CN106794216B

CN106794216B - 阻断异粘蛋白-snd1相互作用的肽作为癌症治疗的用途

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Publication number: CN106794216B
Application number: CN201580041336.5A
Authority: CN
Inventors: 康毅滨; 刑永娜; 万里玲; 郭锋
Original assignee: Princeton University; Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Princeton University; Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: US20170189481A1; US10786545B2; AU2015279834A8; US20190336574A1; AU2015279834A1; WO2015200648A1; CN106794216A; EP3177308B1; US10357539B2; JP2017520574A; JP6797027B2; WO2015200648A8; JP2020097598A; EP3177308A4; EP3177308A1

Abstract

本公开内容一般涉及通过使用肽或其他化合物干扰异粘蛋白与含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)的相互作用来治疗癌症的方法，所述肽或其他化合物抑制SND1与异粘蛋白的结合，并且抑制肿瘤细胞中的MTDH‑SND1复合物的活性。

Description

阻断异粘蛋白-SND1相互作用的肽作为癌症治疗的用途

相关专利申请

本专利申请要求于2014年6月25日提交的美国临时专利申请No. 62/016,947的优先权利益，所述美国临时专利申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。

政府补助

本发明在政府支持下由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R01CA134519和R01GM096060作出。政府在本发明中拥有某些权利。

技术领域

本公开内容涉及治疗癌症以及减少肿瘤生长、复发和转移的方法，所述方法包括施用抑制剂，所述抑制剂阻断异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)的相互作用，并且抑制MTDH-SND1复合物的功能。考虑抑制剂包括MTDH的肽或片段，所述MTDH的肽或片段结合SND1或者来源于SND1的肽或片段，所述SND1的肽或片段结合异粘蛋白。

以引用的方式并入

以引用的方式全文并入的是随同同时提交且如下鉴定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“48166_SeqListing.txt”；17,037字节； 2015年6月24日创建的ASCII文本文件。

背景技术

癌症的特征在于无法控制的遗传和表观遗传改变。重现性的DNA 拷贝数改变通常指示受累基因座中的癌症的关键驱动物的存在。异粘蛋白(MTDH；也称为AEG1、LYRIC)先前已鉴定为位于8q22中的促转移基因，所述8q22是与乳腺癌的弱无复发存活联系的频繁扩增的基因组基因座(Hu等人，2009)。MTDH的过表达在超过40％的原发性肿瘤中观察到，并且是独立的预后不良因素(Hu等人，2009)。驱动MTDH在原发性乳腺肿瘤中的强选择的原因尚不明确，并且MTDH 在正常发育和肿瘤生成中的功能意义仍知之甚少。

使用细胞培养或异种移植物模型的近期研究已牵涉几种癌症相关过程中的MTDH，所述癌症相关过程包括增殖、细胞死亡、侵入和血管生成(Emdad等人，2013)，尽管MTDH在这些过程中的潜在机制理解迄今为止仍是有限的。在乳腺癌中，MTDH假定为介导癌细胞粘附至肺内皮的跨膜蛋白质(Brown和Ruoslahti，2004)。在某些癌症类型中，MTDH已联系至多重致癌途径，例如PI3K/AKT和NF-κB (Emdad等人，2013)。MTDH如何调节这些途径仍然难以捉摸。尽管在高等脊椎动物中是进化保守的，但MTDH含有不可识别的功能结构域，使对其生物功能的理解有挑战性。多个团体已鉴定几个MTDH 结合配偶体，包括PLZF、BCCIPα和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1) (Wan和Kang，2013)。然而，与这些蛋白质的相互作用是否以及如何介导MTDH的功能很大程度上是未知的。

乳腺癌是一种异质性疾病，其可基于基因表达谱广泛地分类为管腔和基底样亚型(Perou等人，2000)。已推测不同的致癌信号传导可靶向不同起源的细胞，从而导致形成不同亚型的乳腺癌。然而，肿瘤起始细胞(TIC)在不同癌基因诱导的乳腺肿瘤中的起源、身份和调节仍得到很少表征。小鼠中的自身肿瘤生成提供了用于跟踪肿瘤起始期间的早期变化以及用于研究目的基因在介导TIC的转化和扩增中的作用的良好模型。

发明内容

本公开内容已显示异粘蛋白(MTDH)对于管腔和基底乳腺肿瘤起始细胞(TIC)以及前列腺肿瘤两者的扩增和功能是重要的，并且强调了过表达MTDH在不同肿瘤亚型中的选择压力。MTDH对其与SND1的保守相互作用的功能依赖性表明，靶向MTDH-SND1复合物可通过防止TIC的扩增而提供控制肿瘤起始、复发和转移的机会，伴随对正常组织的最低限度影响。

本公开内容提供了用于预防或减少受试者中的肿瘤起始细胞的复发或扩增的方法，所述方法包括施用干扰MTDH和SND1的相互作用的试剂。本公开内容还提供了用于治疗患有癌症的受试者中的癌症的方法，所述方法包括给受试者施用破坏MTDH和SND1之间的相互作用的抑制剂。

在各个实施例中，抑制剂结合SEQ ID NO:1中所示的MTDH的残基364-582(例如MTDH的氨基酸364-407)内的人MTDH区域。在一些实施例中，抑制剂结合SND1SN1/2结构域。在一些实施例中，抑制剂结合SEQ ID NO:2中所示的SND1的残基16-339(例如SND1 的氨基酸39-43)内的人MTDH区域。在各个实施例中，本公开内容提供了用于减少或降低受试者中的肿瘤起始细胞扩增的方法，所述方法包括施用异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)之间的相互作用的抑制剂，其中所述抑制剂抑制异粘蛋白(SEQ ID NO:1) 的残基364至407内的SND1蛋白质相互作用。

在各个实施例中，受试者患有癌症。本文考虑的示例性癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、宫颈癌、膀胱癌以及详述中列出的那些。在各个实施例中，癌症选自乳腺癌和前列腺癌。在一些实施例中，癌症是肝癌。

考虑MTDH/SND1抑制剂是MTDH的肽、SND1的肽、与包含 MTDH的残基393-403的肽具有相似结构的肽模拟物、与包含MTDH 的残基393-403的肽具有相似结构或结构部分的小分子化合物、或含有本文描述的肽或肽模拟物的纳米颗粒缀合物。

在各个实施例中，抑制剂是肽。例如，在各个实施例中，肽包含共有序列XWXXXXXXWXX(SEQ ID NO:3)，其中X是任何氨基酸。在各个实施例中，肽包含来自MTDH(SEQID NO:2)的残基393-403 的共有序列XWXXXXXXWXX(SEQ ID NO:3)，其中X是任何氨基酸。在各个实施例中，抑制剂是包含共有序列XWXXXXXWXX(SEQ ID NO:4)的肽，其中X是任何氨基酸。在各个实施例中，抑制剂是选自下述的MTDH的肽：i)在MTDH的残基364-582内的肽，ii)在MTDH 的残基364-407内的肽，iii)包含MTDH的残基386-407的肽，或iv) 包含MTDH的残基393-403的肽。在各个实施例中，抑制剂是选自下述的MTDH的肽：i)基本上由SEQ ID NO:1的残基364-582组成的肽， ii)具有MTDH的残基364-407的肽，iii)基本上由SEQ ID NO:1的残基 386-407组成的肽，或iv)基本上由SEQ ID NO:1的残基393-403组成的肽。在一些实施例中，肽是本文描述的野生型MTDH肽中任一种的变体，其中变体肽保留W394和W401，其中位置基于野生型MTDH 的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1)。

在各个实施例中，肽包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列或其变体，其中变体肽包含在除了W残基之外的任何位置处的至少一个(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一个)突变。在一些实施例中，肽长约11至约22个氨基酸(例如长约15至约22个氨基酸)。在一些实施例中，肽包含对DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列N 末端的约1、2、3、4、5、6或7个氨基酸中的任一种或其变体。在一些实施例中，肽包含对DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列C末端的约1、2、3或4个氨基酸中的任一种或其变体。在一些实施例中，肽包含DWNAPEEWGN(SEQ IDNO:20)的序列或其变体，其中变体肽包含在除了W残基之外的任何位置处的至少一个(例如2、3、4、5、 6、7、8或9中任一个)突变。在一些实施例中，肽长约10至约21个氨基酸(例如长约14至约21个氨基酸)。在一些实施例中，肽包含对DWNAPEEWGN(SEQ ID NO:20)的序列N末端的约1、2、3、4、5、 6或7个氨基酸中的任一种或其变体。在一些实施例中，肽包含对DWNAPEEWGN(SEQ ID NO:20)的序列C末端的约1、2、3或4个氨基酸中的任一种或其变体。

在各个实施例中，肽包含在选自D389、A392、D393、N395、 E399、E400、W404、D406和E407的一个或多个氨基酸残基处的在 MTDH中的突变，其中氨基酸位置基于野生型MTDH序列(即SEQ ID NO:1)。在各个实施例中，肽包含在选自D389R、D393R、E399R、 E400R、W404D、D406R和E407R的一个或多个氨基酸残基处的在 MTDH中的突变，其中位置基于野生型MTDH序列(即SEQ ID NO:1)。在各个实施例中，突变选自SEQ ID NO:1的D389R、D393R、E399R、E400R、W404D、D406R和E407R。

在各个实施例中，抑制剂是在SND1(即SEQ ID NO:2)的残基 16至339内的SND1的肽。在一个实施例中，SND1肽包含在选自F250、 R324、R255、R327、R324、P39、P43、E247、L256、H279、I284、 L287、R259和N281的一个或多个残基处的突变，其中位置基于野生型SND1序列(即SEQ ID NO:2)。在各个实施例中，SND1中的突变选自SEQ ID NO:2的F250AR324E和R255E。

本文考虑抑制剂肽是融合蛋白的部分。在某些实施例中，肽融合至FC结构域。

本公开内容还提供了包含本文描述的MTDH/SND1抑制剂和药学可接受的载体的组合物(例如药物组合物)。本发明还提供了经分离的肽抑制剂(例如本文描述的肽中的任何一种)。本专利申请还提供了制备且使用本文描述的肽抑制剂(以及包含此类肽抑制剂的组合物) 中的任何一种的方法。

因此，例如，在一些实施例中，本发明提供了破坏受试者中的 MTDH和SND1之间的相互作用的方法，所述方法包括给受试者施用上文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物)中的任何一种。在一些实施例中，本发明提供了抑制受试者中的促存活基因的 SND1依赖性表达的方法，所述方法包括给受试者施用上文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物)中的任何一种。

本发明还考虑了可用于研究MTDH和SND1的抑制剂的动物，包括本文描述的MTDH敲除和击倒模型以及本文描述的SND1击倒模型。

本发明还考虑了在MTDH和SND1之间结合的晶体结构，所述晶体结构可用于鉴定MTDH和SND1之间的相互作用的抑制剂。

附图说明

图1A-O显示了Mtdh的系统缺失抑制乳房肿瘤形成和转移。(图 1A)WT和突变型Mtdh等位基因的图示。绿色框代表外显子1-12。用于基因分型的引物(F，正向；R，反向)指示在相应的基因组序列上方。(图1B)通过X-gal染色显现的在第10.5天时的WT和KO胚胎中的LacZ表达。(图1C)从具有所示Mtdh基因型的8周龄雌性小鼠中新鲜解离的MEC中的MTDH蛋白质免疫印迹。(图1D)具有所示 Mtdh基因型的MMTV-PyMT雌性中的乳房肿瘤发作的动力学。Mtdh+/+(n＝13)，Mtdh+/-(n＝26)和Mtdh-/-(n＝30)。(图1E)与(图 1D)中相同的小鼠群组在所示年龄时的无肿瘤乳腺百分比。(图1F) 在所示年龄时评估的PyMT；Mtdh+/+、PyMT；Mtdh+/-和PyMT；Mtdh-/- 群组的总肿瘤负荷。统计学比较在Mtdh+/+和Mtdh-/-组之间完成。数据代表平均值±SEM(n>20)。(图1G)在PyMT；Mtdh+/+(n＝15)、 PyMT；Mtdh+/-(n＝11)和PyMT；Mtdh-/-(n＝14)动物中的肺转移结节数目。误差条代表5-95百分位数。(H)在具有所示基因型的MMTV-ErbB2 小鼠中的乳房肿瘤发作的动力学。Mtdh+/+(n＝22)，Mtdh+/-(n＝31) 和Mtdh-/-(n＝27)。(图1I)在300日龄时荷有所示肿瘤数目的来自与(图1H)中相同群组的小鼠百分比。(图1J)来自Mtdh+/+(n＝30) 和Mtdh-/-(n＝23)组的荷瘤MMTV-ErbB2小鼠中的肺转移的发生率。 (图1K)来自(图1J)的相同小鼠群组中的转移病灶数目/肺切片。误差条代表5-95百分位数。(图1L)在具有所示基因型的MMTV-Wnt 小鼠中的乳房肿瘤发作的动力学。Mtdh+/+(n＝31)，Mtdh+/-(n＝48) 和Mtdh-/-(n＝31)。(图1M)在300日龄时荷有所示肿瘤数目的来自与(L)中相同群组的小鼠百分比。(图1N)如所示的(顶部)用MPA 和DMBA处理的具有所示Mtdh基因型的小鼠中的乳房肿瘤发作的动力学。肿瘤潜伏期记录为第一次DMBA处理后的天数。Mtdh+/+(n＝ 19)，Mtdh+/-(n＝13)和Mtdh-/-(n＝10)。(图1O)在4月龄时荷有所示肿瘤数目的来自与(图1N)中相同群组的小鼠百分比。统计学：(图 1D、图1H、图1L、图1N)时序检验。(图1E、图1I、图1J、图1M、图1O)卡方检验。(图1G、图1K)曼怀二氏检验。(图1F)斯氏t 检验。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图2A-H显示了来自Mtdh-/-小鼠的乳腺显示出在癌基因诱导的扩增和致瘤潜力中的缺陷。(图2A)来自具有所示基因型的6周龄雌性的乳腺的CD45-CD31-TER119-(Lin-)MEC的流式细胞术。(图2B、图2C)在(图2A)(n＝4)中分析的管腔(图2B)和基底(图2C)细胞的定量。(图2D)用从MMTV-PyMT(n＝6)、MMTV-Wnt(n＝4)、 MMTV-ErbB2(n＝6)小鼠的肿瘤前腺体解离的WT或KO MEC的乳房球(mammosphere)形成测定。测定对于每个乳腺一式三份执行。(图2E) 在从PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-小鼠的肿瘤前腺体解离的未分选 MEC的原位移植后3个月的乳房肿瘤发生率(左)和大小(右)。(图 2F)在来自PyMT；Mtdh+/+小鼠的肿瘤前腺体的所示分选的 CD24+CD29低管腔或CD24+CD29高基底MEC的原位移植后8周的乳房肿瘤发生率(左)和大小(右)。(图2G、图2H)在来自 PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-小鼠的肿瘤前腺体的Lin-CD24+CD29 低管腔细胞的原位移植后8周的乳房肿瘤发生率(图2G)和体积(图2H)。统计学：(图2B-D)斯氏t检验。(图2E-H)，基于有限稀释分析的肿瘤发生率和基于曼怀二氏检验的肿瘤体积。***p<0.001，**p <0.01，*p<0.05。数据代表平均值±SEM。

图3A-L还显示了MTDH是癌基因诱导的管腔和基底TIC而不是 MaSC的活性所需的。(图3A、图3B)在来自6月龄ErbB2；Mtdh+/+(n ＝14)、ErbB2；Mtdh+/-(n＝26)和ErbB2；Mtdh-/-(n＝16)小鼠的无肿瘤乳腺中的增生发生率(图3A)和严重性(B)。(图3C)使用CD29和CD61 标记物来自具有所示基因型的6周龄雌性的乳腺的 CD45-CD31-TER119-CD24+MEC的流式细胞术。注意，这是与图3B 中所示相同的分批实验。(图3D)在(图3A)(n＝4)中分析的CD24+ (上图)、CD24+CD29低管腔细胞(中图)和CD24+CD29hi基底细胞(下图)中的CD61+细胞百分比。数据代表平均值±SEM。(图3E) 来自从Wnt增生腺体解离的所示细胞群的CD61+或CD61-细胞的乳房球形成测定。数据代表平均值±SEM。(图3F、图3G)来自7个月无肿瘤乳腺的所示分选管腔和基底群的10000个细胞的原位移植到NSG 小鼠内之后2个月的乳腺肿瘤发生率(图3F)和肿瘤体积(图3G)。 (图3H)自发性ErbB2诱导的肿瘤和通过所示移植细胞生成的肿瘤的 H&E染色。比例尺：200μm(上)和100μm(下)。(图3I)在(图 3J-K)中使用的乳腺重构测定的示意图。(图3J、图3K)显示从WT 或KO雌性处女小鼠的乳腺解离的Lin-MEC(图3J)或 Lin-CD24+CD29hi MEC(图3K)的有限数目移植到WT接受者的清除乳房脂肪垫内的表。组合且显示了三个独立分批的实验。(图3L)在 (图3K)中重构的乳房生长的定量(填充有生长的脂肪垫面积％)。实验组无一通过曼怀二氏检验是有意义的。统计学：(图3D、图3E)斯氏t检验。(图3G)曼怀二氏检验。(图3A、图3F)Fisher氏精确检验。(图3B)卡方检验。(图3J、图3K)有限稀释分析。***p<0.001， **p<0.01，*p<0.05。

图4A-O显示了MTDH是癌基因诱导的TIC功能性固有需要的。 (图4A)用于生成具有(Mtdh-/-+Tg)或不具有MMTV-Mtdh转基因的 PyMT；Mtdh-/-小鼠的MMTV-Mtdh转基因构建体和育种计划的示意图。 (图4B)来自Mtdh+/+、Mtdh-/-或Mtdh-/-+Tg小鼠的PyMT诱导肿瘤中的MTDH蛋白质水平。(图4C)来自具有所示基因型的6周龄雌性的肿瘤前乳腺的Lin-MEC(n＝4)中的CD24+CD29低管腔群的定量 (左侧柱：Mtdh-/-小鼠；右侧柱：Mtdh-/-+Tg小鼠)。(图4D)具有所示基因型的MMTV-PyMT雌性中的乳房肿瘤发作的动力学。 Mtdh-/-(n＝21)，Mtdh-/-+Tg(n＝20)。图4(E)与(图4D)中相同的小鼠群组在所示年龄(左侧柱：Mtdh-/-小鼠；右侧柱：Mtdh-/-+Tg 小鼠)时的无肿瘤乳腺的平均数目。(图4F)与(图4D)中相同的小鼠群组的肿瘤负荷。(图4G、图4H)MTDH在新鲜解离的 PyMT；Mtdh+/+pMEC和体外乳房球中被两种独立shRNA(KD1和 KD2)击倒(图4G，n＝5，各自一式三份；左侧柱：对照；中间柱： KD1；右侧柱：KD2)，并且执行体内肿瘤形成测定(图4H，在3个月时的发生率)。FC，倍数变化。(图4I、图4J)小鼠MTDH在经由慢病毒转导的新鲜解离的PyMT；Mtdh-/-pMEC中以及体外乳房球(图4I，n＝4，各自一式三份；左侧柱：载体；右侧柱：MTDH)中表达，并且执行体内肿瘤形成(图4J)测定。(图4K)L-O中的实验的示意图。(图4L)来自PyMT；Mtdh+/+肿瘤的ALDH阳性或ALDH阴性肿瘤细胞的乳房球形成。(图4M)MTDH在来自PyMT；Mtdh+/+肿瘤的分选ALDH+细胞中被击倒，并且执行乳房球测定。(图4N)来自 Wnt；Mtdh+/+肿瘤的Lin-CD24+CD61+或Lin-CD24+CD61-肿瘤细胞的乳房球形成。(图4O)MTDH在来自Wnt；Mtdh+/+肿瘤的分选 Lin-CD24+CD61+细胞中被击倒，并且执行乳房球测定。统计学：(图 4C、图4G、图4I、图4L-O)斯氏t检验。(图4D)时序检验。(图 4E)卡方检验。(图4F)曼怀二氏检验。(图4H、图4J)有限稀释分析。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。数据代表平均值±SEM。

图5A-H显示了MTDH是乳房上皮细胞的肿瘤起始活性固有需要的。(图5A)包括MMTV-LTR(小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复)启动子、小鼠Mtdh编码序列和SV40多腺苷酸化序列的MMTV-Mtdh转基因构建体的示意图。HindIII和EcoRI限制性位点用于克隆Mtdh；SalI和SpeI限制位点用于使片段线性化用于显微注射到小鼠受精卵内。 (图5B)由转基因小鼠尾剪纯化的基因组DNA经历DNA印迹。显示的是在通过两种独立的限制性酶消化后的一个阳性创立者系18和两个阳性对照。(图5C)来自8周龄转基因阳性或阴性雌性同窝者的器官中的Mtdh mRNA水平(左侧柱：9077MMTV-Mtdh-/-；中间柱：9078 MMTV-Mtdh-/-；右侧柱9079MMTV-Mtdh-/-)。所有小鼠均具有野生型内源Mtdh等位基因。(图5D)来自具有或不具有MMTV-Mtdh转基因的PyMT；Mtdh-/-小鼠的自发性PyMT诱导肿瘤的H&E染色。比例尺：200μm(上)和100μm(下)。(图5E)MTDH在ErbB2；Mtdh+/+ pMEC(n＝5)中被两种shRNA(KD1和KD2)击倒，并且乳房球形成测定对于每种独立样品一式三份执行(左侧柱：对照；中间柱：KD1；右侧柱：KD2)。数据代表平均值±SEM，通过斯氏t检验***p<0.001。 (图5F)在用PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞注射的FVB小鼠中的乳房肿瘤发作(左)和生长(右)的动力学，所述PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞用载体对照或Mtdh表达慢病毒(n＝10)进行转导。p值基于时序检验(左)和斯氏t检验(右)。(图5G、图5H)在用载体对照或Mtdh表达慢病毒转导的pMEC(来自两只独立的PyMT；Mtdh-/-小鼠)的原位移植后的乳房肿瘤发生率。(图5I)在来源于PyMT；Mtdh+/+肿瘤的细胞中的 ALDH活性的代表性流式细胞术分析。DEAB抑制剂处理的样品充当门控对照。(图5J)在用来自(图5I)的ALDH阳性和阴性肿瘤细胞移植的小鼠中的乳房肿瘤发作(n＝10)的动力学。p值基于时序检验。

图6A-F显示了SND1是MTDH介导的肿瘤起始所需的。(图6A) 在PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞中的MTDH再表达和SND1击倒组合。SND1 KD和MTDH再表达的效率通过蛋白质印迹进行评价。(图6B、图6C) 体外乳房球(图6B)和体内肿瘤形成(图6C，6周)测定用(图6A) 中生成的细胞执行。+/-指示所示蛋白质基于(图6A)中的蛋白质印迹存在(+)还是不存在(-)。(图6D)SND1在PyMT；Mtdh+/+或Wnt；Mtdh+/+ pMEC细胞中被击倒，并且乳房球测定一式三份执行。(图6E、图6F) 在对照或SND1-KD PyMT；Mtdh+/+pMEC的原位移植后的肿瘤发生率 (图6E)和体积(图6F)。统计学：(图6B、图6D)斯氏t检验。 (图6C、图6E)有限稀释分析。(图6F)曼怀二氏检验。***p<0.001， **p<0.01，*p<0.05。数据代表平均值±SEM。

图7A-E代表介导MTDH-SND1相互作用的关键区和残基的测定。 (图7A)具有所示SND1结合能力的MTDH片段和突变体的示意图。基于下文所示的结果，+指示结合，并且-指示无结合。两个假定的核定位信号是关于NLS2的残基432–451和关于NLS3的残基561–580。在最低限度结合区386-407的放大视图中，靶向9个残基用于目前研究中的诱变。W394D和W401D分别完全或强烈减少结合。(图7B)通过具有所示边界的加上GST标签的MTDH片段的His6-SND1ΔC下拉。结合的蛋白质通过SDS-PAGE进行检查并且通过考马斯蓝染色进行显现。(图7C)通过加上GST标签的WT或三重突变体MTDH片段 (364-582)的His6-SND1ΔC下拉。对于(图7B)和(图7C)，显示了His6-SND1ΔC输入的1/10，并且GST单独用作阴性对照。显示了3次独立实验的代表性结果。(图7D、图7E)来自表达所示异位人SND1、 AGO2或MTDH的HEK293T细胞的裂解产物用抗Myc进行免疫沉淀，并且用所示抗体进行免疫印迹。

图8A-H显示了SND1结合缺陷MTDH未能促进MEC的肿瘤起始潜力。(图8A、图8E)来自用载体对照、WT或突变型鼠MTDH 重构的PyMT；Mtdh-/-MEC的裂解产物用抗MTDH抗体进行免疫沉淀，并且就所示蛋白质进行免疫印迹。(图8B、图8F)乳房球测定用由所示Mtdh构建体重构的PyMT；Mtdh-/-pMEC执行。(图8C、图8D、图 8G、图8H)体内肿瘤形成(图8C、图8G关于肿瘤发生率；图8D、图8H关于肿瘤体积)使用由所示WT或突变型MTDH重构的 PyMT；Mtdh-/-pMEC以有限数目执行。*注：小鼠W391D MTDH对应于人W394D MTDH；并且小鼠W398D MTDH对应于人W401D MTDH。统计学：(图8B、图3F)斯氏t检验。(图8C、图8G)有限稀释分析。(图8D、图8H)曼怀二氏检验。数据代表平均值±SEM。***p< 0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图9A-I示出了MTDH通过在应激下与促存活蛋白质SND1相互作用且稳定促存活蛋白质SND1来赋予存活优点。(图9A)来自WT (左侧柱)或KO雌性(右侧柱)的正常或MMTV-PyMT肿瘤前腺体 (n>3)的切割的半胱天冬酶3-阳性MEC的定量。(图9B)CPT对用所示Mtdh构建体重构的PyMT；Mtdh-/-pMEC的细胞凋亡的作用(左侧柱：VEC；中间柱：WT；右侧柱：W391D)通过PI和Hoechst染色进行测定。(图9C)CPT对于对照(左侧柱)或SND1-KD(右侧柱) PyMT；Mtdh+/+pMEC的细胞凋亡的作用。(图9D)在用所示浓度的 CPT处理36小时的对照或MTDH-KDPyMT；Mtdh+/+pMEC中的SND1 和β-肌动蛋白(上样对照)的蛋白质水平。降解曲线(右侧)代表3 次独立实验的平均值。(图9E)在CPT处理48小时后，在用所示构建体重构的PyMT；Mtdh-/-MEC中的SND1、MTDH和β-肌动蛋白(上样对照)的蛋白质印迹。降解曲线(右侧)代表3次独立实验的平均值。(图9F)在CPT(50μM)处理36小时后，在对照相对于SND1-KD PyMT；Mtdh+/+pMEC中展示SND1上调基因(n＝504，倍数变化>2， p<0.05)的表达的微阵列数据的热图表示。色键指示log2值。(图9G) Ingenuity途径分析显示(图9F)中所示的SND1上调基因的顶部5种分子和细胞功能以及每个类别中牵涉的分子/基因数目。(图9H)SND1 上调基因在细胞存活和细胞死亡功能中的效应。Z得分基于如通过 ingenuity知识库指定的基因表达变化和基因功能进行计算。给定功能当z>2时预测为显著增加的，或者当z<-2时预测为减少的。(图9I) GSEA图显示了与用W391D突变型MTDH援救的那些相比较，在用小鼠WT MTDH援救的PyMT；Mtdh-/-MEC中的SND1上调基因标记 (signature)的富集。所有细胞均用CPT(50μM)进行处理。NES：标准化的富集得分。统计学：(图9A-C)斯氏t检验。数据代表平均值±SEM。 ***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图10A-K显示了MTDH和SND1对于人乳腺癌细胞的体外球形成和体内肿瘤起始活性是重要的。(图10A、图10B)MTDH(图10A) 或SND1(图10B)在HMLE-Neu细胞中被击倒，并且肿瘤球测定一式三份执行。(图10C、图10D)MTDH(图10C)或SND1(图10D) 在BCM-4013患者来源的异种移植的(PDX)肿瘤细胞中被击倒，并且肿瘤球测定一式三份执行。(图10E)MTDH或SND1在MDA-MB-231 细胞中被击倒，并且KD效率通过免疫印迹进行测量。(图10F) MDA-MB-231细胞的肿瘤球测定一式三份执行。(图10G、图10H) 在有限数目的MDA-MB-231细胞注射后5周的肿瘤发生率(图10G) 和体积(图10H)。(图10I)在人侵袭性乳癌(n＝154)中的MTDH和 SND1的蛋白质水平通过乳腺癌组织微阵列(BR1921a,US Biomax)的 IHC染色进行测定。肿瘤细胞中的染色强度评分为0(阴性)、1(弱)、 2(中等)、3(强)。(图10J)(图10I)的条形图示。(图10K) 描述MTDH在肿瘤起始而不是正常腺体发育中的必要作用的图示。在肿瘤生成期间的应激条件下，MTDH-SND1相互作用使SND1免于应激诱导的降解，并且支持基底和管腔TIC两者的存活和活性。统计学： (图10A-D、图10F)斯氏t检验。(图10G)有限稀释分析。(图10H) 曼怀二氏检验。(图10I、图10J)卡方检验。数据代表平均值±SEM。 ***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图11A-M显示了MTDH和SND1与人乳腺癌中的蛋白质水平正关联，并且在预测预后不良中协作。(图11A、图11B)MTDH(图 11A)或SND1(图11B)在HMLE-Neu细胞中被3种独立shRNA击倒，并且KD效率通过免疫印迹进行测量。(图11C、图11D)MTDH (图11C)或SND1(图11D)在BCM-4013患者来源的异种移植的(PDX) 肿瘤细胞(Zhang等人，2013)中被2种独立shRNA击倒，并且KO 效率通过q-PCR进行测量。数据代表平均值±SEM。(图11E、图11F) MTDH(图11E)和SND1(图11F)抗体对于免疫组织化学染色的特异性的验证。抗体对人和小鼠蛋白质两者反应。(图 11E)，在 PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-乳房肿瘤中的MTDH的代表性免疫组织化学染色。(图11F)，在PyMT；Mtdh+/+对照或SND1-KD肿瘤中的SND1的代表性免疫组织化学染色。比例尺：100μm。(图11G) 人乳腺肿瘤中的MTDH和SND1的蛋白质水平通过乳腺癌组织微阵列 (YTMA_201,Cancer Institute of New Jersey)的免疫组织化学染色进行测定。肿瘤细胞中的染色强度评分为0(阴性)、1(弱)、2(中等)、 3(强)。(图11H)(图11G)的条形图示。(图11I)在NKI295数据集中的MTDH和SND1的mRNA水平之间的关联。(图11J、图11K)MTDH和SND1mRNA水平与原发性肿瘤大小(图11J)和乳腺肿瘤的分化(图11K)之间的关联。(图11L)通过MTDH和SND1的mRNA 水平分层的乳腺癌患者的无远处转移存活(DMFS)。在图11J-L中，使用NKI295人乳腺癌数据集(van de Vijver等人，2002)，并且样品基于MTDH/SND1mRNA水平使用培养基截断分成四组。(图11M) MTDH mRNA水平与人乳腺癌的不同亚型的预后之间的关联。在KM Plotter乳腺癌元分析数据库中通过中值MTDH表达分层的患者的无复发存活的Kaplan-Meier图(Gyorffy等人，2010)。统计学：(图11C、图11D)斯氏t检验。(图11G、图11H、图11J、图11K)卡方检验。 (图11I)皮尔森相关。(图11L、图11M)时序检验。***p<0.001， **p<0.01，*p<0.05。

图12A-D显示了MTDH水平与人前列腺癌中的肿瘤进展和转移相关。(图12A)两个前列腺肿瘤组织微阵列用抗MTDH抗体进行染色。 MTDH水平评分为负(0)、低(1)、中等(2)或高(3)。不同阶段的前列腺组织和远处转移的MTDH免疫染色的代表性图像。比例尺，40μm。(图12C)，左图，正常组织(n＝62)以及BPN(n＝10)、PIN(n＝10)、原发性肿瘤(n＝72)和远处转移(n＝10)中的MTDH表达水平(左侧柱： MTDH IHC得分0或1；右侧柱：MTDH IHC得分2或3)。通过卡方检验P<0.001。右图，PIN(n＝10)和BPH(n＝10)中的MTDH水平(左侧柱：MTDH IHC得分0；中间柱：MTDH IHC得分1和右侧柱：MTDH IHC得分2)。通过卡方检验P＝0.023。(图12B)，MTDH水平与前列腺肿瘤格里森得分的关联。顶部曲线代表平均MTDH得分(平均值±SEM)，并且底部曲线代表在所示组内具有中等/高水平MTDH的样品百分比。(图12D)，基于其肿瘤中的MTDH表达，前列腺癌患者的无复发存活的Kaplan-Meier分析。

图13A-D显示了MTDH基因组增益与前列腺癌中的MTDH蛋白质水平和临床进展相关。(图13A)，前列腺肿瘤组织微阵列通过FISH 就MTDH基因组拷贝数进行分析。所显示的是不具有(左)或具有(右) MTDH基因组增益的肿瘤的例子。SpectrumGreen(绿色)和SpectrumOrange(淡橙色)探针分别检测染色体8着丝粒和8q22区域。比例尺，1μm。(图13B)，MTDH基因组增益与MTDH蛋白质水平关联。具有MTDH增益的样品，n＝11；不具有MTDH增益的样品，n ＝64。通过卡方检验P＝0.0018。(图13C)，在前列腺非癌性组织或肿瘤中的MTDH基因组增益的频率。正常/良性/恶变前，n＝38；原发性肿瘤，n＝29；远处转移，n＝8。显示了通过卡方检验的P值。(图 13D)，在其肿瘤中具有和不具有MTDH基因组增益的前列腺癌患者的无复发存活的Kaplan-Meier分析。显示了Cox比例风险比(HR)。

图14A-F显示了具有不同Mtdh状态的TRAMP小鼠的代和表征。 (图14A)，在具有不同Mtdh状态的C57BL/6背景中用于生成TRAMP 小鼠的交叉方案。(图14B)，(图14A)中生成的小鼠的基因分型。顶部，检测到的WT(602bp)和Mtdh的基因捕获的突变型等位基因(472bp)。底部，检测到的TRAMP转基因(600bp)和内部基因组对照(324bp)。 (图14C)，通过qPCR分析的来自具有所示基因型的小鼠的前列腺组织中的Mtdh mRNA。Mtdh mRNA在Mtdh^-/-组织中是无法检测的，并且与正常腺体相比较在TRAMP阳性前列腺组织中是升高的。基于曼怀二氏检验**P<0.01，***P<0.001。(图14D)，来自WT非转基因小鼠的前列腺和来自TRAMP/Mtdh^+/+小鼠的肿瘤中的Mtdh的蛋白质印迹分析。在针对β-肌动蛋白标准化后的Mtdh蛋白质的任意水平显示于底部。E-F，来自8周龄(图14E)和28周龄(图14F)TRAMP/Mtdh^+/+和TRAMP/Mtdh^-/-小鼠的前列腺中的SV40Tag癌蛋白的代表性免疫组织化学染色。比例尺，50μm。

图15A-E显示了在小鼠中的Mtdh丧失抑制肿瘤形成，减少肿瘤负荷且增加存活率。(图15A-B)，从TRAMP/Mtdh^+/+和TRAMP/Mtdh^+/-小鼠(指示为Mtdh⁺)或TRAMP/Mtdh^-/-(指示为Mtdh^-)中切除的下部泌尿生殖道的湿重(图15A)或作为体重％的相对重量(图15B)。数据代表平均值±SEM。基于曼怀二氏检验**P<0.01。(图15C)，从具有所示基因型的36周龄雄性小鼠中切除的下部泌尿生殖道(B，膀胱；P，前列腺；SV，精囊)的代表性图像。比例尺，1cm。(图15D)，肿瘤发生率通过检查来自不同年龄具有所示Mtdh基因型的 TRAMP小鼠群组的前列腺的组织切片进行评分。在每个条形图顶部上的数目指示具有前列腺癌的小鼠数目相对于在给定组中检查的小鼠总数目。基于卡方检验*P<0.05和**P<0.01。(图15E)，通过一年年龄具有所示Mtdh基因型的TRAMP小鼠的死亡率。基于卡方检验***P <0.001。

图16A-C显示了Mtdh的丧失抑制前列腺癌的恶性进展。(图 16A)，从所示年龄的TRAMP/Mtdh⁺和TRAMP/Mtdh^-小鼠解离的前列腺H&E染色的组织切片。比例尺：200μm。(图16B)，来自具有所示基因型和年龄的小鼠的每个前列腺指定单一最高级别。‘+’和‘–’分别指示TRAMP/Mtdh⁺和TRAMP/Mtdh^-小鼠。级别得分：1，正常；2，低级别PIN；3，高级别PIN；4，高度分化腺癌和叶状肿瘤；5，中等分化腺癌；6，低分化腺癌和神经内分泌肿瘤。分级方案遵循如先前描述的标准方案(Hurwitz等人，Current protocols in immunology/由John EColigan[等人]编辑.2001；Chapter 20:Unit 20 5)。在每个柱底部处的数目指示在每组中评估的前列腺总数目。在T36中通过卡方检验P<0.05。 (图16C)，Ki67阳性上皮细胞的定量。数据代表平均值±SEM。基于斯氏t检验**P<0.01。

图17A-B显示了Mtdh的消除减少前列腺癌的全身转移。(图 17A)，在具有所示Mtdh基因型的一年龄TRAMP小鼠群组中的肺、肝和淋巴结转移发生率。基于卡方检验的P值。(图17B)，(图17A) 的条形图示(左侧柱：Mtdh+；右侧柱：Mtdh-)。

图18A-G显示了在TRAMP-C1前列腺癌细胞中的Mtdh沉默减少体外增殖和体内肿瘤形成。(图18A-B)，Mtdh被两种独立shRNA击倒，如通过qPCR(图18A)和蛋白质印迹(图18B)定量的。(图18C)，在48小时后的对照和Mtdh-KD TRAMP-C1癌细胞的增殖率。(图 18D)，用对照(n＝16)、Mtdh-KD1(n＝8)和Mtdh-KD2(n＝12) TRAMP-C1细胞皮下移植的雄性小鼠中的前列腺肿瘤发作的动力学。基于时序检验的P值。(图18E)，在(图18D)中注射后5周的肿瘤体积。基于曼怀二氏检验的***P<0.001。(图18F)，在(图18D) 中移植后5周解离的肿瘤的图像。G，在对照和KD组中形成的肿瘤中的Mtdh mRNA水平。注意在KD组中最终生长的肿瘤表达与对照相似水平的Mtdh。(图18A、图18C、图18G)数据代表平均值±SEM和基于斯氏t检验的P值。**P<0.01，***P<0.001，n.s.不显著。

图19显示了SND1-MTDH相互作用及其复合物的总体结构的映射。MTDH-SND1复合物的总体结构。显示了两个垂直视图。SND1和 MTDH的SN1和SN2结构域分别被染成青色、品红色和黄色。SND1 显示于色带(左)和曲面(右)中。MTDH显示于蠕虫(主链)和圆柱(侧链)中。

图20A-B代表了SN1/2与SN3/4和SNase的结构和序列比较。(图 20A)立体视图中的SN1/2(品红色，在具有MTDH的复合物中)、 SN3/4(蓝色，PDB代码：3BDL)以及SNase的两个模型(黄色，PDB 代码：2ENB)的结构覆盖。Lβ2-β3环中的差异通过虚线圆圈强调。(图 20B)SN1/2与来自SND1的SN3/4和SNase的序列比对。二级结构元素指示在序列上方。保守残基颜色为红色。与MTDH相互作用的残基通过绿色方块鉴定。在促成核酸酶活性的SNase的活性位点处的残基通过红色圆圈指示。

图21示出了MTDH-SND1结合界面。MTDH-SND1界面的特写立体照片。显示了来自SN3结构域(浅蓝色)和SNase(黄色)的Lβ2-β3 环，用于突出显示MTDH结合所需的SN1Lβ2-β3环的独特结构。

图22A-D显示了在结合中缺陷的MTDH和SND1突变体的鉴定。 (图22A)通过具有WT或突变体序列的加上GST标签的MTDH (364-582)的SND1(16-339)的体外下拉。结合GS4B的蛋白质在 SDS-PAGE上进行检查，并且通过考马斯蓝染色进行显现。(图22B) 通过加上GST标签的MTDH(364-582)的WT和突变型SND1(16-339) 的体外下拉。结合的蛋白质如(图22A)中进行检查。对于(图22A) 和(图22B)两者，实验重复三次；显示了代表性结果。标准化的结合百分比由三次实验求平均值；平均值±SEM显示于数据下方。(图22C) HEK293T细胞用具有所示单一点突变的人HA-SND1、WT Myc-MTDH 或Myc-MTDH进行转染。裂解产物用抗Myc抗体进行免疫沉淀，并且用所示抗体进行免疫印迹。(图22D)HEK293T细胞用具有所示单一点突变或缺失的人Myc-MTDH、WT HA-SND1或突变型HA-SND1进行转染。裂解产物用抗Myc进行免疫沉淀，并且用所示抗体进行免疫印迹。

图23A-E显示了SND1结合残基中的突变损害MTDH的肿瘤促进功能。(图23A)来自用载体对照、WT或突变型鼠MTDH重构的 PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞的裂解产物用抗MTDH抗体进行免疫沉淀，并且就所示蛋白质进行免疫印迹。注意所有氨基酸注释均基于人MTDH。人MTDH的W394和W401分别对应于鼠MTDH中的W391和W398。 (图23B)乳房球测定用由所示MTDH构建体重构的PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞执行。(图23C-E)体内肿瘤形成(图23C用于肿瘤发生率；图23D、图23E用于肿瘤体积)使用由所示WT或突变型MTDH重构的PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞以有限数目执行。统计学：(图23B)斯氏t 检验。数据代表平均值±SEM.(图23C)有限稀释分析。(图23D、图23E)曼怀二氏检验。**p<0.01，*p<0.05。

图24A-D显示了MTDH结合袋中的突变损害SND1的肿瘤促进功能。(图24A)来自用载体对照、WT或突变型shRNA抗性鼠SND1 重构的SND1-KD PyMT；Mtdh+/+肿瘤细胞的裂解产物用抗MTDH抗体进行免疫沉淀，并且就所示蛋白质进行免疫印迹。(图24B)。乳房球测定用由载体对照或所示SND1构建体重构的SND1-KD PyMT；Mtdh+/+肿瘤细胞执行。(图24C、图24D)在用所示构建体重构的SND1-KD PyMT；Mtdh+/+肿瘤细胞的原位移植后的乳房肿瘤发生率(图24C)和肿瘤生长曲线(图24D)。统计学：(图24B、图24D) 斯氏t检验。数据代表平均值±SEM。(图24C)卡方检验。***p<0.01， *p<0.01，*p<0.05。

图25显示了MTDH相互作用使SND1免于热激(heat shock)应激诱导的降解。HEK293T细胞用HA-SND1连同空载体对照或者所示 WT或突变型Myc-MTDH构建体一起进行转染。感染后两天，细胞在热激条件下进行处理，并且裂解产物就所示蛋白质进行免疫印迹。β- 肌动蛋白用作上样对照。显示了三次独立实验的代表性结果。

图26A-D显示了野生型MTDH肽显著阻断MTDH-SND1相互作用。293T细胞用HA-SND1和MYC-MTDH进行共转染。在48小时后，细胞被收集且经历IP测定。(图26A、图26B)细胞裂解产物与抗HA 抗体或IgG一起温育过夜，随后为与蛋白A/G珠的2小时温育，以下拉HA-SND1蛋白质。珠用裂解缓冲液进行洗涤且分成5个级分。每个级分用缓冲液或所示肽洗脱30分钟。收集洗脱级分和珠用于WB。(图 26C、图26D)细胞裂解产物分成6个级分，其中之一与IgG进行温育，并且剩余部分与抗HA抗体加上缓冲液或所示肽一起温育。在24小时后，裂解产物与蛋白A/G珠一起温育，随后珠在洗涤缓冲液中进行洗涤。

图27A-B显示了相互作用中断效应通过乳腺癌细胞系的内源免疫沉淀加以证实。乳腺癌细胞MDA-MB231被收集且经历IP测定。(图 27A)细胞裂解产物与抗SND1抗体或IgG一起温育过夜，随后为与蛋白A/G珠的2小时温育，以下拉内源SND1蛋白质。珠用裂解缓冲液进行洗涤且分成5个级分。每个级分用缓冲液或所示肽洗脱30分钟。收集洗脱级分和珠用于WB。(图27B)细胞裂解产物分成5个级分，并且与抗SND1抗体加上缓冲液或所示肽一起温育。在24小时后，裂解产物与蛋白A/G珠一起温育，随后珠在洗涤缓冲液中进行洗涤。

图28显示了荷有在SND1结合基序中的突变的MTDH突变体的鉴定，所述突变对SND1结合没有作用或具有很少作用。通过荷有WT 或突变体序列的加上GST标签的MTDH(SEQ IDNO:1的氨基酸 386-407)的SND1(SEQ ID NO:2的氨基酸16-339)的体外下拉。结合GS4B的蛋白质在SDS-PAGE上进行检查，并且通过考马斯蓝染色进行显现。

具体实施方式

本公开内容提供了通过使用肽或其他化合物抑制MTDH-SND1复合物的活性，来减少癌症生长和癌症转移的方法，所述肽或其他化合物抑制SND1与MTDH的结合。本发明人发现MTDH缺陷抑制不同的癌基因或致癌剂诱导的肿瘤生成。下文结果显示MTDH是TIC选择性需要的，并且MTDH介导的SND1稳定赋予在应激下的存活优点。这是MTDH相互作用是SND1依赖性促存活基因表达所需的首个公开内容。

如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“衍生物”包括多个此类衍生物，并且提及“患者”包括提及一个或多个患者等等。

此外，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。类似地，“包含 (comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”可互换且不预期是限制性的。

还应理解当各个实施例的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解在一些具体情况下，实施例可替代地可使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”进行描述。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管本文描述了示例性方法、装置和材料，但与本文描述的那些相似或等价的方法和材料可用于实践所公开的方法和产物。

上文和正文自始至终讨论的文件仅为了其在本专利申请的提交日之前的公开内容而提供。本文中任何内容不应被解释为承认发明人由于在先公开内容而无权先于这样的公开内容。每个文件以引用的方式全文并入，特别注意其被引用的公开内容。

下述参考文献为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker编辑， 1988)；THE GLOSSARYOF GENETICS，第五版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。

如本文使用的，“异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1 (SND1)之间的相互作用的抑制剂”或“MTDH/SND1抑制剂”指在两种蛋白质的结合位点处抑制MTDH与SND1的相互作用的化合物或组合物。在一个实施例中，抑制剂抑制在MTDH(即SEQ ID NO:1)的残基393-403处的蛋白质之间的结合。另外的抑制剂在详述中更详细地描述。

如本文使用的，“治疗有效量”或“有效量”指本文描述的肽或其他抑制剂产物的量，所述量足以导致症状的改善，例如有关医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或者此类状况的治疗、治愈、预防或改善率中的增加，从而通常提供治疗的患者群体中的统计上显著的改善。当提及单独施用的个别活性成分时，治疗有效剂量指该单独成分。当提及组合时，治疗有效剂量指无论是否组合施用(包括序贯或同时) 均导致疗效的活性成分的组合量。在各个实施例中，肽或其他抑制剂产物的治疗有效量改善与各种癌症相关的症状，包括但不限于食欲缺乏、口腔疼痛、上腹痛、疲劳、腹部肿胀、持续性痛、骨痛、恶心、呕吐、便秘、重量减轻、头痛、直肠出血、盗汗、消化不良和尿痛。

“处理”指预防性处理或治疗性处理。在某些实施例中，“处理”指化合物或组合物对受试者的施用用于治疗或预防目的。

“治疗性”处理是施用于显示出病理状况的体征或症状的处理，用于缩小或消除那些体征或症状的目的。体征或症状可为生物化学、细胞、组织学、功能或物理的、主观或客观的。

“预防性”处理是施用于未显示出疾病体征或仅显示出疾病的早期体征的处理，用于减少发展病理状况的危险的目的。本公开内容的化合物或组合物可作为预防性处理给予，以减少发展病理状况的危险。本公开内容的化合物或组合物可作为预防性处理给予，以减少发展病理状况的可能性，或使病理状况(如果发展的话)的严重性降到最低。

“药物组合物”指适合于受试者动物包括人和哺乳动物中的药物用途的组合物。药物组合物包含治疗有效量的本文描述的肽或其他产物，任选另一种生物学活性剂，以及任选的药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一个实施例中，药物组合物涵盖这样的组合物，所述组合物包含活性成分、和构成载体的惰性成分，以及直接或间接起因于成分中的任何两种或更多种的组合、复合或聚集，或者起因于成分中的一种或多种的解离，或者起因于成分中的一种或多种的其他类型的反应或相互作用的任何产物。相应地，本公开内容的药物组合物涵盖通过混合本公开内容的化合物和药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂制备的任何组合物。

“药学可接受的载体”指标准药物载体、缓冲液等等中的任一种，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水溶液、以及乳状液(例如油/ 水或水/油乳状液)。赋形剂的非限制性例子包括佐剂、粘合剂、填料、稀释剂、崩解剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、助流剂、甜味剂、调味剂和着色剂。合适的药物载体、赋形剂和稀释剂在Remington's PharmaceuticalSciences，第19版(Mack Publishing Co.,Easton,1995)中描述。优选的药物载体取决于活性剂的预期施用模式。通常的施用模式包括肠内(例如经口)或胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内或腹膜内注射；或者局部、经皮或经粘膜施用)。

如本文使用的，活性剂的“药学可接受的”或“药理学可接受的”盐、酯或其他衍生物包含例如盐、酯或其他衍生物，指并非生物学或其他方面不期望的材料，即材料可施用于个体而不引起任何不期望的生物效应，或不以有害方式与它包含在其中的组合物的组分中的任一种或个体机体上或机体中存在的任何组分相互作用。

如本文使用的，术语“单位剂型”指适合于作为用于人和动物受试者的单元剂量的物理上不连续单位，每个单位含有以足以产生所需效应的量计算的预定数量的本公开内容的化合物，任选与药学可接受的赋形剂、稀释剂、载体或媒介物结合。关于本公开内容的新型单位剂型的规格取决于采用的具体化合物和待实现的效应，以及在宿主中与每种化合物相关的药效学。

如本文使用的，术语“受试者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类动物例如黑猩猩、以及其他猿和猴物种；农场动物例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物例如兔、犬和猫；实验动物包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等等。该术语不指示特定年龄或性别。在各个实施例中，受试者是人。

异粘蛋白和SND1

异粘蛋白：异粘蛋白(MTDH；也称为AEG1、3D3/LYRIC)先前鉴定为位于8q22中的促转移基因，所述8q22是与乳腺癌的弱无复发存活联系的频繁扩增的基因组基因座(Hu等人，2009)。人异粘蛋白的氨基酸序列可在以引用的方式并入本文的Genbank登录号 AAH45642中发现，并且还在本文中作为SEQ ID NO:1提供。近年来，升高水平的MTDH已在超过20个癌症类型中报道(4)，表明该基因在人癌症中的潜在关键和广泛功能性。取决于测试的癌症类型，主要使用细胞培养系统的近期研究已牵涉许多癌症相关过程中的MTDH，所述癌症相关过程包括细胞增殖、应激诱导的细胞死亡、侵袭、化学抗性和转移(Emdad等人，2013；Wan和Kang，2013)

MTDH的这些多效性肿瘤促进作用可起于这种蛋白质的复杂性质，如通过其初始鉴定揭示的。MTDH最初报道为星形细胞中的HIV 诱导基因(Su等人，2002)，介导乳房肿瘤细胞对肺内皮的归巢的细胞表面分子(Brown和Ruoslahti等人，2004)，与前列腺上皮细胞中的紧密连接相关的富含赖氨酸的CEACAM1共分离(LYRIC)蛋白质 (Britt等人，2004)，以及作为不同亚细胞区室中存在的新型跨膜蛋白质(Sutherland等人，2004)。在分子水平上，人MTDH编码具有可指示其生物功能的无法识别的结构域的582个氨基酸的蛋白质，加上假定的跨膜结构域和三个富含赖氨酸的核定位信号(Thirkettle等人， 2009)。MTDH近期已报道与多重蛋白质相互作用。在核中，MTDH 显示与PLZF(Thirkettle等人，2009)、BCCIPα(Ash等人，2008) 和NFκB亚基p65(Emdad等人，2006；Sarkar等人，2008)相互作用。在细胞质中，MTDH据报道与含葡萄球菌核酸酶结构域蛋白质1(SND1) (Blanco等人，2011；Yoo等人，2011；Meng等人，2012)相互作用。 MTDH还以癌细胞类型依赖性方式联系至多重经典癌基因信号传导途径，例如PI3K/AKT和Wnt信号传导(Emdad等人，2013)。然而， MTDH是否通过与其结合配偶体的相互作用发挥其功能，并且MTDH 如何调节上述癌基因途径在很大程度上仍是未知的。

SND1：SND1是具有在N末端处的葡萄球菌核酸酶(SN)样结构域的四个串联重复(SN1-4)，以及在C末端处的融合tudor和SN结构域 (TSN5结构域)的多功能蛋白质(Callebaut和Mornon，1997；Ponting, 1997)。它属于由蛋白质组成的寡核苷酸/寡糖结合折叠(OB折叠)超家族，所述蛋白质主要经由OB折叠的典型β-桶参与DNA/RNA结合(Theobald等人，2003)。人SND1的氨基酸序列可在以引用的方式并入本文的Genbank登录号NP_055205中发现，并且还在本文中作为 SEQ ID NO:2提供。一致地，SND1表明为RNA诱导沉默复合物(RISC) 的必要组分，并且涉及miRNA介导的沉默(Caudy等人，2003)。它还显示具有针对超编辑的miRNA初级转录物的核酸酶活性(Scadden， 2005)。SND1的结构和生物化学分析表明N末端SN结构域特别是 SN3/4具有RNA结合和核酸酶活性(Li等人，2008)，并且C末端 TSN结构域与甲基化的Lys/Arg配体以及核内小核糖核蛋白(snRNP)复合物相互作用(Shaw等人，2007)。SND1在参与与不同蛋白质的相互作用的OB折叠超家族的极少成员中。它最初鉴定为增强EBNA-2 活化基因的转录的细胞组分(Tong等人，1995)，并且以后显示与涉及转录的广谱蛋白质相互作用且调节涉及转录的广谱蛋白质(Leverson, 1998；Paukku等人，2003；Valineva等人，2005；Valineva等人，2006； Yang,2002)，包括致癌转录因子STAT5、STAT6和c-Myb。近年来， SND1鉴定为多个类型的癌症中的MTDH的结合配偶体，并且已显示对于在致癌或化学疗法应激下的癌细胞存活是重要的(Blanco等人， 2011；Meng等人，2012；Wan等人，2014；Yoo等人，2011)。

SND1是具有类似于MTDH那种的肿瘤促进功能的MTDH的相互作用配偶体(Blanco等人，2011；Meng等人，2012；Wang等人， 2012；Yoo等人，2011)。本文显示具有妥协的SND1结合的生物化学鉴定的MTDH突变体显示出在不同亚型的乳腺癌中的肿瘤起始细胞扩增和存活中的减少活性(Wan等人，2014)。还没有结构的了解可用于理解MTDH及其结合配偶体之间的相互作用，以及这些相互作用如何影响其在癌症中的作用。SND1在癌症中的功能是否依赖于MTDH 结合仍不清楚。鉴定的SND1相互作用蛋白的范围表明其SN结构域已进化成蛋白质-蛋白质相互作用结构域；然而，相互作用的模式在本公开内容之前是不清楚的。

异粘蛋白/SND1抑制剂

如本文使用的，MTDH与SND1的相互作用在肿瘤生长和转移的进展中起重要作用。该蛋白质相互作用的抑制剂的施用作为用于治疗癌症的有用疗法。如实例4中所示，SEQ IDNO:1中所示的野生型 MTDH的残基394和401是与SND1的相互作用所需的。在一些实施例中，抑制剂是包含下述的MTDH的肽：(a)共有序列 XWXXXXXXWXX(SEQ ID NO:3)，其中X是任何氨基酸，或(b) XWXXXXXWXX(SEQ ID NO:4)，其中X是任何氨基酸。在各个实施例中，抑制剂是包含来自MTDH的残基393-403的共有序列 XWXXXXXXWXX(SEQ ID NO:3)的MTDH的肽，其中X是任何氨基酸。在一些实施例中，抑制剂是包含共有序列XWXXXXXWXX(SEQ ID NO:4)的MTDH的肽，其中X是任何氨基酸。

在一些实施例中，MTDH/SND1抑制剂是MTDH的肽、SND1的肽、与包含SEQ ID NO:1的残基393-403的肽具有相似结构的肽模拟物、与包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽具有相似结构的肽模拟物、与包含SEQ ID NO:1的残基393-403的肽具有相似结构或结构部分的小分子化合物、与包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽具有相似结构或结构部分的小分子化合物、或者含有本文描述的肽或肽模拟物的纳米颗粒缀合物。

在各个实施例中，抑制剂是选自下述的MTDH的肽：i)在SEQ ID NO:1的残基364-582内的肽，ii)在SEQ ID NO:1的残基364-407内的肽，iii)包含SEQ ID NO:1的残基386-407的肽，iv)包含SEQ ID NO:1 的残基393-403的肽，或v)包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽；或vi)在SEQ ID NO:1的残基364-582、残基364-407、残基386-407、残基393-403或残基390-403内在残基393-403处包含共有序列 XWXXXXXXWXX(SEQ ID NO:3)的肽，其中X是任何氨基酸。

在一些实施例中，肽包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列或其变体，其中变体肽包含在除了W残基之外的任何位置处的至少一个(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一个)突变。在一些实施例中，肽长约11至约22个氨基酸(例如长约15至约22个氨基酸)。在一些实施例中，肽包含对DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列N 末端的约1、2、3、4、5、6或7个氨基酸中的任一种或其变体。在一些实施例中，肽包含对DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列C末端的约1、2、3或4个氨基酸中的任一种或其变体。

在一些实施例中，肽包含DWNAPEEWGN(SEQ ID NO:20)的序列或其变体，其中变体肽包含在除了W残基之外的任何位置处的至少一个(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一个)突变。在一些实施例中，肽长约10至约21个氨基酸(例如长约14至约21个氨基酸)。在一些实施例中，肽包含对DWNAPEEWGN(SEQ ID NO:20)的序列N 末端的约1、2、3、4、5、6或7个氨基酸中的任一种或其变体。在一些实施例中，肽包含对DWNAPEEWGN(SEQ ID NO:20)的序列C末端的约1、2、3或4个氨基酸中的任一种或其变体。

在一些实施例中，肽与包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列的野生型MTDH肽竞争结合SND1(例如具有相同长度的野生型 MTDH肽)。在一些实施例中，肽结合SND1的亲和力为包含 DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的序列的野生型MTDH肽(例如具有相同长度的野生型MTDH肽)对于SND1的结合亲和力的至少约 50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一种。

在一些实施例中，肽包含在选自D389、A392、D393、N395、 E399、E400、W404、D406和E407的MTDH中的一个或多个氨基酸残基处的突变，其中位置对应于野生型MTDH(即SEQ IDNO:1)。在一个实施例中，肽包含在选自N395、A396、P397、A398、E399、 E400和N403的一个或多个(例如2、3、4、5、6或7个)氨基酸残基处的突变，其中位置对应于野生型MTDH(即SEQ IDNO:1)。在一些实施例中，MTDH中的突变选自N395K、A396D、PAE(397-399)SQ 和E400D/N403L，其中位置对应于野生型MTDH(即SEQ ID NO:1)。在各个实施例中，MTDH(SEQ ID NO:1)中的突变选自D389R、D393R、 E399R、E400R、W404D、D406R和E407R。

在各个实施例中，抑制剂是在SND1(即SEQ ID NO:2)的残基 16至339内的SND1的肽。在一个实施例中，SND1肽包含在选自F250、 R324、R255、R327、R324、P39、P43、E247、L256、H279、I284、 L287、R259和N281的一个或多个残基处的突变，其中位置对应于野生型SND1(即SEQ ID NO:2)。在各个实施例中，SND1(即SEQ ID NO:2)中的突变选自F250A R324E和R255E。

在一些实施例中，MTDH或SND1肽包含(例如具有)含60个氨基酸或更少、55个氨基酸或更少、40个氨基酸或更少、35个氨基酸或更少、或者30个氨基酸或更少的氨基酸序列。任选地，肽包含(例如具有)含25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、或者10个氨基酸或更少的氨基酸序列。在各个实施例中，肽包含 (例如具有)10-35个氨基酸残基(例如10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34或35个氨基酸残基)。在一些方面，氨基酸从氨基酸序列内、在N末端处和/或在C末端处从本文描述的肽中取出。此类肽片段可包含3-14个氨基酸残基(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13或14个氨基酸残基)。

本文描述的肽可与第二肽结构域融合或复合，所述第二肽结构域例如结合另一种靶或者增加肽的半衰期或稳定性。

在一个方面，肽还包含有利于肽的合成、处理或使用的一个或多个氨基酸，包括但不限于在N末端和/或C末端处的一个或两个赖氨酸，以增加肽的溶解性。合适的融合蛋白包括但不限于这样的蛋白质，所述蛋白质包含连接至一种或多种多肽、多肽片段或一般未识别为蛋白质序列的部分的氨基酸的本文描述的肽。在一个方面，融合肽包含具有两个或更多个肽的整个氨基酸序列，或可替代地包含两种或更多种肽的一部分(片段)。在一些方面，本文描述的肽可操作地连接至例如下述中的一种或多种：标记蛋白质、有利于纯化的肽、促进多聚蛋白质形成的肽序列、或前述中任一种的片段。合适的融合配偶体包括但不限于His标签、FLAG标签、strep标签和myc标签。

任选地，本文描述的肽融合至增强肽的半衰期的一种或多种实体。半衰期可通过下述得到增加：例如增加肽的分子量以避免肾清除率，和/或掺入用于nFc受体介导的再循环途径的配体。在一个实施例中，肽与白蛋白多肽或其片段(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白 (BSA))融合或化学缀合。白蛋白片段包含全长白蛋白蛋白质的10％、 25％、50％或75％。可替代地或另外，肽与白蛋白结合结构域或脂肪酸融合或复合，所述脂肪酸当体内施用时结合白蛋白。白蛋白结合结构域的例子是“albu标签”，来源于4-(对碘苯基)-丁酸的部分(Dumelin等人，Angew Chem Int Ed Engl 47:3196–3201(2008))。其他合适的融合配偶体包括但不限于脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)和抗体或其片段(例如抗体的Fc部分)。

衍生物被考虑且包括已以与氨基酸的添加、缺失或置换不同的一定方式进行化学修饰的肽。在这点上，本文提供的肽与聚合物、脂质、其他有机部分和/或无机部分化学键合。肽和蛋白质修饰的例子在 Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,(1996)中给出。本文描述的肽任选包含有利于与另一部分(例如肽部分)缀合的官能团。示例性官能团包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、 NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐、卤代烷衍生物(例如卤代乙酰基衍生物)、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰衍生物、芳基化剂、硫醇-二硫化物交换试剂(例如吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烷、羰基二咪唑、N,N'- 二琥珀酰基碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯和肼衍生物。马来酰亚胺例如可用于生成在体内与白蛋白结合的蛋白S结合肽。

在一个方面，本发明包括本文描述的肽，其共价修饰以包括一个或多个水溶性聚合物附着。水溶性聚合物(或其他化学部分)附着至任何氨基酸残基，尽管与N末端或C末端的附着在一些实施例中是优选的。有用的聚合物包括但不限于PEG(例如大小大约40kD、30kD、 20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚乙二醇、聚丙二醇、单甲氧基聚乙二醇、右旋糖酐、羟乙基淀粉、纤维素、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)- 聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚唾液酸 (PSA)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、以及前述中任意种的混合物。在一个方面，本发明的肽是PEG化的肽。PEG部分可以不同形状例如线性或分支获得。关于水溶性聚合物附着的更多讨论，参见美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。可用于改善肽半衰期或稳定性的其他部分在本文中描述，并且包括例如白蛋白(任选修饰以允许与本发明的肽缀合)、脂肪酸链(例如C12-C18脂肪酸例如C14脂肪酸，或二羧酸例如十八烷二羧酸(oddc))、抗体或其片段(例如抗体的Fc部分)和脯氨酸-丙氨酸- 丝氨酸多聚体。

在另一个方面，肽衍生物包括对于特定细胞类型、组织和/或器官特异性的靶向部分。可替代地，肽连接至有利于纯化、检测、多聚化、与相互作用配偶体的结合和肽活性的表征的一种或多种化学部分。示例性化学部分是生物素。适合于与本发明的肽缀合的其他部分包括但不限于光敏剂、染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素和细胞毒性剂。光敏剂包括例如光卟啉、维速达尔、聚左旋糖、Foscan、美特维克、

Cysview^TM、Laserphyrin、安特林、光克洛、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200 ALA和Amphinex。需要时，His标签、FLAG标签、strep标签或myc 标签缀合至肽。

另外，在一个方面，本发明的肽在肽的N末端氨基酸处是酰化的。在另一个方面，本发明的肽在肽的C末端氨基酸处是酰胺化的。在一个再进一步的方面，本发明的肽在肽的N末端氨基酸处是酰化的，并且在肽的C末端氨基酸处是酰胺化的。

衍生物还包括包含经修饰的或非蛋白原氨基酸或经修饰的接头基团的肽(参见例如Grant,Synthetic Peptides:A User’s Guide,Oxford University Press(1992))。经修饰的氨基酸包括例如其中氨基和/或羧基替换为另一种基团的氨基酸。非限制性例子包括掺入硫酰胺、脲、硫脲、酰基酰肼、酯、烯烃、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯二氮杂卓和其他芳香族或非芳香族杂环的经修饰的氨基酸(参见 Estiarte等人，BurgersMedicinal Chemistry,第6版，第1卷，Part 4,John Wiley&Sons,New York(2002))。非蛋白原氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、磺基丙氨酸(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、甲硫氨酸亚砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3',4'-二甲氧基苯基 -丙氨酸(Ear)、3',4'-二氟苯丙氨酸(Dff)、4'-氟苯基丙氨酸(Pff)、1-萘基丙氨酸(1Ni)、2-萘基丙氨酸(2Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸(Phg)、苯并噻吩丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩丙氨酸(Thi)、3,3-二苯基丙氨酸(Ebw)、L-α-叔丁基甘氨酸(Tle)、Bpa、高苯丙氨酸(Hfe)和S-苄基-L-半胱氨酸(Ece)。这些及其他非蛋白原氨基酸可作为D-或L-异构体存在。经修饰的接头的例子包括但不限于柔性接头4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β- 丙氨酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)，以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的组合。

构成本发明的肽的氨基酸的同系物可如表1中所示。在任何实施例中，本发明的肽的一个或多个氨基酸由表1中所示的氨基酸或构件块置换。

表1

在一些实施例中，连接本发明的肽内的氨基酸的肽(CO-NH)键逆转，以产生“逆向修饰的”肽，即包含与参考肽相比较以相反方向 (NH-CO键)装配的氨基酸残基的肽。逆向修饰的肽包含与参考肽相同的氨基酸手性。“反转修饰的”肽是包含与参考肽相同方向装配的氨基酸残基的本发明的肽，但氨基酸的手性反转。因此，当参考肽包含L- 氨基酸时，“反转修饰的”肽包含D-氨基酸，并且反之亦然。反转修饰的肽包含CO-NH肽键。“逆向反转修饰的”肽指包含在相反方向装配且具有反转手性的氨基酸残基的肽。逆向反转类似物具有肽键(即 NH-CO)的逆向末端和逆向方向，同时大致维持在参考肽中发现的侧链拓扑学。逆向反转拟肽使用标准方法进行制备，所述标准方法包括以引用的方式并入本文的Meziere等人，J.Immunol.,159,3230-3237 (1997)中所述的方法。部分逆向反转肽是其中仅氨基酸序列的部分逆转且替换为对映体氨基酸残基的肽。

在一些实施例中，本文描述的肽抑制剂缀合至载体肽或蛋白质，例如货物蛋白质或肽、转运肽或肽、或者细胞穿透蛋白质或肽(CPP)，以改善药物代谢动力学行为。举例说明性改善的药物代谢动力学行为包括但不限于更长的血清和/或循环半衰期，和/或更大的细胞渗透。在一些实施例中，本文描述的肽抑制剂与选自下述的转运肽或细胞穿透肽缀合：HIV TAT肽、TATm、PTD、PTR(也称为PTD)、pVEC、 SynB、R9、R9-TAT、MTS、PreS2-TLM、HTLV-IIREX、MAP、TP、 PEP和PrP。

在一些实施例中，本文描述的肽抑制剂与载体肽或蛋白质例如货物蛋白质或肽、转运肽或肽、或者细胞穿透蛋白质或肽(CPP)混合，以改善药物代谢动力学行为。

肽抑制剂和载体肽或蛋白质之间的合适摩尔比可为例如约1:100 至约100:1，包括例如约1:50至约50:1、约1:20至约20:1、约1:10至约10:1、约1:5至约5:1、或约1:1。在一些实施例中，肽抑制剂和载体肽或蛋白质之间的摩尔比为约1:1至约20:1、约1:1至约10:1、约1:1 至约1:5:1、约1:1至约2:1、约1:1、约1:1至约1:2、约1:1至约1:5、约1:1至约1:10、或约1:1至约1:20中的任一种。

用于如本文描述的癌症预防或治疗的本文所述肽的细胞内递送可利用“促进剂部分”来实现，用于有利于肽或核酸跨越外细胞/质膜的通过或易位进入细胞的细胞质和/或核内，例如载体肽。如本文描述的促进剂部分可有利于由本发明体现的肽、试剂或核酸以多种方式中的任一种进入癌细胞内，并且本发明并不限于任何特定机制(例如直接穿透到细胞内(例如经由增强的细胞膜溶解度或在细胞膜中形成瞬时孔)、内吞作用介导的细胞进入(例如，经由与细胞表面表达受体的相互作用或巨胞饮)和经由在细胞膜上形成瞬时结构的细胞进入。促进剂部分可以是增强根据本发明的抗癌肽的细胞膜溶解度的脂质部分或其他非肽部分(例如，碳水化合物部分)，用于穿过靶细胞的外细胞膜，或由此促进肽进入细胞内。脂质部分可例如选自甘油三酯，包括混合甘油三酯。还可使用脂肪酸且特别是C₁₆-C₂₀脂肪酸。通常，脂肪酸可为饱和脂肪酸且最通常为硬脂酸。

在另外一个实施例中，本文描述的肽与缀合试剂缀合用于与标记、信号传导或其他分子(例如造影剂、显像剂、生物素、链霉抗生物素蛋白、放射性同位素、荧光染料、化学发光剂、化学发光团 (chemiluminophore)、生物发光剂、酶或其结合片段(例如Fab和F(ab).₂片段)、磁性颗粒等)形成复合物，用于肽的检测。如应理解的，由本发明体现的肽可与促进剂部分偶联，用于有利于肽通过进入靶细胞内，并且缀合试剂与标记、信号传导分子、放射性同位素等等复合，或者用于与标记、信号传导分子、放射性同位素等等复合，用于利用合适的成像技术(例如磁共振成像(MRI))检测细胞内的肽。DOTA (1,4,7,10-四氮杂环癸烷-1,4,7,10-四乙酸)是可使用且可与一系列化合物复合用于癌症疗法和诊断中的缀合试剂的例子，例如单克隆抗体、放射性同位素和金属阳离子(例如钙和钆)。在一些实施例中，本文描述的肽缀合至与钆复合的DOTA(Sturzu A等人，2008)，所述钆作为造影剂用于靶细胞的成像。

在一些实施例中，本文描述的肽配制成脂质体、微粒或纳米颗粒，例如用于靶向递送和/或持续释放。适合于肽递送(包括靶向递送和/或持续释放)的脂质体、微粒和纳米颗粒是本领域已知的。参见例如Tan 等人，Recent Developments in Liposomes,Microparticles,and Nanoparticles for protein and peptide drug delivery,Peptides,31(1), 184-193,2010。

还考虑了包含本文描述的肽中的一种或多种的纳米颗粒缀合物。如本文使用的，术语“纳米颗粒”指意指其大小在纳米范围内(即小于 1μm)测量的颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒具有在大约2-500nm，包括例如约2至约200nm、约10至约200nm、约50至约100nm的范围内的总直径。

纳米颗粒核材料可为金属或半导体，并且可由超过一个类型的原子形成。优选地，核材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核还可由合金包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和 Au/Fe/Cu/Gd形成，并且可用于本发明中。优选核材料为Au和Fe，其中最优选的材料是Au。纳米颗粒的核优选包含约100至500个原子(例如金原子)，以提供在纳米范围内的核直径。其他特别有用的核材料掺杂有其为NMR活性的一种或多种原子，从而允许纳米颗粒在体外和体内两者使用NMR进行检测。NMR活性原子的例子包括Mn⁺²、Gd⁺³、 Eu⁺²、Cu⁺²、V⁺²、Co⁺²、Ni⁺²、Fe⁺²、Fe⁺³和镧系元素⁺³或量子点。

包含半导体原子的纳米颗粒核可检测为纳米规模半导体晶体，能够充当量子点，即它们可吸收光，由此激发材料中的电子至更高能级，随后以材料特有的频率释放光的光子。半导体核材料的例子是硒化镉、硫化镉、镉碲。还包括的是锌化合物例如硫化锌。

在一些实施例中，纳米颗粒缀合物包含可检测标记。标记可为纳米颗粒的核的元素或配体。标记由于纳米颗粒的该元素的固有特性或通过与可检测的进一步部分连接、缀合或结合而是可检测的。标记的优选例子包括其为荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素、罗丹明或四甲基罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5 等，并且可通过荧光标记的激发和使用拉曼散射光谱法检测发出的光进行检测(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science 2002,297: 1536-1539)。

在一些实施例中，纳米颗粒缀合物包含放射性核素，用于使用由放射性核素发出的放射性检测纳米颗粒，例如通过使用PET、SPECT，或用于疗法，即用于杀死靶细胞。可容易适合于在本发明中使用的本领域常用的放射性核素的例子包括以各种氧化状态存在的⁹⁹mTc，尽管最稳定的是TcO^4-；³²P或³³P；⁵⁷Co；⁵⁹Fe；通常用作Cu²⁺盐的⁶⁷Cu；通常用作Ga³⁺盐例如柠檬酸镓的⁶⁷Ga；⁶⁸Ge；⁸²Sr；⁹⁹Mo；¹⁰³Pd；一般用作In³⁺盐的¹¹¹In；一般用作碘化钠的¹²⁵I或¹³¹I；¹³⁷Cs；¹⁵³Gd；¹⁵³Sm；¹⁵⁸Au；¹⁸⁶Re；一般用作Tl⁺盐例如氯化铊的²⁰¹Tl；³⁹Y³⁺；⁷¹Lu³⁺；和²⁴Cr² ⁺。放射性核素作为标记和示踪剂的一般用途是本领域众所周知的，并且可容易地由技术人员修改用于本发明的方面。放射性核素可通过掺杂纳米颗粒的核或包括其作为在纳米颗粒上固定的配体的部分存在的标记而最容易地采用。

另外或可替代地，纳米颗粒缀合物可使用本领域众所周知的许多技术进行检测，使用与如上所示的纳米颗粒结合的标记或通过采用其特性。这些检测纳米颗粒的方法范围可从检测当纳米颗粒结合另一个种类时产生的聚集，例如通过简单目视检查或通过使用光散射(含有纳米颗粒的溶液的透射率)，到使用尖端技术例如透射电子显微镜检查(TEM)或原子力显微镜检查(AFM)来显现纳米颗粒。检测金属颗粒的进一步方法是采用等离子体共振，其为在金属表面处的电子激发，通常通过光辐射引起。表面等离子体共振(SPR)的现象存在于金属(例如 Ag或Au)和介电材料例如空气或水的界面处。因为SPR中的变化由于分析物结合固定在纳米颗粒表面上的配体而发生，所以改变界面的折射率。SPR的进一步优点在于它可用于监测实时相互作用。如上所述，如果纳米颗粒包括其为NMR活性的原子或掺杂有其为NMR活性的原子，则这种技术可用于在体外或体内两者检测颗粒，使用本领域众所周知的技术。纳米颗粒还可使用基于定量信号扩增的系统进行检测，使用纳米颗粒促进的银(I)还原。如果纳米颗粒包括配体作为荧光探针，则可使用荧光光谱法。另外，碳水化合物的同位素标记可用于促进其检测。

在一些实施例中，本文描述的肽缀合至金纳米颗粒用于通过分支金颗粒的激光照射进行成像或用于帮助靶细胞的细胞死亡。金纳米颗粒转移越过质膜和核膜先前已得到报道(de la Fuente J.M.和Berry C. C.,2005)。

本文描述的肽可用于许多目的。例如，在一些实施例中，本发明提供了破坏受试者中的MTDH和SND1之间的相互作用的方法，所述方法包括给受试者施用本文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物)中的任何一种。在一些实施例中，本发明提供了抑制受试者中的SND1依赖性促存活基因表达的方法，所述方法包括给受试者施用本文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物)中的任何一种。在一些实施例中，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给受试者施用本文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物)中的任何一种。在一些实施例中，本发明提供了抑制患有癌症的受试者中的肿瘤转移的方法，所述方法包括给受试者施用本文描述的肽抑制剂(或包含此类肽抑制剂的药物组合物) 中的任何一种。

癌症

预期本文所述的MTDH和/或SND1的肽以及MTDH和SND1相互作用的其他抑制剂可用于治疗MTDH在其中起作用的癌症。示例性癌症包括但不限于肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、肛门直肠癌、肛管癌、阑尾癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿膀胱癌、骨和关节癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、胃肠道、神经系统癌症、神经系统淋巴瘤、中枢神经系统癌症、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴样赘生物、蕈样真菌病、Seziary 综合征、子宫内膜癌、食管癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞 (肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、眼部癌、胰岛细胞肿瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、肾部癌、肾癌、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、髓母细胞瘤、黑素瘤、眼内(眼)黑素瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、舌癌、多发性内分泌肿瘤综合征、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓性白血病、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性病症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤因家族的肉瘤肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫癌、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃(胃部) 癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管和其他泌尿器官的移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。在各个实施例中，癌症选自乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。在一些实施例中，所述癌症是乳腺癌。

前列腺癌：前列腺癌是美国男性中最常见的癌症类型。它占总癌症发生率的28％和美国男性的总癌症死亡的10％(1)。前列腺癌相关死亡率主要由晚期癌症引起，所述晚期癌症已扩散并转移至远处器官，例如骨、肺和肝(2)。一旦癌细胞在这些重要器官中建立继发性肿瘤，治疗通常变得更复杂，伴随更糟的结果。定义和理解驱动前列腺癌进展和转移的新型分子靶对于开发前列腺癌的有效治疗方法是重要的。

与良性增生组织和正常上皮细胞相比较，MTDH显示在前列腺肿瘤组织和致瘤细胞系中过表达(Thirkettle等人，2009；Kikuno等人， 2007)。在培养的前列腺癌细胞中的MTDH击倒增强细胞凋亡且抑制基质胶侵袭。

制剂

本公开内容提供了可用于癌症治疗的MTDH/SND1抑制剂(例如以抑制或压制肿瘤的生长或转移)。为了将抑制剂施用于患者或测试动物，优选在包含一种或多种药学可接受的载体的组合物中配制产物。药学或药理学可接受的载体或媒介物指分子实体和组合物，当如下所述使用本领域众所周知的途径施用时，所述分子实体和组合物不产生过敏或其他不良反应，或者被美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)或对应国外监管机构批准为对经口或肠胃外施用的药物的可接受添加剂。药学可接受的载体包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。

药学载体包括药学可接受的盐，特别当碱性或酸性基团存在于化合物中时。例如，当存在酸性取代基例如--COOH时，铵、钠、钾、钙等等盐考虑用于施用。另外，当存在酸基团时，化合物的药学可接受的酯(例如甲基、叔丁基、新戊酰氧基甲基、琥珀酰基等等)考虑作为化合物的优选形式，此类酯是本领域已知的，用于修饰溶解度和/或水解特征用于用作持续释放或前体药物制剂。

当存在碱性基团(例如氨基或碱性杂芳基原子团例如吡啶基)时，则酸性盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、马来酸盐、扑酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等等考虑作为用于施用的形式。

另外，化合物可与水或常见有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物同样加以考虑。

本文的抑制剂可经口、胃肠外、经眼、鼻内、经皮、经粘膜、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射施用。如本文使用的，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。同样考虑通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或在特定部位的手术植入的施用。一般地，通过上述方法中任一种的施用的组合物基本上不含热原以及对接受者可能有害的其他杂质。此外，用于肠胃外施用的组合物是无菌的。

给药和施用

MTDH/SND1抑制剂以治疗有效量施用；通常，组合物采取单位剂型。所施用的抑制剂的量当然取决于患者的年龄、体重和一般状况，所治疗的状况的严重性，以及开处方医师的判断。合适的治疗量将是本领域技术人员已知的和/或在相关参考文本和文献中描述。在一个方面，剂量每天施用一次或每天施用多次。MTDH/SND1抑制剂可每天施用一次、两次、三次或四次。在一些实施例中，抑制剂的有效剂量可在0.01mg至1000mg/kg(mg/kg)体重/天的范围内。在一些实施例中，抑制剂以范围为下述的日剂量施用：约10mg/kg至约250mg/kg、或约 100mg/kg至约250mg/kg、或约60mg/kg至约100mg/kg、或约50mg/kg 至约90mg/kg、或约30mg/kg至约80mg/kg、或约20mg/kg至约60 mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg。此外，有效剂量可为0.5mg/kg、 1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg/25mg/kg、30mg/kg、 35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、 75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、 175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、 450mg/kg、500mg/kg，并且可通过25mg/kg增量增加直到1000mg/kg，或可在前述值中的任何两个之间的范围内。

施用可继续至少3个月、6个月、9个月、1年、2年或更久。

组合疗法

本文描述的治疗组合物可以治疗有效剂量单独或与辅助癌症疗法组合施用，所述辅助癌症疗法例如手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、温热疗法和激光疗法，并且可提供有益效应，例如减少肿瘤大小、减缓肿瘤生长速率、抑制转移、使肿瘤对癌症治疗敏感、或以其他方式改善总体临床状况，而无需根除癌症。靶向癌细胞的细胞抑制剂和细胞毒性剂特别考虑用于组合疗法。同样，靶向血管生成或淋巴管生成的试剂或者靶向检查点途径的免疫治疗特别考虑用于组合疗法。

例如本文使用的，“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的例子包括：烷基化剂，例如噻替派和

环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；海绵他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成类似物、KW-2189和 CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇 (sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；长春花生物碱；表鬼臼毒素；抗生素例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素gammall和加利车霉素omegall；L-天冬酰胺酶；蒽二酮取代的尿素；甲基肼衍生物；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐例如氯屈膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、重氮丝菌素、博莱霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L- 正亮氨酸、

多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苦；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝他布昔(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；

多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2 2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫杉类(taxoid)例如

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE^TM Cremophor-free、白蛋白改造的紫杉醇纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和

多西紫杉醇(

Rorer, Antony，法国)；苯丁酸氮芥；

吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位络合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；

长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇例如视黄酸；卡培他滨；亚叶酸(LV)；伊立替康；肾上腺皮质抑制剂；肾上腺皮质类固醇；孕激素；雌激素；雄激素；促性腺激素释放激素类似物；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如它莫昔芬(包括

它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬、LY117018、奥那司酮和FARESTON-托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，所述芳香酶调节肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、

乙酸甲地孕酮、

依西美坦、福美司坦、法倔唑、

伏氯唑、

来曲唑、和

阿那曲唑；以及抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶例如VEGF-A表达抑制剂(例如

核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗例如基因疗法疫苗例如

疫苗、

疫苗和

疫苗；

rJL-2；

拓扑异构酶 1抑制剂；

rmRH；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施例中，本文描述的肽与任何数目的免疫检查点抑制剂结合施用。免疫检查点抑制剂包括与下述中的一种或多种结合且阻断或抑制其活性的抗体或其抗原结合片段：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、 B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3和GAL9。示例性免疫检查点抑制剂包括但不限于曲美木单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1 单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹木单抗、MK-3475(PD-1 阻断剂)和纳武单抗(抗PD1抗体)

本文描述的治疗方法任选包括监测治疗组合物对肿瘤的作用。例如，肿瘤大小可测定为转移灶的存在。还考虑的是例如通过测量转移结节数目或通过测量与转移相关的腹水来测量转移程度。

MTDH/SND1抑制剂及其他药物/疗法可同时在单一组合物或在分开组合物中组合施用。可替代地，施用是序贯的。同时施用通过施用包括抑制剂及其他治疗剂两者的单一组合物或药理学蛋白质制剂来实现。可替代地，其他治疗剂在与抑制剂的药理学制剂(例如片剂、注射剂或饮料)大约相同的时间分开服用。

试剂盒

本公开内容还提供了用于进行本公开内容的方法的试剂盒。在各个实施例中，试剂盒含有例如包含液体(例如无菌可注射)制剂或固体(例如冻干)制剂的瓶、小瓶、安瓿、管、药液筒和/或注射器。试剂盒还可含有药学可接受的媒介物或载体(例如溶剂、溶液和/或缓冲液)，用于将固体(例如冻干)制剂重构成溶液或悬浮液用于施用(例如通过注射)，包括但不限于在注射器中重构冻干制剂用于注射或用于将浓缩剂稀释至较低浓度。此外，临时注射溶液和悬浮液可由例如包含含有如本文所述的抑制剂的组合物的无菌粉末、颗粒或片剂进行制备。试剂盒还可包括分配装置，例如气溶胶或注射分配装置、笔式注射器、自动注射器、无针注射器、注射器和/或针。在各个实施例中，试剂盒还提供用于方法中的抑制剂的经口剂型，例如本文所述的片剂或胶囊或其他经口制剂。试剂盒还提供了使用说明书。

虽然本公开内容已与其具体实施例结合进行描述，但前述描述以及下述实例预期举例说明而不是限制本公开内容的范围。在本公开内容的范围内的其他方面、优点和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。

实例1-MTDH敲除小鼠的生成和在肿瘤进展中的作用

为了调查异粘蛋白对体内乳腺癌细胞的发展、进展和转移的作用，生成异粘蛋白敲除小鼠。

实验程序

小鼠：所有涉及小鼠的实验方案均得到Princeton University的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)批准。通过将ES细胞系XB780(BayGenomics)注射到C57BL/6 胚泡内，随后确认种系传递，来生成Mtdh-KO小鼠。随后在FVB背景中用MMTV-PyMT、MMTV-ErbB2、MMTV-Wnt转基因小鼠(JacksonLaboratory)育种之前，将KO小鼠回交至FVB背景>6代。为了产生 MMTV-Mtdh构建体，将小鼠Mtdh编码序列插入pMMTV-SV40载体内，随后使表达盒线性化并显微注射到来自FVB小鼠的受精卵的原核中。对于自发性肿瘤发生研究，就乳房肿瘤每周检查携带特定癌基因的雌性小鼠。当肿瘤变得可触及连续两周时，肿瘤视为建立，并且通过卡钳测量肿瘤用于计算肿瘤体积(πx长度x宽度²/6)。肺结节在固定后(MMTV-PyMT模型)或在肺切片和染色后(MMTV-ErbB2模型)直接进行计数。

Mtdh敲除等位基因的基因分型：为了测定基因捕获盒在Mtdh基因座的第二内含子中的精确插入位点，正向引物 5'-CTGCAAAACAAGCACCAGAG-3'(位于Mtdh的第二外显子中)(SEQ ID NO:6)和反向引物5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3'(位于靶向载体pGT0pfs中)IDNO:7)用于扩增覆盖插入位点的片段，使用 Expand 20kb PUS PCR System(Roche)。将PCR产物测序，并且插入位点确定为在Mtdh的第二内含子的3041bp处。基于插入位点，设计三种基因分型引物，以如下所示区分Mtdh^+/+、Mtdh^+/-和Mtdh^-/-小鼠。野生型等位基因对应于602bp PCR片段，而基因捕获等位基因对应于472 bp PCR片段。用于基因分型野生型和基因捕获Mtdh等位基因的PCR 引物在表1中：

表1

MMTV-Mtdh转基因的基因分型：DNA印迹基因分型通过 Transgenic&KnockoutShared Resource在Rutgers Cancer Institute of New Jersey执行，以确认转基因系。对于PCR基因分型，用于鉴定 MMTV-Mtdh转基因后代的引物设计为扩增Mtdh和SV40之间的连接区，而靶向其他基因组DNA区的引物充当内部对照。用于基因分型 MMTV-Mtdh转基因的PCR引物在表2中。

表2

乳房癌发生乳房癌发生实验使用先前描述的方案执行。简言之，在通过管饲法每周接受在0.1ml棉籽油中的1mg DMBA (Sigma-Aldrich Chemical Co,St.Louis,MO)共连续四周前一周，具有所示Mtdh基因型的6周龄雌性FVB/N小鼠用15mg MPA(Depo-Provera, NY,Pfizer)进行皮下注射。就肿瘤形成每周检查小鼠。

组织学和免疫组织化学为了检测β-半乳糖苷酶(lacZ)活性，胚胎在0.2％戊二醛中固定30分钟，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并且在X-gal 染色液(在0.1M磷酸钠，pH 7.3中的1mg/ml 4-氯-5-溴-3-吲哚基-β- 半乳糖苷(X-gal)、4mM K4Fe(CN)6·3H2O、4mM K3Fe(CN)6、2mM MgCl2、0.01％脱氧胆酸盐和0.02％Nonidet P-40)中温育过夜。在染色后，胚胎还在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定。对于乳腺的全标本包埋(whole mount)制备，将第4个腹股沟乳腺解剖，并在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定过夜，随后为水合和胭脂红染色。随后将染色的腺体在一系列醇浴中脱水，用histoclear试剂脱脂并固定。对于组织学，将福尔马林固定的组织包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红(H&E) 染色。对于免疫组织化学染色，在石蜡包埋的切片上使用由柠檬酸缓冲液(pH＝6)的抗原热恢复，并且使切片与针对PyMT(Novus Biologicals,NB100-2749,1:200)、切割的半胱天冬酶-3(CellSignaling，目录#9664，1:200)、ERBB2(Cell Signaling，目录#2165，1:100)和 p-ERBB2(Cell Signaling，目录#2243，1:200)的抗体一起温育1小时。使生物素化的二抗温育30分钟，随后与ABC试剂(Vector laboratories) 一起温育。根据制造商的说明书(Invitrogen)，HRP在3,3-二氨基苯胺中显色。组织切片用苏木精复染，脱水并固定。为了定量图9A中切割的半胱天冬酶3-阳性细胞，在显微镜下获取超过20个随机图像(>2000 个细胞)，并且手动计数阳性细胞。

组织阵列免疫染色使用两个乳腺癌组织微阵列，并且用针对 MTDH(Invitrogen，目录#40-6500)和SND1(Sigma,HPA002632)的抗体染色。一个TMA得自Biomax(BR1921a)，并且由160个原发性肿瘤、 5个正常组织和27个正常邻近组织组成。在这192个样品中，154个样品就MTDH和SND1两者成功染色。第二个TMA得自Cancer Institute of New Jersey(CINJYMTA_201)，并且由399个原发性肿瘤组成。在这399个样品中，270个样品就MTDH和SND1两者成功染色。每个样品根据染色强度评分为阴性(0)、弱(1)、中等(2)或强(3)。

免疫沉淀和蛋白质印迹对于免疫沉淀(IP)实验，培养的细胞在冷 PBS中洗涤，且在裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.4、0.15M NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％Tx-100、0.0025MNa2P2O7、1mMα-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4和1mM NaF)中裂解，所述裂解缓冲液具有无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)和PMSF。细胞裂解产物随后在冰上温育10分钟，离心并通过与蛋白A/G珠(Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下温育1小时得到预澄清。对于IP珠制备，使30μl蛋白A/G珠与5μg抗体一起在4℃下温育2小时。IP在4 ℃下进行过夜，并且使珠离心、洗涤且随后在SDS蛋白质上样缓冲液中煮沸5分钟，以洗脱结合蛋白质。IP裂解产物经历用所示抗体的蛋白质印迹。

对于蛋白质印迹，组织/肿瘤从小鼠中取出且立即在液氮中冷冻，随后为用研钵和研棒在RIPA缓冲液加上PMSF和蛋白酶抑制剂中的匀浆化。对于培养的细胞，裂解产物通过将裂解缓冲液直接加到板上进行收集。蛋白质印迹凝胶制备和免疫印迹遵循标准程序执行。针对 MTDH(invitrogen，目录#40-6500)、SND1(Santa cruz，目录# sc-271590)、ERBB2(Cell Signaling，目录#2165)、p-ERBB2(Cell Signaling，目录#2243)、EGFR(CellSignaling，目录#4267)、抗 Myc(Santa Cruz，目录#sc-40)、和抗HA(Santa Cruz，目录#sc-7392) 的抗体进行1:1000稀释。

ALDEFLUOR测定和ALDH阳性群通过FACS的分离根据制造商的说明书，ALDEFLUOR试剂盒(StemCell Technologies,Durham,NC, USA)用于分离具有高ALDH酶促活性的群。简言之，从自发性或移植的PyMT肿瘤中新鲜解离的肿瘤细胞悬浮于含有ALDH底物的 ALDEFLUOR测定缓冲液(含有1μmol/L BAAA/1x 10⁶个细胞的1ml 缓冲液)中，并且在37℃下温育45分钟。对于每个细胞样品，等分试样在紧加入底物之前用50mM ALDH抑制剂二乙基氨基苯甲醛(DEAB) 进行处理。使用仅由PI染色(关于活力)的细胞和用DEAB处理的 ALDEFLUOR染色的细胞作为阴性对照建立分选门。

人乳腺癌TMA：两个人乳腺TMA用于研究中，以检查MTDH和 SND1蛋白质水平的关联。一个TMA购自US Biomax(BR1921a)，并且第二个TMA得自Cancer Institute of NewJersey(YMTA_201)。两组 TMA均使用去鉴定的肿瘤样品，并且由Princeton University和Rutgers New Jersey Medical School的机构审查委员会(Institutional Review Board)视为豁免的。

收获乳腺上皮细胞和流式细胞术：如先前描述的制备乳腺或肿瘤的单细胞悬浮液(Shackleton等人，2006)。简言之，将组织切碎，剁成小片并在37℃下在培养基(含有5％FBS、10ng/ml EGF、500ng/ml 氢化可的松、5μg/ml胰岛素、20ng/ml霍乱毒素和1％Pen/Strep的1:1 DMEM:Ham’s F-12培养基)中消化1小时，所述培养基补充有300 U/ml 1A型胶原酶(Sigma)和100U/ml透明质酸酶(Sigma)。在通过40μm 尼龙细胞滤器过滤和抗体染色之前，类器官在37℃下进行序贯悬浮，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA 1.5分钟、5mg/ml分散酶(Invitrogen)和0.1 mg/ml DNA酶(Sigma)5分钟、以及0.64％氯化铵5分钟。乳腺上皮细胞与含有CD31、CD45、TER119、CD24、CD29和CD61的抗体混合物(cocktail)一起温育30分钟，随后为在FACS分析或分选之前的二抗染色20分钟。

有限稀释测定：对于乳腺重构测定，将来自7或8周龄雌性小鼠的乳腺的MEC的单细胞悬浮液分选，并且注射到3周龄接受者小鼠的清除乳房脂肪垫内。生长在移植后6-8周时进行分析。对于肿瘤发生测定，原始MEC的单细胞悬浮液移植到FVB WT接受者小鼠内，除非另有说明。

乳房球/肿瘤球测定：单细胞在具有球体培养基(补充有B27 (Invitrogen)、20ng/mL EGF(Novoprotein)、20ng/mL bFGF和4μg/mL 肝素的1:1DMEM:Ham’s 12)的超低附着板(Corning,Tewksbury,MA) 中铺平板。球体在铺平板后4-7天进行计数。

微阵列分析：RNA在CPT(50μM)处理后从所示肿瘤细胞中提取，并且用AgilentWhole Mouse Genome 4x44k阵列进行分析。RNA样品使用Agilent Low RNA Input LinearAmplification Kit用Cy5进行标记，并且连同Cy3标记的Mouse Universal Reference RNA(Stratagene)一起进行杂交。阵列用Agilent G2565BA扫描仪进行扫描，并且用AgilentFeature Extraction v9.5软件进行分析。Cy5/Cy3比使用特征培养基信号进行计算，并且通过阵列中值进行标准化。具有>2平均倍数变化和斯氏t检验p值<0.05的基因包括作为SND1调节的基因。

慢病毒感染：对于击倒研究，含有shRNA序列的pLKO质粒购自 Sigma-Aldrich(StLouis,MO,USA)，所述shRNA序列靶向鼠Mtdh (KD1,TRCN0000125816；KD2,TRCN0000125818)、鼠Snd1 (TRCN0000054742)、人MTDH(KD1,TRCN0000151467；KD2,TRCN0000322872；KD3,TRCN0000322949)和人SND1(KD1, TRCN0000245140；KD2,TRCN0000245141；KD3,TRCN0000245144)。遵循标准方案，使用HEK293-T细胞作为包装细胞系连同辅助质粒 VSVG(包膜)和p8.91(gag-pol,pCMV-dR8.91)，所有慢病毒构建体质粒均被包装到病毒内。原代细胞用补充有8μg/mL聚凝胺的含浓缩病毒的培养基在4℃下以1000g旋转感染2小时且随后移植，或在感染后在板中进行培养且在实验中使用之前进行分选。

qRT-PCR分析：根据制造商的说明书，总RNA使用RNeasy试剂盒(Qiagen)进行分离，并且用Superscript III试剂盒(Invitrogen)进行逆转录。定量PCR使用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems) 与ABI Prism 7900HT热循环仪(Applied Biosystems)执行。

基因集合富集分析(GSEA)：标准化的微阵列表达数据通过使用所提供的类别比(即倍数变化)量度通过表达进行排序。将相同基因的多个探针匹配折叠为(collapsed)一个值，其中在每种情况下使用最高的探针读数。SND1_CPT_UP标记含有在CPT处理后通过SND1特异性上调>2倍(p<0.05)的504种基因。SND1_CPT_UP标记使用经典富集统计学经由GSEA就排序列表中的富集进行测试，并且与来自基因集合的1000个随机排列的富集结果相比较，以获得p值。使用缺省GSEA 参数将原始富集得分转换成标准化的富集得分。富集得分定义为位于排序基因列表的运行和峰(即富集得分)之前或之处的基因集合成员。

统计分析：需要时所有结果均经历统计分析。如图例中指示的，对于大多数研究使用时序检验、非参数曼怀二氏检验、卡方检验和不成对、双侧、独立斯氏t检验，其中具有相等方差假设。对于有限稀释测定，MaSC或TIC的频率和统计学使用L-calc软件(StemCellTechnologies)进行计算。p值在所有图中指示为*p<0.05、**p<0.01、 ***p<0.001。

登录号：所有原始微阵列数据文件均在GEO数据库(GSE55522) 中可获得。

结果

Mtdh敲除小鼠是存活的并且与WT小鼠肉眼无法区分

为了生成Mtdh敲除(KO)小鼠，筛选Bay Genomics基因捕获数据库，并且选择含有进入Mtdh的第二内含子内的插入片段的ESC系 XB780，所述插入片段导致转录的过早终止(图1A)。XB780ES细胞注射到胚泡内生成嵌合小鼠，伴随种系传递的后续确认。Mtdh杂合(Mtdh+/-)小鼠之间的杂交以孟德尔比例产生子代。Mtdh纯合KO (Mtdh-/-)胚胎显示广泛的LacZ活性(图1B)，表明在许多胚胎器官中的遍在Mtdh表达。在成年小鼠中，MTDH也在野生型(WT,Mtdh+/+) 和Mtdh+/-小鼠的各种组织中检测到，而在Mtdh-/-小鼠中无法检测，从而确认基因捕获的等位基因完全消除Mtdh表达。Mtdh-/-小鼠是存活、能育的，并且当监测长达两年时，未展示明显异常。

MTDH还在正常乳腺上皮细胞(MEC)中检测到，并且表达水平与 Mtdh遗传状态相关(图1C)。为了评价MTDH缺陷在出生后乳腺发育中的影响，检查来自WT和KO处女小鼠的腹股沟乳房脂肪垫的全标本包埋。除了与WT同窝者相比较，来自3周龄和5周龄KO小鼠的乳腺的导管长出中的瞬时延迟之外，在以后时间点或在妊娠和哺乳期间未观察到分支形态发生中的显著差异。在青春期时开始的WT和 Mtdh-/-小鼠中在很大程度上可比较的乳腺上皮允许我们使用Mtdh-/-小鼠检查MTDH对于乳房肿瘤形成的必要性。

Mtdh KO抑制管腔乳房肿瘤中的肿瘤形成和转移：为了剖析 MTDH在自身乳房肿瘤进展中的作用，首先使用MMTV-PyMT和 MMTV-ErbB2转基因模型，这两种模型均发展管腔腺癌，伴随肺转移的高发生率。在侵略性MMTV-PyMT模型中，乳房肿瘤早在42日龄时出现，并且到第63天时，50％的Mtdh+/+小鼠发展肿瘤(图1D)。相比之下，第一可触及肿瘤在第50天时在Mtdh-/-组中检测到，并且这些小鼠中的50％仅在80天后发展肿瘤。肿瘤出现中的延迟还通过与WT 对照相比较在Mtdh-/-小鼠中更大数目的无肿瘤乳腺得到支持(图1E)。一致地，PyMT；Mtdh+/-和PyMT；Mtdh-/-小鼠的总肿瘤负荷分别减少为 WT对照那种的54％和10％(图1F)。此外，PyMT；Mtdh-/-小鼠具有显著更少(图1G)和更小的(p<0.05)转移结节。

肿瘤形成中的差异在MMTV-ErbB2模型中甚至更突出，其中肿瘤发生在长潜伏期后出现。虽然几乎所有ErbB2；Mtdh+/+小鼠到300日龄时均发展肿瘤，但超过60％的ErbB2；Mtdh-/-小鼠没有肿瘤(图1H和1I)。即使监测直到18个月时，30％的ErbB2；Mtdh-/-小鼠(n＝68)仍保持完全无肿瘤，而所有ErbB2；Mtdh+/+小鼠(n＝61)均死亡或达到安乐死的发病率标准(p<0.0001)。肺转移在ErbB2；Mtdh-/-小鼠中也严重受损(图 1J和1K)。

乳房肿瘤形成中的差异并非是由于癌基因的差异诱导，因为PyMT 和ErbB2的表达在WT和KO乳腺或肿瘤之间是可比较的。另外，如通过其磷酸化指示的，ErbB2的活化不受影响。此外，与年龄匹配的正常对照相比较，MTDH蛋白质水平在PyMT和ErbB2驱动的肿瘤中是升高的，表明高水平的MTDH可在肿瘤发生期间对MEC赋予生长优点。

Mtdh KO遏制基底样和混合亚型乳房肿瘤的形成：MTDH在肿瘤形成中的调查扩展至MMTV-Wnt模型，所述MMTV-Wnt模型发展显示出乳房干细胞(MaSC)样基因表达谱且类似人乳腺癌的基底亚型的肿瘤(Herschkowitz等人，2007)。虽然基本上所有Wnt；Mtdh+/+小鼠在300日龄时均死于癌症，但在35％的Wnt；Mtdh+/-和62％的Wnt；Mtdh-/- 小鼠中未检测到肿瘤(图1L)。肿瘤的多样性也高度依赖于Mtdh的基因剂量(图1M)。这些表型明显类似于我们在管腔肿瘤模型中观察到的那种。为了拓宽我们的分析，我们使用乙酸甲羟孕酮(MPA)和7,12- 二甲基苯并蒽(DMBA)的组合处理诱导乳房癌发生(图1N)，所述组合处理导致形成具有腺癌、腺鳞癌和腺肌上皮瘤的组织学特征的乳腺肿瘤(Yin等人，2005)。再次，Mtdh-/-雌性显示在MPA/DMBA处理后显著减弱的肿瘤敏感性(图1N和1O)。

Mtdh KO损害癌基因诱导的基底和管腔TIC的扩增和活性：Mtdh 缺失对乳房肿瘤形成的显著作用促进了在肿瘤发生期间的早期事件调查。为此，我们检查了在检查的肿瘤前期时来自不同肿瘤模型的乳腺的全标本包埋(图2A，上图)和苏木精/曙红染色切片(图2A，下图)。 PyMT和Wnt癌基因两者均在Mtdh+/+小鼠中诱导早在四周时的广泛增生；然而，Mtdh-/-腺体显示出与正常导管结构混杂的显著更少和更小的增生病灶。MMTV-ErbB2小鼠具有最长的肿瘤潜伏期，并且这对应于显著延迟和最不严重的增生。来自6月龄无肿瘤MMTV-ErbB2雌性的乳腺的全标本包埋分析揭示：在Mtdh阳性小鼠中接近于100％的增生发生率，而来自ErbB2；Mtdh-/-的那些中的仅20％为轻度增生(图3A 和3B)。

Mtdh-/-腺体中的这些严重受损的肿瘤前变化可表明在转化的MEC的扩增中的缺陷。为了检查在乳腺的细胞组成中的癌基因诱导的变化，肿瘤前乳腺使用CD24、CD29(β1整联蛋白)和CD61(β3整联蛋白)进行概况分析，这先前已用于分辨管腔和基底乳腺上皮亚群(Asselin-Labat等人，2007；Shackleton等人，2006)。与正常腺体相比较，PyMT肿瘤前组织展示Lin-CD24+CD29低管腔亚群 (CD24+CD29低)的急剧扩增(图2B和2C)，与“管腔样”基因表达概况的先前报道(Herschkowitz等人，2007)一致。相比之下，富含 MaSC的Lin-CD24+CD29高(CD24+CD29hi)基底群的百分比在来自 Wnt乳腺的肿瘤前组织中显著增加(图2B和2D)，如先前注明的 (Shackleton等人，2006)，表明该群代表在该模型中转化的关键细胞靶。有趣的是，上皮层级的这些癌基因特异性扰动受Mtdh丧失损害，如通过下述证明的：(1)在PyMT；Mtdh-/-腺体中的CD24+CD29低管腔亚群扩增的缺乏(图2B和2C)；(2)与WT配对物相比较，在Wnt；Mtdh-/- 腺体中的CD24+CD29hi基底亚群扩增中的显著减少(图2B和2D)。值得注意的是，与正常腺体相比较，Mtdh+/+小鼠中的PyMT或Wnt 诱导的增生腺体不显示出CD61+群的选择性扩增(图3C和3D，比较橙色条)。然而，与Wnt；Mtdh+/+腺体相比较，比CD61-细胞(图3E) 更能形成乳房球的CD61+细胞的百分比在Wnt；Mtdh-/-腺体中显著减少 (图3C和3D，比较WT相对于KO)。

为了测试Mtdh-/-肿瘤前腺体是否的确含有更少的TIC，我们从 Mtdh+/+和Mtdh-/-肿瘤前腺体中分离原代MEC(pMEC)，并且执行体外乳房球形成测定。Mtdh-/-pMEC跨越多重肿瘤模型形成减少数目的球体(图2E)。此外，当原位移植到WT接受者小鼠中时，PyMT；Mtdh-/- pMEC在体内含有基本上更少的肿瘤再生细胞，如当测试一系列稀释数目时减少的肿瘤发生率所揭示的(图2F)。

随后分析PyMT诱导的TIC是否存在于扩增的管腔群中。来自 PyMT小鼠的肿瘤前腺体的分选的管腔和基底pMEC在体内进行移植。在接受管腔而不是基底细胞的小鼠中以高频率检测到肿瘤(图2G)，表明PyMT诱导的肿瘤前TIC与MEC的管腔亚群共纯化。重要的是，当在体内检查来自PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-雌性的管腔细胞的致瘤能力时，肿瘤发生率(图2H)和体积(图2I)在移植有Mtdh-/- 细胞的小鼠中基本上减少。这些结果表明，管腔细胞的不仅扩增而且致瘤潜力在PyMT；Mtdh-/-小鼠中严重损害。

根据先前的报道(Shackleton等人，2006)，与正常对照相比较，在MMTV-ErbB2肿瘤前腺体中未检测到MEC的管腔或基底亚群的选择性扩增。为了鉴定哪个亚群的MEC充当TIC，从ErbB2；Mtdh+/+增生腺体中分选出管腔和基底MEC，并且原位移植这些细胞。在接受管腔或基底MEC的100％小鼠中检测到可触及的肿瘤(图3F和3G)。无论细胞来源如何，所有肿瘤在组织学中均非常类似来自 MMTV-ErbB2小鼠的自发性肿瘤(图3H)。这些结果表明MMTV-ErbB2 肿瘤可源自管腔和基底区室两者，并且基底细胞可引起管腔型肿瘤，这一发现得到近期报道(Zhang等人，2013a)支持。为了鉴定依赖于 MTDH的细胞靶，来自ErbB2；Mtdh-/-雌性的管腔和基底亚群在体内进行移植。引人注目的是，当接受ErbB2；Mtdh+/+细胞的所有小鼠均发展大肿瘤时，管腔和基底ErbB2；Mtdh-/-细胞均不引起可触及的肿瘤(图 3F和3G)。这些结果表明MTDH对于维持ErbB2诱导的基底和管腔 TIC是关键的。

与其在早期肿瘤发生中调节TIC的必需作用形成对比，MTDH对于成年MaSC活性在很大程度上是可有可无的，如通过来自WT和KO 小鼠的未分级的Lin-MEC(图3J)或富集MaSC的基底细胞(图3K 和3L)的类似的体内乳腺重构(图3I)效率所指示的。

在促进乳房肿瘤起始能力中的MEC固有作用：由于MTDH在小鼠中广泛表达，全生物KO小鼠中的肿瘤发生缺陷可起因于MEC或其他细胞/组织类型中的MTDH丧失。为了区分这两种可能性，将小鼠 MTDH在体内特异性地重新引入Mtdh-/-小鼠的MEC中，并测试这是否援救致瘤性缺陷。为此，产生MMTV-Mtdh转基因小鼠系(图4A、 5A和5B)，并且在乳腺中以及在唾液腺(在较小程度上)中特异性地观察到Mtdh转基因的表达(图5C)。接下来，将这些MMTV-Mtdh 小鼠与PyMT；Mtdh-/-小鼠杂交，以产生具有或不具有外源Mtdh转基因的PyMT；Mtdh-/-小鼠(图4A)。值得注意的是，转基因(Tg)援救的 PyMT；Mtdh-/-肿瘤表达与PyMT；Mtdh+/+肿瘤的那种相似的MTDH水平(图4B)。与PyMT；Mtdh-/-小鼠相比较，观察到来自PyMT；Mtdh-/- +Tg肿瘤前腺体的管腔细胞扩增中的几乎两倍增加(图4C)。此外，在PyMT；Mtdh-/-+Tg组中，肿瘤发作加速(图4D)并且肿瘤负荷(图 4E和4F)增加。Mtdh转基因的存在不改变所得到的肿瘤的组织学(图 5D)。这些结果强烈支持MTDH在促进靶细胞扩增和随后的体内乳房肿瘤发生中的肿瘤固有作用，尽管不能排除肿瘤基质的贡献。

为了补充我们的自发性肿瘤模型研究，接下来调查了MTDH的急性操作是否也影响肿瘤前MEC的致瘤潜能。MTDH在从PyMT；Mtdh+/+ (图4G)和ErbB2；Mtdh+/+(图5E)雌性的肿瘤前腺体中新鲜解离的 pMEC中被击倒。在两种模型中，MTDH击倒(KD)细胞的球体形成能力在多个独立样品中显著降低(图4G和5E)。PyMT；Mtdh+/+pMEC 的体内肿瘤形成也被MTDH KD严重损害(图4H)。相反，当MTDH 在PyMT；Mtdh-/-pMEC中经由慢病毒转导恢复至与WT配对物可比较的水平时，体外球体和体内肿瘤形成两者均显著增强(图4I、4J和图 5F-5H)。

接下来分析来自建立的MTDH阳性肿瘤的TIC是否依赖MTDH 用于其功能性(图4K)。当用CD24和CD29进行概况分析时(Vaillant 等人，2008)，由PyMT、Wnt和ErbB2驱动的肿瘤模型建立的肿瘤展示一个相对同质的群的事实，突出显示了需要其他标记物来鉴定来自已建立的肿瘤的TIC。已在包括乳腺癌的多个癌症类型中的癌症干样群中发现了增加的醛脱氢酶(ALDH)活性(Ginestier等人，2007)，但其在小鼠模型中作为TIC标记物的用途仍然较少表征。从PyMT肿瘤中分选出ALDH+和ALDH-细胞(图5I)，并且发现与ALDH-细胞相比， ALDH+细胞显示出显著更高的体外球体形成(图4L)和体内肿瘤起始活性(图5J)。与具有TIC特征的ALDH+群体一致，由该群生成的肿瘤重现(recapitulate)了初始肿瘤的表型异质性，具有ALDH+和ALDH- 细胞的类似比。这指示ALDH+肿瘤细胞能够自我更新，以及分化成 ALDH-细胞。当MTDH在来自PyMT；Mtdh+/+肿瘤的新鲜分离的 ALDH+细胞中被击倒时，球体形成活性显著降低(图4M)。对于 MMTV-Wnt肿瘤，CD61+群已证实具有TIC特征且是高度致瘤的(Vaillant等人，2008)。一致地，CD61+肿瘤细胞能够生成比CD61- 细胞更大数目的肿瘤球体(图4N)。重要的是，MTDH KD损害了来自MMTV-Wnt肿瘤的CD61+细胞中的球体形成活性(图4O)。这些结果表明MTDH是MTDH阳性肿瘤中TIC的全部功能性连续需要的。

MTDH的促肿瘤发生作用需要其相互作用配偶体SND1：SND1先前已被鉴定为人乳腺癌细胞中MTDH的主要结合配偶体，并且它具有类似于MTDH的转移促进功能(Blanco等人，2011)。在本研究中，发现MTDH和SND1之间的相互作用在人和鼠乳腺癌细胞中是良好保守的。

为了测试SND1对MTDH在肿瘤起始中功能的必要性，SND1首先在PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞中被击倒，并且显示在这些细胞中援救小鼠MTDH的表达(图6A)。MTDH在PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞中的重新引入一致地促进体外球形成(图4B)和体内肿瘤形成(图6C)；然而，MTDH的这种效应在SND1KD后被完全消除(图6B和6C)。如果MTDH的确需要SND1用于其促肿瘤发生功能，则预期Mtdh+/+肿瘤细胞中SND1的击倒将表型模拟MTDH缺陷对乳房肿瘤发生的作用。事实上，Mtdh+/+肿瘤细胞中的SND1KD损害体外球体形成活性(图 6D)和体内肿瘤起始(图6E和6F)，类似MTDH消除对肿瘤起始活性的作用。这些结果共同指示MTDH对TIC的功能需要SND1的存在。

为了进一步测试与SND1的物理相互作用对MTDH的功能是否是关键的，进行对蛋白质的相互作用的详细分析。SND1含有四个N末端葡萄球菌核酸酶(SN)重复和C末端Tudor-SN混合结构域。缺少第二 SN结构域后的C末端序列的SND1构建体(SND1ΔC，1-339)，与 MTDH片段364-582而不是MTDH片段1-289化学计量结合(图7A 和7B)，类似全长SND1的结合行为(Blanco等人，2011)。这允许我们使用SND1ΔC片段用于下述体外结合研究。为了映射MTDH的最低限度SND1结合结构域，生成在区域364-582内的一系列MTDH片段(图7A)，并测试其与SND1ΔC的相互作用。这导致鉴定足以用于 SND1结合的22个氨基酸的片段(残基386-407)(图7A和7B)，其还通过MNDH-SND1复合物的晶体结构得到确认(参见实例3)。

为了测定对于相互作用必需的MTDH的关键残基，设计了三种三重点突变体(称为TPM)，其中每种具有在MTDH(SEQ ID NO:1的氨基酸364-582)片段中的22-aa最低限度结合结构域内的3个氨基酸突变(图7A)。TPM1包含突变D389R、D393R和W394D。TPM2包含突变E399R、E400R和W401D。TPM3包含突变W404D、D406R和 E407R。体外结合测定显示TPM1和TPM2两者均不能结合SND1ΔC，而TPM3与WT MTDH一样有效地结合SND1ΔC(图7C)。突变也在表3中阐述。

表3

为了检查TPM1和TPM2是否在体内与SND1相互作用，在 HEK293T细胞中异位表达全长加上HA标签的SND1和加上Myc标签的MTDH，并且使细胞裂解产物经历抗Myc免疫沉淀。与来自体外结合测定的发现一致(图7C)，HA-SND1由WT而不是TPM1或TPM2 MTDH下拉(图7D)。使用相似的策略进一步分析所有9个个别突变，并且发现W394D完全消除结合并且W401D部分消除结合，而其他突变个别地不影响相互作用(图7E)。注意到SND1结合缺陷型TPM1 和TPM2MTDH仍能够与AGO2相互作用(图7D)，所述AGO2是另一种已知的MTDH结合配偶体(Yoo等人，2011)，表明这些突变不太可能引起MTDH中的总体构象变化，而是选择性地破坏与SND1的相互作用。

测试这些突变是否影响MTDH在肿瘤发生中的功能。鼠形式的 WT MTDH、TPM1或TPM2在PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞中稳定表达，并且发现这些MTDH突变体丧失与SND1相互作用的能力(图8A)。功能上，WT MTDH能够增加PyMT；Mtdh-/-细胞在体外的球体形成活性和在体内的肿瘤起始，而TPM1或TPM2突变体未能实现这点(图 8B-8D)。当测试W391D突变体(对应于人MTDH中的W394D)时，观察到类似的结果(图8E-8H)。这些结果强烈地表明MTDH与SND1的结合残基在人和小鼠中是高度保守的，并且与SND1的相互作用对于调节MTDH在调节TIC活性中的功能性是关键的。

MTDH介导的SND1的稳定化赋予MEC在应激条件下的存活优点：SND1已报道为在各种应激条件下的存活因子(Gao等人，2010； Sundstrom等人，2009；Weissbach和Scadden，2012)。MTDH在肿瘤起始而不是乳腺的正常生理学中的更突出作用导致下述假设：MTDH 通过其与SND1的相互作用赋予MEC在肿瘤发生期间的应激条件下的优点。支持这一假设，本文检测到在肿瘤前PyMT；Mtdh-/-乳腺上皮中比在PyMT；Mtdh+/+配对物中显著更高百分比的凋亡细胞，这在不含 PyMT的腺体中未见(图9A)。为了测试MTDH-SND1相互作用在体外应激条件下的作用，我们用喜树碱(CPT)处理由WT或突变型小鼠 MTDH重构的PyMT；Mtdh-/-pMEC，以诱导DNA复制应激(图9B)，这是在肿瘤发展过程中常见的应激类型(Halazonetis等人，2008)。 CPT处理以剂量依赖性方式诱导MEC的细胞凋亡(图9B)。与对照相比较，存在MTDH援救组中凋亡细胞百分比的显著减少，并且SND1 结合缺陷突变消除了MTDH的这种促存活效应(图9B)。

与SND1水平对于在应激条件下的细胞存活是关键的先前观察一致，在PyMT；Mtdh+/+MEC中的SND1沉默导致在CPT处理后细胞凋亡中的显著增加(图9C)。有趣的是，在用CPT处理的MEC中观察到SND1蛋白质水平的药物剂量依赖性降低(图9D)。这种现象不是这类应激所独有的，因为热激处理也导致SND1的快速减少。值得注意的是，在PyMT；Mtdh+/+pMEC中的MTDH沉默加速了SND1蛋白质的减少(图9D)。相反，在PyMT；Mtdh-/-MEC中的WT而不是SND1结合缺陷型MTDH的恢复稳定了在这些应激条件下的SND1蛋白质(图 9E)。因此，这些数据共同表明MTDH通过与存活因子SND1相互作用且稳定存活因子SND1促进在应激条件下的存活。

为了提供SND1如何发挥其促存活功能的更好理解，对CPT处理后的对照相对于SND1-KD PyMT；Mtdh+/+pMEC执行转录组概况分析 (图9F-9H)。Ingenuity途径分析揭示通过SND1上调的基因(图9F， >2倍变化，p<0.05)显示对于分子和细胞功能包括“细胞死亡和存活”、“细胞周期”和“DNA修复”的显著富集(图9G)，这是与CPT诱导的复制应激相关的过程。有趣的是，SND1上调基因的显著部分牵涉“细胞死亡和存活”类别，并且这些基因的表达共同被预测显著活化细胞存活功能(图9H，顶部六行)，且损害细胞死亡和细胞凋亡(图9H，底部两行)。因此，SND1全面活化促存活基因的能力可能是其在使细胞免于应激诱导的细胞死亡的作用的基础(图9C)。为了证实MTDH通过与SND1相互作用且稳定SND1来调节存活的假设，用WT或SND1 结合缺陷突变型小鼠MTDH(W391D)重构的PyMT；Mtdh-/-pMEC进行了概况分析。基因集合富集分析(GSEA)证实了SND1上调的基因标记在用WT相对于突变型Mtdh重构的PyMT；Mtdh-/-pMEC中显著富集 (图9I)。

MTDH和SND1对于人乳腺癌细胞的肿瘤起始活性是重要的：为了证实MTDH和SND1两者在人乳腺癌的肿瘤起始活性中的重要作用， MTDH或SND1在多重人乳腺癌模型中被沉默，包括：(1)HER2/Neu- 转化的人乳腺上皮细胞(HMLE-N)(Mani等人，2008)(图10A、10B、 11A和11B)，(2)人原发性患者衍生的异种移植物(DeRose等人，2011； Zhang等人，2013b)(图10C、10D、11C和11D)，和(3)MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系(图10E-10H)。MTDH或SND1的击倒显著减少所有测试模型的体外肿瘤球形成和体内MDA-MB-231细胞的肿瘤起始。

还检查MTDH介导的SND1的稳定化是否在人乳腺癌样品中出现。在确认抗体的特异性之后(图11E和11F)，用针对MTDH和SND1 的抗体对人乳腺癌组织微阵列(TMA)进行染色(图10I-10J)。发现 MTDH和SND1的染色得分之间的正相关(图10I和10J)，这使用独立的TMA得到确认(图11G和11H)。值得注意的是，MTDH和SND1 在mRNA水平上不相关(图11I)。这些数据支持MTDH在乳腺癌中 SND1的转录后调节中的关键作用，与我们的发现一致：MTDH在肿瘤发生过程中的应激条件下与SND1相互作用且稳定SND1。

为了进一步探索MTDH-SND1相互作用的临床重要性，分析了 NKI295人乳腺癌微阵列数据集(van de Vijver等人，2002)。基于SND1 和MTDH两者的中值表达，将患者分成四个不同的组。具有MTDH和 SND1两者的高mRNA水平的原发性肿瘤显著较大(图11J)、较少分化(图11K)并与较短的无远处转移存活相关(图11L)，从而支持在肿瘤发展、转移和复发中人乳腺癌中的MTDH和SND1之间的功能合作。与其在不同乳腺肿瘤模型中的肿瘤促进功能一致，还发现更高水平的MTDH预测KM-绘图仪数据集中跨越多重乳腺癌亚型的预后不良 (图11M)。不受理论束缚，但看起来MTDH在管腔A亚型中的表面上更强的预后能力很可能是由于与其他亚型相比较在该组中显著更大的样品大小。

讨论

虽然肿瘤进展的经典克隆进化理论假定转移能力被在原发性肿瘤内的罕见细胞中出现的随机遗传变化赋予，但基因组和临床研究矛盾地证实可通过概况分析大部分原发性肿瘤来预测转移的可能性(van de Vijver等人，2002)。这表明转移潜力可由具有附加转移促进功能的致癌事件赋予(Bernards和Weinberg，2002)，因此这些遗传变化可在肿瘤进化早期出现并选择(Vanharanta和Massague，2013)。支持这个概念，几种促进转移的基因已显示促进异种移植模型中的原发性肿瘤生长(Vanharanta和Massague，2013；Wan等人，2013)。除了其报道的促进乳腺癌转移的作用之外，MTDH在人原发性乳腺肿瘤中的复发性扩增/过表达因此可牵涉肿瘤发生中的MTDH。虽然使用人或鼠乳腺癌细胞系的先前研究未能揭示MTDH对异种移植模型中原发性肿瘤形成的任何作用(Brown和Ruoslahti，2004；Hu等人，2009)，但目前研究中使用的遗传工程小鼠模型使我们能够揭示MTDH在肿瘤发生的早期阶段调节肿瘤起始细胞的扩增和活性的作用，从而在原发性肿瘤起始与获得转移性状之间建立另一种分子联系。当在先前的异种移植物研究中使用大量高度侵略性和晚期肿瘤细胞时，MTDH对肿瘤起始的这种作用可能被掩盖。与该推测一致，当大量移植晚期PyMT 肿瘤细胞时，在Mtdh WT和KO细胞之间的肿瘤起始中未观察到差异。然而，来自MTDH阳性的已建立的乳房肿瘤的TIC，例如分别来自 PyMT和Wnt诱导的肿瘤的ALDH+细胞和CD61+细胞，保持对MTDH 抑制的敏感性，表明MTDH依赖性机制在已建立的肿瘤中起作用，以维持TIC的最佳功能性，并且因此阻断MTDH及其调节途径将有益于具有MTDH异常表达的癌症患者。

已表明起始遗传病灶对来自人和转基因动物两者的乳房肿瘤的组织病理学和分子特征发挥显著影响。例如，与PyMT和ErbB2相比较， Wnt信号传导诱导具有类似更原始祖细胞的特征的乳房肿瘤(Li等人， 2003)。值得注意的是，本文发现MTDH是跨越这些不同肿瘤模型的 TIC功能性所需的。一致地，MTDH表达与人乳腺癌的特定亚型不显著相关(Hu等人，2009)，并且更高水平的MTDH预测跨越不同亚型的预后不良。这些结果共同确证MTDH以癌基因和谱系非依赖性方式促进肿瘤起始的想法，与谱系特异性肿瘤促进基因例如管腔肿瘤存活因子PDEF形成对比(Buchwalter等人，2013)。MTDH在肿瘤发生中的广泛功能也与其在不同谱癌症类型中的频繁上调相一致(Emdad 等人，2013；Wan和Kang，2013)。

在不存在MTDH的情况下形成的肿瘤显示出与MTDH阳性肿瘤相似的组织学特征，表明MTDH可不改变TIC的起源细胞或细胞命运，而是影响其致瘤潜力。这连同Mtdh KO对MaSC的活性具有很少作用的观察一起确定了MTDH作为与其他细胞命运调节剂不同的TIC的关键调节剂，所述其他细胞命运调节剂例如Wnt信号传导(Lento等人， 2013)、Slug/Sox9(Guo等人，2012)和GATA3(Kouros-Mehr等人， 2008)，其由于其在正常和恶性背景下介导分化细胞和更原始的干细胞/祖细胞之间的转换的能力来调节肿瘤发生。

本发明人和其他人已将SND1鉴定为MTDH的主要结合配偶体 (Blanco等人，2011；Meng等人，2012；Yoo等人，2011)。然而，由于MTDH的两个非重叠区，即氨基酸364-470(Blanco等人，2011) 和101-205(Yoo等人，2011)各自独立地映射为介导MTDH与SND1 的相互作用的唯一必需结构域，存在关于MTDH与SND1的结合结构域的差异。我们的目前研究还测定MTDH的最低限度片段(386-407)足以用于相互作用，并鉴定该片段内的两个关键残基对于相互作用是关键的。这些发现使得与SND1的相互作用对于MTDH的功能是至关关键的目前证实成为可能。这些发现还确定SND1作为乳腺TIC的重要调节剂。重要的是，MTDH和SND1之间的相互作用以及结合残基在人和小鼠之间是良好保守的，突出显示了我们在小鼠模型中的发现可能与人癌症高度相关的可能性，如通过目前的功能和临床分析所表明的。

肿瘤发生伴随肿瘤细胞必须克服的不同应激，包括癌基因诱导的 DNA复制/损害应激。本文证实SND1是在应激条件下在细胞中表达一群促存活基因所需的，并且SND1的沉默使转化的MEC对复制应激诱导的细胞凋亡敏感。这些结果与确定SND1作为在各种应激条件下的促存活蛋白的先前报道(Gao等人，2010；Sundstrom等人，2009； Weissbach和Scadden，2012)一致。此外，与MTDH的物理相互作用对于使SND1免于降解且在应激条件下支持SND1调节的基因标记是必需的。因此，可能MTDH在肿瘤发生期间的应激条件下由于其与SND1相互作用和稳定SND1的能力而至少部分地使TIC免于损耗。仍然不清楚SND1如何调节下游促存活基因。SND1是多功能蛋白，据报道其涉及几个基因调控过程，包括转录控制、mRNA剪接、RNA应激颗粒形成和RNA诱导沉默复合物(RISC)机制(在Wan和Kang，2013 中综述)。保证未来的研究是调查SND1如何响应应激条件而调节基因表达，以促进细胞存活。

除了提供在肿瘤起始和转移能力之间的分子联系之外，我们的发现还提示了几种潜在的翻译应用。首先，在患者衍生的肿瘤移植物中得到验证的MTDH和SND1在支持TIC功能中的功能重要性，可将这些蛋白质确定为癌症治疗中的潜在治疗靶。此外，关于MTDH-SND1相互作用的结果可有利于筛选或设计可破坏MTDH和SND1的相互作用的小分子抑制剂。我们的结果还突出显示了MTDH的肿瘤特异性需求，并且表明MTDH-SND1模块的全身靶向可被癌症患者良好耐受，因为Mtdh的全生物敲除不导致小鼠的显著缺陷。

实例2-MTDH在前列腺癌中的调查

为了调查MTDH在前列腺癌中的作用，将MTDH敲除小鼠与小鼠前列腺(TRAMP)小鼠的转基因腺癌杂交，以便生成具有MTDH和 TRAMP的异源表达的动物。TRAMP模型导致其中SV40T抗原的表达受大鼠Probasin启动子控制并在小鼠的性成熟期间诱导的动物，导致类似人前列腺癌的临床进展的前列腺癌发展(Greenberg等人，1995； Gingrich等人，1999)。

实验程序

小鼠。所有涉及小鼠的实验方案均得到Princeton University的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。通过将含有基因捕获的Mtdh 等位基因的ES细胞系XB780(BayGenomics)注射到C57BL/6胚泡内，随后通过PCR确认种系传递，来生成Mtdh-/-小鼠。在用C57BL/6 TRAMP转基因小鼠(Jackson Laboratory)(Greenberg,2005)育种之前，将所有Mtdh-/-小鼠回交至C57BL/6背景>6代。使雌性TRAMP小鼠与 Mtdh-/-雄性小鼠育种，以获得雌性TRAMP/Mtdh+/-和雄性Mtdh+/-创立者小鼠。随后，将这些创立者小鼠育种，以生成TRAMP/Mtdh+/+、 TRAMP/Mtdh+/-和TRAMP/Mtdh-/-雄性小鼠。该育种策略确保所有实验小鼠均与SV40转基因杂合。从尾部活组织检查中提取DNA，并使用下述引物执行PCR用于基因型分析：(1)共同正向引物 5'-GAGAGGAGGTTTTGGGGAAG-3'(SEQ ID NO:8)；(2)用于WT等位基因的反向引物5'-CCCATGTCTAAAAAGCCAATC-3'(SEQ ID NO: 9)；(3)用于突变型等位基因的反向引物5'- GTTCATATGGTGCCGTGCAG-3’(SEQ ID NO:11)。对于肿瘤细胞注射，向无胸腺裸鼠雄性小鼠皮下注射5×10⁵TRAMP-C1细胞，并且通过卡钳每周两次测量肿瘤用于计算肿瘤体积(πx长度x宽度²/6)。

细胞培养。TRAMP-C1细胞系从ATCC获得，并使用短串联重复 (STR)概况分析方法认证。将细胞维持在补充有0.005mg/ml牛胰岛素、 10nM脱氢异雄甾酮、5％胎牛血清和5％；Nu-Serum IV的达尔贝科改良伊格尔培养基中。

组织检查和肿瘤分级。在安乐死时，将下泌尿生殖道取出并称重，包括膀胱(清空的)、精囊和前列腺。取出主动脉周淋巴结、肺和肝，并检查可见转移的证据。将组织固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，并以5μm厚度切片。H&E染色的背外侧叶切片各自在 1-6的等级上(其中‘1’代表正常前列腺，并且‘6’代表低分化的前列腺腺癌或神经内分泌肿瘤)进行不知情评分(Gingrich,1999；Kaplan-Lefko, 2003；Hurwitz,2001)。

人样品。从University of Michigan的Comprehensive Cancer Center 获得肿瘤标本，根据University of Michigan的机构审查委员会，伴随来自所有受试者的知情同意书。在我们的临床研究中使用两个前列腺组织微阵列，所述前列腺组织微阵列由62个正常前列腺组织、10个良性前列腺增生(BPH)、10个前列腺萎缩或前列腺炎性萎缩(PIA)、10个前列腺上皮内瘤变(PIN)、72个前列腺肿瘤和10个远处转移组成。在手术时，具有可用信息的患者的年龄为56至90岁(中值＝76岁，SD ＝7.6岁)。所有患者均未用激素或放射疗法治疗。

统计分析：需要时所有结果均经历统计分析。如图例中指示的，对于大多数研究使用时序检验、非参数曼怀二氏检验、卡方检验和不成对、双侧、独立斯氏t检验，其中具有相等方差假设。对于所有统计检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

结果

MTDH与人前列腺癌中的肿瘤进展和转移相关：最初，调查了 MTDH在人前列腺癌样品中的临床相关性。通过免疫组织化学分析两个前列腺组织微阵列，所述前列腺组织微阵列由正常前列腺(NP)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺上皮内瘤变(PIN)、前列腺原发性肿瘤和远处转移的样品组成，并且比较不同临床阶段的样品之间的MTDH蛋白质水平(图12A)。MTDH蛋白质在所有正常或BPH前列腺组织中无法检测或以非常低的水平表达。MTDH的蛋白质水平在恶变前组织 (PIN)、原发性肿瘤和转移中逐渐增加，其中表达中等或大量MTDH的样品的百分比分别为10％、47.2％和80.0％，揭示MTDH水平与前列腺疾病的临床进展的紧密相关(图12C，左图，X²检验P<0.001)。当我们比较BPH和PIN这两种类型的非癌性组织时(图12C，右图，X²检验P＝0.023)，MTDH蛋白质水平中的差异已显而易见，指示在从良性到恶变前阶段的过渡期间MTDH表达的增加。MTDH水平也与原发性肿瘤的格里森评分相关，如通过MTDH的较高平均染色强度(图 12B，顶部曲线)或晚期肿瘤中具有至少中等MTDH水平的更大样品百分比(图12B，底部曲线)所证明的。重要的是，在具有中等或高水平的MTDH的患者中基于前列腺特异性抗原(PSA)的复发率显著高于在其前列腺肿瘤中具有低水平的MTDH的患者中的那种(图12D)。连同前列腺癌远处转移中的MTDH蛋白质水平明显高于原发性肿瘤中的那些的事实(图12A和12B)，这些数据证明MTDH水平与前列腺癌复发和转移的强正相关。

MTDH基因组增益与前列腺癌中的MTDH过表达和临床进展相关。为了测试是否还存在前列腺肿瘤中MTDH的基因组拷贝数增加，使用针对MTDH基因组基因座或染色体8着丝粒区域(作为对照)的探针，通过分裂间期荧光原位杂交(FISH)分析前列腺组织微阵列。FISH分析揭示显著部分的前列腺癌样品具有MTDH基因的额外基因组拷贝 (图13A)。MTDH DNA增益与细胞中更高水平的蛋白质显著相关(图 13B)，指示DNA增益是前列腺癌中的MTDH过表达的机制。此外， MTDH DNA增益与临床阶段和预后紧密相关，使得在恶变前期(正常、 BPH或PIN)、局部肿瘤和远处转移之前或之时的样品，具有DNA增益的部分分别为0％、24％和50％(图13C)。此外，具有增加的MTDH 拷贝的患者比没有MTDH基因组增益的患者具有更早的复发(图 13D)。这些临床数据证实DNA和MTDH的蛋白质状态的预后价值，并且表明MTDH在前列腺癌进展和转移中的潜在重要作用。

Mtdh缺失的TRAMP小鼠的生成和表征：为了调查Mtdh在正常发育和癌症中的作用，使用来自Bay Genomics基因捕获数据库的ESC 系XB780产生全生物Mtdh敲除(KO)小鼠(Stryke等人，2003)。突变型等位基因含有插入到Mtdh的第二内含子内的LacZ转基因插入片段，所述LacZ转基因插入片段导致转录的过早终止。Mtdh-KO(Mtdh-/-) 小鼠是存活和能育的，并且在尸检时没有看到任何器官中的明显异常。具体地，包括前列腺和精囊两者的下泌尿生殖道的总体形态和相对重量在野生型(WT,Mtdh+/+)、杂合(Mtdh+/-)和Mtdh-/-雄性小鼠之间是可比较的。当在微观水平下检查时，不存在Mtdh-/-小鼠的前列腺上皮中的形态异常。

为了检查Mtdh消除在前列腺肿瘤形成中的后果，使用小鼠前列腺转基因腺瘤(TRAMP)模型。如“材料与方法”中所述，生成C57BL/6 背景中的TRAMP/Mtdh+/+、TRAMP/Mtdh+/-和TRAMP/Mtdh-/-小鼠(图 14A)，并且通过PCR确认基因型(图14B)。作为评价Mtdh在前列腺肿瘤发生中的作用的初始步骤，我们从正常和TRAMP小鼠中分离前列腺组织，并检查Mtdh的mRNA(图14C)和蛋白质(图14D)水平。如预期的，在Mtdh-/-前列腺组织中未检测到Mtdh mRNA(图14C)，确认基因捕获的方法完全消除了Mtdh表达。与不表达SV40T抗原的匹配对照小鼠相比较，在来自TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh+/-小鼠的前列腺组织中观察到更丰富的Mtdh mRNA(图14C)。一致地，与正常对照相比较，在TRAMP/Mtdh+/+前列腺中检测到Mtdh的蛋白质水平中的显著增加(图14D)。这些数据指示Mtdh在小鼠中的前列腺肿瘤发生期间被上调，并且表明更高水平的Mtdh可赋予肿瘤细胞竞争优势。

为了测试Mtdh丧失是否影响PB-Tag转基因的表达，SV40T抗原在来自TRAMP小鼠的前列腺中进行免疫染色。T抗原早在8周龄时在前列腺上皮细胞中检测到(图14E)，并且在晚期阶段时在前列腺上皮和肿瘤细胞中连续表达(图14F)。在癌症进展的早期或晚期时，在TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh-/-小鼠之间的个体前列腺上皮细胞中的T抗原免疫反应性中不存在显著差异。SV40t和T mRNA表达在具有不同Mtdh状态的TRAMP小鼠中是可比较的。如对于阴性对照预期的，SV40抗原在来自正常小鼠的前列腺中是无法检测的。这些结果证实Mtdh缺失不影响前列腺上皮细胞中的PB-Tag转基因表达。

Mtdh的丧失压制前列腺肿瘤形成并增加存活率：为了调查Mtdh 对癌基因诱导的前列腺肿瘤发生的总体效应，就其前列腺肿瘤发展和癌症相关死亡率研究具有不同Mtdh状态的TRAMP小鼠群组(n>100)。首先，因为泌尿生殖器重量是TRAMP小鼠中的肿瘤负荷的可靠指标 (Kaplan-Lefko等人，2003)，所以将来自不同年龄的TRAMP小鼠的泌尿生殖器进行解剖并测量，以在总体水平下监测肿瘤形成。因为Mtdh 表达在Mtdh+/+和Mtdh+/-前列腺组织之间是可比较的(图14C)，所以这些小鼠被分组为Mtdh阳性组(Mtdh+)相对于Mtdh阴性组(Mtdh-)。 SV40T抗原根据年龄诱导TRAMP/Mtdh+小鼠中泌尿生殖器质量的急剧扩大(图15A，菱形)，使得这些小鼠中的许多在36周龄时展示严重扩大的腹部。相比之下，在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的泌尿生殖器湿重保持相对恒定或仅以慢得多的速率增加(图15A，正方形)。当比较相对泌尿生殖器重量(作为体重的％)时，获得相似的结果(图15B)。一致地，几乎所有从36周龄TRAMP/Mtdh+小鼠中解剖的泌尿生殖器复合物均显示出肿瘤形成的肉眼可见体征(图15C，顶图)，而 TRAMP/Mtdh-/-小鼠的那些保持类似于正常对照(图15C，底图)。

为了进一步评价在组织学水平下的前列腺癌出现，将来自TRAMP 小鼠的前列腺组织切片，并进行苏木精和曙红染色。大约50％的23或 28周龄的TRAMP/Mtdh+小鼠发展前列腺癌病变，并且到36周龄时，该组中的几乎所有小鼠均发展多灶性前列腺肿瘤(图15D)。相比之下，在28周龄TRAMP/Mtdh-/-小鼠中未检测到前列腺癌，并且在前列腺上皮的非常有限区域中，仅在50％的36周龄TRAMP/Mtdh-/-小鼠中检测到前列腺癌病变。这些组织病理学结果与形态学观察一致，显示大多数TRAMP/Mtdh-/-小鼠到36周龄时不展示前列腺肿瘤形成的可见体征(图15C)。值得注意的是，在TRAMP小鼠中形成的肿瘤显示出不同的组织学特征，所述组织学特征是腺癌、叶状肿瘤和神经内分泌肿瘤的特征，并且已表明这些形态上不同的肿瘤可源自前列腺内的不同细胞谱系，或由共同早期祖先独立发展(Chiaverotti等人，2008)。有趣的是，TRAMP/Mtdh-/-小鼠显示所有这些不同肿瘤亚型的出现中的延迟通常在28或36周左右出现，表明Mtdh在前列腺癌中的可能谱系不依赖性作用。

由于恶性前列腺癌发展，显著百分比(～50％)的TRAMP/Mtdh+在达到一岁之前死亡。相比之下，检查的14个TRAMP/Mtdh-/-中仅1个死于癌症相关疾病(图15E，P<0.001)。这些数据共同证实小鼠中的 Mtdh缺失抑制癌基因驱动的前列腺癌形成，并延长TRAMP小鼠的寿命。

Mtdh的失活阻碍前列腺癌进展：前列腺癌进展由从恶变前病变例如PIN开始到高度分化癌、中度分化癌和低分化癌的多个阶段组成。为了调查Mtdh丧失如何影响前列腺癌的起始和进展，对每个前列腺的背侧和外侧叶执行组织学检查，所述前列腺是TRAMP小鼠中经历肿瘤发生的最频繁和严重的部位(21)(图16A)。基于对于TRAMP肿瘤的先前描述的分级系统(21,22)，每个前列腺被分配范围从正常前列腺的得分1到包括神经内分泌肿瘤的低分化癌的得分6的最高得分。在8 至12周龄的TRAMP/Mtdh+和TRAMP/Mtdh-前列腺两者中均容易检测到PIN病变(图16B，第一图)，如由上皮增生和完整基底细胞层的存在所证明的(图16A，T8和T12)。这与来自10周龄TRAMP/Mtdh+ 和TRAMP/Mtdh-小鼠的前列腺上皮中的可比较的增殖和细胞凋亡指数一致。在23周和28周时，相当大部分的TRAMP/Mtdh+小鼠分别发展具有侵袭性病变的高度或中度分化的腺癌，并且到36周时，84％的 TRAMP/Mtdh+小鼠展示肿瘤细胞的间变片的中度分化至低分化腺癌特征。相比之下，大多数TRAMP/Mtdh-小鼠仅到36周时才发展PIN或早期、高度分化的腺癌或叶状肿瘤。一致地，E-钙粘蛋白的表达逐渐减少甚至变得不存在，因为前列腺肿瘤在TRAMP/Mtdh+小鼠中进展至较少分化的阶段，而跨越检查的不同年龄在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的前列腺组织中检测到丰富的E-钙粘蛋白。此外，Mtdh+肿瘤的恶性进展伴随显著更高百分比的增殖细胞(图16C，P<0.01)，而凋亡细胞的百分比在该阶段的Mtdh+和Mtdh-肿瘤中相似。总之，这些发现表明 Mtdh的失活在肿瘤发生的早期阶段阻止前列腺癌进展，并且预防恶变前病变扩张并进展到晚期。

Mtdh的消除减少前列腺肿瘤细胞的全身转移：在大约50周龄时 (大多数TRAMP/Mtdh-/-小鼠已发展前列腺癌病变的时间点)，检查 TRAMP小鼠群组中的转移性疾病。解剖肝、肺和主动脉周淋巴结，在 TRAMP模型中频繁的转移部位(Gingrich等人，1996)，并在宏观和组织学水平两者下检查转移病灶的出现(图17A-B)。在来自34％的 TRAMP/Mtdh+小鼠的肝中观察到多个大转移性结节，导致显著增加的肝尺寸。相反，检查的TRAMP/Mtdh-/-小鼠无一在肝中发展可见的转移灶。类似地，在39％的TRAMP/Mtdh+小鼠中发现肺中的多个转移性沉积物，但17只TRAMP/Mtdh-/-小鼠中仅2只在其肺中检测到一个或两个转移病灶。在TRAMP/Mtdh+小鼠(9/20)中频繁鉴定淋巴结的扩大，并且该发生率在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中降低至30％。为了证实转移细胞是前列腺来源的，对肝、肺和淋巴结的连续切片执行免疫组织化学分析，以检测T抗原癌蛋白。观察到T抗原癌蛋白的均匀表达局限于转移性沉积物而不是围绕正常细胞，与PB指导的转基因表达的组织特异性模式相一致(Gingrich等人，1996)。这些数据共同清楚地显示小鼠中的Mtdh缺失显著减少TRAMP模型中的全身转移。值得注意的是，由于接近于50％的TRAMP/Mtdh+小鼠在达到一岁之前死于大型原发性肿瘤和可能的转移性肿瘤的事实，所以观察到的Mtdh+和Mtdh-组之间的转移差异非常可能被低估。

前列腺癌细胞中的Mtdh击倒减少体外增殖和体内肿瘤形成：由于 Mtdh在小鼠中广泛表达，全生物Mtdh-KO小鼠中的肿瘤发生缺陷可起因于前列腺上皮细胞或其他细胞/组织类型中的Mtdh丧失。为了区分这两种可能性，检查了Mtdh在TRAMP-C1细胞系的致瘤能力中的必要性，这是TRAMP模型中的晚期前列腺肿瘤的特征(Foster，1997)。 Mtdh被击倒(KD)(图15A和9B)，并且发现Mtdh-KD降低TRAMP-C1 细胞的体外增殖(图15C)。为了检查Mtdh-KD在体内肿瘤形成中的后果，我们将对照和Mtdh-KD细胞注射到接受者小鼠的侧腹中，并监测随着时间过去的肿瘤出现。可触及的肿瘤的出现在KD组中显著延迟 (图18D)，并且从KD组切除的肿瘤远小于来自对照组的肿瘤(图 18E和18F)。在另外两个独立的实验中获得类似的结果。有趣的是，最终在Mtdh-KD组中形成的肿瘤表达与对照组中的肿瘤相似的Mtdh 水平(图18G)，其可起因于没有Mtdh抑制的细胞克隆扩增或Mtdh 在Mtdh-KD细胞中的重新表达。

讨论

人前列腺癌的特征在于猖獗的复发性扩增和缺失，表明连同一些众所周知的遗传损伤，例如肿瘤抑制基因PTEN和p53的丧失，仍然存在许多未表征的基因控制这种恶性肿瘤的生成和进展(Taylor,2010)。在目前研究中，证实MTDH在人前列腺癌中频繁过表达和扩增，并且其表达水平与疾病进展和弱存活后果强相关。此外，利用Mtdh-KO小鼠的遗传研究提供了第一个体内证据：Mtdh在自发前列腺癌进展和转移中起关键作用，而不影响正常发育。

TRAMP模型紧密类似人前列腺癌，因为其自发地发展可转移到多个不同器官的进行性前列腺癌。重要的是，此处显示与正常前列腺组织相比较，Mtdh水平在人和SV40驱动的鼠前列腺肿瘤两者中均升高。有趣的是，近期发现Mtdh通过基因组扩增在p53/Pten缺陷型转移性前列腺癌小鼠模型中过表达，在所述小鼠模型中端粒酶活性在端粒功能障碍后被重新激活(Ding,2012)，表明Mtdh可通过类似于我们在人前列腺癌中发现的基因组扩增机制在小鼠中被活化。未来的研究需要调查 Mtdh过表达在SV40转化肿瘤中的分子基础。

显示TRAMP小鼠中的Mtdh敲除显著损害肿瘤形成并降低癌症相关死亡率。在TRAMP-C1癌细胞中的Mtdh沉默延长无肿瘤存活并减少体内肿瘤生长的发现还支持在前列腺癌中Mtdh的前列腺肿瘤细胞固有作用。值得注意的是，由推测携带Mtdh靶向shRNA的TRAMP-C1 癌细胞最终形成的肿瘤重新获得Mtdh的表达，加强了Mtdh对于体内前列腺癌形成是必需的概念。在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的良性或高度分化阶段观察到前列腺癌进展的阻断，这一概念还通过 TRAMP/Mtdh-/-前列腺组织中组成型高水平的上皮标记物E-钙粘蛋白得到支持。一致地，尽管TRAMP/Mtdh+小鼠展示扩大的前列腺和阻塞的精囊，这一现象通常起因于进入尿道和精囊内的前列腺肿瘤细胞的侵袭和恶性生长，来自TRAMP/Mtdh-/-小鼠的泌尿生殖道在很大程度上看起来正常。与来自小鼠模型的发现一致，MTDH在人前列腺癌中显示出进展相关的表达模式。这些结果可表明MTDH作为前列腺癌进展的生物标记物的潜在用途和停止人前列腺癌的恶性进展的可能治疗靶。

小百分比的TRAMP/Mtdh-/-小鼠在长潜伏期后仍展示侵袭性前列腺癌并死于疾病的事实(14只中的1只)表明，一些TRAMP/Mtdh-/- 肿瘤已克服Mtdh的缺陷并利用Mtdh非依赖性途径来支持其恶性生长和进展。事实上，SV40癌基因的诱导早在青春期时在前列腺上皮细胞中均匀出现；然而，侵袭性前列腺癌和转移的发展出现要晚得多，并且看起来是高度异质的，表明个别肿瘤可获得不同的遗传和表观遗传改变，以完全转化SV40抗原阳性细胞。尽管如在大多数 TRAMP/Mtdh-/-小鼠中观察到的，Mtdh的失活抑制Mtdh依赖性信号传导和前列腺癌进展，但它不阻断由Mtdh非依赖性机制支持的肿瘤生长。这也与MTDH在大百分比但不是所有人前列腺癌中高度表达的观察一致。然而，依赖于高水平的MTDH进展到恶性阶段的癌细胞对于MTDH 靶向治疗剂是敏感的，如通过Mtdh阳性TRAMP-C1细胞中的Mtdh抑制显著损害这些细胞的致瘤潜力的发现所支持的。

转移到远处器官负责患有实体癌的患者中癌症相关死亡的大多数 (Wan,2013)。先前证实MTDH在具有较高转移风险的人乳腺癌中被扩增和/或过表达(Hu等人，2009)。在目前研究中，发现人前列腺癌的远处转移的大部分显示出高水平的MTDH，并且具有8q22基因组基因座的扩增。在功能上，Mtdh消除显著降低了TRAMP模型中的远处器官中的转移发生率和负荷。根据这些发现，近期研究显示在由Pten和 p53丧失驱动的前列腺癌倾向的小鼠模型中的端粒功能障碍后的端粒酶再活化有利于在癌症相关基因座处的拷贝数改变的选择，并且发现 Mtdh位于选择性基因列表的顶部，所述基因的遗传扩增在这个小鼠模型中与癌症进展和转移强烈相关(Ding等人，2012)。这表明除了SV40 癌基因之外，Mtdh在由遗传事件驱动的前列腺癌中的可能重要作用。最后，应当注意MTDH的转移促进功能很可能存在于除乳腺癌和前列腺癌之外的其他癌症类型中。几项近期研究的确显示异常MTDH表达与另外的癌症类型中的淋巴结转移和更差的预后相关，所述另外的癌症类型包括喉鳞状细胞癌(Liu等人，2013)、头与颈鳞状细胞癌(Yu 等人，2014)、以及肝细胞癌(Zhu等人，2011)，并且MTDH的过表达增加肝细胞癌细胞的实验转移(Yoo等人，2009)。

总之，本文的研究报道MTDH在小鼠和人前列腺癌两者中均过表达，并且这种升高的MTDH水平对于自发性前列腺癌进展和体内转移是关键的。鉴于MTDH在不同癌症类型中的广泛过表达，MTDH的肿瘤促进作用可能不限于本研究中使用的模型。事实上，正在进行的研究还已发现Mtdh的缺失显著抑制自发性乳房肿瘤形成和转移。未来的研究需要了解负责MTDH的肿瘤促进功能的根本机制和信号传导途径，并且有利于开发MTDH靶向治疗剂以控制人癌症。

实例3-异粘蛋白和SND1之间的相互作用的分析

异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)在不同癌症类型中过表达且相互作用。MTDH和SND1两者均与不同细胞机制和信号传导蛋白质相互作用，并且牵涉多重癌症相关细胞过程和信号传导途径，可能Mtdh和SND1通过经由其多重相互作用结构域/基序协调肿瘤促进信号传导活性来增强恶性特征。然而，结构信息的完全缺乏极大妨碍了MTDH/SND1蛋白质复合物的功能的机制性理解，尽管两种蛋白质在许多类型的癌症中有显著的临床相关性。阐明 MTDH-SND1相互作用的结构基础对于开发靶向MTDH或SND1的新方法作为新型癌症治疗策略也是重要的。为了分析两种蛋白质之间的相互作用，如下所述测定MTDH-SND1复合物的高分辨率晶体结构，其揭示11个残基的MTDH肽基序占据在两个SN结构域(SN1/2)之间延伸的蛋白质凹槽，其中两个MTDH色氨酸残基嵌套在SND1中的两个明确限定的口袋内。

实验程序

蛋白质制备：使用标准的基于PCR的克隆策略生成所有构建体和点突变。简言之，将具有不同边界和突变型的SND1和MTDH克隆到 pQlink载体(Addgene)中，所述pQlink载体分别具有N端His8标签和 GST标签，具有在亲和标签后的TEV切割位点。蛋白质在大肠杆菌(E. coli)菌株DH5α中在23℃下过表达。SND1和SND1(16-339)-L21-MTDH (386-407)的表达和纯化遵循由先前出版物(Li等人，2008)修改的程序。

对于SND1蛋白质，使用含有2mMβ-ME、0.5M NaCl、5mM咪唑和25mM Tris PH8的裂解缓冲液，在Ni-NTA树脂(Qiagen)上纯化裂解产物的可溶级分。通过含有0.2M NaCl、250mM咪唑和不含β-ME 的25mM Tris PH8的缓冲液洗脱His-SND1蛋白质。在通过肝素缓冲液A(25mMHEPES、PH7、10mM EDTA、10％甘油、2mMβ-ME) 稀释4倍后，将蛋白质装载到肝素柱(GEHealthcare)，并且通过100ml 0-0.6M NaCl梯度洗脱。加上GST标签的MTDH蛋白质在GS4B树脂 (GE Healthcare)上进行纯化，并且还通过阴离子交换色谱(Source 15Q, GEHealthcare)进行分级。

为了有利于SND1和MTDH复合物的结晶，经由具有21个残基的柔性接头(L21)，使SND1(16-339)融合至MTDH肽(386-407)。对于 SeMet蛋白质，12L His-SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)融合蛋白在 pQlink载体中在23℃下在大肠杆菌菌株(BL21,DE3)中在OD600＝1时过表达22小时，使用0.25mM IPTG。在10mM DTT的存在下通过TEV 蛋白酶切割之前，如上所述通过Ni-NTA和肝素柱纯化蛋白质。在通过疏水相互作用色谱(HiTrap Phenyl HP,GEHealthcare)进一步纯化以去除杂质(包括TEV和在以后峰处的融合蛋白二聚体)前，将样品调整至1.4M(NH4)2SO4并旋转以去除团块。随后在最终步骤中通过凝胶过滤色谱(Superdex200,GE Healthcare)纯化融合蛋白的单体，以将缓冲液更换为10mM Tris PH8、150mM NaCl和10mM DTT。将样品浓缩至15mg/ml用于结晶。

结晶和数据收集：通过混合250nl 15mg/ml SeMet-SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)与250nl孔缓冲液(21.6％ pEG3350、0.1M柠檬酸钠,PH8.0、0.1M CsCl)，加上50nl微小种子，使SND1和MTDH融合蛋白的晶体通过坐滴式蒸汽扩散法在23℃下生长。单晶在4天内生长且在7天后成熟。在液氮中快速冷冻之前，将晶体逐渐更换为具有0至25％甘油的孔缓冲液。为了减少对晶体的辐射损害，在相同位置上用25％束能量，0.6秒/帧在波长

处连续收集SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的两个SAD数据集。在APS LS-CAT(ID-D)处收集数据，并且使用HKL2000(Otwinowski,1997) 将这两个数据集组合并加工至

通过phenix.xtriage在0.0833的

处测量反常散射信号的最佳截断(Adams等人，2010)。通过将暴露时间增加到1.5S来收集第二个SAD数据集，其被加工为

结构测定：使用在

下的组合SAD数据集，通过phenix.autosol (Adams等人，2010)测定SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的初始结构。在具有Rfree/Rwork＝0.35/0.30的初始模型中发现24个硒原子和5个不对称单元。该模型通过phenix.refine(Adams等人，2010)以反常基团(Se)进行精制，并且使用在CCP4包(Winn等，2011)中的 Phaser(McCoy等人，2007)，通过分子替换充当

数据集的起始模型。改进的模型使用Coot(Emsley和Cowtan，2004)手动构建，并使用具有TLS和异常基团(Se)的phenix.refine约束进行精制(Adams 等人，2010)。最终结构精制为

(表S1)。

GST-介导的下拉测定：经由GST标签使～20μg GST-MTDH(不同的截短形式和位点突变型)结合到10μl谷胱甘肽树脂。树脂用200μl 测定缓冲液(25mM Tris,PH8.0,150mMNaCl,3mM DTT)洗涤三次，以去除过量的未结合蛋白。将15μg His-SND1(16-339)以在具有2mg/ml BSA的测定缓冲液中悬浮的100μl体积加入树脂中。在通过SDS-PAGE 检查之前，混合物用200μl测定缓冲液洗涤两次，并通过考马斯蓝染色显现。实验重复3次，并通过ImageJ分析与GST-MTDH相关的SND1 比。

免疫沉淀和蛋白质印迹：对于体内免疫沉淀(IP)实验，培养的细胞在冷PBS中进行洗涤，并且在裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.4、0.15M NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％Tx-100、0.0025M Na2P2O7、 1mMβ-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4和1mM NaF)进行裂解，所述裂解缓冲液具有无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science) 和PMSF。随后使细胞裂解产物在冰上温育10分钟，离心，并通过与蛋白A/G珠(Santa Cruz Biotechnology)在4℃下温育1小时进行预清除。对于IP珠制备，使30μl蛋白A/G珠与5μg抗体在4℃下温育2小时。IP在4℃下进行过夜，并将珠离心，洗涤，随后在SDS蛋白质上样缓冲液中煮沸5分钟，以洗脱结合的蛋白质。使IP裂解产物经历用所示抗体的蛋白质印迹。

对于蛋白质印迹，通过在板上直接加入裂解缓冲液来收集来自培养的细胞的裂解产物。根据标准程序执行蛋白质印迹凝胶制备和免疫印迹。针对MTDH(Invitrogen，目录#40-6500)、SND1(Santa cruz，目录#sc-271590)、抗Myc(Santa Cruz，目录#sc-40)和抗HA(Santa Cruz，目录#sc-7392)的抗体进行1:1000稀释。

肿瘤球测定：单细胞在具有球体培养基(补充有B27(Invitrogen)、 20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF和4μg/mL肝素的1:1DMEM:Ham’s 12)的超低附着板(Corning,Tewksbury,MA)中铺平板。球体在铺平板后4-7天进行计数。

肿瘤发生测定：所有涉及小鼠的程序和所有实验方案均得到 PrincetonUniversity的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。对于肿瘤发生测定，将所示数目的PyMT肿瘤细胞移植到FVB接受者小鼠的乳房脂肪内，并且每周两次监测肿瘤形成。当肿瘤变得可触及连续两周时，肿瘤视为建立，并且通过卡钳测量肿瘤大小用于计算肿瘤体积(πx长度x宽度²/6)。

FRET测定：对于FRET测定，将与(TC)SND1(16-339)融合的 CFP-MTDH融合蛋白和四半胱氨酸肽克隆到pQlink载体(Addgene)内，所述pQlink载体具有N末端GST标签与亲和标签后的TEV切割位点。蛋白质在23℃下在大肠杆菌菌株DH5α中过表达。大肠杆菌细胞裂解产物的可溶级分在GS4B树脂(Qiagen)上进行纯化，随后通过TEV切割来去除GST标签。未加上标签的蛋白质还通过阴离子交换色谱(Source 15Q,GE Healthcare)和凝胶过滤色谱(Superdex 200,GE Healthcare)进行分级。

将FlAsH-EDC2化合物(Invitrogen)以1:1.1摩尔比加入TC-SND1 (16-339)中，以产生在FRET测定中充当CFP受体的高度荧光的 TC-FLASH-SND1。使用Victor X5MultilabelPlate Reader(Perkin Elmer)，伴随在450nm处的激发和在490nm处的发射，在浓度渐增的TC-FLASH-SND1(0.25、0.5、1、2、4、8μM)的存在和不存在下，测量0.2μM CFP-MTDH的CFP的供体荧光信号。基于供体荧光的丧失，使用下述方程计算能量转移速率：E＝1-(FDA/FD)，其中FDA和 FD分别是在TC-FLASH-SND1的存在和不存在下的CFP荧光。 TC-FLASH-SND1浓度依赖性FRET效率在GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)中进行拟合，用于估计MTDH肽和SND1之间的平衡解离常数(KD)。实验重复三次；显示了代表性结果。

生物层干涉测量法(BLI)：通过与150nM GST-MTDH(386-407) 温育，随后与1mg/mlBSA温育，并通过含有25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl和3mM DTT的结合缓冲液洗涤，来活化通过抗GST抗体固定的 BLI传感器，其中每个步骤3分钟。将由GST-MTDH活化的7个传感器同时浸入7个孔内，所述7个孔含有结合缓冲液对照和浓度渐增的 His8-SND1(16-339)(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μM)，以测量SND1 结合的结合速率。在结合三分钟后，将传感器浸入结合缓冲液内，以测量解离速率。使用ForteBio Octet RED96(Pall Life Science)执行数据收集和分析。

统计分析：需要时所有结果均经历统计分析。如图例中指示的，对于大多数研究使用时序检验、非参数曼怀二氏检验、卡方检验和不成对、双侧、独立斯氏t检验，其中具有相等方差假设。对于有限稀释测定，TIC的频率和统计学使用L-calc软件(StemCellTechnologies)进行计算。P值在所有图中指示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

登录号：MTDH-SND1复合物的原子坐标以登录号4QMG保藏于蛋白质数据库中。

结果

其相互作用所需的MTDH和SND1的最低限度区域的映射：最初进行的MTDH(残基1-582)的一级序列分析表明MTDH在其整个序列中大部分是非结构化的，除了接近N末端的跨膜结构域之外。因此， MTDH可充当支架蛋白质，并且经由其在其序列自始至终的肽基序召募不同的信号传导分子。基于MTDH片段(SEQ ID NO:1的氨基酸 364-470)具有与SND1相互作用所需的基本区域的先前观察(Blanco 等人，2011)，MTDH的最低限度片段(SEQ ID NO:1的氨基酸386-407) 最近映射在赋予SND1结合的该区域内(参见上文)。SND1结构域无一已映射用于与蛋白质分子的特异性相互作用。为了填补这个缺口，制备一些SND1构建体，并且两个给出了分别具有N末端SN1/2和C 末端SN3/4-TSN5结构域的高度可溶性重组蛋白质。通过使用具有 SND1结合基序的加上GST标签的MTDH(SEQ ID NO:1的氨基酸 364-582)片段执行下拉实验，我们显示SND1的SN1/2结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸16-339)与MTDH化学计量结合，而SN3/4-TSN5结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸340-885)几乎不与MTDH相互作用。使用生物层干涉测量法的这种相互作用的进一步分析显示这种相互作用是容易可逆的。MTDH和SND1之间的结合亲和力为约0.9μM，如通过FRET(荧光共振能量转移)测定所指示的。

MTDH-SND1复合物的总体结构：在广泛的努力之后，SND1 SN1/2 结构域和具有SEQID NO:1的MTDH残基386-407的合成肽的共结晶未能获得蛋白质晶体，可能是由于两种蛋白质之间相对弱的相互作用。为了稳定复合物并促进结晶，经由长度范围为12-37个残基的柔性接头，使SND1SN1/2结构域融合至MTDH(SEQ ID NO:1的氨基酸 386-407)。具有21个残基的接头的构建体最终获得衍射晶体。虽然 SN1/2结构域与SN3/4结构域紧密相关，但使用SN3/4(PDB代码： 3BDL)结构通过分子替换的结构测定是不成功的，可能是由于从OB 折叠发出的扩展环的大多样性。最后，通过Selenium SAD(单波长异常色散)定相测定结构，并精制至

在几乎相同的每个不对称单位中发现MTDH-SND1融合蛋白的五个拷贝，其中均方根偏差在290个残基内不超过

具有限定的电子密度的MTDH残基数目在不同拷贝中略有不同。尽管如此，MTDH 的残基393-403在所有拷贝中均可见，在与SND1的界面处具有明确限定的电子密度图。SN1和SN2两者均显示出葡萄球菌核酸酶(SNase)的典型OB折叠，并且以类似于SN3/4(图17A)的中心对称相关方式排列(图16)。每个SN结构域含有由三螺旋束(α1-α2-α3)和短β-发夹(β4-β8) 封端的β-桶(β1-β2-β3-β7-β5)(图16)。MTDH肽(SEQ ID NO:1的D393WNAPAEEWGN403)占据SN1和SN2结构域之间的浅凹槽，其中SEQ ID NO:1的两个色氨酸残基W394和W401与SND1中两个明确限定的疏水口袋形成广泛的疏水性接触。

值得注意的是，在MTDH-SND1界面的相对侧，SND1具有三个延长的突出结构元件(SN1中的β6-β7发夹以及SN1和SN2两者中延长的Lβ4-α1环)，导致能够具有不同结合模式的尖锐表面。SN1/2结构域先前表明参与DNA/RNA结合，并且促成SND1的核酸酶活性(Li 等人，2008)。有待确定与MTDH-SND1界面相对的SND1的丘陵表面是否可能参与结合DNA/RNA或其他蛋白质，并且促成由SND1介导的核酸酶活性或信号转导。

SN1/2与SN3/4和SNase的结构比较：SN1/2、SN3/4(PDB代码： 3BDL)和SNase(PDB代码：2ENB)的两个拷贝的结构叠加揭示了β片层和α螺旋中的相似结构(图19)，其中均方根偏差在SN1/2和SN3/4 之间的268个残基上为

在SN1和SNase之间的123个残基上为

并且在SN2和SNase之间的116个残基上为

然而，几个环区域明显不同，具有不同的长度和氨基酸序列(图20A和20B)。这些可能是由OB折叠进化的新特征，以赋予新功能性。例如，如以后详细显示的，SN1中细长的Lβ2-β3环对于介导MTDH结合是关键的。 SN1和SN3中的Lβ4-α1环显著长于SNase中的那种，并且它们采用明显不同的构象，所述构象可能对两个SN结构域限定不同的特异性。在 SNase活性位点处的六个残基中的两个保留在SN3中，这些残基中的仅一个在SN1和SN4中保持相同或相似，但其中无一保留在SN2中(图20B)。这与先前观察一致：SN3/4显示出低核酸酶活性，而SN1/2增加核酸酶活性(Li等人，2008)，推测是通过增强底物结合。这些观察表明对于SND1中的SN结构域已进化出新功能，但这些SN折叠中的核酸酶活性在进化过程中降低(在SN3/4中)或缩小(在SN1/2中)。

MTDH-SND1相互作用界面：MTDH在SND1的丘陵表面背面上占据SN1和SN2之间的延长凹槽的事实与MTDH可充当支架信号传导蛋白质的概念一致。该体系结构可允许MTDH桥接SND1和其他MTDH 相关的信号传导复合物，而不干扰SND1的主要结合表面。 MTDH-SND1界面因此为理解不同的下游信号传导及其在癌症中的功能提供了重要的基础。

界面由MTDH中的W394和W401与SND1中的两个分离的明确限定的疏水口袋的疏水性范德华接触支配，其由在口袋的外围处的氢键(H-键)和盐桥相互作用支撑(图21)。W394的疏水口袋由SN1Lβ2-β3 环中的残基P39、P43和P44以及SN2α1螺旋上的E247和F250的侧链形成。W401的口袋远离约

并位于来自SN2的α1和α2螺旋之间，并且由疏水残基L256、H279、I284和L287以及残基R255、R259 和N281的碳链区形成轮廓。在接近界面一端的疏水口袋的外周处， SND1中的R327和R324与MTDH中的D393和N395，及其在不对称单元的五个复合物中的两个的392处的主链羰基基团形成几个H键和盐桥相互作用；在中间，SND1中的R255与在395处的MTDH主链形成H键相互作用；并且在另一端处，几个H键和盐桥相互作用由来自 SN1α1螺旋和SN2β5链的残基和主链原子与MTDH残基E400和N403 形成。

SND1中的MTDH界面是高度独特的，并且仅存在于SN1/2中。用于W394和W401的明确限定的疏水口袋由具有静电势的SN1/2的表面轮廓清楚地显示，但在SN3/4中不存在。SN1/2中的两个疏水口袋之间的表面是碱性的，其部分有利于与E400的静电相互作用，但对于与W394和W401之间的非极性残基(A396PA398)的相互作用并不理想。这可能解释了SND1和MTDH之间相对弱的相互作用以及这种相互作用的快速解离速率。与SN1/2不同，SN3和SN4之间的蛋白质凹槽大部分是碱性的，是不利于MTDH结合的SN3/4的另一个结构特征的基础。此外，SN1Lβ2-β3环中对于衬里W394的口袋必需的脯氨酸残基在SN3或SNase中均不存在(图20B、图21)，进一步限定SN1/2与 MTDH的结合特异性。

结合缺陷的MTDH和SND1突变体的鉴定：为了获得上文表征的界面如何促成MTDH-SND1相互作用的了解，执行结构指导的诱变研究。MTDH-SND1结构表明由MTDH W394和W401作出的范德华疏水接触可在SND1结合中起主要作用。与该概念一致，将两个色氨酸残基中任一突变为小得多的残基丙氨酸(W394A、W401A)或带负电荷的残基天冬氨酸(W394D、W401D)，消除或显著降低在体外在SND1 (16-339)和MTDH(364-582)之间的相互作用(图22A)。W→A突变体显示出比W→D突变体更强的缺陷，并且关于W394的突变导致比关于W401的突变更严重的缺陷，表明MTDH-SND1相互作用在很大程度上由范德华接触决定，并且W394对SND1结合作出比W401更大的贡献。预期破坏H键或盐桥相互作用的在外周界面处的MTDH突变 (N395A、E400A、E400R、N403A)几乎没有任何效应，类似靶向在界面外的D389的突变(D389R)(图22A)。这可能是个别H键对 MTDH-SND1相互作用作出较小贡献。这些结果与结构观察一致，并支持MTDH和SND1之间的相互作用由MTDH色氨酸残基和SND1中的疏水口袋之间的范德华接触支配的概念。

还鉴定了破坏MTDH结合的在界面处的几个SND1突变。对SND1 疏水口袋作出的变化(包括R255E、F250A和SN1Lβ2-β3环中的缺失 (Δ39-43))几乎完全消除了MTDH结合(图22B)。除了扰乱与W401 的范德华接触之外，R255E也可能影响其与MTDH主链的H键相互作用(图21)。Δ39-43的作用还支持了在SN1Lβ2-β3环中独特发现的这些残基(图20A、20B和21)对于MTDH-结合的作用。R324E突变显著削弱了MTDH结合，可能通过引入与MTDH中的D393的排斥性电荷-电荷接触。预期扰动其H键相互作用的对该残基的不同突变 R324A几乎不影响MTDH结合，类似于阴性对照，R316E，位于界面外部的SND1突变。

还检查在该界面处鉴定的MTDH和SND1突变如何影响哺乳动物细胞中的全长蛋白质的相互作用。全长加上HA标签的SND1与全长加上Myc标签的野生型(WT)或突变型MTDH一起在HEK293T细胞中共表达，并且使细胞裂解产物经历抗HA免疫沉淀用于SND1下拉。与体外观察(图22A)一致，WT MTDH而不是突变体W394A、W394D或 W401A连同HA-SND1一起被下拉(图22C，以红色表示)。MTDH 突变W401D显著降低了结合(图22C，以蓝色表示)，而其他突变，包括阴性对照D389R，位于MTDH-SND1界面外部的突变，不影响相互作用(图22C)。同样地，在体外影响MTDH结合的SND1突变也影响体内的全长蛋白质结合至相似的水平。WT HA-SND1和阴性对照突变体HA-SND1R316E两者均容易地与Myc-MTDH结合，而其他突变Δ39-43、F250A或R255E几乎完全消除MTDH结合，并且R324E 显著降低结合(图22D)。

对MTDH-SND1相互作用的体外和体内研究的相似结果强烈表明上文表征的MTDH-SND1界面决定了哺乳动物细胞中的全长MTDH和 SND1的相互作用。这允许进一步定义该界面在控制MTDH和SND1 在癌症促进中的功能中的作用。

SND1结合缺陷的MTDH突变体具有减少的促肿瘤发生活性：如上文证实的，MTDH在调节乳房肿瘤发生中起作用。特别地，小鼠中 Mtdh的遗传缺失损害由不同癌基因(PyMT、Wnt、ErbB2)或致癌剂刺激转化的乳腺上皮细胞的肿瘤起始潜能，并且这种缺陷可通过经由慢病毒转导将MTDH重新引入Mtdh敲除(Mtdh-/-)肿瘤细胞内容易地援救。为了测试与SND1相互作用对于MTDH的肿瘤起始效应是否重要，鼠形式的WT或突变型MTDH(W394A或W401A，小鼠中的相应突变是W391A、W398A)在来自PyMT；Mtdh-/-小鼠的乳房肿瘤细胞中稳定表达。MTDH突变体W394A或W401A完全丧失与SND1相互作用的能力(图23A)，表明MTDH的SND1相互作用残基在小鼠和人之间是良好保守的。在功能上，体外乳房球形成测定显示，与用WTMTDH 重构的那些相比较，用突变型MTDH重构的PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞形成显著更低数量的球体(图23B)。为了检查MTDH突变如何影响体内肿瘤形成，将PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞原位移植到WT接受者小鼠的乳房脂肪垫内。发现用突变型MTDH重构的PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞含有基本上更少的肿瘤起始细胞，如通过当注射有限数量的细胞时减少的肿瘤发生率揭示的(图23C)。此外，由用突变型MTDH重构的 PyMT；Mtdh-/-肿瘤细胞形成的肿瘤大小比用WTMTDH的那种小得多 (图23D-E)。这些结果证实MTDH和SND1之间的相互作用对于 MTDH的促肿瘤产生活性是必需的。

MTDH结合缺陷的SND1突变体在肿瘤促进中无活性：用于 MTDH-结合的SND1中明确限定的口袋和这种相互作用在肿瘤起始中的作用表明SND1中的蛋白质口袋代表了新型癌症治疗靶。如上文证实的，SND1的击倒(KD)损害PyMT/Mtdh+/+肿瘤细胞的肿瘤起始活性，从而支持SND1的肿瘤促进作用(Wan等人，2014)。在目前研究中， WT或突变型SND1(F250A或R255E)的shRNA抗性构建体在 SND1-KD PyMT/Mtdh+/+肿瘤细胞中稳定表达，并且在体外和体内测试其对肿瘤起始活性的作用。SND1突变几乎完全消除了与MTDH的相互作用(图24A)。SND1突变体几乎不导致在体外乳房球测定中形成的球体数目中的任何增加，而WT SND1与对照相比使球体数目增加超过2倍(图24B)。在将细胞移植到接受者小鼠的乳房脂肪垫内之后，如通过肿瘤发生率和总肿瘤负荷反映的，WT SND1显著提高了肿瘤起始和肿瘤生长，而SND1突变体显示出非常小的作用(图24D)。这些结果还支持我们的结论：MTDH和SND1之间的相互作用对于肿瘤促进是重要的，并且SND1中的两个MTDH结合口袋对于该活性均为关键的。

SND1结合缺陷的MTDH突变体未能在应激下稳定SND1：这些近期研究表明MTDH在应激条件下增强SND1蛋白质的稳定性中起关键作用，这可能促成SND1在癌细胞中在致癌或其他应激下的促存活作用(Gao等人，2010；Sundstrom等人，2009；Weissbach和Scadden，2012)。为了证实这一概念，检查了MTDH突变对SND1在热激下的细胞稳定性的作用，所述热激是在其下SND1已被证实对于细胞存活是重要的条件(Gao等人，2010；Weissbach和Scadden，2012)。当单独过表达时，HA-SND1的细胞水平在45℃下迅速降低，具有约30 分钟的半衰期(图25)。与WT Myc-MTDH的共表达增强了HA-SND1 在45℃下的细胞稳定性，其中半衰期延长超过3小时，而任一MTDH 突变体W394A和W401A的共表达未能在热激下稳定HA-SND1。该结果支持MTDH-SND1相互作用在促进SND1的细胞稳定性中的作用，与我们的MTDH和SND1的蛋白质水平在人乳腺癌中正相关的近期观察一致(参见上文)。

讨论

近年来，MTDH由于其在不同癌症类型中的广泛牵涉而获得越来越多的关注，并且SND1已证实为具有类似于MTDH的肿瘤促进功能的MTDH结合蛋白(Emdad等人，2013；Wan和Kang，2013)。然而，相互作用的结构基础和功能意义仍不清楚。我们的研究在此处映射MTDH和SND1的最低限度相互作用基序/结构域，并测定其复合物的高分辨率晶体结构。结构分析和结构指导的功能研究显示 MTDH-SND1界面是MTDH和SND1在乳房肿瘤起始中的活性所必需的，并且具有希望作为新型癌症治疗靶的结构特征。此外，MTDH-SND1 复合物的结构为未来理解由这种相互作用桥接的癌细胞信号传导提供了重要的平台。

本研究中表征的MTDH-SND1界面提供了关于其相互作用的分子基础的关键了解。先前将必需的SND1结合基序映射至MTDH的两个不同区域：SEQ ID NO:1的残基364-470(Blanco等人，2011)和SEQ ID NO:1的残基101-205(Yoo等人，2011)。在此处的研究将MTDH的短的11个残基的肽基序(SEQ ID NO:1的残基393-403)限定为主要SND1结合基序，其位于由Blanco等人(Blanco等人，2011)鉴定的片段内。在该界面处的MTDH或SND1中的突变消除了HEK293T 细胞和乳腺肿瘤细胞两者中的全长蛋白质的相互作用，从而支持该界面是MTDH和SND1之间的主要结合位点的概念。

MTDH-SND1界面在癌症促进中的突出功能表明靶向该界面可能是用于癌症治疗的有用策略。此外，我们的结果表明靶向该界面的重要方式。MTDH和SND1之间的相互作用由MTDH中的W395和W401 以及SND1中的两个明确限定的疏水口袋之间的范德华接触所支配，所述范德华接触吸引小分子抑制剂的结合。重要的是，在任一结合口袋处的MTDH或SND1中的突变消除了其促进乳房肿瘤起始的活性，从而使同时靶向两个SND1口袋成为有吸引力的治疗方法。用于靶向的该界面的其他吸引人的特征包括MTDH和SND1之间的容易可逆的结合，表明这种相互作用可被特异性抑制剂逆转。此外，MTDH结合口袋是在SN1/2结构域中独特进化的，但不存在于其他OB折叠超家族蛋白质或SND1中的其他SN结构域中，是开发对于阻断MTDH结合高度特异性的化合物的潜在希望。

MTDH-SND1界面的结构为理解由该相互作用协调的细胞信号传导提供了重要的平台。尽管SN1/2和SN3/4结构域之间具有结构相似性，SN3/4不具有MTDH结合所需的独特口袋和表面特征。此外，在SN1/2和SN3/4中具有突出结构的丘陵表面是明显不同的，并且预期赋予不同的结合特异性。含有SN3/4-TSN5结构域的SND1片段中的结构域显示以新月形的线性取向排列(Li等人，2008)。FRET分析指示全长SND1的末端之间的距离比SN3/4-TSN5片段的距离更远，表明多个 SND1结构域以线性方式排列。该体系结构可能允许不同的结合配偶体以相关定向进行协调，用于下游信号传导。令人惊讶的是，MTDH经由短肽与SND1的表面结合，所述SND1的表面相当平坦并且明显不同于位于相对侧的丘陵表面。这种简单的结合模式与该界面在癌症促进中的强大功能形成鲜明对比，表明由该界面介导的下游信号传导可促成MTDH和SND1在癌症中的多方面作用。重要的是注意到，除单个跨膜结构域之外，具有几乎五百个残基的MTDH的整个序列大部分是无序的，表明MTDH可与许多信号传导蛋白相互作用的可能性。这些特征类似信号传导支架蛋白质例如AKAP(激酶锚定蛋白(Gelman， 2012)的那种，表明MTDH可充当信号传导支架蛋白质。连同SND1 一起，MTDH可经由不同的信号传导分子介导细胞信号传导，所述不同信号传导分子通过SND1和MTDH的多个相互作用结构域/基序协调。

在应激下SND1稳定性对MTDH结合的依赖提供了MTDH-SND1 相互作用在癌症中的作用的另一种解释。该结果也与MTDH和SND1 在肿瘤组织中同时升高的观察一致(参见上文和Wang等人，2012)。然而，MTDH-SND1相互作用如何促成在应激下的SND1稳定性仍有待确定。目前的体外研究证实MTDH结合对SN1/2结构域的热稳定性或其对蛋白酶切割的敏感性具有最低限度影响，表明MTDH结合可能不直接稳定SND1。需要进一步的研究来解开SND1的细胞稳定性是否依赖于其他生物分子的召募的疑团。

实例4–野生型MTDH肽显著阻断MTDH-SND1相互作用。

293T细胞用HA-SND1和MYC-MTDH共转染。48小时后，收集细胞并实施免疫沉淀测定。参见图26A和图26B。将细胞裂解产物与抗HA抗体或IgG温育过夜，随后为与蛋白A/G珠的两小时温育，以下拉HA-SND1蛋白质。将珠用裂解缓冲液洗涤并分成五个级分。每个级分用缓冲液或指示的肽(即肽-wt(PNSDWNAPAEEWGNW，SEQ ID NO:16)；肽-394A(PNSDANAPAEEWGNW，SEQ ID NO:17)；肽 -401A(PNSDWNAPAEEAGNW，SEQ ID NO:18)和肽-MT(PNSDANAPAEEAGNW，SEQ ID NO:19)洗脱30分钟。

收集洗脱级分和珠用于蛋白质印迹。(图26C和26D)将细胞裂解产物分成6个级分。级分之一与IgG一起温育，并且剩余部分与抗 HA抗体加上缓冲液或指示的肽一起温育。在24小时后，将裂解产物与蛋白A/G珠一起温育，随后通过洗涤缓冲液洗涤珠。在所有测定中均使用50uM肽。

通过乳腺癌细胞系的内源性免疫沉淀(IP)确认相互作用中断效应。简言之，收集来自乳腺癌细胞系MDA-MB-231的细胞裂解产物并实施 IP测定。结果在图27A和图27B中提供。图27A-细胞裂解产物与抗 SND1抗体或IgG温育过夜，随后为与蛋白A/G珠的2小时温育，以下拉内源性SND1蛋白质。将珠用裂解缓冲液洗涤并分成5个级分。每个级分用缓冲液或指示的肽洗脱30分钟。收集洗脱级分和珠用于 WB。图27B-将细胞裂解产物分成5个级分，并与抗SND1抗体加上缓冲液或指示的肽一起温育。在24小时后，将裂解产物与蛋白A/G珠一起温育，随后洗涤珠，随后为蛋白质印迹。

上文结果指示野生型MTDH肽可有效阻断MTDH-SND1相互作用。包含单一点突变W401A的肽使野生型肽的效力降低一半。还观察到插入单一点突变W394A或双重点突变对中断MTDH与SND1的相互作用没有作用。

实例5–保留MTDH-SND1相互作用的序列变化

MTDH-SND1复合物的高分辨率晶体结构揭示了异粘蛋白(MTDH) 的11个残基的肽基序用于结合含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)的延长蛋白质凹槽。在该界面处结合缺陷的MTDH和SND1突变体具有降低的癌症促进活性，这确定了该界面作为开发癌症治疗剂的新型靶的意义。在该界面处的肽基序及其衍生物是阻断这种相互作用的潜在抑制剂。为了探究保留SND1结合的在与SND1的界面处的MTDH肽的序列变化，对除W394和W401外的残基执行结构指导的突变分析，所述W394和W401是结合SND1中的两个明确限定的口袋的两个残基。突变无一对MTDH-SND1结合具有明显作用。这提供了在设计肽和肽模拟抑制剂方面很大的灵活性，并且允许在制备这种抑制剂中的灵活化学。

实验程序

蛋白质制备：使用标准的基于PCR的克隆策略生成所有构建体和点突变。简言之，将具有不同边界和突变型的SND1和MTDH克隆到 pQlink载体(Addgene)中，所述pQlink载体分别具有N端His8标签和 GST标签，在亲和标签后具有TEV切割位点。蛋白质在大肠杆菌菌株 DH5α中在23℃下过表达。SND1和SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407) 的表达和纯化遵循由先前出版物(Li等人，2008)修改的程序。

GST-介导的滴定下拉测定：经由GST标签将～20μg GST-MTDH (386-407，野生型和不同突变体)结合到10μl的谷胱甘肽树脂上。树脂用200μl测定缓冲液(25mM Tris,PH8.0、150mM NaCl、3mM DTT) 洗涤三次，以去除过量的未结合蛋白。将具有滴定浓度(10、3、1、0.5、0.25、0.12μM)的15μg His-SND1(16-339)以在具有2mg/ml BSA 的测定缓冲液中悬浮的500μl体积加入树脂中。在通过SDS-PAGE检查之前，混合物用500μl测定缓冲液洗涤两次，并通过考马斯蓝染色显现。

结果

保留SND1结合的MTDH的氨基酸序列变化：肽基序中的序列变化程度代表了在开发肽模拟抑制剂的化学中的灵活性水平。为了探索这种可能性，基于由MTDH-SND1复合物的高分辨率结构揭示的 MTDH-SND1相互作用模式，执行对在与SND1的界面处或附近的 MTDH残基的进一步突变分析。制备了对七个残基的新型突变，并且通过滴定下拉测定测量其与具有SN1/2结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸16-339)的His₆-SND1的结合亲和力(图28)。所有MTDH突变体均获得在野生型MTDH那种的0.7-1.3倍内的结合亲和力。W394和 W401不包括在该突变列表中，因为对这两个残基的突变较早显示对与 SND1的相互作用具有强烈的影响。预期对W394和W401的有限突变，例如替换为Tyr和Phe，保留对SND1的结合亲和力的小部分。对于保留SND1结合的这两个残基的突变存在很少的耐受。在此处和早期的突变研究收集的结果支持对MTDH的其他位点的突变保留SND1结合的一般很大的耐受。这在设计肽抑制剂和肽模拟抑制剂中提供了显著的灵活性。

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序列表

<110> 普林斯顿大学理事会

威斯康星旧生研究基金会

<120> 阻断异粘蛋白-SND1相互作用的肽作为癌症治疗的用途

<130> 31256/48166 PC

<150> US 62/016914

<151> 2014-06-25

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 582

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Arg Ser Trp Gln Asp Glu Leu Ala Gln Gln Ala Glu Glu

1 5 10 15

Gly Ser Ala Arg Leu Arg Glu Met Leu Ser Val Gly Leu Gly Phe Leu

20 25 30

Arg Thr Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Glu Pro Lys Arg Tyr Pro

35 40 45

Gly Trp Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu

50 55 60

Phe Leu Leu Gly Tyr Gly Trp Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ser Arg Lys

65 70 75 80

Lys Arg Arg Ser Pro Pro Arg Lys Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro

85 90 95

Ala Ala Ala Pro Asp Asp Leu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu

100 105 110

Glu Gln Lys Lys Lys Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Pro

115 120 125

Asn Gly Arg Thr Val Glu Val Ala Glu Gly Glu Ala Val Arg Thr Pro

130 135 140

Gln Ser Val Thr Ala Lys Gln Pro Pro Glu Ile Asp Lys Lys Asn Glu

145 150 155 160

Lys Ser Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Ser Asp Ala Lys Ala Val

165 170 175

Gln Asn Ser Ser Arg His Asp Gly Lys Glu Val Asp Glu Gly Ala Trp

180 185 190

Glu Thr Lys Ile Ser His Arg Glu Lys Arg Gln Gln Arg Lys Arg Asp

195 200 205

Lys Val Leu Thr Asp Ser Gly Ser Leu Asp Ser Thr Ile Pro Gly Ile

210 215 220

Glu Asn Thr Ile Thr Val Thr Thr Glu Gln Leu Thr Thr Ala Ser Phe

225 230 235 240

Pro Val Gly Ser Lys Lys Asn Lys Gly Asp Ser His Leu Asn Val Gln

245 250 255

Val Ser Asn Phe Lys Ser Gly Lys Gly Asp Ser Thr Leu Gln Val Ser

260 265 270

Ser Gly Leu Asn Glu Asn Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Trp Asn Glu

275 280 285

Lys Ser Val Lys Leu Ser Ser Gln Ile Ser Ala Gly Glu Glu Lys Trp

290 295 300

Asn Ser Val Ser Pro Ala Ser Ala Gly Lys Arg Lys Ala Glu Pro Ser

305 310 315 320

Ala Trp Ser Gln Asp Thr Gly Asp Ala Asn Thr Asn Gly Lys Asp Trp

325 330 335

Gly Arg Ser Trp Ser Asp Arg Ser Ile Phe Ser Gly Ile Gly Ser Thr

340 345 350

Ala Glu Pro Val Ser Gln Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Gln Trp Asp Val

355 360 365

Ser Arg Asn Gln Pro Tyr Ile Asp Asp Glu Trp Ser Gly Leu Asn Gly

370 375 380

Leu Ser Ser Ala Asp Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu

385 390 395 400

Trp Gly Asn Trp Val Asp Glu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Lys Ser Gln

405 410 415

Glu Pro Ile Pro Asp Asp Gln Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Glu Lys

420 425 430

Gly Glu Gly Ala Leu Pro Thr Gly Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

435 440 445

Lys Lys Lys Gln Gly Glu Asp Asn Ser Thr Ala Gln Asp Thr Glu Glu

450 455 460

Leu Glu Lys Glu Ile Arg Glu Asp Leu Pro Val Asn Thr Ser Lys Thr

465 470 475 480

Arg Pro Lys Gln Glu Lys Ala Phe Ser Leu Lys Thr Ile Ser Thr Ser

485 490 495

Asp Pro Ala Glu Val Leu Val Lys Asn Ser Gln Pro Ile Lys Thr Leu

500 505 510

Pro Pro Ala Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Ile Leu Ser Lys Ser Asp

515 520 525

Ser Asp Lys Ser Ser Ser Gln Val Pro Pro Ile Leu Gln Glu Thr Asp

530 535 540

Lys Ser Lys Ser Asn Thr Lys Gln Asn Ser Val Pro Pro Ser Gln Thr

545 550 555 560

Lys Ser Glu Thr Ser Trp Glu Ser Pro Lys Gln Ile Lys Lys Lys Lys

565 570 575

Lys Ala Arg Arg Glu Thr

580

<210> 2

<211> 910

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ala Gln Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Ala Val

1 5 10 15

Pro Thr Val Gln Arg Gly Ile Ile Lys Met Val Leu Ser Gly Cys Ala

20 25 30

Ile Ile Val Arg Gly Gln Pro Arg Gly Gly Pro Pro Pro Glu Arg Gln

35 40 45

Ile Asn Leu Ser Asn Ile Arg Ala Gly Asn Leu Ala Arg Arg Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Gln Pro Asp Ala Lys Asp Thr Pro Asp Glu Pro Trp Ala Phe

65 70 75 80

Pro Ala Arg Glu Phe Leu Arg Lys Lys Leu Ile Gly Lys Glu Val Cys

85 90 95

Phe Thr Ile Glu Asn Lys Thr Pro Gln Gly Arg Glu Tyr Gly Met Ile

100 105 110

Tyr Leu Gly Lys Asp Thr Asn Gly Glu Asn Ile Ala Glu Ser Leu Val

115 120 125

Ala Glu Gly Leu Ala Thr Arg Arg Glu Gly Met Arg Ala Asn Asn Pro

130 135 140

Glu Gln Asn Arg Leu Ser Glu Cys Glu Glu Gln Ala Lys Ala Ala Lys

145 150 155 160

Lys Gly Met Trp Ser Glu Gly Asn Gly Ser His Thr Ile Arg Asp Leu

165 170 175

Lys Tyr Thr Ile Glu Asn Pro Arg His Phe Val Asp Ser His His Gln

180 185 190

Lys Pro Val Asn Ala Ile Ile Glu His Val Arg Asp Gly Ser Val Val

195 200 205

Arg Ala Leu Leu Leu Pro Asp Tyr Tyr Leu Val Thr Val Met Leu Ser

210 215 220

Gly Ile Lys Cys Pro Thr Phe Arg Arg Glu Ala Asp Gly Ser Glu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Pro Phe Ala Ala Glu Ala Lys Phe Phe Thr Glu Ser Arg Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Asp Val Gln Ile Ile Leu Glu Ser Cys His Asn Gln Asn

260 265 270

Ile Leu Gly Thr Ile Leu His Pro Asn Gly Asn Ile Thr Glu Leu Leu

275 280 285

Leu Lys Glu Gly Phe Ala Arg Cys Val Asp Trp Ser Ile Ala Val Tyr

290 295 300

Thr Arg Gly Ala Glu Lys Leu Arg Ala Ala Glu Arg Phe Ala Lys Glu

305 310 315 320

Arg Arg Leu Arg Ile Trp Arg Asp Tyr Val Ala Pro Thr Ala Asn Leu

325 330 335

Asp Gln Lys Asp Lys Gln Phe Val Ala Lys Val Met Gln Val Leu Asn

340 345 350

Ala Asp Ala Ile Val Val Lys Leu Asn Ser Gly Asp Tyr Lys Thr Ile

355 360 365

His Leu Ser Ser Ile Arg Pro Pro Arg Leu Glu Gly Glu Asn Thr Gln

370 375 380

Asp Lys Asn Lys Lys Leu Arg Pro Leu Tyr Asp Ile Pro Tyr Met Phe

385 390 395 400

Glu Ala Arg Glu Phe Leu Arg Lys Lys Leu Ile Gly Lys Lys Val Asn

405 410 415

Val Thr Val Asp Tyr Ile Arg Pro Ala Ser Pro Ala Thr Glu Thr Val

420 425 430

Pro Ala Phe Ser Glu Arg Thr Cys Ala Thr Val Thr Ile Gly Gly Ile

435 440 445

Asn Ile Ala Glu Ala Leu Val Ser Lys Gly Leu Ala Thr Val Ile Arg

450 455 460

Tyr Arg Gln Asp Asp Asp Gln Arg Ser Ser His Tyr Asp Glu Leu Leu

465 470 475 480

Ala Ala Glu Ala Arg Ala Ile Lys Asn Gly Lys Gly Leu His Ser Lys

485 490 495

Lys Glu Val Pro Ile His Arg Val Ala Asp Ile Ser Gly Asp Thr Gln

500 505 510

Lys Ala Lys Gln Phe Leu Pro Phe Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ser Glu

515 520 525

Ala Val Val Glu Tyr Val Phe Ser Gly Ser Arg Leu Lys Leu Tyr Leu

530 535 540

Pro Lys Glu Thr Cys Leu Ile Thr Phe Leu Leu Ala Gly Ile Glu Cys

545 550 555 560

Pro Arg Gly Ala Arg Asn Leu Pro Gly Leu Val Gln Glu Gly Glu Pro

565 570 575

Phe Ser Glu Glu Ala Thr Leu Phe Thr Lys Glu Leu Val Leu Gln Arg

580 585 590

Glu Val Glu Val Glu Val Glu Ser Met Asp Lys Ala Gly Asn Phe Ile

595 600 605

Gly Trp Leu His Ile Asp Gly Ala Asn Leu Ser Val Leu Leu Val Glu

610 615 620

His Ala Leu Ser Lys Val His Phe Thr Ala Glu Arg Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Lys Ser Leu Leu Ser Ala Glu Glu Ala Ala Lys Gln Lys Lys Glu Lys

645 650 655

Val Trp Ala His Tyr Glu Glu Gln Pro Val Glu Glu Val Met Pro Val

660 665 670

Leu Glu Glu Lys Glu Arg Ser Ala Ser Tyr Lys Pro Val Phe Val Thr

675 680 685

Glu Ile Thr Asp Asp Leu His Phe Tyr Val Gln Asp Val Glu Thr Gly

690 695 700

Thr Gln Leu Glu Lys Leu Met Glu Asn Met Arg Asn Asp Ile Ala Ser

705 710 715 720

His Pro Pro Val Glu Gly Ser Tyr Ala Pro Arg Arg Gly Glu Phe Cys

725 730 735

Ile Ala Lys Phe Val Asp Gly Glu Trp Tyr Arg Ala Arg Val Glu Lys

740 745 750

Val Glu Ser Pro Ala Lys Ile His Val Phe Tyr Ile Asp Tyr Gly Asn

755 760 765

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770 775 780

Ser Thr Arg Val Leu Pro Ala Gln Ala Thr Glu Tyr Ala Phe Ala Phe

785 790 795 800

Ile Gln Val Pro Gln Asp Asp Asp Ala Arg Thr Asp Ala Val Asp Ser

805 810 815

Val Val Arg Asp Ile Gln Asn Thr Gln Cys Leu Leu Asn Val Glu His

820 825 830

Leu Ser Ala Gly Cys Pro His Val Thr Leu Gln Phe Ala Asp Ser Lys

835 840 845

Gly Asp Val Gly Leu Gly Leu Val Lys Glu Gly Leu Val Met Val Glu

850 855 860

Val Arg Lys Glu Lys Gln Phe Gln Lys Val Ile Thr Glu Tyr Leu Asn

865 870 875 880

Ala Gln Glu Ser Ala Lys Ser Ala Arg Leu Asn Leu Trp Arg Tyr Gly

885 890 895

Asp Phe Arg Ala Asp Asp Ala Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Arg

900 905 910

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(8)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 3

Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa

1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 4

Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu Trp Gly Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 6

ctgcaaaaca agcaccagag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 7

gttttcccag tcacgacgtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 8

gagaggaggt tttggggaag 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 9

cccatgtcta aaaagccaat c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 10

gagaggaggt tttggggaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 11

gttcatatgg tgccgtgcag 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 12

caagactctt cctcctgcta tctc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 13

cccattcatc agttccatag gttg 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 14

caaatgttgc ttgtctggtg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic primer

<400> 15

gtcagtcgag tgcacagttt 20

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu Trp Gly Asn Trp

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Pro Asn Ser Asp Ala Asn Ala Pro Ala Glu Glu Trp Gly Asn Trp

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu Ala Gly Asn Trp

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Pro Asn Ser Asp Ala Asn Ala Pro Ala Glu Glu Ala Gly Asn Trp

1 5 10 15

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Asp Trp Asn Ala Pro Glu Glu Trp Gly Asn

1 5 10

Claims

1.破坏异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)之间的相互作用的抑制剂在制备用于在患有癌症的受试者中减少肿瘤生长进展或抑制转移的药物中的用途，其中所述抑制剂是肽或包含与一般未识别为MTDH序列的部分的一种或多种多肽连接的所述肽的融合蛋白，其中所述肽包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或其变体，其中所述变体在选自D393、N395、A396、PAE397-399、E399、E400和N403的位置处具有一个或两个突变，其中这些氨基酸位置是基于SEQ ID NO:1，并且其中所述肽长11至22个氨基酸。

2.破坏MTDH和SND1之间的相互作用的抑制剂在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述抑制剂是肽或包含与一般未识别为MTDH序列的部分的一种或多种多肽连接的所述肽的融合蛋白，其中所述肽包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或其变体，其中所述变体在选自D393、N395、A396、PAE397-399、E399、E400和N403的位置处具有一个或两个突变，其中这些氨基酸位置是基于SEQ ID NO:1，并且其中所述肽长11至22个氨基酸。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述抑制剂结合在SEQ ID NO:2所示的SND1的残基16-339内的人SND1区域。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述抑制剂是肽。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述肽选自：i)在SEQ ID NO:1的残基364-582内的肽，ii)在SEQ ID NO:1的残基364-407内的肽，iii)包含SEQ ID NO:1的残基386-407的肽，iv)包含SEQ ID NO:1的残基393-403的肽，以及v)包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的变体，并且其中所述变体具有选自D393R、N395K、A396D、PAE397-399SQ、E399R、E400R和E400D/N403L的突变。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的残基386-407或其在SEQ ID NO:1的任何位置处包含至少一个突变的变体，其中所述变体肽保留W394和W401。

9.权利要求8的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的残基386-407的变体，其中所述变体在选自D389、A392、D393、N395、A396、PAE397-399、E399、E400、N403、W404、D406和E407的位置处包含一个或多个突变，并且其中这些氨基酸位置是基于SEQ ID NO:1。

10.权利要求9的用途，其中所述变体具有选自以下的突变：D389R、D393R、N395K、A396D、PAE397-399SQ、E399R、E400R、E400D/N403L、W404D、D406R和E407R。

11.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

12.根据权利要求3所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

13.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

14.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

15.根据权利要求6所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

16.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

17.根据权利要求8所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

18.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

19.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

20.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

21.根据权利要求3所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

22.根据权利要求4所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

23.根据权利要求5所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

24.根据权利要求6所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

25.根据权利要求7所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

26.根据权利要求8所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

27.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

28.根据权利要求10所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

29.根据权利要求11所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

30.根据权利要求12-19中任一项所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

31.根据权利要求4所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

32.根据权利要求5所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

33.根据权利要求6所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

34.根据权利要求7所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

35.根据权利要求8所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

36.根据权利要求9所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

37.根据权利要求10所述的用途，其中所述肽是融合蛋白的部分。

38.根据权利要求31-37中任一项所述的用途，其中所述肽融合至Fc结构域。

39.一种包含抑制剂和药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，所述抑制剂破坏异粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)之间的相互作用，其中所述抑制剂是肽或包含与一般未识别为MTDH序列的部分的一种或多种多肽连接的所述肽的融合蛋白，其中所述肽包含DWNAPAEEWGN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或其变体，其中所述变体在选自D393、N395、A396、PAE397-399、E399、E400和N403的位置处具有一个或两个突变，其中这些氨基酸位置是基于SEQ ID NO:1，并且其中所述肽长11至22个氨基酸。

40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述抑制剂结合在SEQ ID NO:2所示的SND1的残基16-339内的人SND1区域。

41.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述肽选自：i)在SEQ ID NO:1的残基364-582内的肽，ii)在SEQ ID NO:1的残基364-407内的肽，iii)包含SEQ ID NO:1的残基386-407的肽，iv)包含SEQ ID NO:1的残基393-403的肽，以及v)包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽。

42.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述肽选自：i)在SEQ ID NO:1的残基364-582内的肽，ii)在SEQ ID NO:1的残基364-407内的肽，iii)包含SEQ ID NO:1的残基386-407的肽，iv)包含SEQ ID NO:1的残基393-403的肽，以及v)包含SEQ ID NO:1的残基390-403的肽。

43.根据权利要求39-42中任一项所述的药物组合物，其中所述肽是融合蛋白的部分。

44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述肽融合至Fc结构域。

45.根据权利要求39-42中任一项所述的药物组合物，其中所述肽缀合至细胞穿透肽或与细胞穿透肽混合。

46.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述肽缀合至细胞穿透肽或与细胞穿透肽混合。

47.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述肽缀合至细胞穿透肽或与细胞穿透肽混合。

48.根据权利要求39或40所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

49.根据权利要求39或40所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的变体，并且其中所述变体具有选自D393R、N395K、A396D、PAE397-399SQ、E399R、E400R和E400D/N403L的突变。

50.根据权利要求39或40所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的残基386-407或其在SEQ ID NO:1的任何位置处包含至少一个突变的变体，其中所述变体肽保留W394和W401。

51.权利要求50所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的残基386-407的变体，其中所述变体在选自D389、A392、D393、N395、A396、PAE397-399、E399、E400、N403、W404、D406和E407的位置处包含一个或多个突变，并且其中这些氨基酸位置是基于SEQ ID NO:1。

52.权利要求51所述的药物组合物，其中所述变体具有选自以下的突变：D389R、D393R、N395K、A396D、PAE397-399SQ、E399R、E400R、E400D/N403L、W404D、D406R和E407R。

53.根据权利要求39-52中任一项所述的药物组合物在制备用于在患有癌症的受试者中减少肿瘤生长进展或抑制转移或用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。