ES2310469B1 - Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones. - Google Patents
Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de los compuestos inhibidores de la
actividad de
Snail1 en la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de
diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicaciones.
Snail1 en la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de
diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicaciones.
La presente describe que el gen Snail1 transduce
la señalización mediada por el receptor FGFR3 responsable de
condrodisplasias (acondodroplasia (ACH), displasia tanatofórica
(TD) e hipocondroplasia (HCH)), habiéndose demostrado que la simple
activación aberrante de Snail1 es suficiente para reproducir un
fenotipo de condrodisplasia. Igualmente, mediante experimentos de
RNA de interferencia (siRNA) sobre cultivos primarios se demostró
que al impedir la función de Snail1 se impide la señalización
asediada por el FGFR3 en condrocitos. Esto permite identificar a
Snail1 como una diana terapéutica y diagnóstico de
condrodisplasias, así como el uso de sus inhibidores como fármacos
para el tratamiento de dicha enfermedad.
Description
Uso de los compuestos inhibidores de la
actividad de Snail1 en la elaboración de composiciones
farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias,
procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas
composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de
condrodisplasias y sus aplicaciones.
La presente invención se enmarca en el campo de
la biomedicina, y más concretamente en la aplicación de
herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y tratamiento de
enfermedades humanas, y más concretamente de las condrodisplasias
relacionadas con el receptor 3 del factor de crecimiento
fibroblástico (acondrodisplasias (ACH), displasias tanatofóricas
(TD) e hipocondrodisplasias (HCH), en adelante denominadas
genéricamente como condrodisplasias).
El esqueleto está formado por el cartílago y el
hueso. El cartílago, a su vez, está formado por los condrocitos,
mientras que el hueso está formado por los osteoblastos y los
osteoclastos. Los condrocitos y los osteoblastos tienen origen
mesenquimático, mientras que los osteoclastos provienen del linaje
hematopoyético.
Los condrocitos tienen un papel primordial en la
formación de la mayoría de los componentes esqueléticos. Además de
su papel durante la osteogénesis, los condrocitos situados en la
placa de crecimiento controlan el crecimiento longitudinal de los
huesos. En el interior de las condensaciones mesenquimáticas, se
van diferenciando gradualmente, desde condrocitos proliferativos,
hasta llegar a su estadio de diferenciación final, los condrocitos
hipertróficos. Esta población celular es rodeada gradualmente por
matriz extracelular calcificada, que favorece la invasión de vasos
sanguíneos provenientes del pericondrio. Es entonces cuando las
células del pericondrio empiezan a diferenciarse a osteoblastos, y
a formar la estructura mineralizada denominada collar óseo
(Caplan, 1987 y St-Jacques y cols., 1999).
Después de la invasión vascular, los condrocitos
hipertróficos mueren por apoptosis y los osteoblastos empiezan a
depositar la matriz extracelular ósea, consistente principalmente
en colágeno tipo I. Los condrocitos se ven restringidos a la placa
de crecimiento, donde junto con los osteoblastos, dirigirán el
crecimiento longitudinal del hueso.
En la placa de crecimiento, los miembros de la
familia FGF y sus receptores, principalmente el receptor 3 (FGFR3),
regulan la proliferación e inhiben el crecimiento del hueso
(Karsenty y Wagner, 2002). FGFR3 se expresa en los condrocitos
proliferativos. Mutaciones de ganancia de función del Fgfr3 causan
hipocondroplasia, acondroplasia y displasia tanatofórica, la
variante más severa de la acondroplasia (Horton, 1997 y Heuertz y
cols., 2006). La hipocondroplasia (HCH, OMIM 146000) es la forma
más leve de este tipo de enanismos, causada en un 65% de los casos
por la mutación N540K, en el dominio tirosina kinasa 1 del
receptor (Winterpacht y cols., 2000; Bellus y cols., 1995 y Prinos
y cols., 1995). La acondroplasia (ACH, OMIM 100800), debida en el
98% de los casos a la mutación G680R, en el dominio transmembrana
del receptor, es la condrodisplasia más común en humanos (Naski y
cols., 1998; Yamanaka y cols., 2003 y Wang y cols., 1999). La
displasia tanatofórica presenta un fenotipo letal y se han descrito
dos variedades según diagnóstico radiológico: de tipo I (TD I, OMIM
187600; Chen y cols., 1999 y 2001 y Legeai-Mallet y
cols., 1998), y de tipo II (TD II, OMIM 187601; Iwata y cols., 2000
y 2001 y Li y cols., 1999). En todos los casos, el fenotipo de
acortamiento de los huesos largos es debido a una desorganización y
acortamiento de las columnas de condrocitos proliferativos,
provocados por problemas en proliferación, y a la consecuente
reducción de la zona de condrocitos hipertróficos, tanto en modelos
animales como en humanos. Por el contrario, la inactivación de
Fgfr3 en ratón, causa un crecimiento endocondral prolongado,
con el resultado de un fenotipo de "huesos largos", que va
acompañado de una extensión de la zona de condrocitos
proliferativos en la placa de crecimiento (Deng y cols., 1996 y
Colvin y cols., 1996). Todos estos datos dan al FGFR3 un importante
papel como regulador negativo de la proliferación de los
condrocitos. Este papel inhibidor de la proliferación por parte de
la vía FGF es único de los condrocitos (Wang y cols., 2001), y está
mediado por el factor de transcripción STAT1, que aumenta la
expresión del inhibidor del ciclo celular p21, responsable final de
la parada de proliferación inducida por esta vía de señalización.
Sus niveles pueden considerarse reflejo de la activación de la vía
de señalización mediada por el FGFR3 en la placa de
crecimiento.
Cuando se clonó Snail de ratón (Nieto y cols.,
1992) se observó que en día 12 del desarrollo embrionario del
ratón, el sitio predominante de expresión de Snail era el
pre-cartílago, incluyendo los correspondientes al
esclerotomo de la cola, las pre-vértebras, las
costillas, las extremidades y la cabeza. Sin embargo, a partir del
día 14 de desarrollo, ya no hay expresión en el
pre-cartílago en ninguno de estos sitios, excepto
en las falanges distales de las extremidades posteriores, que son
los únicos sitios en que sigue habiendo
pre-cartílago en las patas a este estadio.
Recientemente se ha descrito a Snail1 como un
represor directo del colágeno tipo II (Seki y cols., 2003),
característico de condrocitos proliferativos, y que desaparece
cuando éstos dejan de proliferar y diferencian a condrocitos
hipertróficos, población celular que expresa colágeno tipo X. En un
contexto completamente independiente, se observó que la presencia
de Snail atenuaba la proliferación de células epiteliales en
cultivo y cursaba con un aumento en los niveles de p21 (Vega y
cols., 2004).
\newpage
En resumen, las condrodisplasias humanas (que
cursan con retardo e irregularidad en la formación del cartílago)
y los modelos murinos generados para su estudio, se han asociado
con mutaciones que generan mayor actividad del FGFR3, que provoca
una parada de la proliferación de las poblaciones condrocíticas
patológica, impidiendo el correcto desarrollo óseo del
individuo.
Las aproximaciones terapeúticas para estas
condrodisplasias en humanos son varias. Una quirúrgica, muy
invasiva y de larga duración (Noonan y cols., 1999), el tratamiento
con hormona de crecimiento (Hertel y cols., 2005; Seino y cols.,
2000) que resulta poco efectivo en la acondroplasia, agrava la
desproporción entre el tronco y las extremidades y es muy costoso y
la utilización del péptido natiurético CNP, inhibidor de la
activación de las MAPKs mediada por los FGFs en la placa de
crecimiento (Yasoda y cols., 2004) pero no rescata los defectos de
proliferación de los
condrocitos.
condrocitos.
Otras estrategias persiguen disminuir la
actividad tirosina kinasa del receptor con agentes químicos o
bloquear con anticuerpos la unión del ligando al FGFR3 (Aveizer y
cols., 2003).
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación de un proceso de
condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un
proceso de condrodisplasia de la invención, basado en la
identificación de la presencia de Snail1 en una muestra biológica y
que comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en
una muestra biológica de origen óseo, y
b) comparación de la presencia de Snail1
observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su
presencia es indicativa de la existencia de condrodisplasia.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación y evaluación de la
actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1 útiles
para el tratamiento de la condrodisplasia, en adelante
procedimiento de identificación de compuestos de la presente
invención, que comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico
donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia
con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e
incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del
proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de
la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una
disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la invención lo constituye un
sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de
identificación de compuestos de la presente invención,
preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero,
y más preferentemente un primate no humano, donde la expresión de
la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada,
y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización
particular de dicho animal mamífero no humano de la presente
invención lo constituye el ratón transgénico desarrollado en la
invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo
2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la
actividad de la proteína Snail1, en adelante uso de un compuesto
inhibidor de la presente invención, en la elaboración de un
medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de
un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o
veterinario.
Por tanto, otro objeto particular de la
invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de Snail1
en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o
polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen
codificante de la proteína Snail1 humana y que incluye una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA)
específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la
proteína Snail1.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para
el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante
composición farmacéutica de la presente invención, que comprende
una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente
inhibidor de la proteína Snail1, junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso
de la composición farmacéutica de la presente invención,
consistente en la administración de dicha composición terapéutica
que inhibe el proceso de condrodisplasia.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que el gen Snail1 transduce la
señalización mediada por el receptor 3 de los FGF (FGFR3)
responsable de condrodisplasias. Para determinar si el gen Snail1
puede ser responsable de esta vía de señalización, se estudiaron
sus patrones de expresión relativos durante el desarrollo
embrionario en ratones, cuando ocurren los distintos procesos en
los que están implicados durante la formación del hueso maduro en
ratones sanos (Ejemplo 1). Los datos muestran que los patrones de
expresión son coincidentes en estadios embrionarios ya que el pico
de expresión de Snail1 aparece en la población celular que expresa
FGFR3. Estos datos son compatibles con que FGFR3 induce la
expresión del gen de la Snail1 in vivo.
Además, se estudiaron los efectos de la
activación patológica de Snail1 en el desarrollo óseo en ratones
transgénicos con expresión inducible del gen Snail1 (Ejemplo 2). De
esta forma se ha relacionado directamente la presencia de Snail1 con
la parada de proliferación de condrocitos en ratones transgénicos
en los que se ha activado Snail1 de manera artificial (ratón
transgénico de la presente invención, ratón
transgSnail1-ER), y al mismo tiempo se ha
demostrado que la simple activación aberrante de Snail1 es
suficiente para reproducir un fenotipo de condrodisplasia. El
desarrollo y caracterización de este modelo animal, ratón
transgSnail1-ER, permite la disponibilidad de
modelos animales -este proceso de transgénesis puede ser trasladado
por cualquier experto al desarrollo de otros animales mamíferos
incluido primates, no humanos- en los que se pueden testar y
caracterizar compuestos terapéuticos para el tratamiento de
procesos condrodisplásicos veterinarios o humanos, y que hasta la
fecha no existían.
Así, se observó que Snail1 reprime la
proliferación celular in vivo, lo cual induce defectos
morfológicos en la placa de crecimiento de estos huesos (huesos más
cortos). Estos cambios aquí descritos son reminiscentes de los
observados tras la inducción experimental de condrodisplasia en
ratones modificados genéticamente que expresaban versiones mutadas
de FGFR3 que suponen su activación constitutiva (Chen y cols.,
1999; Li y cols., 1999; Wang y cols.,
1999).
1999).
Igualmente, se ha relacionado a Snail1 con la
vía de señalización del FGFR3 mediante experimentos in vitro
en cultivos primarios de condrocitos hipertróficos obtenidos a
partir de hueso embrionario de ratón más tardíos, demostrando que
la señalización mediada por el FGFR3 activa la expresión de Snail1
(Ejemplo 3).
Por otro lado, en muestras de pacientes con
condrodisplasia, se estudió la activación del gen Snail1 (Ejemplo
4). En este sentido, en un no-nato con displasia
tanatofórica se confirmó la mutación en FGFR3 responsable de esta
enfermedad (forma grave de condrodisplasia y de curso siempre
letal). Se observó que esta mutación en FGFR3, que produce su
actividad constitutiva, provoca una activación aberrante del gen
Snail1.
Finalmente, los experimentos de RNA de
interferencia ("small interference", siRNA) realizados en
cultivos primarios procedentes de hueso fetal de ratón, demostraron
que impedir la función de Snail1 es suficiente para impedir la
señalización mediada por el FGFR3 en condrocitos, revertiendo la
parada de ciclo celular (medida por la expresión de p21), incluso
en presencia del FGFR3 constitutivamente activo (Ejemplo 3). Por
tanto Snail1 es el mediador de la parada de proliferación que se
produce en respuesta a la señalización de FGFR3. Estos
polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de
terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento
se permita la integración de los mismos en las células de un
paciente humano.
Si la sola actividad de Snail en el cartílago
embrionario es capaz de inducir parada de ciclo celular y
acondroplasia, la presencia de Snail1 en etapas donde normalmente
está reprimido podría considerarse un marcador del fenotipo
acondroplásico del tipo de las asociadas al FGFR3 -
acondrodroplasia (ACH), displasia tanatofórica (TD) e
hipocondroplasia (HCH) - y, por tanto, utilizar su expresión
aberrante como diagnóstico de cualquier fenotipo provocado por la
ganancia de función del FGFR3. Por otro lado, si la activación de
Snail1 es suficiente para inducir todas las características de las
acondroplasias relacionadas con mutaciones que generan un aumento
de actividad del FGFR3, es decir, que existe una relación directa
-no sólo una asociación temporal- entre la actividad del gen Snail1
y la etiopatogenia de esta enfermedad, su inhibición, por ejemplo
su inhibición génica, se convertiría en una forma de terapia
anti-displásica y Snail1 podría ser de gran
utilidad en la identificación de nuevos fármacos
anti-condrodisplásicos. Estas aproximaciones
terapéuticas se basan en el uso de compuestos o agentes inhibidores
de la actividad de dicha proteína Snail1. De hecho, podrían
aparecer casos de condrodisplasia de este tipo aun en ausencia de
mutaciones en el FGFR3 y por la sola activación patológica de
Snail1 durante el desarrollo del sistema
cartílago-hueso.
\newpage
La presencia aberrante de Snail1 en el cartílago
embrionario (en un momento en el cual, en condiciones normales, ya
no ocurre) induce acondroplasia, de forma independiente de la señal
que haya inducido esta presencia patológica de Snail1. La
inhibición de Snail1 por siRNA impide la parada de la proliferación
de condrocitos aún en presencia de actividad constitutiva de FGFR3.
Por lo tanto, la inhibición de Snail1 en la placa de crecimiento
impedirá los efectos de la ganancia de función del FGFR3 inducidos
por cualquier mecanismo o las acondroplasias generadas por la
presencia aberrante de Snail1 independientes el FGFR3.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
lo constituye un procedimiento de identificación de un proceso de
condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un
proceso de condrodisplasia de la invención, basado en la
identificación de la presencia de Snail1 en una muestra biológica y
que comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en
una muestra biológica de origen óseo, y
b) comparación de la presencia de Snail1
observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su
presencia es indicativa de la existencia de condrodisplasia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "proceso de condrodisplasia" se refiere a una
enfermedad con fenotipo condrodisplásico, preferentemente humana,
en la que la acción biológica de Snail1 sea la causa de dicha
enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 -
como por ejemplo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia
displásica(TD) e hipocondroplasia (HCH) - o no. Esta
identificación de Snail1 en una muestra biológica de origen
veterinario o médico de animales o sujetos humanos puede ser
extraída de los mismos y posteriormente ex vivo identificar
sobre la misma la presencia o no Snail1, que se correlacionaría con
el diagnóstico de un proceso condrodisplásico en dicho sujeto, lo
que permitiría la definición y la ejecución de una aproximación
terapéutica, veterinaria o médica.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "gen Snail1" o "proteína Snail1" se refiere tanto
al gen o proteína, de distinto origen animal, preferentemente
humano, Snail1 (por ejemplo, Snail1 de ratón: SEQ ID NO1 y NO2, o
humano: SEQ ID NO3, NO4, respectivamente) como al gen o proteína
Snail2 (por ejemplo, Snail1 de ratón: SEQ ID NO5 y NO6, o humano:
SEQ ID NO7, NO8, respectivamente), así como a cualquier secuencia
de nucleótidos o de aminoácidos (aás.) análoga a éstas,
respectivamente. En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en
base a las secuencias de nucleótidos o aminoácidos mostradas en la
presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de
sustituciones de nucleótidos o aminoácidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos o
aminoácidos, la adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos en
cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o
más nucleótidos o aminoácidos en cualquier extremo o en el interior
de la secuencia, y que constituya una secuencia codificante o
péptido con actividad similar a la secuencia de Snail1 de la
invención, es decir, sea capaz de inducir condrodisplasia. Ambas
proteínas Snail, Snail1 y Snail2, presentan una actividad biológica
similar en los distintos modelos estudiados (cáncer, fibrosis
peritoneal y fibrosis renal) por lo que los resultados obtenidos en
la presente invención sobre Snail1 pueden ser trasladados a
Snail2.
En general, una secuencia de nucleótidos o de
aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de
aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en
esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga"
significa que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos en
cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%,
preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de identificación de la invención en el
que la identificación de Snail1 de a) se refiere a la forma humana
de Snail1 (hSnail1 y/o h/Snail2, ya sea la identificación en forma
de un transcrito génico (RNAm) o de la forma proteica del gen; SEQ
ID NO 3 y 4 y SEQ ID NO 7 y 8). La realización de estos análisis de
identificación de los niveles de expresión de Snail1 puede ser
llevado a cabo por un experto medio del área de la biomedicina
gracias a la información descrita en la presente invención y en el
estado de la técnica por distintas técnicas (Sambrook y cols.,
1989; Lambolez y Rossier, 2000; Egger y cols., 2000; Folz y
Nepluev, 2000 y Pfaffl, 2001).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de identificación de un proceso de
condrodisplasia en el que la identificación de Snail1, ya sea
hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos
específicos de la proteína Snail1, preferentemente hSnail1 y/o
hSnail2. (Franci y cols., 2006). Los anticuerpos pueden ser
monoclonales o policlonales.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de identificación de un proceso de
condrodisplasia en el que la identificación de Snail1 se lleva a
cabo mediante hibridación in situ con un precursor de Snail1
(ver Figura 1).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de identificación de un proceso de
condrodisplasia en el que la identificación de Snail1 se lleva a
cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de
Snail1 (Ejemplo 3, Figura 4). Este procedimiento está basado en la
extracción de RNA polyA+ de una muestra biológica de origen óseo y
de un tejido control y la amplificación de la secuencia codificante
de Snail1 con adecuados oligonucleótidos cebadores (Boutet y cols.,
2006).
Por otro lado, este procedimiento de diagnóstico
de condrodisplasia puede realizarse utilizándose a Snail1 como
único marcador o de forma conjunta con otros marcadores de
condrodisplasia, por ejemplo formando parte de un microarray de
expresión biológica, ya sea en forma génica - a partir de RNAm- o
en forma de proteína.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación y evaluación de la
actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1 útiles
para el tratamiento de la condrodisplasia, en adelante
procedimiento de identificación de compuestos de la presente
invención, que comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico
donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia
con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e
incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del
proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de
la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una
disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de identificación de compuestos de
la invención donde el sistema biológico del punto a) es un animal
transgénico donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible,
de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca
condrodisplasia. Una realización particular del procedimiento de
identificación de compuestos de la presente invención es aquella
donde el animal transgénico es el ratón transgénico de la presente
invención (Ejemplo 2, ratón transgSnail1-ER).
Otro objeto de la invención lo constituye un
sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de
identificación de compuestos de la presente invención,
preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero,
y más preferentemente un primate no humano, donde la expresión de
la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada,
y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización
particular de dicho animal mamífero no humano de la presente
invención lo constituye el ratón transgénico desarrollado en la
invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo
2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la
actividad de la proteína Snail1, en adelante uso de un compuesto
inhibidor de la presente invención, en la elaboración de un
medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de
un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o
veterinario.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere
a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína
Snail1 (por ejemplo, SEQ ID NO2, SEQ ID NO4, SEQ ID NO6 y SEQ ID
NO8), o con fragmentos funcionales de la misma, disminuye o elimina
la intensidad o la duración de la actividad biológica de dicha
proteína. En esta definición se incluye además aquellos compuestos
que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante de la
proteína Snail (por ejemplo, SEQ ID NO1, SEQ ID NO3, SEQ ID NO5 y
SEQ ID NO7), es decir, que impiden o diminuyen la transcripción del
gen, la maduración del RNAm, la traducción del RNAm y la
modificación post-traduccional. Un agente inhibidor
puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido
nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un
compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o
elimine el efecto y/o la función de la proteína Snail1.
A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede
ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos
antisentido específica de la secuencia del gen o del mRNA de la
proteína Snail1, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima
específica del mRNA de la proteína Snail1, o bien un polinucleótido
que codifica un aptámero específico del mRNA de la proteína
Snail1, bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia
("small interference RNA" o siRNA o un shRNA) específico del
mRNA de la proteína Snail1 o bien un microRNA (miRNA).
Estos polinucleótidos mencionados pueden ser
utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante
cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los
mismos en las células de un paciente humano. Este objetivo puede
conseguirse mediante la administración a estas células óseas o de
cartílago de una construcción génica que comprende uno de los
polinucleótidos mencionados con el fin de transformar dichas
células permitiendo su expresión en el interior de las mismas de
manera que se inhiba la expresión de la proteína Snail.
Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida
dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o
un vector de transferencia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el
proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción
génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo
la vehiculación de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos
vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales (Pfeifer
y Verma, 2001) y su administración puede ser preparada por un
experto en la materia en función de las necesidades y
especificidades de cada caso.
Por tanto, otro objeto particular de la
invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de Snail1
en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o
polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen
codificante de la proteína Snail1 humana y que incluye una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA)
específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la
proteína Snail1.
Con anterioridad se han descrito e incluso
protegido mediante patente oligonucleótidos antisentido
(Patente
US20060003956; Kajita y cols., 2004) y siRNAs que inhiben la expresión de Snail1 (Peinado y cols., 2005; Tripathi y cols., 2005). Cualquiera de estas secuencias de nucleótidos descritas en el estado del arte como inhibidoras de la expresión de Snail1 se incorporan como realizaciones de la presente invención como potenciales compuestos terapéuticos útiles para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de un proceso condrodisplásico. Por otro lado, estas técnicas de inhibición génica, y más concretamente la vehiculización de los compuestos -oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptámeros- puede llevarse a cabo mediante el uso de liposomas, nanopartículas u otros vehiculizantes que incrementan el éxito de dicha transferencia al interior de la célula, preferentemente al núcleo celular (Lu y Woodle, 2005; Hawker y Wooley, 2005). En principio, pueden utilizarse inhibidores de la traducción del RNAm de Snail1 que se unen tanto a su región codificante como a la no codificante, por ejemplo frente a la zona 3' no codificante.
US20060003956; Kajita y cols., 2004) y siRNAs que inhiben la expresión de Snail1 (Peinado y cols., 2005; Tripathi y cols., 2005). Cualquiera de estas secuencias de nucleótidos descritas en el estado del arte como inhibidoras de la expresión de Snail1 se incorporan como realizaciones de la presente invención como potenciales compuestos terapéuticos útiles para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de un proceso condrodisplásico. Por otro lado, estas técnicas de inhibición génica, y más concretamente la vehiculización de los compuestos -oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptámeros- puede llevarse a cabo mediante el uso de liposomas, nanopartículas u otros vehiculizantes que incrementan el éxito de dicha transferencia al interior de la célula, preferentemente al núcleo celular (Lu y Woodle, 2005; Hawker y Wooley, 2005). En principio, pueden utilizarse inhibidores de la traducción del RNAm de Snail1 que se unen tanto a su región codificante como a la no codificante, por ejemplo frente a la zona 3' no codificante.
Así, una realización particular de la invención
lo constituye el uso de un siRNA de d) en el que el RNAi se une
preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail
gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda
a ésta o a un fragmento más corto de la misma (Patente
US20060003956; el uso de los siRNA descritos en esta patente
americana se incorporan como realizaciones particulares dentro del
alcance de la presente patente).
Otra realización particular de la invención lo
constituye el uso de un RNAi de d) en el que el siRNA está
constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una
mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- -
- I : 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
- -
- II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
- -
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
Las parejas I y II se unen a la región
codificante del RNAm de Snail1, mientras que la pareja III se une a
la zona 3' no codificante). Las tres parejas de secuencias de siRNA
que se indican fueron activas, siendo la imagen presentada de
inhibición de los niveles de Snail1 y p21 representativa de los
resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs
(Figura 4h y 4j) ya sea por separado o en combinación.
Las secuencias de nucleótidos
a)-e) mencionadas previamente impiden la expresión
del gen en mRNA o del mRNA en la proteína Snail1, y, por tanto,
anulan su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un
experto en el sector de ingeniería genética en función del
conocimiento existente en el estado del arte sobre transgénesis y
anulación de la expresión génica (Clarke, 2002; Patente
US20020128220; Miyake y cols., 2000; Puerta-Ferández
y cols., 2003; Kikuchi y cols., 2003; Reynolds y cols., 2004).
Por otro lado, el origen de estos compuestos
inhibidores de la actividad de las proteínas Snail puede ser
variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo,
de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos
eucariotas) o sintético.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para
el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante
composición farmacéutica de la presente invención, que comprende
una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente
inhibidor de la proteína Snail1, junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye una composición farmacéutica en la que el
compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que
impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína
Snail1 humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la
proteína Snail1.
Otra realización particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el
inhibidor de Snail1 es un siRNA que se une preferentemente a la
secuencia fragmento del RNAm de Snail1 gatgcacatccgaagccac (SEQ ID
NO21) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más
corto de la misma (Patente US20060003956; el uso de los siRNA
descritos en esta patente americana se incorporan como
realizaciones particulares dentro del alcance de la presente
patente).
Otra realización particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el
inhibidor de Snail es un RNAi constituido por una pareja de
secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas,
perteneciente al siguiente grupo:
- -
- I : 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
- -
- II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
- -
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia
y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto inhibidor de la actividad de la
proteína Snail1, calculada para producir el efecto deseado y, en
general, vendrá determinada, entre otras causas, por las
características propias de los compuestos, incluyendo la edad,
estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y
de la ruta y frecuencia de administración.
En una realización particular, dicha composición
terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión
acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición
terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada
por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha
composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía
de administración elegida. En una realización particular, la
administración de la composición terapéutica proporcionada por esta
invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía
intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas
formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los
excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede
encontrarse, por ejemplo, en Faulí i Trillo, 1993.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso
de la composición farmacéutica de la presente invención,
consistente en la administración de dicha composición terapéutica
que inhibe el proceso de condrodisplasia.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
el que el proceso de condrodisplasia causado por la acción
biológica de Snail1, se acompaña de una activación anómala del
FGFR3, perteneciente a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, al siguiente grupo: acondrodroplasia
(ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
Finalmente, otro objeto particular de la
invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la
invención en el que el proceso de condrodisplasia causado por la
acción biológica de Snail1 no se acompaña de una activación anómala
del FGFR3.
Figura 1.- Snail1 se expresa durante el
desarrollo embrionario del hueso en las poblaciones implicadas en
el crecimiento longitudinal del mismo. Imágenes de secciones
de huesos embrionarios en las que se ha detectado la presencia del
RNAm de Snail1 de ratón mediante la técnica de hibridación in
situ. En los paneles superiores (a-d) se
muestra la expresión endógena del gen durante el desarrollo,
primero en las condensaciones mesenquimáticas y posteriormente
reducido a las poblaciones de condrocitos hipertróficos. En los
paneles inferiores (e-i) se compara su patrón de
expresión con el de moléculas marcadoras de poblaciones celulares,
observando que Snail1 se expresa en el estadio de 18,5 días
post-coito (dpc) en las poblaciones hipertróficas,
el pericondrio y en los osteoblastos. (j, k) detalle de la placa de
crecimiento de embriones de 18,5 dpc mostrando la expresión de
Snail1 y de FGFR3. En esta y en las siguientes figuras, wt, ratón
salvaje; tg, ratón transgénico con activación inducible de Snail1;
-TAM, sin tamoxifeno; +TAM, con tamoxifeno.
\newpage
Figura 2.- Los huesos largos de los embriones
que expresan Snail1 transgénico son más cortos.
(a-d) tinción cartílago-hueso en la
que se observa una reducción en la zona de cartílago (azul) a costa
de las poblaciones de la placa de crecimiento en los huesos de los
animales con activación de Snail1 inducida por la administración de
Tamoxifeno. (e-h) secciones histológicas en las que
se muestra que el acortamiento anteriormente descrito es a costa de
poblaciones de condrocitos proliferativos.
Figura 3.- La presencia de Snail1 en la placa
de crecimiento inhibe la proliferación celular.
(a-d) inmunohistoquímica frente a PH3 para marcar
células proliferando, dónde se puede observar una drástica
disminución del número de células proliferativas en los ratones con
expresión inducida de Snail1. (e-h) en estos mismos
ratones, la inmunohistoquímica frente a STAT1 revela un aumento en
su activación (presencia nuclear de la proteína), que viene
acompañado de un aumento en los niveles de RNAm de p21 (m). También
se puede observar un detalle de la co-expresión
endógena de STAT1 y Snail1 en condiciones normales en el hueso de
ratón (i-1).
Figura 4.- Snail1 es suficiente y necesario
para la señalización del FGFR3 en el hueso. La activación de
FGFR3 en cultivos primarios de condrocitos (a-d) de
ratón induce la activación de Snail1 valorada mediante sus niveles
de RNAm (e), que va acompañada de la activación de p21 (g). Este
efecto se ve impedido por el tratamiento de dichos cultivos con
siRNA de Snail1 (h y j). Mock, cultivos primarios transfectados con
el vector vacío; wt, cultivos primarios transfectados con el FGFR3
humano normal; K644E, cultivos primarios transfectados con el FGFR3
humano con la mutación K644E, responsable de la mayoría de las
displasias tanatofóricas humanas.
Figura 5.- La mutación del FGFR3 responsable
de la displasia tanatofórica en humanos activa la expresión de
Snail1. Los niveles de RNAm de Snail1 están aumentados en
cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave de
la acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del
FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético
(a). El feto tanatóforo presenta la mutación descrita como
constitutivamente activa de dicho receptor (b). N, muestra obtenida
de un feto sin problemas óseos; T, muestra obtenida de un feto con
displasia tanatofórica.
Se procedió a la detección de la presencia del
RNAm de Snail1 en huesos embrionarios de ratón mediante la técnica
de hibridación in situ. Los embriones de ratón procedieron
de la cepa C57xCBA y sus edades, establecidas en días
post-coitum (dpc) se determinaron considerando el
día en el cual se ve el tapón vaginal como el día 0,5. Los huesos
se disecaron a estadios comprendidos entre 12,5 dpc y 18,5 dpc
respectivamente, se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS/DEPC
toda la noche. A continuación se embebieron en gelatina y cortaron
con un vibratomo para obtener secciones de 50 \mum. Las ISH en
secciones de gelatina se realizaron como se describe en Blanco y
cols., 2002 utilizando las sondas de RNA marcadas con
DIG-II-UTP. Después de la
hibridación, las secciones se procesaron como se ha descrito en
Cano y cols., 2000.
Así, se demostró que la expresión endógena del
gen Snail1 tiene lugar durante el desarrollo, primero en las
condensaciones mesenquimáticas y posteriormente reducido a las
poblaciones de condrocitos hipertróficos, el pericondrio y en los
osteoblastos (Figura 1).
Se utilizó el plásmido
pcDNA3-Snail1 correspondiente a la secuencia
completa del cDNA de Snail1 de ratón insertada en el
plásmido pcDNA3 (Invitrogen; Cano y cols., 2000).
pcDNA3-Snail-ER corresponde a la
secuencia codificante de Snail1 unida a una versión mutada del
dominio de unión al agonista del receptor de estrógeno humano que
reconoce el ligando sintético
4-OH-Tamoxifeno (Locascio y cols.,
2002).
El transgén Snail1-ER fue
diseñado como fue descrito anteriormente (Locascio y cols., 2002) y
se generó un ratón transgénico (ratón
transgSnail1-ER) para esta construcción según los
procedimientos estándares (Hogan y cols., 1994). Para este estudio,
se seleccionó una línea de animales cuya expresión de la proteína
transgénica fue ubicua en el embrión. En este modelo, aunque la
proteína Snail1-ER esté expresada
constitutivamente, su función como factor de trascripción se
desarrolla únicamente cuando se trasloca la proteína en el núcleo
después del tratamiento con el tamoxifeno (Danielian y cols., 1998
y Feil y cols., 1996 y 1997). El transgén se detecta a partir del
DNA procedente de la cola de los animales por PCR. La localización
subcelular de la proteína fue analizada por inmunohistoquímica
utilizando un anticuerpo anti-receptor de estrógeno
humano. El mismo anticuerpo sirvió para valorar la cantidad de la
proteína Snail1-ER en los distintos tejidos
obtenidos de los ratones transgénicos por Western Blot. El
tamoxifeno (Sigma) fue disuelto primero en etanol (10% del volumen
final) y luego en aceite de maíz (Sigma) para tener una
concentración final de 30 mg/ml. Se realizan dos inyecciones
intraperitoneales consecutivas de tamoxifeno a días 12,5 y 14,5 dpc
a hembras gestantes. La dosis utilizada fue de 75 \mug/g peso de
la hembra (Hayashi y McMahon, 2002).
Posteriormente, y para llevar a cabo los
experimentos de tinción de cartílago-hueso los
embriones disecados y los ratones post-natales del
ratón transgénico transgSnail1-ER se fijaron en
formalina tamponada al 10% a temperatura ambiente durante un mínimo
de 2 días. Se evisceraron y se les quitó la piel. Se lavaron en
agua entre 2 horas y 2 días, dependiendo del tamaño del ejemplar. Se
tiñeron en una solución de azul alcian (Sigma A5268) durante
12-48 horas, para teñir los cartílagos. Después de
lavar los especimenes en Etanol absoluto durante al menos dos días,
se rehidrataron y se incubaron en tripsina (Sigma T4799) hasta la
completa maceración del tejido. Se transfirieron a una solución de
alizarina roja S (Sigma A5533) en KOH 0,5% hasta que los huesos
aparecieron teñidos de rojo. Se lavaron los ejemplares en
soluciones consecutivas de KOH 0,5%/glicerina 3:1, 1:1 y 1:3, y se
conservaron en glicerina pura.
El estudio de los huesos de embriones de los
ratones transgénicos transgSnail1-ER permitió
observar que éstos eran más cortos que los no
sobre-expresaban Snail1 (Figura 2), debido a una
reducción en la zona de cartílago a costa de las poblaciones de
condrocitos proliferativos. Además, la expresión de Snail1 se
asoció a una inhibición de la proliferación de los condrocitos
proliferativos y se acompañó de un aumento de la expresión de STAT1
y de p21 (Figura 3).
Para la realización de los ensayos de
inmunohistoquímica se analizaron secciones de hueso. En detalle,
las secciones fueron obtenidas por cortes en microtomo, se trataron
durante 30 minutos en EDTA 1 mM a 100ºC, con el fin de
desenmascarar el antígeno. Después de retirar los restos de parafina
e hidratar, se permeabilizaron durante 30 minutos en 0,5% Tritón
X-100 en PBS a temperatura ambiente y,
posteriormente, se bloquearon durante 1 hora en 0,1% Tween, 10% FCS
en PBS. Las preparaciones se incubaron con los anticuerpos
primarios en 0,1% Tween-20, 1% FCS en PBS durante
16 horas a 4ºC y con los anticuerpos secundarios en 0,1%
Tween-20, 1% FCS en PBS, 2 horas a temperatura
ambiente. Las preparaciones se montaron con Mowiol y se conservaron
protegidas de la luz a 4ºC hasta su visualización en un
microscopio.
Los niveles de de RNAm de p21 se analizaron
mediante RT-PCR. En este sentido y en el resto de
análisis de RNAm de la presente invención la PCR cuantitativa se
realizó con una máquina de PCR cuantitativa ABI PRISM® 7000
siguiendo el método Syber Greenº. Los niveles de expresión se
calcularon según el método de la Ct, usando GAPDH como normalizador
y los niveles del ratón salvaje sin ningún tratamiento ni
transfección como calibrador. Para estos estudios se utilizaron las
secuencias de cebadores (todas 5'-3'):
mGapdh, CTGAGCAAGAGAGGCCCTATCC (SEQ ID NO9) y
CTCCCTAGGCCCCTCCTGTT (SEQ ID NO10); mP21,
AGGAGCCAGGCCAAGATGGT (SEQ ID NO11) y GCTTTGACACCCACGGTATTCA (SEQ ID
NO12); mSnail1, CCACACTGGTGAGAAGCCATTC (SEQ ID NO13) y
TCTTCACATCCGAGTGGGTTTG (SEQ ID NO14).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos primarios de condrocitos se
obtuvieron a partir de hueso de las patas traseras de embriones de
14,5 dpc de animales C57 que se disecaron en medio de cultivo
(a-MEM, 1% BSA, 0,1% L-Glutamina,
0,1% penicilina/estreptomicina. Al día siguiente se tripsinizaron y
se trataron con colagenasa en DMEM y 10% de suero. Se cultivaron en
medio (50% F-12, 50% DMEM, 10% FCS, 0,1%
L-Glutamina, 0,1% penicilina/estreptomicina una
densidad celular de 1,5.106 células/P100 (Woods and Beier, 2006).
Después de cinco días en cultivo, se empezó la diferenciación con
BMP-2 (Figura 4).
La activación de FGFR3 en cultivos primarios de
condrocitos de ratón con FGF indujo la activación de Snail1
valorada mediante el incremento de sus niveles de RNAm (Figura 4e),
que fue acompañada de la activación de p21 (Figura 4g). Como
ejemplo de procedimiento de control de los niveles de Snail1 -y de
modelo de tratamiento de un proceso condrodisplásico- se realizó un
ensayo de regulación de la expresión de Snail1 mediante siRNA
específicos, observándose que dichos siRNAs impidieron la expresión
de Snail1 y p21 (Figura 4h y 4j). Se utilizaron tres siRNAs
diferentes, dos frente a secuencias de la zona codificante y uno
frente a zona 3' no codificante, a fin de asegurarnos de la
especificidad de los resultados. Las secuencias de estos siRNAs
son:
- -
- I (codificante): 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
- -
- II (codificante): 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
- -
- III (zona 3' no codificante): 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
\vskip1.000000\baselineskip
Las tres parejas de secuencias de siRNA que se
han indicado fueron activas, siendo la imagen presentada de
inhibición de los niveles de Snail1 y p21 representativa de los
resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs
(Figura 4h y 4j) ya sea por separado o en combinación.
Los niveles de RNAm de Snail1 están aumentados
en cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave
de la acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del
FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético
(Figura 5a). El feto tanatóforo presenta la mutación descrita como
constitutivamente activa de dicho receptor (Figura 5b).
Tinción histológica. Las secciones se
sumergieron en Hematoxilina (Harris Hematoxylin solution modified,
Sigma HHS-16), durante 1 minuto, lavaron en agua
del grifo, y posteriormente se sumergieron en Eosina (Eosin Y
Counteratain Solution, 0,5% Aqueous, Sigma
HT110-2-32), durante 30 segundos.
Tras lavar en agua se deshidrataron de nuevo, se pasaron por
Histoclear y se montaron con Depex (BDH Laboratoires) para ser
analizadas en el microscopio óptico.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\hskip1cmUNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE LOS COMPUESTOS INHIBIDORES DE
LA ACTIVIDAD DE SNAIL1 EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES
FARMACÉUTICAS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE CONDRODISPLASIAS,
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS INHIBIDORES, DICHAS
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE
CONDRODISPLASIAS Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SnailCondrod
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1613
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mouse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(858)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de Snail1 de
ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mouse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(865)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de Snail1
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2084
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mouse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (116)..(925)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de Snai12 de
ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mouse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (165)..(971)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de Snai12
humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mGapdh_A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagcaaga gaggccctat cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mGapdh_B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipctccctaggc ccctcctgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mP21_A
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\hfill20
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mP21_B
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgctttgacac ccacggtatt ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mSnail1_A
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\hskip-.1em\dddseqskipccacactggt gagaagccat tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 22
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo_mSnail1_B
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcacatc cgagtgggtt tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_I_A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaagaucu ucaacugcaa auauu
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_I_Bcomplem
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaauauuugca guugaagauc uuccg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> RNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_II_A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacccacu cggaugugaa gagau
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> RNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_II_Bcomplem
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaucucuucac auccgagugg guuug
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_III_A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcugcuuc gagccauaga acuaa
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA_III_Bcomplem
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipuuaguucuau ggcucgaagc agcug
\hfill25
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<210> 21
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RNAm_snail
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcacatc cgaagccac
\hfill19
Claims (27)
1. Procedimiento de identificación de un proceso
de condrodisplasia caracterizado porque se basa en la
identificación de la sobreexpresión de Snail1 en una muestra
biológica y porque comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en
una muestra biológica de origen óseo de un mamífero,
preferentemente un ser humano, y
b) comparación de la cantidad de Snail1
observada en a) con la cantidad en una muestra control, y donde su
incremento es indicativo de la existencia de condrodisplasia.
2. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 1 caracterizado porque el proceso de
condrodisplasia es una enfermedad con fenotipo condrodisplasico en
la que la acción biológica de Snail1 sea la causa de dicha
enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 o
no.
3. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 2 caracterizado porque la enfermedad pertenece
al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica
(TD) e hipocondroplasia (HCH).
4. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 1 caracterizado porque la identificación de
Snail1 se refiere tanto al gen o proteína, de distinto origen
animal, preferentemente humano, Snail1 y Snail2.
5. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o
proteína Snail1 de ratón de secuencia SEQ ID NO1 y NO2,
respectivamente.
6. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o
proteína Snail1 humana de secuencia SEQ ID NO3 y NO4,
respectivamente.
7. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o
proteína Snail2 de ratón de secuencia NO5 y NO 6,
respectivamente.
8. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o
proteína Snai12 humana de secuencia SEQ ID NO7 y NO8,
respectivamente.
9. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 4 caracterizado porque la identificación de
Snail1 de a) se refiere a la forma humana de Snail1, ya sea hSnail1
y/o hSnail2, ya sea la identificación en forma de un transcrito
génico (RNAm) o de la forma proteica del gen, de secuencias SEQ ID
NO 3 y 4 y SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente.
10. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de
Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante el uso
de anticuerpos específicos, ya sean monoclonales o policlonales, de
la proteína hSnail1 y/o hSnail2.
11. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de
Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante
hibridación in situ con un precursor de dichos genes.
12. Procedimiento de identificación según la
reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de
Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante
RT-PCR de un precursor génico de dichos genes.
13. Procedimiento de identificación y evaluación
de la actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1
útiles para el tratamiento de la condrodisplasia
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico
donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia
con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e
incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del
proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de
la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una
disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
14. Procedimiento de identificación y evaluación
según la reivindicación 13 caracterizado porque el sistema
biológico de a) es un animal transgénico, preferentemente un
mamífero, y, más preferentemente, un primate no humano, donde la
expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o
condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia.
15. Procedimiento de identificación y evaluación
según la reivindicación 14 caracterizado porque el animal
transgénico utilizado es el ratón transgénico
transgSnail1-ER.
\newpage
16. Sistema biológico necesario para llevar a
cabo el procedimiento de identificación y evaluación según las
reivindicaciones 13 a la 15 caracterizado porque es un
animal transgénico preferentemente un mamífero, y, más
preferentemente, un primate no humano, donde la expresión de la
proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y
donde su expresión provoca condrodisplasia.
17. Sistema biológico según la reivindicación 16
caracterizado porque dicho animal mamífero no humano lo
constituye el ratón transgénico transgSnail1-ER.
18. Uso de un compuesto o agente inhibidor de la
actividad de la proteína Snail1 en la elaboración de un medicamento
o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso
condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario,
caracterizado porque es un ácido nucleico o polinucleótido y
que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA)
específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la
proteína Snail1.
19. Uso de un compuesto según la reivindicación
18 caracterizado porque el siRNA de d) es un RNAi que se une
preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail
gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda
a ésta o a un fragmento más corto de la misma.
20. Uso de un compuesto según la reivindicación
18 caracterizado porque el RNAi de d) es un siRNA constituido por
una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las
mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- -
- I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
- -
- II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
- -
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
21. Composición farmacéutica o medicamento útil
para el tratamiento de un proceso condrodisplásico
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
efectiva de un ácido nucleico o polinucleótido que impide o
disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail
humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la
proteína Snail1,
junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes
y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) se une
preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail
gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda
a ésta o a un fragmento más corto de la misma.
23. Composición farmacéutica según la
reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) es un
RNAi constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una
mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- -
- I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
- -
- II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
- -
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
24. Uso de la composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 para la elaboración de
un medicamento para el tratamiento de un proceso condrodisplásico
en un mamífero.
25. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 24 en la que el mamífero es un humano.
26. Uso de la composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 en el que el proceso
condrodisplásico causado por la acción biológica de Snail1 se
acompaña de una activación anómala del FGFR3, y se selecciona de la
lista que comprende: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica
(TD) e hipocondroplasia (HCH).
27. Uso de la composición farmacéutica según la
cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 caracterizado
porque el proceso condrodisplásico causado por la acción biológica
de Snail1 no se acompaña de una activación anómala del FGFR3.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| ES200700619A ES2310469B1 (es) | 2007-03-08 | 2007-03-08 | Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones. |
| PCT/ES2008/070042 WO2008107508A1 (es) | 2007-03-08 | 2008-03-07 | Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicacione |
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| BOUTET A et al. "{}Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney"{}. The EMBO Journal. 2006. Vol. 25, N$^{o}$ 23, páginas 5603-5613. Especialmente, página 5603, resumen, columna 2, párrafo 3; página 5611, columna 2, párrafo 2; página 5612, columna 2, párrafo 2. * |
| SEKI K. et al. "{}Mouse Snail Family Transcriptions Repressors Regulate Chondrocyte, Extracellular Matrix, Type II Collagen, and Aggrecan"{}. The Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 274, N$^{o}$ 43, páginas 41862-41870. Especialmente, página 41862, resumen, columna 2, párrafos 3-4; página 41864, columna 1, párrafo 2; columna 2, párrafo 2; página 41865, figura 2; página 41866, columna 1, párrafo 4; página 41867, figura 3; página 41867, figura 4. * |
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