WO2014023869A2 - Aplicacion terapéutica de agentes inhibidores de cd44 frente a la leucemia linfoblástica aguda (all) humana - Google Patents

Aplicacion terapéutica de agentes inhibidores de cd44 frente a la leucemia linfoblástica aguda (all) humana Download PDF

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María Luisa TORIBIO GARCÍA
Marina GARCÍA PEYDRÓ
Francisco SÁNCHEZ MADRID
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad Autónoma de Madrid
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention is part of the chemistry and pharmacy sector, in particular it refers to the therapeutic use of agents inhibiting the function of the CD44 molecule for the treatment and / or prevention of human acute lymphoblastic leukemia (ALL), with special mention to the subtype of acute lymphoblastic T leukemia (T-ALL).
  • ALL human acute lymphoblastic leukemia
  • T-ALL subtype of acute lymphoblastic T leukemia
  • ALL is an aggressive tumor that constitutes the most common pediatric cancer.
  • B-ALL ALL B-ALL ALL
  • T-ALL The subtype T-ALL constitutes 10-15% of pediatric ALLs and 25% of adults and their pathogenesis is less known.
  • Conventional treatment with chemotherapy of T-ALL has a high frequency of relapses and the 5-year survival in these cases is less than 30% (Aifantis et al., 2008).
  • SCIs leukemia-initiating cells
  • CD44 is overexpressed in some types of B lymphocyte leukemias, such as B-ALL, where it appears to be a marker of SCIs associated with poor prognosis and relapse (Hertweck et al. 201 1; Coustan-Smith et al., 201 1).
  • CD44 could also be a therapeutic intervention target in B lymphocyte leukemia (Giannopoulos et al., 2009; Herishanu et al. 201 1; Buggins et al. 201 1).
  • this possibility has not been formally demonstrated.
  • T-ALL the SCIs are included in the population of immature T lymphoblasts that infiltrate the BM.
  • T-ALL SCIs originate from the appearance of oncogenic mutations in various signaling molecules that are involved in the development of T lymphocytes in the thymus. Among them, activating mutations in the NOTCH1 gene are frequent in more than 50% of human T-ALL (Weng et al. 2004). These mutated forms (specifically ICN1) are capable of generating in the mouse a leukemia similar to human T-ALL (Pear et al., 1996), which reinforces the proto-oncogenic function of Notchl in vivo
  • CD44 is overexpressed in the SCIs of several myeloid and lymphoid B hematologic tumors (Liu and Jiang, 2006; Hertweck et al. 2011), the possibility that CD44 is a molecule of relevance in the SCIs of T-ALLs does not It has been contemplated to date.
  • the main reason for the lack of attention towards CD44 in T-ALL is due to the fact that CD44 must be a functionally dispensable molecule in the T lymphocyte lineage, since its expression decreases progressively until it disappears from the membrane during development normal in the thymus (Márquez et al. 1995). Since the development of T lymphocytes is dependent on the activation of Notchl (Radtke et al. 1999; Pui et al. 1999), CD44 is not expected to be induced in leukemias of the T lineage, especially those where Notchl is active ( Pear et al., 1996; Weng et al. 2004).
  • Notchl-dependent human T-ALL models Due to the lack of Notchl-dependent human T-ALL models in vivo, it has not been possible to formally analyze whether aberrant activation of Notchl (specifically ICN1) in human hematopoietic T-lymphocyte progenitors is capable of regulating expression of molecules of functional relevance for T-ALL SCIs, such as CD44 or others. This information is essential, since it would allow the development of therapeutic strategies against human T-ALL based on inhibitors of these molecules. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention refers to an inhibitor of the function of the CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1, for use in medicine, in particular for the preparation of a pharmaceutical composition or medicament useful for the prevention and / or treatment of acute human lymphoblastic leukemia.
  • human acute lymphoblastic leukemia is an acute lymphoblastic T leukemia (T-ALL).
  • the inhibitor agent described above characterized in that it is capable of inhibiting the grafting and / or expansion of human initiating cells of acute human lymphoblastic leukemia in the bone marrow of a patient.
  • the inhibitor agent described above characterized in that said agent is an antibody or a fragment thereof, capable of specifically and / or selectively recognizing the CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1.
  • the antibody is monoclonal.
  • the inhibitor agent in another preferred embodiment, characterized in that said agent is a gene silencing vector comprising at least one nucleotide sequence complementary to the CD44 gene with SEQ ID No. 1, capable of silencing his expression.
  • the vector is lentiviral.
  • said agent is a blocking agent of a CD44 protein ligand encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1.
  • said ligand It is hyaluronic acid.
  • the present invention also refers to a pharmaceutical composition and / or medicament characterized by or comprising at least one inhibitor agent described above.
  • said pharmaceutical composition and / or medicament is characterized in that it comprises a therapeutically acceptable amount of at least one vehicle, and / or an excipient, and / or an additive.
  • the present invention also refers to a kit for the treatment and / or prevention of acute human lymphoblastic leukemia characterized / or comprising at least one inhibitor agent defined above, or at least one pharmaceutical composition and / or medication defined / or above.
  • the present invention also relates to a method of prevention and / or treatment of acute human lymphoblastic leukemia which comprises administering to the patient a therapeutically effective amount of an inhibitor agent defined above, or a pharmaceutical composition and / or defined medication. above, or a kit defined above.
  • the present invention also refers to a model of generation of pre-leukemic cells of human T-ALL leukemia in mice induced by ICN1.
  • said cell model is characterized in that said cells are aberrant human T lymphocytes with double positive CD4 + CD8 + pre-leukemic phenotype with high levels of expression of the CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1.
  • the present invention also refers to a mouse xenotransplant model characterized in that it comprises a bone marrow graft of aberrant human T lymphocytes with double positive CD4 + CD8 + pre-leukemic phenotype with high levels of expression of the CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1.
  • the present invention also refers to a method of obtaining the mouse xenotransplant model defined above, characterized in that it comprises the following essential steps: i) transplant human hematopoietic progenitors transduced with the ICN1 oncogene into at least one immunodeficient mouse; and ii) generate aberrant T lymphocytes with CD4 + CD8 + double positive pre-leukemic phenotype with high levels of expression of the CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1.
  • the present invention also refers to the use of the cell model described above, or of the mouse xenotransplantation model described above, for the study of early molecular alterations that are associated with the generation of cells that initiate and maintain leukemia.
  • Human T-ALL as well as for the pre-clinical study of possible therapeutic agents.
  • CD44 The CD44 protein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1, hereafter referred to as "CD44", is identified as a Notchl transcriptional target in human hematopoietic progenitors.
  • SEQ ID No. 1 corresponds to ENSG00000026508, and identifies the nucleotide sequence of the CD44 gene in Homo sapiens from 5 kilobases "upstream" of the transcription initiation site to the first exon coding.
  • mice models of human T-ALL pre-leukemic cells are generated in mice. Specifically aberrant human T cells with pre-leukemic phenotype CD4 + CD8 + double positive (DP) with high levels of CD44 expression (CD44 hl ), in the BM of RAG-2 " ' " x and c ⁇ ' ⁇ xenotransplanted mice human hematopoietic progenitors (of umbilical cord blood or neonatal thymus) in which the oncogenic form ICN1 of Notchl has been expressed by retroviral transduction.
  • DP pre-leukemic phenotype CD4 + CD8 + double positive
  • CD44 hl high levels of CD44 expression
  • CD44 The induction of CD44 by ICN1 in pre-leukemic cells is demonstrated. Specifically, the role of CD44 is demonstrated as a molecule involved in graft in the bone marrow of pre-leukemic aberrant human T lymphocytes induced by ICN1 in a mouse xenotransplant model, using two strategies:
  • Treatment is demonstrated to prevent the expansion of human primary T-ALL leukemia cells in vivo and prevent the establishment and progression of the disease. Specifically, it is shown that in vitro and in vivo treatment with inhibitors of CD44 function inhibits grafting and the expansion of primary human T-ALL leukemia transplanted in mice.
  • the therapeutic treatment of human T-ALL is tested using a preclinical model in RAG-2 " ' " x and c ⁇ ' ⁇ immunodeficient mice. generated (Weijer et al. 2002) that are transplanted with primary human T-ALL leukemias from peripheral blood of untreated patients diagnosed with T-ALL.
  • T-ALL induction model For the preventive treatment of T-ALL a human T-ALL induction model is used, which has been developed on the basis of the previously established mouse model (Pear et al. 1996).
  • the model consists of the xenotransplantation of RAG-2 " ' " xy c ⁇ ' ⁇ mice previously obtained (Weijer et al. 2002) with human hematopoietic progenitors (from umbilical cord blood or neonatal thymus) transduced with the oncogenic form ICN1 of Notchl, which has been shown to induce T-ALL in mice (Pear et al. 1996).
  • T-ALL acute lymphoblastic T leukemia
  • human T-ALL pre-leukemia refers to the population of human T cells with proliferative capacity, which have an aberrant CD4 + CD8 + double positive (DP) phenotype with high levels of CD44 expression (CD44hi), and that graft the BM of RAG-2 " ' " xy c ⁇ ' ⁇ immunodeficient mice that have been transplanted with human hematopoietic progenitors (from umbilical cord blood or neonatal thymus) expressing the oncogenic form ICN1 of Notchl
  • This term is used by analogy to the term used to define the population CD4 + CD8 + DP CD44hi derived from mouse precursors in which ICN1 is expressed (Pear et al., 1996; Weng et al. 2004) or other oncogenes such as K- Ras (Kindler et al., 2008), which graft the BM of recipient mice and eventually generate T-ALL leukemias per se or after
  • primary human T-ALL leukemia refers to unmanipulated cells from peripheral blood of patients diagnosed with T-ALL leukemia, who have not undergone treatment.
  • CD44 refers to a membrane glycoprotein encoded by the CD44 gene with SEQ ID No. 1, belonging to the group of adhesion molecules, which binds to hyaluronic acid as the main ligand and participates in: cell activation, recirculation, migration and metastasis, adhesion to the extracellular matrix, angiogenesis, and cell proliferation and differentiation (Hertweck et al., 201 1).
  • CD44 participates in: the interaction of the parents with the stroma of the BM, maturation and death induced by T lymphocyte activation, extravasation and lymphoid migration, leukocyte activation. CD44 also participates in the development and progression of hematologic malignancies, as well as their invasiveness, grafting in the BM and mobilization from the BM to the periphery (Hertweck et al., 2011).
  • Notchl refers to one of the members of a highly conserved family of membrane receptors (Notch), involved in proliferation processes, apoptosis, cell differentiation, determination of cell lineages and oncogenesis (Artavanis -Tsakonas, 1999).
  • Notchl ICN1 oncogenic form refers to the intracellular portion of the Notchl receptor that: 1) under physiological conditions, upon activation of Notchl by recognition of its ligand, is released from the rest of the molecule and is disrupted to the nucleus where it binds to the CSL transcription factor and the co-activator MAML1 and acts as a transcription regulator, (Aster et al., 2008; Kopan and llagan, 2009); and 2) under pathological conditions due to activating mutations it is released and translocates to the nucleus independently of ligand, inducing the generation of T-ALL leukemias (Pear ef a /., 1996; Weng et al. 2004).
  • the term: "aberrant human T cells with CD4 + CD8 + double positive pre-leukemic phenotype (DP) with high levels of CD44 expression (CD44hi)” refers to cells with proliferative capacity that graft BM of RAG-2 " ' " x and c ⁇ ' ⁇ immunodeficient mice that have been transplanted with human hematopoietic progenitors (from umbilical cord blood or neonatal thymus) in which the oncogenic form ICN 1 of Notchl has been expressed by retroviral transduction.
  • This term is used by analogy to the term used to define the population CD4 + CD8 + DP CD44hi derived from mouse precursors in which ICN1 is expressed (Pear et al., 1996; Weng et al. 2004) or other oncogenes such as K- Ras (Kindler et al., 2008), which graft the BM of recipient mice and eventually generate T-ALL leukemias.
  • CD44 function inhibitors refers to all those agents capable of inhibiting the transcription and / or protein expression of CD44, or of interacting with the CD44 protein in the membrane inducing the death of the cell that expresses it, or to block the interaction of CD44 with its ligands or to block the interaction of ligands such as hyaluronic acid with its CD44 receptor.
  • the present invention refers to those agents known to a person skilled in the art.
  • the following examples are cited in a non-limiting manner:
  • anti-CD44 antibodies preferably monoclonal (mAbs) and / or polyclonal, capable of interacting with the human CD44 membrane molecule and inducing: a.1) the death of the leukemic cell expressing CD44 by complement-mediated cell cytotoxicity or by antibody-dependent cellular cytotoxity (ADCC), or
  • CD44 ligand blocking agents preferably hyaluronic acid (HA) (Liao et al., 1995), such as HA oligosaccharides competing for endogenous HA.
  • HA hyaluronic acid
  • anti-CD44 antibody refers non-limitingly to immunoglobulin molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the molecule of the invention, and a Fe fragment capable of fixing complement.
  • Immunologically active portions of immunoglobulin molecules are not excluded from the term. Examples of portions of immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ') 2 fragments, which can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin, which contain a binding antigen binding site. specifically (immunoreacts) with the molecule of the invention they recognize, but lack the Fe fragment and are not able to fix complement.
  • specific blocking peptides are also included.
  • the antibodies can be polyclonal (typically include different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the monoclonal antibody can be altered biochemically or by genetic manipulation, or it can be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in parts, of portions that are not necessary for the recognition of the molecule of the invention and being substituted by others. which communicate additional advantageous properties to the antibody.
  • the antibody can also be recombinant, chimeric, humanized, synthetic or a combination of any of the foregoing.
  • a "recombinant antibody or polypeptide” is an antibody that has been produced in a transformed or transfected host cell with the nucleic acid encoding the antibody against the molecule of the invention, or producing the antibody against the molecule of the invention as a result of homologous recombination.
  • gene silencing vector refers to a plasmid of viral origin (lentiviral, retroviral, or adenoviral), preferably lentiviral, which codes for one or more complementary nucleotide sequences of the human CD44 gene, preferably a shRNA, inhibiting its transcription.
  • the vector also expresses the green fluorescent protein (GFP) as a tracer of the silenced cells.
  • GFP green fluorescent protein
  • shRNA referred to, an RNA hairpin complementary to a sequence of
  • siRNA referred to a small interfering RNA complementary to a human CD44 RNA sequence that inhibits its transcription
  • microRNA referring to a 21-25 nucleotide RNA capable of inhibiting the expression of human CD44 at the post-transcriptional level
  • ribozymes referring to RNA molecules whose three-dimensional folding allows them to catalyze cutting reactions of specific sequences of human CD44 messenger RNA, inhibiting its function
  • RNA aptamers or decoys referring to RNA sequences whose three-dimensional structure allows them to bind to a protein and render it useless, inhibiting the expression of human CD44.
  • CD44 ligand blocking agent refers to all those agents that block the interaction of CD44 ligands with the CD44 molecule expressed on the surface of leukemic cells. P Cited as preferred but not limiting examples:
  • CD44 ligands such as osteopontin
  • CD44 HA ligand blocking oligosaccharides which compete with endogenous HA for binding to CD44 and displace it, inhibiting its function.
  • prevention is to avoid the in vivo establishment of human T-ALL caused after grafting of T-ALL SCIs in BM.
  • treatment means fighting the effects caused after grafting and expansion of the SCIs that initiate and maintain human T-ALLs, to stabilize the status of individuals and prevent disease progression.
  • FIG. 1 The oncogenic form ICN1 of Notchl increases the grafting on the BM of human HSCs and induces the generation of aberrant CD44hi T cells in a mouse xenotransplantation model.
  • Human hematopoietic stem cells (HSCs) were isolated from umbilical cord blood (CB) by immunomagnetic selection, removing mature cells from various lineages (Lin " ) and selecting positive cells for the CD34 marker (CD34 + ). The cells were infected with retroviruses.
  • the percentages of human cells of the indicated hematopoietic lineages are shown. , generated from HSCs GFP + or ICN1 + in BM, spleen and peripheral blood (PB) at 9 weeks post-transplant.
  • C Expression profiles of CD44 in human T cells DP TCRap + GFP + or ICN1 + generated in the thymus and BM of the transplanted mice.
  • D Percentages of human GFP + or ICN1 + cells detected in the blood of the transplanted mice at 4-10 weeks post-transplant.
  • FIG. 3 The ectopic expression of ICN1 in early thymus transplanted progenitors (ETPs) in mice induces their bone marrow grafting.
  • ETPs were isolated from postnatal human scams by immunomagnetic selection based on the expression of the CD34 marker (CD34 + ).
  • ETPs were infected with retroviruses carrying ICN 1 and GFP or only GFP as a control.
  • Transduced cells were transplanted into RAG-2 " ' " xy c ⁇ ' ⁇ mice.
  • the numbers were normalized to a value of 10 5 transduced and transplanted / mouse ETPs. The data comes from 8-14 independent experiments.
  • C Flow cytometric analysis (FACS) of human cells recovered from the BM of transplanted animals. The percentages of the human populations GFP " and GFP + (upper panel) or ICN 1 " and ICN 1 + (lower panel), identified by the CD45 leukocyte marker are shown. The results are representative of 3 independent experiments.
  • FIG. 4 Generation of aberrant human CD44hi T cells induced in vivo by ectopic expression of ICN1 in thymus progenitors.
  • Human ETPs transduced with retroviruses carrying ICN 1 and GFP or only GFP were transplanted into RAG-2 " ' " x and c ⁇ ' ⁇ immunodeficient mice.
  • A Analysis by flow cytometry of human cell populations generated from the transplanted progenitors. The expression profiles of the CD4 vs. CD8 and TCRap vs. CD3 markers in human GFP + or ICN 1 + cells generated in BM (left panel) and thymus (right panel) are shown 4 weeks after transplantation.
  • B Analysis of the clonality of the aberrant populations generated.
  • FIG. 5 The expression of CD44 correlates with the expression levels of the ICN1 transgene in the transplanted human cells.
  • the efficiency of the expression of the ICN1 transgene in the transduced human cells was determined by flow cytometry, quantifying the mean fluorescence intensity (MFI) of the GFP transduction tracer in cells from: (A) thymus or BM of transplanted mice with ICN1 + ETPs, and (B) thymus, BM, spleen and PB of mice transplanted with human HSCs GFP + (o) or ICN1 + (A).
  • MFI mean fluorescence intensity
  • results were normalized with respect to the MFI of CD44 in: (B) ETPs before transduction, or (C) SupT1 control cells transduced with GFP.
  • the data represent the mean ⁇ the standard error of the mean (SEM) of: (A) 3-9, (B) 3 and (C) 3-4 independent experiments.
  • the data correspond to: (D) GFP + or ICN1 + ETPs at 36 hours post-transduction, (E) SupT1 GFP + , ICN1 + or dnMAML1 + cells, (F) human control DP thymocytes or BM ICN1 + DP cells from of mice transplanted with ETPs.
  • the values correspond to the mean ⁇ SEM of triplicates from at least 3 independent samples.
  • Figure 7. ICN1 induces CD44 expression in vitro and in vivo.
  • A CD44 MFI, determined by FACS, on CD4ISP, preTCR and DP TCRap + T cells and thymus and BM-generated B cells from mice transplanted with human HSCs transduced with GFP or ICN1.
  • Figure 8. Notchl regulates the transcription of CD44 dependent on the CSL / MAML complex.
  • A Schematic representation of the 4 possible CSL transcription factor binding sites identified in the 5 ' region of the human CD44 gene. The numbers indicate the distance in bp from the transcription start site (+1).
  • BC Transcriptional activity was determined by luciferase induction assays in SupT1 T cells transfected with the empty pGL3-luciferase tracer vector (pGL3) or in which they were cloned: (B) the 4 possible CSL sites shown in A (s1 + 2 + 3 + 4) or (C) sequences that include combinations of 2 original or mutated CSL sites (mui).
  • the data represent the induction of luciferase activity with respect to controls that include: (B) the empty pGL3-luciferase vector + retrovirus-GFP, or (C) the pGL3-lucifera vector with each of the CSL + retrovirus- combinations GFP (D)
  • Anti-Notch1 antibodies or control immunoglobulins were used to precipitate the DNA of the T-ALL CUTTL1, SupT1 and HPB-ALL cell lines. The results were normalized with respect to the starting sample and the immunoprecipitate obtained with the control Ig. The bars in BD represent the mean ⁇ SEM of at least 3 independent experiments.
  • FIG. 9 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay of the CD44 regulatory region. Specific oligonucleotides were used for each of the 4 possible CSL binding sites in the CD44 gene or for the CSL binding site described in the C-MYC gene as a positive control. A representative ChIP of the data summarized in Figure 8D is shown.
  • FIG. 10 The function of CD44 is essential, although insufficient, to induce aberrant grafting of human ETPs in BM.
  • Analysis of the involvement of CD44 in the induction of aberrant graft in the BM of human ETPs transduced with ICN1 The absolute numbers of human cells recovered at 3 weeks post-transplant of RAG-2 " ' " x and c ⁇ ' ⁇ mice that were: (A) transplanted with ICN1 + ETPs pretreated with a control lgG1 (A) or with a blocking monoclonal antibody (mAb) against CD44 (B) transplanted with ICN1 + ETPs and treated in vivo 3 times / week for 2 weeks with lgG1 control (A) or with anti-CD44 ( ⁇ ), starting treatment 5 days after transplantation; (C) transplanted with ETPs transduced with ICN1 (A) or with CD44 (0) and untreated, 3 weeks post-transplant; (D) transplanted with ETPs co-transduce
  • a and C Percentages of T-ALL cells present in BM, PB, spleen and thymus after (A) the transplantation of T-ALL5 primary leukemia cells previously treated with a control lgG1 or with a mAb against CD44; (C) T-ALL5 or T-ALL8 primary leukemia cell transplantation, followed by in vivo administration of control lgG1 or an anti-CD44 blocking mAb.
  • the scheme of the experimental procedure used to analyze the effect of in vivo administration of anti-CD44 is shown in (B). 0.5-1x10 6 primary BM leukemic cells were transplanted intravenously into sublettally irradiated mice.
  • Treatment with anti-CD44 prevents the establishment and progression of T-ALL in vivo and the appearance of splenomegaly. Photograph of spleens extracted from mice transplanted with T-ALL8 cells and treated in vivo with lgG1 or anti-CD44. The spleens shown are part of those used to calculate the data represented in C.
  • EXAMPLE 1 The oncogenic form of Notchl ICN1 increases engraftment in bone marrow (BM) of human hematopoietic stem cells (HSCs) and promotes ectopic development of T CD4 + CD8 + double positive (DP) cells CD44 aberrant hl.
  • BM bone marrow
  • HSCs human hematopoietic stem cells
  • DP double positive
  • ICN1 is a highly leukemogenic Notchl form that has been described to induce the generation of aberrant CD4 + CD8 + double positive (DP) T cells when expressed in mouse HSC progenitors transplanted into recipient mice (Pear ef al. 1996 ; Pui et al. 1999; Aster et al. 2000).
  • model object of the invention constitutes a modification of the mouse transplant model previously described (Pear et al. nineteen ninety six).
  • the transplanted cells in the mouse were human cells, which allowed to directly analyze the effect of ICN1 overexpression on the in vivo development of human progenitors.
  • HSCs Human hematopoietic stem cells
  • CB umbilical cord blood
  • GFP green fluorescent protein
  • the transduced HSCs (10 5 ) were transplanted by intrahepatic injection (ih) into immunocompromised mice RAG-2 " ' " x yc' ⁇ neonates (1-6 days) irradiated sublettally (1.5Gy), as originally described for unhandled human cells (Weijer et al. 2002).
  • RAG-2 " ' " x and c "A immunodeficient mice are not able to reject human cells, so they constitute the ideal host to analyze human progenitor cell grafting in vivo and
  • the HSCs in step ii) are a model of human T-ALL pre-leukemic cells in mice. Specifically, they are aberrant human T cells with pre-leukemic phenotype CD4 + CD8 + double positive (DP) with high levels of CD44 expression (CD44hi), in the BM of RAG-2 mice - / - x and c - / - xenotransplanted with Human hematopoietic progenitors (of umbilical cord blood or neonatal thymus) transduced with the oncogenic form ICN1 of Notchl
  • This phenotype coincided with the aberrant DP CD44 hl phenotype described in the mouse model for ICN1 + pre-leukemic cells that are generated in BM and migrate to the periphery to generate a T-ALL leukemia (Pear et al. 1996; Pui et al.
  • DP aberrant CD44 hl cells or pre-leukemic cells object of the present invention the equivalent human cells generated in the transplanted mice will hereinafter be referred to as "DP aberrant CD44 hl cells or pre-leukemic cells object of the present invention.
  • mice the results obtained in mice (Pear et al. 1996), in the human xenotransplantation model object of the present invention, the aberrant DP CD44 hl phenotype of human ICN1 + cells was restricted to BM, these cells not being found in no other organ ( Figures 1 B, 1 C and 8).
  • mice undergoing secondary transplants with human ICN1 + T cells.
  • Human cells generated in BM were isolated from RAG-2 - / - x ⁇ - / - mice transplanted 9 weeks earlier with CB HSCs transduced with GFP (GFP +) or ICN1 + GFP (ICN1 +) and implanted in new recipient mice for evaluate its potential for restocking and / or generating leukemia.
  • GFP + GFP
  • ICN1 + ICN1 +
  • ICN1 provides signals to human HSCs capable of inducing their ectopic differentiation in BM in preleukemic T cells with an aberrant DP CD44 hl phenotype; although ICN1 is insufficient to generate human T-ALL leukemia in the mouse during the analyzed period.
  • the xenotransplant model object of the present invention constitutes the first available model of in vivo generation of human T cells of pre-leukemic aberrant phenotype.
  • ICN1 The generation of human aberrant cells induced by ICN1 represents a unique tool for the study of early molecular alterations they associate the generation of SCIs in the T-ALL, whose sequence of appearance is not possible to analyze in real time in patients at the time of diagnosis, when leukemia has already been established.
  • EXAMPLE 2 Reprogramming ICN1 residents early progenitors in human thymus (ETPs) inducing their graft in the BM and promote ectopic generation of human T cells CD44 aberrant DP hl.
  • T-ALL originates from the oncogenic transformation of T cells during their development in the thymus. Therefore, the intrathymic precursors of T lymphocytes would constitute the target cell of the early events that would lead to T-cell leukemogenesis induced by onchogenic isoforms of NOTCH1 (Pui C.H. et al. 2004; Hagenbeek T.J. et al. 2008).
  • ICN1 does not affect the initial migration of human ETPs to the BM, or their entry into the BM, but favors their proliferation, expansion and retention in that specific microenvironment. Therefore, the ICN1 mutation not only increases the reconstitution in vivo of BM with human cells that have intrinsic ability to graft BM, such as CB HSCs, but also reprograms the intratymic precursors ETPs that have lost this potential. , and promotes its efficient grafting in BM.
  • the ETP transduced ETPs differentiated extrathymically in BM, generating T cells with an aberrant DP TCRc ⁇ + CD3 + phenotype ( Figure 4A), which did not spread through the periphery, nor did they generate T-ALL in a period of 15 weeks (data not shown).
  • the human ICN1 + DP cells of the BM presented a polyclonal repertoire of TCR indistinguishable from that of control DP thymocytes ( Figure 4B).
  • these cells showed the aberrant pre-leukemic phenotype, characterized by high levels of CD44, observed in cells derived from ICN1 + HSCs.
  • CD44 correlated with the expression levels of the ICN1 transgene, which were significantly higher (up to 40% higher) in BM IC 1 + DP cells derived from ETPs ( Figure 3A and 5A) or HSCs (Figure 5B ).
  • CD44 expression was always higher in ICN1 + BM cells than in ICN 1 + populations of thymus, spleen or PB. ( Figure 5B). Therefore, selective grafting in the BM of aberrant ICN1 + DP cells, derived from both ETPs and HSCs, shows a direct correlation between CD44 and ICN 1 expression levels, suggesting a specific role of signaling by Notchl and CD44 in the process of grafting in the BM.
  • EXAMPLE 3 ICN1 regulates the transcription of CD44 dependent on the CSL / MAML complex.
  • CD44 Aberrant expression of CD44 was confirmed in all ICN1 + cells of the T lineage that repopulated BM in vivo, regardless of their origin (ETPs or HSCs) and stage of differentiation, including not only the majority DP TCRc ⁇ + population , but also its precursors pre-TCR + and CD4 + simple immature positive (CD4ISP). In contrast, all ICN1 + populations that differentiated in the thymus presented with conventional levels of CD44 ( Figures 6A and 7A). The correlation observed between the expression of CD44 and ICN1 could indicate that CD44 is regulated by the activation of Notchl.
  • CD44 is a transcriptional target of NOTCH1 dependent on the CSL / MAML complex. Therefore, in the present invention CD44 is identified as a transcriptional target of Noten 1 in human hematopoietic progenitors.
  • CD44 is essential to promote aberrant human CD lymphocyte DP CD44 hi induced by ICN1 in BM.
  • EXAMPLE 5 Blocking the function of CD44 through the use of an inhibitory agent prevents BM grafting, oncogenic expansion and in vivo progression of primary human T-ALL: preclinical evidence of a new therapeutic strategy against T -ALL.
  • ICN1 induces the expression of CD44 and regulates the interaction of aberrant human T cells with the BM microenvironment is especially relevant, since the increase in CD44 expression has not only been described in preleukemic T cells.
  • mouse models Amazon et al. 2008
  • SCIs of various human leukemias that include acute myeloid leukemia (AML) and chronic myeloid leukemia (CML)
  • AML acute myeloid leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • CD44-mediated interactions could also participate in grafting in vivo in the BM of primary human T-ALL leukemias.
  • the xenotransplantation model of the primary T-ALL leukemia was used in RAG-2 " ' " x yc' ⁇ immunodeficient mice.
  • BM or PB cells from untreated patients diagnosed with T-ALL were analyzed and CD44 expression was confirmed in vivo in these leukemias ( Figure 11).
  • the leukemias were then treated with a blocking mAb against human CD44 (clone 515; BD Biosciences; Kansas et al., 1990) and the effect of the treatment on their grafting capacity and progression in vivo after transplantation in RAG immunodeficient mice was analyzed.
  • -2 " ' " x yc' ⁇ was analyzed.
  • T-ALL initiating cells appear to require the interaction of CD44 with the appropriate niche in BM to maintain their leukemogenic properties and promote their expansion in vivo.
  • the candidate immunotherapeutical target is associated with proliferation and shows prognostic valué in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 23: 519-27.
  • T-cell lymphomas in T-cell-specific Pten-deficient mice originated in the thymus.

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Abstract

La presente invención describe la aplicación terapéutica de agentes inhibidores de CD44 frente a la leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana. En concreto, la presente invención hace referencia a un agente inhibidor de la función de CD44 para su uso en medicina, preferentemente para la prevención y/o tratamiento de la T-ALL humana, así como a una composición farmacéutica y un kit. La presente invención también hace referencia aun método de prevención y/o tratamiento de la T-ALL humana, aun modelo de células pre- leucémicas de la T-ALL humana en ratón inducidas por ICN1, y a un modelo de xenotrasplante en ratón para el estudio de las alteraciones moleculares tempranas que se asocian a la generación de las células que inician y mantienen la T-ALL humana.

Description

APLICACIÓN TERAPÉUTICA DE AGENTES INHIBIDORES DE CD44 FRENTE A LA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA (ALL) HUMANA.
DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención forma parte del sector de la química y la farmacia, en concreto se refiere al uso terapéutico de agentes inhibidores de la función de la molécula CD44 para el tratamiento y/o la prevención de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana, con especial mención al subtipo de leucemia T linfoblástica aguda (T-ALL).
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La ALL es un tumor agresivo que constituye el cáncer pediátrico más común. Entre las ALLs, la ALL de linfocitos B (B-ALL) es el subtipo más frecuente y mejor estudiado. El subtipo T-ALL constituye el 10-15% de las ALLs pediátricas y el 25% de las adultas y su patogénesis es menos conocida. El tratamiento convencional con quimioterapia de la T- ALL tiene una alta frecuencia de recaídas y la supervivencia a 5 años en estos casos es menor del 30% (Aifantis et al., 2008). Esta mala respuesta es debida a la resistencia a los tratamientos convencionales de las células iniciadoras de la leucemia, conocidas como LICs, y refleja la necesidad de encontrar tratamientos alternativos frente a ellas.
A día de hoy, no existen terapias dirigidas específicamente contra las LICs de las T- ALLs, ni se han descrito marcadores que permitan identificar a las células iniciadoras de este tipo de leucemia linfoide, o a las moléculas implicadas en su función. Por el contrario, en otros tipos de leucemias distintas a la T-ALL, como las leucemias mieloides, tanto aguda (AML) como crónica (CML), se ha descrito que la molécula de adhesión CD44, un receptor del ácido hialurónico esencial en la mielopoyesis normal, es fundamental para establecer la interacción de las LICs mieloides con su nicho en la médula ósea (BM) y para mantener sus propiedades oncogénicas en un modelo de ratón (Jin et al. 2006; Krause et al., 2006, Hertweck et al. 201 1). De hecho, se ha demostrado la relevancia de CD44 como diana terapéutica en estas leucemias mieloides humanas en modelos de ratón in vivo (Jin et al., 2006). Además, CD44 se sobre-expresa en algunos tipos de leucemias de linfocitos B, como la B-ALL, donde parece ser un marcador de LICs asociado con mal pronóstico y recaída (Hertweck et al. 201 1 ; Coustan-Smith et al., 201 1). En otros tipos de leucemias linfoides B, como la leucemia linfoide crónica (LLC), la sobre-expresión de CD44 tiene una función inductora de supervivencia, y también se asocia con mal pronóstico, por lo que se ha sugerido que CD44 también podría ser una diana de intervención terapéutica en leucemias de linfocitos B (Giannopoulos et al., 2009; Herishanu et al. 201 1 ; Buggins et al. 201 1). Sin embargo, esta posibilidad no se ha demostrado formalmente.
En el caso de las T-ALL, las LICs están incluidas en la población de linfoblastos T inmaduros que infiltran la BM. Las LICs de la T-ALL se originan por la aparición de mutaciones oncogénicas en diversas moléculas de señalización que intervienen en el desarrollo de los linfocitos T en el timo. Entre ellas, las mutaciones activadoras en el gen NOTCH1 son frecuentes en más del 50% de las T-ALL humanas (Weng et al. 2004). Estas formas mutadas (en concreto ICN1) son capaces de generar en el ratón una leucemia similar a la T-ALL humana (Pear et al., 1996), lo que refuerza la función proto-oncogénica de Notchl in vivo
Sin embargo, actualmente, se desconoce el impacto in vivo de la activación aberrante de Notchl en progenitores hematopoyéticos humanos, y no se han descrito hasta la fecha modelos humanizados de generación de T-ALL dependiente de Notchl , similares a los de ratón (Pear et al., 1996), que permitan analizar los múltiples eventos que determinan la generación de la T-ALL humana, incluyendo la generación de las LICs.
Aunque CD44 se sobre-expresa en las LICs de varios tumores hematológicos mieloides y linfoides B (Liu and Jiang, 2006; Hertweck et al. 2011), la posibilidad de que CD44 sea una molécula de relevancia en las LICs de las T-ALLs no se ha contemplado hasta la fecha. El motivo principal de la falta de atención hacia CD44 en las T-ALL es debido al hecho de que CD44 debe ser una molécula funcionalmente dispensable en el linaje de los linfocitos T, ya que su expresión disminuye progresivamente hasta desaparecer de la membrana durante el desarrollo normal en el timo (Márquez et al. 1995). Puesto que el desarrollo de los linfocitos T es dependiente de la activación de Notchl (Radtke et al. 1999; Pui et al. 1999), no se espera que CD44 se induzca en leucemias del linaje T, especialmente en aquellas donde Notchl es activo (Pear et al., 1996; Weng et al. 2004).
Debido a la falta de modelos de T-ALL humana dependiente de Notchl in vivo, actualmente no se ha podido analizar formalmente si la activación aberrante de Notchl (en concreto ICN1) en los progenitores hematopoyéticos humanos de los linfocitos T es capaz de regular la expresión de moléculas de relevancia funcional para las LICs de las T-ALL, como CD44 u otras. Esta información es esencial, ya que permitiría desarrollar estrategias terapéuticas frente a la T-ALL humana basadas en agentes inhibidores de estas moléculas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención hace referencia a un agente inhibidor de la función de la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , para su uso en medicina, en concreto para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento útil para la prevención y/o tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda humana. Preferentemente, la leucemia linfoblástica aguda humana es una leucemia T linfoblástica aguda (T-ALL).
En una realización preferente de la presente invención, se hace referencia al agente inhibidor anteriormente descrito, caracterizado por que es capaz de inhibir el injerto y/o la expansión de células humanas iniciadoras de la leucemia linfoblástica aguda humana en la médula ósea de un paciente.
En otra realización preferente de la presente invención, se hace referencia al agente inhibidor anteriormente descrito, caracterizado por que dicho agente es un anticuerpo o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1. Preferentemente, el anticuerpo es monoclonal.
En otra realización preferente de la presente invención, se hace referencia al agente inhibidor anteriormente descrito, caracterizado por que dicho agente es un vector de silenciamiento génico que comprende al menos una secuencia nucleotídica complementaria del gen CD44 con SEQ ID No. 1 , capaz de silenciar su expresión. Preferentemente, el vector es lentiviral.
En otra realización preferente de la presente invención, se hace referencia al agente inhibidor anteriormente descrito, caracterizado por que dicho agente es un agente bloqueante de un ligando de la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1. Preferentemente, dicho ligando es el ácido hialurónico.
La presente invención hace referencia también a una composición farmacéutica y/o medicamento caracterizada/o por comprender al menos un agente inhibidor descrito anteriormente. Preferentemente, dicha composición farmacéutica y/o medicamento se caracteriza por que comprende una cantidad terapéuticamente aceptable de al menos un vehículo, y/o un excipiente, y/o un aditivo.
La presente invención hace referencia también a un kit para el tratamiento y/o prevención de la leucemia linfoblástica aguda humana caracterizada/o por comprender al menos un agente inhibidor definido anteriormente, o al menos una composición farmacéutica y/o medicamento definida/o anteriormente. La presente invención hace referencia también a un método de prevención y/o tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda humana que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente inhibidor definido anteriormente, o una composición farmacéutica y/o medicamento definida/o anteriormente, o un kit definido anteriormente.
La presente invención hace referencia también a un modelo de generación de células pre-leucémicas de la leucemia T-ALL humana en ratón inducidas por ICN1. Preferentemente, dicho modelo de células se caracteriza por que dichas células son linfocitos T humanos aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo con altos niveles de expresión de la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1.
La presente invención hace referencia también a un modelo de xenotrasplante en ratón caracterizado por que comprende un injerto en la médula ósea de linfocitos T humanos aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo con altos niveles de expresión de la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1.
La presente invención hace referencia también a un método de obtención del modelo de xenotrasplante en ratón definido anteriormente, caracterizado por que comprende las siguientes etapas esenciales: i) trasplantar progenitores hematopoyéticos humanos transducidos con el oncogén ICN1 en al menos un ratón inmunodeficiente; y ii) generar linfocitos T aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo con altos niveles de expresión de la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1.
Por último, la presente invención hace referencia también al uso del modelo celular descrito anteriormente, o del modelo de xenotrasplante de ratón descrito anteriormente, para el estudio de las alteraciones moleculares tempranas que se asocian a la generación de las células que inician y mantienen la leucemia T-ALL humana, así como para el estudio pre-clínico de posibles agentes terapéuticos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En concreto en la presente invención:
1. Se identifica la proteína CD44 codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , de ahora en adelante indicada como "CD44", como una diana transcripcional de Notchl en progenitores hematopoyéticos humanos. SEQ ID No. 1 corresponde a ENSG00000026508, e identifica la secuencia nucleotídica del gen CD44 en Homo sapiens desde 5 kilobases "upstream" del sitio de inicio de la transcripción hasta el primer exón codificante.
2. Se generan modelos de células pre-leucémicas T-ALL humanas en ratón. En concreto células T humanas aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo (DP) con altos niveles de expresión de CD44 (CD44hl), en la BM de ratones RAG-2"'" x yc ~'~ xenotrasplantados con progenitores hematopoyéticos humanos (de sangre de cordón umbilical o de timo neonatal) en los que se ha expresado la forma oncogénica ICN1 de Notchl por transducción retroviral.
3. Se demuestra la inducción de CD44 por ICN1 en las células pre-leucémicas. En concreto, se demuestra la función de CD44 como molécula implicada en el injerto en la médula ósea de linfocitos T humanos aberrantes pre-leucémicos inducidos por ICN1 en un modelo de xenotrasplante en ratón, utilizando dos estrategias:
a) Por sobre-expresión de CD44; se demuestra el efecto cooperativo de la expresión de ICN1 y CD44 sobre el incremento del injerto en la BM de progenitores hematopoyéticos humanos trasplantados en ratones RAG-2"'" x yc ~'~.
b) Por inhibición de CD44; se demuestra que el tratamiento in vitro con agentes inhibidores de la función de CD44 bloquea el injerto en la BM de las células T humanas aberrantes pre-leucémicas inducidas por ICN1.
4. Se demuestra el tratamiento para prevenir el injerto de las células pre-leucémicas. En concreto se demuestra que el tratamiento in vivo con agentes inhibidores de la función de CD44, inhibe el injerto en la BM de células T humanas aberrantes pre-leucémicas, inducidas por ICN1 en un modelo de ratón.
5. Se demuestra el tratamiento para prevenir la expansión de células leucémicas primarias T-ALL humanas in vivo y evitar el establecimiento y la progresión de la enfermedad. En concreto se demuestra que el tratamiento in vitro e in vivo con agentes inhibidores de la función de CD44, inhibe el injerto y la expansión de leucemias T-ALL humanas primarias trasplantadas en ratón.
En la presente invención, el tratamiento terapéutico de la T-ALL humana se ensaya utilizando un modelo preclínico en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc ~'~ previamente generados (Weijer et al. 2002) que se trasplantan con leucemias humanas T-ALL primarias procedentes de sangre periférica de pacientes no tratados diagnosticados de T-ALL.
Para el tratamiento preventivo de la T-ALL se utiliza un modelo de inducción de T- ALL humana que se ha desarrollado sobre la base del modelo establecido previamente en ratón (Pear et al. 1996). El modelo consiste en el xenotrasplante de ratones RAG-2"'" x yc ~'~ obtenidos previamente (Weijer et al. 2002) con progenitores hematopoyéticos humanos (de sangre de cordón umbilical o de timo neonatal) transducidos con la forma oncogénica ICN1 de Notchl , que se ha demostrado que induce T-ALL en ratón (Pear et al. 1996).
En la presente invención, el término: "leucemia T linfoblástica aguda (T-ALL)" se refiere a un tumor agresivo de linfocitos T inmaduros que se caracteriza por la infiltración de la BM y la sangre con linfoblastos de fenotipo linfoide T (Aster et ai, 2008; Aifantis et ai, 2008).
En la presente invención, el término: "pre-leucemia T-ALL humana" se refiere a la población de células T humanas con capacidad proliferativa, que presentan un fenotipo aberrante CD4+CD8+ doble positivo (DP) con altos niveles de expresión de CD44 (CD44hi), y que injertan la BM de ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc ~'~ que han sido trasplantados con progenitores hematopoyéticos humanos (de sangre de cordón umbilical o de timo neonatal) que expresan la forma oncogénica ICN1 de Notchl Se utiliza este término por analogía al término utilizado para definir a la población CD4+CD8+ DP CD44hi derivada de precursores de ratón en los que se expresa ICN1 (Pear et al., 1996; Weng et al. 2004) u otros oncogenes como K-Ras (Kindler et al., 2008), que injertan la BM de ratones receptores y eventualmente generan leucemias T-ALL per se o tras la colaboración de otros eventos oncogénicos.
En la presente invención, el término: "leucemia humana T-ALL primaria" se refiere a células no manipuladas procedentes de sangre periférica de pacientes diagnosticados de leucemia T-ALL, que no han sido sometidos a tratamiento.
En la presente invención, el término: "CD44" se refiere a una glicoproteína de membrana codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , perteneciente al grupo de las moléculas de adhesión, que se une al ácido hialurónico como principal ligando y participa en: activación celular, recirculación, migración y metástasis, adhesión a la matriz extracelular, angiogénesis, y proliferación y diferenciación celular (Hertweck et al., 201 1).
En hematopoyesis, CD44 participa en: la interacción de los progenitores con el estroma de la BM, la maduración y muerte inducida por activación de linfocitos T, la extravasación y migración linfoide, la activación leucocitaria. CD44 también participa en el desarrollo y progresión de neoplasias hematológicas, así como en su invasividad, injerto en la BM y movilización desde la BM a la periferia (Hertweck et al., 2011).
En la presente invención, el término: "Notchl" se refiere a uno de los miembros de una familia altamente conservada de receptores de membrana (Notch), implicados en procesos de proliferación, apoptosis, diferenciación celular, determinación de linajes celulares y oncogenesis (Artavanis-Tsakonas, 1999).
En la presente invención, el término: "forma oncogénica ICN1 de Notchl" se refiere a la porción intracelular del receptor Notchl que: 1) en condiciones fisiológicas, tras la activación de Notchl por el reconocimiento de su ligando, se libera del resto de la molécula y se trastoca al núcleo donde se une al factor de transcripción CSL y al coactivador MAML1 y actúa como regulador de la transcripción, (Aster et al., 2008; Kopan and llagan, 2009); y 2) en condiciones patológicas debido a mutaciones activadoras se libera y trasloca al núcleo de forma independiente de ligando, induciendo la generación de leucemias T-ALL (Pear ef a/., 1996; Weng et al. 2004).
En la presente invención, el término: "células T humanas aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo (DP) con altos niveles de expresión de CD44 (CD44hi)" se refiere a las células con capacidad proliferativa que injertan la BM de ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc ~'~ que han sido trasplantados con progenitores hematopoyéticos humanos (de sangre de cordón umbilical o de timo neonatal) en los que se ha expresado la forma oncogénica ICN 1 de Notchl por transducción retroviral. Se utiliza este término por analogía al término utilizado para definir a la población CD4+CD8+ DP CD44hi derivada de precursores de ratón en los que se expresa ICN1 (Pear et al., 1996; Weng et al. 2004) u otros oncogenes como K-Ras (Kindler et al., 2008), que injertan la BM de ratones receptores y eventualmente generan leucemias T-ALL.
En la presente invención, el término: "inhibidores de la función de CD44" se refiere a todos aquellos agentes capaces de inhibir la transcripción y/o expresión proteica de CD44, o de interaccionar con la proteína CD44 en la membrana induciendo la muerte de la célula que la expresa, o de bloquear la interacción de CD44 con sus ligandos o de bloquear la interacción de los ligandos como el ácido hialurónico con su receptor CD44.
Como agentes inhibidores de la función de CD44, la presente invención hace referencia a aquellos agentes conocidos por un experto en la materia. A continuación se citan los siguientes ejemplos de manera no limitante:
a) anticuerpos anti-CD44, preferentemente monoclonales (mAbs) y/o policlonales, capaces de interaccionar con la molécula CD44 humana de membrana e inducir: a.1) la muerte de la célula leucémica que expresa CD44 por citotoxicidad celular mediada por complemento o por citotoxidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), o
a.2) la diferenciación terminal, la muerte por apoptosis o la inhibición de proliferación de las células leucémicas, o
a.3) la internalización de CD44 y/o el bloqueo de la unión de CD44 de la célula leucémica con sus ligandos.
b) vectores de silenciamiento génico portadores de secuencias nucleotídicas complementarias del gen CD44 humano, capaces de silenciar CD44, preferentemente vectores lentivirales, y
c) agentes bloqueantes de ligandos de CD44, preferentemente el ácido hialurónico (HA) (Liao et al., 1995), tales como oligosacáridos HA competidores del HA endógeno.
El término "anticuerpo anti-CD44", tal como se emplea en esta memoria, se refiere de forma no limitante a moléculas de inmunoglobulinas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la molécula de la invención, y un fragmento Fe capaz de fijar complemento. No se excluyen del término las porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina, que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la molécula de la invención reconocen, pero carecen del fragmento Fe y no son capaces de fijar complemento. Preferentemente, también se incluyen péptidos específicos bloqueantes. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente o mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de la molécula de la invención y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del anticuerpo frente a la molécula de la invención, o que produce el anticuerpo contra la molécula de la invención como resultado de la recombinación homologa.
El término "vector de silenciamiento génico" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a un plásmido de origen viral (lentiviral, retroviral, o adenoviral), preferentemente lentiviral, que codifica para una o varias secuencias nucleotídicas complementarias del gen CD44 humano, preferentemente un shRNA, inhibiendo su transcripción. El vector expresa además la proteína verde fluorescente (GFP) como trazador de las células silenciadas. A continuación se citan de manera no limitante los siguientes ejemplos:
a) shRNA, referido a ,una horquilla de ARN complementario de una secuencia del
RNA de CD44 humano, que inhibe su transcripción,
b) siRNA, referido a un ARN pequeño de interferencia complementario de una secuencia del RNA de CD44 humano que inhibe su transcripción,
c) microRNA, referido a un ARN de 21-25 nucleótidos capaz de inhibir la expresión de CD44 humano a nivel post-transcripcional,
d) ribozimas, referido a moléculas de ARN cuyo plegamiento tridimensional les permite catalizar reacciones de corte de secuencias específicas del ARN mensajero de CD44 humano, inhibiendo su función, y
e) aptámeros o señuelos de RNA, referido a secuencias de ARN cuya estructura tridimensional les permite unirse a una proteína e inutilizarla, inhibiendo la expresión de CD44 humano.
El término "agente bloqueante de ligandos de CD44", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a todos aquellos agentes que bloquean la interacción de los ligandos de CD44 con la molécula CD44 expresada en la superficie de las células leucémicas. P Se citan como ejemplos preferentes pero no limitantes:
a) anticuerpos monoclonales y/o policlonales específicos de ligandos de CD44, como por ejemplo la osteopontina; u
b) oligosacáridos bloqueantes del ligando de CD44 HA, que compiten con el HA endógeno por su unión a CD44 y lo desplazan, inhibiendo su función.
El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar el establecimiento in vivo de la T-ALL humana causado tras el injerto de las LICs de la T-ALL en la BM. El término "tratamiento" supone combatir los efectos causados tras el injerto y la expansión de las LICs que inician y mantienen las T-ALLs humanas, para estabilizar el estado de los individuos y prevenir la progresión de la enfermedad.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. La forma oncogénica ICN1 de Notchl incrementa el injerto en la BM de las HSCs humanas e induce la generación de células T CD44hi aberrantes en un modelo de xenotrasplante en ratón. Se aislaron células madre hematopoyéticas (HSCs) humanas de sangre de cordón umbilical (CB) por selección inmunomagnética, eliminando células maduras de diversos linajes (Lin") y seleccionando células positivas para el marcador CD34 (CD34+). Las células se infectaron con retrovirus portadores de la forma oncogénica ICN1 de Notchl y GFP (A) o sólo con GFP como control de la transducción retroviral (o) y se trasplantaron por inyección intrahepática en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x ye"'", evaluándose su capacidad de reconstitución por citometría de flujo en los órganos indicados. (A) Números absolutos de células humanas transducidas recuperadas de BM, bazo (spleen) y timo (thymus) 9 semanas post-trasplante (identificadas por la expresión de la molécula CD45). Los números se corrigieran para un valor de 105 HSCs transducidas trasplantadas/ratón. (B) Análisis por citometría de flujo de las poblaciones de células humanas generadas a partir de los progenitores trasplantados. Se muestran los porcentajes de células humanas de los linajes hematopoyéticos indicados (progenitores CD34+ Lin" células mieloides, células B, células T maduras simples positivas (SP) CD4+ o CD8+, o células T inmaduras doble positivas (DP) CD4+CD8+), generadas a partir de HSCs GFP+ o ICN1+ en BM, bazo y sangre periférica (PB) a 9 semanas post-trasplante. (C) Perfiles de expresión de CD44 en células T humanas DP TCRap+ GFP+ o ICN1 + generadas en el timo y la BM de los ratones trasplantados. (D) Porcentajes de células humanas GFP+ o ICN1+ detectadas en la sangre de los ratones trasplantados a 4-10 semanas post-trasplante. Los porcentajes se normalizaron a un 25% de células iniciales trasplantadas. Los resultados proceden de cuatro experimentos independientes. Figura 2. Repoblación y fenotipo de ratones trasplantados con HSCs humanas primarias o transducidas con GFP o ICN1. (A) Análisis por citometría de flujo de las poblaciones de células humanas generadas a partir de los progenitores trasplantados. Se muestran los porcentajes de células de los linajes hematopoyéticos señalados recuperados en BM, bazo y PB de ratones trasplantados con HSCs primarias humanas sin manipular, tras 9 semanas post-trasplante. Los resultados mostrados corresponden a 4 experimentos independientes. (B) Perfiles representativos de expresión de los marcadores de membrana CD4 vs CD8, TCRap vs CD3 y CD19 vs CD13 en las células humanas generadas en la BM (panel superior) y timo (panel inferior) de ratones trasplantados con HSCs humanas GFP+ o ICN 1 + a 9 semanas post-trasplante.
Figura 3. La expresión ectópica de ICN1 en progenitores tempranos del timo (ETPs) humano xenotrasplantados en ratón induce su injerto en la médula ósea. Los ETPs se aislaron de timos humanos postnatales por selección inmunomagnética en base a la expresión del marcador CD34 (CD34+). Los ETPs se infectaron con retrovirus portadores de ICN 1 y GFP o sólo de GFP como control. Las células transducidas se trasplantaron en ratones RAG-2"'" x yc ~'~. (A-B) Números absolutos de células humanas GFP+ (o) o ICN 1 + (A) presentes en BM (A) y timo (B) a distintos tiempos post-trasplante. Los números se normalizaron a un valor de 105 ETPs transducidos y trasplantados/ratón. Los datos proceden de 8-14 experimentos independientes. (C) Análisis por citometría de flujo (FACS) de las células humanas recuperadas de la BM de los animales trasplantados. Se muestran los porcentajes de las poblaciones humanas GFP" y GFP+ (panel superior) o ICN 1 " e ICN 1 + (panel inferior), identificadas por el marcador leucocitario CD45. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.
Figura 4. Generación de células T humanas aberrantes CD44hi inducida in vivo por la expresión ectópica de ICN1 en progenitores de timo. Se trasplantaron ETPs humanos transducidos con retrovirus portadores de ICN 1 y GFP o sólo de GFP en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc ~'~. (A) Análisis por citometría de flujo de las poblaciones de células humanas generadas a partir de los progenitores trasplantados. Se muestran los perfiles de expresión de los marcadores CD4 vs CD8 y TCRap vs CD3 en células humanas GFP+ o ICN 1 + generadas en la BM (panel izquierdo) y el timo (panel derecho) 4 semanas después del trasplante. (B) Análisis de la clonalidad de las poblaciones aberrantes generadas. Se analizó por PCR el repertorio para regiones TCRVp del TCR en timocitos CD4+ CD8+ (DP) no transducidos (panel superior) vs células ICN1+ DP de BM (panel inferior). Se muestran los resultados de 3 muestras independientes. (C) Análisis por FACS de la expresión de CD44 en células transducidas DP TCRap+ presentes en BM y timo de los ratones trasplantados.
Figura 5. La expresión de CD44 correlaciona con los niveles de expresión del transgen ICN1 en las células humanas trasplantadas. La eficiencia de la expresión del transgen ICN1 en las células humanas transducidas se determinó mediante citometría de flujo, cuantificando la media de intensidad de fluorescencia (MFI) del trazador de la transducción GFP en células procedentes de: (A) timo o BM de ratones transplantados con ETPs ICN1+, y (B) timo, BM, bazo y PB de ratones trasplantados con HSCs humanas GFP+ (o) o ICN1+ (A). Los datos corresponden a 13 y 6 experimentos independientes, respectivamente. Figura 6. La activación de Notchl regula la expresión de CD44. (A) Expresión de CD44, determinada mediante citometría de flujo como media de la intensidad de fluorescencia (MFI), en poblaciones humanas progenitoras de linfocitos T (CD4ISP), células pre-T (preTCR+) y células T inmaduras DP TCRap+ generadas en el timo y la BM de ratones trasplantados con ETPs. (B-C) Expresión relativa de CD44 en: (B) ETPs GFP+ o ICN1+ 36 horas después de la transducción retroviral, o (C) células de la línea celular T- ALL SupT1 transducidas con un vector control (GFP+), con ICN1 (ICN1+) o con un inactivador de Notch (dnMAML1+). Los resultados se normalizaron respecto a la MFI de CD44 en: (B) ETPs antes de la transducción, o (C) células SupT1 control transducidas con GFP. Los datos representan la media ± el error estándar de la media (SEM) de: (A) 3-9, (B) 3 y (C) 3-4 experimentos independientes. (D-F) Expresión relativa de los genes CD44, Hes1, y IL2RG determinada por PCR cuantitativa a tiempo real y normalizada para GAPDH. Los datos corresponden a: (D) ETPs GFP+ o ICN1+ a 36 horas post-transducción, (E) células SupT1 GFP+, ICN1+ o dnMAML1+, (F) timocitos humanos DP control o células ICN1+ DP de BM procedentes de ratones trasplantados con ETPs. Los valores corresponden a la media±SEM de triplicados procedentes de al menos 3 muestras independientes. Figura 7. ICN1 induce la expresión de CD44 in vitro e in vivo. (A) MFI de CD44, determinada por FACS, en células T CD4ISP, preTCR y DP TCRap+ y linfocitos B generados en timo y BM de ratones trasplantados con HSCs humanas transducidas con GFP o ICN1. Se muestra la media±SEM de 3-5 muestras independientes. (B-C) Expresión relativa de CD44 en la línea celular T CUTLL1 transducida con: (B) GFP, ICN1 o dnMAML.1 , o con: (C) GFP o ICN1 tratadas con un inhibidor de Notch (GSI) o DMSO como control durante los periodos indicados. Los datos se normalizaron respecto a la MFI de CD44 en células CUTLLItransducidas con GFP (B), o transducidas con GFP y tratadas con DMSO (C). Los resultados mostrados corresponden a la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes.
Figura 8. Notchl regula la transcripción de CD44 dependiente del complejo CSL/MAML. (A) Representación esquemática de los 4 posibles sitios de unión del factor de transcripción CSL identificados en la región 5' del gen CD44 humano. Los números indican la distancia en pb respecto al sitio de inicio de la transcripción (+1). (B-C) La actividad transcripcional se determinó mediante ensayos de inducción de luciferasa en células T SupT1 transfectadas con el vector trazador pGL3-luciferasa vacío (pGL3) o en el que se clonaron: (B) los 4 posibles sitios CSL mostrados en A (s1 +2+3+4) o (C) secuencias que incluyen combinaciones de 2 sitios CSL originales o mutados (muí). Todas las muestras se co-transdujeron con vectores retrovirales que codifican para GFP (control), ICN1 (Notchl activo) y/o dnMAMLI (inhibidor de la activación de Notch). Los datos representan la inducción de la actividad de la luciferasa respecto a los controles que incluyen: (B) el vector pGL3-luciferasa vacío + retrovirus-GFP, o (C) el vector pGL3-luciferas con cada una de las combinaciones CSL+ retrovirus-GFP. (D) La unión de ICN1 a los sitios CSL identificados se analizó en ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Se utilizaron anticuerpos anti-Notch1 o inmunoglobulinas control (ctrl Igs) para precipitar el DNA de las líneas celulares T-ALL CUTTL1 , SupT1 and HPB-ALL. Los resultados se normalizaron respecto a la muestra de partida y al inmunoprecipitado obtenido con la Ig control. Las barras en B-D representan la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes.
Figura 9. Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la región reguladora de CD44. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para cada uno de los 4 posibles sitios de unión a CSL en el gen CD44 o para el sitio de unión a CSL descrito en el gen C-MYC como control positivo. Se muestra un ChIP representativo de los datos resumidos en la Figura 8D.
Figura 10. La función de CD44 es esencial, aunque insuficiente, para inducir el injerto aberrante de los ETPs humanos en la BM. Análisis de la implicación de CD44 en la inducción del injerto aberrante en la BM de ETPs humanos transducidos con ICN1 Se representan los números absolutos de células humanas recuperadas a 3 semanas posttrasplante de ratones RAG-2"'" x yc ~'~ que fueron: (A) trasplantados con ETPs ICN1+ pre- tratados con una lgG1 control (A) o con un anticuerpo monoclonal (mAb) bloqueante contra CD44 (B) trasplantados con ETPs ICN1+ y tratados in vivo 3 veces/semana durante 2 semanas con lgG1 control (A) o con anti-CD44 (Δ), comenzando el tratamiento 5 días después del trasplante; (C) trasplantados con ETPs transducidos con ICN1 (A) o con CD44 (0) y no tratados, a 3 semanas post-trasplante; (D) trasplantados con ETPs co- transducidos con retrovirus portadores de ICN1 y el marcador ANGFR y retrovirus portadores de CD44 y GFP o sólo GFP como control, a diversos tiempos tras el trasplante. Los números se normalizaron a un valor de 105 ETPs transducidos y trasplantados/ratón.
Figura 11. Fenotipo de las leucemias primarias T-ALL humanas utilizadas en el estudio preclínico. Perfiles fenotípicos de expresión de CD4 vs CD8, CD34 vs CD44, CD5 y CD7 en las muestras de BM de pacientes diagnosticados con T-ALL utilizadas en la Figura 12. (A) T-ALL5; (B) T-ALL8.
Figura 12. La administración in vivo de mAbs anti-CD44 inhibe el injerto en la BM y la expansión celular y la progresión de leucemias primarias T-ALL humanas. Se trasplantaron células de BM de pacientes diagnosticados de T-ALL en ratones RAG-2"'" x Ye "'" y se evaluó su capacidad de injerto in vivo por citometría de flujo. (A y C) Porcentajes de células T-ALL presentes en BM, PB, bazo y timo tras (A) el trasplante de células de la leucemia primaria T-ALL5 previamente tratadas con una lgG1 control o con un mAb contra CD44; (C) el trasplante de células de las leucemias primarias T-ALL5 o T-ALL8, seguido de la administración in vivo de lgG1 control o un mAb bloqueante anti-CD44. El esquema del procedimiento experimental empleado para analizar el efecto de la administración in vivo de anti-CD44 se muestra en (B). Se trasplantaron por vía intravenosa 0.5-1x106 células leucémicas primarias de BM en ratones irradiados subletalmente. Una semana después del trasplante, se comenzó el tratamiento consistente en la inyección intraperitoneal de 150μg de anti-CD44 o de una lgG1 irrelevante 3 veces/semana. (D) El tratamiento con anti- CD44 previene el establecimiento y progresión de la T-ALL in vivo y la aparición de esplenomegalia. Fotografía de los bazos extraídos de ratones trasplantados con células T- ALL8 y tratados in vivo con lgG1 o con anti-CD44. Los bazos mostrados son parte de los utilizados para calcular los datos representados en C.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1 : La forma oncogénica ICN1 de Notchl aumenta el injerto en la médula ósea (BM) de las células madre hematopoyéticas (HSCs) humanas y promueve el desarrollo ectópico de células T CD4+CD8+ doble positivas (DP) CD44hl aberrantes.
Para analizar los eventos tempranos asociados a la generación de células iniciadoras de la leucemia (LICs) T linfoblástica aguda (T-ALL) humana in vivo, se analizó el impacto que tiene en progenitores hematopoyéticos humanos la expresión de la forma oncogénica ICN1 de NOTCH 1 , ya que ICN1 es una forma de Notchl altamente leucemogénica que se ha descrito que induce la generación de células T aberrantes CD4+CD8+ doble positivas (DP) cuando se expresa en progenitores HSCs de ratón trasplantados en ratones receptores (Pear ef al. 1996; Pui et al. 1999; Aster et al. 2000).
Para analizar el efecto de ICN1 en progenitores humanos, hubo que desarrollar un modelo de xenotrasplante humano/ratón, a partir de ahora "modelo objeto de la invención", que constituye una modificación del modelo de trasplante de ratón previamente descrito (Pear et al. 1996). En este modelo objeto de la invención, las células trasplantadas en el ratón eran células humanas, lo que permitió analizar de forma directa el efecto de la sobre- expresión de ICN1 sobre el desarrollo in vivo de los progenitores humanos.
Las etapas de establecimiento del modelo de xenotrasplante humano/ratón objeto de la invención se resumen seguidamente:
i) células madre hematopoyéticas (HSCs) humanas Lin" (Linaje") CD34+ de sangre de cordón umbilical (CB) se infectaron con un vector retroviral que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador y para el oncogén ICN1 , que se había usado previamente para progenitores de ratón (Pear et al., 1996);
ii) las HSCs transducidas (105) se trasplantaron por inyección intrahepática (ih) en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc '~ neonatos (1-6 días) irradiados subletalmente (1.5Gy), tal como se describió originalmente para células humanas no manipuladas (Weijer et al. 2002). Los ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc"Ano son capaces de rechazar a las células humanas, por lo que constituyen el huésped idóneo para analizar el injerto de células progenitoras humanas in vivo y
iii) se analizó la reconstitución de las células humanas in vivo mediante análisis por citometría de flujo.
Las HSCs del paso ii) son un modelo de células pre-leucémicas T-ALL humanas en ratón. En concreto, son células T humanas aberrantes con fenotipo pre-leucémico CD4+CD8+ doble positivo (DP) con altos niveles de expresión de CD44 (CD44hi), en la BM de ratones RAG-2-/- x yc-/-xenotrasplantados con progenitores hematopoyéticos humanos (de sangre de cordón umbilical o de timo neonatal) transducidos con la forma oncogénica ICN1 de Notchl
El desarrollo del modelo de xenotrasplante humano/ratón objeto de la invención, permitió observar que la expresión de ICN1 aumentaba significativamente (hasta 25 veces) el injerto de las HSCs humanas en la BM, en comparación con las HSCs control transducidas sólo con GFP (Figura 1A). Este incremento era específico de la BM, ya que no se detectaron diferencias significativas en la eficiencia de reconstitución del bazo (Spleen ó Spl) ni del timo (Thymus ó Thy) entre células ICN1+ y GFP+ (Figura 1A). El análisis de la BM indicó que ICN1 promovía la generación ectópica en la BM de células T con un fenotipo mayoritario de células tímicas CD4+ CD8+ doble positivas (DP) que expresan el receptor TCR-CD3 (TCRap+ CD3+) (Figuras 1 B y 2), pero que mantienen de forma aberrante altos niveles de expresión de la molécula de adhesión CD44 que se pierde en los timocitos DP normales (Figura 1C). Este fenotipo coincidía con el fenotipo aberrante DP CD44hl descrito en el modelo de ratón para las células pre-leucémicas ICN1+ que se generan en la BM y migran a la periferia para generar una leucemia T-ALL (Pear et al. 1996; Pui et al. 1999; Aster et al. 2000; Kindler et al. 2008). Por tanto, las células equivalentes humanas generadas en los ratones trasplantados se denominarán de aquí en adelante "células aberrantes DP CD44hl o células pre-leucémicas objeto de la presente invención". En contra de los resultados obtenidos en ratón (Pear et al. 1996), en el modelo de xenotrasplante humano objeto de la presente invención, el fenotipo aberrante DP CD44hl de las células ICN1+ humanas se restringió a la BM, no encontrándose estas células en ningún otro órgano (Figuras 1 B, 1 C y 8). De hecho, la reconstitución de células humanas ICN1+ en sangre periférica (PB) fue transitoria y mostró una cinética similar a la de las células control GFP+ (Figura 1 D). Estos datos indican que las células T aberrantes humanas desaparecen de los ratones xenotrasplantados sin llegar a generar una leucemia T-ALL evidente. En efecto, no se identificaron blastos leucémicos DP CD44hl en PB en cinéticas largas, hasta 17 semanas post-trasplante, y los injertos ICN1+ de la BM fueron incapaces de inducir leucemia en trasplantes secundarios (Tabla 1).
Tabla. 1. Injerto en ratones inmunodeficientes sometidos a trasplantes secundarios con células T humanas ICN1 +. Se aislaron células humanas generadas en la BM de ratones RAG-2-/- x γ-/- trasplantados 9 semanas antes con HSCs de CB transducidas con GFP (GFP+) o ICN1 +GFP (ICN1+) y se implantaron en nuevos ratones receptores para evaluar su potencial de repoblación y/o de generación de leucemia.
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En conjunto, estos resultados indican que ICN1 proporciona señales a las HSCs humanas capaces de inducir su diferenciación ectópica en la BM en células T pre- leucémicas con un fenotipo aberrante DP CD44hl; aunque ICN1 es insuficiente para generar una leucemia T-ALL humana en el ratón durante el periodo analizado.
Este mismo patrón de reconstitución con células T aberrantes pre-leucémicas se había observado previamente en los modelos de alotrasplante de ratón en los que las HSCs se transducen con una forma mutada débil de NOTCH1 que sólo genera leucemia en cooperación con otras mutaciones (Chiang M.Y. et al. 2006; Chiang M.Y. et al. 2008). Por tanto, el modelo de xenotrasplante objeto de la presente invención, constituye el primer modelo disponible de generación in vivo de células T humanas de fenotipo aberrante pre-leucémico.
La generación de células aberrantes humanas inducidas por ICN1 representa una herramienta única para el estudio de las alteraciones moleculares tempranas que se asocian a la generación de LICs en la T-ALL, cuya secuencia de aparición no es posible analizar a tiempo real en los pacientes en el momento del diagnóstico, cuando ya se ha establecido la leucemia. EJEMPLO 2: ICN1 reprograma a los progenitores tempranos residentes en el timo humano (ETPs) induciendo su injerto en la BM y promueve la generación ectópica de células T humanas DP CD44hl aberrantes.
Se ha sugerido que la T-ALL se origina por la transformación oncogénica de las células T durante su desarrollo en el timo. Por ello, los precursores intratímicos de los linfocitos T constituirían la célula diana de los eventos tempranos que darían lugar a la leucemogénesis de células T inducida por isoformas oncogénicas de NOTCH1 (Pui C.H. et al. 2004; Hagenbeek T.J. et al. 2008). Para confirmar esta hipótesis en humanos, se utilizó el modelo de xenotrasplante descrito en el ejemplo 1 y se analizó el impacto que ejerce in vivo la expresión de la forma pro-oncogénica ICN1 en los precursores tempranos del timo (ETPs) humano que ya han perdido el potencial de injertar la BM in vivo (Márquez C. et al. 1995). Se observó que los ETPs del grupo control, transducidos con GFP, no eran capaces de injertar la BM de los ratones trasplantados, pero repoblaban significativamente el timo (Figuras 3A y 3B).
Por el contrario, la expresión ectópica de ICN 1 dio lugar a un eficiente injerto de los ETPs humanos en la BM de los ratones trasplantados, sin modificar significativamente la reconstitución del timo (Figura 3A y 3B). Como se muestra en la Figura 3C, ya a 4 horas post-trasplante eran detectables bajas proporciones de células ICN1+ y control (GFP+ o no transducidas) en la BM de los ratones xenotrasplantados, que repoblaron la BM con cinéticas similares durante la primera semana. Posteriormente, las células control se redujeron hasta ser básicamente indetectables, mientras que la población ICN1+ aumentó de forma progresiva (hasta 1000 veces) durante las primeras 3-4 semanas y se mantuvo estable en la BM hasta 7 semanas post-trasplante (Figura 3A). Estos datos indican que la señalización por ICN1 no afecta a la migración inicial de los ETPs humanos a la BM, ni a su entrada en la BM, sino que favorece su proliferación, expansión y retención en ese microambiente específico. Por lo tanto, la mutación ICN1 no sólo incrementa la reconstitución in vivo de la BM con células humanas que tienen capacidad intrínseca de injertar la BM, como son las HSCs de CB, sino que también reprograma a los precursores intratímicos ETPs que han perdido este potencial, y promueve su injerto eficiente en la BM. Como se observó con las HSCs, los ETP transducidos con ICN1 se diferenciaron extratímicamente en la BM, generando células T con un fenotipo aberrante DP TCRc^+ CD3+ (Figura 4A), que no se diseminaron por la periferia, ni generaron T-ALL en un periodo de 15 semanas (datos no mostrados). Conforme a la ausencia de transformación oncogénica, las células humanas ICN1+ DP de la BM presentaban un repertorio policlonal de TCR indistinguible del de timocitos DP control (Figura 4B). Sin embargo, estas células presentaron el fenotipo pre-leucémico aberrante, caracterizado por altos niveles de CD44, observado en las células derivadas de HSCs ICN1 +. La expresión de CD44 correlacionaba con los niveles de expresión del transgen ICN1 , que eran significativamente más altos (hasta un 40% mayor) en las células ICN 1+ DP de BM derivadas de ETPs (Figura 3A y 5A) o de HSCs (Figura 5B). Además, la expresión de CD44 fue siempre más elevada en las células ICN1+ de la BM que en las poblaciones ICN 1+ de timo, bazo o PB. (Figura 5B). Por lo tanto, el injerto selectivo en la BM de células ICN1+ DP aberrantes, derivadas tanto de ETPs como de HSCs, muestra una correlación directa entre los niveles de expresión de CD44 e ICN 1 , lo que sugiere un papel específico de la señalización por Notchl y CD44 en el proceso de injerto en la BM.
En conjunto, estos resultados demuestran la eficiencia de la forma pro-oncogénica ICN1 de NOTCH1 en la generación ectópica de células T con un fenotipo pre-leucémico aberrante DP CD44hl a partir tanto de HSCs como de ETPs humanos, y sugieren la implicación funcional de CD44 en el proceso.
EJEMPLO 3: ICN1 regula la transcripción de CD44 dependiente del complejo CSL/MAML.
Se investigaron los mecanismos moleculares subyacentes a la generación ectópica de células T y al injerto en la BM inducidos por ICN1. Para ello, el estudio se centró en CD44, debido a su elevada expresión en las células ICN 1+ DP aberrantes que repueblan la BM, así como a su reportada función como molécula mediadora del injerto de las HSCs convencionales y de las células madre o iniciadoras de leucemias mieloides en la BM (Avigdor A. et al. 2004; Jin L. et al. 2006). Se confirmó la expresión aberrante de CD44 en todas las células ICN1+ del linaje T que repoblaron la BM in vivo, independientemente de su origen (ETPs o HSCs) y estadio de diferenciación, incluyendo no sólo la población mayoritaria DP TCRc^+, sino también sus precursores pre-TCR+ y CD4+ inmaduros simples positivos (CD4ISP). Por el contrario, todas las poblaciones ICN1+ que se diferenciaron en el timo presentaron niveles de CD44 convencionales (Figuras 6A y 7A). La correlación observada entre la expresión de CD44 e ICN1 podría indicar que CD44 se regula por la activación de Notchl Conforme a esta posibilidad, se observó que los ETPs humanos transducidos con ICN1 mantenían mayores niveles de expresión de CD44 in vitro que los ETPs GFP+ control (Figura 6B). Además, ICN1 indujo a nivel clonal el aumento de la expresión de CD44 endógeno que expresan las líneas T SupT1 y CUTLL1 , mientras que la inhibición de Notch mediada por: i) una forma dominante negativa del coactivador MAML1 (dnMAMLI) o, ii) el tratamiento con un inhibidor de gamma-secretasas (GSI), disminuyó la expresión de CD44, efecto que pudo ser rescatado por la expresión ectópica de ICN1 (Figuras 6C, 7B y 7C). Colectivamente, estos resultados demuestran que la activación de Notchl permite mantener una mayor expresión de CD44 en timocitos primarios e incrementa los niveles de expresión endógena en líneas celulares T-ALL.
Para averiguar si ICN1 es capaz de regular la expresión de CD44 a nivel transcripcional, se realizaron estudios cuantitativos de expresión génica. Se observó que tanto los ETPs primarios, como las líneas celulares T-ALL, transducidos con ICN1 mostraban niveles transcripcionales de CD44 mayores que las correspondientes células GFP+ control. Por el contrario, la inhibición de la señalización de Notchl mediada por dnMAMLI redujo la expresión de CD44 (Figura 6D y 6E), cuyo patrón transcripcional era idéntico al del gen diana de NOTCH1 HES1, pero distinto del correspondiente al gen irrelevante IL2RG (Figuras 6D y 6E). Además, se confirmó a nivel cuantitativo la expresión in vivo del gen CD44 era mayor en células ICN1+ DP aberrantes de la BM que en timocitos DP convencionales (Figura 6F).
Considerando estos datos, se analizó la posibilidad de una regulación transcripcional directa del gen CD44 por NOTCH 1 , dependiente de su unión al factor de transcripción CSL. Se identificaron 4 posibles sitios de unión de CSL en la región 5' del gen CD44, concretamente a -4.7, -4.4, -3.8 y -3.5 kb del sitio de inicio de la transcripción (Figura 8A). Para determinar la capacidad de activación transcripcional de estas secuencias, se utilizó la línea celular T-ALL SupT1 transducida con un vector trazador portador de luciferasa, en el que se clonó el fragmento -4,8 a -3.5 Kb del gen CD44. En estos ensayos, ICN1 indujo la expresión de luciferasa, que era suprimida específicamente por dnMAMLI (Figura 8B), demostrando la funcionalidad de los sitios de unión a CSL en CD44. Además, la mutagénesis individual de los sitios de unión a CSL indicados en SEQ ID No. 1 , mostró que cada uno de ellos poseía actividad transcripcional (Figura 8C). Finalmente, la utilización de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las líneas T-ALL SupT1 , CUTLL1 y HPB-ALL, demostró que la forma endógena de Notchl activo era capaz de unirse in vivo a todos los motivos CSL de la región reguladora de CD44 (Figuras 8D y 9).
En conjunto, estos resultados demuestran que CD44 es una diana transcripcional de NOTCH1 dependiente del complejo CSL/ MAML. Por tanto, en la presente invención se identifica a CD44 como una diana transcripcional de Noten 1 en progenitores hematopoyéticos humanos.
EJEMPLO 4: CD44 es esencial para promover el injerto de linfocitos T humanos aberrantes DP CD44hi inducidos por ICN1 en la BM.
Considerando que la expresión aberrante de CD44 inducida por ICN1 se limita a las células T que colonizan la BM, se procedió a estudiar la contribución de CD44 en la reprogramación de los ETPs para su injerto en la BM. Con esta finalidad, se pensó en una estrategia de bloqueo de la función de CD44. Para ello, los ETPs transducidos con ICN1 se trataron in vitro con un anticuerpo monoclonal (mAb) bloqueante de ratón contra CD44 humano disponible comercialmente (clon 515; BD Biosciences, Kansas et al., 1990) y su capacidad de injertar in vivo se analizó en el modelo de xenotrasplante en ratones RAG-2"'" x yc '~. Este tratamiento dio lugar a un bloqueo completo de la repoblación de la BM por células ICN1+, mientras que el pre-tratamiento con un mAb control no tuvo ningún efecto (Figura 10A). Datos similares se pueden obtener mediante una estrategia de silenciamiento de CD44, utilizando células transducidas con vectores lentivirales portadores de shRNA frente a CD44. Además, la administración in vivo de un mAb anti-CD44 (clon HP2/9; de la Hera et al. 1989; Liao et al. 1995) en ratones trasplantados 7 días antes con los ETPs ICN1+ humanos reducía notable y específicamente la repoblación de la BM (Figura 10B), lo que revela la posibilidad de manipular in vivo el injerto en la BM de las células T aberrantes mediante el bloqueo de CD44. Por tanto, la interacción con el nicho de la BM mediada por CD44 es necesaria para permitir el injerto de los linfocitos T pre-leucémicos aberrantes inducidos por ICN1 a partir de los ETPs humanos y esa interacción puede bloquearse mediante el tratamiento in vivo con un mAb anti-CD44. Sin embargo, la expresión ectópica de CD44 no es suficiente para inducir el injerto de los ETPs en ausencia de ICN1 (Figura 10C), sino que se requiere la cooperación de Notchl y CD44, ya que la expresión ectópica combinada de CD44 e ICN 1 aumentó y prolongó de forma significativa la capacidad de los ETPs de reconstituir la BM en los ratones trasplantados (Figura 10D).
En su conjunto, estos resultados demuestran que el bloqueo de las interacciones mediadas por CD44 mediante el uso de un agente inhibidor de la función de CD44, constituye una terapia eficiente para impedir el injerto en la BM de los linfocitos T pre- leucémicos aberrantes inducidos por ICN1 y, por tanto, la generación de T-ALL.
EJEMPLO 5: El bloqueo de la función de CD44 mediante el uso de un agente inhibidor, impide el injerto en la BM, la expansión oncogénica y la progresión in vivo de T-ALL humanas primarias: evidencia preclínica de una nueva estrategia terapéutica contra la T-ALL.
El hallazgo de que ICN1 induce la expresión de CD44 y regula la interacción de las células T humanas aberrantes con el microambiente de la BM es especialmente relevante, ya que el incremento de la expresión de CD44 no sólo se ha descrito en células T pre- leucémicas en modelos de ratón (Kindler et al. 2008), sino que también se ha observado en las LICs de diversas leucemias humanas que incluyen la leucemia mieloide aguda (AML) y la leucemia mieloide crónica (CML) (Jin et al. 2006; Krause et al., 2006, Liu and Jiang, 2006; Hertweck et al. 201 1). Considerando estos datos, analizamos si las interacciones mediadas por CD44 también podrían participar en el injerto in vivo en la BM de leucemias T-ALL humanas primarias. Para ello, se utilizó el modelo de xenotrasplante de las leucemias T-ALL primarias en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc'~. En primer lugar, se analizaron células de BM o PB procedentes de pacientes no tratados diagnosticados con T-ALL y se confirmó la expresión in vivo de CD44 en estas leucemias (Figura11). A continuación las leucemias se trataron con un mAb bloqueante contra CD44 humano (clon 515; BD Biosciences; Kansas et al., 1990) y se analizó el efecto del tratamiento sobre su capacidad de injerto y progresión in vivo tras su trasplante en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x yc '~. El análisis por citometría de flujo a diversos tiempos post-trasplante mostró que el pre-tratamiento con un agente inhibidor de la función de CD44, como un mAb anti-CD44, impedía tanto el injerto de la T-ALL en la BM como la expansión de las células leucémicas en timo, bazo y PB de los ratones trasplantados (Figura 12A). Datos similares se pueden obtener con células leucémicas transducidas con vectores lentivirales portadores de shRNA frente a CD44.
Por tanto, las células iniciadoras de la T-ALL parecen requerir la interacción de CD44 con el nicho adecuado en la BM para mantener sus propiedades leucemogénicas y promover su expansión in vivo.
Para valorar la relevancia clínica de estos resultados, se analizó el efecto del tratamiento in vivo por administración intraperitoneal de un mAb bloqueante anti-CD44 (clon HP2/9; de la Hera et al. 1989; Liao et al. 1995) en ratones inmunodeficientes RAG-2"'" x ye 1' que habían sido trasplantados con leucemias T-ALL primarias humanas 7 días antes del inicio del tratamiento. Este tratamiento disminuyó notablemente la carga leucémica total en BM, bazo, timo y PB de los ratones trasplantados a lo largo de 6 semanas (Figura 12B), en comparación con animales tratados con un mAb irrelevante del mismo isotipo (Figura 12C). Como consecuencia, el tratamiento con un agente inhibidor de la función de CD44, como un mAb anti-CD44, inhibió el desarrollo y progresión de la T-ALL en el bazo, impidiendo la aparición de esplenomegalia que se observa en los ratones control (Figura 12D). Estos resultados demuestran que el bloqueo de la función de CD44 inhibe con una gran eficiencia tanto el mantenimiento como la progresión de las leucemias humanas T- ALL in vivo. Por tanto, CD44 y su ligando, el ácido hialuronico, constituyen nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la T-ALL.
BIBLIOGRAFÍA Aifantis I, Raetz E, Buonamici S. 2008. Molecular pathogenesis of T-cell leukaemia and lymphoma. Nat Rev Immunol. 8:380-390.
Artavanis-Tsakonas, S, Rand, MD, Lake, RJ. 1999. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science 284:770-776.
Aster JC, Xu L, Karnell FG, Patriub V, Pui JC, Pear WS. 2000. Essential roles for ankyrin repeat and transactivation domains in induction of T-cell leukemia by Notchl . Mol CelI Biol. 20:7505-15.
Avigdor A, Goichberg P, Shivtiel S, Dar A, Peled A, Samira S, Kollet O, Hershkoviz R, Alón R, Hardan I, Ben-Hur H, Naor D, Nagler A, Lapidot T. 2004. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/progenitor cells to bone marrow. Blood. 103:2981-9.
Buggins AG, Levi A, Gohil S, Fishlock K, Patten PE, Calle Y, Yallop D, Devereux S.2011. Evidence for a macromolecular complex in poor prognosis CLL that contains CD38, CD49d, CD44 and MMP-9. Br J Haematol, 154:216-22.
Chiang MY, Xu ML, Histen G, Shestova O, Roy M, Nam Y, Blacklow SC, Sacks DB, Pear WS, Aster JC. 2006. Identification of a conserved negative regulatory sequence that influences the leukemogenic activity of NOTCH 1. Mol Cell Biol. 26:6261-71. Chiang MY, Xu L, Shestova O, Histen G, L'heureux S, Romany C, Childs ME, Gimotty PA, Aster JC, Pear WS. 2008. Leukemia-associated NOTCH1 alíeles are weak tumor initiators but accelerate K-ras-initiated leukemia. J Clin Invest. 118:3181-94.
Coustan-Smith E, Song G, Clark C, Key L, Liu P, Mehrpooya M, Stow P, Su X, Shurtleff S, Pui CH, Downing JR, Campana D. 201 1. New markers for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1 17:6267-76.
de la Hera A, Acevedo A, Marston W, Sánchez-Madrid F. 1989. Function of CD44 (Pgp-1) homing receptor in human T cell precursors. Int Immunol. 1 :598-604.
Giannopoulos K, Mertens D, Bühler A, Barth TF, Idler I, Móller P, Króber A, Greiner J, Chocholska S, Dmoszyñska A, Roliñski J, Dóhner H, Stilgenbauer S, Schmitt M. 2009. The candidate immunotherapeutical target, the receptor for hyaluronic acid-mediated motility, is associated with proliferation and shows prognostic valué in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 23: 519-27.
Hagenbeek TJ, Spits H. 2008. T-cell lymphomas in T-cell-specific Pten-deficient mice origínate in the thymus. Leukemia. 22:608-19.
Herishanu Y, Gibellini F, Njuguna N, Hazan-Halevy I, Farooqui M, Bern S, Keyvanfar K, Lee E, Wilson W, Wiestner A. Activation of CD44, a receptor for extracellular matrix components, protects chronic lymphocytic leukemia cells from spontaneous and drug induced apoptosis through MCL-1. Leuk Lymphoma, 52: 1758-69.
Hertweck MK, Erdfelder F, Kreuzer KA. 201 1. CD44 in hematological neoplasias. Ann Hematol. 90:493-508.
Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE. 2006. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 12: 1 167-74.
Kansas GS, Muirhead MJ, Dailey MO. 1990. Expression of the CD11/CD18, leukocyte adhesión molecule 1 , and CD44 adhesión molecules during normal myeloid and erythroid differentiation in humans. Blood. 76:2483-2492.
Kindler T, Cornejo MG, Scholl C, Liu J, Leeman DS, Haydu JE, Fróhling S, Lee BH, Gilliland DG. 2008. K-RasG12D-induced T-cell lymphoblastic lymphoma/leukemias harbor Notchl mutations and are sensitive to gamma-secretase inhibitors. Blood. 1 12:3373-82. Liao HX, Lee DM, Levesque MC, Haynes BF. 1995. N-terminal and central regions of the human CD44 extracellular domain particípate in cell surface hyaluronan binding. J Immunol. 155:3938-45.
Kopan, R, llagan, MX. 2009. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell 737:216-233.
Krause DS, Lazarides K, von Andrian UH, Van Etten RA. 2006. Requirement for CD44 in homing and engraftment of BCR-ABL-expressing leukemic stem cells. Nat Med. 12: 1 175-1 180.
Liu J, Jiang G. 2006. CD44 and hematologic malignancies. Cell Mol Immunol. 3:359-365.
Márquez C, Trigueros C, Fernández E, Toribio ML. 1995. The development of T and non-T cell lineages from CD34+ human thymic precursors can be traced by the differential expression of CD44. J Exp Med. 181 :475-83.
Pear WS, Aster JC, Scott ML, Hasserjian RP, Soffer B, Sklar J, Baltimore D. 1996. Exclusive development of T cell neoplasms in mice transplanted with bone marrow expressing activated Notch alíeles. J Exp Med. 183:2283-91.
Pui JC, Allman D, Xu L, DeRocco S, Karnell FG, Bakkour S, Lee JY, Kadesch T.Hardy RR, Aster JC, Pear WS. 1999. Notchl expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity 1 1 :299-308.
Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. 2004. N Engl J
Med. 350:1535-48.
Radtke F, Wilson A, Stark G, Bauer M, van Meerwijk J, MacDonald HR, Aguet M. 1999. Deficient T cell fate specification in mice with an induced inactivation of Notchl Immunity 70:547-558.
Weijer K, Uittenbogaart CH, Voordouw A, Couwenberg F, Seppen J, Blom B, Vyth-
Dreese FA, Spits H. Intrathymic and extrathymic development of human plasmacytoid dendritic cell precursors in vivo. 2002 Blood.99:2752-2759.
Weng, AP, Ferrando, AA, Lee, W, Morris, JP, Silverman, LB, Sanchez-lrizarry, C, Blacklow, SC, Look, T, Aster, JC. 2004. Activating mutations of NOTCH 1 in human T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Science 306: 269-271.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína CD44 humana codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es inhibidor de la función de dicha proteína CD44, para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento útil para la prevención y/o tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda humana.
2. Uso del anticuerpo o del fragmento del mismo según la reivindicación 1 , caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de inhibir el injerto y/o la expansión de células humanas iniciadoras de la leucemia linfoblástica aguda humana en la médula ósea de un paciente.
3. Uso del anticuerpo o del fragmento del mismo según la reivindicación 2, caracterizado por que el anticuerpo es monoclonal.
4. Uso del anticuerpo o del fragmento del mismo según las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que la leucemia linfoblástica aguda es una leucemia linfoblástica aguda T humana.
5. Una composición farmacéutica y/o medicamento caracterizada/o por comprender al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína CD44 humana codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es inhibidor de la función de dicha proteína CD44, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una leucemia linfoblástica aguda humana.
6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, caracterizada por que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de inhibir el injerto y/o la expansión de células humanas iniciadoras de la leucemia linfoblástica aguda humana en la médula ósea de un paciente.
7. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, caracterizada por que el anticuerpo es monoclonal.
8. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizada por que comprende además una cantidad terapéuticamente aceptable de al menos un vehículo, un excipiente y/o un aditivo.
9. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizada por que la leucemia linfoblástica aguda es una leucemia linfoblástica aguda T humana.
10. Un kit para el tratamiento y/o prevención de la leucemia linfoblástica aguda humana caracterizado por comprender al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, capaz de reconocer específicamente y/o selectivamente la proteína CD44 humana codificada por el gen CD44 con SEQ ID No. 1 , donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es inhibidor de la función de dicha proteína CD44, o al menos una composición farmacéutica y/o medicamento definida/o en las reivindicaciones 5-9.
1 1. Un kit según la reivindicación 10, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de inhibir el injerto y/o la expansión de células humanas iniciadoras de la leucemia linfoblástica aguda humana en la médula ósea de un paciente.
12. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 10-1 1 , caracterizado por que el anticuerpo es monoclonal.
13. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizado por que la leucemia linfoblástica aguda es una leucemia linfoblástica aguda T humana.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024750A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Dyax Corporation Cd44-binding ligands
WO2009007124A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Friedrich-Alexander-Universität Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
WO2012012759A2 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 The Regents Of The University Of California Anti-tumor antigen antibodies and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024750A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Dyax Corporation Cd44-binding ligands
WO2009007124A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Friedrich-Alexander-Universität Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
WO2012012759A2 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 The Regents Of The University Of California Anti-tumor antigen antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERTWECK MAGDALENA KATHARINA ET AL.: 'CD44 in hematological neoplasias' ANNALS OF HEMATOLOGY GERMANY (2011) vol. 90, no. 5, 30 April 2011, pages 493 - 508 *
JIN, L. ET AL.: ''Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stemcells'' NAT MED vol. 12, 2006, pages 1167 - 1174 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021233962A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Institut Curie Methods for the diagnosis and treatment of cytokine release syndrome

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