JP6797027B2 - メタドヘリン−ｓｎｄ１相互作用を遮断するペプチドの癌の治療としての使用 - Google Patents

メタドヘリン−ｓｎｄ１相互作用を遮断するペプチドの癌の治療としての使用 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１４年６月２５日出願の米国特許仮出願第６２／０１６，９４７号の優先権の利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府認可
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号Ｒ０１ＣＡ１３４５１９及びＲ０１ＧＭ０９６０６０の下、政府支援を得て行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
技術分野
本開示は、癌を治療し、腫瘍の成長、再発、及び転移を低減する方法に関し、該方法は、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）とブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）との相互作用を遮断し、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の機能を阻害する阻害剤を投与することを含む。該阻害剤は、ＳＮＤ１に結合するＭＴＤＨのペプチドもしくは断片、またはメタドヘリンに結合するＳＮＤ１由来のペプチドもしくは断片を含むことが企図される。
参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下、２０１５年６月２４日に作成された「４８１６６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前の１７，０３７バイトのＡＳＣＩＩテキストファイルとして特定される、コンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列の一覧が、参照によりその全体が組み込まれる。
癌は、激しい遺伝的及び後生的変化によって特徴付けられる。反復ＤＮＡコピー数の変化は、多くの場合、影響を受けた遺伝子座における癌の主要な駆動因子の存在を示す。メタドヘリン（ＭＴＤＨ；ＡＥＧ１、ＬＹＲＩＣとも呼ばれる）は、乳癌の不良な無再発生存率と関連付けられる頻繁に増幅されるゲノム遺伝子座、８ｑ２２に常在する転移促進性遺伝子として以前に特定された（Ｈｕら、２００９）。ＭＴＤＨの過剰発現が、原発腫瘍の４０％超において観察され、独立した予後不良因子である（Ｈｕら、２００９）。原発乳房腫瘍において何がＭＴＤＨの強い選択を駆り立てるのかは明確でなく、正常な発達及び腫瘍形成におけるＭＴＤＨの機能的重要性は依然として良く理解されていない。
細胞培養または異種移植モデルを使用する最近の研究は、増殖、細胞死、浸潤、及び血管新生を含むいくつかの癌関連プロセスにＭＴＤＨが関係していることを示したが（Ｅｍｄａｄら、２０１３）、これらのプロセスにおけるＭＴＤＨの根底にある機構の理解は、今日まで限られたままである。乳癌において、ＭＴＤＨは、癌細胞の肺内皮への接着を媒介する膜貫通タンパク質であると仮定された（Ｂｒｏｗｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００４）。ある特定の癌の型において、ＭＴＤＨは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＮＦ−κＢなどの複数の発癌経路と関連付けられてきた（Ｅｍｄａｄら、２０１３）。ＭＴＤＨがどのようにこれらの経路を調節するかは依然として理解困難である。高等脊椎動物において進化的に保存されたが、ＭＴＤＨは、認識可能な機能ドメインを含まず、その生物学的機能に関する理解を困難にする。複数のグループは、ＰＬＺＦ、ＢＣＣＩＰα、及びブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）を含むいくつかのＭＴＤＨ結合パートナーを特定した（Ｗａｎ及びＫａｎｇ、２０１３）。しかしながら、これらのタンパク質との相互作用がＭＴＤＨの機能を媒介するかどうか、及びその方法は主に不明である。
乳癌は、遺伝子発現プロファイルに基づいて管腔様及び基底様亜型に広く分類され得る異質性疾患である（Ｐｅｒｏｕら、２０００）。異なる発癌シグナル伝達が異なる細胞源を標的とすることができ、故に乳癌の異なる亜型の形成につながると推測された。しかしながら、異なる発癌遺伝子誘発性乳房腫瘍における腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の起源、特定、及び調節は、十分に特徴付けられていないままである。マウスにおける自発性腫瘍形成は、腫瘍開始中の早期変化を追跡するため、及びＴＩＣの形質転換及び増殖を媒介することにおける関心対象の遺伝子の役割を調査するための優れたモデルを提供する。
本開示は、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）が、管腔型及び基底型両方の乳腺腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）及び前立腺腫瘍の増殖及び機能に重要であり、種々の腫瘍亜型においてＭＴＤＨを過剰発現する選択圧を強調することを示した。ＭＴＤＨの、ＳＮＤ１とのその保存された相互作用に対する機能的依存性は、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体を標的とすることが、ＴＩＣの増殖を予防することによって、正常組織への影響を最小限に抑えながら腫瘍の開始、再発及び転移を制御する機会を提供し得ることを示唆する。
本開示は、対象における腫瘍開始細胞の再発または増殖を予防または低減するための方法を提供し、該方法は、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との相互作用を干渉する薬剤を投与することを含む。本開示はまた、癌を有する対象における癌を治療するための方法を提供し、該方法は、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用を妨害する阻害剤を該対象に投与することを含む。
様々な実施形態において、この阻害剤は、配列番号１に記載されるＭＴＤＨの残基３６４〜５８２（例えば、ＭＴＤＨのアミノ酸３６４〜４０７）内のヒトＭＴＤＨの領域に結合する。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＮＤ１ ＳＮ１／２ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、阻害剤は、配列番号２に記載されるＳＮＤ１の残基１６〜３３９（例えば、ＳＮＤ１のアミノ酸３９〜４３）内のヒトＳＮＤ１の領域に結合する。様々な実施形態において、本開示は、対象における腫瘍開始細胞の増殖を低減または減少させるための方法を提供し、該方法は、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）とブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）との間の相互作用の阻害剤を投与することを含み、該阻害剤が、メタドヘリン（配列番号１）の残基３６４〜４０７内のＳＮＤ１タンパク質相互作用を阻害する。
様々な実施形態において、対象は癌を有する。本明細書において企図される例示的な癌としては、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、子宮頸癌、膀胱癌、ならびに詳細な説明において列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、癌は、乳癌及び前立腺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌は肝臓癌である。
ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤は、ＭＴＤＨのペプチド、ＳＮＤ１のペプチド、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３を含むペプチドと同様の構造を有するペプチド模倣体、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３を含むペプチドと同様の構造もしくはその構造の一部を有する小分子化合物、または本明細書に記載されるペプチドもしくはペプチド模倣体を含有するナノ粒子抱合体であることが企図される。
様々な実施形態において、阻害剤は、ペプチドである。例えば、様々な実施形態において、ペプチドは、コンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）を含み、Ｘが任意のアミノ酸である。様々な実施形態において、ペプチドは、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３（配列番号２）からのコンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）を含み、Ｘが任意のアミノ酸である。様々な実施形態において、阻害剤は、コンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号４）を含むペプチドであり、Ｘが任意のアミノ酸である。様々な実施形態において、阻害剤は、ｉ）ＭＴＤＨの残基３６４〜５８２内のペプチド、ｉｉ）ＭＴＤＨの残基３６４〜４０７内のペプチド、ｉｉｉ）ＭＴＤＨの残基３８６〜４０７を含むペプチド、またはｉｖ）ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３を含むペプチドから選択されるＭＴＤＨのペプチドである。様々な実施形態において、阻害剤は、ｉ）配列番号１の残基３６４〜５８２から本質的になるペプチド、ｉｉ）ＭＴＤＨの残基３６４〜４０７を有するペプチド、ｉｉｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７から本質的になるペプチド、またはｉｖ）配列番号１の残基３９３〜４０３から本質的になるペプチドから選択されるＭＴＤＨのペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、本明細書に記載される野生型ＭＴＤＨペプチドのうちのいずれかの変異型であり、該変異型ペプチドは、Ｗ３９４及びＷ４０１を保持し、その位置は、野生型ＭＴＤＨのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１）に基づく。
様々な実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）またはその変異型を含み、該変異型ペプチドは、Ｗ残基を除く任意の位置に少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９つのうちのいずれか）の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１１〜約２２アミノ酸長（例えば、約１５〜約２２アミノ酸長）である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）またはその変異型に対してＮ末端側の１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸のうちのおよそいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）またはその変異型に対してＣ末端側の１、２、３、または４つのアミノ酸うちのおよそいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型を含み、該変異型ペプチドが、Ｗ残基を除く任意の位置に少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９つのうちのいずれか）の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１０〜約２１アミノ酸長である（例えば、約１４〜約２１アミノ酸長）。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型に対してＮ末端側の１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸のうちのおよそいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型に対してＣ末端側の１、２、３、または４つのアミノ酸うちのおよそいずれかを含む。
様々な実施形態において、ペプチドは、Ｄ３８９、Ａ３９２、Ｄ３９３、Ｎ３９５、Ｅ３９９、Ｅ４００、Ｗ４０４、Ｄ４０６、及びＥ４０７からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基において、ＭＴＤＨ内の突然変異を含み、そのアミノ酸位置は、野生型ＭＴＤＨ配列（すなわち、配列番号１）に基づく。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｄ３８９Ｒ、Ｄ３９３Ｒ、Ｅ３９９Ｒ、Ｅ４００Ｒ、Ｗ４０４Ｄ、Ｄ４０６Ｒ、及びＥ４０７Ｒからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基において、ＭＴＤＨ内の突然変異を含み、その位置は、野生型ＭＴＤＨ配列（すなわち、配列番号１）に基づく。様々な実施形態において、突然変異は、配列番号１のＤ３８９Ｒ、Ｄ３９３Ｒ、Ｅ３９９Ｒ、Ｅ４００Ｒ、Ｗ４０４Ｄ、Ｄ４０６Ｒ、及びＥ４０７Ｒからなる群から選択される。
様々な実施形態において、阻害剤は、ＳＮＤ１（すなわち、配列番号２）の残基１６〜３３９内のＳＮＤ１のペプチドである。一実施形態において、ＳＮＤ１ペプチドは、Ｆ２５０、Ｒ３２４、Ｒ２５５、Ｒ３２７、Ｒ３２４、Ｐ３９、Ｐ４３、Ｅ２４７、Ｌ２５６、Ｈ２７９、Ｉ２８４、Ｌ２８７、Ｒ２５９、及びＮ２８１からなる群から選択される１つ以上の残基において突然変異を含み、その位置は、野生型ＳＮＤ１配列（すなわち、配列番号２）に基づく。様々な実施形態において、ＳＮＤ１内の突然変異は、配列番号２のＦ２５０Ａ、Ｒ３２４Ｅ、及びＲ２５５Ｅからなる群から選択される。
阻害剤ペプチドは、融合タンパク質の一部であることが本明細書において企図される。ある特定の実施形態において、ペプチドは、Ｆｃドメインに融合される。
本開示はまた、本明細書に記載されるＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤、及び薬学的に許容される担体を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。また、単離されたペプチド阻害剤（例えば、本明細書に記載されるペプチドのうちのいずれか１つ）も提供される。本出願は、本明細書に記載されるペプチド阻害剤（ならびにそのようなペプチド阻害剤を含む組成物）のうちのいずれか１つを作製及び使用する方法をさらに提供する。
したがって、例えば、いくつかの実施形態において、対象におけるＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用を妨害する方法が提供され、該方法は、上記のペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象における生存促進性遺伝子のＳＮＤ１依存的発現を阻害する方法が提供され、該方法は、上記のペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。
また、本明細書に記載されるＭＴＤＨノックアウト及びノックダウンモデル、ならびに本明細書に記載されるＳＮＤ１ノックダウンモデルを含む、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の阻害剤を研究するために有用な動物も企図される。
また、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用の阻害剤を特定するために有用なＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の結合の結晶構造も企図される。
Ｍｔｄｈの体系的欠失が、乳房腫瘍の形成及び転移を阻害することを示す。（図１Ａ）ＷＴ及び突然変異Ｍｔｄｈ対立遺伝子の概略図。緑色のボックスは、エクソン１〜１２を表す。遺伝子型判定に使用されるプライマー（Ｆ、順方向；Ｒ、逆方向）は、対応するゲノム配列の上に示される。（図１Ｂ）Ｘ−ｇａｌ染色によって可視化された１０．５日目のＷＴ及びＫＯ胚内のＬａｃＺ発現。（図１Ｃ）示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有する８週齢の雌マウスから新たに解離されたＭＥＣにおけるＭＴＤＨタンパク質免疫ブロット。（図１Ｄ）示されるＭｔｄｈ遺伝子型のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌における乳房腫瘍発症の動態。Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝１３）、Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝２６）、及びＭｔｄｈ−／−（ｎ＝３０）。（図１Ｅ）（図１Ｄ）と同じマウス群における示される年齢での無腫瘍乳腺の割合。（図１Ｆ）示される年齢で評価されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／−、及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−群の総腫瘍量。Ｍｔｄｈ＋／＋群とＭｔｄｈ−／−群との間で統計比較を行った。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＞２０）を表す。（図１Ｇ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝１５）、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝１１）、及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−（ｎ＝１４）動物における肺転移小結節の数。エラーバーは、５〜９５パーセンタイルを表す。（Ｈ）示される遺伝子型のＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２マウスにおける乳房腫瘍発症の動態。Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝２２）、Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝３１）、及びＭｔｄｈ−／−（ｎ＝２７）。（図１Ｉ）３００日齢で示される数の腫瘍を担持する（図１Ｈ）と同じ群からのマウスの割合。（図１Ｊ）Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝３０）及びＭｔｄｈ−／−（ｎ＝２３）群からの担腫瘍ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２マウスにおける肺転移の発生率。（図１Ｋ）（図１Ｊ）からの同じマウス群における肺切片当たりの転移病変の数。エラーバーは、５〜９５パーセンタイルを表す。（図１Ｌ）示される遺伝子型のＭＭＴＶ−Ｗｎｔマウスにおける乳房腫瘍発症の動態。Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝３１）、Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝４８）、及びＭｔｄｈ−／−（ｎ＝３１）。（図１Ｍ）３００日齢で示される数の腫瘍を担持する（Ｌ）と同じ群からのマウスの割合。（図１Ｎ）示されるように（上）、ＭＰＡ及びＤＭＢＡで治療された、示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有するマウスにおける乳房腫瘍発症の動態。腫瘍潜伏を、最初のＤＭＢＡ治療後の日数として記録した。Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝１９）、Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝１３）、及びＭｔｄｈ−／−（ｎ＝１０）。（図１Ｏ）４ヶ月齢で示される数の腫瘍を担持する（図１Ｎ）と同じ群からのマウスの割合。統計：（図１Ｄ、図１Ｈ、図１Ｌ、図１Ｎ）対数順位検定。（図１Ｅ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｍ、図１Ｏ）カイ二乗検定。（図１Ｇ、図１Ｋ）マン・ホイットニー検定。（図１Ｆ）スチューデントｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 Ｍｔｄｈ−／−マウスからの乳腺が、発癌遺伝子誘発性増殖及び腫瘍形成能の欠陥を呈することを示す。（図２Ａ）示される遺伝子型の６週齢雌の乳腺からのＣＤ４５−ＣＤ３１−ＴＥＲ１１９−（Ｌｉｎ−）ＭＥＣのフローサイトメトリー。（図２Ｂ、図２Ｃ）（図２Ａ）において解析された管腔型（図２Ｂ）及び基底型（図２Ｃ）細胞の定量（ｎ＝４）。（図２Ｄ）ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ（ｎ＝６）、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ（ｎ＝４）、ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２（ｎ＝６）マウスの前新生物性腺から解離されたＷＴまたはＫＯ ＭＥＣを用いるマンモスフェア形成アッセイ。アッセイは、各乳腺について３連で行った。（図２Ｅ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスの前新生物性腺から解離された未選別のＭＥＣの同所移植の３ヶ月後の乳房腫瘍発生率（左）及びサイズ（右）。（図２Ｆ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋マウスの前新生物性腺からの示される選別済みＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔型またはＣＤ２４＋ＣＤ２９高基底型ＭＥＣの同所移植後８週間の乳房腫瘍発生率（左）及びサイズ（右）。（図２Ｇ、図２Ｈ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスの前新生物性腺からのＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔型細胞の同所移植後８週間の乳房腫瘍発生率（図２Ｇ）及び体積（図２Ｈ）。統計：（図２Ｂ〜Ｄ）スチューデントｔ検定。（図２Ｅ〜Ｈ）、限界希釈解析に基づく腫瘍発生率、及びマン・ホイットニー検定に基づく腫瘍体積。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭを表す。 ＭＴＤＨが、ＭａＳＣではなく、発癌遺伝子誘発性管腔型及び基底型ＴＩＣの活性に必要であることも示す。（図３Ａ、図３Ｂ）６ヶ月齢のＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋（ｎ＝１４）、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／−（ｎ＝２６）、及びＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−（ｎ＝１６）マウスからの無腫瘍乳腺における過形成の発生率（図３Ａ）及び重症度（Ｂ）。（図３Ｃ）ＣＤ２９及びＣＤ６１マーカーを使用する、示される遺伝子型の６週齢雌の乳腺からのＣＤ４５−ＣＤ３１−ＴＥＲ１１９−ＣＤ２４＋ＭＥＣのフローサイトメトリー。これは、図３Ｂに示されるものと同じバッチ実験であったことに留意されたい。（図３Ｄ）（図３Ａ）において解析されたＣＤ２４＋中のＣＤ６１＋細胞（上パネル）、ＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔型細胞（中間パネル）、及びＣＤ２４＋ＣＤ２９高基底型細胞（下パネル）の割合（ｎ＝４）。データは、平均±ＳＥＭを表す。（図３Ｅ）Ｗｎｔ過形成腺から解離された示される細胞集団からのＣＤ６１＋またはＣＤ６１−細胞のマンモスフェア形成アッセイ。データは、平均±ＳＥＭを表す。（図３Ｆ、図３Ｇ）７ヶ月無腫瘍乳腺からの示される選別済み管腔型及び基底型集団の１００００細胞の、ＮＳＧマウスへの同所移植後２ヶ月の乳房腫瘍発生率（図３Ｆ）及び腫瘍体積（図３Ｇ）。（図３Ｈ）自然発生ＥｒｂＢ２誘発腫瘍、及び示される移植細胞により生成された腫瘍のＨ＆Ｅ染色。スケールバー：２００μｍ（上）及び１００μｍ（下）。（図３Ｉ）（図３Ｊ〜Ｋ）において使用される乳腺再構成アッセイの概略。（図３Ｊ、図３Ｋ）ＷＴまたはＫＯ雌バージンマウスの乳腺から解離された制限数のＬｉｎ−ＭＥＣ（図３Ｊ）またはＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ２９高ＭＥＣ（図３Ｋ）の、ＷＴレシピエントの切除された（ｃｌｅａｒｅｄ）乳房脂肪体への移植を示す表。３つの独立したバッチの実験を組み合わせ、示した。（図３Ｌ）（図３Ｋ）における再構成された乳房増殖物の定量（増殖物で満たされた脂肪体領域の％）。実験群のいずれもマン・ホイットニー検定によって有意ではなかった。統計：（図３Ｄ、図３Ｅ）スチューデントｔ検定。（図３Ｇ）マン・ホイットニー検定。（図３Ａ、図３Ｆ）フィッシャー直接検定。（図３Ｂ）カイ二乗検定。（図３Ｊ、図３Ｋ）限界希釈解析。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨが、発癌遺伝子誘発性ＴＩＣ機能性に本質的に必要であることを示す。（図４Ａ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスを、（Ｍｔｄｈ−／−＋Ｔｇ）を用いるか、またはＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子を用いずに生成するために使用されるＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子構成体及び繁殖スキームの概略図。（図４Ｂ）Ｍｔｄｈ＋／＋、Ｍｔｄｈ−／−、またはＭｔｄｈ−／−＋ＴｇマウスからのＰｙＭＴ誘発腫瘍中のＭＴＤＨタンパク質レベル。（図４Ｃ）示される遺伝子型の６週齢雌の前新生物性乳腺からのＬｉｎ−ＭＥＣ（ｎ＝４）中のＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔型集団の定量（左棒：Ｍｔｄｈ−／−マウス、右棒：Ｍｔｄｈ−／−＋Ｔｇマウス）。（図４Ｄ）示される遺伝子型のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌における乳房腫瘍発症の動態。Ｍｔｄｈ−／−（ｎ＝２１）、Ｍｔｄｈ−／−＋Ｔｇ（ｎ＝２０）。図４（Ｅ）（図４Ｄ）と同じマウス群における示される年齢での無腫瘍乳腺の平均数（左棒：Ｍｔｄｈ−／−マウス、右棒：Ｍｔｄｈ−／−＋Ｔｇマウス）。（図４Ｆ）（図４Ｄ）と同じマウス群の腫瘍量。（図４Ｇ、図４Ｈ）ＭＴＤＨを、２つの独立したｓｈＲＮＡ（ＫＤ１及びＫＤ２）によって、新たに解離されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣ内でノックダウンし、生体外マンモスフェア（図４Ｇ、ｎ＝５、各々３連、左棒：対照、中央棒：ＫＤ１、右棒：ＫＤ２）及び生体内腫瘍形成アッセイを行った（図４Ｈ、３ヶ月での発生率）。ＦＣ、倍率変化。（図４Ｉ、図４Ｊ）マウスＭＴＤＨを、新たに解離されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣ内でレンチウイルス形質導入を介して発現させ、生体外マンモスフェア（図４Ｉ、ｎ＝４、各々３連、左棒：ベクター、右棒：ＭＴＤＨ）及び生体内腫瘍形成（図４Ｊ）アッセイを行った。（図４Ｋ）Ｌ〜Ｏにおける実験の概略図。（図４Ｌ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍からのＡＬＤＨ陽性またはＡＬＤＨ陰性腫瘍細胞のマンモスフェア形成。（図４Ｍ）ＭＴＤＨを、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍からの選別済みＡＬＤＨ＋細胞内でノックダウンし、マンモスフェアアッセイを行った。（図４Ｎ）Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍からのＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ６１＋またはＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ６１−腫瘍細胞のマンモスフェア形成。（図４Ｏ）ＭＴＤＨを、Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍からの選別済みＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ６１＋細胞内でノックダウンし、マンモスフェアアッセイを行った。統計：（図４Ｃ、図４Ｇ、図４Ｉ、図４Ｌ〜Ｏ）スチューデントｔ検定。（図４Ｄ）対数順位検定。（図４Ｅ）カイ二乗検定。（図４Ｆ）マン・ホイットニー検定。（図４Ｈ、図４Ｊ）限界希釈解析。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭを表す。 ＭＴＤＨが、乳房上皮細胞の腫瘍開始活性に本質的に必要であることを示す。（図５Ａ）ＭＭＴＶ−ＬＴＲ（マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復配列）プロモータ、マウスＭｔｄｈコード配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含むＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子構成体の概略図。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を使用して、Ｍｔｄｈをクローン化し、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩ制限部位を使用して、マウス接合子への微量注入のための断片を線形化した。（図５Ｂ）遺伝子導入マウスの尾の切れ端から精製されたゲノムＤＮＡをサザンブロットに供した。２つの独立した制限酵素による消化後の、１つの陽性樹立株１８及び２つの陽性対照を示す。（図５Ｃ）８週齢の導入遺伝子陽性または陰性雌同腹子からの臓器内のＭｔｄｈ ｍＲＮＡレベル（左棒：９０７７ ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ−／−、中央棒：９０７８ ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ−／−、右棒：９０７９ ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ−／−）。全てのマウスは、野生型の内在性Ｍｔｄｈ対立遺伝子を内包する。（図５Ｄ）ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子を有するか、または有しないＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスからの自発性ＰｙＭＴ誘発腫瘍のＨ＆Ｅ染色。スケールバー：２００μｍ（上）及び１００μｍ（下）。（図５Ｅ）ＭＴＤＨを、２つのｓｈＲＮＡ（ＫＤ１及びＫＤ２）によって、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋ｐＭＥＣ（ｎ＝５）内でノックダウンし、マンモスフェア形成アッセイを、各独立試料について３連で行った（左棒：対照、中央棒：ＫＤ１、右棒：ＫＤ２）。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊スチューデントｔ検定によるｐ＜０．００１。（図５Ｆ）ベクター対照またはＭｔｄｈ発現レンチウイルスのいずれかで形質導入されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞を注入したＦＶＢマウスにおける乳房腫瘍発症（左）及び成長（右）の動態（ｎ＝１０）。ｐ値は、対数順位検定（左）及びスチューデントｔ検定（右）に基づく。（図５Ｇ、図５Ｈ）ベクター対照またはＭｔｄｈ発現レンチウイルスのいずれかで形質導入されたｐＭＥＣ（２つの独立したＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスから）の同所移植後の乳房腫瘍発生率。（図５Ｉ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍由来の細胞におけるＡＬＤＨ活性の代表的なフローサイトメトリー解析。ＤＥＡＢ阻害剤で処理された試料がゲート制御として機能した。（図５Ｊ）（図５Ｉ）からのＡＬＤＨ陽性及び陰性腫瘍細胞を移植したマウスにおける乳房腫瘍発症（ｎ＝１０）の動態。ｐ値は、対数順位検定に基づく。 ＳＮＤ１は、ＭＴＤＨ媒介性腫瘍開始に必須であることを示す。（図６Ａ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞におけるＭＴＤＨ再発現及びＳＮＤ１ノックダウンの組み合わせ。ＳＮＤ１ ＫＤ及びＭＴＤＨ再発現の効率を、ウェスタンブロットによって評価した。（図６Ｂ、図６Ｃ）生体外マンモスフェア（図６Ｂ）及び生体内腫瘍形成（図６Ｃ、６週）アッセイを、（図６Ａ）において生成された細胞を用いて行った。＋／−は、（図６Ａ）におけるウェスタンブロットに基づいて、示されたタンパク質が存在するか（＋）、または不在であるか（−）を示す。（図６Ｄ）ＳＮＤ１を、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋またはＷｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣ細胞内でノックダウンし、マンモスフェアアッセイを３連で行った。（図６Ｅ、図６Ｆ）対照またはＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣの同所移植後の腫瘍発生率（図６Ｅ）及び体積（図６Ｆ）。統計：（図６Ｂ、図６Ｄ）スチューデントｔ検定。（図６Ｃ、図６Ｅ）限界希釈解析。（図６Ｆ）マン・ホイットニー検定。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭを表す。 ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用を媒介する主要な領域及び残基の判定を表す。（図７Ａ）示されたＳＮＤ１結合能を有するＭＴＤＨ断片及び突然変異体の概略。下に示される結果に基づいて、＋は結合を示し、−は結合がないことを示す。２つの推定核局在化シグナルは、ＮＬＳ２の場合、残基４３２〜４５１であり、ＮＬＳ３の場合、残基５６１〜５８０である。最小結合領域３８６〜４０７の拡大図において、９個の残基を、現行研究における突然変異誘発のために標的とした。Ｗ３９４Ｄ及びＷ４０１Ｄは、それぞれ完全に、または強力に結合を低減した。（図７Ｂ）示される境界を有するＧＳＴタグ付きＭＴＤＨ断片によるＨｉｓ６−ＳＮＤ１ΔＣのプルダウン。結合されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査し、クマシーブルー染色によって可視化した。（図７Ｃ）ＧＳＴタグ付きＷＴまたは三重変異体ＭＴＤＨ断片（３６４〜５８２）によるＨｉｓ６−ＳＮＤ１ΔＣのプルダウン。（図７Ｂ）及び（図７Ｃ）について、Ｈｉｓ６−ＳＮＤ１ΔＣ入力の１０分の１が示され、ＧＳＴ単独を陰性対照として使用した。３つの独立した実験の代表的な結果を示す。（図７Ｄ、図７Ｅ）示される異所性ヒトＳＮＤ１、ＡＧＯ２、またはＭＴＤＨを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物を、抗Ｍｙｃで免疫沈降させ、示される抗体で免疫ブロットした。 ＳＮＤ１結合欠乏ＭＴＤＨは、ＭＥＣの腫瘍開始能を促進できないことを示す。（図８Ａ、図８Ｅ）ベクター対照、ＷＴ、または突然変異体マウスＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＭＥＣからの溶解物を、抗ＭＴＤＨ抗体で免疫沈降させ、示されるタンパク質について免疫ブロットした。（図８Ｂ、図８Ｆ）マンモスフェアアッセイを、示されるＭｔｄｈ構成体で再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣを用いて行った。（図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｇ、図８Ｈ）生体内腫瘍形成（腫瘍発生率については図８Ｃ、図８Ｇ；腫瘍体積については図８Ｄ、図８Ｈ）を、示されるＷＴまたは突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣを使用して、制限数で行った。＊注記：マウスＷ３９１Ｄ ＭＴＤＨは、ヒトＷ３９４Ｄ ＭＴＤＨに対応し、マウスＷ３９８Ｄ ＭＴＤＨは、ヒトＷ４０１Ｄ ＭＴＤＨに対応する。統計：（図８Ｂ、図３Ｆ）スチューデントｔ検定。（図８Ｃ、図８Ｇ）限界希釈解析。（図８Ｄ、図８Ｈ）マン・ホイットニー検定。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨが、ストレス下で生存促進性タンパク質ＳＮＤ１と相互作用し、安定させることによって、生存優位性を付与することを示す。（図９Ａ）ＷＴ（左棒）またはＫＯ雌（右棒）の正常またはＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ前新生物性腺（ｎ＞３）から切断されたカスパーゼ３陽性ＭＥＣの定量。（図９Ｂ）示されるＭｔｄｈ構成体（左棒：ＶＥＣ、中央棒：ＷＴ、右棒：Ｗ３９１Ｄ）で再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣのアポトーシスに対するＣＰＴの効果を、ＰＩ及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色によって判定した。（図９Ｃ）対照（左棒）またはＳＮＤ１−ＫＤ（右棒）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣのアポトーシスに対するＣＰＴの効果。（図９Ｄ）対照または示される濃度で３６時間、ＣＰＴで処理されたＭＴＤＨ−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣ中のＳＮＤ１及びβ−アクチン（負荷対照）のタンパク質レベル。分解曲線（右）は、３つの独立した実験の平均を表す。（図９Ｅ）４８時間のＣＰＴ処理後に示される構成体で再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＭＥＣ中のＳＮＤ１、ＭＴＤＨ、及びβ−アクチン（負荷対照）のウェスタンブロット。分解曲線（右）は、３つの独立した実験の平均を表す。（図９Ｆ）対照対３６時間のＣＰＴ（５０μＭ）処理下のＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣにおけるＳＮＤ１上方調節された遺伝子（ｎ＝５０４、倍率変化＞２、ｐ＜０．０５）の発現を表すマイクロアレイデータのヒートマップ表示。色キーは、対数２値を示す。（図９Ｇ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析は、（図９Ｆ）に示されるＳＮＤ１上方調節された遺伝子の上位５つの分子機能及び細胞機能、ならびに各カテゴリーに関係する分子／遺伝子の数を示す。（図９Ｈ）細胞生存及び細胞死機能におけるＳＮＤ１上方調節された遺伝子の効果。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙナレッジベースによって特定される遺伝子発現変化及び遺伝子機能に基づいて、Ｚスコアを計算した。所与の機能は、ｚ＞２であるときに著しく増加するか、またはｚ＜−２であるときに減少することが予想される。（図９Ｉ）Ｗ３９１Ｄ突然変異体ＭＴＤＨで機能回復されたものと比較して、マウスＷＴ ＭＴＤＨで機能回復されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＭＥＣにおけるＳＮＤ１上方調節された遺伝子サインの強化を示すＧＳＥＡプロット。全ての細胞を、ＣＰＴ（５０μＭ）で処理した。ＮＥＳ：正規化されたエンリッチメントスコア（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）。統計：（図９Ａ〜Ｃ）スチューデントｔ検定。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１が、ヒト乳癌細胞の生体外塊形成及び生体内腫瘍開始活性に重要であることを示す。（図１０Ａ、図１０Ｂ）ＭＴＤＨ（図１０Ａ）またはＳＮＤ１（図１０Ｂ）を、ＨＭＬＥ−Ｎｅｕ細胞内でノックダウンし、腫瘍様塊（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）アッセイを３連で行った。（図１０Ｃ、図１０Ｄ）ＭＴＤＨ（図１０Ｃ）またはＳＮＤ１（図１０Ｄ）を、ＢＣＭ−４０１３患者由来の異種移植された（ＰＤＸ）腫瘍細胞内でノックダウンし、腫瘍様塊アッセイを３連で行った。（図１０Ｅ）ＭＴＤＨまたはＳＮＤ１を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でノックダウンし、ＫＤ効率を免疫ブロットによって測定した。（図１０Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の腫瘍様塊アッセイを３連で行った。（図１０Ｇ、図１０Ｈ）制限数のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注入後５週間の腫瘍発生率（図１０Ｇ）及び体積（図１０Ｈ）。（図１０Ｉ）ヒト浸潤性乳癌（ｎ＝１５４）におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のタンパク質レベルを、乳癌組織マイクロアレイ（ＢＲ１９２１ａ、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）のＩＨＣ染色によって判定した。腫瘍細胞内の染色強度を、０（無）、１（弱）、２（中）、３（強）として採点した。（図１０Ｊ）（図１０Ｉ）の棒グラフ表示。（図１０Ｋ）正常な腺発達ではなく腫瘍開始におけるＭＴＤＨの重要な役割を描写する概略図。腫瘍形成中のストレス条件下で、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用は、ＳＮＤ１をストレス誘発性の分解から保護し、基底型及び管腔型両方のＴＩＣの生存及び活性を支持する。統計：（図１０Ａ〜Ｄ、図１０Ｆ）スチューデントｔ検定。（図１０Ｇ）限界希釈解析。（図１０Ｈ）マン・ホイットニー検定。（図１０Ｉ、図１０Ｊ）カイ二乗検定。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１が、ヒト乳癌においてタンパク質レベルで正の相関があり、予後不良を予測する際に協働することを示す。（図１１Ａ、図１１Ｂ）ＭＴＤＨ（図１１Ａ）またはＳＮＤ１（図１１Ｂ）を、３つの独立したｓｈＲＮＡによってＨＭＬＥ−Ｎｅｕ細胞内でノックダウンし、ＫＤ効率を免疫ブロットによって測定した。（図１１Ｃ、図１１Ｄ）ＭＴＤＨ（図１１Ｃ）またはＳＮＤ１（図１１Ｄ）を、２つの独立したｓｈＲＮＡによってＢＣＭ−４０１３患者由来の異種移植された（ＰＤＸ）腫瘍細胞（Ｚｈａｎｇら、２０１３）内でノックダウンし、ＫＤ効率をｑ−ＰＣＲによって測定した。データは、平均±ＳＥＭを表す。（図１１Ｅ、図１１Ｆ）免疫組織化学染色に対するＭＴＤＨ（図１１Ｅ）及びＳＮＤ１（図１１Ｆ）抗体の特異性の検証。これらの抗体は、ヒト及びマウスタンパク質の両方に反応性である。（図１１Ｅ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−乳房腫瘍内のＭＴＤＨの代表的な免疫組織化学染色。（図１１Ｆ）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋対照またはＳＮＤ１−ＫＤ腫瘍内のＳＮＤ１の代表的な免疫組織化学染色。スケールバー：１００μｍ。（図１１Ｇ）ヒト乳腺腫瘍内のＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のタンパク質レベルを、乳癌組織マイクロアレイ（ＹＴＭＡ＿２０１、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の免疫組織化学染色によって判定した。腫瘍細胞内の染色強度を、０（無）、１（弱）、２（中）、３（強）として採点した。（図１１Ｈ）（図１１Ｇ）の棒グラフ表示。（図１１Ｉ）ＮＫＩ２９５データセットにおけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のｍＲＮＡレベル間の相関。（図１１Ｊ、図１１Ｋ）ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のｍＲＮＡレベル間の、乳腺腫瘍の原発腫瘍サイズ（図１１Ｊ）及び分化（図１１Ｋ）との相関。（図１１Ｌ）ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のｍＲＮＡレベルにより階層化された乳癌患者の無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）。図１１Ｊ〜Ｌにおいて、ＮＫＩ２９５ヒト乳癌データセット（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら、２００２）を使用し、試料をＭＴＤＨ／ＳＮＤ１ ｍＲＮＡレベルに基づき、中間カットオフを使用して４つの群に分割した。（図１１Ｍ）ＭＴＤＨ ｍＲＮＡレベル間の、ヒト乳癌の異なる亜型の予後との相関。ＫＭ Ｐｌｏｔｔｅｒ乳癌メタ解析データベース（Ｇｙｏｒｆｆｙら、２０１０）におけるＭＴＤＨ発現の中央値によって階層化された患者の無再発生存率のカプラン・マイヤープロット。統計：（図１１Ｃ、図１１Ｄ）スチューデントｔ検定。（図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｋ）カイ二乗検定。（図１１Ｉ）ピアソン相関。（図１１Ｌ、図１１Ｍ）対数順位検定。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨレベルが、ヒト前立腺癌における腫瘍進行及び転移と関連付けられることを示す。（図１２Ａ）２つの前立腺腫瘍組織マイクロアレイを、抗ＭＴＤＨ抗体で染色した。ＭＴＤＨレベルを、負（０）、低（１）、中（２）、または高（３）として採点した。異なる期及び遠隔転移の前立腺組織のＭＴＤＨ免疫染色の代表的な画像。スケールバー、４０μｍ。（図１２Ｃ）左パネル、正常組織（ｎ＝６２）及びＢＰＮ（ｎ＝１０）、ＰＩＮ（ｎ＝１０）、原発腫瘍（ｎ＝７２）及び遠隔転移（ｎ＝１０）におけるＭＴＤＨ発現レベル（左棒：ＭＴＤＨ ＩＨＣスコア０または１、右棒：ＭＴＤＨ ＩＨＣスコア２または３）。カイ二乗検定によりＰ＜０．００１。右パネル、ＰＩＮ（ｎ＝１０）及びＢＰＨ（ｎ＝１０）におけるＭＴＤＨレベル（左棒：ＭＴＤＨ ＩＨＣスコア０、中央棒：ＭＴＤＨ ＩＨＣスコア１、及び右棒：ＭＴＤＨ ＩＨＣスコア２）。カイ二乗検定によりＰ＝０．０２３。（図１２Ｂ）ＭＴＤＨレベルの、前立腺腫瘍グリーソンスコアとの相関。上の曲線は、平均ＭＴＤＨスコア（平均±ＳＥＭ）を表し、下の曲線は、示される群内の中／高レベルのＭＴＤＨを有する試料の割合を表す。（図１２Ｄ）腫瘍内のＭＴＤＨ発現に基づく前立腺癌患者の無再発生存率のカプラン・マイヤー解析。 ＭＴＤＨゲノム増加（ｇａｉｎ）が、前立腺癌におけるＭＴＤＨタンパク質レベル及び臨床進行と関連付けられることを示す。（図１３Ａ）前立腺腫瘍組織のマイクロアレイを、ＦＩＳＨによりＭＴＤＨゲノムコピー数について解析した。ＭＴＤＨゲノム増加を有しない（左）または有する（右）腫瘍の例を示す。ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（緑色）及びＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（薄橙色）プローブは、それぞれ染色体８動原体及び８ｑ２２領域を検出する。スケールバー、１μｍ。（図１３Ｂ）ＭＴＤＨゲノム増加は、ＭＴＤＨタンパク質レベルと相関する。ＭＴＤＨ増加を有する試料、ｎ＝１１；ＭＴＤＨ増加を有しない試料、ｎ＝６４。カイ二乗検定によりＰ＝０．００１８。（図１３Ｃ）前立腺非癌性組織または腫瘍におけるＭＴＤＨゲノム増加の頻度。正常／良性／前悪性、ｎ＝３８；原発腫瘍、ｎ＝２９；遠隔転移、ｎ＝８。カイ二乗検定によるＰ値を示す。（図１３Ｄ）腫瘍内にＭＴＤＨゲノム増加を有する、及び有しない前立腺癌患者の無再発生存率のカプラン・マイヤー解析。コックス比例ハザード比（ＨＲ）を示す。 異なるＭｔｄｈステータスを有するＴＲＡＭＰマウスの世代及び特徴付けを示す。（図１４Ａ）異なるＭｔｄｈを有するＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＴＲＡＭＰマウスの世代についてのクロススキーム。（図１４Ｂ）（図１４Ａ）において生成されたマウスの遺伝子型判定。上、検出されたＷＴ（６０２ｂｐ）及びＭｔｄｈのジーントラップされた突然変異体対立遺伝子（４７２ｂｐ）。下、検出されたＴＲＡＭＰ導入遺伝子（６００ｂｐ）及び内部ゲノム対照（３２４ｂｐ）。（図１４Ｃ）ｑＰＣＲによって解析された示される遺伝子型を有するマウスからの前立腺組織内のＭｔｄｈ ｍＲＮＡ。Ｍｔｄｈ ｍＲＮＡは、Ｍｔｄｈ−／−組織内で検出不可能であり、正常な腺と比較して、ＴＲＡＭＰ陽性前立腺組織内で上昇した。＊＊マン・ホイットニー検定に基づいてＰ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図１４Ｄ）ＷＴ非遺伝子導入マウスからの前立腺及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋マウスからの腫瘍におけるＭｔｄｈのウェスタンブロット解析。β−アクチンに対して正規化した後の任意のレベルのＭｔｄｈタンパク質を下に示す。Ｅ〜Ｆ、８週齢（図１４Ｅ）及び２８週齢（図１４Ｆ）ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスからの前立腺におけるＳＶ４０タグ発癌タンパク質の代表的な免疫組織化学染色。スケールバー、５０μｍ。 マウスにおけるＭｔｄｈの損失が、腫瘍形成を阻害し、腫瘍量を低減し、生存率を増加させることを示す。（図１５Ａ〜Ｂ）ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／−マウス（Ｍｔｄｈ＋と表される）またはＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−（Ｍｔｄｈ−と表される）から切除された下部尿生殖路の湿重量（図１５Ａ）または体重の％としての相対重量（図１５Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭを表す。マン・ホイットニー検定に基づいて＊＊Ｐ＜０．０１。（図１５Ｃ）示される遺伝子型を有する３６週齢雄マウスから切除された下部尿生殖路の代表的な画像（Ｂ、膀胱；Ｐ、前立腺；ＳＶ、精嚢）。スケールバー、１ｃｍ。（図１５Ｄ）示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有する異なる年齢のＴＲＡＭＰマウスの群からの前立腺の組織学的切片を検査することによって採点された腫瘍発生率。各棒グラフの上の数は、所与の群内で検査された前立腺癌を有するマウスの数対マウスの総数を示す。＊カイ二乗検定に基づいてＰ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。（図１５Ｅ）示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有するＴＲＡＭＰマウスの１歳までの死亡率。＊＊＊カイ二乗検定に基づいてｐ＜０．００１。 Ｍｔｄｈの損失が、前立腺癌の悪性進行を阻害することを示す。（図１６Ａ）示される年齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−マウスから切り取られた前立腺のＨ＆Ｅ染色組織学切片。スケールバー：２００μｍ。（図１６Ｂ）示される遺伝子型及び年齢を有するマウスからの各前立腺に単一の最高グレードを割り当てた。「＋」及び「−」は、それぞれＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウス及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−マウスを示す。グレードスコア：１、正常；２、低グレードＰＩＮ；３高グレードＰＩＮ；４、十分に分化した腺癌及び葉状腫瘍；５、中程度に分化した腺癌；６、不十分に分化した腺癌及び神経内分泌腫瘍。グレーディングスキームは、前述の標準プロトコルに従った（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｅ Ｃｏｌｉｇａｎ［ｅｔ ａｌ］．２００１；；Ｃｈａｐｔｅｒ ２０：Ｕｎｉｔ ２０ ５）。各棒の下の数は、各郡内で評価された前立腺の総数を示す。Ｔ３６群におけるカイ二乗検定によってＰ＜０．０５。（図１６Ｃ）Ｋｉ６７陽性上皮細胞の定量。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊スチューデントｔ検定に基づいてＰ＜０．０１。 Ｍｔｄｈの切除が、前立腺癌の全身転移を低減することを示す。（図１７Ａ）示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有する１歳のＴＲＡＭＰマウス群における肺、肝臓、及びリンパ節転移の発生率。Ｐ値はカイ二乗検定に基づく。（図１７Ｂ）（図１７Ａ）の棒グラフ表示（左棒：Ｍｔｄｈ＋、右棒：Ｍｔｄｈ−）。 ＴＲＡＭＰ−Ｃ１前立腺癌細胞内のＭｔｄｈのサイレンシングが、生体外の増殖及び生体内の腫瘍形成を減少させることを示す。（図１８Ａ〜Ｂ）Ｍｔｄｈを、ｑＰＣＲ（図１８Ａ）及びウェスタンブロット（図１８Ｂ）によって定量される、２つの独立したｓｈＲＮＡによってノックダウンした。（図１８Ｃ）４８時間後の対照及びＭｔｄｈ−ＫＤ ＴＲＡＭＰ−Ｃ１癌細胞の増殖率。（図１８Ｄ）対照（ｎ＝１６）、Ｍｔｄｈ−ＫＤ１（ｎ＝８）、及びＭｔｄｈ−ＫＤ２（ｎ＝１２）ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞を皮下的に移植した雄マウスにおける前立腺腫瘍発症の動態。ｐ値は対数順位検定に基づく。（図１８Ｅ）（図１８Ｄ）における注入後５週間の腫瘍体積。＊＊＊マン・ホイットニー検定に基づいてｐ＜０．００１。（図１８Ｆ）（図１８Ｄ）における移植後５週間で切り取られた腫瘍の画像。Ｇ、対照及びＫＤ群において形成された腫瘍のＭｔｄｈ ｍＲＮＡレベル。ＫＤ群において最終的に増殖した腫瘍が、対照と同様レベルのＭｔｄｈを発現したことに留意されたい。（図１８Ａ、図１８Ｃ、図１８Ｇ）データは、平均±ＳＥＭを表し、Ｐ値はスチューデントｔ検定に基づく。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．有意でない。 ＳＮＤ１−ＭＴＤＨ相互作用のマッピング及びそれらの複合体の全体構造を示す。ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の全体構造。２つの垂直図を示す。ＳＮＤ１及びＭＴＤＨのＳＮ１及びＳＮ２ドメインは、それぞれシアン、マゼンタ、及び黄色で色付けられる。ＳＮＤ１をリボン（左）及び面（右）で示す。ＭＴＤＨをワーム（骨格）及び円筒（側鎖）で示す。 ＳＮ１／２と、ＳＮ３／４及びＳＮａｓｅとの構造及び配列比較を表す。（図２０Ａ）ＳＮ１／２（マゼンタ、ＭＴＤＨを有する複合体内）、ＳＮ３／４（青色、ＰＤＢコード：３ＢＤＬ）、及びＳＮａｓｅの２つのモデル（黄色、ＰＤＢコード：２ＥＮＢ）の構造の立体図のオーバーレイ。Ｌβ２−β３ループの差は、破線の円によって強調される。（図２０Ｂ）ＳＮＤ１及びＳＮａｓｅからのＳＮ１／２とＳＮ３／４の配列整合。二次構造要素は、配列の上に示される。保存残基は、赤色で色付けられる。ＭＴＤＨと相互作用する残基は、緑色の正方形によって特定される。ヌクレアーゼ活性に寄与するＳＮａｓｅの活性部位における残基は、赤色の円によって示される。 ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１結合界面を示す。ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面の近接立体図。ＭＴＤＨ結合に必要なＳＮ１ Ｌβ２−β３ループの固有の構造を強調表示するために、ＳＮ３ドメイン（水色）及びＳＮａｓｅ（黄色）からのＬβ２−β３ループを示す。 結合において欠乏しているＭＴＤＨ及びＳＮＤ１突然変異体の特定を示す。（図２２Ａ）ＷＴまたは突然変異体配列を内包するＧＳＴタグ付きＭＴＤＨ（３６４〜５８２）によるＳＮＤ１（１６〜３３９）の生体外プルダウン。ＧＳ４Ｂに結合したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で検査し、クマシーブルー染色によって可視化した。（図２２Ｂ）ＧＳＴタグ付きＭＴＤＨ（３６４〜５８２）によるＷＴ及び突然変異体ＳＮＤ１（１６〜３３９）の生体外プロダウン。結合タンパク質を（図２２Ａ）と同様に検査した。（図２２Ａ）及び（図２２Ｂ）の両方について、実験を３回繰り返し、代表的な結果を示す。３回の実験から正規化した結合の割合を平均し、データを下回る平均±ＳＥＭが示された。（図２２Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示される単一点突然変異を有するヒトＨＡ−ＳＮＤ１、ＷＴ Ｍｙｃ−ＭＴＤＨ、またはＭｙｃ−ＭＴＤＨで形質移入した。溶解物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させ、示される抗体で免疫ブロットした。（図２２Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示される単一点突然変異または欠失を有するヒトＭｙｃ−ＭＴＤＨ、ＷＴ ＨＡ−ＳＮＤ１、または突然変異体ＨＡ−ＳＮＤ１で形質移入した。溶解物を抗Ｍｙｃで免疫沈降させ、示される抗体で免疫ブロットした。 ＳＮＤ１結合残基内の突然変異が、ＭＴＤＨの腫瘍促進機能を損なうことを示す。（図２３Ａ）ベクター対照、ＷＴ、または突然変異体マウスＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞からの溶解物を、抗ＭＴＤＨ抗体で免疫沈降させ、示されるタンパク質について免疫ブロットした。全てのアミノ酸注解が、ヒトＭＴＤＨに基づくことに留意されたい。ヒトＭＴＤＨのＷ３９４及びＷ４０１は、それぞれマウスＭＴＤＨにおけるＷ３９１及びＷ３９８に対応する。（図２３Ｂ）マンモスフェアアッセイを、示されるＭＴＤＨ構成体で再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞を用いて行った。（図２３Ｃ〜Ｅ）生体内腫瘍形成（腫瘍発生率については図２３Ｃ、腫瘍体積については図２３Ｄ、図２３Ｅ）を、示されるＷＴまたは突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞を使用して、制限数で行った。統計：（図２３Ｂ）スチューデントｔ検定。データは、平均±ＳＥＭを表す。（図２３Ｃ）限界希釈解析。（図２３Ｄ、図２３Ｅ）マン・ホイットニー検定。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨ結合ポケット内の突然変異が、ＳＮＤ１の腫瘍促進機能を損なうことを示す。（図２４Ａ）ベクター対照、ＷＴ、または突然変異体ｓｈＲＮＡ抵抗性マウスのＳＮＤ１で再構成されたＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞からの溶解物を、抗ＭＴＤＨ抗体で免疫沈降させ、示されるタンパク質について免疫ブロットした。（図２４Ｂ）マンモスフェアアッセイを、ベクター対照または示されるＳＮＤ１構成体で再構成されたＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞を用いて行った。（図２４Ｃ、図２４Ｄ）示される構成体で構成されたＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞の同所移植後の乳房腫瘍発生率（図２４Ｃ）及び腫瘍成長曲線（図２４Ｄ）。統計：（図２４Ｂ、図２４Ｄ）スチューデントｔ検定。データは、平均±ＳＥＭを表す。（図２４Ｃ）カイ二乗検定。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 ＭＴＤＨ相互作用が、ＳＮＤ１を熱ショックストレスにより誘導される分解から保護することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、空のベクター対照または示されるＷＴもしくは突然変異体Ｍｙｃ−ＭＴＤＨ構成体のいずれかと一緒に、ＨＡ−ＳＮＤ１で形質移入した。感染の２日後に、細胞を熱ショック条件下で処理し、溶解物を示されるタンパク質について免疫ブロットした。β−アクチンを負荷対照として使用した。３つの独立した実験の代表的な結果を示す。 野生型ＭＴＤＨペプチドが、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用を著しく遮断することを示す。ＨＡ−ＳＮＤ１及びＭＹＣ−ＭＴＤＨで同時形質移入された２９３Ｔ細胞。４８時間後に細胞を収集し、ＩＰアッセイに供した。（図２６Ａ、図２６Ｂ）細胞溶解物を抗ＨＡ抗体またはＩｇＧで終夜インキュベートし、続いてタンパク質Ａ／Ｇビーズで２時間インキュベートして、ＨＡ−ＳＮＤ１タンパク質をプルダウンした。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、５つの分画に分割した。各分画を、緩衝液または示されるペプチドで３０分間溶出した。溶出分画及びビーズをＷＢのために収集した。（図２６Ｃ、図２６Ｄ）細胞溶解物を６つの分画に分割し、それらのうちの１つをＩｇＧでインキュベートし、残りを抗体ＨＡ抗体プラス緩衝液または示されるペプチドのいずれかでインキュベートした。２４時間後、溶解物をタンパク質Ａ／Ｇビーズでインキュベートし、次にこれらのビーズを洗浄緩衝液中で洗浄した。 相互作用中断効果が、乳癌細胞系の内在性免疫沈降によって確認されたことを示す。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１を収集し、ＩＰアッセイに供した。（図２７Ａ）細胞溶解物を抗ＳＮＤ１抗体またはＩｇＧで終夜インキュベートし、続いてタンパク質Ａ／Ｇで２時間インキュベートして、内在性ＳＮＤ１タンパク質をプルダウンした。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、５つの分画に分割した。各分画を、緩衝液または示されるペプチドで３０分間溶出した。溶出分画及びビーズをＷＢのために収集した。（図２７Ｂ）細胞溶解物を５つの分画に分割し、抗ＳＮＤ１抗体＋緩衝液または示されるペプチドのいずれかでインキュベートした。２４時間後、溶解物をタンパク質Ａ／Ｇビーズでインキュベートし、次にこれらのビーズを洗浄緩衝液中で洗浄した。 ＳＮＤ１結合に対して効果を有しない、またはほとんど有しないＳＮＤ１結合モチーフ内に突然変異を担持するＭＴＤＨ突然変異体の特定を示す。ＷＴまたは突然変異体配列を内包するＧＳＴタグ付きＭＴＤＨ（配列番号１のアミノ酸３８６〜４０７）によるＳＮＤ１（配列番号２のアミノ酸１６〜３３９）の生体外プルダウン。ＧＳ４Ｂに結合されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で検査し、クマシーブルー染色によって可視化した。
本開示は、ＳＮＤ１とＭＴＤＨとの結合を阻害するペプチドまたは他の化合物を使用してＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の活性を阻害することによって、癌成長及び癌転移を低減する方法を提供する。発明者らは、ＭＴＤＨの欠乏が、多様な発癌遺伝子または発癌物質によって誘導される腫瘍形成を阻害することを発見した。下の結果は、ＭＴＤＨが、ＴＩＣに選択的に必要とされ、ＳＮＤ１のＭＴＤＨ媒介性安定化が、ストレス下で生存優位性を付与することを示す。これは、ＭＴＤＨ相互作用が、生存促進性遺伝子のＳＮＤ１依存的発現に必要とされるという最初の開示である。
本明細書で使用される場合、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明らかに示されない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「１つの誘導体」に対する言及は、複数のそのような誘導体を含み、「１人の患者」に対する言及は、１人以上の患者に対する言及を含むなどである。
また、「または」の使用は、別途記載されない限り、「及び／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は交換可能であり、制限的であることが意図されない。
様々な実施形態に関する記述が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定例において、実施形態が「から本質的になる」または「からなる」という言語を使用して代替的に記述され得ることを理解するであろうことがさらに理解される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び化学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するか、または同等の方法及び材料を、開示される方法及び生成物の実施に使用することができるが、例示的な方法、デバイス、及び材料が本明細書に記載される。
上記及び本文全体で論じられる文書は、本出願の提出日前に、単にそれらの開示のために提供される。本明細書において、先行開示に基づいて発明者らがそのような開示に先行する権利がないと認められるように解釈されるべきものは何もない。各文書は、それが引用される開示を特に重視して、参照によりその全体が組み込まれる。
以下の参照文献は、本開示において使用される用語の多くの一般定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ ｅｄ．１９９４）、ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）、ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
本明細書で使用される場合、「メタドヘリン（ＭＴＤＨ）とブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）との間の相互作用の阻害剤」または「ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤」は、２つのタンパク質の結合部位におけるＭＴＤＨとＳＮＤ１との相互作用を阻害する化合物または組成物を指す。一実施形態において、阻害剤は、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３（すなわち、配列番号１）におけるタンパク質間の結合を阻害する。追加の阻害剤は、詳細な説明においてさらに詳述される。
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」または「有効量」は、症状の改善、例えば、関連病態の治療、治癒、予防、もしくは改善、またはそのような病態の治療、治癒、予防、または改善の割合の増加をもたらし、典型的に、治療された患者集団において統計的に優位な改善をもたらすのに十分なペプチドまたは本明細書に記載される他の阻害剤生成物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分について言及するとき、治療上有効な用量は、その成分単独を指す。組み合わせについて言及するとき、治療上有効な用量は、組み合わせで投与されるか否かに関わらず（連続的または同時を含む）、治療効果をもたらす活性成分の複合量を指す。様々な実施形態において、治療上有効な量のペプチドまたは他の阻害剤生成物は、食欲減退、口腔内痛、上部腹痛、疲労、腹部膨満、持続的な痛み、骨痛、吐き気、嘔吐、便秘、体重減少、頭痛、直腸出血、寝汗、消化器の不快感、及び排尿時痛が挙げられるが、それらに限定されない様々な癌と関連付けられる症状を改善する。
「治療」は、予防的治療または治療的治療を指す。ある特定の実施形態において、「治療」は、治療目的または予防目的での対象への化合物または組成物の投与を指す。
「治療的」治療は、病理の徴候または症状を呈する対象に、それらの徴候または症状を軽減または排除する目的で投与される治療である。これらの徴候または症状は、生化学的、細胞性、組織学的、機能的、または物理的、主観的もしくは客観的であり得る。
「予防的」治療は、疾患の徴候を呈しないか、または疾患の早期徴候のみを呈する対象に、病理を発達させる危険性を減少させる目的で投与される処置である。本開示の化合物または組成物は、病理を発達させる可能性を低減するか、または発達した場合に病理の重症度を最小限に抑えるために、予防的治療として付与されてもよい。
「薬学的組成物」は、ヒト及び哺乳動物を含む対象動物における薬学的使用に適した組成物を指す。薬学的組成物は、治療上有効な量のペプチドまたは本明細書に記載される他の生成物、随意に別の生物学的活性剤、及び随意に薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む。実施形態において、薬学的組成物は、活性成分、及び担体を形成する不活性成分、ならびにそれらの成分のうちの任意の２つ以上の組み合わせ、複合、もしくは凝集から、またはそれらの成分のうちの１つ以上の解離から、またはそれらの成分のうちの１つ以上の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を含む組成物を包含する。したがって、本開示の薬学的組成物は、本開示の化合物及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を混和することによって作製される任意の組成物を包含する。
「薬学的に許容される担体」は、標準薬学的担体、緩衝液などのうちのいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロースの５％水性溶液、及びエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）を指す。賦形剤の非限定例としては、アジュバント、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、滑剤、甘味剤、風味剤、及び着色剤が挙げられる。好適な薬学的担体、賦形剤、及び希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載される。好ましい薬学的担体は、活性剤の意図される投与形態に依存する。典型的な投与形態としては、腸内（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋内、静脈内、もしくは腹腔内注入、または局所、経皮、もしくは経粘膜投与）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩、エステル、または活性剤の他の誘導体は、例えば、生物学的に、またはその他の点で望ましくないわけではない材料を指す塩、エステル、または他の誘導体を含み、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的作用をも引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の成分のうちのいずれかと、または個体の身体上もしくは体内に存在するいかなる成分とも有害に相互作用することなく個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位が、所望の効果をもたらすのに十分な量で、随意に薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、または媒体と関連して計算された既定量の本開示の化合物を含有する。本開示の新規単位剤形についての仕様は、用いられる特定の化合物、達成される効果、及び宿主内の各化合物と関連付けられる薬力学に依存する。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、哺乳網の任意のメンバー、すなわちヒト、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ならびに他の猿人及びサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物；ウサギ、イヌ、及びネコなどの飼育動物；ラット、マウス、及びモルモットなどの齧歯類を含む研究室動物が挙げられるが、それらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。様々な実施形態において、対象はヒトである。
メタドヘリン及びＳＮＤ１
メタドヘリン：メタドヘリン（ＭＴＤＨ、ＡＥＧ−１、３Ｄ３／ＬＹＲＩＣとしても知られる）は、乳癌の不良な無再発生存率と関連付けられる、頻繁に増幅されたゲノム遺伝子座、８ｑ２２内に常在する転移促進性遺伝子として特定された（Ｈｕら、２００９）。ヒトメタドヘリンのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＨ４５６４２において見出すことができ、また配列番号１として本明細書に提供される。近年、高レベルのＭＴＤＨが、２０を超える癌型において報告され（４）、ヒト癌におけるこの遺伝子の潜在的に重要かつ広範な機能性を示唆する。試験される癌型に応じて、主に細胞培養系を使用する近年の研究は、ＭＴＤＨが、細胞増殖、ストレス誘発性細胞死、浸潤、化学療法抵抗性、及び転移を含む多くの癌関連過程に関係するとした（Ｅｍｄａｄら、２０１３；Ｗａｎ及びＫａｎｇ、２０１３）。
こうしたＭＴＤＨの多面発現腫瘍促進的役割は、その初期特定によって明らかにされるように、このタンパク質の複合体性質に起因し得る。ＭＴＤＨは、本来、星状細胞におけるＨＩＶ誘発遺伝子（Ｓｕら、２００２）、肺内皮への乳房腫瘍の帰巣を媒介する細胞表面分子（Ｂｒｏｗｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉら、２００４）、前立腺上皮細胞内の密着結合と関連付けられる高リシンＣＥＡＣＡＭ１共単離（ＬＹＲＩＣ）タンパク質（Ｂｒｉｔｔら、２００４）として、及び異なる亜細胞区画内に存在する新規の膜貫通タンパク質（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、２００４）として報告された。分子レベルにおいて、ヒトＭＴＤＨは、推定上の膜貫通ドメイン及び３つの高リシン核局在化シグナルを除いて、その生物学的機能を示し得る認識可能なドメインを有しない５８２アミノ酸タンパク質をコードする（Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅら、２００９）。最近では、ＭＴＤＨが、複数のタンパク質と相互作用することが報告された。細胞核内で、ＭＴＤＨは、ＰＬＺＦ（Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅら、２００９）、ＢＣＣＩＰα（Ａｓｈら、２００８）、及びＮＦκＢサブユニットｐ６５（Ｅｍｄａｄら、２００６；Ｓａｒｋａｒら、２００８）と相互作用することが示された。細胞質内で、ＭＴＤＨは、ブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有タンパク質１（ＳＮＤ１）と相互作用することが報告された（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１；Ｙｏｏら、２０１１；Ｍｅｎｇら、２０１２）。ＭＴＤＨはまた、複数の伝統的な発癌シグナル伝達経路、例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＷｎｔシグナル伝達（Ｅｍｄａｄら、２０１３）と、癌細胞型依存的様式で関連付けられた。しかしながら、ＭＴＤＨが、その結合パートナーとの相互作用を通じてその機能を発揮するか否か、及びＭＴＤＨがどのように上述の発癌経路を調節するかは主に不明のままである。
ＳＮＤ１：ＳＮＤ１は、Ｎ末端にブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）様ドメインの４つの縦列反復（ＳＮ１−４）、ならびにＣ末端に融合チュードル（ｔｕｄｏｒ）及びＳＮドメイン（ＴＳＮ５ドメイン）を内包する多機能タンパク質である（Ｃａｌｌｅｂａｕｔ及びＭｏｒｎｏｎ、１９９７；Ｐｏｎｔｉｎｇ、１９９７）。それは、ＯＢ折り畳みの典型的なβ−バレルを介してＤＮＡ／ＲＮＡ結合に主に関与するタンパク質からなるオリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合折り畳み（ＯＢ折り畳み）スーパーファミリーに属する（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、２００３）。ヒトＳＮＤ１のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５５２０５において見出すことができ、また本明細書において配列番号２として提供される。一貫して、ＳＮＤ１は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の必須成分であり、ｍｉＲＮＡ媒介性サイレンシングに関与することが示唆された（Ｃａｕｄｙら、２００３）。超編集されたｍｉＲＮＡ一次転写物に対するヌクレアーゼ活性を有することも示された（Ｓｃａｄｄｅｎ、２００５）。ＳＮＤ１の構造及び生化学的解析は、Ｎ末端ＳＮドメイン、具体的にはＳＮ３／４が、ＲＮＡ結合及びヌクレアーゼ活性を有し（Ｌｉら、２００８）、及びＣ末端ＴＳＮドメインが、メチル化Ｌｙｓ／Ａｒｇリガンド及び小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体と相互作用する（Ｓｈａｗら、２００７）ことを示唆した。ＳＮＤ１は、種々のタンパク質との相互作用に関与するＯＢ折り畳みスーパーファミリーの非常に少ないメンバーの１つである。それは最初に、ＥＢＮＡ−２活性化遺伝子の転写を強調する細胞成分として特定され（Ｔｏｎｇら、１９９５）、発癌性転写因子ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、及びｃ−Ｍｙｂを含む、転写に関与する広範囲のタンパク質と相互作用し、調節することが後に示された（Ｌｅｖｅｒｓｏｎ、１９９８；Ｐａｕｋｋｕら、２００３；Ｖａｌｉｎｅｖａら、２００５；Ｖａｌｉｎｅｖａら、２００６；Ｙａｎｇ、２００２）。近年、ＳＮＤ１は、複数の癌の型におけるＭＴＤＨの結合パートナーとして特定され、発癌ストレスまたは化学療法ストレス下での癌細胞生存率に重要であることが示された（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１；Ｍｅｎｇら、２０１２；Ｗａｎら、２０１４；Ｙｏｏら、２０１１）。
ＳＮＤ１は、ＭＴＤＨのものと同様の腫瘍促進機能を有するＭＴＤＨの相互作用パートナーである（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１；Ｍｅｎｇら、２０１２；Ｗａｎｇら、２０１２；Ｙｏｏら、２０１１）。損なわれたＳＮＤ１結合を有する生化学的に特定されたＭＴＤＨ突然変異体が、乳癌の種々の亜型において、腫瘍開始細胞の増殖及び生存における活性の低減を呈したことが本明細書に示される（Ｗａｎら、２０１４）。ＭＴＤＨとその結合パートナーとの間の相互作用、及びそれらの相互作用が、癌におけるその役割にどのように影響を及ぼすかを理解するための構造的洞察は未だに入手可能でない。癌におけるＳＮＤ１の機能が、ＭＴＤＨ結合に依存するかどうかは、依然として明らかでない。一連の特定されたＳＮＤ１相互作用タンパク質は、そのＳＮドメインが、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインへと進化したことを示唆するが、相互作用の形態は、本開示まで明らかでなかった。
メタドヘリン／ＳＮＤ１阻害剤
本明細書に記載されるように、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との相互作用は、腫瘍成長及び転移の進行において重要な役割を果たす。このタンパク質相互作用の阻害剤の投与は、癌の治療のための有用な療法としてのものである。実施例４に示されるように、配列番号１に記載される野生型ＭＴＤＨの残基３９４及び４０１は、ＳＮＤ１との相互作用に必要である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、（ａ）コンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）（Ｘは任意のアミノ酸である）、または（ｂ）ＸＷＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号４）（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むＭＴＤＨのペプチドである。様々な実施形態において、阻害剤は、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３からのコンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むＭＴＤＨのペプチドである。いくつかの実施形態において、阻害剤は、コンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号４）（Ｘは任意のアミノ酸である）をＭＴＤＨのペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤は、ＭＴＤＨのペプチド、ＳＮＤ１のペプチド、配列番号１の残基３９３〜４０３を含むペプチドと同様の構造を有するペプチド模倣体、配列番号１の残基３９０〜４０３を含むペプチドと同様の構造を有するペプチド模倣体、配列番号１の残基３９３〜４０３を含むペプチドと同様の構造または構造の一部を有する小分子化合物、配列番号１の残基３９０〜４０３を含むペプチドと同様の構造または構造の一部を有する小分子化合物、または本明細書に記載されるペプチドもしくはペプチド模倣体を含有するナノ粒子抱合体である。
様々な実施形態において、阻害剤は、ｉ）配列番号１の残基３６４〜５８２内のペプチド、ｉｉ）配列番号１の残基３６４〜４０７内のペプチド、ｉｉｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７を含むペプチド、ｉｖ）配列番号１の残基３９３〜４０３を含むペプチド、またはｖ）配列番号１の残基３９０〜４０３を含むペプチド、またはｖｉ）残基３９３〜４０３にコンセンサス配列ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む配列番号１の残基３６４〜５８２、残基３６４〜４０７、残基３８６〜４０７、残基３９３〜４０３、または残基３９０〜４０３から選択されるＭＴＤＨのペプチドである。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）、またはその変異型を含み、変異型ペプチドが、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９つのうちのいずれか）の突然変異を、Ｗ残基を除く任意の位置に含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１１〜約２２アミノ酸長である（例えば、約１５〜約２２アミノ酸長）。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）またはその変異型に対してＮ末端側の１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸のうちのおよそいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）またはその変異型に対してＣ末端側の１、２、３、または４つのアミノ酸うちのおよそいずれかを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型を含み、変異型ペプチドは、Ｗ残基を除く任意の位置に少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９つのうちのいずれか）の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、約１０〜約２１アミノ酸長（例えば、約１４〜約２１アミノ酸長）である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型に対してＮ末端側の１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸のうちのおよそいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＥＥＷＧＮ（配列番号２０）またはその変異型に対してＣ末端側の１、２、３、または４つのアミノ酸うちのおよそいずれかを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＳＮＤ１（例えば、同じ長さを有する野生型ＭＴＤＨペプチド）に結合するために配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）を含む野生型ＭＴＤＨペプチドと競合する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）を含む野生型ＭＴＤＨペプチド（例えば、同じ長さを有する野生型ＭＴＤＨペプチド）のＳＮＤ１に対する結合親和性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の少なくともおよそいずれかである親和性を有するＳＮＤ１に結合する。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、Ｄ３８９、Ａ３９２、Ｄ３９３、Ｎ３９５、Ｅ３９９、Ｅ４００、Ｗ４０４、Ｄ４０６、及びＥ４０７からなる群から選択されるＭＴＤＨ内の１つ以上のアミノ酸残基に突然変異を含み、この位置が、野生型ＭＴＤＨ（すなわち、配列番号１）に対応する。一実施形態において、ペプチドは、Ｎ３９５、Ａ３９６、Ｐ３９７、Ａ３９８、Ｅ３９９、Ｅ４００、及びＮ４０３からなる群から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）のアミノ酸残基に突然変異を含み、この位置が、野生型ＭＴＤＨ（すなわち、配列番号１）に対応する。いくつかの実施形態において、ＭＴＤＨ内の突然変異は、Ｎ３９５Ｋ、Ａ３９６Ｄ、ＰＡＥ（３９７〜３９９）ＳＱ、及びＥ４００Ｄ／Ｎ４０３Ｌからなる群から選択され、この位置が、野生型ＭＴＤＨ（すなわち、配列番号１）に対応する。様々な実施形態において、ＭＴＤＨ（配列番号１）内の突然変異は、Ｄ３８９Ｒ、Ｄ３９３Ｒ、Ｅ３９９Ｒ、Ｅ４００Ｒ、Ｗ４０４Ｄ、Ｄ４０６Ｒ、及びＥ４０７Ｒからなる群から選択される。
様々な実施形態において、阻害剤は、ＳＮＤ１（すなわち、配列番号２）の残基１６〜３３９内のＳＮＤ１のペプチドである。一実施形態において、ＳＮＤ１ペプチドは、Ｆ２５０、Ｒ３２４、Ｒ２５５、Ｒ３２７、Ｒ３２４、Ｐ３９、Ｐ４３、Ｅ２４７、Ｌ２５６、Ｈ２７９、Ｉ２８４、Ｌ２８７、Ｒ２５９、及びＮ２８１からなる群から選択される１つ以上の残基に突然変異を含み、この位置が、野生型ＳＮＤ１（すなわち、配列番号２）に対応する。様々な実施形態において、ＳＮＤ１（すなわち、配列番号２）内の突然変異は、Ｆ２５０Ａ、Ｒ３２４Ｅ、及びＲ２５５Ｅからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＭＴＤＨまたはＳＮＤ１ペプチドは、６０個以下のアミノ酸、５５個以下のアミノ酸、４０個以下のアミノ酸、３５個以下のアミノ酸、または３０個以下のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む（例えば、有する）。随意に、ペプチドは、２５個以下のアミノ酸、２０個以下のアミノ酸、１５個以下のアミノ酸、または１０個以下のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む（例えば、有する）。様々な実施形態において、ペプチドは、１０〜３５個のアミノ酸残基（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸残基）を含む（例えば、有する）。いくつかの態様において、アミノ酸は、アミノ酸配列内から、Ｎ末端において、及び／またはＣ末端において本明細書に記載されるペプチドから除去される。そのようなペプチド断片は、３〜１４個のアミノ酸残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸残基）を含む。
本明細書に記載されるペプチドは、例えば、別の標的に結合するか、またはペプチドの半減期もしくは安定性を増加させる第２のペプチドドメインに融合され得るか、または複合され得る。
一態様において、ペプチドは、Ｎ末端及び／またはＣ末端における１つ以上の溶解物を含むが、これらに限定されないペプチドの合成、取り扱い、または使用を促進して、ペプチドの溶解度を増加させる１つ以上のアミノ酸をさらに含む。好適な融合タンパク質としては、１つ以上のポリペプチド、ポリペプチド断片、またはタンパク質配列の一部であると一般に認識されないアミノ酸と関連付けられる本明細書に記載されるペプチドを含むタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、融合ペプチドは、２つ以上のペプチドの全体アミノ酸配列を含むか、または代替として、２つ以上のペプチドの部分（断片）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるペプチドは、例えば、以下のマーカータンパク質、精製を促進するペプチド、多量体タンパク質の形成を促進するペプチド配列、または前述のうちのいずれかの断片のうちの１つ以上に操作可能に連結される。好適な融合パートナーとしては、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、及びｍｙｃタグが挙げられるが、これらに限定されない。
随意に、本明細書に記載されるペプチドは、ペプチドの半減期を強化する１つ以上の実体に融合される。半減期は、例えば、ペプチドの分子量を増加させて腎クリアランスを回避すること、及び／またはｎＦｃ受容体媒介性再生経路のためのリガンドを組み込むことによって増加され得る。一実施形態において、ペプチドは、アルブミンポリペプチドまたはその断片（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に融合されるか、または化学的に抱合される。アルブミン断片は、全長アルブミンタンパク質の１０％、２５％、５０％、または７５％を含む。代替として、または追加として、ペプチドは、生体内投与される場合、アルブミンに結合するアルブミン結合ドメインまたは脂肪酸と融合されるか、または複合される。アルブミン結合ドメインの例は、「ａｌｂｕタグ」、４−（ｐ−ヨードフェニル）−ブタン酸由来の部分である（Ｄｕｍｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４７：３１９６−３２０１（２００８））。他の好適な融合パートナーとしては、プロリン−アラニン−セリン多量体（ＰＡＳ化）、及び抗体またはその断片（例えば、抗体のＦｃ部分）が挙げられるが、これらに限定されない。
誘導体が企図され、アミノ酸の付加、欠失、または置換とは異なるいくつかの様式で化学的に修飾されたペプチドを含む。この点において、本明細書に提供されるペプチドは、ポリマー、脂質、他の有機部分、及び／または無機部分と化学的に結合される。ペプチド及びタンパク質修飾の例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）において付与される。本明細書に記載されるペプチドは、別の部分（例えば、ペプチド部分）への抱合を促進する官能基を随意に含む。例示的な官能基としては、イソチオシアン酸塩、イソシアン酸塩、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、エポキシド、オキシラン、炭酸塩、アリール化剤、イミドエスエル、カルボジイミド、無水物、アルキルハロゲン化物誘導体（例えば、ハロアセチル誘導体）、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール−ジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィドまたはＴＮＢチオール）、ジアゾアルカン、カルボイルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ′−ジスクシニル炭酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロギ酸塩、及びヒドラジン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。マレイミドは、例えば、生体内でアルブミンと結合するタンパク質Ｓ結合ペプチドを生成するために有用である。
一態様において、本発明は、１つ以上の水溶性ポリマー付着を含むように複合的に修飾された本明細書に記載されるペプチドを含む。水溶性ポリマー（または他の化学部分）は、任意のアミノ酸残基に付着されるが、いくつかの実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端への付着が好ましい。有用なポリマーとしては、ＰＥＧ（例えば、約４０ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１０ｋＤ、５ｋＤ、または１ｋＤのサイズのＰＥＧ）ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、ならびに前述のうちのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、本発明のペプチドは、ＰＥＧ化ペプチドである。ＰＥＧ部分は、異なる形状、例えば、線状または分枝状で使用可能である。水溶性ポリマー付着に関するさらなる考察については、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号を参照されたい。ペプチド半減期または安定性を改善するために有用な他の部分が本明細書に記載され、例えば、アルブミン（本発明のペプチドへの抱合を可能にするように随意に修飾される）、脂肪酸鎖（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、例えば、Ｃ１４脂肪酸、またはジカルボン酸、例えば、オクタデカンジカルボン酸（ｏｄｄｃ））、抗体またはその断片（例えば、抗体のＦｃ部分）、及びプロリン−アラニン−セリン多量体が挙げられる。
別の態様において、ペプチド誘導体は、特定の細胞型、組織、及び／または臓器に特異的な標的部分を含む。代替として、ペプチドは、精製、検出、多量体化、相互作用パートナーとの結合、及びペプチド活性の特徴付けを促進する１つ以上の化学部分に連結される。例示的な化学部分はビオチンである。本発明のペプチドへの抱合に好適な他の部分としては、光増感剤、染料、蛍光染料、放射性核種、放射性核種含有複合体、酵素、毒素、及び細胞毒性剤が挙げられるが、これらに限定されない。光増感剤としては、例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ、Ｌｅｖｕｌａｎ、Ｆｏｓｃａｎ、Ｍｅｔｖｉｘ、Ｈｅｘｖｉｘ（登録商標）、Ｃｙｓｖｉｅｗ（商標）、Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ、Ａｎｔｒｉｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ、Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ、Ｐｈｏｔｒｅｘ、Ｌｕｍａｃａｎ、Ｃｅｖｉｒａ、Ｖｉｓｏｎａｃ、ＢＦ−２００ ＡＬＡ、及びＡｍｐｈｉｎｅｘが挙げられる。所望される場合、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、またはｍｙｃタグが、ペプチドに抱合される。
加えて、一態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸においてアシル化される。別の態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸においてアミド化される。なおもさらなる態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸においてアシル化され、ペプチドのＣ末端アミノ酸においてアミド化される。
誘導体はまた、修飾もしくは非タンパク新生アミノ酸、または修飾リンカー基を含むペプチドを含む（例えば、Ｇｒａｎｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ′ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照されたい）。修飾アミノ酸は、例えば、アミノ及び／またはカルボキシル基が別の基によって置換されるアミノ酸を含む。非限定例としては、チオアミド、ウレア、チオウレア、アシルヒドラジド、エステル、オレフィン、スルホンアミド、リン酸アミド、ケトン、アルコール、ホウ酸アミド、ベンゾジアゼピン、及び他の芳香族または非芳香族複素環を組み込む修飾アミノ酸が挙げられる（Ｅｓｔｉａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｒｇｅｒｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｐａｒｔ ４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）を参照されたい）。非タンパク新生アミノ酸としては、β−アラニン（Ｂａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、タウリン、サルコシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、システイン酸（Ｃｏｈ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、メチオニンスルホキシド（Ｍｅｏ）、メチオニンスルホン（Ｍｏｏ）、ホモセリンメチルエステル（Ｈｓｍ）、プロパルギルグリシン（Ｅａｇ）、５−フルオロトリプトファン（５Ｆｗ）、６−フルオロトリプトファン（６Ｆｗ）、３′，４′−ジメトキシフェニル−アラニン（Ｅａｒ）、３′，４′−ジフルオロフェニルアラニン（Ｄｆｆ）、４′−フルオロフェニル−アラニン（Ｐｆｆ）、１−ナフチル−アラニン（１Ｎｉ）、２−ナフチルアラニン（２Ｎｉ）、１−メチルトリプトファン（１Ｍｗ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ベンゾチエニルアラニン（Ｂｔａ）、Ｌ−ホモ−システイン（Ｈｃｙ）、Ｎ−メチル−フェニルアラニン（Ｎｍｆ）、２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、３，３−ジフェニルアラニン（Ｅｂｗ）、Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）、Ｂｐａ、ホモフェニルアラニン（Ｈｆｅ）、及びＳ−ベンジル−Ｌ−システイン（Ｅｃｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他の非タンパク新生アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体として存在し得る。修飾リンカーの例としては、可撓性リンカー４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｔｔｄｓ）、グリシン、６−アミノヘキサン酸、β−アラニン（Ｂａｌ）、ペンチン酸（Ｐｙｎ）、ならびにＴｔｄｓ、グリシン、６−アミノヘキサン酸、及びＢａｌの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のペプチドを構成するアミノ酸の相同体は、表１に記載される通りであり得る。任意の実施形態において、本発明のペプチドの１つ以上のアミノ酸は、表１に記載されるアミノ酸または構築ブロックで置換される。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチド内のアミノ酸を接合するペプチド（ＣＯ−ＮＨ）結合は、反転して「レトロ修飾」ペプチド、すなわち、基準ペプチドと比較して反対方向に組み立てられたアミノ酸残基（ＮＨ−ＣＯ結合）を含むペプチドを創出する。レトロ修飾ペプチドは、基準ペプチドと同じアミノ酸キラリティを含む。「インベルソ修飾」ペプチドは、基準ペプチドと同じ方向に組み立てられたアミノ酸残基を含むが、アミノ酸のキラリティが反転した本発明のペプチドである。したがって、基準ペプチドがＬ−アミノ酸を含む場合、「インベルソ修飾」ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含み、逆も同様である。インベルソ修飾ペプチドは、ＣＯ−ＮＨペプチド結合を含む。「レトロ・インベルソ修飾」ペプチドは、反対方向に組み立てられたアミノ酸残基を含み、反転したキラリティを有するペプチドを指す。レトロ・インベルソ類似体は、逆末端及び逆方向のペプチド結合（すなわち、ＮＨ−ＣＯ）を有する一方で、基準ペプチドにおいて見出される側鎖トポロジーをほぼ維持する。レトロ・インベルソペプチド模倣体は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，３２３０−３２３７（１９９７）に記載される方法を含む、標準方法を使用して作製される。部分的レトロ・インベルソペプチドは、アミノ酸配列の一部のみが逆転し、エナンチオマーアミノ酸残基で置換されたペプチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチド阻害剤は、担体ペプチドまたはタンパク質、例えば、積み荷タンパク質もしくはペプチド、輸送ペプチドもしくはペプチド、または細胞貫通タンパク質もしくはペプチド（ＣＰＰ）に抱合され、薬力学的挙動を改善する。例示の改善された薬理学的挙動としては、より長い血清及び／もしくは循環半減期、ならびに／または優れた細胞透過が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチド阻害剤は、ＨＩＶ ＴＡＴ ペプチド、ＴＡＴｍ、ＰＴＤ、ＰＴＲ（ＰＴＤとも称される）、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ、Ｒ９、Ｒ９−ＴＡＴ、ＭＴＳ、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ、ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲＥＸ、ＭＡＰ、ＴＰ、ＰＥＰ、及びＰｒＰからなる群から選択される輸送ペプチドまたは細胞貫通ペプチドと抱合される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチド阻害剤は、担体ペプチドまたはタンパク質、例えば、積み荷タンパク質もしくはペプチド、輸送ペプチドまたはペプチドまたは細胞貫通タンパク質もしくはペプチド（ＣＰＰ）と混和され、薬理学的挙動を改善する。
ペプチド阻害剤と担体ペプチドまたはタンパク質との間の好適なモル比は、例えば、約１：１００〜約１００：１であり得、例えば、約１：５０〜約５０；１、約１：２０〜約２０：１、約１：１０〜約１０：１、約１：５〜約５：１、または約１：１を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド阻害剤と担体ペプチドまたはタンパク質との間のモル比は、約１：１〜約２０：１、約１：１〜約１０：１、約１：１〜約１：５：１、約１：１〜約２：１、約１：１、約１：１〜約１：２、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：１０、または約１：１〜約１：２０のうちのおよそいずれかである。
本明細書に記載される癌の予防または治療のための本明細書に記載されるペプチドの細胞内送達は、外部細胞／形質膜を横断して、細胞の細胞質及び／または核へのペプチドまたは核酸の通過または転位を促進するための「ファシリテータ部分」、例えば担体ペプチドを利用して達成され得る。本明細書に記載されるファシリテータ部分は、本発明により具現化されるペプチド、薬剤、または核酸の、多くの方法のうちのいずれかでの癌細胞への移入を促進することができ、本発明は、いかなる特定の機序（例えば、細胞への直接貫通（例えば、強化された細胞膜溶解度または細胞膜内の一時的な孔の形成による））、細胞内取込み媒介性細胞移入（例えば、細胞と表面発現した受容体との相互作用またはマクロピノサイトーシスによる）、及び細胞膜上の一過性構造の形成を介した細胞移入にも限定されない。ファシリテータ部分は、脂質部分または他の非ペプチド部分（例えば、炭水化物部分）であり得、標的細胞の外部細胞膜を横断する通過のために、本発明に従う抗癌ペプチドの細胞膜溶解度を増強するか、またはそれにより細胞へのペプチドの移入が促進される。脂質部分は、例えば、混合トリグリセリドを含むトリグリセリドから選択され得る。脂肪酸及び具体的にはＣ１６〜Ｃ２０脂肪酸を使用することもできる。典型的に、脂肪酸は、飽和脂肪酸、及び最も一般的にはステアリン酸であろう。
さらに別の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、ペプチドの検出のために、標識、シグナル伝達、または他の分子（例えば、造影剤、撮像剤、ビオチン、ストレプトアビジン、放射性同位体、蛍光染料、化学発光剤、化学発光団、生物発光剤、酵素、またはその結合断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）．２断片）、磁気粒子など）を有する複合体を形成するための抱合剤と抱合される。理解されるように、本発明により具現化されるペプチドは、標的細胞へのペプチドの通過を促進するためのファシリテータ部分、及び好適な撮像技法（例えば、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ））を利用して細胞内のペプチドを検出するための標識、シグナル伝達分子、放射性同位体などと複合される、またはそれに複合するための抱合剤に結合され得る。ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）は、使用でき、癌治療及び診断に使用するための一連の化合物、例えば、モノクローナル抗体、放射性同位体、及び金属カチオン（例えば、カルシウム及びガドリニウム）に複合され得る抱合剤の例である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、標的細胞の撮像のための造影剤としてガドリニウムと複合されたＤＯＴＡに抱合される（Ｓｔｕｒｚｕ Ａら、２００８）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、例えば、標的送達及び／または持続放出のために、リポソーム、微小粒子、またはナノ粒子に製剤化される。ペプチド送達（標的送達及び／または持続放出を含む）に好適なリポソーム、微小粒子、及びナノ粒子が当該技術分野において既知である。例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３１（１），１８４−１９３，２０１０を参照されたい。
本明細書に記載されるペプチドのうちの１つ以上を含むナノ粒子抱合体も企図される。「ナノ粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、サイズがナノメートル範囲（すなわち、１μｍ未満）で測定される粒子を指す意味する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約２〜５００ｎｍの範囲の総直径を有し、例えば、約２〜約２００ｎｍ、約１０〜約２００ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍを含む。
ナノ粒子コア材料は、金属または半導体であり得、複数の原子型で形成され得る。好ましくは、コア材料は、Ａｕ、Ｆｅ、またはＣｕから選択される金属である。ナノ粒子コアは、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ、及びＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金から形成されてもよく、本発明において使用することができる。好ましいコア材料は、Ａｕ及びＦｅであり、最も好ましい材料はＡｕである。ナノ粒子のコアは、好ましくは約１００〜５００個の原子（例えば、金原子）を含み、ナノメートル範囲のコア直径を提供する。他の特に有用なコア材料は、ＮＭＲ活性である１つ以上の原子でドープされ、ナノ粒子が生体外及び生体内の両方でＮＭＲを使用して検出されるのを可能にする。ＮＭＲ活性原子の例としては、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋２、Ｃｕ＋２、Ｖ＋２、Ｃｏ＋２、Ｎｉ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、及びランタニド＋３、または量子ドットが挙げられる。
ナノメートルスケール半導体結晶が、量子ドットとして作用することができるため、すなわち、それらが光を吸収することができ、それにより材料中の電子をより高いエネルギーレベルに励起し、後次にその材料に特徴的な周波数で光の光子を放出するため、半導体原子を含むナノ粒子コアが検出され得る。半導体コア材料の例は、カドミウムセレニド、硫化カドミウム、カドミウムテルリウムである。硫化亜鉛などの亜鉛化合物も挙げられる。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子抱合体は、検出可能な標識を含む。この標識は、ナノ粒子のコアまたはリガンドの要素であり得る。標識は、ナノ粒子のその要素の本来の特性に起因して、または検出可能なさらなる部分と結合される、抱合される、または関連付けられることによって検出可能であり得る。標識の好ましい例としては、蛍光基、放射性核、磁気標識、または染料である標識が挙げられる。蛍光基としては、フルオレセイン、ローダミン、またはテトラメチルローダミン、テキサス−レッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられ、蛍光標識の励起及びラマン分光法を使用する放出光の検出によって検出され得る（Ｙ．Ｃ．Ｃａｏ，Ｒ．Ｊｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７：１５３６−１５３９）。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子抱合体は、放射性核によって、例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴを使用することによって放出される放射活性を使用してナノ粒子を検出する際に使用するため、または治療のため、すなわち、標的細胞を殺傷するための放射性核を含む。本発明における使用のために容易に適合され得る当該技術分野において一般に使用される放射性核の例としては、様々な酸化状態で存在する９９ｍＴｃが挙げられるが、最も安定しているのは、ＴｃＯ４−、３２Ｐまたは３３Ｐ、５７Ｃｏ、５９Ｆｅ、多くの場合、Ｃｕ２＋塩として使用される６７Ｃｕ、Ｇａ３＋塩として一般に使用される６７Ｇａ、例えば、クエン酸ガリウム、６８Ｇｅ、８２Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０３Ｐｄ、Ｉｎ３＋塩として一般に使用される１１１Ｉｎ、ヨウ化ナトリウムとして一般に使用される１２５Ｉまたは１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１５３Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１５８Ａｕ、１８６Ｒｅ、Ｔｌ＋塩として一般に使用される２０１ＴＬ、例えば、塩化タリウム、３９Ｙ３＋、７１Ｌｕ３＋、及び２４Ｃｒ２＋である。標識及び追跡子としての放射性核の一般的使用は、当該技術分野において周知であり、本発明の態様における使用のために熟練者によって容易に適合され得る。放射性核は、ナノ粒子のコアをドープするか、またはそれらをナノ粒子上に固定されたリガンドの一部として存在する標識として含めることによって最も容易に用いることができる。
追加として、または代替として、ナノ粒子抱合体は、上で示されるナノ粒子と関連付けられた標識を使用する、当該技術分野において周知の多くの技法を使用して、またはそれらの特性を用いることによって検出され得る。ナノ粒子を検出するこれらの方法は、それらのナノ粒子が別の種に結合するときに生じる凝集を、例えば、単なる目視検査によって、または光散乱（ナノ粒子を含有する溶液の透過率）を使用することによって検出することから、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または原子量顕微鏡（ＡＦＭ）などの洗練された技法を使用してナノ粒子を可視化することにまで及び得る。金属粒子を検出するさらなる方法は、通常、光学照射によって引き起こされる金属の表面における電子の励起であるプラズモン共鳴を用いることである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象は、金属（例えば、ＡｇまたはＡｕ）及び空気または水などの誘電材料の界面に存在する。検体がナノ粒子の表面上に固定されたリガンドに結合するため、ＳＰＲの変化が起こり、界面の屈折率を変化させる。ＳＰＲのさらなる利点は、それを使用してリアルタイム相互作用を監視できることである。上述されるように、ナノ粒子がＮＭＲ活性である原子を含むか、またはそれでドープされる場合、次にこの技法を使用して、生体外または生体内の両方で、当該技術分野において周知の技法を使用して粒子を検出することができる。ナノ粒子は、ナノ粒子により促進された銀の還元を使用する定量シグナル増幅に基づくシステムを使用して検出することもできる（Ｉ）。ナノ粒子が蛍光プローブとしてリガンドを含む場合、蛍光分光法が使用され得る。また、炭水化物の同位体標識を使用して、それらの検出を容易にすることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、分枝状金粒子のレーザー照射を通じて標的細胞を撮像するか、または標的細胞の細胞死の補助のために金ナノ粒子に抱合される。金ナノ粒子は、原形質を渡って移動し、核膜は、以前に報告された（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ Ｃ．Ｃ．，２００５）。
本明細書に記載されるペプチドは、多くの目的に有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、対象におけるＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用を妨害する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象における生存促進性遺伝子のＳＮＤ１依存的発現を阻害する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、癌を有する対象における腫瘍転移を阻害する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるペプチド阻害剤（またはそのようなペプチド阻害剤を含む薬学的組成物）のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。
癌
ＭＴＤＨ及び／またはＳＮＤ１のペプチド、ならびに本明細書に記載されるＭＴＤＨとＳＮＤ１との相互作用の他の阻害剤が、ＭＴＤＨが役割を果たす癌を治療するために有用であることが企図される。例示的な癌としては、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、盲腸癌、小児小脳星状細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿道癌、骨及び関節癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹グリア腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視路及び視床下部グリオーマ、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管神経系癌、神経系リンパ腫、中枢神経系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼球内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ、ｓｔｏｍａｃｈ）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍グリオーマ、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、眼球癌、膵島細胞腫瘍（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎癌、腎臓癌、咽頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨肉腫性白血病、毛様細胞白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、髄芽細胞腫、黒色腫、眼球内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平頸部癌、口癌、舌癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨肉腫性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、鼻咽頭癌、神経芽腫、口癌、口腔癌、中咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫、膵臓癌、膵島細胞膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂及び尿管移行上皮癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイングファミリーの肉腫腫瘍、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平細胞癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管ならびに他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、癌は、乳癌、肝臓癌、結腸癌、肺癌、及び前立腺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌は前立腺癌である。いくつかの実施形態において、癌は乳癌である。
前立腺癌：前立腺癌は、米国内の男性の中で最も一般的な癌の種類である。それは、総癌発生率の２８％、及び米国男性の総癌死の１０％を占める（１）。前立腺癌関連死亡率は、骨、肺、及び肝臓などの遠隔臓器へと分散及び転移した進行癌によって主に引き起こされる（２）。一旦これらの極めて重要な臓器内で癌細胞が二次腫瘍を確立すると、治療は通常、転帰が悪化してより複雑になる。前立腺癌の進行及び転移を駆動する新規の分子標的を定義し、理解することは、前立腺癌の有効な治療手法を開発するために重要である。
ＭＴＤＨは、良性過形成組織及び正常上皮細胞と比較して、前立腺腫瘍組織及び腫瘍形成細胞系内で過剰発現することが示された（Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅら、２００９；Ｋｉｋｕｎｏら、２００７）。培養した前立腺癌細胞内のＭＴＤＨのノックダウンは、アポトーシスを強化し、マトリゲル浸潤を阻害した。
製剤
本開示は、癌の治療に有用な（例えば、腫瘍の成長または転移を阻害または抑制する）ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤を提供する。阻害剤を患者または試験動物に投与するために、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物中で生成物を製剤化することが好ましい。薬学的または薬理学的に許容される担体または媒体は、下記のように、当該技術分野において周知の経路を使用して投与されたときにアレルギー反応または他の有害反応をもたらさないか、または米国食品医薬品局もしくは対応する外国規制当局によって経口もしくは非経口的に投与される医薬品への許容される添加剤として承認される分子実態及び組成物を指す。薬学的に許容される担体としては、任意及び全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。
薬学的担体としては、特に塩基性基または酸性基が化合物中に存在する、薬学的に許容される塩が挙げられる。例えば、−−ＣＯＯＨなどの酸性置換基が存在する場合、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及び同様の塩が投与に企図される。追加として、酸性基が存在する場合、化合物の薬学的に許容されるエステル（例えば、メチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ピバロイルオキシメチル、スクシニルなど）が、化合物の好ましい形態として企図され、そのようなエステルは、持続放出またはプロドラッグ製剤として使用するために、溶解度及び／または加水分解特徴を修正することが当該技術分野において既知である。
塩基性基（例えば、アミノまたは塩基性ヘテロアリールラジカル、例えば、ピリジル）が存在する場合、塩酸塩、臭化水素塩、酢酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などの酸性塩が、投与のための形態として企図される。
加えて、化合物は、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。そのような溶媒和物が同様に企図される。
本明細書における阻害剤は、経口的に、非経口的に、経眼球的に、鼻腔内に、経皮的に、経粘膜的に、吸入スプレーによって、膣的に、直腸的に、または頭蓋内注入によって投与され得る。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注入、静脈内、筋内、嚢内注入、または注射技法を含む。静脈内、皮内、筋内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注入による投与及び／または特定部位における外科的移植も同様に企図される。一般に、上記方法のうちのいずれかによる投与のための組成物は、発熱物質、ならびにレシピエントに有害であり得る他の不純物を本質的に含まない。さらに、非経口的投与のための組成物は滅菌である。
投薬及び投与
ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤は、治療上有効な量で投与され、典型的に、組成物は、単位剤形である。投与される阻害剤の量は、当然のことながら、患者の年齢、体重、及び全身状態、治療される病態の重症度、及び処方する医師の判断に依存する。好適な治療量は、当業者に既知であり、及び／または関連する参照文書及び文献に記載されている。一態様において、用量は、１日１回または１日複数回のいずれかで投与される。ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤は、１日１回、２回、３回、または４回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、阻害剤の有効投薬量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ）の範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、阻害剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、または約６０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の日用量で投与される。さらに、有効用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ／２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、２５ｍｇ／ｋｇ増分で最大１０００ｍｇ／ｋｇまで増加し得るか、または前述の値のうちのいずれか２つの間の範囲であってもよい。
投与は、少なくとも３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、またはそれよりも長く継続させることができる。
併用療法
本明細書に記載される治療組成物は、治療上有効な投薬量で、単独で、または手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、熱療法、及びレーザー療法などの補助的癌療法と組み合わせて投与され得、例えば、腫瘍サイズを低減する、腫瘍成長の速度を遅らせる、転移を阻害する、腫瘍を癌治療に敏感にさせる、または他の方法で全体臨床病態を改善するという有益な効果を、必ずしも癌を根治することなくもたらし得る。癌細胞を標的とする細胞増殖抑制剤及び細胞毒性剤が、併用療法のために具体的に企図される。同様に、血管新生またはリンパ脈管新生を標的とする薬剤、またはチェックポイント経路を標的とする免疫療法が、併用療法のために具体的に企図される。
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；エチレンイミン及びメチルアメラミ（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にバラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸酸化物、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；ビンカアルカロイド；エピポドフィロトキシン；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１１及びカリケアミシンω１１などの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼ；アントラセンジオン置換ウレア；メチルヒドラジン誘導体；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩などのビスホスホン酸塩；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣなどのミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどのギ酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メプチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナル；フロリン酸などの葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシン及びアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニチアエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサンチオン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２，２″−トリクロロトリエチルアミン；トリクロテセン（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）パクリタキセルのクレモフォール不含アルブミン操作されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ロイコボリン（ＬＶ）；イレノテカン；アドレノコルチカル抑制剤、アドレノコルチコステロイド；プロゲスチン；エストロゲン；アンドロゲン；ゴナドトロピン放出ホルモン類似体；及び上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれ、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ−トレミフェン；副腎内のエストロゲン生成を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＬ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＴＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ、及びＨ−Ｒａｓ；ＶＥＧＦ−Ａ発現阻害剤などのリボザイム（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＪＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＬＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；及び上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、任意の数の免疫チェックポイント阻害剤と併せて投与される。免疫チェックポイント阻害剤としては、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、及びＧＡＬ９のうちの１つ以上に結合し、その活性を遮断または阻害する抗体、またはその抗原結合断片が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１遮断剤）及びニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書に記載される治療方法は、腫瘍に対する治療組成物の効果を監視することを随意に含む。例えば、転移の存在と同様に、腫瘍のサイズを判定することができる。例えば、転移モジュールの数を測定することによるか、または転移と関連付けられる腹水の測定による転移の程度の測定も企図される。
ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１阻害剤及び他の薬物／療法は、単一組成物中で同時に、または別個の組成物中のいずれかで組み合わせて投与され得る。代替として、投与は連続的である。同時投与は、阻害剤及び他の治療薬（複数可）の両方を含む単一組成物または薬理学的タンパク質製剤を投与することによって達成される。代替として、他の治療薬は、阻害剤の薬理学的製剤（例えば、錠剤、注入、または飲料）としてほぼ同時に別個に摂取される。
キット
本開示は、該開示の方法を実行するためのキットも提供する。様々な実施形態において、このキットは、例えば、液体（例えば、滅菌注入可能な）製剤または固体（例えば、凍結乾燥された）製剤を含むボトル、バイアル瓶、アンプル、管、カートリッジ、及び／またはシリンジを含む。これらのキットは、固体（例えば、凍結乾燥された）製剤を投与（例えば、注入による）のための溶液または懸濁液に再構成するため（限定されないが、注入のためにシリンジ内で凍結乾燥された製剤を再構成することを含む）、または濃縮物をより低い濃度に希釈するために、薬学的に許容される媒体または担体（例えば、溶媒、溶液、及び／もしくは緩衝液）を含むこともできる。さらに、即時注入溶液及び懸濁液は、例えば、本明細書に記載される阻害剤を含む組成物を含む、滅菌粉末、顆粒、または錠剤から調製され得る。これらのキットは、エアロゾルまたは注入分注デバイス、ペン注入器、自動注入器、無針注入器、シリンジ、及び／または針などの分注デバイスを含むこともできる。様々な実施形態において、このキットは、経口剤形、例えば、この方法で使用するための阻害剤の錠剤もしくはカプセル、または本明細書に記載される他の経口製剤も提供する。このキットは、使用のための指示書も提供する。
本開示は、その特定の実施形態と併せて説明されたが、前述の説明ならびにそれに続く実施例は、本開示の範囲を例証することが意図され、制限するものではない。本開示の範囲内の態様、利点、及び修正は、当業者に明らかとなるであろう。
実施例１−ＭＴＤＨノックアウトマウスの生成及び腫瘍進行における効果
生体内の乳癌細胞の発達、進行、及び転移に対するメタドヘリンの効果を調査するために、メタドヘリンノックアウトマウスを生成した。
実験手順
マウス：マウスを必要とする全ての実験プロトコルは、プリンストン大学の施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ｍｔｄｈ−ＫＯマウスを、ＥＳ細胞系ＸＢ７８０（ＢａｙＧｅｎｏｍｉｃｓ）をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入することによって生成した後、生殖系伝達を確認した。次にＫＯマウスを、ＦＶＢバックグラウンド内でＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ、ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ遺伝子導入マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と繁殖させる前に、６世代超にわたってＦＶＢバックグラウンドに戻し交雑した。ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ構成体を創出するために、マウスＭｔｄｈコード配列をｐＭＭＴＶ−ＳＶ４０ベクターに挿入し、次に発現カセットを線形化して、ＦＶＢマウスからの接合子の前核に微量注入した。自発的腫瘍形成研究の場合、特異的発癌遺伝子を担持する雌マウスを、乳房腫瘍について毎週検査した。腫瘍は、連続２週間にわたって明白になったときに確立されたと見なし、腫瘍体積（π×長さ×幅２／６）の計算のために腫瘍をカリパスによって測定した。固定後（ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴモデル）または肺の切断及び染色後（ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２モデル）に、肺小結節を直接数えた。
Ｍｔｄｈノックアウト対立遺伝子の遺伝子型判定：Ｍｔｄｈ遺伝子座の第２のイントロン内の遺伝子トラップカセットの正確な挿入部位を判定するために、順方向プライマー５′−ＣＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧ−３′（ＭＴＤＨの第２のエクソン内に位置する）（配列番号６）及び逆方向プライマー５′−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３′（標的ベクターｐＧＴ０ｐｆｓ内に位置する）（配列番号７）を使用し、Ｅｘｐａｎｄ ２０ｋｂ ＰＵＳ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、挿入部位を被覆する断片を増幅させた。ＰＣＲ生成物を配列決定し、挿入部位がＭＴＤＨの第２のイントロンの３０４１ｂｐであることを判定した。この挿入部位に基づいて、３つの遺伝子型判定プライマーを、下に示されるように、Ｍｔｄｈ＋／＋、ＭＴＤＨ＋／−、及びＭｔｄｈ−／−マウスを区別するように設計された。野生型対立遺伝子は、６０２ｂｐ ＰＣＲ断片に対応するが、遺伝子トラップ対立遺伝子は、４７２ｂｐ ＰＣＲ断片に対応する。野生型及びジーントラップされたＭｔｄｈ対立遺伝子を遺伝子型判定するためのＰＣＲプライマーを表１に示す。
ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子の遺伝子型判定：ニュージャージー州のＲｕｔｇｅｒｓ癌研究所における遺伝子導入及びノックアウト共有リソースによって、サザンブロット遺伝子型判定を行い、遺伝子導入系を確認した。ＰＣＲ遺伝子型判定の場合、ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ遺伝子導入子孫を特定するために使用されるプライマーは、ＭｔｄｈとＳＶ４０との間の連結領域を増幅させるように設計し、一方で他のゲノムＤＮＡ領域を標的とするプライマーは、内部対照とした。ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ導入遺伝子を遺伝子型判定するためのＰＣＲプライマーを表２に示す。
乳房発癌：前述のプロトコルを使用して乳房発癌実験を行った。手短に言えば、示されるＭｔｄｈ遺伝子型を有する６週齢雌ＦＶＢ／Ｎマウスに、１５ｍｇ ＭＰＡ（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ，ＮＹ，Ｐｆｉｚｅｒ）を皮下注入し、１週間後に０．１ｍＬの綿実油中１ｍｇのＤＭＢＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を連続４週間にわたって毎週強制的に投与した。腫瘍形成について、マウスを毎週検査した。
組織学及び免疫組織化学：β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）活性を検出するために、胚を０．２％グルタルアルデヒド中で３０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム中の１ｍｇ／ｍＬ ４−クロロ−５−ブロモ−３−インドリル−β−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、４ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６３Ｈ２Ｏ、４ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％デオキシコレート、及び０．０２％ ノニデットＰ−４０、ｐＨ７．３）中で終夜インキュベートした。染色した後、胚を１０％リン酸緩衝ホルマリン中でさらに固定した。乳腺の全組織標本調製のために、第４鼠径部乳腺を切り取り、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で終夜固定し、続いて水和反応及びカーマインレッド染色を行った。次に染色された腺を、一連のアルコール浴中で脱水し、組織切除（ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ）試薬で脱脂して載置した。組織診断のために、ホルマリン固定した組織をパラフィンに埋め込み、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学染色のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）による抗原熱回復を、パラフィンに埋め込まれた切片上で使用し、切片を、ＰｙＭＴに対する抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００−２７４９，１：２００）、切断されたカスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９６６４、１：２００）、ＥＲＢＢ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２１６５、１：１００）、及びｐ−ＥＲＢＢ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２２４３、１：２００）で１時間インキュベートした。ビオチニル化二次抗体を３０分間インキュベートし、続いてＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。ＨＲＰを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従い、３，３−ジアミノベンジデイン中で発達させた。組織切片をヘモトキシリンで対比染色し、脱水して載置した。図９Ａにおいて切断されたカスパーゼ３陽性細胞を定量するために、２０を超えるランダム画像（２０００個超の細胞）を顕微鏡下で撮影し、陽性細胞を手動で数えた。
組織アレイ免疫染色：２つの乳癌組織マイクロアレイを使用し、ＭＴＤＨに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４０−６５００）及びＳＮＤ１（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ００２６３２）で染色した。１つのＴＭＡをＢｉｏｍａｘから入手し（ＢＲ１９２１ａ）、１６０原発腫瘍、５正常組織、及び２７正常隣接組織で構成された。これらの１９２試料から、１５４試料を、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の両方について良好に染色した。第２のＴＭＡをニュージャージー州の癌研究所から入手し（ＣＩＮＪ ＹＭＴＡ＿２０１）、３９９原発腫瘍で構成されていた。これらの３９９試料から、２７０試料を、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の両方について良好に染色した。各試料を、染色強度に従い、負（０）、弱（１）、中（２）、または強（３）として採点した。
免疫沈降及びウェスタンブロット：免疫沈降（ＩＰ）実験のために、培養した細胞を冷たいＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（２０ｍＭ トリス ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｘ−１００、０．００２５Ｍ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ α−グリセロールリン酸塩、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び１ｍＭ ＮａＦ）中に、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＭＳＦと共に溶解した。次に、細胞溶解物を氷上で１０分間インキュベートし、遠心分離して、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１時間、４℃でインキュベートすることによって事前切除した（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）した。ＩＰビーズ調製のために、３０μＬのタンパク質Ａ／Ｇビーズを、５μｇの抗体で２時間、４℃でインキュベートした。ＩＰを終夜４℃で実行し、ビーズを遠心分離し、洗浄した後、ＳＤＳタンパク質負荷緩衝液中で５分間煮沸して、結合されたタンパク質を溶出した。ＩＰ溶解物を、示される抗体と共にウェスタンブロットに供した。
ウェスタンブロットのために、組織／腫瘍をマウスから除去し、液体窒素中で即時冷凍し、続いて乳棒及び乳鉢を用いてＲＩＰＡ緩衝液＋ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤中で均質化した。培養細胞について、溶解緩衝液をプレート上に直接添加することによって溶解物を収集した。ウェスタンブロットゲル調製及び免疫ブロットを、以下の標準手順に従って行った。ＭＴＤＨに対する抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４０−６５００）、ＳＮＤ１（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−２７１５９０）、ＥＲＢＢ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２１６５）、ｐ−ＥＲＢＢ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２２４３）、ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４２６７）、抗Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−４０）、及び抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−７３９２）を、１：１０００で希釈した。
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ及びＦＡＣＳによるＡＬＤＨ陽性集団の分離 ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って、高ＡＬＤＨ酵素活性を有する集団を単離した。手短に言えば、自発性または移植されたＰｙＭＴ腫瘍から新たに切り取られた腫瘍細胞を、ＡＬＤＨ基質を含有するＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ緩衝液（１×１０６細胞当たり１μｍｏｌ／Ｌ ＢＡＡＡを含有する１ｍＬ 緩衝液）中に懸濁し、３７℃で４５分間インキュベートした。細胞の各試料について、基質を添加する直前に、アリコートを５０ｍＭ ＡＬＤＨ阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）で処理した。ＰＩのみ（生存能力について）で染色された細胞、及び負の対照としてＤＥＡＢで処理されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ染色細胞を使用し、選別ゲートを確立した。
ヒト乳癌ＴＭＡ：２つのヒト乳房ＴＭＡを研究に使用して、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１タンパク質レベルの相関を検査した。１つのＴＭＡを、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ（ＢＲ１９２１ａ）から購入し、第２のＴＭＡをニュージャージー州の癌研究所から入手した（ＹＭＴＡ＿２０１）。両方のＴＭＡのセットは、非特定化した腫瘍試料を使用し、プリンストン大学の施設内治験検査委員会及びＲｕｔｇｅｒｓニュージャージー医学校により免除されるものと見なされた。
乳腺上皮細胞の採取及びフローサイトメトリー：乳腺または腫瘍の単一細胞懸濁液を、前述のように調製した（Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎら、２００６）。手短に言えば、組織を切り取り、小片に粉砕して、３００Ｕ／ｍＬ １Ａ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び１００Ｕ／ｍＬ ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で補足された培養培地（５％ ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、５００ｎｇ／ｍＬ ヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬ インスリン、２０ｎｇ／ｍＬ コレラ毒素、及び１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する１：１ ＤＭＥＭ：ＨａｍのＦ−１２培地）中、３７℃で１時間消化させた。４０μｍ ナイロン細胞ストレーナでの濾過及び抗体染色の前に、オルガノイドを、０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡで１．５分間、５ｍｇ／ｍＬ ジスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で５分間、ならびに０．６４％ 塩化アンモニウムで５分間、３７℃で連続的に懸濁した。乳腺上皮細胞を、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、ＣＤ２４、ＣＤ２９、及びＣＤ６１を含有する抗体カクテルで３０分間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ分析または選別の前に２０分間、二次抗体染色した。
限界希釈アッセイ：乳腺再構成アッセイのために、７または８週齢雌マウスの乳腺からのＭＥＣの単一細胞懸濁液を選別し、３週齢のレシピエントマウスの切除された乳房脂肪体に注入した。移植後６〜８週間で増殖物を解析した。腫瘍形成アッセイの場合、原発性ＭＥＣの単一細胞懸濁液を、別途指示されない限り、ＦＶＢ ＷＴレシピエントマウスに移植した。
マンモスフェア／腫瘍様塊アッセイ：単一細胞を超低取り付け板（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）において、塊培地（１：１ ＤＭＥＭ：Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、及び４μｇ／ｍＬ ヘパリンで補足されたＨａｍの１２）と共に平板培養した。平板培養の４〜７日後に塊を数えた。
マイクロアレイ解析：ＲＮＡを、ＣＰＴ（５０μＭ）処理下で示される腫瘍細胞から抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ全マウスゲノム４×４４ｋアレイで解析した。ＲＮＡ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ低ＲＮＡ投入線形増幅キットで標識し、Ｃｙ３標識マウスユニバーサル基準ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と一緒にハイブリダイズした。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＢＡ走査器でアレイを走査し、Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ｖ９．５ソフトウェアで解析した。特徴媒体シグナルを使用してＣｙ５／Ｃｙ３比を計算し、アレイ中央値によって正規化した。２より大きい平均倍率変化及びスチューデントｔ検定のｐ値＜０．０５を有する遺伝子を、ＳＮＤ１調節遺伝子として含めた。
レンチウイルス感染：ノックダウン研究のために、マウスＭｔｄｈ（ＫＤ１、ＴＲＣＮ００００１２５８１６；ＫＤ２、ＴＲＣＮ００００１２５８１８）、マウスＳｎｄ１（ＴＲＣＮ０００００５４７４２）、ヒトＭＴＤＨ（ＫＤ１、ＴＲＣＮ００００１５１４６７；ＫＤ２、ＴＲＣＮ００００３２２８７２；ＫＤ３、ＴＲＣＮ００００３２２９４９）、及びヒトＳＮＤ１（ＫＤ１、ＴＲＣＮ００００２４５１４０；ＫＤ２、ＴＲＣＮ００００２４５１４１；ＫＤ３、ＴＲＣＮ００００２４５１４４）を標的とするｓｈＲＮＡ配列を含むｐＬＫＯプラスミドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。全てのレンチウイルス構成体プラスミドは、標準プロトコルに従い、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞をパッケージング細胞系として使用し、ヘルパープラスミドＶＳＶＧ（エンベロープ）及びｐ８．９１（ｇａｇ−ｐｏｌ、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１）と一緒にウイルスにパッケージングされた。一次細胞は、８μｇ／ｍＬ ポリブレンで補足された濃縮ウイルス含有培地で２時間、１０００ｇ、４℃でスピン感染した後に移植されるか、または感染に続いてプレート内で培養され、実験で使用される前に選別されるかのいずれかである。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析：製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ熱循環器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲを行った。
遺伝子セット強化解析（ＧＳＥＡ）：正規化したマイクロアレイ発現データを、提供されたクラス（すなわち、倍率変化）メトリクスの比を使用して、発現別に順位順序付けした。同じ遺伝子に対する複数のプローブマッチを、１つの値にまとめ、最高プローブ読み取り値を各例で使用した。ＳＮＤ１＿ＣＰＴ＿ＵＰサインは、ＣＰＴ処理下でＳＮＤ１によって２倍より多く（ｐ＜０．０５）特異的に上方調節される５０４遺伝子を含有する。ＳＮＤ１＿ＣＰＴ＿ＵＰサインを、古典的強化統計を使用して、ＧＳＥＡを介して順位順序付けされたリストの強化について試験し、遺伝子セットの１０００ランダム順列からの強化結果と比較してｐ値を得た。原強化スコアを、デフォルトＧＳＥＡパラメータを使用して正規化強化スコアに変換した。強化スコアは、順位付けされた遺伝子リストの累計ピーク（すなわち、強化スコア）の前またはそのピークにある遺伝子セットのメンバーとして定義される。
統計解析：全ての結果は、必要に応じて統計解析に供した。対数順位検定、非パラメトリックマン・ホイットニー検定、カイ二乗検定、及び等分散仮定による不対両側独立スチューデントｔ検定を、図のレジェンドに示されるように、ほとんどの研究に使用した。限界希釈アッセイの場合、ＭａＳＣまたはＴＩＣの頻度及び統計を、Ｌ−ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計算した。ｐ値は、全ての図面において＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１と示される。
受入番号：全ての原マイクロアレイデータファイルは、ＧＥＯデータベースにおいて入手可能である（ＧＳＥ５５５２２）。
結果
Ｍｔｄｈ−ノックアウトマウスは生存可能であり、全体的にＷＴマウスとは区別不可能であった。
Ｍｔｄｈ−ノックアウト（ＫＯ）マウスを生成するために、Ｂａｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓジーントラップデータベースをスクリーニングし、転写の早期終結をもたらす（図１Ａ）Ｍｔｄｈの第２のイントロンへの挿入を含むＥＳＣ株ＸＢ７８０を選択した。胚盤胞へのＸＢ７８０ＥＳ細胞の注入は、キメラマウスを生成し、生殖系伝達の後次確認を伴う。Ｍｔｄｈヘテロ接合性（Ｍｔｄｈ＋／−）マウス間の交雑は、メンデル比において子孫をもたらした。Ｍｔｄｈホモ接合性ＫＯ（Ｍｔｄｈ−／−）胚子は、広範囲に渡るＬａｃＺ活性を示し（図１Ｂ）、多くの胚子臓器内のユビキタスＭｔｄｈ発現を示唆する。成体マウスにおいて、ＭＴＤＨはまた、野生型（ＷＴ、Ｍｔｄｈ＋／＋）及びＭＴＤＨ＋／−マウスの様々な組織内で検出されたが、Ｍｔｄｈ−／−マウスでは検出できず、ジーントラップ型対立遺伝子が、Ｍｔｄｈ発現を完全に排除したことを確認する。Ｍｔｄｈ−／−マウスは生存可能であり、繁殖力があり、最長２年間にわたって監視された場合に明らかな異常を示さなかった。
ＭＴＤＨは、正常乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）内でも検出され、発現レベルは、Ｍｔｄｈ遺伝的ステータスと相関していた（図１Ｃ）。出生後乳腺発達におけるＭＴＤＨ欠乏の影響を評価するために、ＷＴ及びＫＯバージンマウスからの鼠径部乳房脂肪体の全組織標本を検査した。ＷＴ同腹子と比較して、３週齢及び５週齢ＫＯマウスからの乳腺の管増殖物における一時的遅延を除いて、分枝形態形成における有意差は、後の時点において、または妊娠及び授乳中に観察されなかった。したがって、思春期に開始するＷＴ及びＭｔｄｈ−／−マウスにおいて主に相当する乳腺上皮は、Ｍｔｄｈ−／−マウスを使用して乳房腫瘍形成に対するＭＴＤＨの必要性を検査するのを可能にする。
Ｍｔｄｈ ＫＯは、管腔型乳房腫瘍内の腫瘍形成及び転移を阻害する：自所性乳房腫瘍進行中のＭＴＤＨの役割を解明するために、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ及びＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２遺伝子導入モデルを最初に使用し、それらの両方が、管腔型腺癌を発症し、高い肺転移発生率を有する。急速に進行するＭＭＴＶ−ＰｙＭＴモデルにおいて、乳房腫瘍は、早くも４２日齢、及び６３日目までに起こり、Ｍｔｄｈ＋／＋マウスの５０％が腫瘍を発症した（図１Ｄ）。対照的に、Ｍｔｄｈ−／−群では、５０日目に最初の触知可能な腫瘍が検出され、これらのマウスの５０％が、８０日後にのみ腫瘍を発症した。この腫瘍発生の遅延は、ＷＴ対照と比較して、Ｍｔｄｈ−／−マウスにおけるより多くの無腫瘍乳腺によってさらに支持された（図１Ｅ）。一貫して、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／−及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスの総腫瘍量は、それぞれＷＴ対照のそれの５４％及び１０％に低減した（図１Ｆ）。さらに、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスは、著しく少なく（図１Ｇ）小さい（ｐ＜０．０５）転移性小結節を有していた。
腫瘍形成の差は、ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２モデルにおいてさらにより顕著であり、腫瘍形成が長期潜伏後に起こる。ほぼ全てのＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋マウスが３００日齢までに腫瘍を発達させたが、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−マウスの６０％超が、腫瘍を有していなかった（図１Ｈ及び１Ｉ）。最長１８ヶ月にわたって監視した場合でも、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−マウス（ｎ＝６８）の３０％が、依然として完全に無腫瘍のままであったが、全てのＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋マウス（ｎ＝６１）は、死亡していたか、または安楽死の罹患基準に達していた（ｐ＜０．０００１）。肺転移もまた、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−マウスにおいて激しく障害された（図１Ｊ及び１Ｋ）。
ＰｙＭＴ及びＥｒｂＢ２の発現が、ＷＴ及びＫＯの乳腺または腫瘍間で同等であったため、乳房腫瘍形成の差は、発癌遺伝子の分化誘導に起因していなかった。加えて、そのホスホリル化によって示されるように、ＥｒｂＢ２の活性化は影響されなかった。さらに、ＭＴＤＨタンパク質レベルは、同年齢の正常対照と比較して、ＰｙＭＴ及びＥｒｂＢ２駆動腫瘍において上昇し、高レベルのＭＴＤＨが、腫瘍形成中にＭＥＣに成長優位性を付与し得ることを示唆する。
Ｍｔｄｈ ＫＯは、基底様及び混合亜型の乳房腫瘍の形成を制限する：腫瘍形成におけるＭＴＤＨの調査は、乳房幹細胞（ＭａＳＣ）様遺伝子発現プロファイルを呈し、基底亜型のヒト乳癌に類似する腫瘍を発達させるＭＭＴＶ−Ｗｎｔモデルにまで拡張された（Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚら、２００７）。事実上全てのＷｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／＋マウスが、３００日齢において癌で死亡したが、Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／−マウスの３５％及びＷｎｔ；Ｍｔｄｈ−／−マウスの６２％において腫瘍は検出されなかった（図１Ｌ）。腫瘍の多様性もまた、Ｍｔｄｈの遺伝子投薬量に高度に依存していた（図１Ｍ）。これらの表現型は、管腔型腫瘍モデルにおいて観察したものと明らかに類似していた。我々の解析を広げるために、メドロキシプロゲステロン酢酸塩（ＭＰＡ）及び７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）（図１Ｎ）の複合治療を使用して乳房発癌を誘導し、腺癌、腺扁平上皮癌、及び腺筋上皮腫癌の組織学的特徴を有する乳房腫瘍の形成をもたらした（Ｙｉｎら、２００５）。再度、Ｍｔｄｈ−／−雌は、ＭＰＡ／ＤＭＢＡ治療後に明らかに減衰した腫瘍感受性を示した（図１Ｎ及び１Ｏ）。
Ｍｔｄｈ ＫＯは、発癌遺伝子誘発性基底型及び管腔型ＴＩＣの増殖及び活性を障害する：乳房腫瘍形成に対するＭｔｄｈ欠失の劇的効果は、腫瘍形成中の早期事象の調査を促した。この目標を達成するために、前新生物期における異なる腫瘍モデルからの乳腺の全組織標本（図２Ａ、上パネル）及びヘマトキシリン／エオシン染色された切片（図２Ａ、下パネル）を検査した。ＰｙＭＴ及びＷｎｔ両方の発癌遺伝子が、Ｍｔｄｈ＋／＋マウスにおいて、早くも４週間で広範囲にわたる過形成を誘導したが、Ｍｔｄｈ−／−腺は、正常管構造と入り混じった著しく少なく小さい過形成巣を呈した。ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２マウスは、最長の腫瘍潜伏を有し、これは、著しく遅く、最低重症度の過形成に対応する。６ヶ月齢無腫瘍ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２雌からの乳腺の全組織標本解析は、Ｍｔｄｈ陽性マウスにおいて１００％に近い過形成の発生率を明らかにしたが、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−からのものの２０％のみが軽度に過形成であった（図３Ａ及び３Ｂ）。
Ｍｔｄｈ−／−腺におけるこれらの激しく障害された前新生物性変化は、形質転換されたＭＥＣの増殖の欠陥を示唆し得る。乳腺の細胞構成の発癌遺伝子誘発性変化を検査するために、前新生物性乳腺を、ＣＤ２４、ＣＤ２９（β１インテグリン）及びＣＤ６１（β３インテグリン）を使用してプロファイルし、これらは、管腔型及び基底型乳腺上皮サブセットを解明するために以前から使用されてきた（Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｌａｂａｔら、２００７；Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎら、２００６）。正常な腺と比較して、ＰｙＭＴ前新生物性組織は、Ｌｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔型サブセット（ＣＤ２４＋ＣＤ２９低）の劇的な増殖を示し（図２Ｂ及び２Ｃ）、以前の報告の「管腔様」遺伝子発現プロファイルと一致する（Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚら、２００７）。対照的に、ＭａＳＣが豊富なＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＤ２９高（ＣＤ２４＋ＣＤ２９ｈｉ）基底型集団の割合は、先述されるように（Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎら、２００６）、Ｗｎｔ乳腺からの前新生物性組織において顕著に増加し（図２Ｂ及び２Ｄ）、この集団がこのモデルにおける形質転換のための主要な細胞標的を表すことを示唆する。興味深いことに、上皮階層のこれらの発癌遺伝子特異的攪乱は、（１）ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−におけるＣＤ２４＋ＣＤ２９低管腔サブセット増殖の欠失（図２Ｂ及び２Ｃ）、（２）ＷＴ対応物と比較して、Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ−／−腺におけるＣＤ２４＋ＣＤ２９ｈｉ基底サブセットの増殖の著しい減少（図２Ｂ及び２Ｄ）によって証明されるように、Ｍｔｄｈ喪失によって損なわれた。Ｍｔｄｈ＋／＋マウスにおけるＰｙＭＴまたはＷｎｔ誘発性過形成腺は、正常な腺と比較して、ＣＤ６１＋集団の選択的増殖を呈しなかったことは、記録するに値する（図３Ｃ及び３Ｄ、橙色のバーを比較する）。しかしながら、ＣＤ６１−細胞（図３Ｅ）よりもマンモスフェアを形成することができるＣＤ６１＋細胞の割合は、Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ＋／＋腺と比較して、Ｗｎｔ；Ｍｔｄｈ−／−腺において著しく減少した（図３Ｃ及び３Ｄ、ＷＴ対ＫＯを比較する）。
Ｍｔｄｈ−／−前新生物性腺が、実際により少ないＴＩＣを含むかどうかを試験するために、原発性ＭＥＣ（ｐＭＥＣ）を、Ｍｔｄｈ＋／＋及びＭｔｄｈ−／−前新生物性腺から解離し、生体外マンモスフェア形成アッセイを行った。Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣは、複数の腫瘍モデルにわたって減少した数の塊を形成した（図２Ｅ）。さらに、ＷＴレシピエントマウスに同所移植された場合、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣは、一連の希釈数を試験した場合の低減した腫瘍発生率によって明らかになるように、生体内で実質的に少ない腫瘍再増殖細胞を含んでいた（図２Ｆ）。
次に、ＰｙＭＴ誘発性ＴＩＣが増殖した管腔型集団内に存在するかどうかを解析した。ＰｙＭＴマウスの前新生物性腺から選別された管腔型及び基底型ｐＭＥＣを生体内移植した。基底細胞ではなく、管腔細胞を受けたマウスにおいて、腫瘍が高頻度で検出され（図２Ｇ）、ＰｙＭＴ誘発性前新生物性ＴＩＣが、ＭＥＣの管腔型サブセットと同時精製されたことを示唆する。重要なことに、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋及びＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−雌からの管腔細胞の腫瘍形成能を生体内で検査した場合、腫瘍発生率（図２Ｈ）及び体積（図２Ｉ）は、Ｍｔｄｈ−／−細胞が移植されたマウスにおいて実質的に減少した。これらの結果は、管腔細胞の増殖だけでなく、腫瘍形成能もまた、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスにおいて激しく損なわれたことを示唆する。
ＭＥＣの管腔型または基底型サブセットの選択的増殖は、以前の報告に従い、正常対照と比較して、ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２前新生物性腺内で検出されなかった（Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎら、２００６）。ＭＥＣのどのサブセットがＴＩＣとして機能するかを特定するために、管腔型及び基底型ＭＥＣをＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋過形成腺から選別し、これらの細胞を同所移植した。管腔型または基底型ＭＥＣのいずれかを受けたマウスの１００％において明らかな腫瘍が検出された（図３Ｆ及び３Ｇ）。細胞起源に関わらず、全ての腫瘍が、組織学においてＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２マウスからの自発性腫瘍と酷似していた（図３Ｈ）。これらの結果は、ＭＭＴＶ−ＥｒｂＢ２腫瘍が、管腔区画及び基底区画の両方を起源とし得ること、及び基底細胞が管腔型の腫瘍を生じ得ることを示唆し、この所見は、最近の報告によって支持される（Ｚｈａｎｇら、２０１３ａ）。ＭＴＤＨに依存する細胞標的を特定するために、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−雌からの管腔型及び基底型サブセットを生体内移植した。驚くべきことに、ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋を受ける全てのマウスが大きな腫瘍を発達させていたとき、管腔型または基底型ＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ−／−細胞のいずれも、明らかな腫瘍を生じなかった（図３Ｆ及び３Ｇ）。これらの結果は、ＭＴＤＨが、ＥｒｂＢ２誘発性基底型及び管腔型ＴＩＣを維持するために重要であることを示す。
早期腫瘍形成においてＴＩＣを調節することにおけるその重要な役割とは対照的に、ＭＴＤＨは主に、ＷＴ及びＫＯマウスからの未分画Ｌｉｎ−ＭＥＣ（図３Ｊ）またはＭａＳＣが豊富な基底細胞（図３Ｋ及び３Ｌ）のいずれかと同様の生体内乳腺再構成（図３Ｉ）の効率によって示されるように、成体ＭａＳＣ活性に必要ではない。
乳房腫瘍開始能を促進することにおけるＭＴＤＨのＭＥＣ本来の役割：ＭＴＤＨは、マウスにおいて広く発現するため、生物全体ＫＯマウスにおける腫瘍形成の欠陥は、ＭＥＣまたは他の細胞／組織型のいずれかにおけるＭＴＤＨの喪失から生じ得る。これら２つの可能性を区別するために、マウスＭＴＤＨを、Ｍｔｄｈ−／−マウスのＭＥＣに生体内で特異的に再導入し、これが腫瘍形成の欠陥を機能回復するかどうかを試験した。この目的を達成するために、ＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈ遺伝子導入マウス系を創出し（図４Ａ、５Ａ、及び５Ｂ）、Ｍｔｄｈ導入遺伝子の発現を乳腺、及びそれ程ではないが唾液腺内で特異的に観察した（図５Ｃ）。次に、これらのＭＭＴＶ−Ｍｔｄｈマウスを、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスと交雑して、外因性Ｍｔｄｈ導入遺伝子を有する、または有しないＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスを生成した（図４Ａ）。注目すべきことに、導入遺伝子（Ｔｇ）−により機能回復されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍は、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍のそれと同様レベルのＭＴＤＨを発現した（図４Ｂ）。ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスと比較して、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＋Ｔｇ前新生物性腺からの管腔細胞の増殖のほぼ２倍の増加が観察された（図４Ｃ）。加えて、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＋Ｔｇ群において、腫瘍発症は加速され（図４Ｄ）、腫瘍量（図４Ｅ及び４Ｆ）は増加した。Ｍｔｄｈ導入遺伝子の存在は、結果として得られる腫瘍の組織学を変えなかった（図５Ｄ）。これらの結果は、標的細胞増殖及び後次の乳房腫瘍形成を生体内で促進することにおけるＭＴＤＨの腫瘍本来の役割を強く支持するが、腫瘍ストローマの寄与を無視することはできない。
我々の自発性腫瘍モデル研究を補完するために、次に、ＭＴＤＨの急性操作もまた、前新生物性ＭＥＣの腫瘍形成能に影響するかどうかを調査した。ＭＴＤＨを、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋（図４Ｇ）及びＥｒｂＢ２；Ｍｔｄｈ＋／＋（図５Ｅ）雌の前新生物性腺から新たに解離されたｐＭＥＣ中でノックダウンした。ＭＴＤＨノックダウン（ＫＤ）細胞の塊形成能は、両方のモデルの複数の独立した試料において著しく低減した（図４Ｇ及び５Ｅ）。ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣの生体内腫瘍形成もまた、ＭＴＤＨ ＫＤによって激しく障害された（図４Ｈ）。逆に、ＭＴＤＨが、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣ内で、レンチウイルス形質導入を介して、ＷＴ対応物に相当するレベルまで回復した場合、生体外塊及び生体内腫瘍形成の両方が著しく増強された（図４Ｉ、４Ｊ、及び図５Ｆ〜５Ｈ）。
次に、確立されたＭＴＤＨ陽性腫瘍からのＴＩＣが、それらの機能性についてＭＴＤＨに依存するかどうかを解析した（図４Ｋ）。ＰｙＭＴ、Ｗｎｔ、及びＥｒｂＢ２駆動腫瘍からの確立された腫瘍が、ＣＤ２４及びＣＤ２９でプロファイルされた場合、１つの比較的均質な集団を示したという事実は（Ｖａｉｌｌａｎｔら、２００８）、確立された腫瘍からＴＩＣを特定するために、他のマーカーの必要性を強調する。増加したアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性は、乳癌を含む複数の癌型において、癌幹様集団内で見出されたが（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒら、２００７）、マウスモデルにおけるそのＴＩＣマーカーとしての使用は、あまり特徴付けられていないままである。ＡＬＤＨ＋及びＡＬＤＨ−細胞を、ＰｙＭＴ腫瘍から選別し（図５Ｉ）、ＡＬＤＨ＋細胞が、ＡＬＤＨ−細胞と比較して、著しく高い生体外塊形成（図４Ｌ）及び生体内腫瘍開始活性（図５Ｊ）を呈したことを見出した。ＴＩＣ特徴を有するＡＬＤＨ＋集団と一致して、この集団によって生成された腫瘍は、初期腫瘍の表現型異質性を要約し、同様の比率のＡＬＤＨ＋及びＡＬＤＨ−細胞を有する。これは、ＡＬＤＨ＋腫瘍細胞が、自己再生することができると共に、ＡＬＤＨ−細胞に分化できることを示す。ＭＴＤＨが、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍から新たに単離されたＡＬＤＨ＋細胞内でノックダウンされた場合、塊形成活性は、著しく低減された（図４Ｍ）。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍の場合、ＣＤ６１＋集団は、ＴＩＣ特徴を有することが明示され、高度に腫瘍形成性であった（Ｖａｉｌｌａｎｔら、２００８）。一貫して、ＣＤ６１＋腫瘍細胞は、ＣＤ６１−細胞よりも多くの腫瘍塊を生成することができた（図４Ｎ）。重要なことに、ＭＴＤＨ ＫＤは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍からのＣＤ６１＋細胞内で塊形成活性を損なった（図４Ｏ）。これらの結果は、ＭＴＤＨが、ＭＴＤＨ−陽性腫瘍内のＴＩＣの全機能性に連続的に必要とされることを示唆する。
ＭＴＤＨの腫瘍形成促進的役割は、その相互作用パートナーＳＮＤ１を必要とする：ＳＮＤ１は、ヒト乳癌細胞におけるＭＴＤＨの主要な結合パートナーとして以前に特定され、ＭＴＤＨと同様の転移促進機能を有していた（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）。この研究において、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用は、ヒト及びマウス乳癌細胞において十分に保存されたことが見出された。
腫瘍開始におけるＭＴＤＨの機能に対するＳＮＤ１の必要性を試験するために、ＳＮＤ１を最初に、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞内でノックダウンしたところ、これらの細胞内でマウスＭＴＤＨの発現を機能回復することが示された（図６Ａ）。ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞内のＭＴＤＨの再導入は、生体外塊形成（図４Ｂ）及び生体内腫瘍形成（図６Ｃ）を一貫して促進したが、ＭＴＤＨのこの効果は、ＳＮＤ１ ＫＤ時に完全に排除された（図６Ｂ及び６Ｃ）。ＭＴＤＨが、その腫瘍形成促進機能のために実際にＳＮＤ１を必要とする場合、Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞内のＳＮＤ１のノックダウンは、乳房腫瘍形成に対するＭＴＤＨ欠乏の効果を表現型模写することが予想された。実際に、Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞内のＳＮＤ１ ＫＤは、生体外塊形成活性（図６Ｄ）及び生体内腫瘍開始（図６Ｅ及び６Ｆ）を障害し、腫瘍開始活性に対するＭＴＤＨ切除の効果に類似する。これらの結果は一緒に、ＴＩＣに対するＭＴＤＨの機能が、ＳＮＤ１の存在を必要とすることを示す。
ＳＮＤ１との物理的相互作用がＭＴＤＨの機能に重要であるかどうかをさらに試験するために、タンパク質の相互作用に関する詳細な解析を行った。ＳＮＤ１は、４つのＮ末端ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）の繰り返し、及びＣ末端Ｔｕｄｏｒ−ＳＮハイブリッドドメインを含有する。第２のＳＮドメイン（ＳＮＤ１ΔＣ、１〜３３９）に続くＣ末端配列を欠くＳＮＤ１構成体は、ＭＴＤＨ断片１〜２８９とではなく、ＭＴＤＨ断片３６４〜５８２と化学量論的に結合し（図７Ａ及び７Ｂ）、全長ＳＮＤ１の結合挙動に類似する（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）。これは、ＳＮＤ１ΔＣ断片を以降の生体外結合研究に使用することを可能にした。ＭＴＤＨの最小ＳＮＤ１結合ドメインをマップするために、領域３６４〜５８２内のＭＴＤＨの一連の断片を生成し（図７Ａ）、それらのＳＮＤ１ΔＣとの相互作用を試験した。これは、ＳＮＤ１結合に十分な２２アミノ酸断片（残基３８６〜４０７）の特定につながり（図７Ａ及び７Ｂ）、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の結晶構造によってさらに確認された（実施例３を参照されたい）。
相互作用に必須のＭＴＤＨの主要な残基を判定するために、３つの三重点突然変異体（ＴＰＭと称される）を設計し、各々がＭＴＤＨ（配列番号１のアミノ酸３６４〜５８２）断片の２２−ａａ最小結合ドメイン内に３つのアミノ酸突然変異を内包する（図７Ａ）。ＴＰＭ１は、突然変異Ｄ３８９Ｒ、Ｄ３９３Ｒ、及びＷ３９４Ｄを含む。ＴＰＭ２は、突然変異Ｅ３９９Ｒ、Ｅ４００Ｒ、及びＷ４０１Ｄを含む。ＴＰＭ３は、突然変異Ｗ４０４Ｄ、Ｄ４０６Ｒ、及びＥ４０７Ｒを含む。生体外結合アッセイは、ＴＰＭ１及びＴＰＭ２の両方がＳＮＤ１ΔＣに結合できなかったが、ＴＰＭ３は、ＷＴ ＭＴＤＨのように有効にＳＮＤ１ΔＣに結合したことを示した（図７Ｃ）。これらの突然変異はまた、表３に記載される。
ＴＰＭ１及びＴＰＭ２がＳＮＤ１と生体内で相互作用するかどうかを検査するために、全長ＨＡタグ付きＳＮＤ１及びＭｙｃタグ付きＭＴＤＨを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で異所的に発現させ、細胞溶解物を抗Ｍｙｃ免疫沈降に供した。生体外結合アッセイからの所見と一致して（図７Ｃ）、ＨＡ−ＳＮＤ１は、ＴＰＭ１またはＴＰＭ２ ＭＴＤＨではなくＷＴでプロダウンされた（図７Ｄ）。全９個の個別の突然変異を、同様の戦略を使用してさらに解析したところ、Ｗ３９４Ｄは完全に、Ｗ４０１Ｄは部分的に結合を排除したが、他の突然変異は個別に相互作用に影響しなかったことが見出された（図７Ｅ）。ＳＮＤ１結合欠乏ＴＰＭ１及びＴＰＭ２ ＭＴＤＨが、ＭＴＤＨの別の既知の結合パートナーであるＡＧＯ２（図７Ｄ）と依然として相互作用できることが指摘され（Ｙｏｏら、２０１１）、これらの突然変異が、ＭＴＤＨ内で全体の立体配座的変化を引き起こす可能性は低いが、むしろＳＮＤ１との相互作用を選択的に妨害することを示唆する。
これらの突然変異が、腫瘍形成におけるＭＴＤＨの機能に影響を及ぼすかどうかを試験した。マウス形態のＷＴ ＭＴＤＨ、ＴＰＭ１、またはＴＰＭ２は、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞内で安定して発現し、これらのＭＴＤＨ突然変異体が、ＳＮＤ１と相互作用する能力を喪失したことが見出された（図８Ａ）。機能的に、ＷＴ ＭＴＤＨは、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−細胞の生体外塊形成活性、及び生体内腫瘍開始を増加させることができたが、ＴＰＭ１またはＴＰＭ２突然変異体は増加させることができなかった（図８Ｂ〜８Ｄ）。Ｗ３９１Ｄ突然変異体（ヒトＭＴＤＨにおけるＷ３９４Ｄに対応する）を試験したとき、同様の結果が観察された（図８Ｅ〜８Ｈ）。これらの結果は、ＭＴＤＨの、ＳＮＤ１との結合残基が、ヒト及びマウス内で高度に保存され、ＳＮＤ１との相互作用が、ＴＩＣ活性を調節することにおけるＭＴＤＨの機能性を媒介するために重要であることを強く示唆する。
ＳＮＤ１のＭＴＤＨ媒介性安定化は、ＭＥＣにストレス条件下での生存優位性を付与する：ＳＮＤ１は、様々なストレス条件下での生存因子として報告された（Ｇａｏら、２０１０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００９；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＳｃａｄｄｅｎ、２０１２）。乳腺の正常な生理学ではなく腫瘍開始におけるＭＴＤＨのより顕著な役割は、ＭＴＤＨが、そのＳＮＤ１との相互作用を通じて、腫瘍形成中にストレス条件下でＭＥＣに優位性を付与するという仮説につながった。この仮説を支持するように、本明細書において、前新生物性ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−乳腺上皮において、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋対応物よりも著しく高い割合のアポトーシス細胞が検出され、これはＰｙＭＴ無しの腺では見られなかった（図９Ａ）。生体外でストレス条件下のＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の役割を試験するために、ＷＴまたは突然変異体マウスＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣを、カンプトテシン（ＣＰＴ）で処理し、腫瘍発達中の一般的なストレス型である（Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓら、２００８）、ＤＮＡ複製ストレスを誘発した（図９Ｂ）。ＣＰＴ処理は、投薬量依存的にＭＥＣのアポトーシスを誘発した（図９Ｂ）。対照と比較して著しく減少した割合のアポトーシス細胞がＭＴＤＨ機能回復群内に存在し、ＳＮＤ１結合欠乏性突然変異は、ＭＴＤＨのこの生存促進効果を排除した（図９Ｂ）。
ＳＮＤ１レベルが、ストレス条件下での細胞生存に重要であるという以前の観察と一致して、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ＭＥＣ内のＳＮＤ１のサイレンシングは、ＣＰＴ処理時のアポトーシスの著しい増加につながった（図９Ｃ）。興味深いことに、ＳＮＤ１タンパク質レベルの薬物投薬量依存的減少は、ＣＰＴで処理されたＭＥＣ内で観察された（図９Ｄ）。熱ショック処理もまた、ＳＮＤ１の急速な減少をもたらしたため、この現象は、このストレス型に固有ではなかった。注目すべきことに、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣ内のＭＴＤＨのサイレンシングは、ＳＮＤ１タンパク質の減少を加速させた（図９Ｄ）。逆に、ＳＮＤ１結合欠乏性ＭＴＤＨではなく、ＷＴの回復は、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ＭＥＣにおいて、これらのストレス条件下でＳＮＤ１タンパク質を安定させた（図９Ｅ）。したがって、これらのデータは、ＭＴＤＨが、生存因子ＳＮＤ１と相互作用し、安定させることによって、ストレス条件下で生存を促進することを集合的に示唆する。
ＳＮＤ１がどのようにその生存促進機能を発揮するかに関するより良い理解を提供するために、トランスクリプトームプロファイリングを、対照対ＣＰＴ処理下のＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ＋／＋ ｐＭＥＣに関して行った（図９Ｆ〜９Ｈ）。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析は、ＳＮＤ１によって上方調節された遺伝子（図９Ｆ、＞２倍率変化、ｐ＜０．０５）が、「細胞死及び生存」、「細胞周期」、及び「ＤＮＡ修復」（図９Ｇ）、ＣＰＴ誘発性複製ストレスに関連する過程を含む、分子機能及び細胞機能の著しい強化を示した。興味深いことに、ＳＮＤ１により上方調節された遺伝子の大部分が、「細胞死及び生存」カテゴリーに関与し、これらの遺伝子の発現は、集合的に細胞生存機能を著しく活性化し（図９Ｈ、上６列）、細胞死及びアポトーシスを損なうことが予想された（図９Ｈ、下２列）。したがって、ＳＮＤ１が生存促進遺伝子を全体的に活性化する能力は、ストレス誘発性細胞死から細胞を保護することにおけるその役割の根底にあり得る（図９Ｃ）。ＭＴＤＨが、ＳＮＤ１と相互作用し、安定させることによって生存を調節するという仮説を実証するために、ＷＴまたはＳＮＤ１結合欠乏性突然変異体マウスＭＴＤＨ（Ｗ３９１Ｄ）で再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣをプロファイルした。遺伝子セット強化解析（ＧＳＥＡ）は、ＳＮＤ１上方調節された遺伝子サインが、ＷＴ対突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／− ｐＭＥＣにおいて著しく強化されたことを明示した（図９Ｉ）。
ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１は、ヒト乳癌細胞の腫瘍開始活性に重要である：ヒト乳癌の腫瘍開始活性におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１両方の重要な役割を明示するために、ＭＴＤＨまたはＳＮＤ１を、（１）ＨＥＲ２／Ｎｅｕ形質転換ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＬＥ−Ｎ）（Ｍａｎｉら、２００８）（図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、及び１１Ｂ）、（２）ヒト患者由来の一次異種移植片（ＤｅＲｏｓｅら、２０１１；Ｚｈａｎｇら、２０１３ｂ）（図１０Ｃ、１０Ｄ、１１Ｃ、及び１１Ｄ）、及び（３）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞系（図１０Ｅ〜１０Ｈ）を含む複数のヒト乳癌モデルにおいてサイレンシングした。ＭＴＤＨまたはＳＮＤ１のいずれかのノックダウンは、試験した全モデルの生体外腫瘍様塊形成及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生体内腫瘍開始を著しく低減した。
ＳＮＤ１のＭＴＤＨ媒介性安定化が、ヒト乳癌試料において発生するかどうかをさらに検査した。ヒト乳癌組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、抗体の特異性を確認した後（図１１Ｅ及び１１Ｆ）、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１に対して抗体で染色した（図１０Ｉ〜１０Ｊ）。ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の染色スコア間の正の相関（図１０Ｉ及び１０Ｊ）が見出され、これは独立したＴＭＡを使用して確認された（図１１Ｇ及び１１Ｈ）。ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１が、ｍＲＮＡレベルで相関しなかったことは注目に値する（図１１Ｉ）。これらのデータは、乳癌のＳＮＤ１の転写後調節におけるＭＴＤＨの主要な役割を支持し、ＭＴＤＨが、腫瘍形成中にストレス条件下でＳＮＤ１と相互作用し、安定させるという我々の見出と一致する。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の臨床的重要性をさらに検証するために、ＮＫＩ２９５ヒト乳癌マイクロアレイデータセット（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら、２００２）を解析した。ＳＮＤ１及びＭＴＤＨ両方の中央値発現に基づいて、患者を４つの異なる群に階層化した。高ｍＲＮＡレベルのＭＴＤＨ及びＳＮＤ１両方を有する原発腫瘍は、著しく大きく（図１１Ｊ）、低分化であり（図１１Ｋ）、より短い無遠隔転移生存率と相関し（図１１Ｌ）、腫瘍発達、転移、及び再発におけるヒト乳癌のＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の機能連携を支持する。種々の乳房腫瘍モデルにおけるその腫瘍促進機能と一致して、より高レベルのＭＴＤＨが、ＫＭ−プロッターデータセット内の複数乳癌亜型にわたって予後不良を予測したことも見出された（図１１Ｍ）。理論に拘束されないが、管腔Ａ亜型におけるＭＴＤＨの、より強そうに見える予知能力は、他の亜型と比較して、この群の著しく大きい試料サイズに起因する可能性があると思われる。
論考
腫瘍進行の古典的クローン進化理論は、転移能が原発腫瘍内の希少細胞において起こるランダム遺伝的変化によって与えられると仮定するが、ゲノム研究及び臨床研究は、転移する可能性が、大量の原発腫瘍をプロファイリングすることによって予想され得ることを逆説的に明示する（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら、２００２）。これは、転移能が、追加の転移促進機能を有する発癌事象によって付与され得（Ｂｅｒｎａｒｄｓ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、２００２）、したがって、これらの遺伝的変化が、腫瘍進化の早期に起こり、選択され得ることを示唆する（Ｖａｎｈａｒａｎｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ，２０１３）。この見解を支持するものとして、いくつかの転移促進遺伝子が、異種移植モデルにおいて原発腫瘍成長を促進することが示された（Ｖａｎｈａｒａｎｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２０１３；Ｗａｎら、２０１３）。ヒト原発乳腺腫瘍におけるＭＴＤＨの再発増幅／過剰発現は、したがって、乳癌転移を促進することにおけるその報告された役割に加えて、ＭＴＤＨが腫瘍形成に関係があるとし得る。ヒトまたはマウス乳癌細胞系を使用する以前の研究は、異種移植モデルにおける原発腫瘍形成に対するＭＴＤＨのいかなる効果も明らかにすることができなかったが（Ｂｒｏｗｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００４；Ｈｕら、２００９）、現行研究において使用される遺伝子操作されたマウスモデルは、腫瘍形成の早期において腫瘍開始細胞の増殖及び活性を調節することにおけるＭＴＤＨの役割を解明するのを可能にし、したがって原発腫瘍開始と転移特性の取得との間の別の分子結合を確立する。腫瘍開始に対するＭＴＤＨのこの効果は、多数の高攻撃後期腫瘍細胞が以前の異種移植研究において使用されたときに隠された可能性がある。この推測と一致して、後期ＰｙＭＴ腫瘍細胞が大量に移植された場合、Ｍｔｄｈ ＷＴ細胞とＫＯ細胞との間の腫瘍開始に差は観察されなかった。それにも関わらず、ＭＴＤＨ陽性確立乳房腫瘍からのＴＩＣ、例えば、それぞれＰｙＭＴ及びＷｎｔ誘発性腫瘍からのＡＬＤＨ＋細胞及びＣＤ６１＋細胞は、ＭＴＤＨ阻害に対して敏感なままであり、ＭＴＤＨ依存的機序が、確立腫瘍内でＴＩＣの最適機能性を維持する役割を果たし、したがって、ＭＴＤＨ及びその調節経路を遮断することは、ＭＴＤＨの異常発現を有する癌患者にとって有益であることを示唆する。
遺伝病的変を開始することは、ヒト及び遺伝子導入動物の両方からの乳房腫瘍の組織病理及び分子特徴に対して著しい影響を及ぼすことが示唆された。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達は、ＰｙＭＴ及びＥｒｂＢ２と比較して、より原始的な前駆細胞に類似する特徴を有する乳房腫瘍を誘発する（Ｌｉら、２００３）。注目すべきことに、ＭＴＤＨが、これらの異なる腫瘍モデルにわたって、ＴＩＣの機能性に必要であることが本明細書において発見された。一貫して、ＭＴＤＨ発現は、ヒト乳癌の特異的亜型と著しく相関せず（Ｈｕら、２００９）、より高レベルのＭＴＤＨは、異なる亜型にわたって予後不良を予測する。これらの結果は一緒に、ＭＴＤＨが、管腔型腫瘍生存因子ＰＤＥＦなどの系統特異的腫瘍促進遺伝子とは対照的に、発癌遺伝子及び系統から独立して腫瘍開始を促進するという考えを確証する（Ｂｕｃｈｗａｌｔｅｒら、２０１３）。腫瘍形成におけるＭＴＤＨの広範な機能はまた、広範囲の癌型におけるその頻繁な上方調節と一致する（Ｅｍｄａｄら、２０１３；Ｗａｎ及びＫａｎｇ、２０１３）。
ＭＴＤＨの不在下で形成された腫瘍は、ＭＴＤＨ陽性腫瘍と同様の組織学的特徴を呈し、ＭＴＤＨが、ＴＩＣの細胞起源または細胞運命を変化させないが、代わりにそれらの腫瘍形成能に影響を及ぼし得ることを示唆する。これは、ＭＴＤＨ ＫＯがＭａＳＣの活性にほとんど影響しないという観察と一緒に、ＭＴＤＨを、正常例及び悪性例の両方において、分化細胞とより原始的な幹／前駆細胞との間の変換を媒介するそれらの能力によって腫瘍形成を調節する、Ｗｎｔシグナル伝達（Ｌｅｎｔｏら、２０１３）、Ｓｌｕｇ／Ｓｏｘ９（Ｇｕｏら、２０１２）、及びＧＡＴＡ３（Ｋｏｕｒｏｓ−Ｍｅｈｒら、２００８）などの他の細胞運命調節因子とは異なるＴＩＣの重要な調節因子として確立する。
本発明者及び他は、ＳＮＤ１をＭＴＤＨの主要な結合パートナーとして特定した（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１；Ｍｅｎｇら、２０１２；Ｙｏｏら、２０１１）。しかしながら、ＭＴＤＨの２つの非重複領域、つまりアミノ酸３６４〜４７０（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）及び１０１〜２０５（Ｙｏｏら、２０１１）が各々、ＳＮＤ１とのＭＴＤＨの相互作用を媒介する唯一の必須ドメインとして独立してマップされたため、ＳＮＤ１とのＭＴＤＨの結合ドメインに関する矛盾が存在した。我々の現行研究は、相互作用に十分なＭＴＤＨの最小断片（３８６〜４０７）をさらに判定し、相互作用に重要なこの断片内の２つの主要な残基を特定する。これらの所見は、ＳＮＤ１との相互作用が、ＭＴＤＨの機能の中枢であるという現行の明示を可能にした。これらの所見はまた、ＳＮＤ１を、乳房ＴＩＣの重要な調節因子として確立する。重要なことに、ＭＴＤＨとＳＮＤ１、ならびに結合残基との間の相互作用は、ヒト及びマウス間で十分に保存され、マウスモデルにおける我々の所見が、現行の機能解析及び臨床解析によって示唆されるように、ヒト癌と高度に関連し得ることを強調する。
腫瘍形成は、発癌遺伝子誘発性ＤＮＡ複製／損傷ストレスを含む、腫瘍細胞が克服する必要がある種々のストレスを伴う。本明細書において、ＳＮＤ１が、ストレス条件下での細胞内の生存促進遺伝子の群の発現に必要であり、ＳＮＤ１のサイレンシングが、形質転換されたＭＥＣを複製ストレス誘発性アポトーシスに感作することが明示された。これらの結果は、様々なストレス条件下で生存促進性タンパク質としてＳＮＤ１を確立した以前の報告と一致する（Ｇａｏら、２０１０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００９；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＳｃａｄｄｅｎ、２０１２）。さらに、ＭＴＤＨとの物理的相互作用は、ストレス条件下でＳＮＤ１を分解から保護し、ＳＮＤ１調節された遺伝子サインを維持するために必須である。したがって、ＭＴＤＨが、腫瘍形成中にストレス条件下で、ＳＮＤ１と相互作用し、安定させるその能力によって、少なくとも部分的にＴＩＣを消耗から保護することが可能である。ＳＮＤ１がどのように下流の生存促進性遺伝子を調節するかは依然として明らかでない。ＳＮＤ１は、転写制御、ｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡストレス顆粒形成、及びＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）機構を含む、いくつかの遺伝子調節過程に関与することが報告された多機能性タンパク質である（Ｗａｎ及びＫａｎｇ、２０１３において検討される）。今後の研究は、ＳＮＤ１が、細胞生存を促進するためのストレス条件に応答して、どのように遺伝子発現を調節するかを調査することが保証される。
腫瘍開始と転移能との間の分子結合を提供することに加えて、我々の所見は、いくつかの潜在的翻訳適用を示唆する。最初に、患者由来の腫瘍移植片において検証されたＴＩＣ機能を持続することにおけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の機能的重要性は、これらのタンパク質を癌治療における潜在的治療標的として確立し得る。加えて、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用に関する結果は、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の相互作用を妨害し得る小分子阻害剤のスクリーニングまたは設計を容易にし得る。我々の結果はまた、ＭＴＤＨの腫瘍特異的要件を強調し、Ｍｔｄｈの生物全体ノックアウトがマウスにおいて著しい欠陥を引き起こさないため、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１モジュールの体系的標的は、癌患者によって十分に耐えられ得ることを示唆する。
実施例２−前立腺癌におけるＭＴＤＨの調査
前立腺癌におけるＭＴＤＨの効果を調査するために、ＭＴＤＨノックアウトマウスを、マウス前立腺遺伝子導入腺癌（ＴＲＡＭＰ）マウスと交雑し、ＭＴＤＨ及びＴＲＡＭＰの異質性発現を有する動物を生成した。ＴＲＡＭＰモデルは、ＳＶ４０Ｔ抗原の発現が、ラットプロバシンプロモータによって制御され、マウスの性成熟中に誘発される動物をもたらし、ヒト前立腺癌の臨床的進行に類似する前立腺癌の発達につながる（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５；Ｇｉｎｇｒｉｃｈら、１９９９）。
実験手順
マウス。マウスを必要とする全実験プロトコルは、プリンストン大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ｍｔｄｈ−／−マウスは、ジーントラップ型対立遺伝子を含有するＥＳ細胞株ＸＢ７８０（Ｂａｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入によって生成し、続いてＰＣＲにより生殖系伝達を確認した。全Ｍｔｄｈ−／−マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６ＴＲＡＭＰ遺伝子導入マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と繁殖させる前に、６世代超にわたってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交雑した（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，２００５）。雌ＴＲＡＭＰマウスを、Ｍｔｄｈ−／−雄マウスと繁殖させて、雌ＴＲＡＭＰ／ＭＴＤＨ＋／−及び雄ＭＴＤＨ＋／−樹立マウスを得た。後次に、これらの樹立マウスを繁殖させて、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋、ＴＲＡＭＰ／ＭＴＤＨ＋／−、及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−雄マウスを生成した。この繁殖戦略は、全実験マウスが、ＳＶ４０導入遺伝子にヘテロ接合性であることを保証した。ＤＮＡは、尾部検体から抽出され、以下のプライマー、（１）一般的な順方向プライマー５′−ＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧ−３′（配列番号８）、（２）ＷＴ対立遺伝子の逆方向プライマー５′−ＣＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣ−３′（配列番号９）、（３）突然変異体対立遺伝子の逆方向プライマー５′−ＧＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＧ−３′（配列番号１１）を使用して、遺伝子型解析のためにＰＣＲを行った。腫瘍細胞注入の場合、胸腺欠損ヌード雄マウスに５×１０５ ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞を皮下注入し、腫瘍体積の計算（π×長さ×幅２／６）のために、週２回カリパスによって腫瘍を測定した。
細胞培養。ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞系をＡＴＣＣから入手し、短いタンデム反復（ＳＴＲ）プロファイリング方法を使用して認証された。細胞を、０．００５ｍｇ／ｍＬ ウシインスリン、１０ｎＭ デヒドロイソアンドロステロン、５％ウシ胎仔血清、及び５％ Ｎｕ−血清ＩＶで補足されたダルベッコ改変イーグル培地内で維持した。
組織検査及び腫瘍悪性度分類。安楽死の時点で、膀胱（空）、精嚢、及び前立腺を含むより下位泌尿生殖路を除去し、計量した。大動脈周囲リンパ節、肺、及び肝臓を除去し、目に見える転移の証拠について調べた。組織を、１０％リン酸緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに埋め込み、５μｍ厚で切片化した。Ｈ＆Ｅ染色された背外側葉切片を、各々盲検的に１〜６のスケールで採点した（「１」は正常な前立腺を表し、「６」は不十分に分化した前立腺腺癌または神経内分泌腫瘍を表す）（Ｇｉｎｇｒｉｃｈ、１９９９；Ｋａｐｌａｎ−Ｌｅｆｋｏ、２００３；Ｈｕｒｗｉｔｚ、２００１）。
ヒト試料。腫瘍標本を、ミシガン大学の施設内検査委員会に従い、全対象からのインフォームドコンセントと共にミシガン大学の総合癌センターから得た。６２正常前立腺組織、１０良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、１０前立腺萎縮または前立腺炎症性萎縮（ＰＩＡ）、１０前立腺内上皮新生物（ＰＩＮ）、７２前立腺腫瘍、及び１０遠隔転移で構成された２つの前立腺組織マイクロアレイを、当臨床研究に使用した。手術時に、情報入手可能な患者の年齢は、５６〜９０歳であった（中央値＝７６歳、ＳＤ＝７．６歳）。全患者は、ホルモン療法または放射線療法で治療されていなかった。
統計解析。必要であるか否かに関わらず、全結果を統計解析に供した。対数順位検定、非パラメトリックマン・ホイットニー検定、カイ二乗検定、及び等分散仮定による不対両側独立スチューデントｔ検定を、図のレジェンドに示される大部分の研究に使用した。全統計検定について、＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
結果
ＭＴＤＨは、ヒト前立腺癌における腫瘍進行及び転移と関連付けられる：最初に、ヒト前立腺癌試料におけるＭＴＤＨの臨床関連を調査した。正常な前立腺（ＮＰ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺内上皮新生物（ＰＩＮ）、前立腺原発腫瘍、及び遠隔転移の試料からなる２つの前立腺組織マイクロアレイを、免疫組織化学によって解析し、ＭＴＤＨタンパク質レベルを、異なる臨床段階の試料間で比較した（図１２Ａ）。ＭＴＤＨタンパク質は、検出不可能であったか、または全ての正常またはＢＰＨ前立腺組織において非常に低レベルで発現した。ＭＴＤＨのタンパク質レベルは、前悪性組織（ＰＩＮ）、原発腫瘍、及び転移において次第に増加し、媒質または多量のＭＴＤＨを発現する試料の割合は、それぞれ１０％、４７．２％、及び８０．０％であり、ＭＴＤＨレベルと前立腺疾患の臨床進行との密接な相関を明らかにする（図１２Ｃ、左パネル、Χ２検定Ｐ＜０．００１）。ＭＴＤＨタンパク質レベルの差は、２つの非癌性組織型であるＢＰＨ及びＰＩＮを比較したときに既に明らかであり（図１２Ｃ、右パネル、Ｘ２検定Ｐ＝０．０２３）、良性から悪性期への移行中のＭＴＤＨ発現の増加を示す。ＭＴＤＨレベルは、後期腫瘍におけるＭＴＤＨのより高い平均染色強度（図１２Ｂ、上曲線）、または少なくとも中間レベルのＭＴＤＨを有する試料のより高い割合（図１２Ｂ、下曲線）によって証明されるように、原発腫瘍のグリーソンスコアとも相関していた。重要なことに、中レベルまたは高レベルのＭＴＤＨを有する患者における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に基づく再発率は、それらの前立腺腫瘍において低レベルのＭＴＤＨを有する患者よりも著しく高かった（図１２Ｄ）。前立腺癌遠隔転移におけるＭＴＤＨタンパク質レベルが、原発腫瘍におけるものよりも顕著に高いという事実と共に（図１２Ａ及び１２Ｂ）、これらのデータは、ＭＴＤＨレベルと前立腺癌の再発及び転移との強い正の相関を記録する。
ＭＴＤＨゲノム増加は、前立腺癌におけるＭＴＤＨ過剰発現及び臨床進行と関連付けられる。前立腺腫瘍内のＭＴＤＨのゲノムコピー数も増加したかどうかを試験するために、前立腺組織マイクロアレイを、ＭＴＤＨゲノム遺伝子座または染色体８動原体部位（対照として）のいずれかに対するプローブを使用して、中間期蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって解析した。ＦＩＳＨ解析は、前立腺癌試料の大部分が、ＭＴＤＨ遺伝子の超過ゲノムコピーを内包することを明らかにした（図１３Ａ）。ＭＴＤＨ ＤＮＡ増加は、細胞内のより高レベルのタンパク質と有意に関連付けられ（図１３Ｂ）、ＤＮＡ増加が前立腺癌におけるＭＴＤＨ過剰発現の機序であることを示す。さらに、ＭＴＤＨ ＤＮＡ増加は、臨床病期及び予後と密接に相関し、それにより前悪性期（正常、ＢＰＨ、またはＰＩＮ）、局所腫瘍、及び遠隔転移以前の試料、ＤＮＡ増加を有する部分が、それぞれ０％、２４％、及び５０％であった（図１３Ｃ）。加えて、増加したＭＴＤＨコピーを有する患者は、ＭＴＤＨゲノム増加を有しない患者よりも早く再発を罹患した（図１３Ｄ）。これらの臨床データは、ＤＮＡの予後値及びＭＴＤＨのタンパク質ステータスを明示し、前立腺癌の進行及び転移におけるＭＴＤＨの潜在的に重要な役割を示唆する。
Ｍｔｄｈ欠失ＴＲＡＭＰマウスの生成及び特徴付け：正常な発達及び癌におけるＭｔｄｈの役割を調査するために、生物全体Ｍｔｄｈ−ノックアウト（ＫＯ）マウスを、Ｂａｙ ＧｅｎｏｍｉｃｓジーントラップデータベースからのＥＳＣ系統ＸＢ７８０を使用して創出した（Ｓｔｒｙｋｅら、２００３）。突然変異体対立遺伝子は、Ｍｔｄｈの第２のイントロンへのＬａｃＺ導入遺伝子挿入を含み、転写の早期終結をもたらす。Ｍｔｄｈ−ＫＯ（Ｍｔｄｈ−／−）マウスは生存可能及び繁殖可能であり、検死解剖においていかなる臓器においても明らかな異常は見られなかった。具体的に、前立腺及び精嚢の両方を含む下位泌尿生殖路の全体形態論及び相対重量は、野生型（ＷＴ、Ｍｔｄｈ＋／＋）、ヘテロ接合性（ＭＴＤＨ＋／−）、及びＭｔｄｈ−／−雄マウス間で相当していた。顕微鏡レベルで検査したとき、Ｍｔｄｈ−／−マウスの前立腺上皮内の形態論的異常性はなかった。
前立腺腫瘍形成におけるＭｔｄｈ切除の結果を検査するために、マウス前立腺の遺伝子導入腺癌（ＴＲＡＭＰ）モデルを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋、ＴＲＡＭＰ／ＭＴＤＨ＋／−、及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスは、材料及び方法に記載されるように生成し（図１４Ａ）、遺伝子型をＰＣＲによって確認した（図１４Ｂ）。前立腺腫瘍形成におけるＭｔｄｈの役割を評価するための最初のステップとして、前立腺組織を正常マウス及びＴＲＡＭＰマウスから単離し、ＭｔｄｈのｍＲＮＡ（図１４Ｃ）及びタンパク質（図１４Ｄ）レベルを検査した。予想されるように、Ｍｔｄｈ ｍＲＮＡは、Ｍｔｄｈ−／−前立腺組織内で検出されず（図１４Ｃ）、ジーントラップ法がＭｔｄｈ発現を完全に排除したことを確認する。ＳＶ４０Ｔ抗原を発現しないマッチ対照マウスと比較して、より多くのＭｔｄｈ ｍＲＮＡが、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／−マウスからの前立腺組織内で観察された（図１４Ｃ）。一貫して、Ｍｔｄｈのタンパク質レベルの著しい増加が、正常対照と比較して、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋前立腺において検出された（図１４Ｄ）。これらのデータは、Ｍｔｄｈがマウスにおける前立腺腫瘍形成中に上方調節されることを示し、より高レベルのＭｔｄｈが、腫瘍細胞に競合優位性を付与し得る。
Ｍｔｄｈの喪失がＰＢタグ導入遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ＳＶ４０Ｔ抗原を、ＴＲＡＭＰマウスからの前立腺内で免疫染色した。このＴ抗原は、早くも８週齢の前立腺上皮細胞内で検出され（図１４Ｅ）、後期に前立腺上皮及び腫瘍細胞内で連続して発現した（図１４Ｆ）。ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋／＋マウスとＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスとの間で、癌進行の早期または後期のいずれかにおいて、個別の前立腺上皮細胞におけるＴ抗原免疫反応性の認識可能な差はなかった。ＳＶ４０ｔ及びＴ ｍＲＮＡ発現は、異なるＭｔｄｈステータスを有するＴＲＡＭＰマウスにおいて同等であった。負の対照について予想されるように、ＳＶ４０抗原は、正常マウスからの前立腺において検出不可能であった。これらの結果は、Ｍｔｄｈの欠失が、前立腺上皮細胞内のＰＢタグ導入遺伝子の発現に影響しないことを明示する。
Ｍｔｄｈの喪失は、前立腺腫瘍形成を抑制し、生存率を増加させる：発癌遺伝子誘発性前立腺腫瘍形成に対するＭｔｄｈの全体効果を調査するために、異なるＭｔｄｈステータスを有するＴＲＡＭＰマウス（ｎ＞１００）の群を、それらの前立腺腫瘍発達及び癌関連死亡率について研究した。最初に、泌尿生殖器重量は、ＴＲＡＭＰマウスにおける腫瘍量の信頼できる指標であるため（Ｋａｐｌａｎ−Ｌｅｆｋｏら、２００３）、異なる年齢のＴＲＡＭＰマウスからの泌尿生殖器を切り取り、測量して全体レベルでの腫瘍形成を監視した。Ｍｔｄｈ発現は、Ｍｔｄｈ＋／＋とＭｔｄｈ＋／−前立腺組織との間で同等であったため（図１４Ｃ）、これらのマウスを、Ｍｔｄｈ陽性群（Ｍｔｄｈ＋）対Ｍｔｄｈ陰性群（Ｍｔｄｈ−）に分けた。ＳＶ４０Ｔ抗原は、年齢の関数として、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスにおける泌尿生殖器質量の劇的な増加を誘発し（図１５Ａ、菱形）、それによりこれらのマウスの多くは、３６週齢において激しく巨大化した腹部を示した。対照的に、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスにおける泌尿生殖器の湿重量は、比較的一定のままであるか、またははるかに遅い速度でのみ増加した（図１５Ａ、正方形）。相対泌尿生殖器重量（体重の％として）を比較したとき、同様の結果が得られた（図１５Ｂ）。一貫して、３６週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスから切り取られた泌尿生殖器複合体のほぼ全てが、腫瘍形成の全体的に目に見える徴候を呈したが（図１５Ｃ、上パネル）、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスのものは、正常対照と同様のままであった（図１５Ｃ、下パネル）。
前立腺癌の発生を組織学的レベルでさらに評価するために、ＴＲＡＭＰマウスからの前立腺組織を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン染色を行った。２３週齢または２８週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの約５０％は、前立腺癌病変を発達させ、３６週齢までに、この群のほぼ全てのマウスが多巣前立腺腫瘍を発達させた（図１５Ｄ）。対照的に、２８週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスにおいて、前立腺癌は検出されず、前立腺癌病変は、前立腺上皮の非常に限定された領域において、３６週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスの５０％のみにおいて検出された。これらの組織病理学的結果は、大部分のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスが、３６週齢までに前立腺腫瘍形成の目に見える徴候を示さなかったことを示す形態論的観察と一致している（図１５Ｃ）。注目すべきことに、ＴＲＡＭＰマウスにおいて形成された腫瘍は、腺癌、葉様腫瘍、及び神経内分泌腫瘍に特徴的である種々の組織学的特徴を呈し、これらの形態論的に明らかな腫瘍が、前立腺内の異なる細胞系統を起源とし得るか、または一般的な早期前駆体から独立して発達し得ることが示唆された（Ｃｈｉａｖｅｒｏｔｔｉら、２００８）。興味深いことに、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスは、これらの異なる腫瘍亜型全ての発生の遅延を示し、多くの場合、約２８週または３６週で出現し、前立腺癌におけるＭｔｄｈの可能な系統非依存的役割を示唆する。
悪性前立腺癌の発達の結果として、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋の相当の割合（約５０％）が、１歳に到達する前に死亡した。対照的に、検査された１４ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−のうちの１匹のみが、癌関連疾患で死亡した（図１５Ｅ、Ｐ＜０．００１）。これらのデータは一緒に、マウスにおけるＭｔｄｈの欠失が、前立腺癌の発癌遺伝子駆動による形成を阻害し、ＴＲＡＭＰマウスの寿命を延長することを明示する。
Ｍｔｄｈの不活性化は、前立腺癌の進行を妨げる：前立腺癌の進行は、ＰＩＮなどの前悪性病変から開始し、十分に、中程度に、及び不十分に分化した癌の複数期からなる。Ｍｔｄｈの喪失が前立腺癌の開始及び進行にどのように影響するかを調査するために、組織学的検査を、各前立腺の背外側葉上で行い、最も頻繁で重症な部位をＴＲＡＭＰマウス内の腫瘍形成に供した（２１）（図１６Ａ）。ＴＲＡＭＰ腫瘍について前述の悪性度分類システムに基づいて（２１、２２）、各前立腺に、正常な前立腺に対して１〜神経内分泌腫瘍を含む不十分に分化した癌に対して６の範囲の最高スコアを割り当てた。ＰＩＮ病変は、上皮過形成及び無傷の基底細胞層の存在によって証明されるように（図１６Ａ、Ｔ８及びＴ１２）、８〜１２週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−両方の前立腺において容易に検出された（図１６Ｂ、第１パネル）。これは、１０週齢のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋及びＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−マウスからの前立腺上皮において同等の増殖及びアポトーシスの指標と一致した。ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの実質的分画は、良好に発達したか、または中程度に分化した腺癌であり、それぞれ２３週及び２８週で浸潤性病変を有し、３６週までに、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの８４％が、腫瘍細胞の未分化シートに特徴的な中程度〜不十分に分化した腺癌を示した。比較において、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−マウスの大半は、３６週までに、ＰＩＮまたは早期の十分に分化した腺癌または葉様腫瘍を発達させただけであった。一貫して、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスにおいて、前立腺腫瘍が低分化期に進行したため、Ｅ−カドヘリンの発現は、次第に低減するか、またはさらには不在になったが、豊富なＥ−カドヘリンが、検査された異なる年齢にわたって、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスの前立腺組織内で検出された。加えて、Ｍｔｄｈ＋腫瘍の悪性進行は、著しく高い割合の増殖細胞を伴ったが（図１６Ｃ、Ｐ＜０．０１）、アポトーシス細胞の割合は、この期でＭｔｄｈ＋及びＭｔｄｈ−腫瘍と同様であった。まとめると、これらの所見は、Ｍｔｄｈの不活性化が、腫瘍形成の早期で前立腺癌の進行を停止し、前悪性病変が増殖して進行期に進むのを防ぐことを示唆する。
Ｍｔｄｈの切除は、前立腺腫瘍細胞の体系的転移を低減する：ＴＲＡＭＰマウスの群における転移性疾患を、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／マウスの大部分が前立腺癌病変を発達させた時点の約５０週齢で検査した。ＴＲＡＭＰモデルの転移の頻出部位である肝臓、肺、及び大動脈周辺リンパ節（Ｇｉｎｇｒｉｃｈら、１９９６）を切り取り、巨視的レベル及び組織学的レベルの両方で転移性病変の出現を検査した（図１７Ａ−Ｂ）。複数の大きな転移性小結節を、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの３４％からの肝臓内で観察したところ、肝臓サイズが顕著に増加していた。逆に、検査されたＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスはいずれも、肝臓内で目に見える転移を発達させていなかった。同様に、肺内の複数転移性病巣が、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの３９％において見出されたが、１７ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスのうちの２匹のみが、肺内で１つまたは２つの転移性病巣を有していた。リンパ節の巨大化は、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスにおいて頻繁に特定され（９／２０）、この発生率は、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスにおいて３０％に減少した。転移性細胞が前立腺起源であったことを明示するために、肝臓、肺、及びリンパ節の連続切片上で免疫組織化学解析を行い、Ｔ抗原発癌タンパク質を検出した。Ｔ抗原発癌タンパク質の均一発現が、周囲正常細胞ではなく、転移性病巣になることが観察され、ＰＢ方向導入遺伝子発現の組織特異的パターンと一致する（Ｇｉｎｇｒｉｃｈら、１９９６）。これらのデータは一緒に、マウスにおけるＭｔｄｈの欠失が、ＴＲＡＭＰモデルにおいて体系的転移を著しく低減したことを明らかに示す。ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスの５０％近くが、１歳に達する前に大きな原発性かつ転移の可能性のある腫瘍で死亡していたという事実に起因して、Ｍｔｄｈ＋群とＭｔｄｈ−群との間の観察される転移差は、過小評価される可能性が非常に高かったことは記録するに値する。
前立腺癌細胞におけるＭｔｄｈのノックダウンは、生体外増殖及び生体内腫瘍形成を低減する：Ｍｔｄｈはマウスにおいて広く発現するため、生物全体Ｍｔｄｈ−ＫＯマウスにおける腫瘍形成の欠陥は、前立腺上皮細胞内のＭｔｄｈまたは他の細胞／組織型のいずれかの喪失から生じ得る。これら２つの可能性を区別するために、ＴＲＡＭＰモデルにおける進行した前立腺腫瘍に特徴的である、ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞系の腫瘍形成能力におけるＭｔｄｈの必要性を検査した（Ｆｏｓｔｅｒ、１９９７）。Ｍｔｄｈをノックダウン（ＫＤ）し（図１５Ａ及び９Ｂ）、Ｍｔｄｈ−ＫＤが生体外でＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞の増殖を減少させたことを見出した（図１５Ｃ）。生体内腫瘍形成におけるＭｔｄｈ−ＫＤの結果を検査するために、対照及びＭｔｄｈ−ＫＤ細胞をレシピエントマウスの横腹に注入し、腫瘍発生を経時的に監視した。明白な腫瘍の発生は、ＫＤ群において著しく遅延し（図１８Ｄ）、ＫＤ群から切り取られた腫瘍は、対照群からの腫瘍よりもはるかに小さかった（図１８Ｅ及び１８Ｆ）。別の２つの独立した実験において、同様の結果が得られた。興味深いことに、Ｍｔｄｈ−ＫＤ群内で最終的に形成された腫瘍は、対照群において、同様レベルのＭｔｄｈを腫瘍として発現し（図１８Ｇ）、これはＭｔｄｈ阻害のない細胞のクローン性増殖またはＭｔｄｈ−ＫＤ細胞内のＭｔｄｈの再発現から生じ得る。
論考
ヒト前立腺癌は、激しい再発増幅及び欠失によって特徴付けられ、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ及びｐ５３の喪失などのいくつかの周知の遺伝的病変と共に、この悪性腫瘍の発生及び進行を支配する多くの特徴付けられていない遺伝子が残存することを示唆する（Ｔａｙｌｏｒ、２０１０）。現行研究において、ヒト前立腺癌においてＭＴＤＨが頻繁に過剰発現し、増殖すること、及びその発現レベルが疾患の進行及び不良な生存転帰と強く相関することが明示された。加えて、Ｍｔｄｈ−ＫＯマウスを用いる遺伝的研究は、Ｍｔｄｈが正常な発達に影響することなく、自発性前立腺癌の進行及び転移において重要な役割を果たすという最初の生体内証拠を提供する。
ＴＲＡＭＰモデルは、複数の異なる臓器に転移し得る進行性前立腺癌を自発的に発達させるため、ヒト前立腺癌と非常に類似している。重要なことに、Ｍｔｄｈレベルが、正常な前立腺組織と比較して、ヒト及びＳＶ４０駆動マウス両方の前立腺腫瘍において上昇することが示された。興味深いことに、最近では、Ｍｔｄｈが、テロメア機能不全に続いてテロメラーゼ活性が再活性化された、ｐ５３／Ｐｔｅｎ欠乏性転移性前立腺癌マウスモデルにおけるゲノム増殖を通じて過剰発現することが示され（Ｄｉｎｇ、２０１２）、ヒト前立腺癌において我々が見出したものと同様のゲノム増殖機序を通じて、Ｍｔｄｈがマウス内で活性化され得ることを示唆する。ＳＶ４０形質転換腫瘍におけるＭｔｄｈ過剰発現の分子基盤を調査するために、さらなる研究が必要である。
ＴＲＡＭＰマウスにおけるＭｔｄｈノックアウトが、腫瘍形成を著しく障害し、癌関連死亡率を減少させたことが示された。ＴＲＡＭＰ−Ｃ１癌細胞内のＭｔｄｈのサイレンシングが、無腫瘍生存を延長し、生体内腫瘍成長を低減したという所見は、前立腺癌におけるＭｔｄｈの前立腺腫瘍細胞本来の役割をさらに支持する。Ｍｔｄｈ標的ｓｈＲＮＡを担持した思われるＴＲＡＭＰ−Ｃ１癌細胞により最終的に形成された腫瘍は、Ｍｔｄｈの発現を回復したことは記録するに値し、Ｍｔｄｈが生体内の前立腺癌形成に必須であるという見解を補強する。前立腺癌進行の遮断は、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスにおいて、良性または十分に分化した期で観察され、その見解は、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−前立腺組織内の高レベルの上皮マーカーＥ−カドヘリンによって構成的にさらに支持される。一貫して、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ＋マウスは、多くの場合、前立腺腫瘍細胞の、尿道及び精嚢への浸潤性及び悪性成長から生じる現象である、巨大化した前立腺及び閉塞した精嚢を示し、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスからの泌尿生殖路は、主に正常であると思われた。マウスモデルからの所見と一致して、ＭＴＤＨは、ヒト前立腺癌における進行関連発現パターンを呈する。これらの結果は、前立腺癌進行のバイオマーカー、及びヒト前立腺癌の悪性進行を止めるための可能な治療標的としてのＭＴＤＨの潜在的使用を示唆し得る。
わずかな割合のＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスが、長期潜伏後も依然として浸潤性前立腺癌を発達させ、その疾患により死亡した（１４匹中１匹）という事実は、いくつかのＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−腫瘍が、Ｍｔｄｈの欠乏を克服し、Ｍｔｄｈ非依存的経路を利用して、それらの悪性成長及び進行を支持したことを示唆する。実際に、ＳＶ４０発癌遺伝子の誘発は、早くも思春期に前立腺上皮細胞内で均一に起こるが、浸潤性前立腺癌及び転移の発達は、はるかに後で起こり、高度に異質性であると思われ、個別の腫瘍が異なる遺伝的及び後成的変化を獲得して、ＳＶ４０抗原陽性細胞を完全に形質転換し得るを示唆する。Ｍｔｄｈの不活性化は、ＴＲＡＭＰ／Ｍｔｄｈ−／−マウスの大半において観察されるように、Ｍｔｄｈ依存的シグナル伝達及び前立腺癌の進行を阻害するが、Ｍｔｄｈ非依存的機序によって支持される腫瘍成長は遮断しない。これもまた、ＭＴＤＨが、全てのヒト前立腺癌ではないが、多くの割合で高度に発現するという観察と一致する。それにも関わらず、悪性期への進行のために高レベルのＭＴＤＨに依存していた癌細胞は、Ｍｔｄｈ陽性ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞内のＭｔｄｈの阻害がこれらの細胞の腫瘍形成能を著しく障害するという所見によって支持されるように、ＭＴＤＨ標的治療に感受性である。
遠隔臓器への転移は、固形癌を有する患者における癌関連死の大半に関与する（Ｗａｎ、２０１３）。ＭＴＤＨが、より高い転移リスクを有するヒト乳癌において増幅及び／または過剰発現することが以前に明示された（Ｈｕら、２００９）。現行研究において、ヒト前立腺癌の遠隔転移の実質的分画は、高レベルのＭＴＤＨを呈し、８ｑ２２ゲノム遺伝子座の増幅を内包することが見出された。機能的に、Ｍｔｄｈの切除は、ＴＲＡＭＰモデルの遠隔臓器内の転移の発生及び負荷を著しく減少させた。これらの見出と一致して、近年の研究は、Ｐｔｅｎ及びｐ５３の喪失によって駆動される前立腺癌の傾向があるマウスモデルにおけるテロメア機能不全に続くテロメラーゼ再活性化が、癌関連遺伝子座におけるコピー数変化の選別を容易にすることを示し、Ｍｔｄｈは、その遺伝的増幅がこのマウスモデルにおける癌進行及び転移と強く関連付けられる遺伝子の選択的リストの上位にあることが見出された（Ｄｉｎｇら、２０１２）。これは、ＳＶ４０発癌遺伝子に加えて、遺伝的事象によって駆動される前立腺癌におけるＭｔｄｈの重要な役割である可能性を示唆する。最後に、ＭＴＤＨの転移促進機能が、乳癌及び前立腺癌以外に、他の癌型において存在する可能性があることに留意すべきである。いくつかの最近の研究は、実際に、異常なＭＴＤＨ発現が、咽頭扁平細胞癌（Ｌｉｕら、２０１３）、頭頸部の扁平細胞癌（Ｙｕら、２０１４）、及び肝細胞癌（Ｚｈｕら、２０１１）を含む追加の癌型においてリンパ節転移及び予後不良と関連付けられ、ＭＴＤＨの過剰発現は、肝細胞癌細胞の実験的転移を増加させる（Ｙｏｏら、２００９）。
要約すると、本明細書の研究は、ＭＴＤＨが、マウス及びヒト両方の前立腺癌において過剰発現し、この高レベルのＭＴＤＨが、生体内の自発性前立腺癌進行及び転移に重要であることを報告する。種々の癌型におけるＭＴＤＨの広範な過剰発現を考慮して、ＭＴＤＨの腫瘍促進的役割は、本研究で使用されるモデルに制限されないことがある。実際に、進行中の研究はまた、Ｍｔｄｈの欠失が、自発性乳房腫瘍形成及び転移を劇的に阻害することを見出した。今後の研究は、ＭＴＤＨの腫瘍促進機能に関与する、根底にある機序及びシグナル伝達経路を理解し、ヒト癌を制御するためのＭＴＤＨ標的療法の開発を容易にする必要がある。
実施例３−メタドヘリンとＳＤＮ１との間の相互作用の解析
メタドヘリン（ＭＴＤＨ）及びブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）は過剰発現し、種々の癌型において相互作用する。ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の両方は、種々の細胞機構及びシグナル伝達タンパク質と相互作用し、複数の癌関連細胞過程及びシグナル伝達経路と関係があるとされ、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１が、それらの複数の相互作用ドメイン／モチーフを介して腫瘍促進シグナル伝達活性を調整することによって悪性特徴を増強することが可能である。しかしながら、構造情報の完全な欠失は、多くの癌型における両方のタンパク質の有意な臨床関連にも関わらず、ＭＴＤＨ／ＳＮＤ１タンパク質複合体の機能に関する機構的理解を著しく妨害する。ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の構造的基盤を明らかにすることもまた、新規の癌治療戦略として、ＭＴＤＨまたはＳＮＤ１を標的する新たな方法を開発するために重要である。２つのタンパク質間の相互作用を解析するために、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の高解像度結晶構造が下記のように判定され、１１残基ＭＴＤＨペプチドモチーフが、２つのＳＮドメイン（ＳＮ１／２）間の延長されたタンパク質溝を占め、２つのＭＴＤＨトリプトファン残基が、ＳＮＤ１内の２つの十分に定義されたポケットに寄り添うことを明らかにする。
実験手順
タンパク質調製：全ての構成体及び点突然変異は、標準ＰＣＲ系クローニング戦略を使用して生成された。手短に言えば、異なる境界及び突然変異体を有するＳＮＤ１及びＭＴＤＨは、それぞれＮ末端Ｈｉｓ８タグ及びＧＳＴタグを内包するｐＱｌｉｎｋベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）内でクローン化され、親和性タグの後にＴＥＶ開裂部位を有する。タンパク質は、大腸菌株ＤＨ５αにおいて２３℃で過剰発現した。ＳＮＤ１及びＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）の発現及び精製は、以前の刊行物から修正された手順に従った（Ｌｉら、２００８）。
ＳＮＤ１タンパク質の場合、溶解物の可溶性分画を、２ｍＭ β−ＭＥ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール、及び２５ｍＭ トリスＰＨ８を含有する溶解緩衝液を用いてＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製した。Ｈｉｓ−ＳＮＤ１タンパク質を、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、及び２５ｍＭ トリスＰＨ８を含有し、β−ＭＥを含まない緩衝液によって溶出した。ヘパリン緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＰＨ７、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２ｍＭ β−ＭＥ）によって４倍に希釈した後、タンパク質をヘパリンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、１００ｍＬの０〜０．６Ｍ ＮａＣｌ勾配によって溶出した。ＧＳＴタグ付きＭＴＤＨタンパク質を、ＧＳ４Ｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製し、アニオン交換クロマトグラフィーによってさらに分画化した（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
ＳＮＤ１及びＭＴＤＨ複合体の結晶化を容易にするために、ＳＮＤ１（１６〜３３９）を、ＭＴＤＨペプチド（３８６〜４０７）に、２１残基を有する可撓性リンカー（Ｌ２１）を介して融合した。ＳｅＭｅｔタンパク質の場合、１２ＬのＨｉｓ−ＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）融合タンパク質を、ｐＱｌｉｎｋベクター内で、大腸菌株（ＢＬ２１、ＤＥ３）において２３℃で２２時間、ＯＤ６００＝１．０で０．２５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて過剰発現させた。タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴの存在下、ＴＥＶプロテアーゼによって開裂される前に、上記のようにＮｉ−ＮＴＡ及びヘパリンカラムによって精製した。試料を、１．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製して、ＴＥＶ及び後期ピークにおける融合タンパク質の二量体を含む不純物を除去する前に、回転させてペレットを除去した。次に、融合タンパク質のモノマーを、ゲル濾過クロマトグラフィーによって（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）最終ステップで精製し、緩衝液を１０ｍＭ トリスＰＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭ ＤＴＴに変化させた。試料を、結晶化のために１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
結晶化及びデータ収集：ＳＮＤ１及びＭＴＤＨ融合タンパク質の結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散方法によって、２５０ｎＬの１５ｍｇ／ｍＬ ＳｅＭｅｔ−ＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）を、２５０ｎＬの良好な緩衝液（２１．６％ ｐＥＧ３３５０、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ８．０、０．１Ｍ ＣｓＣｌ）、プラス５０ｎＬの微小種と混合することにより２３℃で成長させた。単結晶は４日で成長し、７日後に成熟した。結晶を、液体窒素中でフラッシュ凍結させる前に、０〜２５％グリセロールを用いて良好な緩衝液へと次第に変化させた。結晶への放射線損傷を低減するために、ＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）についての２つのＳＡＤデータセットを、同位置上で２５％ビームエネルギーを用いて、０．６秒／フレーム、波長０．９７８４９Åで連続的に収集した。データを、ＡＰＳ ＬＳ−ＣＡＴ（ＩＤ−Ｄ）で収集し、これら２つのデータセットを複合して、ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，１９９７）を使用して３．０Åに処理した。異常な散乱シグナルの最適カットオフは、ｐｈｅｎｉｘ．ｘｔｒｉａｇｅ（Ａｄａｍｓら、２０１０）によって４．３Åで０．０８３３と測定された。第２のＳＡＤデータセットを、露出時間を１．５秒に増加させることによって収集し、２．７Åに処理した。
構造判定：ＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）の初期構造を、ｐｈｅｎｉｘ．ａｕｔｏｓｏｌ（Ａｄａｍｓら、２０１０）によって、複合ＳＡＤデータセットを使用して３．０Åで判定した。２４個のセレニウム原子及び５個の非対称単位が、Ｒｆｒｅｅ／Ｒｗｏｒｋ＝０．３５／０．３０を用いて、初期モデル内で見出された。このモデルを、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ａｄａｍｓら、２０１０）によって、異常群（Ｓｅ）を用いて精練し、ＣＣＰ４パッケージ（Ｗｉｎｎら、２０１１）内でＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙら、２００７）を使用する分子置換によって、２．７Åデータセットの開始モデルとした。改善されたモデルを、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ、２００４）を使用して手動で構築し、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ制限を使用してＴＬＳ及び異常群（Ｓｅ）を用いて精練した（Ａｄａｍｓら、２０１０）。最終構造を、２．７Å（表Ｓ１）に精練した。
ＧＳＴ媒介性プルダウンアッセイ：約２０μｇのＧＳＴ−ＭＴＤＨ（異なる切断形態及び部位突然変異体）を、ＧＳＴタグを介して１０μＬのグルタチオン樹脂に結合した。この樹脂を２００μＬアッセイ緩衝液（２５ｍＭ トリス、ＰＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＤＴＴ）で３回洗浄して、過剰な未結合のタンパク質を除去した。１５μｇのＨｉｓ−ＳＮＤ１（１６〜３３９）を、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むアッセイ緩衝液に懸濁された１００μＬ量の樹脂に添加した。混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査する前に、２００μＬアッセイ緩衝液で２回洗浄し、クマシーブルー染色によって可視化した。実験を３回繰り返し、ＧＳＴ−ＭＴＤＨと関連付けられたＳＮＤ１の比を、ＩｍａｇｅＪによって解析した。
免疫沈降及びウェスタンブロット：生体内免疫沈降（ＩＰ）実験の場合、培養された細胞を、冷たいＰＢＳ中で洗浄し、ＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＭＳＦを含む溶解緩衝液（２０ｍＭ トリスｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｘ−１００、０．００２５Ｍ Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び１ｍＭ ＮａＦ）中で溶解した。次に、細胞溶解物を、氷上で１０分間インキュベートし、遠心分離して、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１時間、４℃でインキュベートすることによって事前切除した。ＩＰビーズ調製の場合、３０μＬのタンパク質Ａ／Ｇビーズを、５μｇの抗体で２時間、４℃でインキュベートした。ＩＰを、４℃で終夜実行し、ビーズを遠心分離し、洗浄した後、ＳＤＳタンパク質負荷緩衝液中で５分間煮沸して、結合タンパク質を溶出した。ＩＰ溶解物を、示される抗体を用いてウェスタンブロットに供した。
ウェスタンブロットの場合、培養細胞からの溶解物を、プレート上に溶解緩衝液を直接添加することによって収集した。ウェスタンブロットゲル調製物及び免疫ブロットを、標準手順に従って行った。ＭＴＤＨに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４０−６５００）、ＳＮＤ１（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−２７１５９０）、抗Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−４０）、及び抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−７３９２）を、１：１０００で希釈した。
腫瘍様塊アッセイ：単一細胞を、超低取り付けプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）内で塊培地（１：１ ＤＭＥＭ：Ｂ２７で補足されたハムの１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、及び４μｇ／ｍＬヘパリンと共に平板培養した。平板培養の４〜７日後に塊を数えた。
腫瘍形成アッセイ：マウスを必要とする全ての手順及び全ての実験プロトコルを、プリンストン大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。腫瘍形成アッセイの場合、示される数のＰｙＭＴ腫瘍細胞を、ＦＶＢレシピエントマウスの乳房脂肪体に移植し、腫瘍形成を毎週２回監視した。腫瘍は、連続２週間にわたって明白になったときに確立されたと見なし、腫瘍サイズを腫瘍体積の計算のために（π×長さ×幅２／６）、カリパスによって測定した。
ＦＲＥＴアッセイ：ＦＲＥＴアッセイの場合、ＣＦＰ−ＭＴＤＨ融合タンパク質、及び（ＴＣ）ＳＮＤ１（１６〜３３９）に融合したテトラシステインペプチドは、親和性タグ後にＴＥＶ開裂部位を有するＮ末端ＧＳＴタグを内包するｐＱｌｉｎｋベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローン化された。これらのタンパク質は、大腸菌株ＤＨ５αにおいて２３℃で過剰発現した。大腸菌細胞溶解物の可溶性分画を、ＧＳ４Ｂ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製した後、ＴＥＶ開裂によってＧＳＴタグを除去した。タグ付きでないタンパク質を、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに分画化した。
ＦｌＡｓＨ−ＥＤＣ２化合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＴＣ−ＳＮＤ１（１６〜３３９）に１：１．１モル比で添加して、ＦＲＥＴアッセイにおいてＣＦＰの受容体となる高度蛍光ＴＣ−ＦＬＡＳＨ−ＳＮＤ１を創出した。０．２μＭ ＣＦＰ−ＭＴＤＨのＣＦＰのドナー蛍光シグナルを、ＴＣ−ＦＬＡＳＨ−ＳＮＤ１（０．２５、０．５、１、２、４、８μＭ）の漸増の存在及び不在下、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、４５０ｎｍでの励起及び４９０ｎｍでの放出を用いて測定した。エネルギー移動の速度を、ドナー蛍光の喪失に基づいて以下の等式、Ｅ＝１−（ＦＤＡ／ＦＤ）を使用して計算し、式中、ＦＤＡ及びＦＤは、それぞれＴＣ−ＦＬＡＳＨ−ＳＮＤ１の存在及び不在下でのＣＦＰの蛍光である。ＴＣ−ＦＬＡＳＨ−ＳＮＤ１濃度依存的ＦＲＥＴ効率を、ＭＴＤＨペプチドとＳＮＤ１との間の平衡解離定数（ＫＤ）を推定するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）と適合させた。実験を３回繰り返し、代表的な結果を示す。
Ｂｉｏｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）：抗ＧＳＴ抗体によって固定されたＢＬＩセンサーを、１５０ｎＭ ＧＳＴ−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）でのインキュベーションに続いて、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡでのインキュベーションによって活性化し、２５ｍＭ トリスｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ ＤＴＴを含有する結合緩衝液によって洗浄した（各ステップ３分）。ＧＳＴ−ＭＴＤＨによって活性化された７つのセンサーを、結合干渉液対照及び漸増濃度のＨｉｓ８−ＳＮＤ１（１６〜３３９）（０．１、０．２、０．４、０．８、１．６、３．２μＭ）を含有する７つのウェルに同時に浸漬して、ＳＮＤ１結合のオン速度を測定した。３分の結合後、センサーを結合緩衝液に浸漬して、オフ速度を測定した。データ収集及び解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。
統計解析：必要であるか否かに関わらず、全結果を統計解析に供した。対数順位検定、非パラメトリックマン・ホイットニー検定、カイ二乗検定、及び等分散仮定による不対両側独立スチューデントｔ検定を、図のレジェンドに示される大部分の研究に使用した。限界希釈アッセイの場合、ＴＩＣの頻度及び統計を、Ｌ−ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計算した。Ｐ値を、全ての図面において＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１と記した。
受入番号：ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の原子座標は、受入コード４ＱＭＧでタンパク質データバンクに寄託された。
結果
ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の相互作用に必要な最小領域のマッピング：ＭＴＤＨ（残基１〜５８２）に関して最初に実行された一次配列解析は、ＭＴＤＨが、Ｎ末端の近くの膜貫通ドメインを除いて、その全体配列内で主に構造化されていないことを示唆した。したがって、ＭＴＤＨは、足場タンパク質として機能し、その配列全体でそのペプチドモチーフを介して種々のシグナル伝達分子を動員し得る。ＭＴＤＨ断片（配列番号１のアミノ酸３６４〜４７０）がＳＮＤ１との相互作用に必要な必須領域を内容するという以前の観察に基づいて（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）、ＭＴＤＨの最小断片（配列番号１のアミノ酸３８６〜４０７）は、ＳＮＤ１結合を付与するこの領域内で最近マッピングされた（上記を参照されたい）。ＳＮＤ１ドメインはいずれも、タンパク質分子との特異的相互作用のためにマッピングされていなかった。このギャップを満たすために、少数のＳＮＤ１構成体を作製し、２つが、それぞれＮ末端ＳＮ１／２及びＣ末端ＳＮ３／４−ＴＳＮ５ドメインを内包する高度に可溶性の組み換えタンパク質を付与した。ＳＮＤ１結合モチーフを内包するＧＳＴタグ付きＭＴＤＨ（配列番号１のアミノ酸３６４〜５８２）断片を使用してプルダウン実験を行うことによって、ＳＮＤ１のＳＮ１／２ドメイン（配列番号２のアミノ酸１６−３３９）は、ＭＴＤＨと化学量論的に結合するが、ＳＮ３／４−ＴＳＮ５ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４０−８８５）は、ＭＴＤＨとほとんど相互作用しないことを示した。バイオレイヤー（ｂｉｏｌａｙｅｒ）干渉法を使用するこの相互作用のさらなる解析は、この相互作用が、容易に反転可能であることを示した。ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の結合親和性は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイによって示されるように、約０．９μＭであった。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の全体構造：広範な努力の後、ＳＮＤ１ ＳＮ１／２ドメイン及び配列番号１のＭＴＤＨ残基３８６〜４０７を内包する合成ペプチドの共結晶は、恐らく２つのタンパク質間の比較的弱い相互作用に起因して、タンパク質結晶をもたらすことができなかった。複合体を安定させ、結晶化を容易にするために、ＳＮＤ１ ＳＮ１／２ドメインを、１２〜３７残基の範囲の長さを有する可撓性リンカーを介して、ＭＴＤＨ（配列番号１のアミノ酸３８６〜４０７）に融合した。２１残基リンカーを有する構成体は、最終的に回折結晶を付与した。ＳＮ１／２ドメインは、ＳＮ３／４と密接に関連したが、ＳＮ３／４（ＰＤＢコード：３ＢＤＬ）の構造を使用する分子置換による構造判定は、恐らくＯＢ折り畳みから発する延長されたループの大きな多様性に起因して成功しなかった。最後に、セレニウムＳＡＤ（単波長異常分散）位相によって構造を判定し、２．７Åに精練した。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１融合タンパク質の５つのコピーが、ほぼ同一の各非対称単位内で見出され、２９０残基上の平均二乗偏差は、０．９Å以下であった。定義された電子密度を有するＭＴＤＨ残基の数は、異なるコピー内でわずかに変化した。それにも関わらず、ＭＴＤＨの残基３９３〜４０３は、ＳＮＤ１との界面において、十分に定義された電子密度マップを有する全コピーにおいて可視であった。ＳＮ１及びＳＮ２の両方は、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）の典型的なＯＢ折り畳みを呈し、ＳＮ３／４（図１７Ａ）と同様に、中心対称関連様式（図１６）で配置された。各ＳＮドメインは、３つのらせん束（α１−α２−α３）及び短いβ−ヘアピン（β４−β８）によってキャップされたβ−バレル（β１−β２−β３−β７−β５）を含有する（図１６）。ＭＴＤＨペプチド（配列番号１のＤ３９３ＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ４０３）は、ＳＮ１ドメインとＳＮ２ドメインとの間の浅い溝を占め、２つのトリプトファン残基、配列番号１のＷ３９４及びＷ４０１を有し、ＳＮＤ１内の２つの十分に定義された疎水性ポケットとの広範な疎水性接触を形成した。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１インターフェースの反対側において、ＳＮＤ１は、３つの延長された突出構造要素を有し（ＳＮ１内のβ６−β７ヘアピン、ならびにＳＮ１及びＳＮ２両方における延長されたＬβ４−α１ループ）、種々の結合形態が可能な尖った表面をもたらすことは特筆すべきである。ＳＮ１／２ドメインは、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合に関与し、ＳＮＤ１のヌクレアーゼ活性に寄与することが以前に示唆された（Ｌｉら、２００８）。ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面と反対のＳＮＤ１の丘状表面が、ＤＮＡ／ＲＮＡまたは他のタンパク質との結合に関与し、ヌクレアーゼ活性またはＳＮＤ１によって媒介されるシグナル伝達に寄与するかどうかは依然として判定されていない。
ＳＮ１／２とＳＮ３／４及びＳＮａｓｅとの構造比較：ＳＮ１／２、ＳＮ３／４（ＰＤＢコード：３ＢＤＬ）及びＳＮａｓｅの２つのコピー（ＰＤＢコード：２ＥＮＢ）の構造の重畳は、β−シート及びα−らせんにおいて同様の構造を明らかにし（図１９）、ＳＮ１／２とＳＮ３／４との間の２６８残基上で２．０２Å、ＳＮ１とＳＮａｓｅとの間の１２３残基上で１．６７Å、及びＳＮ２とＳＮａｓｅとの間の１１６残基上で１．６８Åの二乗平均平方分散を有する。しかしながら、いくつかのループ領域は明確に異なり、異なる長さ及びアミノ酸配列を有する（図２０Ａ及び２０Ｂ）。これらは、ＯＢ折り畳みから進化した新たな特徴であり、新たな機能性を付与する可能性がある。例えば、後に詳細に示されるように、ＳＮ１内の伸長されたＬβ２−β３ループは、ＭＴＤＨ結合を媒介するために重要である。ＳＮ１及びＳＮ３内のＬβ４−α１ループは、ＳＮａｓｅ内のそれよりも著しく長く、それらは明確に異なる立体構造を採用し、２つのＳＮドメインに対する異なる特異性を定義する可能性がある。ＳＮａｓｅ活性部位における６つの残基のうちの２つは、ＳＮ３内に保持され、これらの残基のうちの１つのみが、ＳＮ１及びＳＮ４において同じまたは同様のままであるが、それらのうちのいずれもＳＮ２内で保持されない（図２０Ｂ）。これは、ＳＮ３／４が、低いヌクレアーゼ活性を呈する一方で、ＳＮ１／２は、恐らく基質結合を増強することによって、ヌクレアーゼ活性を相補する（Ｌｉら、２００８）という以前の観察と一致する。これらの観察は、新規の機能が、ＳＮＤ１内のＳＮドメインに対して進化したが、これらのＳＮ折り畳み内のヌクレアーゼ活性が、進化中に低減（ＳＮ３／４において）または消滅（ＳＮ１／２において）したことを示唆する。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用界面：ＭＴＤＨが、ＳＮＤ１の丘状表面の影響でＳＮ１とＳＮ２との間の延長された溝を占めるという事実は、ＭＴＤＨが足場シグナル伝達タンパク質となり得るという見解と一致する。このアーキテクチャは、ＭＴＤＨが、ＳＮＤ１の主要結合表面を干渉することなく、ＳＮＤ１及び他のＭＴＤＨ関連シグナル伝達複合体を架橋するのを可能にし得る。したがって、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面は、種々の下流シグナル伝達及び癌におけるそれらの機能を理解するための重要な基盤を提供する。
この界面は、ＭＴＤＨ内のＷ３９４及びＷ４０１の、ＳＮＤ１内の２つの別個の十分に定義された疎水性ポケットとの疎水性ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触が優位を占め、ポケットの周辺における水素結合（Ｈ結合）及び塩架橋相互作用によって支えられる（図２１）。Ｗ３９４の疎水性ポケットは、ＳＮ１ Ｌβ２−β３ループ内の残基Ｐ３９、Ｐ４３、及びＰ４４、ならびにＳＮ２α１らせん上のＥ２４７及びＦ２５０の側鎖によって形成される。Ｗ４０１のポケットは、約１５Å離れており、ＳＮ２からのα１らせんとα２らせんとの間に位置し、疎水性残基Ｌ２５６、Ｈ２７９、Ｉ２８４、及びＬ２８７、ならびに残基Ｒ２５５、Ｒ２５９、及びＮ２８１の炭素鎖領域によって輪郭が示される。界面の一端に近い疎水性ポケットの周縁において、ＳＮＤ１内のＲ３２７及びＲ３２４は、ＭＴＤＨ内のＤ３９３及びＮ３９５、ならびに非対称単位の５つの複合体のうちの２つの３９２におけるその骨格カルボニル基とのいくつかのＨ結合及び塩架橋相互作用を形成し、中間では、ＳＮＤ１内のＲ２５５が、３９５においてＭＴＤＨ骨格とのＨ結合相互作用を形成し、他端において、ＭＴＤＨ残基Ｅ４００及びＮ４０３を有するＳＮ１α１らせん及びＳＮ２β５鎖からの残基及び骨格原子によって、いくつかのＨ結合及び塩架橋相互作用が形成される。
ＳＮＤ１内のＭＴＤＨの界面は高度に固有であり、ＳＮ１／２においてのみ存在する。Ｗ３９４及びＷ４０１の十分に定義された疎水性ポケットは、静電位を有するＳＮ１／２の表面輪郭によって明らかに示されるが、ＳＮ３／４においては不在である。ＳＮ１／２内の２つの疎水性ポケット間の表面は塩基性であり、部分的にＥ４００との静電相互作用を好むが、Ｗ３９４とＷ４０１との間の非極性残基（Ａ３９６ＰＡ３９８）との相互作用には理想的でない。これは、ＳＮＤ１とＭＴＤＨとの間の比較的弱い相互作用、及びこの相互作用の速いオフ速度を説明すると思われる。ＳＮ１／２とは異なり、ＳＮ３とＳＮ４との間のタンパク質溝は主に塩基性であり、ＭＴＤＨ結合を好まないＳＮ３／４の別の構造特徴の根底にある。さらに、Ｗ３９４のポケットを並べるために必須のＳＮ１ Ｌβ２−β３ループ内のプロリン残基は、ＳＮ３またはＳＮａｓｅにおいて全て不在であり（図２０Ｂ、図２１）、ＭＴＤＨに対するＳＮ１／２の結合特異性をさらに定義する。
結合欠乏性ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１突然変異体の特定：上で特徴付けられた界面がどのようにＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用に寄与するかに関する洞察を得るために、構造誘導性突然変異誘発研究を行った。ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１構造は、ＭＴＤＨ Ｗ３９４及びＷ４０１によって形成されたｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ疎水性接触が、ＳＮＤ１結合において優位な役割を果たし得ることを示唆する。この見解と一致して、２つのトリプトファン残基のうちのいずれかの、はるかに小さい残基アラニン（Ｗ３９４Ａ、Ｗ４０１Ａ）または負電荷残基アスパラギン酸塩（Ｗ３９４Ｄ、Ｗ４０１Ｄ）への突然変異は、ＳＮＤ１（１６〜３３９）とＭＴＤＨ（３６４〜５８２）との間の相互作用を生体外で排除したか、または著しく低減した（図２２Ａ）。Ｗ→Ａ突然変異体は、Ｗ→Ｄ突然変異体よりも強い欠陥を呈し、Ｗ３９４との突然変異は、Ｗ４０１との突然変異よりも深刻な欠陥をもたらし、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用が、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触によって主に決定されること、及びＷ３９４が、Ｗ４０１よりも高いＳＮＤ１への寄与をもたらすことを示唆する。Ｈ結合または塩架橋相互作用を妨害することが予想される周縁界面におけるＭＴＤＨ突然変異（Ｎ３９５Ａ、Ｅ４００Ａ、Ｅ４００Ｒ、Ｎ４０３Ａ）は、いかなる効果もほとんど有さず、界面の外側のＤ３８９を標的とする突然変異（Ｄ３８９Ｒ）に類似する（図２２Ａ）。個別のＨ結合が、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用に対してわずかな寄与をもたらす可能性がある。これらの結果は構造観察と一致し、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用が、ＭＴＤＨトリプトファン残基とＳＮＤ１内の疎水性ポケットとの間のｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触によって支配されるという見解を支持する。
ＭＴＤＨ結合を妨害する界面におけるいくつかのＳＮＤ１突然変異も特定された。Ｒ２５５Ｅ、Ｆ２５０Ａを含むＳＮＤ１疎水性ポケットに対して行われた変更及びＳＮ１ Ｌβ２−β３ループ内の欠失（Δ３９〜４３）は、ほぼ完全にＭＴＤＨ結合を排除した（図２２Ｂ）。Ｗ４０１とのｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触の攪乱に加えて、Ｒ２５５Ｅもまた、ＭＴＤＨ骨格とのそのＨ結合相互作用に影響を及ぼし得る（図２１）。Δ３９〜４３の効果は、ＭＴＤＨ結合についてＳＮ１ Ｌβ２−β３ループ（図２０Ａ、２０Ｂ、及び２１）内で固有に見出されるこれらの残基の役割をさらに支持する。Ｒ３２４Ｅ突然変異は、恐らくＭＴＤＨ内でＤ３９３との反発する電荷−電荷接触を導入することによって、ＭＴＤＨ結合を著しく脆弱化した。そのＨ結合相互作用を攪乱することが予想されるこの残基、Ｒ３２４Ａに対する異なる突然変異は、負の対照であるＲ３１６Ｅ、界面の外側に位置するＳＮＤ１突然変異と同様に、ＭＴＤＨ結合にほとんど影響を及ぼさなかった。
この界面において特定されたＭＴＤＨ及びＳＮＤ１突然変異が、哺乳動物細胞内の全長タンパク質の相互作用にどのように影響するかをさらに検査した。全長ＨＡタグ付きＳＮＤ１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で全長Ｍｙｃタグ付き野生型（ＷＴ）または突然変異体ＭＴＤＨと共発現し、ＳＮＤ１プルダウンのために、細胞溶解物を抗ＨＡ免疫沈降に供した。生体外観察と一致して（図２２Ａ）、突然変異体Ｗ３９４Ａ、Ｗ３９４Ｄ、またはＷ４０１Ａではなく、ＷＴ ＭＴＤＨを、ＨＡ−ＳＮＤ１と一緒にプルダウンした（図２２Ｃ、赤色）。ＭＴＤＨ突然変異Ｗ４０１Ｄは、結合を著しく低減したが（図２２Ｃ、青色）、負の対照Ｄ３８９Ｒ、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面の外側に位置する突然変異を含む他の突然変異は、相互作用に影響を及ぼさなかった（図２２Ｃ）。同様に、ＭＴＤＨ結合に生体外で影響を及ぼすＳＮＤ１突然変異はまた、同様のレベルで生体内の全長タンパク質の結合に影響を及ぼした。ＷＴ ＨＡ−ＳＮＤ１及び負の対照突然変異体、ＨＡ−ＳＮＤ１ Ｒ３１６Ｅの両方は、Ｍｙｃ−ＭＴＤＨと容易に結合したが、他の突然変異、Δ３９〜４３、Ｆ２５０Ａ，またはＲ２５５Ｅは、ＭＴＤＨ結合をほぼ完全に排除し、Ｒ３２４Ｅは、結合を著しく低減した（図２２Ｄ）。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用に関する生体外及び生体内研究の同様の結果は、上で特徴付けられたＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面が、哺乳動物細胞内での全長ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の相互作用を決定することを強く示唆する。これは、癌進行におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の機能を制御することにおけるこの界面の役割のさらなる定義を可能にした。
ＳＮＤ１結合欠乏性ＭＴＤＨ突然変異体は、腫瘍形成促進活性を低減した：上で明示されるように、ＭＴＤＨは、乳房腫瘍形成を調節することにおいて役割を果たす。具体的に、マウスにおけるＭｔｄｈの遺伝的欠失は、種々の発癌遺伝子（ＰｙＭＴ、Ｗｎｔ、ＥｒｂＢ２）または癌刺激によって形質転換された乳房上皮細胞の腫瘍開始能を障害し、この欠陥は、レンチウイルス形質導入によって、ＭＴＤＨをＭｔｄｈ−ノックアウト（Ｍｔｄｈ−／−）腫瘍細胞に再導入することによって容易に機能回復され得る。ＳＮＤ１との相互作用が、ＭＴＤＨの腫瘍開始効果に重要であるかどうかを試験するために、マウス形態のＷＴまたは突然変異体ＭＴＤＨ（Ｗ３９４ＡまたはＷ４０１Ａ、マウスにおいて対応する突然変異は、Ｗ３９１Ａ、Ｗ３９８Ａである）は、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−マウスからの乳房腫瘍内で安定して発現した。ＭＴＤＨ突然変異体Ｗ３９４ＡまたはＷ４０１Ａは、ＳＮＤ１と相互作用する能力を完全に喪失し（図２３Ａ）、ＭＴＤＨのＳＮＤ１相互作用残基が、マウスとヒトとの間で良好に保存されることを示唆する。機能的に、生体外マンモスフェア形成アッセイは、突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞が、ＷＴ ＭＴＤＨで再構成されたものと比較して、著しく少数の塊を形成したことを示した（図２３Ｂ）。ＭＴＤＨ突然変異が、生体内で腫瘍形成に影響を及ぼすことを検査するために、ＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞を、ＷＴレシピエントマウスの乳房脂肪体に同所的に移植した。制限数の細胞が注入されたときに、突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞が、低減された腫瘍発生率によって明らかにされるように（図２３Ｃ）、実質的に少ない腫瘍開始細胞を含むことが見出された。さらに、突然変異体ＭＴＤＨで再構成されたＰｙＭＴ；Ｍｔｄｈ−／−腫瘍細胞によって形成された腫瘍のサイズは、ＷＴ ＭＴＤＨで再構成されたものよりもはるかに小さかった（図２３Ｄ〜Ｅ）。これらの結果は、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用が、ＭＴＤＨの腫瘍形成促進活性に必須であることを明示する。
ＭＴＤＨ結合欠乏性ＳＮＤ１突然変異体は、腫瘍促進において不活性であった：ＭＴＤＨ結合のためのＳＮＤ１内の十分に定義されたポケット及び腫瘍開始におけるこの相互作用の役割は、ＳＮＤ１内のタンパク質ポケットが、癌の新規の治療標的を表すことを示唆する。上で明示されるように、ＳＮＤ１のノックダウン（ＫＤ）は、ＰｙＭＴ／Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞の腫瘍開始活性を障害し、ＳＮＤ１の腫瘍促進的役割を支持する（Ｗａｎら、２０１４）。現行研究において、ＷＴまたは突然変異体ＳＮＤ１のｓｈＲＮＡ抵抗性構成体（Ｆ２５０ＡまたはＲ２５５Ｅ）を、ＳＮＤ１−ＫＤ ＰｙＭＴ／Ｍｔｄｈ＋／＋腫瘍細胞内で安定して発現させ、腫瘍開始活性に対するそれらの効果を生体外及び生体内で試験した。ＳＮＤ１突然変異は、ＭＴＤＨとの相互作用をほぼ完全に排除した（図２４Ａ）。ＳＮＤ１突然変異体は、生体外マンモスフェアアッセイにおいて形成された塊の数のいかなる増加にもほとんどつながらなかったが、ＷＴ ＳＮＤ１は、対照と比較して、塊の数を２倍より多く増加させる（図２４Ｂ）。レシピエントマウスの乳房脂肪体への細胞の移植後に、ＷＴ ＳＮＤ１は、腫瘍発生率及び総腫瘍量によって反映されるように、腫瘍開始及び腫瘍成長を顕著に促進したが、ＳＮＤ１突然変異体は、ごくわずかな効果を呈した（図２４Ｄ）。これらの結果は、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用が、腫瘍促進に重要であり、ＳＮＤ１内のＭＴＤＨ結合ポケットの両方が、この活性に必須であるという我々の結論をさらに支持する。
ＳＮＤ１結合欠乏性ＭＴＤＨ突然変異体は、ストレス下でＳＮＤ１を安定させることができなかった：これらの最近の研究は、ＭＴＤＨが、ストレス条件下でＳＮＤ１タンパク質の安定性を増強することにおいて主要な役割を果たし、発癌ストレスまたは他のストレス下で癌細胞におけるＳＮＤ１の生存促進的役割に寄与し得ることを示唆する（Ｇａｏら、２０１０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００９；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＳｃａｄｄｅｎ、２０１２）。この見解を実証するために、熱ショック下でのＳＮＤ１の細胞安定性に対するＭＴＤＨ突然変異の効果を検査し、その条件下で、ＳＮＤ１が細胞生存に重要であることが明示された（Ｇａｏら、２０１０；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＳｃａｄｄｅｎ、２０１２）。単独で過剰発現したとき、ＨＡ−ＳＮＤ１の細胞レベルは、４５℃で急速に低減し、半減期は約３０分であった（図２５）。ＷＴ Ｍｙｃ−ＭＴＤＨとの共発現は、ＨＡ−ＳＮＤ１の細胞安定性を４５℃で増補し、半減期は３時間を超えて延長されたが、ＭＴＤＨ突然変異体、Ｗ３９４Ａ、及びＷ４０１Ａのいずれかの共発現は、熱ショック下でＨＡ−ＳＮＤ１を安定させることができなかった。この結果は、ＳＮＤ１の細胞安定性を促進することにおけるＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の役割を支持し、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１のタンパク質レベルが、ヒト乳癌において正に相関するという我々の最近の観察と一致する（上記を参照されたい）。
論考
ＭＴＤＨは、種々の癌型におけるその広範な関わりから近年益々多くの関心を集めており、ＳＮＤ１は、ＭＴＤＨと同様の腫瘍促進機能を有するＭＴＤＨ結合タンパク質として記録された（Ｅｍｄａｄら、２０１３；Ｗａｎ及びＫａｎｇ、２０１３）。しかしながら、その相互作用の構造基盤及び機能的重要性は依然として明らかでない。我々の研究は、本明細書においてＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の最小相互作用モチーフ／ドメインをマップし、それらの複合体の高解像度結晶構造を判定した。構造解析及び構造誘導性機能研究は、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面が、乳房腫瘍開始におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の活性に必須であり、新規の癌治療標的として有望な構造特徴を内包することを示した。加えて、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の構造は、この相互作用によって架橋される癌細胞シグナル伝達に関するさらなる理解のために重要なプラットフォームを提供する。
本研究において特徴付けられるＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面は、それらの相互作用の分子基礎に関する主要な洞察を提供する。必須のＳＮＤ１結合モチーフは、以前に、ＭＴＤＨの２つの異なる領域、配列番号１の残基３６４〜４７０（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）及び配列番号１の残基１０１〜２０５（Ｙｏｏら、２０１１）にマップされた。本明細書における研究は、ＭＴＤＨの短い１１残基ペプチドモチーフ（配列番号１の残基３９３〜４０３）を、Ｂｌａｎｃｏらによって特定された断片内に位置する一次ＳＮＤ１結合モチーフとして定義した（Ｂｌａｎｃｏら、２０１１）。この界面におけるＭＴＤＨまたはＳＮＤ１のいずれかにおける突然変異は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び乳房腫瘍細胞の両方において全長タンパク質の相互作用を排除し、この界面がＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の優位結合部位であるという見解を支持する。
癌促進におけるＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面の顕著な機能は、この界面が、癌治療のための有用な戦略であり得ることを示唆する。加えて、我々の結果は、この界面を標的とするための重要な方法を示唆する。ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の相互作用は、ＭＴＤＨ内のＷ３９５とＷ４０１との間のｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触、及び小分子阻害剤の結合に好ましいＳＮＤ１内の２つの十分に定義された疎水性ポケットによって支配される。重要なことに、いずれかの結合ポケットにおけるＭＴＤＨまたはＳＮＤ１における突然変異は、乳房腫瘍開始の促進におけるそれらの活性を排除し、したがって、両方のＳＮＤ１ポケットを同時に標的とすることを魅力的な治療手法にする。標的とするためのこの界面の他の好ましい特徴としては、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との間の容易に反転可能な結合が挙げられ、この相互作用が特定の阻害剤によって反転され得ることを示唆する。さらに、ＭＴＤＨ結合ポケットは、ＳＮ１／２ドメイン内で固有に進化するが、他のＯＢ折り畳みスーパーファミリータンパク質またはＳＮＤ１内の他のＳＮドメインにおいて不在であり、ＭＴＤＨ結合を遮断するために高度に特異的な化合物を開発する期待の根底にある。
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１界面の構造は、この相互作用によって調整される細胞シグナル伝達を理解するための重要なプラットフォームを提供する。ＳＮ１／２とＳＮ３／４ドメインとの間の構造類似性にも関わらず、ＳＮ３／４は、ＭＴＤＨ結合に必要な固有のポケット及び表面特徴を有しない。さらに、ＳＮ１／２及びＳＮ３／４内に突出構造を内包する丘状表面は明らかに異なり、異なる結合特異性を付与することが予想される。ＳＮ３／４−ＴＳＮ５ドメインを含むＳＮＤ１断片内のドメインは、三日月形の線形配向で配置されることが示された（Ｌｉら、２００８）。ＦＲＥＴ解析は、全長ＳＮＤ１の末端間の距離が、ＳＮ３／４−ＴＳＮ５断片のものよりも遠いことを示し、複数のＳＮＤ１ドメインが、線形様式で配置されることを示唆する。このアーキテクチャは、異なる結合パートナーが、下流シグナル伝達のためにコヒーレント配向で組織化されるのを可能にする可能性がある。驚くべきことに、ＭＴＤＨは、むしろ平坦であり、反対側に位置する丘状表面とは明らかに異なるＳＮＤ１の表面に対する短いペプチドを介してＳＮＤ１と連携する。この単純な結合形態は、癌促進におけるこの界面の頑強な機能に対して明確な対照であり、この界面によって媒介される下流シグナル伝達が、癌におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１の多面的役割に寄与し得ることを示唆する。単一膜貫通ドメインの他に、約５００個の残基を有するＭＴＤＨの配列全体が主に障害されることに留意することが重要であり、ＭＴＤＨが、多くのシグナル伝達タンパク質と相互作用し得るという可能性を示唆する。これらの特徴は、ＡＫＡＰ（キナーゼアンカータンパク質（Ｇｅｌｍａｎ、２０１２）などのシグナル伝達足場タンパク質のものと類似し、ＭＴＤＨが、シグナル伝達足場タンパク質として機能し得ることを示唆する。ＳＮＤ１と一緒に、ＭＴＤＨは、ＳＮＤ１及びＭＴＤＨの複数の相互作用ドメイン／モチーフによって組織化される種々のシグナル伝達分子を介して細胞シグナル伝達を媒介し得る。
ストレス下でのＭＴＤＨ結合に対するＳＮＤ１安定性の信頼性は、癌におけるＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の役割についての別の説明を提供する。この結果もまた、ＭＴＤＨ及びＳＮＤ１が、腫瘍組織内で同時に上昇したという観察と一致する（上記及びＷａｎｇら、２０１２を参照されたい）。しかしながら、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用が、ストレス下でどのようにＳＮＤ１安定性に寄与するかは、依然として特定されていない。現行の生体外研究は、ＭＴＤＨ結合が、ＳＮ１／２ドメインの熱安定性またはプロテアーゼ開裂に対するそれらの感受性に最小の効果を有していたことを明示し、ＭＴＤＨ結合が、ＳＮＤ１を直接安定させない場合があることを示唆する。ＳＮＤ１の細胞安定性が、他の生体分子の動員に依存するかどうかを解読するために、さらなる研究が必要とされる。
実施例４−野生型ＭＴＤＨペプチドは、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用を著しく遮断する。
２９３Ｔ細胞を、ＨＡ−ＳＮＤ１及びＭＹＣ−ＭＴＤＨと同時形質移入した。４８時間後に細胞を収集し、免疫沈降アッセイに供した。図２６Ａ及び図２６Ｂを参照されたい。細胞溶解物を、抗ＨＡ抗体またはＩｇＧで終夜インキュベートした後、タンパク質Ａ／Ｇビーズで２時間インキュベートして、ＨＡ−ＳＮＤ１タンパク質をプルダウンした。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、５つの分画に分割した。各分画を、緩衝液または示されるペプチド（すなわち、ペプチド−ｗｔ（ＰＮＳＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮＷ、配列番号１６）；ペプチド−３９４Ａ（ＰＮＳＤＡＮＡＰＡＥＥＷＧＮＷ、配列番号１７）；ペプチド−４０１Ａ（ＰＮＳＤＷＮＡＰＡＥＥＡＧＮＷ、配列番号１８）、及びペプチド−ＭＴ（ＰＮＳＤＡＮＡＰＡＥＥＡＧＮＷ、配列番号１９）で３０分間溶出した。
溶出分画及びビーズを、ウェスタンブロットのために収集した。（図２６Ｃ及び２６Ｄ）細胞溶解物を、６つの分画に分割した。それらの分画のうちの１つを、ＩｇＧでインキュベートし、残りを抗ＨＡ抗体、プラス緩衝液または示されるペプチドのいずれかでインキュベートした。２４時間後に溶解物をタンパク質Ａ／Ｇビーズでインキュベートし、次にそれらのビーズを洗浄緩衝液によって洗浄した。５０μＭのペプチドを、全てのアッセイで使用した。
相互作用中断効果は、乳癌細胞系の内在性免疫沈降（ＩＰ）によって確認された。手短に言えば、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの細胞溶解物を収集し、ＩＰアッセイに供した。結果を、図２７Ａ及び図２７Ｂに提供する。図２７Ａ−細胞溶解物を、抗ＳＮＤ１抗体またはＩｇＧで終夜インキュベートした後、タンパク質Ａ／Ｇビーズで２時間インキュベートして、内在性ＳＮＤ１タンパク質をプルダウンした。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、５つの分画に分割した。各分画を、緩衝液または示されるペプチドで３０分間溶出した。溶出分画及びビーズを、ＷＢのために収集した。図２７Ｂ−細胞溶解物を５つの分画に分割し、抗ＳＮＤ１抗体プラス緩衝液または示されるペプチドのいずれかでインキュベートした。２４時間後に溶解物をタンパク質Ａ／Ｇビーズでインキュベートし、次にそれらのビーズを洗浄した後、ウェスタンブロットを行った。
上記の結果は、野生型ＭＴＤＨペプチドが、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用を有効に遮断し得ることを示した。単一点突然変異Ｗ４０１Ａを含むペプチドは、野生型ペプチドの有効性を半減させた。単一点突然変異Ｗ３９４Ａまたは二重点突然変異を挿入することが、ＭＴＤＨとＳＮＤ１との相互作用を中断することにおいて効果を有しないことも観察された。
実施例５−ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用を保持する配列変化
ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の高解像度結晶構造は、ブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）の延長されたタンパク質溝に結合するためのメタドヘリン（ＭＴＤＨ）の１１残基ペプチドモチーフを明らかにした。この結合欠乏性界面におけるＭＴＤＨ及びＳＮＤ１突然変異体は、癌促進における活性を低減し、癌治療を開発するための新規標的としてのこの界面の重要性を確立する。この界面におけるペプチドモチーフ及びそれらの誘導体は、この相互作用を遮断するための潜在的阻害剤である。ＳＮＤ１結合を保持するＳＮＤ１との界面におけるＭＴＤＨペプチドの配列変化を検証するために、構造誘導型突然変異解析を、ＳＮＤ１内の２つの十分に定義されたポケットに結合する２つの残基、Ｗ３９４及びＷ４０１以外の残基に対して行った。どの突然変異も、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１結合に対して明らかな効果を有しない。これは、ペプチド及びペプチド模倣体阻害剤を設計する際に多大な柔軟性を提供し、そのような阻害剤を作製することにおける柔軟な化学的性質を可能にする。
実験手順
タンパク質調製：全ての構成体及び点突然変異を、標準ＰＣＲに基づくクローン化戦略を使用して生成した。手短に言えば、異なる境界及び突然変異体を有するＳＮＤ１及びＭＴＤＨは、それぞれＮ末端Ｈｉｓ８タグ及びＧＳＴタグを内包するｐＱｌｉｎｋベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）内でクローン化され、親和性タグ後にＴＥＶ開裂部位を有する。タンパク質は、大腸菌株ＤＨ５αにおいて２３℃で過剰発現した。ＳＮＤ１及びＳＮＤ１（１６〜３３９）−Ｌ２１−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７）の発現及び精製は、以前の刊行物（Ｌｉら、２００８）から修正された手順に従った。
ＧＳＴ媒介による滴定プルダウンアッセイ：約２０μｇのＧＳＴ−ＭＴＤＨ（３８６〜４０７、野生型及び異なる突然変異体）を、ＧＳＴタグを介して１０μＬのグルタチオン樹脂に結合した。この樹脂を、２００μＬアッセイ緩衝液（２５ｍＭ トリス、ＰＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＤＴＴ）で３回洗浄し、過剰な未結合のタンパク質を除去した。滴定濃度（１０、３、１、０．５、０．２５、０．１２μＭ）を有する１５μｇのＨｉｓ−ＳＮＤ１（１６〜３３９）を、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡとのアッセイ緩衝液中に懸濁された５００μＬ量の樹脂に添加した。この混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査する前に、５００μＬアッセイ緩衝液で２回洗浄し、クマシーブルー染色によって可視化した。
結果
ＳＮＤ１結合を保持するＭＴＤＨのアミノ酸配列変化：ペプチドモチーフ内の配列変化の程度は、ペプチド模倣体阻害剤を開発する化学的性質における柔軟性のレベルを表す。そのような可能性を検証するために、ＭＴＤＨ−ＳＮＤ１複合体の高解像度構造によって明らかにされたＭＴＤＨ−ＳＮＤ１相互作用の形態に基づいて、ＳＮＤ１との界面における、またはその付近のＭＴＤＨ残基に対するさらなる突然変異解析を行った。７つの残基に対する新規の突然変異を作製し、ＳＮ１／２ドメイン（配列番号２のアミノ酸１６〜３３９）を内包するＨｉｓ６−ＳＮＤ１とのそれらの結合親和性を、滴定プルダウンアッセイによって測定した（図２８）。全てのＭＴＤＨ突然変異体は、野生型ＭＴＤＨのそれの０．７〜１．３倍以内の結合親和性を付与した。Ｗ３９４及びＷ４０１は、これらの２つの残基に対する突然変異が、ＳＮＤ１との相互作用に対して強い影響を有することが以前に示されたため、この突然変異リストに含まれなかった。Ｗ３９４及びＷ４０１に対する限定された突然変異、例えば、Ｔｙｒ及びＰｈｅとの置換は、ＳＮＤ１に対する結合親和性の小分画を保持すると予想される。ＳＮＤ１結合を保持するためのこれら２つの残基に対する突然変異の耐性はほとんどない。本明細書及び以前の突然変異研究の集合結果は、ＳＮＤ１結合を保持するための、ＭＴＤＨの他の部位に対する突然変異の一般に大きな耐性を支持する。これは、ペプチド阻害剤及びペプチド模倣体阻害剤を設計することにおいて著しい柔軟性を提供する。
参照文献
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Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｓｉｍｉｎ，Ｋ．，Ｗｅｉｇｍａｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｍｉｋａｅｌｉａｎ，Ｉ．，Ｕｓａｒｙ，Ｊ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｐ．，Ａｓｓｅｆｎｉａ，Ｓ．，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ８，Ｒ７６．
Ｈｕ，Ｇ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｑ．，Ｗｅｉ，Ｙ．，Ｂｌａｎｃｏ，Ｍ．Ａ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｍ．，Ａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｈａｆｆｔｙ，Ｂ．Ｇ．，ａｎｄ Ｋａｎｇ，Ｙ．（２００９）．ＭＴＤＨ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ８ｑ２２ ｇｅｎｏｍｉｃ ｇａｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｐｏｏｒ−ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５，９−２０．
Ｋｏｕｒｏｓ−Ｍｅｈｒ，Ｈ．，Ｂｅｃｈｉｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｌｏｒａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｌｉｔｔｌｅｐａｇｅ，Ｌ．Ｅ．，Ｅｇｅｂｌａｄ，Ｍ．，Ｅｗａｌｄ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｉ，Ｓ．Ｙ．，Ｈｏ，Ｉ．Ｃ．，ａｎｄ Ｗｅｒｂ，Ｚ．（２００８）．ＧＡＴＡ−３ ｌｉｎｋｓ ｔｕｍｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｌｕｍｉｎａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １３，１４１−１５２．
Ｌｅｎｔｏ，Ｗ．，Ｃｏｎｇｄｏｎ，Ｋ．，Ｖｏｅｒｍａｎｓ，Ｃ．，Ｋｒｉｔｚｉｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｙａ，Ｔ．（２０１３）．Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ５．
Ｌｉ，Ｙ．，Ｗｅｌｍ，Ｂ．，Ｐｏｄｓｙｐａｎｉｎａ，Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｃｈａｍｏｒｒｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｒｏｗｌａｎｄｓ，Ｔ．，Ｅｇｅｂｌａｄ，Ｍ．，Ｃｏｗｉｎ，Ｐ．，Ｗｅｒｂ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００，１５８５３−１５８５８．
Ｍａｎｉ，Ｓ．Ａ．，Ｇｕｏ，Ｗ．，Ｌｉａｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｅａｔｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ａｙｙａｎａｎ，Ａ．，Ｚｈｏｕ，Ａ．Ｙ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｍ．，Ｒｅｉｎｈａｒｄ，Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １３３，７０４−７１５．
Ｍｅｎｇ，Ｘ．，Ｚｈｕ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｂｒａｃｈｏｖａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｌｅｓｌｉｅ，Ｋ．Ｋ．（２０１２）．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｍｅｔａｄｈｅｒｉｎ（ＭＴＤＨ） ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ ｂｙ ａｃｔｉｎｇ ａｓ ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７，４４８５−４４９１．
Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｏｒｌｉｅ，Ｔ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎ，Ｍ．，Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｓ．，Ｒｅｅｓ，Ｃ．Ａ．，Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｅｎ，Ｈ．，Ａｋｓｌｅｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０６，７４７−７５２．
Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ，Ｍ．，Ｖａｉｌｌａｎｔ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．，Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．，Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｌａｂａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｉｓｖａｄｅｒ，Ｊ．Ｅ．（２００６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，８４−８８．
Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｆ．，Ｖａｃｕｌｏｖａ，Ａ．，Ｓｍｅｒｔｅｎｋｏ，Ａ．Ｐ．，Ｓａｖｅｎｋｏｖ，Ｅ．Ｉ．，Ｇｏｌｏｖｋｏ，Ａ．，Ｍｉｎｉｎａ，Ｅ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｂ．Ｓ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎｉｅｔｏ，Ｓ．，Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｖａｌｉｎｅｖａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｔｕｄｏｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｓ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｇｒａｄｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １１，１３４７−１３５４．
Ｖａｉｌｌａｎｔ，Ｆ．，Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｌａｂａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ，Ｍ．，Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｎ．Ｃ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｉｓｖａｄｅｒ，Ｊ．Ｅ．（２００８）．Ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｍａｒｋｅｒ ＣＤ６１／ｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８，７７１１−７７１７．
ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｅ，Ｙ．Ｄ．，ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｌ．Ｊ．，Ｄａｉ，Ｈ．，Ｈａｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｖｏｓｋｕｉｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．Ｊ．，Ｐｅｔｅｒｓｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃ．，Ｍａｒｔｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ａ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４７，１９９９−２００９．
Ｖａｎｈａｒａｎｔａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２０１３）．Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｒａｉｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２４，４１０−４２１．
Ｗａｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｋａｎｇ，Ｙ．（２０１３）．Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＡＥＧ−１／ＭＴＤＨ／ＬＹＲＩＣ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ １２０，１１３−１３４．
Ｗａｎ，Ｌ．，Ｐａｎｔｅｌ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋａｎｇ，Ｙ．（２０１３）．Ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ： ｍｏｖｉｎｇ ｎｅｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９，１４５０−１４６４．
Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｃａｄｄｅｎ，Ａ．Ｄ．（２０１２）．Ｔｕｄｏｒ−ＳＮ ａｎｄ ＡＤＡＲ１ ａｒｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ．Ｒｎａ １８，４６２−４７１．
Ｙｉｎ，Ｙ．，Ｂａｉ，Ｒ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｅｉｌｄｅｃｋ，Ｍ．Ｅ．，Ｘｉｅ，Ｚ．，Ｋｏｐｅｌｏｖｉｃｈ，Ｌ．，ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｒ．Ｉ．（２００５）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｄ ＤＭＢＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ４４，４２−５０．
Ｙｏｏ，Ｂ．Ｋ．，Ｓａｎｔｈｅｋａｄｕｒ，Ｐ．Ｋ．，Ｇｒｅｄｌｅｒ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．，Ｅｍｄａｄ，Ｌ．，Ｂｈｕｔｉａ，Ｓ．，Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｌ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．，ａｎｄ Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．（２０１１）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３，１５３８−１５４８．
Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｐｏｕｓｔｏｖｏｉｔｏｖ，Ｍ．，Ｓｔｒａｓｎｅｒ，Ａ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ，Ｎ．，Ｇｈａｓｓｅｍｉａｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋａｒｉｎ，Ｍ．（２０１３ａ）．Ａ ＮＩＫ−ＩＫＫａｌｐｈａ ｍｏｄｕｌｅ ｅｘｐａｎｄｓ ＥｒｂＢ２−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｐ２７／Ｋｉｐ１．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２３，６４７−６５９．
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｃｌａｅｒｈｏｕｔ，Ｓ．，Ｐｒａｔ，Ａ．，Ｄｏｂｒｏｌｅｃｋｉ，Ｌ．Ｅ．，Ｐｅｔｒｏｖｉｃ，Ｉ．，Ｌａｉ，Ｑ．，Ｌａｎｄｉｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，Ｓｃｈｉｆｆ，Ｒ．，Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３ｂ）．Ａ ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｅｔｈｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ，ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３，４８８５−４８９７．
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＮＭ，ＤｅＭａｙｏ Ｆ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄ ＭＪ，Ｍｅｄｉｎａ Ｄ，Ｔｉｌｌｅｙ ＷＤ，Ａｓｐｉｎａｌｌ ＪＯ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１９９５；９２：３４３９−４３．
Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲ，Ｂａｒｒｉｏｓ ＲＪ，Ｆｏｓｔｅｒ ＢＡ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＮＭ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ＴＲＡＭＰ ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ．１９９９；２：７０−５．
Ｋａｐｌａｎ−Ｌｅｆｋｏ ＰＪ，Ｃｈｅｎ ＴＭ，Ｉｔｔｍａｎｎ ＭＭ，Ｂａｒｒｉｏｓ ＲＪ，Ａｙａｌａ ＧＥ，Ｈｕｓｓ ＷＪ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００３；５５：２１９−３７．
Ｈｕｒｗｉｔｚ ＡＡ，Ｆｏｓｔｅｒ ＢＡ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＮＭ，Ｋｗｏｎ ＥＤ．Ｔｈｅ ＴＲＡＭＰ ｍｏｕｓｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ／ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｅ Ｃｏｌｉｇａｎ ［ｅｔ ａｌ］．２００１；Ｃｈａｐｔｅｒ ２０：Ｕｎｉｔ ２０ ５．
Ｃｈｉａｖｅｒｏｔｔｉ Ｔ，Ｃｏｕｔｏ ＳＳ，Ｄｏｎｊａｃｏｕｒ Ａ，Ｍａｏ ＪＨ，Ｎａｇａｓｅ Ｈ，Ｃａｒｄｉｆｆ ＲＤ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００８；１７２：２３６−４６．
Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲ，Ｂａｒｒｉｏｓ ＲＪ，Ｍｏｒｔｏｎ ＲＡ，Ｂｏｙｃｅ ＢＦ，ＤｅＭａｙｏ ＦＪ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９６；５６：４０９６−１０２．
Ｆｏｓｔｅｒ ＢＡ，Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲ，Ｋｗｏｎ ＥＤ，Ｍａｄｉａｓ Ｃ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＮＭ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ（ＴＲＡＭＰ） ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９７；５７：３３２５−３０．
Ｔａｙｌｏｒ ＢＳ，Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｎ，Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓ Ｈ，Ｇｏｐａｌａｎ Ａ，Ｘｉａｏ Ｙ，Ｃａｒｖｅｒ ＢＳ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ．２０１０；１８：１１−２２．
Ｄｉｎｇ ＺＨ，Ｗｕ ＣＪ，Ｊａｓｋｅｌｉｏｆｆ Ｍ，Ｉｖａｎｏｖａ Ｅ，Ｋｏｓｔ−Ａｌｉｍｏｖａ Ｍ，Ｐｒｏｔｏｐｏｐｏｖ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｙｉｅｌｄｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｎｅ Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１２；１４８：８９６−９０７．
Ｌｉｕ Ｙ，Ｓｕ ＺＷ，Ｌｉ Ｇ，Ｙｕ ＣＹ，Ｒｅｎ ＳＬ，Ｈｕａｎｇ ＤＨ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｄｈｅｒｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｗｏｒｓｅ ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ａｎｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１３；１３３：６７１−９．
Ｙｕ Ｃ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｔａｎ Ｈ，Ｌｉ Ｇ，Ｓｕ Ｚ，Ｒｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｄｈｅｒｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｖｉａ ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ．２０１４；３４３：２５８−６７．
Ｚｈｕ Ｋ，Ｄａｉ Ｚ，Ｐａｎ Ｑ，Ｗａｎｇ Ｚ，Ｙａｎｇ ＧＨ，Ｙｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｄｈｅｒｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；１７：７２９４−３０２．
Ｙｏｏ ＢＫ，Ｅｍｄａｄ Ｌ，Ｓｕ ＺＺ，Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ Ａ，Ｃｈｉａｎｇ ＤＹ，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ＮＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｅｎｅ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９；１１９：４６５−７７．
Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．，Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．（１９９７）．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６，３０７−３２６．
Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｐ．Ｖ．，Ｂｕｎｋｏｃｚｉ，Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．，Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，Ｅｃｈｏｌｓ，Ｎ．，Ｈｅａｄｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｋａｐｒａｌ，Ｇ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．ＰＨＥＮＩＸ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２１３−２２１．
ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．（２００７）．Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４０，６５８−６７４．
Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｂａｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，２３５−２４２．
Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ｃｏｏｔ： ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２１２６−２１３２．
Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｃａｄｄｅｎ，Ａ．Ｄ．（２０１２）．Ｔｕｄｏｒ−ＳＮ ａｎｄ ＡＤＡＲ１ ａｒｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ．Ｒｎａ １８，４６２−４７１．
Ｇａｏ，Ｘ．，Ｇｅ，Ｌ．，Ｓｈａｏ，Ｊ．，Ｓｕ，Ｃ．，Ｚｈａｏ，Ｈ．，Ｓａａｒｉｋｅｔｔｕ，Ｊ．，Ｙａｏ，Ｘ．，Ｙａｏ，Ｚ．，Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，Ｏ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｊ．（２０１０）．Ｔｕｄｏｒ−ＳＮ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｗｉｔｈ Ｇ３ＢＰ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８４，３５２５−３５３２．
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Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅ ＨＪ，Ｇｉｒｌｉｎｇ Ｊ，Ｗａｒｒｅｎ ＡＹ，Ｍｉｌｌｓ ＩＧ，Ｓａｈａｄｅｖａｎ Ｋ，Ｌｅｕｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＬＹＲＩＣ／ＡＥＧ−１ ｉｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｂｙ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５：３００３−１３．
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Ｓｔｒｙｋｅ Ｄ，Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｍ，Ｈｕａｎｇ ＣＣ，Ｊｏｈｎｓ ＳＪ，Ｋｉｎｇ ＬＡ，Ｈａｒｐｅｒ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．ＢａｙＧｅｎｏｍｉｃｓ： ａ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３；３１：２７８−８１．
Ｓｕ ＺＺ，Ｋａｎｇ ＤＣ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｐｅｋａｒｓｋａｙａ Ｏ，Ｃｈａｏ Ｗ，Ｖｏｌｓｋｙ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＩＶ−１ ｏｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ＨＩＶ−１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｒａｐｉｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＲａＳＨ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００２；２１：３５９２−６０２．
Ｂｒｉｔｔ ＤＥ，Ｙａｎｇ ＤＦ，Ｙａｎｇ ＤＱ，Ｆｌａｎａｇａｎ Ｄ，Ｃａｌｌａｎａｎ Ｈ，Ｌｉｍ ＹＰ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＹＲＩＣ，ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４；３００：１３４−４８．
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Claims (13)

  1. 癌を有する対象における腫瘍成長の進行を低減するか、または転移を阻害するための薬学的組成物であって、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）とブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）との間の相互作用を妨害するペプチド阻害剤を含む、薬学的組成物、ここで、前記ペプチド阻害剤は、ヒトＳＮＤ１（配列番号２）の残基１６〜３３９内の領域に結合する；前記ペプチド阻害剤は、ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）のアミノ酸配列またはその変異型を含み、前記変異型は、Ｄ３９３、Ｎ３９５、Ａ３９６、ＰＡＥ３９７−３９９、Ｅ３９９、Ｅ４００、およびＮ４０３からなる群から選択される位置における１つまたは２つの変異を有する；および、前記ペプチド阻害剤は、約１１-約２２アミノ酸長である。
  2. 前記ペプチド阻害剤が、ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記ペプチド阻害剤が、ｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７内のペプチド、ｉｉ）配列番号１の残基３９０〜４０３内のペプチド、ｉｉｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７を含むペプチド、ｉｖ）配列番号１の残基３９３〜４０３を含むペプチド、およびｖ）配列番号１の残基３９０〜４０３を含むペプチドからなる群から選択されるＭＴＤＨペプチドである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  4. 前記癌が、乳癌または前立腺癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  5. 前記対象が、ヒト対象である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  6. 前記ペプチド阻害剤が、融合タンパク質の一部である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ペプチド阻害剤が、Ｆｃドメインに融合される、請求項６に記載の方法。
  8. 対象における癌を治療するための薬学的組成物であって、（１）メタドヘリン（ＭＴＤＨ）とブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有１（ＳＮＤ１）との間の相互作用を妨害するペプチド阻害剤、ここで、前記ペプチド阻害剤は、ヒトＳＮＤ１（配列番号２）の残基１６〜３３９内の領域に結合する；前記ペプチド阻害剤は、ＤＷＮＡＰＡＥＥＷＧＮ（配列番号５）のアミノ酸配列またはその変異型を含み、前記変異型は、Ｄ３９３、Ｎ３９５、Ａ３９６、ＰＡＥ３９７−３９９、Ｅ３９９、Ｅ４００、およびＮ４０３からなる群から選択される位置における１つまたは２つの変異を有する；および前記ペプチド阻害剤は、約１１-約２２アミノ酸長である、及び（２）薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  9. 前記ペプチド阻害剤が、ＸＷＸＸＸＸＸＸＷＸＸ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
  10. 前記ペプチド阻害剤が、ｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７内のペプチド、ｉｉ）配列番号１の残基３９０〜４０３内のペプチド、ｉｉｉ）配列番号１の残基３８６〜４０７を含むペプチド、ｉｖ）配列番号１の残基３９３〜４０３を含むペプチド、およびｖ）配列番号１の残基３９０〜４０３を含むペプチドからなる群から選択される、ＭＴＤＨペプチドである、請求項９に記載の薬学的組成物。
  11. 前記ペプチド阻害剤が、融合タンパク質の一部である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  12. 前記ペプチド阻害剤が、Ｆｃドメインに融合される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
  13. 前記ペプチド阻害剤が、細胞透過性ペプチドに複合されるか、またはそれと混和される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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