KR20140092422A - Ｓ１００ａ９ 및 ｅｇｆｒ에 대한 저해제와 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ｓ１００ａ９ 및 ｅｇｆｒ에 대한 저해제와 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법, 근육 침윤성 방광암의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법, 및 S100A9 및 EGFR의 저해제와 시스플라틴(cisplatin)을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 근육 침윤성 방광암 환자의 화학요법치료 후의 예후에 대한 정확한 예측이 가능하며, 근육 침윤성 방광암 환자의 화학요법치료를 위한 개인 맞춤형 의약을 제공함에 있어서 시스플라틴의 민감도에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 기존의 시스플라틴 투여와 병행하여 S100A9과 EGFR의 저해제를 병용 투여함으로써 근육 침윤성 방광암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다.

Description

Ｓ１００Ａ９ 및 ＥＧＦＲ에 대한 저해제와 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF MIBC COMPRISING INHIBITOR OF S100A9 AND EGFR AND CISPLATIN AS EFFECTIVE COMPONENTS}
본 발명은 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법, 근육 침윤성 방광암의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법, 및 S100A9 및 EGFR의 저해제와 시스플라틴(cisplatin)을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
방광암은 두 번째로 가장 일반적인 비뇨생식기 종양이며, 이 종양의 90% 이상은 요로상피세포암종이다. 새로이 진단된 방광암 환자의 거의 25%는 근육 침윤성 방광암 (MIBC)을 가지고 있고, 이 종양의 대부분은 높은 조직학적 등급을 가진다. 뿐만 아니라, 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자의 거의 50%는 진단 시점에 이미 잠재적 원격 전이를 가지고 있다.
근치적 방광절제술은 근육 침윤성 방광암 (MIBC)의 표준 치료임에도 불구하고, 이 환자들의 약 50%는 2년 이내에 전이되고, 수술 이후에 5년 생존율이 약 50%이다. 전신성 시스플라틴을 근간으로 하는 병용화학요법은 전이성 방광암을 가진 환자를 위한 1차 치료 양식이다. 그러나, 진행암 환자에게서 40~70%로 보고되는 높은 초기 반응률에도 불구하고, 화학요법은 대개는 치유력이 없었으며, 전반적인 5년 생존율은 5~15%에 불과하다. 수행도 및 내장전이의 발현은 시스플라틴을 근간으로 하는 화학요법으로 치료한 환자에게서 부정적인 예후를 예측하는 것으로 입증된, 수립된 예후 인자이다. 그러나, 이러한 임상병리적 인자들은 생존 지표로서 유용한 반면, 환자 개개인의 반응률 또는 생존율을 예측하기에는 적절하지 않다. 따라서, 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자의 화학요법 반응 및 환자 개개인에서 이러한 관계의 예측력에서의 유전자의 역할에 대한 관심이 증가하고 있다.
지금까지는, 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자와 다른 많은 암 환자의 사례에서, 개별 환자의 화학요법에 대한 반응을 예측하게 해 주는 정보가 부족했다. 따라서, 일부 환자들은 이러한 독성이 강한 약물들의 의도된 작용의 혜택을 받지 못하고, 부작용을 겪는다. 아마도 더욱 중요한 사실은, 환자들의 신체 상태가 나빠짐에 따라, 이러한 불필요한 치료를 받은 환자들의 일부는 추가적인 치료를 받지 못할 수 있다는 점이다.
우리의 이전 연구에서, 유전자발현프로필 분석은 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자의 진행에 대한 유전형을 확인하기 위한 목적으로 수행되었다. 마이크로어레이 자료 분석에 의해 확인된 1,320개의 유전자 중에서 4개의 유전자 (IL1B , S100A8 , S100A9 , 및 EGFR )가 질병 진행을 예측하는 데 중요한 것으로 정해졌다. 이번 연구에서, 우리는 이 4개의 유전자형이 국소적으로 재발하거나 전이된 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자에 대한 화학요법 이후에 질병 진행을 예측하는 데 사용될 수 있는지 연구하였다.
특허문헌 KR 10-2007-0018108
본 발명에서 해결하기 위한 과제는, 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 근육 침윤성 방광암의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 S100A9 및 EGFR의 저해제와 스플라틴(cisplatin)을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 화학요법치료 후 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
상기 발현량은 mRNA 또는 단백질의 발현량인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 근육 침윤성 방광암(MIBC) 환자의 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 화학요법치료의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 발현량은 mRNA 또는 단백질의 발현량인 것이 바람직하다.
상기 화학요법치료는 시스플라틴(cisplatin) 기반 화학요법치료인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 S100A9 및 EGFR에 대한 저해제와 시스플라틴(cisplatin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 저해제는 S100A9 및 EGFR의 siRNAs인 것이 바람직하다.
상기 저해제는 S100A9 및 EGFR의 단백질 저해제인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 근육 침윤성 방광암 환자의 화학요법치료 후의 예후에 대한 정확한 예측이 가능하며, 근육 침윤성 방광암 환자의 화학요법치료를 위한 개인 맞춤형 의약을 제공함에 있어서 시스플라틴의 민감도에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 기존의 시스플라틴 투여와 병행하여 S100A9과 EGFR의 저해제를 병용 투여함으로써 근육 침윤성 방광암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다.
도 1은 화학요법치료를 받은 재발성 또는 전이성 MIBC 환자의 시간 경과에 따른 진행 가능성을 signature group 별로 비교한 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 화학요법치료를 받은 재발성 또는 전이성 MIBC 환자의 시간 경과에 따른 overall survival 및 cancer-specific survival을 signature group 별로 비교한 그래프이다.
도 3a 내지 도 3f는 방광암에서 S100A9 및 EGFR에 대한 immunohistochemical staining을 보여주는 그림 또는 그래프이다.
도 4는 과발현된 S100A9이 증가된 migration, proliferation, 시스플라틴 유도 세포사멸에 대한 저항을 유도함을 보여준다.
도 5는 EGFR 발현은 시스플라틴 치료에 의한 세포사멸과 동시에 발생함을 보여준다.
도 6은 S100A9 및 EGFR의 저해는 시스플라틴 치료에서 증가된 감수성을 유도함을 보여준다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 화학요법치료 후 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 근육 침윤성 방광암 환자의 화학요법치료 후 국소적 재발 또는 전이 가능성은 S100A9 및 EGFR의 발현량과 상관 관계가 있음을 확인하였다.
보다 구체적으로, 근육 침윤성 방광암의 재발 또는 전이 예후를 보인 환자의 대부분에서 S100A9 및 EGFR의 발현량 증가를 보였으며, 이는 S100A9 및 EGFR의 mRNA 또는 단백질의 발현량의 증가이다.
또한, 본 발명은 근육 침윤성 방광암(MIBC) 환자의 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 화학요법치료의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 발현량은 S100A9 및 EGFR의 mRNA 또는 단백질의 발현량이며, 상기 화학요법치료는 시스플라틴(cisplatin) 기반 화학요법치료이다.
본 발명의 상기 방법에 의하면, 근육 침윤성 방광암 환자에 대한 시스플라틴 기반 화학요법치료의 개인 맞춤형 의약에 대한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 S100A9 및 EGFR에 대한 저해제와 시스플라틴(cisplatin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 저해제는 S100A9 및 EGFR의 siRNAs 또는 단백질 저해제인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 기존 시스플라틴 단독 투여와 같은 화학요법치료와 비교하여 시스플라틴에 대한 약제 민감성을 현저히 상승시킴으로써 소량의 약물 투여로도 시스플라틴 단독 투여의 경우와 비교하여 동등 또는 우수한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 근육 침윤성 방광암의 치료또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 근육 침윤성 방광암의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 근육 침윤성 방광암의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 근육 침윤성 방광암을 경감시킴.
(4) 근육 침윤성 방광암의 재발을 예방함, 및
(5) 근육 침윤성 방광암의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 근육 침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 유효성분을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 근육 침윤성 방광암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
또한, 본 발명에 상기 약학적으로 유효한 양은 근육 침윤성 방광암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 근육 침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 근육 침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 조성물은 근육 침윤성 방광암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
환자 및 조직 샘플
본 실시예의 연구 대상은 화학요법 치료를 받은, 국소적으로 재발하거나 전이된 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자들로 구성되었다. 선택 또는 이전 연구 결과의 지식으로부터의 치우침을 최소화하기 위하여 본 실시예의 환자 코호트는 근육 침윤성 방광암 (MIBC)에 대한 본 발명자들의 이전 연구에 등록된 환자들과는 다르게 하였다. 국소적으로 재발한 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자들은 이전에 근치적 방광절제술을 받았지만, 그 후에 국소적 또는 림프절 재발로 진행하였다. 전이성 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자들은 내장 기관에 전이되었다. 양호한 수행도 (PS) (ECOG 0 또는 1)를 가진 환자들만 등록하여 이러한 기능적 변수의 혼동 효과를 제거하였다. 등록된 모든 환자들은 시스플라틴에 근거한 화학요법을 최소한 4 사이클 치료받았다. 어떤 이유로 인해 방사선요법으로 추가적인 치료를 받은 환자들 또는 수술과 연관된 심각한 합병증을 겪은 환자들은 제외하였다. 근치적 방광절제술 상태에 상관없이, 최소한 3개월에 한 번 CT 스캔 또는 MRI와 같은 이미지 검사를 받지 않은 환자들 또한 본 연구에서 제외되었다. 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 일차 샘플은 본 발명자들이 소속된 병원에서 본 실시예의 연구에 등록된, 조직학적으로 증명된 요로상피세포암종을 가진 69명의 환자들로부터 얻었다.
모든 종양들은 일반적으로 외과적 절제술의 15분 이내에 매크로-해부되었다. 각각의 방광암 표본은 방광절제술 및 요도경유절제술 표본의 신선 동결 절편에 있는 인접한 조직의 분석에 의해 견본으로 확인되었다. 그 다음에 종양 표본들은 사용할 때까지 액체 질소에 얼려서 -80℃에서 보관되었다. 모든 샘플들의 수집과 분석은 충북대학교 생명의학연구윤리심의위원회의 승인을 받았다. 본 실시예의 연구에 등록된 각 환자들로부터 동의서를 득하였다 (IRB 승인 번호: 2006-01-001).
종양은 2002 TNM 분류법 및 1973 WHO 등급 시스템에 따라 병기를 결정하였다. 본 실시예에서, 질병 진행은 화학요법 이후에 새로이 진단된 원격 전이 및 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 종양 덩어리에서 a = 20% 증가로 정의되었다.
시약
TRIzol과 First-Strand cDNA synthesis kit는 Invitrogen(Caelsbad, CA) 및 Amersham Biosciences(Freiburg, Germany)로부터 구입하였다. Ventana Ultraview DAB Kit는 Ventana Medical Systems(Tucson, AZ)로부터 구입하였다. Heat-inactivated fetal bovine serum(FBS) 및 Lipofectamine 2000은 Invitrogen으로부터 구입하였다. Protein inhibitor cocktail tablets는 Roche Diagnostics(Basel, Switzerland)로부터 구입하였다. Micro BCA protein assay kit는 Pierce(Rockford, IL)로부터 구입하였다. Premade SDS-PAGE gels, Coomassie Blue R-250 staining solution 및 destaining sulution은 Bio-Rad(Hercules, CA)로부터 구입하였다. EGFR, S100A9 및 NON-TARGET controls에 대한 Small interfering RNAs(siRNAs)를 Dharmacon(Chicago, IL)로부터 구입하였다. EGFR 및 β-actin에 대한 Antibodies는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)로부터 구입하였다. S100A9에 대한 Antibody는 AbCam(West Grove, PA)로부터 구입하였다. 모든 다른 시약들은 Sigma-Aldrich 또는 Promega(Madison, WI)로부터 구입하였다.
RNA 추출 및 cDNA 합성
1ml의 TRIzol을 사용하여 malignant bladder tissue로부터 분리된 Total RNA를 5ml glass tube에서 homogenization시켰다. homogenate를 1.5ml tube로 옮기고, 200μl의 chloroform으로 혼합하였다. 4℃에서 5분 동안 incubation한 후, homogenate를 13,000×g 및 4℃에서 13분 동안 centrifugation하였다. upper aqueous phase을 clean tube로 옮기고, 500μl의 isopropanol을 첨가하였다. samples을 4℃에서 60분 동안 incubation시키고, 13,000×g 및 4℃에서 8분 동안 centrifugation하였다. upper aqueous phase을 버리고, pellet을 500μl의 75% ethanol로 resuspending한 후, 13,000×g 및 4℃에서 5분 동안 centrifugation하였다. upper aqueous layer을 제거하고, pellet을 실온에서 건조시킨 후, diethylpyrocarbonate(DEPC)-treated water에 녹이고, 80℃에 보관하였다. RNA의 순도는 agarose gel electrophoresis와 ethidium bromide staining 후 ultraviolet light하에서 visual inspection으로 확인하였다. cDNA는 1μg의 random primers와 First-Strand cDNA synthesis kit(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 준비하였다.
RT - PCR 분석
4 genes의 expression을 Rotor-Gene 6000 system(Corbett Research, Mortlake, Australia)을 사용하여 real-time PCR으로 정량하였다. assays는 SYBR Premix EX Taq (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan)을 사용하여 micro-reaction tubes(Corbett Research, Mortlake, Australia)에서 수행하였다. 본 발명에서 분석된 4 genes의 증폭을 위하여 사용된 primers는 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
PCR은 5μl의 2× SYBR Premix EX Taq buffer, 각각 0.5μl의 sense 및 antisense primers(10 pmol/μl), 및 1μl의 sample cDNA를 final reaction volume 10μl로 수행하였다. amplified products를 QIAquick extraction kit(QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하고, spectrophotometer(Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA)로 정량하였다. Fragments를 automated laser fluorescence sequencer(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI)로 sequencing하였다. 100 내지 0.1pg/μl의 범위의 알려진 농도를 얻기 위하여 Ten-fold serial dilutions을 준비하였다. dilution series는 real-time PCR의 standard curve를 얻기 위하여 다음의 조건으로 수행하였다: (i) denaturation, 96℃에서 20sec 동안 1cycle 후, 96℃에서 2sec 동안 40cycle; (ii) annealing, 60℃에서 15sec; 및 (iii) extension, 72℃에서 15sec. melting program을 45sec 당 1℃의 속도로 heating하면서 72~95℃의 범위 내에서 수행하였다. Spectral data를 capture하고, Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14(Corbett Research, Mortlake, Australia)를 사용하여 분석하였다. 모든 samples은 3회 반복하였다. gene expression은 β-globin expression으로 normalization되었다.
Immunohistochemical staining
38 bladder cancer cases로부터의 Paraffin blocks을 immunohistochemical analysis에 사용하였다. Tissue sections을 cut하고, Superfrost Plus microscope slides(Fisher Scientific)에 두었다. Benchmark XT automated immunohistochemistry stainer(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA)를 사용하여, slides를 다음의 과정으로 staining하였다. Detection을 Ventana Ultraview DAB Kit(Ventana Medical Systems)를 사용하여 수행하였다. Sections을 EZ Prep solution을 사용하여 deparaffinization하였다. CC1 standard(Tris/Borate/EDTA을 포함하는 pH 8.4 buffer)를 antigen retrieval을 위하여 사용하였다. DAB inhibitor(3% H2O2, Endogenous peroxidase) 37℃에서 4분 동안 blocking하였다. Sections을 anti-EGFR(Abcam Inc., San Diego, CA, dilution 1/100) 및 anti-S100A9 primary antibody(Abcam Inc., San Diego, CA, dilution 1/100)로 37℃에서 40분 동안, secondary antibody로서 Univeral HRP Multimer로 37℃에서 8분 동안 incubation하였다. Slides를 DAB + H2O2 substrate에 8분 동안 처리하고, hematoxylin과 bluing reagent로 37℃에서 counterstaining하였다. Reaction buffer(pH 7.6 Tris buffer)를 washing solution으로 사용하였다. positively-stained cells의 staining intensity와 proportion을 평가하였다. EGFR와 S100A9를 먼저 cytoplasm에 위치시켰다. Staining intensity는 다음과 같이 분류하였다: none, weak, moderate 및 strong. 각 specimen을 검사하고, 3인의 조사자에 의하여 개별적으로 scoring하고, 합의에 도달할 때까지 편차를 조절하였다.
Cell culture 및 transfection
T24 human bladder cancer cells을 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하고, 10% FBS와 1% Penicillin/Streptomycin이 포함된 RPMI1640 media(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37℃에서 5% CO2 조건하에서 유지시켰다. ~80% confluence인 T24 cells을 EGFR 및 S100A9의 expressing constructs 또는 small interfering RNAs(siRNAs)로 Lipofactamine 2000를 사용하여 transient transfection시켰다. S100A9 overexpression을 위하여, pCMV-Sports6-S100A9와 vector constructs는 Dr. A. Moon(Duksung Univeristy, Korea)로부터 제공받았다. transfection controls로서, empty (Ctrl) 또는 NON-TARGET control siRNAs (siCtrl)를 사용하였다.
Western blot 분석
Whole cell lysates를 ice 상에서 NP40-containing lysis buffer(1% Nonidet P-40, 50mM Tris pH 7.4, 10mM NaCl, 1mM NaF, 5mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM PMSF 및 protease inhibitor cocktail)로 추출하였다. 강하게 vortexing한 후, lysates를 12,000 × g에서 15분 동안 centrifugation하여 debris를 제거하였다. Protein concentration를 microBCA(Pierce/Thermo Scientific)로 결정하고, 25μg의 proteins을 SDS-PAGE separation에 적용한 후, western blot analysis을 수행하였다. Secondary antibodies와 Micro BCA protein assay kit는 Pierce(Rockford, IL, USA)로부터 입수하였다. ECL™ detection system을 사용하여 blotting signal detection을 수행하고, densitometry(Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK)에 적용하여 band intensities를 측정하였다.
Wound - healing assay
cell density가 약 90%에 도달한 후, 6-well plates에서 Wound healing assays를 수행하였다. T24 cells을 sharp tip으로 약하게 scratching하고, plates를 현미경으로 관찰하기 전에 추가적으로 8h 동안 incubation하였다.
Cell proliferation assay
T24 bladder cancer cells을 10% FBS-함유 성장 배지에서 5x103 cells/well의 밀도로 6-well culture plates에 플레이팅하였다. S100A9를 overexpression하기 위하여, Lipofectamine 2000을 사용하여 transient transfection을 수행하였다. transfection 24h 후, cells를 16h 동안 serum-starvation시켰다. proliferation assay를 위하여 배지를 정상 성장 배지로 대체하였다. Cell proliferation rate를 0, 1 및 2일에서 crystal violet staining으로 결정하였다. 요약하면, cells를 crystal violet solution으로 염색하고, 염색된 cells를 10% acetic acid solution에 용해시킴으로써 정량하였다. Colorimetric measurement을 570nm에서 흡광도 측정하였다.
Cell viability assay
T24 cells이 다양한 constructs 또는 siRNAs로 transfection되었고, cells는 지시된 시간 동안 drugs(예를 들어, cisplatin 또는 Iressa)를 포함하는 serum free medium에서 incubation되었다. Cell viability는 제조사의 protocol(Promega Corporation, Madison, WI)에 지시된 바에 따라 MTS reagents를 사용하여 결정하였다.
데이터 및 통계 분석
각 유전자의 mRNA 발현 수준이 매우 비대칭으로 분포하기 때문에 결과의 해석을 위해 자료를 자연로그로 변환하고 그 다음 역변환 하였다. 화학요법 이후의 질병 진행과 유전자형 간의 연관성은 단변량 콕스 회귀 분석을 사용하여 평가하였다. 진행까지의 시간은 카플란-마이어 방법에 따라 계산하였고, 시간들 간의 차는 로그 순위 검정 통계법을 이용하여 평가하였다.
진행-관련 유전자 4개의 단변량 콕스 분석 후에, 2개의 유전자는, 대응하는 회귀 계수를 곱하여 각 유전자의 발현 수준의 합으로 정의된, 각 환자에 대한 질병 진행의 위험도 점수를 계산하기 위해 사용되었다. ROC 곡선은, 질병의 진행에 대하여 가장 높은 결합 민감도 및 특이도를 산출하는 각 위험도 점수에 대한 최적 절사점을 확인하였다. 이러한 수치에 근거하여 환자들은 좋은- 또는 부족한- 예후의 유전자형 그룹으로 분류되었다. 유전자 발현형의 예측인자는 다변량 콕스 비례위험 회귀모형에 의해 결정되었다. 화학요법 이후의 질병 진행과 면역조직화학염색 결과 간의 연관성은 Fisher의 정확 검정을 사용해서 평가하였고, mRNA 발현 수준과 면역조직화학염색 강도 간의 상관 관계는 Spearman 순위 상관에 의해 평가되었다. 시험관내 실험에서, p-값은 언페어드 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산하였다. 통계 분석은, p<0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주하여, SPSS 19.0 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하여 시행되었다.
결 과
기준치 특성
화학요법으로 치료받은 69명 환자들의 평균 나이는 64.74±8.97세였고, 평균 추적관찰 기간은 46.24±56.24개월이었다. 54명 (78.3%)의 환자들은 내장 전이 없이 국소적으로 재발하였고, 15명 (21.7%)의 환자들은 다른 기관에 전이되었다. 40명 (58.0%)의 환자들은 이전에 근치적 방광절제술을 받았다. 환자들의 다른 기준치 특성들은 표 2에 나와 있다.
Figure pat00002
국소적으로 재발하거나 전이된 근육 침윤성 방광암 ( MIBC )에서 질병 진행과 관련 있는 유전자의 확인
이전 연구에서 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 결정된 4개 유전자 (IL1B , S100A8 , S100A9, 및 EGFR)들의 단변량 콕스 회귀 분석이 시행되었다. 그 중 2개 유전자 S100A9 와 EGFR은 질병 진행에 유의하게 관련 있었다 (p=0.023, p=0.045, 각각). 그리고 나서 2개의 이 유전자들은 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자들에서 화학요법 이후의 질병 진행 위험도 점수를 계산하기 위해 사용되었다. 위험도 점수는 환자들의 두 그룹을 확인하였다. 좋은-예후형 그룹은 2개 유전자의 비교적 낮은 발현 수준을 보였고, 나쁜-예후형 그룹은 현저하게 더 높은 발현을 보였다. 절사점 (36.1683)은 질병 진행에 대해 ROC 곡선에 근거하여 가장 높게 결합된 민감도 (91.9%)와 특이도 (56.3%)로 결정되었다.
국소 재발 또는 전이성 근육 침윤성 방광암 ( MIBC ) 환자에서 질병 진행에 대한 2개 유전자형의 예측인자
두 그룹의 비교는 진행까지의 시간이 좋은-예후형 그룹에서 유의하게 더 길다는 것을 보여주었다 (p<0.001)(도 1). 단변량 콕스 회귀 분석은 전이, 이전의 방광절제술, 및 결합된 유전자형이 화학요법 이후의 질병 진행에 상당히 큰 영향을 주는 요인임을 보여주었다 (표 3). 다변량 콕스 회귀 분석에서는, 결합한 유전자형만이 화학요법 이후에 국소 재발 또는 전이성 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자에서의 질병 진행에 상당히 큰 영향을 주는 요인이었다 (표 3).
Figure pat00003
좋은-예후형 그룹은 부족한-예후형 그룹보다 유의하게 더 긴 암-특이 생존 기간을 가졌다 (p=0.010)(도 2b). 그러나, 전반적인 생존 기간은 좋은-예후형 그룹에서 미미하게 길어졌다 (p=0.072) (도 2a).
방광암에서 S100A9 및 EGFR 의 면역조직화학염색
S100A9 / EGFR이 화학요법 이후에 국소 재발 또는 전이성 근육 침윤성 방광암 (MIBC)에 대한 새로운 진단 인자일 것임을 제시하는 본 발명자들의 발견을 확장하기 위하여 예측 인자로서 S100A9/EGFR 단백질의 가치를 평가하였다. S100A9 및 EGFR 단백질의 단백질 발현 수준이 방광암 샘플 38개에서 면역조직화학적 분석에 의해 평가되었다. S100A9 및 EGFR의 다양한 강도 (없음부터 강함까지)가 암 조직에서 발견되었다 (도 3a 내지 도 3f). S100A9는 세포질과 핵에서 발견되었고 (도 3a), EGFR은 세포질, 핵 및 형질막에서 발견되었다 (도 3c). EGFR 양성도는 우리의 근육 침윤성 방광암 (MIBC) 환자들에서 화학요법 이후의 질병 진행과 미미한 연관이 있었다 (p=0.106). 그러나, S100A9 양성도는 질병 진행과 강한 상관 관계가 있었다 (p=0.047). 화학요법 이후에 질병이 진행된 방광암 환자의 65% (23명 중 15명)는 높은 S100A9 수준을 보였고, 진행되지 않은 환자의 26% (15명 중 4명)만이 높은 강도를 보였다 (표 4). 게다가, S100A9와 EGFR을 결합한 접근법은 질병의 진행과 상당히 많은 관련이 있었다 (p=0.018). 진행된 환자의 73.9% (23명 중 17명)는 높은 S100A9/EGFR 염색을 보였고, S100A9/EGFR 음성염색을 보인 환자는 없었다 (표 4). 특히, 우리는 S100A9 및 EGFR의 단백질 발현 강도가 S100A9 및 EGFR의 mRNA 수준과 좋은 상관 관계를 보임을 발견하였다 (r = 0.395, p = 0.014 및 r=0.453, p=0.004).
Figure pat00004
S100A9 과잉발현에 의한 과대-증식 및 시스플라틴에 의해 유도된 세포사멸
본 발명의 발명자들이 수행한 2개의 독립된 발현 분석 (qRT-PCR 및 IHC를 바탕으로 한)은 S100A9/EGFR이 방광암에서 시스플라틴을 근간으로 하는 화학요법 이후의 질병 진행에 대한 새로운 예후 인자임을 제시한다. S100A9 및 EGFR이 약제저항성에서 중요한 역할을 한다는 가설을 평가하기 위하여, 우리는 S100A9 또는 EGFR의 변형된 유전자 발현이 시스플라틴 치료에 대한 약제민감성을 조정하는지를 평가하기 위하여 시험관 내 기능적 분석을 시도하였다. 본 발명의 발명자들 또는 다른 연구 집단의 이전 논문들로부터의 자료는 S100A9가 방광암이 진행되는 동안 필수적인 역할을 할 것이라고 제시한다. 최근의 프로테오믹스 분석은 S100A9의 단백질 수준이 방광암 등급과 상관 관계가 있다고 나타내었다 (p<0.05). S100A9는 또한 본 발명자들에 의하여 근육 침윤성 방광암 (MIBC)에서 진단 인자의 4개 유전자형 중 하나로서 보고되었다. S100A9가 방광암의 약제민감성과 기능적 관련성을 갖는지 밝히기 위하여, 이 가설을 시험관 내에서 시험하기 위하여, T24 세포들은 S100A9 과잉발현 구성 또는 제어와 함께 핵산전달감염되었고, S100A9는 방광암 세포들의 이동 및 증식에 관련 있음을 발견하였다 (도 4의 B 및 C). 도 4의 B에서 보여지듯이, 상처-치유 분석 (wound-healing assay)은 S100A9 구성을 가진 핵산전달감염된 방광 종양세포는 더 빠르게 움직이고 제어 세포보다 더 빨리 경로를 채우는 것을 보여주었다. 강제적인 S100A9는 제어 세포와 비교하여, 배지에서 T24 세포의 증식 속도를 현저하게 증가시켰다 (Ctrl, 배지만으로 핵산전달감염된 T24 세포). 증가된 S100A9 수준은 T24 세포가 시스플라틴이 있을 때 더욱 생존 가능하도록 한다. 제어 세포의 세포 생존력은 10μM의 시스플라틴으로 치료한 2일 후에 약 20%로 감소하였다. 대조적으로, S100A9 발현 세포는 같은 치료에 의해 약 60%의 생존 가능한 세포를 보였다 (도 4의 D). S100A9의 증가한 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 확인되었다 (도 4의 A).
EGFR 발현 수준으로부터 시스플라틴에 의해 유도된 세포사멸에 대한 반응 변화
본 발명의 발명자들은 EGFR의 생물학적 역할을 평가하기 위하여 T24 방광암 세포에서 이익- 및 손실-의 기능적 연구를 수행하였다. EGFR의 과잉발현은 무혈청배지에서 10μM 시스플라틴이 있을 때 세포 생존 능력을 증가시켰다. 빈 배지로 핵산전달감염된 제어 T24 세포들은 시스플라틴 치료 18시간 후에 50% 생존력을 보였고, EGFR 과잉발현 세포는 24시간 치료까지 의미 있는 세포사멸을 보이지 않았다 (도 5의 B). RNAi를 사용한 EGFR의 발현 감소는 T24 세포가 시스플라틴에 의해 유도되는 세포사멸에 민감하도록 만든다 (도 5의 D). 제어 RNAi (siCtrl)은 시스플라틴 치료 6시간 후에 80%의 세포 생존력을 보였고, EGFR 발현 감소 (siEGFR-1 및 siEGFR-2)의 2 세트는 모두 30-40%의 제어 생존력을 나타내었다 (도 5의 D). EGFR의 과잉발현 또는 발현 감소 이후의 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다 (도 5의 A 및 C).
S100A9 및 EGFR 의 억제로부터 시스플라틴에 의해 유도된 세포사멸에 대한 T24 방광암 세포의 민감화 시너지 효과
도 6의 실험 자료는 S100A9 및 EGFR이 방광암 세포에서 화학요법 시약, 시스플라틴에 반응하여 역할을 함을 제시한다. 본 발명의 발명자들은 EGFR 및 S100A9의 하향조절이, 시스플라틴에 의해 유도되는 세포사멸의 수준을 바꾸는지를 시험하였다. EGFR 키나아제 활성도는 EGFR 키나아제 억제제인 Iressa (ZD1839, gefitinib)에 의해 하향조절 되었다. S100A9는 RNAi 접근법을 사용하여 무활동상태가 되었다. 제어 siRNA는 siRNA에 의한 비-표적 효과를 위한 대조군으로 사용되었다. EGFR 억제 (Iressa에 의한)는 생존력을 현저하게 감소시켰고, 시스플라틴에 대한 약제민감성을 증가시켰다 (도 6의 라인 2). 뿐만 아니라, S100A9 및 EGFR를 결합한 억제는 상승작용에 의해 T24 방광암 세포의 약제민감성을 증가시켰고 (도 6의 라인 4), 방광암 환자에 대한 시스플라틴에 근거한 화학요법 기간 동안 종종 관찰되는 약제저항성을 극복하는 가능성 있는 치료 전략을 제시한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 화학요법치료 후 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 재발 또는 전이 가능성을 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현량은 mRNA 또는 단백질의 발현량인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 근육 침윤성 방광암(MIBC) 환자의 S100A9 및 EGFR의 발현량을 측정하여 화학요법치료의 개인 맞춤형 의약(personalized medicine)에 관한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 발현량은 mRNA 또는 단백질의 발현량인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 화학요법치료는 시스플라틴(cisplatin) 기반 화학요법치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. S100A9 및 EGFR에 대한 저해제와 시스플라틴(cisplatin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 침윤성 방광암(MIBC)의 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 저해제는 S100A9 및 EGFR의 siRNAs인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 저해제는 S100A9 및 EGFR의 단백질 저해제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
KR1020120149641A 2012-12-20 2012-12-20 Ｓ１００ａ９ 및 ｅｇｆｒ에 대한 저해제와 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물 KR20140092422A (ko)

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