정지를 유도한다는 것을 확인할 수 있었으며(도 5a 내지 도 5e), RARRES1 과발현 세포에서 어떤 세포주기 조절 단백질이 변형되었는지 조사하기 위해, 실시예 1-7에 따라 이중 티미딘 블록(Double thymidine block; DTB)방법으로 Western blot 분석을 수행한 결과 Rb 단백질과 Rb 인산화(Ser 807,811), cyclin B1의 발현과 인산화(Serine 126), 및 Plk1의 트레오닌 210 인산화가 감소하였음을 확인할 수 있었는 바(도 6a 및 도 6b), RARRES1이 과발현 될 때 cyclin B1의 활성과 관련이 있음을 확인할 수 있었다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, RARRES1이 직접 결합을 통하여 유사 분열 동안 cyclin B1 활성화에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, HEK293 세포를 실시예 1-1의 방법에 따라 RARRES1 및 cyclin B1과 공동 형질 감염시키고 세포 용해물의 GST 비드로 실시예 1-8에 따른 면역 침전시킨 결과 RARRES1이 cyclin B1에 직접 결합한다는 것을 확인할 수 있었으며(도 7a), RARRES1이 CDK1와 직접 상호 작용한다는 것도 확인할 수 있었고(도 7b), RARRES1이 간기 CDKs(CDK2, CDK4, CDK6) 및 그들과 상호결합하는 사이클린들을 포함하여 다른 CDK-사이클린 복합체와 상호 작용하는지 여부를 조사하기 위하여, 293 세포에서 실시예 1-8에 따른 면역 침전을 수행한 결과 CDK4-Cyclin D 및 CDK2-Cyclin A 복합체의 각 성분은 RARRES1에 결합하지 않았는 바(도 8a 및 도 8b), RARRES1이 유사 분열에서 CDK1-cyclin B1 복합체 형성을 특이적으로 억제한다는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 CDK1과 결합하는 RREES1 단백질의 아미노산 부위 탐색을 위하여, RARRES1 단백질 서열을 50개씩 결실을 달리한 돌연변이체를 만들고, 면역 침전을 수행한 결과, RARRES1의 카복실 말단 251-294아미노산이 결실된 돌연변이체에서 CDK1에 대한 결합이 거의 일어나지 않았는 바, RARRES1 카복실 말단이 CDK1결합에 중요한 부위로 작용한다는 점을 확인할 수 있었다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 CDK1 단백질의 양적변화가 어떠한 조절을 통해서인지 알아보기 위하여, 리소좀 분해 방해 억제제 및 프로테아좀 분해 방해 억제제를 처리하여 관찰한 결과, 리소좀 분해 방해 억제제 처리시 CDK1단백질의 양이 다시 증가하였는 바, RARRES1의 카복실말단을 통한 CDK1과의 결합이 리소좀을 통해 CDK1 단백질의 불안정성을 야기시킴을 확인할 수 있었다(실시예 7 참조).

따라서, RARRES1과 CDK1 또는 Cyclin B1의 상호 결합정도에 따라 CDK1-Cyclin B1 복합체의 형성을 억제시켜 암세포의 유사분열의 정지시켜 암세포의 증가를 억제시킨다는 것을 확인하였는 바,

본 발명은 (a) In vitro 상에서 피검체에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 피검체의 CDK1과 Cyclin B1의 결합 정도를 측정, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해, CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되는 후보물질, 또는, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 후보물질을 암 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 (b)단계에서 상기 피검체의 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1)와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도를 측정하는 단계; 및 상기 (c)단계에서 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되고, 상기 RARRES1와 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되는 후보물질을 암 치료물질로 선정하는 단계를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않고, 결국 (c)단계에서 RARRES1가 CDK1 또는 Cyclin B1과 결합하여 CDK1-Cyclin B1 복합체 형성을 억제하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (c) 단계에서, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 후보물질을 암 치료물질로 선정할 수 있고, 바람직하게는 CDK1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 것은 RARRES1와 CDK1의 결합 정도가 증가되어 리소좀(Lysosome)에서 CDK1의 분해가 증가되는 바, RARRES1이 CDK1 단백질 분해를 유도하여 안정성에 영향을 주는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 또는 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 피검체는 전립선 암, 폐암, 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 분리된 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않고, 상기 피검체는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 및 뇨로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도가 감소되는 것은 Cyclin B1 단백질의 126번째 세린의 인산화가 억제되는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않으며, RARRES1와 CDK1의 결합 정도가 증가되는 것은 RARRES1 단백질 중 251~294번 아미노산을 포함하는 C-terminal부위에서 불활성화된 CDK1과 결합될 수 있고,

상기 RARRES1와 Cyclin B1의 결합 정도가 증가되는 것은 RARRES1 단백질의 아형 불문하고 Cyclin B1과 결합할 수 있기 때문이며, 바람직하게는 Cyclin B1과 결합하는 RARRES1의 아미노산 부위는 RARRES1 단백질 중에 cyclin B1과 결합할 수 있는 부위면 어느 부위든 제한되지 않는다.

또한, 상기 Cyclin B1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타낼 수 있고, 상기 RARRES1 단백질 중 251~294번 아미노산은 서열번호 6의 아미노산 서열로 나타낼 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 이외에 Cyclin B1 단백질의 아미노산으로서, CDK1과 결합정도가 감소되는 아미노산에 해당하는 아미노산 서열이면 어느 하나에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열 이외에 RARRES1 단백질에 속하는 아미노산으로서, 불활성화된 CDK1과 결합되는 아미노산에 해당하는 아미노산 서열이면 어느 하나에 제한되지 않는다.

또한, 상기 후보물질은 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도, RARRES1과 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합정도, 및, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성을 측정하기 위하여 스크리닝에서 사용되는 미지의 물질을 의미하며, 바람직하게는 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않으며, 상기 핵산은 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 피검체의 CDK1과 Cyclin B1의 결합정도, RARRES1과 CDK1 또는 Cyclin B1의 결합정도, 및, CDK1 또는 Cyclin B1 단백질의 양 또는 활성의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 또는 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, RARRES1의 mRNA 또는 상기 mRNA가 코딩하는 펩티드 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하고, RARRES1의 mRNA 또는 상기 mRNA가 코딩하는 펩티드 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 RARRES1의 mRNA는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 나타낸 것일 수 있고, 서열번호 7의 염기서열의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 RARRES1의 mRNA가 코딩하는 펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타낸 것일 수 있고, 서열번호 6의 아미노산 서열의 펩티드를 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 전립선 암, 폐암, 및 유방암의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 전립선 암, 폐암, 및 유방암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

상기 RARRES1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명의 진단 또는 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, CDK1 및 Cyclin B1 간의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 암 발병 전에 선제적으로 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 암 발병 후에 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

이에, 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료효과를 증진시키기 위하여, 바람직하게는 병용되는 약물과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사, 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

또한, 상기 암은 전립선 암, 폐암, 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용되는 용어 "전립선 암"이란, 전립선 세포에서 발생하는 선암이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분하는데, 널리 쓰이는 분류 방식은 도널드 글리슨이라는 병리학자가 제시한 것으로, 분화도가 가장 좋은 1등급부터 최하인 5등급까지로 나뉜다. 전립선에 생기는 암의 95%는 관선방 분비상피에서 발생하는 선암이고, 5%는 이행상피암 등이 차지하고 있다. 또한 선암의 85%가량은 앞에서 본 맥닐의 구역 분류에서 말초대라고 한 부분에 발생한다. 전립선에 생긴 전암성 변화를 ‘전립선 상피 내 신생물’이라고 하는데 이는 전립선암 환자의 약 3분의 1에서 발견된다. 그중 분화도가 나쁜 고악성도의 신생물은 침윤성 전립선암, 즉 인접 조직으로 번지는 성질을 지닌 암의 80%에서 발견되는 만큼, 전립선암의 전구 병변으로 본다.

본 발명에 사용되는 용어 "폐암"이란, 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 폐 자체에서 발생하거나 다른 장기에서 생긴 암이 폐로 전이되어 발생하기도 한다. 원발성 폐암의 종류는 암세포의 크기와 형태를 기준으로 비소세포 폐암과 소세포 폐암으로 구분한다. 폐암 가운데 80~85%는 비소세포폐암인데, 이것은 다시 선암(샘암), 편평상피세포암, 대세포암 등으로 나뉜다. 그 나머지인 소세포폐암은 전반적으로 악성도가 높아서, 발견 당시에 이미 림프관 또는 혈관을 통하여 다른 장기나 반대편 폐, 종격동으로 전이되어 있는 수가 많다.

본 발명에 사용되는 용어 "유방암"이란, 유방 밖으로 퍼져서 생명을 위협할 수 있는 악성 종양이다. 발생 부위에 따라 유관과 소엽 같은 실질 조직에 생기는 암과 그 외의 간질 조직에 생기는 암으로 나뉘며, 유관과 소엽의 암은 암세포가 주위 조직으로 퍼진 정도에 따라 다시 침윤성 유방암과 비침윤성 유방암으로 나뉜다. 남성의 유방암은 여성 유방암의 1% 이하로, 침윤성 유관암이 가장 많이 발견된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 세포 및 형질 감염(Cells and transfection)

사람 포유류의 상피세포는 10 %(v / v) 소태아혈청(FBS), 10000 IU/ml 페니실린, 10000μg/ml 스트렙토마이신 및 포유류 상피세포 성장 보충물(ScienCell)을 보충한 포유류의 상피세포 배지(ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, California, USA)로 배양하였다. 다른 모든 세포는 10 %(v / v)소태아혈청(FBS), 10000 IU/ml 페니실린, 10000μg/ml 스트렙토마이신, 및 피루브산 나트륨을 보충한 배지에서 95 % 공기와 5 % 이산화탄소로 구성된 습한 환경에서 37 ℃에서 성장시켰다. 실시예 1-3에 따른 플라스미드 DNA 또는 실시예 1-4에 따른 siRNA의 형질 감염을 위해, Lipofectamine LTX/PLUS(Invitrogen, Carlsbad, USA) 및 Lipofectamine2000(Invitrogen)을 각각 제조사의 지침에 따라 사용했다.

1-2. RT-PCR

제조업체의 지시에 따라 TRIZOL 시약(Invitrogen)을 사용하여 전립선 암, 폐암 및 유방암을 포함한 인체 암 세포주에서 총 RNA를 추출하고, 1ug의 총 RNA를 Superscript® Ⅲ 역전사 효소(Invitrogen)로 cDNA로 전환시켰다. 사람 DNA에 사용된 프라이머는 다음과 같다: Rarres1-1-F (CGCATTCACTTGGTCTGGTA), Rarres1-1-R (CTGAAACCCTGAGGAACCTG), Rarres1-2-F (TTTGGGGAAATGTTCTGCTCG), Rarres1-2-R (CCACTTTGATTGTAACTCTTGTGG), cyclin B1-F (CGGGAAGTCACTGGAAACAT), cyclin B1-R (GATGCTCTCCGAAGGAAGTG), Actin-F (CATCGAGCACGGCATCGTCA), Actin-R (TAGCACAGCCTGGATAGCAAC), 상기 프라이머들은 각각 327bp, 359bp, 347bp 그리고 626bp의 예측된 크기의 PCR 산물을 산출했다. 쥐 DNA에 사용된 프라이머는 다음과 같다: Rarres1-F(GCGCTGCACTTCTTCAACTT), Rarres1-R (GCCATAGCTGATGCTTCCAT), Gapdh-F (TGCACCACCAACTGCTTA), Gapdh-R (GGATGCAGGGATGATGTTC), 상기 프라이머들은 653bp와 177BP의 예측된 크기의 PCR 산물을 산출했다.

1-3. 플라스미드 및 렌티 바이러스(Plasmids and lenti virus)

야생형 RARRES1 아형 cDNA insert를 BamHⅠ/EcoRV 및 HindⅢ/EcoRⅠ제한 효소 부위를 각각 사용하여, pcDNA3.1 발현 벡터(Invtirogen)에 서브클론(subcloned)시켰다. RARRES1 형광 발현 벡터는 SacI/BamHⅠ 제한 효소 부위를 갖는 pAcGFP-C1 벡터(Clontech, Heidelberg, Germany)를 사용하여 제작되었다. RARRES1 결실 돌연변이체는 pcDNA3.1벡터에 서브클로닝시킨 RARRES1 야생형을 가지고 PCR을 이용하여 카복실 말단으로부터 50개의 아미노산을 순차적으로 결손시켰다. RARRES1 251-294 아미노산만을 갖는 돌연변이체는 EcoRⅠ/XhoⅠ 제한효소 부위를 사용하여 pEBG-2T-GST 발현 벡터에 서브클론시켰다. Ju-Bac Park(성균관대학교, 수원, 한국)으로부터 GST-cyclin B1과 GST-cdk1을 제공받았다. 모든 서열은 자동 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. PmRFP-H2B를 GFP가 결실된 pLL3.1 렌티 바이러스 벡터에 클로닝하였다.

1-4. SiRNA

RARRES1 녹다운(kcockdown)에 대해, RARRES1에 특이적인 siRNA로 세포를 형질감염시켰다. Genebank accession NM_206963 및 NM_002888에 따르면 siRNA duplexes는 RARRES1 (아형 1과 2)(5'-AUGUUCUGCUCGAGUGUUU-3') 모두를 녹다운 시킬 수 있고, RARRES1 아형 1(5'-AAUG AUGGUCUCAUCUCUGAA-3 ')에 특이적이고, RARRES1 아형 2 (5'-GAGUUAC AAUCAAAGUGGU-3)에 특이적이다. 대조군 siRNA로는 5'-GTTCAGCGTGTCCGGCGAG-3'을 사용했다.

1-5. 세포 증식(Cell proliferation)

MTT 분석을 위해, MDA-MB-231 및 JIMT-1 세포에 pcDNA3.1에 서브클론(subcloned)된 아형 1 혹은 2, 빈 벡터, 또는 RARRES1에 대한 실시예 1-4에 따라siRNA을 이용해서 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시켰다. 세포를 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액으로 2시간 동안 처리한 후, 세포를 DMSO로 용해시키고 각 샘플의 광학밀도 (optical density; OD)를 ELISA 판독기(Molecular Devices ELISA Reader, Sunnyvale, USA)를 사용하여 540nm에서 측정하였다.

1-6. 라이브 셀 이미징(Live cell imaging)

세포를 10 % FBS를 함유한 DMEM에서 유지시키고, 비디오 현미경 플랫폼 내부의 37℃ 및 5 % CO2에서 가습 배양기에 두었다. 10분마다 현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 형광 이미지를 촬영했다.

1-7. 세포 동기화(Cell synchronizations)(DTB; 혈청 기아)

G1/S 경계에서 동기화하는 이중 티미딘 블록(double thymidine block ; DTB)의 경우, HEK293 세포를 2mM 티미딘과 함께 16시간 동안 배양한 다음, 정상 배지로 10시간 방치한 후 2 mM 티미딘을 추가로 16시간 동안 첨가하였다.

1-8. 면역 블로팅 및 Co - 면역 침전법(Immunoblotting and Co-immunoprecipitation)

상기 세포를 용해 완충액(20 mM Tris, pH7.4, 5mM EDTA, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 1% NP-40, 1mM PMSF, 0.2% protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor)에서 용해시켰다. 세포 용해물의 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, USA)를 사용하여 측정하였다. 이어서, 단백질 용해물을 로딩 완충액에 재현탁시키고, 5분간 끓인 다음 SDS-PAGE를 수행하고 지시된 항체로 면역 블로팅하였다. 면역 침전을 위해, 세포 용해물에 TAP 완충액(25mM Tris, pH7.4, 140mM NaCl, 0.5% NP-40, 10mM NaF, 1mM dithiothreitol(DTT), 1mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM β-glycerophosphate, 10% glycerol and 0.2% protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor)를 첨가 한 후, 4 ℃에서 RARRES1 항체(R & D system, MN, USA) 또는 GST 비드와 함께 배양했다. SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)를 사용하여 화학 발광으로 단백질 발현을 검출했다.

1-9. 항체 및 시약

다음의 주요 항체는 실시예 1-8에 따른 면역 블로팅, 실시예 1-8에 따른 Co-면역 침전법, 및 간접 면역 형광에 사용되었다 : Cdc2/cdk1에 대한 마우스 단일 클론 항체(Santa cruz, sc-54,1/1000), cdk1-phospho-tyr 15(BD, 612306, 1/1000), cyclin B1(Cell signaling, #4135, 1/2000), cyclin D1(Santa cruz, sc-246, 1/1000), Rb(Cell signaling, #9309, 1/2000), histone H3-phospho-Ser 10(abcam, ab14955, 1/500), p62(BD, 610832, 1/1000), β-actin, and α-tubulin(Sigma-Aldrich, 1/5000)에 대한 토끼 다 클론 항체(Abgent, AP7517d, 1/500)뿐만 아니라, Weel (Cell signaling, #4936, 1/1000), Cdk2 (Cell signaling, #2546, 1/1000), cyclin B1(Cell signaling, #4138,1/1000), cyclin B1-phospho-ser 126(abcam, ab55184,1/1000), cyclin E(Santa cruz, sc-481, 1/1000), cyclin A(Santa cruz, sc-751, 1/1000), aurora a(Cell signaling, #3092,1/1000), aurora b(Cell signaling, #3094,1/1000), Rb-phospho-Ser 807,811(Cell signaling, #9308, 1/1000), GST(Abfrontier, LF-PA0189, 1/1000), cdk4(Santa cruz, sc-260, 1/1000), 그리고 RARRES1에 대한 염소 항체(R&D systems, AF4255, 1/1000). 서양고추냉이 퍼옥시다아제-태그된 2차 항체(horseradish peroxidase-tagged secondary antibodies)(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, USA)를 사용하였다. 단백질분해억제제로는 Bafilomycin A1 (Selleckchem, S1413), E-64-D (Enzo, BML-PI107), MG132 (Calbiochem, 474790)을 사용하였다. 이 연구에서 사용된 다른 시약은 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입했다. 모든 시약은 제조자의 권장 프로토콜에 따라 사용되었다.

1-10. 유동 세포 계측법(Flow cytometry)

세포주기 또는 sub-G1 DNA 함량 분석을 위해 세포를 얼음처럼 차가운 80%에탄올로 고정시키고, 4 ℃에서 보관하였다. 50 μg/ml 요오드화 프로피디움(propidium iodide; PI)와 100 μg ml RNase A를 함유한 PBS로 37 ℃에서 30분간 염색하였다. DNA 함량은 실시예 1-10에 따른 FACS Calibur 세포 계측법으로 분석하였으며, 결과는 Cellquest 소프트웨어(Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Diego, CA) 및 Modfit LT 3.3 소프트웨어로 분석했다. 1 샘플 당 최소 10000개의 세포가 분석되었다.

실시예 2. 인간 암세포주에서 과메틸화에 의한 RARRES1의 비활성화

실시예 1-2에 따른 RT-PCR을 이용하여 전립선 암, 폐암 및 유방암을 비롯한 인간 정상 세포와 암 세포주의 RARRES1 아형(isoforms)의 발현 수준을 평가했다. 이전에 발표된 데이터와 일치하여, RARRES1 발현은 정상 세포와 비교했을 때, 대부분의 테스트된 인간 암에서 침묵되었다(silenced). 일부 암세포는 폐(1/6; Calu3) 및 유방(3/11; MDA-MB-468, HCC70 및 HCC1569)에서 정상 또는 다른 암보다 높은 수준의 RARRES1발현이 일어났다. 두 RARRES1 전사 변이체의 mRNA 발현 양상은 모든 인간 암 세포주에서 매우 유사하게 검사되었다(도 1a 내지 도 1c).

프로모터 메틸화가 암 세포에서 RARRES1 발현의 침묵과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해, 5-aza-2’-deoxycytidine(5-aza-2-dC; 5, 25, 및 100 uM)을 5일 간 DNA 메틸화의 억제제로 처리했다. 대부분의 테스트된 세포주(전립선(도 2a), 폐(도 2b), 및 유방(도 2c)에서 각각 4/4 (100 %), 4/5(80 %) 및 8/10(80%))들은 5-aza-2-dC 처리 후, RARRES1 발현이 용량 의존적으로 회복되었지만, 그 정도는 달랐다.

그러나, Calu3와 HCC70을 포함한 RARRES1의 mRNA 수준이 높은 세포는 5-aza-2-dC 처리에 의한 RARRES1 발현을 재도입하지 못했다(도 2b 및 도 2c). 오히려 JIMT-1 세포에서 이 유전자의 mRNA가 감소했다(도 2c). 유사하게, 내인성 mRNA 발현 양상은 두 아형(isoform) 모두 전립선 암, 폐암 및 유방암에서 거의 동일한 메틸화 상태를 보였다. 그러나 일부 암세포에서, 아형 1은 5-aza-2-dC 처리조건에서 증가하였음에도 불구하고, CWR22rv와 T47D, 아형 2는 5-aza-2-dC에 의한 탈 메틸화 상태에서는 검출되지 않았다. 상기 결과를 통해 전립선, 폐 및 유방암 세포주에서 RARRES1의 억제는 적어도 부분적으로 이 유전자의 프로모터 메틸화에 의해 매개된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 종양 억제 유전자로 추정되는 RARRES1

프로모터의 과메틸화는 암에서 종양 억제 유전자를 비활성화시키는 메커니즘일 수 있다. 실시예 2에 나타난 바와 같이, 도 1a 내지 1c와 도2a 내지 도 2c의 결과를 바탕으로 RARRES1이 종양 억제 유전자로 작용한다고 가정한다. 이 가설을 시험하기 위해, MTT 세포 증식 분석에 의해 측정된 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 JIMT-1에서 실시예 1-5에 따른 세포 증식에 대한 RARRES1의 영향을 조사하였다.

RARRES1 전사 변이체 두 가지 모두 또는 각각은 RARRES1의 낮은 mRNA수준을 나타내는 MDA-MB-231세포에서 특이적으로 발현되었으며, 세포 성장은 5일 동안 분석되었다. RARRES1 아형 발현 벡터 둘 다 혹은 각각 일시적으로 실시예 1-1의 방법에 따라 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염 후에 암세포 성장은 일정 기간 동안 점차적으로 억제되었다(도 3a). 반대로, JIMT-1 세포에서 RARRES1 변이체에 대한 실시예 1-4에 따른 특이적인 siRNA로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시킨 경우 RARRES1 mRNA 발현은 감소되었고, 실시예 1-5에 따른 세포 생존력은 5일 동안 MTT 분석으로 측정하였다. 세포 생존력은 모든 결핍된 RARRES1 세포에서 강화되었다. RARRES1의 실시예 1-5에 따른 세포 증식에 대한 이러한 향상된 효과는 두 변이체에서 가장 크게 나타났으며 각각보다 억제되었다(도 3b). 이 데이터는 RARRES1이 종양 억제 유전자로 추정되는 후보로 작용함을 보여주었다.

실시예 4. RARRES1 과발현에 의한 유사분열 정지

실시예 3에 나타난 바와 같이, 세포 생존 실험에서 RARRES1은 세포 증식을 음성으로 조절했다. 그 중 세포 사멸이 증가의 가능성이 존재할 수 있는바 이를 확인하기 위해, MDA-MB-231(도 4a) 및 HEK293 세포(도 4b)에서 RARRES1을 과발현 시켰을 때 실시예 1-10에 따른 유동 세포 계측법(FACS)을 통해 입증한 결과, 이는 RARRES1이 세포 사멸을 거의 유발하지 않는다는 것을 확인하였다.

RARRES1 과발현 세포에서 관찰된 세포 성장 감소의 원인이 변화된 세포주기 진행으로 인한 것인지를 평가하기 위해, 우리는 HEK293 세포를 RARRES1 또는 빈 벡터(Ctrl)로 표지된 녹색 형광 단백질(GFP)로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염시키고, 실시예 1-6에 따른 라이브 셀 이미징(live cell imaging)을 사용해 세포를 관찰했다. 지금부터는 RARRES1의 두 아형 사이의 차이가 위의 실험에서 보이지 않았기 때문에 표시된 모든 데이터는 isoform 1에 대한 것이고 'RARRES1'로 명명되었다. GFP대조군(Ctrl)으로 실시예 1-1의 방법에 따라 형질 감염된 HEK293세포에서, 상기 세포는 정상적인 세포주기 진행을 겪었다. 세포는 1시간 이내에 유사 분열(둥근 모양)으로 들어갔고, 적어도 2 시간 30 분 내에 두 개의 딸세포를 분리시켰다(도 5a, 상단 패널). 그러나, GFP로 표지된 RARRES1-과발현 293 세포는 2 시간 30 분 동안 유사 분열에 존재하였고, 모니터링 동안 두 개의 딸 세포를 분리하지 않았다(도 5a, 하단 패널). RARRES1 과발현에 의해 유도된 유사 분열 정지를 확인하기 위해, GFP-대조군 또는 GFP-RARRES1-과발현 293 세포 및 실시예 1-3에 따라 GFP 비형질 감염된 세포를 표지하기 위해 사용된 빨강 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 렌티바이러스(lentivirus)로 감염된 293 세포를 공동 배양하고, 형광 발현 세포의 수의 변화(도 5b)를 모니터링하였다. 72시간까지, GFP-RARRES1 과발현 세포는 둥근 모양이었고 더 오랜 기간 동안 존재했지만, RFP-발현 세포의 수는 점차적으로 증가했다. RFP 바이러스 감염 세포와 결합된 GFP-대조군의 공동 배양 조건에서, 두 형광-발현 세포의 수는 시간이 지남에 따라 풍부해졌다. GFP-RARRES1 과발현 293 세포만이 유사 분열이 정지되어 분열되지 않았으며, 다른 세포는 세포주기를 통해 정상적으로 진행되었다(도 5c). 실시예 1-7에 따라 이중 티미딘 블록(Double thymidine block; DTB) 실험을 사용하여, RARRES1 과발현 세포가 4시간 후에 G2/M 단계에 급속히 들어갔다는 것(대조군의 21.38 %, RARRES1의 29.85 %)과 6시간 후에 G2/M 단계의 축적은 대조군보다 증가했으며(각각 77.41 % 및 80.91 %), G2/M 단계에서 8시간에서 더 오래 지속되었다(대조군의 경우 45.47 %, RARRES1의 경우 54.46 %). DTB로부터 10 시간이 경과한 후, 두 세포 모두 G1기에 성공적으로 복귀하였다(도 5d). RARRES1 단백질은 2시간째에 약간 향상되었고, 10시간까지 점차적으로 증가하였으며, 방출 후 12시간째에 최고점을 보였다. 반면, mRNA 수준은 시간이 지남에 따라 존재했다(도 5e). 이러한 결과는 RARRES1 과발현이 HEK293 세포에서 유사 분열 정지를 유도함을 시사한다.

RARRES1 과발현 세포에서 어떤 세포주기 조절 단백질이 변형되었는지 조사하기 위해, 실시예 1-7에 따라 DTB 방법으로 Western blot 분석을 수행하였다. Rb 단백질과 Rb 인산화(Ser 807,811)는 대조군 세포에 비해 RARRES1 과발현 세포에서 감소했다. 특히, cyclin B1의 발현과 인산화(Serine 126)는 RARRES1의 존재 하에서 방출 후 8 시간에서 낮았다. CDK1의 발현과 억제 인산화(Tyrosine 15)는 변하지 않았고, CDK1의 티로신 15 잔기에서의 인산화 CDK1 억제 키나아제인 Wee1도 변하지 않았다. CDK1-사이클린 B1에 의한 Plk1의 트레오닌 210 인산화 또한 RARRES1 과발현 세포에서 감소하였다(도 6a). Cycin B1 mRNA는 실시예 1-2에 따른 RT-PCR로 측정했을 때 두 형질 전환 세포 모두에서 변하지 않았다. mRNA 발현은 방출 후 8 시간째에 최고조에 달했다(도 6b). 결론적으로, 이들 결과는 HEK293 세포에서 RARRES1이 과발현 될 때, cyclin B1의 활성과 관련이 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 유사 분열에서 CDK1-사이클린 B1 복합체 형성을 억제시키는 RARRES1

RARRES1이 직접 결합을 통하여 유사 분열 동안 cyclin B1 활성화에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, HEK293 세포를 lipofectamine LTX / PLUS를 사용하여 RARRES1 및 glutathione S-transferase(GST) 표지된 cyclin B1으로 실시예 1-1의 방법에 따라 공동 형질 감염시키고 세포 용해물의 GST 비드로 실시예 1-8에 따른 면역 침전시켰다. RARRES1이 cyclin B1에 직접 결합함을 보여준다. 흥미롭게도, cyclin B1은 RARRES1이 없는 상태에서보다, RARRES1이 존재하는 상태에서 내인성 CDK1과 덜 효율적으로 상호 작용했다. 같은 조건에서 CDK1의 발현은 같았다(도 7a). 다음으로, RARRES1의 존재가 어떻게 CDK1-사이클린 B1 복합체 형성을 감소시키는지를 조사했다. GST 풀 다운 분석은 실시예 1-1의 방법에 따른 RARRES1 및 GST-CDK1 동시 형질 감염 293 세포에서 수행되었다. CDK1은 RARRES1과 직접 상호 작용하고 RARRES1의 존재하에 내인성 cyclin B1에 대한 결합을 감소시켰다. 상대적으로, cyclin B1의 발현은 RARRES1의 없을 때보다 존재할 때 약간 감소하였다(도 7b). cyclin B1 또는 CDK1과 RARRES1의 상호 작용을 확인하기 위해, 우리는 유사 분열(+nocodazole, 50ng/ml) 또는 기하 급수적으로 성장하는(-nocodazole) 293 세포로부터 RARRES1에 특이적인 항체로 침전시켰다. 내인성 CDK1은 nocodazole 치료와 관계없이 RARRES1과 관련이 있지만, 유사 분열에서 RARRES1에 주로 결합한 내인성 cyclin B1(도 7c)은 RARRES1이 유사 분열에서 CDK1-사이클린 B1 복합체의 내인성 억제제임을 시사한다.

또한, RARRES1이 간기 CDKs(CDK2, CDK4, CDK6) 및 그들의 결합 파트너 사이클린들을 포함하여 다른 CDK-사이클린 복합체와 상호 작용하는지 여부를 조사하였고, 도 7c와 동일한 조건 하에서 293 세포에서 실시예 1-8에 따른 면역 침전을 수행했다. CDK4- 사이클린 D 및 CDK2- 사이클린 A 복합체의 각 성분은 RARRES1에 결합하지 않았다(도 8a 및 도 8b). 이러한 결과는 RARRES1이 유사 분열에서 CDK1-cyclin B1 복합체 형성을 특이적으로 억제한다는 것을 시사한다.

실시예 6. CDK1과 결합하는 RARRES1 단백질의 아미노산 부위 탐색

RARRES1 단백질 중 어느 아미노산 부위가 CDK1직접 결합을 하는지 알아내기 위해 RARRES1 단백질 서열을 50개씩 결실을 달리한 돌연변이체를 만든 후(도 9a) His-CDK1과 함께 실시예 1-1의 방법으로 형질 감염시킨 293 세포에서 실시예 1-8에 따른 면역 침전을 수행했다. RARRES1의 카복실말단 251-294 아미노산이 결실된 돌연변이체에서 CDK1에 대한 결합이 거의 일어나지 않았다(도 9b). 이러한 결과는 RARRES1의 카복실말단이 CDK1결합에 중요한 부위임을 시사한다.

실시예 7. 리소좀에서 일어나는 RARRES1에 의한 CDK1의 분해

또한 RARRES1을 CDK1과 함께 실시예 1-1의 방법으로 형질 감염시키면 CDK1 단백질의 양이 감소하였다. CDK1의 단백질의 양적인 변화가 어떠한 조절을 통해서 이루어지는지 알아보고자 단백질 분해억제제들을 세포에 처리하였다. 리소좀에 의한 단백질분해를 방해하는 억제제인 Bafilomycin(BafA1) 또는 E64D와 pepstatin A(E/P)을 같이 처리하였을 때 RARRES1에 의해 감소되었던 CDK1 단백질의 양이 다시 증가되었다. 반면에 프로테아좀에 의한 단백질분해를 방해하는 억제제인 MG132를 세포에 처리하였을 때는 여전히 RARRES1에 의해 CDK1의 단백질이 감소하였다(도 10). 결론적으로, 이들 결과로부터 RARRES1의 카복실말단을 통한 CDK1과의 결합이 리소좀을 통한 CDK1의 단백질 불안정성을 야기시킴을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> National Cancer Center <120> A method for screening a therapeutic agent for cancer using binding inhibitor of Cyclin-dependent kinase 1(CDK1) - Cyclin B1 <130> MP18-187_분할 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 433 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(433) <223> Cyclin B1 <400> 1 Met Ala Leu Arg Val Thr Arg Asn Ser Lys Ile Asn Ala Glu Asn Lys 1 5 10 15 Ala Lys Ile Asn Met Ala Gly Ala Lys Arg Val Pro Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Ala Thr Ser Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile 35 40 45 Gly Asn Lys Val Ser Glu Gln Leu Gln Ala Lys Met Pro Met Lys Lys 50 55 60 Glu Ala Lys Pro Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile Asp Lys Lys Leu Pro 65 70 75 80 Lys Pro Leu Glu Lys Val Pro Met Leu Val Pro Val Pro Val Ser Glu 85 90 95 Pro Val Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Val Lys Glu 100 105 110 Glu Lys Leu Ser Pro Glu Pro Ile Leu Val Asp Thr Ala Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Met Glu Thr Ser Gly Cys Ala Pro Ala Glu Glu Asp Leu Cys Gln 130 135 140 Ala Phe Ser Asp 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Gln Pro Arg Arg Gln Arg Leu Pro Ala Pro Trp Ser Gly Pro Arg 1 5 10 15 Gly Pro Arg Pro Thr Ala Pro Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala 20 25 30 Pro Val Ala Ala Pro Ala Gly Ser Gly Asp Pro Asp Asp Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Gln Asp Ala Gly Val Pro Arg Arg Leu Leu Gln Gln Ala Ala Arg 50 55 60 Ala Ala Leu His Phe Phe Asn Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Ala Leu 65 70 75 80 Arg Val Leu Ala Glu Val Gln Glu Gly Arg Ala Trp Ile Asn Pro Lys 85 90 95 Glu Gly Cys Lys Val His Val Val Phe Ser Thr Glu Arg Tyr Asn Pro 100 105 110 Glu Ser Leu Leu Gln Glu Gly Glu Gly Arg Leu Gly Lys Cys Ser Ala 115 120 125 Arg Val Phe Phe Lys Asn Gln Lys Pro Arg Pro Thr Ile Asn Val Thr 130 135 140 Cys Thr Arg Leu Ile Glu Lys Lys Lys Arg Gln Gln Glu Asp Tyr Leu 145 150 155 160 Leu Tyr Lys Gln Met Lys Gln Leu Lys Asn Pro Leu Glu Ile Val Ser 165 170 175 Ile Pro Asp Asn His Gly His Ile Asp Pro Ser Leu Arg Leu Ile Trp 180 185 190 Asp Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ser Tyr Val Met Trp Glu Met Thr Thr 195 200 205 Gln Val Ser His Tyr Tyr Leu Ala Gln Leu Thr Ser Val Arg Gln Trp 210 215 220 Val Arg Lys Thr 225 <210> 4 <211> 1545 <212> RNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (1)..(1545) <223> RARRES1 isoform 1 <400> 4 tttccgcgag cgccggcact gcccgctccg agcccgtgtc tgtcgggtgc cgagccaact 60 ttcctgcgtc catgcagccc cgccggcaac ggctgcctgc tccctggtcc gggcccaggg 120 gcccgcgccc caccgccccg ctgctcgcgc tgctgctgtt gctcgccccg gtggcggcgc 180 ccgcggggtc cggggacccc gacgaccctg ggcagcctca ggatgctggg gtcccgcgca 240 ggctcctgca gcaggcggcg cgcgcggcgc ttcacttctt caacttccgg tccggctcgc 300 ccagcgcgct acgagtgctg gccgaggtgc aggagggccg cgcgtggatt aatccaaaag 360 agggatgtaa agttcacgtg gtcttcagca cagagcgcta caacccagag tctttacttc 420 aggaaggtga gggacgtttg gggaaatgtt ctgctcgagt gtttttcaag aatcagaaac 480 ccagaccaac catcaatgta acttgtacac ggctcatcga gaaaaagaaa agacaacaag 540 aggattacct gctttacaag caaatgaagc aactgaaaaa ccccttggaa atagtcagca 600 tacctgataa tcatggacat attgatccct ctctgagact catctgggat ttggctttcc 660 ttggaagctc ttacgtgatg tgggaaatga caacacaggt gtcacactac tacttggcac 720 agctcactag tgtgaggcag tggaaaacta atgatgatac aattgatttt gattatactg 780 ttctacttca tgaattatca acacaggaaa taattccctg tcgcattcac ttggtctggt 840 accctggcaa acctcttaaa gtgaagtacc actgtcaaga gctacagaca ccagaagaag 900 cctccggaac tgaagaagga tcagctgtag taccaacaga gcttagtaat ttctaaaaag 960 aaaaaatgat ctttttccga cttctaaaca agtgactata ctagcataaa tcattcttct 1020 agtaaaacag ctaaggtata gacattctaa taatttggga aaacctatga ttacaagtaa 1080 aaactcagaa atgcaaagat gttggttttt tgtttctcag tctgctttag cttttaactc 1140 tggaagcgca tgcacactga actctgctca gtgctaaaca gtcaccagca ggttcctcag 1200 ggtttcagcc ctaaaatgta aaacctggat aatcagtgta tgttgcacca gaatcagcat 1260 ttttttttta actgcaaaaa atgatggtct catctctgaa tttatatttc tcattctttt 1320 gaacatacta tagctaatat attttatgtt gctaaattgc ttctatctag catgttaaac 1380 aaagataata tactttcgat gaaagtaaat tataggaaaa aaattaactg ttttaaaaag 1440 aacttgatta tgttttatga tttcaggcaa gtattcattt ttaacttgct acctactttt 1500 aaataaatgt ttacatttct aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1545 <210> 5 <211> 883 <212> RNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (1)..(883) <223> RARRES1 isoform 2 <400> 5 tttccgcgag cgccggcact gcccgctccg agcccgtgtc tgtcgggtgc cgagccaact 60 ttcctgcgtc catgcagccc cgccggcaac ggctgcctgc tccctggtcc gggcccaggg 120 gcccgcgccc caccgccccg ctgctcgcgc tgctgctgtt gctcgccccg gtggcggcgc 180 ccgcggggtc cggggacccc gacgaccctg ggcagcctca ggatgctggg gtcccgcgca 240 ggctcctgca gcaggcggcg cgcgcggcgc ttcacttctt caacttccgg tccggctcgc 300 ccagcgcgct acgagtgctg gccgaggtgc aggagggccg cgcgtggatt aatccaaaag 360 agggatgtaa agttcacgtg gtcttcagca cagagcgcta caacccagag tctttacttc 420 aggaaggtga gggacgtttg gggaaatgtt ctgctcgagt gtttttcaag aatcagaaac 480 ccagaccaac catcaatgta acttgtacac ggctcatcga gaaaaagaaa agacaacaag 540 aggattacct gctttacaag caaatgaagc aactgaaaaa ccccttggaa atagtcagca 600 tacctgataa tcatggacat attgatccct ctctgagact catctgggat ttggctttcc 660 ttggaagctc ttacgtgatg tgggaaatga caacacaggt gtcacactac tacttggcac 720 agctcactag tgtgaggcag tgggtaagaa aaacctgaaa attaacttgt gccacaagag 780 ttacaatcaa agtggtctcc ttagactgaa ttcatgcgaa cttctaattt catatcaaga 840 gttgtaatca catttatttc aataaatatg tgagttcctg caa 883 <210> 6 <211> 44 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SITE <222> (1)..(44) <223> 251~294 peptides derived from RARRES1 isoform 1 <400> 6 Arg Ile His Leu Val Trp Tyr Pro Gly Lys Pro Leu Lys Val Lys Tyr 1 5 10 15 His Cys Gln Glu Leu Gln Thr Pro Glu Glu Ala Ser Gly Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Ala Val Val Pro Thr Glu Leu Ser Asn Phe 35 40 <210> 7 <211> 183 <212> RNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (1)..(183) <223> 771~953 mRNA derived from RARRES1 isoform 1 full length <400> 7 gattatactg ttctacttca tgaattatca acacaggaaa taattccctg tcgcattcac 60 ttggtctggt accctggcaa acctcttaaa gtgaagtacc actgtcaaga gctacagaca 120 ccagaagaag cctccggaac tgaagaagga tcagctgtag taccaacaga gcttagtaat 180 ttc 183

Claims (10)

1. 서열번호 7의 염기서열의 레티노산 수용체 반응인자 1(Retinoic acid receptor responder 1; RARRES1) mRNA 또는 서열번호 6의 아미노산 서열의 RARRES1 펩티드 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물로서,
   상기 RARRES1 펩티드의 발현은 폐암 세포에서 억제된 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
   
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3. 삭제
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7. 제1항의 조성물을 포함하는, 폐암 진단 또는 예후 예측용 키트.
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