WO2008107508A1 - Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicacione - Google Patents

Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicacione Download PDF

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Cristina Alvarez De Frutos
Sonia Vega
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Definitions

  • the present describes that the SnaiM gene transduces the signaling mediated by the FGFR3 receptor responsible for chondrodysplasia
  • achondrodroplasia ACH
  • TD tanatophoreic dysplasia
  • HCH hypochondroplasia
  • siRNA RNA interference experiments
  • the present invention is framed in the field of biomedicine, and more specifically in the application of biotechnological tools for the diagnosis and treatment of human diseases, and more specifically of chondrodysplasias related to receptor 3 of the fibroblast growth factor (achondrodysplasias (ACH ), tanatophoreic dysplasias (TD) and hypochondrodysplasias (HCH), hereinafter referred to generically as chondrodysplasia)
  • achondrodysplasias ACH
  • TD tanatophoreic dysplasias
  • HH hypochondrodysplasias
  • the skeleton is made up of cartilage and bone.
  • the cartilage in turn, is formed by chondrocytes, while the bone is formed by osteoblasts and osteoclasts. Chondrocytes and osteoblasts have mesenchymal origin, while osteoclasts come from the hematopoietic lineage.
  • Chondrocytes have a primary role in the formation of most skeletal components. In addition to their role during osteogenesis, the chondrocytes located in the growth plate control the longitudinal growth of the bones. Inside the mesenchymal condensations, they gradually differentiate, from proliferative chondrocytes, to the stage of final differentiation, hypertrophic chondrocytes. This cell population is gradually surrounded by calcified extracellular matrix, which favors the invasion of blood vessels from the perichondrium. It is then when the perichondrial cells begin to differentiate into osteoblasts, and to form the mineralized structure called the bone collar (Karsenty and Wagner, 2002; Kronenberg, 2003).
  • the hypertrophic chondrocytes die by apoptosis and the osteoblasts begin to deposit the bone extracellular matrix, consisting mainly of type I collagen.
  • the chondrocytes are restricted to the growth plate, where together with the osteoblasts, they will direct the growth Longitudinal bone.
  • FGFR3 receptor 3
  • Fgfr3 function gain mutations cause hypochondroplasia, achondroplasia and tanatophoric dysplasia, the most severe variant of achondroplasia (Horton, 2006 and Heuertz et al., 2006).
  • Hypochondroplasia (HCH, OMIM 146000) is the mildest form of this type of dwarfism, caused in 65% of cases by the N540K mutation, in the receptor tyrosine kinase 1 domain (Bellus et al., 1995 and Prinos and cois., 1995).
  • Achondroplasia (ACH, OMIM 100800), due in 98% of cases to the G380R mutation, in the transmembrane domain of the recipient, is the most common chondrodysplasia in humans (Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994 ; Bellus et al., 1995b).
  • Tanatophoreic dysplasia has a lethal phenotype and two varieties have been described according to diagnosis radiological: type I and type Il (TD I and TD II, OMIM 187600 and 187601, respectively; Tavormina et al., 1995).
  • diagnosis radiological type I and type Il (TD I and TD II, OMIM 187600 and 187601, respectively; Tavormina et al., 1995).
  • There are murine models that reproduce the pathologies with mutations in the corresponding positions (Naski and cois., 1998; Wang and cois., 1999; Chen and cois., 1999 and 2001 and Li and cois., 1999).
  • the phenotype of shortening of the long bones is due to a disorganization and shortening of the proliferative chondrocyte columns and a delay in the differentiation.
  • Defects in proliferative chondrocytes are due to the activation of Stati, responsible for the induction of the p21 cell cycle inhibitor (Su et al., 1997; Sahni et al., 1999; devisi- Mallet et al., 2004) and the delay in the differentiation to the activation of the signaling cascade of MAPKs (Murakami et al., 2004) causing the reduction of the area of hypertrophic chondrocytes, both in animal and human models.
  • SnaiM has been described as a direct repressor of type II collagen (Seki et al., 2003), characteristic of proliferative chondrocytes, and that disappears when they stop proliferating and differentiate hypertrophic chondrocytes, a cell population that expresses type X collagen.
  • Snail attenuated the proliferation of epithelial cells in culture and involved an increase in p21 levels and an increase in the phosphorylation of ERK1 and ERK2 (Vega et al., 2004).
  • human chondrodysplasias which present with delay and irregularity in the formation of cartilage
  • murine models generated for their study have been associated with mutations that generate greater FGFR3 activity, which causes a delay in differentiation and a stop of the proliferation of pathological chondrocytic populations, preventing the proper bone development of the individual.
  • the therapeutic approaches for these chondrodysplasias in humans are several.
  • An object of the present invention constitutes a procedure for identifying a chondrodysplasia process, hereinafter a procedure for identifying a chondrodysplasia process of the invention, based on the identification of the presence of SnaiM in a biological sample and comprising the following steps: a) identification of the presence of SnaiM, in a biological sample of bone origin, and b) comparison of the presence of SnaiM observed in a) with its absence in a control sample, and where its presence is indicative of the existence of chondrodysplasia.
  • Another object of the present invention constitutes a method of identification and evaluation of the activity of compounds that inhibit SnaiM protein useful for the treatment of chondrodysplasia, hereinafter method of identification of compounds of the present invention, comprising the following steps: a) Contacting a biological system where there is an expression of SnaiM that produces chondrodysplasia with the candidate compound object of this procedure, and incubation under the appropriate conditions, b) determination of a parameter indicative of the chondrodysplasia process, ec) identification of a compound that inhibits the activity of the SnaiM protein when a decrease in said chondrodysplasia parameter is observed.
  • Another object of the invention constitutes a biological system necessary to carry out the method of identifying compounds of the present invention, preferably a transgenic animal, preferably a mammal, and more preferably a non-human primate, where the expression of the SnaiM protein It is inducible, constant or conditioned, and where its expression causes chondrodysplasia.
  • a particular embodiment of said non-human mammalian animal of the present invention constitutes the transgenic mouse developed in the invention, the transgSnail1-ER mouse (Example 2).
  • Another object of the present invention constitutes the use of a compound or agent that inhibits the activity of the SnaiM protein, hereinafter use of an inhibitor compound of the present invention, in the preparation of a medicament or pharmaceutical composition useful for the treatment of a chondrodisplastic process, preferably human or veterinary.
  • another particular object of the invention constitutes the use of a SnaiM inhibitor compound in which the inhibitor compound is a nucleic acid or polynucleotide that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human SnaiM protein and that includes a sequence of nucleotides selected from: a) a specific antisense nucleotide sequence of the sequence of the gene or mRNA of the SnaiM protein, b) a ribozyme specific of the mRNA of the SnaiM protein, c) a specific aptamer of the mRNA of the SnaiM protein, d) an interfering RNA (siRNA or shRNA) specific to the SnaiM protein mRNA, and e) a microRNA (miRNA) specific to the SnaiM protein mRNA.
  • the inhibitor compound is a nucleic acid or polynucleotide that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human Sn
  • Another object of the present invention constitutes a pharmaceutical composition or a medicament useful for the treatment of a chondrodisplastic process, hereinafter pharmaceutical composition of the present invention, which comprises a therapeutically effective amount of a compound or agent inhibiting SnaiM protein, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles.
  • Another object of the present invention constitutes the use of the pharmaceutical composition of the invention in a method of treating a mammal, preferably a human being, affected by a chondrodysplastic process, hereinafter using the pharmaceutical composition of the present invention, consisting in the administration of said therapeutic composition that inhibits the chondrodysplasia process.
  • the present invention is based on the fact that the inventors have observed that the SnaiM gene transduces the signaling mediated by the FGF receptor 3 (FGFR3) responsible for chondrodysplasia.
  • FGFR3 FGF receptor 3
  • transgSnail1-ER mouse allows the availability of animal models - this process of transgenesis can be transferred by any expert to the development of other mammalian animals including primates, nonhuman - in which they can be tested and characterize therapeutic compounds for the treatment of veterinary or human chondrodisplastic processes, and which to date did not exist.
  • SnaiM represses cell proliferation in vivo, which induces morphological defects in the growth plate of these bones (shorter bones).
  • These changes described here are reminiscent of those observed after the experimental induction of chondrodysplasia in genetically modified mice expressing mutated versions of FGFR3 that suppose its constitutive activation (Chen et al., 1999 and 2001; Li et al., 1999; Wang et al. ., 1999).
  • SnaiM has been related to the signaling pathway of the
  • RNA interference experiments (“small interference", siRNA) performed in primary cultures from fetal mouse bone, demonstrated that preventing SnaiM function is sufficient to prevent FGFR3-mediated signaling in chondrocytes, reversing the stop cell cycle (measured by the expression of p21) and the activation of the MAPK pathway (recognized by the phosphorylation of ERK1 / 2), even in the presence of constitutively active FGFR3 (Example 3). Therefore SnaiM is the mediator of the signaling of FGFR3.
  • These polynucleotides mentioned can be used in a process of gene therapy in which by any technique or procedure the integration of them into the cells of a human patient is allowed.
  • the single deregulated activity of Snail in the embryonic cartilage is capable of inducing achondroplasia
  • the presence of SnaiM in stages where it is normally repressed could be considered a marker of the achondroplastic phenotype of the type associated with FGFR3 - achondroplasia (ACH), tanatophoreic dysplasia (TD) and hypochondroplasia (HCH) - and, therefore, use its aberrant expression as a diagnosis of any phenotype caused by the gain of function of FGFR3.
  • the aberrant presence of SnaiM in the embryonic cartilage induces achondroplasia, independently of the signal that has induced this pathological presence of SnaiM.
  • the inhibition of SnaiM by siRNA prevents the stopping of the proliferation of chondrocytes and the phosphorylation of the ERKs even in the presence of constitutive activity of FGFR3. Therefore, the inhibition of SnaiM in the growth plate will prevent the effects of the gain of function of the FGFR3 induced by any mechanism or the achondroplasias generated by the aberrant presence of independent SnaiM the FGFR3.
  • an object of the present invention constitutes a procedure for identifying a chondrodysplasia process, hereinafter a procedure for identifying a chondrodysplasia process of the invention, based on the identification of the presence of SnaiM in a biological sample and comprising the following stages: a) identification of the presence of SnaiM, in a biological sample of bone origin, and b) comparison of the presence of SnaiM observed in a) with its absence in a control sample, and where its presence is indicative of The existence of chondrodysplasia.
  • chondrodysplasia process refers to a disease with chondrodysplastic phenotype, preferably human, in which the biological action of SnaiM is the cause of this disease, whether accompanied by an abnormal activation of FGFR3 - such as: achondrodroplasia (ACH), dysplastic tanatoforia (TD) and hypochondroplasia (HCH) - or not.
  • ACH achondrodroplasia
  • TD dysplastic tanatoforia
  • HSH hypochondroplasia
  • This identification of SnaiM in a biological sample of veterinary or medical origin of animals or human subjects can be extracted from them and subsequently ex vivo to identify on the same Ia presence or not SnaiM, which would correlate with the diagnosis of a chondrodisplastic process in said subject, which would allow the definition and execution of a therapeutic, veterinary or medical approach.
  • SnaiM gene or “SnaiM protein” refers to both the gene or protein, of different animal origin, preferably human, SnaiM (for example, mouse SnaiM: SEQ ID NO1 and NO2, or human: SEQ ID NO3, NO4, respectively), as well as any nucleotide or amino acid sequence (aás.) analogous to these, respectively.
  • SnaiM for example, mouse SnaiM: SEQ ID NO1 and NO2, or human: SEQ ID NO3, NO4, respectively
  • analogous is intended to include any nucleotide or amino acid sequence that can be isolated or constructed based on the nucleotide or amino acid sequences shown herein, for example, by introducing substitutions.
  • nucleotides or conservative or non-conservative amino acids including the insertion of one or more nucleotides or amino acids, the addition of one or more nucleotides or amino acids at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides or amino acids at any end or within the sequence, and that constitutes a coding sequence or peptide with activity similar to the SnaiM sequence of the invention, that is, is capable of inducing chondrodysplasia.
  • an analogous nucleotide or amino acid sequence is substantially homologous to the amino acid sequence discussed above.
  • the expression "substantially homologous" means that the nucleotide or amino acid sequences in question have an identity degree of at least 40%, preferably at least 85%, or more. preferably at least 95%.
  • a particular object of the invention constitutes the identification procedure of the invention in which the identification of SnaiM of a) refers to the human form of SnaiM (hSnaiM, either the identification in the form of a gene transcript (mRNA) or of the protein form of the gene; SEQ ID NO 3 and 4).
  • Another particular object of the invention constitutes the method of identifying a chondrodysplasia process in which the identification of SnaiM is carried out through the use of specific antibodies of the SnaiM protein, preferably hSnaiM (Franci et al., 2006) .
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • Another particular object of the invention constitutes the method of identifying a chondrodysplasia process in which the identification of SnaiM is carried out by in situ hybridization with a SnaiM precursor (see Figure 1).
  • Another particular object of the invention constitutes the method of identifying a chondrodysplasia process in which the identification of SnaiM is carried out by RT-PCR of a SnaiM gene precursor (Example 3, Figure 4). This procedure is based on the extraction of polyA + RNA from a biological sample of bone origin and from a control tissue and the amplification of the SnaiM coding sequence with suitable oligonucleotide primers (Boutet et al., 2006).
  • this chondrodysplasia diagnosis procedure can be performed using SnaiM as the sole marker or in conjunction with other chondrodysplasia markers, for example as part of a biological expression microarray, either in gene form -from RNAm- or in the form of protein.
  • Another object of the present invention constitutes a method of identification and evaluation of the activity of inhibitor compounds of Ia SnaiM protein useful for the treatment of chondrodysplasia, hereinafter method of identifying compounds of the present invention, which comprises the following steps: a) Contacting a biological system where there is an expression of SnaiM that produces chondrodysplasia with the candidate compound object of this procedure, and incubation under the appropriate conditions, b) determination of a parameter indicative of the chondrodysplasia process, ec) identification of a compound that inhibits the activity of the SnaiM protein when a decrease in said chondrodysplasia parameter is observed.
  • Another particular object of the present invention is the method of identifying compounds of the invention where the biological system of point a) is a transgenic animal where the expression of the SnaiM protein is inducible, in a constant or conditioned manner, and where its expression It causes chondrodysplasia.
  • a particular embodiment of the method of identifying compounds of the present invention is that where the transgenic animal is the transgenic mouse of the present invention (Example 2, transgSnail1-ER mouse).
  • Another object of the invention constitutes a biological system necessary to carry out the method of identifying compounds of the present invention, preferably a transgenic animal, preferably a mammal, and more preferably a non-human primate, where the expression of the SnaiM protein It is inducible, constant or conditioned, and where its expression causes chondrodysplasia.
  • a particular embodiment of said non-human mammalian animal of the present invention constitutes the transgenic mouse developed in the invention, the transgSnail1-ER mouse (Example 2).
  • Another object of the present invention constitutes the use of a compound or agent that inhibits the activity of the SnaiM protein, hereinafter used an inhibitor compound of the present invention, in the preparation of a medicament or pharmaceutical composition useful for the treatment of a chondrodisplastic process, preferably human or veterinary.
  • the term "compound / inhibitor or antagonist agent” refers to a molecule that when bound or interacts with the SnaiM protein (for example, SEQ ID NO2, SEQ ID NO4), or with functional fragments thereof, decreases or eliminates the intensity or duration of the biological activity of said protein.
  • This definition also includes those compounds that prevent or reduce the expression of the gene coding for the Snail protein (for example, SEQ ID NO1, SEQ ID NO3), that is, that prevent or diminish the transcription of the gene, the maturation of the mRNA , The translation of the mRNA and the post-translational modification.
  • An inhibitory agent can be constituted by a peptide, a protein, a nucleic acid or polynucleotide, a carbohydrate, an antibody, a chemical compound or any other type of molecule that diminishes or eliminates the effect and / or the function of the SnaiM protein.
  • said polynucleotide can be a polynucleotide that encodes a specific antisense nucleotide sequence of the gene or mRNA sequence of the SnaiM protein, or a polynucleotide encoding a specific ribozyme of the mRNA of the SnaiM protein, or polynucleotide that encodes a specific aptamer of the SnaiM protein mRNA, either a polynucleotide that encodes an interference RNA ("small interference RNA" or siRNA or a shRNA) specific to the SnaiM protein mRNA or a microRNA (miRNA).
  • interference RNA small interference RNA
  • siRNA siRNA
  • shRNA microRNA
  • polynucleotides mentioned can be used in a process of gene therapy in which by any technique or procedure the integration of them into the cells of a human patient is allowed. This objective can be achieved by administering to these bone or cartilage cells a gene construct comprising one of the aforementioned polynucleotides in order to transform said cells allowing their expression inside them so that expression of the Ia is inhibited.
  • said gene construction it may be included within a vector, such as, for example, an expression vector or a transfer vector.
  • vector refers to systems used in the process of transferring an exogenous gene or an exogenous gene construct into a cell, thus allowing the vehicle to generate genes and gene constructs.
  • exogenous Said vectors can be non-viral vectors or viral vectors (Pfeifer and Verma, 2001) and their administration can be prepared by an expert in the field according to the needs and specificities of each case.
  • another particular object of the invention constitutes the use of a SnaiM inhibitor compound in which the inhibitor compound is a nucleic acid or polynucleotide that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human SnaiM protein and that includes a sequence of nucleotides selected from: a) a specific antisense nucleotide sequence of the sequence of the gene or mRNA of the SnaiM protein, b) a ribozyme specific of the mRNA of the SnaiM protein, c) a specific aptamer of the mRNA of the SnaiM protein, d) an interfering RNA (siRNA or shRNA) specific to the SnaiM protein mRNA, and e) a microRNA (miRNA) specific to the SnaiM protein mRNA.
  • the inhibitor compound is a nucleic acid or polynucleotide that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human Sn
  • antisense oligonucleotides have been described and even protected by patent (US20060003956; Kajita et al., 2004) and siRNAs that inhibit the expression of SnaiM (Peinado y cois., 2005; Tripathi and cois., 2005). Any of these nucleotide sequences described in the state of the art as inhibitors of SnaiM expression are incorporated as embodiments of the present invention as potential therapeutic compounds useful for the manufacture of medicaments for the treatment of a chondrodisplastic process.
  • these gene inhibition techniques and more specifically the vehiculization of the compounds - antisense oligonucleotides, iRNA, ribozymes or aptamers - can be carried out through the use of liposomes, nanoparticles or other vehicles that increase the success of said transfer within the cell, preferably to the cell nucleus (Lu and Woodle, 2005; Hawker and Wooley, 2005).
  • SnaiM mRNA translation inhibitors can be used that bind both their coding and non-coding regions, for example against the 3 'non-coding zone.
  • a particular embodiment of the invention constitutes the use of a siRNA of d) in which the RNAi preferentially binds to the fragment sequence of the Snail gatgcacatccgaagccac mRNA (SEQ ID NO17) or to another sequence comprising this or a fragment shorter thereof (US20060003956; the use of the siRNAs described in this US patent are incorporated as particular embodiments within the scope of this patent).
  • RNAi of d RNAi of d
  • siRNA is constituted by a pair of nucleotide sequences, or a mixture thereof, belonging to the following group:
  • nucleotide sequences a) -e) mentioned above prevent the expression of the gene in mRNA or mRNA in the SnaiM protein, and, therefore, they cancel their biological function, and can be developed by an expert in the genetic engineering sector based on the knowledge existing in the state of the art on transgenesis and cancellation of gene expression (Clarke, 2002; US20020128220; Miyake et al., 2000 ; Puerta-Ferández et al., 2003; Kikuchi et al., 2003; Reynolds et al., 2004).
  • compositions or a medicament useful for the treatment of a chondrodisplastic process hereinafter pharmaceutical composition of the present invention, which comprises a therapeutically effective amount of a compound or agent inhibiting SnaiM protein, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles.
  • a particular embodiment of the present invention constitutes a pharmaceutical composition in which the inhibitor compound is a nucleic acid or polynucleotide that prevents or decreases the expression of the gene encoding the human SnaiM protein and that includes at least one selected nucleotide sequence. between: a) a specific antisense nucleotide sequence of the sequence of the SnaiM protein gene or mRNA, b) a specific ribozyme of the SnaiM protein mRNA, c) a specific SnaiM protein mRNA aptamer, d) a RNA interference (iRNA) specific to the protein mRNA
  • RNA a microRNA specific for the SnaiM protein mRNA.
  • Another particular embodiment of the invention constitutes the pharmaceutical composition of the invention in which the SnaiM inhibitor is a siRNA that preferentially binds to the fragment sequence of the SnaiM mRNA gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) or to another sequence comprising this or a shorter fragment thereof (US20060003956; the use of the siRNAs described in this American patent are incorporated as particular embodiments within the scope of the present patent).
  • the SnaiM inhibitor is a siRNA that preferentially binds to the fragment sequence of the SnaiM mRNA gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) or to another sequence comprising this or a shorter fragment thereof (US20060003956; the use of the siRNAs described in this American patent are incorporated as particular embodiments within the scope of the present patent).
  • Another particular embodiment of the invention constitutes the pharmaceutical composition of the invention in which the Snail inhibitor is an RNAi constituted by a pair of nucleotide sequences, or a mixture thereof, belonging to the following group:
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the agent or compound that inhibits the activity of the SnaiM protein, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes. , due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention can be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the administration of the therapeutic composition provided by this invention is carried out parenterally, orally, intraperitoneally, subcutaneously, etc.
  • Another object of the present invention constitutes the use of the pharmaceutical composition of the invention in a method of treating a mammal, preferably a human being, affected by a chondrodysplastic process, hereinafter using the pharmaceutical composition of the present invention, consisting in the administration of said therapeutic composition that inhibits the chondrodysplasia process.
  • Another particular object of the invention constitutes the use of the pharmaceutical composition of the invention in which the chondrodysplasia process caused by the biological action of SnaiM is accompanied by an abnormal activation of FGFR3, belonging by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: achondropalasia (ACH), dysplastic tanatoforia (TD) and hypochondroplasia (HCH).
  • ACH achondropalasia
  • TD dysplastic tanatoforia
  • HSH hypochondroplasia
  • Another particular object of the invention constitutes the use of the pharmaceutical composition of the invention in which the chondrodysplasia process caused by the biological action of SnaiM is not accompanied by an abnormal activation of FGFR3.
  • FIG. 1 SnaiM is expressed during embryonic bone development in the populations involved in its longitudinal growth.
  • FIG. 3 The presence of SnaiM in the growth plate inhibits cell proliferation.
  • AD immunohistochemistry against PH3 to mark proliferating cells, where a drastic decrease in the number of proliferative cells can be observed in mice with SnaiM induced expression.
  • EH in these same mice, the immunohistochemistry against STAT1 reveals an increase in its activation (nuclear presence of the protein), which is accompanied by an increase in mRNA levels of p21 (m).
  • m mRNA levels of p21
  • a detail of the endogenous co-expression of STAT1 and SnaiM can also be observed under normal conditions in the mouse bone (IL).
  • FGFR3 signaling in primary mouse chondrocyte (AD) cultures due to the transfection of the mutated versions of FGFR3 representative of the human chondrodysplasias ACH and TDII K644E and G380R, respectively), induces the activation of SnaiM assessed by means of their mRNA levels (E), which is accompanied by the activation of p21 (G), without transcriptional variations of STAT1 (F).
  • Figure 5. SnaiM is necessary for the signaling of FGFR3 in the bone. The effects described in Figure 4 are prevented by the treatment of said cultures with SnaiM siRNA.
  • Figure 6. SnaiM expression levels correlate with the severity of the achondroplastic phenotype of the mice. The phenotypes were divided into three groups, low (25%, A, B, G), medium (60%, C, D, H) and high (15%, E, F, I). The severity of the phenotype is related to the levels of SnaiM expression.
  • Figure 7. The mutation of the FGFR3 responsible for tanatophic dysplasia in humans activates the expression of SnaiM.
  • SnaiM mRNA levels are increased in cartilage from a human tanatophore fetus (severe form of achondroplasia related to the constitutive activation of FGFR3) with respect to one without skeletal development problems (a).
  • the tanatophore fetus has the mutation described as constitutively active of said receptor (b).
  • N sample obtained from a fetus without bone problems
  • T sample obtained from a fetus with tanatophoreic dysplasia.
  • Example 1 SnaiM is expressed during embryonic bone development in the populations involved in its longitudinal growth.
  • the presence of the SnaiM mRNA in mouse embryonic bones was detected by means of the in situ hybridization technique.
  • the mouse embryos came from the C57xCBA strain and their ages, established in post-coitum days (dpc) were determined considering the day on which the vaginal plug is seen as day 0.5.
  • the bones were dissected at stages between 12.5 dpc and 18.5 dpc respectively, fixed in 4% paraformaldehyde in PBS / DEPC overnight. Then you embedded in jelly and cut with a vibratome to obtain 50 m sections.
  • ISH in gelatin sections were performed as described in Blanco et al., 2002 using RNA probes labeled with DIG-11-UTP. After hybridization, the sections were processed as described in Cano et al., 2000.
  • Example 2. Snail1-ER transgenic mice show bone growth alterations.
  • pcDNA3-Snail1 corresponding to the complete sequence of the mouse SnaiH cDNA inserted in the plasmid pcDNA3 (Invitrogen; Cano et al., 2000) was used.
  • pcDNA3-Snail-ER corresponds to the SnaiM coding sequence linked to a mutated version of the human estrogen receptor agonist binding domain that recognizes the synthetic ligand 4- OH-Tamoxifen (Locascio et al., 2002).
  • the Snail1-ER transgene was designed as described previously (Locascio et al., 2002) and a transgenic mouse (transgSnaiM-ER mouse) was generated for this construction according to standard procedures (Hogan et al., 1994). For this study, a line of animals was selected whose expression of the transgenic protein was ubiquitous in the embryo. In this model, although the Snail1-ER protein is constitutively expressed, its function as a transcription factor is only developed when the protein is translocated in the nucleus after treatment with tamoxifen (Danielian et al., 1998 and Feil et al., 1996 and 1997). The transgene is detected from the DNA from the tail of the animals by PCR.
  • the subcellular location of the protein was analyzed by immunohistochemistry using a human estrogen receptor antibody. The same antibody served to assess the amount of the Snail1-ER protein in the different tissues obtained from the transgenic mice by Western Blot.
  • Tamoxifen (Sigma) was dissolved first in ethanol (10% of the final volume) and then in corn oil (Sigma) to have a final concentration of 30 mg / ml. Two consecutive intraperitoneal injections of tamoxifen are made at 12.5 and 14.5 dpc days to pregnant females. The dose used was 75 g / g female weight (Hayashi and McMahon, 2002).
  • the dissected embryos and the post-natal mice of the transgSnail1-ER transgenic mouse were fixed in 10% buffered formalin at room temperature for a minimum of 2 days. They were eviscerated and their skin was removed. They were washed in water between 2 hours and 2 days, depending on the size of the specimen. They were stained in a solution of alcian blue (Sigma A5268) for 12-48 hours, to stain the cartilage. After washing the specimens in absolute Ethanol for at least two days, they were rehydrated and incubated in trypsin (Sigma T4799) until complete tissue maceration.
  • Bone sections were analyzed for the performance of the immunohistochemical tests.
  • the sections were obtained by microtome cuts were treated for 30 minutes in 1 mM EDTA at 100 0 C, in order to unmask the antigen.
  • the preparations were incubated with the primary antibodies in 0.1% Tween-20, 1% FCS in PBS for 16 hours at 4 0 C and with the secondary antibodies in 0.1% Tween-20, 1% FCS in PBS, 2 hours at room temperature.
  • the preparations were mounted with Mowiol and kept protected from light at 4 0 C until visualization under a microscope.
  • P21 mRNA levels were analyzed by RT-PCR.
  • the quantitative PCR was performed with an ABI PRISM ® 7000 quantitative PCR machine following the Syber Green ® method. Expression levels were calculated according to the Ct method, using GAPDH as normalizer and wild mouse levels without any treatment or transfection as a calibrator.
  • the primer sequences (all 5'-3 ') were used: mGapdh, CTGAGCAAGAGAGGCCCTATCC (SEQ ID NO5) and
  • CTCCCTAGGCCCCTCCTGTT (SEQ ID NO6); mP21, AGGAGCCAGGCCAAGATGGT (SEQ ID NO7) and
  • Example 3 SnaiM is sufficient and necessary for the signaling of FGFR3 in chondrocytes.
  • chondrocyte cultures were obtained from bone of the hind legs of 14.5 dpc embryos of C57 animals that were dissected in culture medium (-MEM, 1% BSA, 0.1% L-Glutamine, 0, 1% penicillin / streptomycin). The next day they were trypsinized and treated with collagenase in DMEM and 10% serum. A cell density of 1, 5.10 6 cells / P100 (Woods and Beier) were grown in medium (50% F-12, 50% DMEM, 10% FCS, 0.1% L-Glutamine, 0.1% penicillin / streptomycin) , 2006). After five days in culture, the differentiation with BMP-2 was started (Figure 4).
  • transgSnail1-ER mouse The single activation of Snail induced by the administration of 4-OHT in primary cultures of chondrocytes from the transgenic mouse of the present invention (transgSnail1-ER mouse), causes the activation of the MAPK signaling pathway, recognized by the increase in the phosphorylation levels of ERK1 / 2 and the levels of Sox9 (Figure 4H).
  • siRNAs As an example of a control procedure for SnaiM levels - and a treatment model for a chondrodysplastic process - a test for regulating the expression of SnaiM by specific siRNA was performed, observing that said siRNAs prevented the expression of SnaiM and increases in The expression of p21 and Sox9 and in the phosphorylation of ERK1 / 2 ( Figure 5). Three different siRNAs were used, two against sequences of the coding zone and one against the 3 'non-coding zone, in order to ensure the specificity of the results. The sequences of these siRNAs are:
  • Example 5 The mutation of the FGFR3 responsible for tanatophic dysplasia in humans activates the expression of SnaiM.
  • SnaiM mRNA levels are increased in cartilage from a human tanatophore fetus (severe form of achondroplasia related to the constitutive activation of FGFR3) with respect to one without skeletal development problems ( Figure 7A).
  • the tanatophore fetus presents the mutation described as constitutively active of said receptor ( Figure 7B).
  • the membranes were blocked with 3% skim milk in TBS for 1 hour at room temperature and subsequently incubated with the corresponding primary antibodies diluted in 3% skim milk in TBS for 16 hours at 4 0 C. After washing the membranes in TBS they were incubated for 1 hour at room temperature with the corresponding secondary antibodies coupled to peroxidase. After washing the excess antibody, the membranes were developed by chemiluminescence and exposed in films. The total ERK-2 protein was used as load control.
  • Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am. J. Hum. Genet 56, 368-373.
  • RNA interference from functional genomics to therapeutics. (2005) Adv Genet 54: 117-42.

Abstract

Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias, prodecimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicaciones.

Description

USO DE LOS COMPUESTOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE SNAIL1 EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE CONDRODISPLASIAS, PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS INHIBIDORES, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, PROCEDIMIENTO DE
DIAGNÓSTICO DE CONDRODISPLASIAS Y SUS APLICACIONES
La presente describe que el gen SnaiM transduce Ia señalización mediada por el receptor FGFR3 responsable de condrodisplasias
(acondrodroplasia (ACH), displasia tanatofórica (TD) e hipocondroplasia (HCH)), habiéndose demostrado que Ia simple activación aberrante de SnaiM es suficiente para reproducir un fenotipo de condrodisplasia. Igualmente, mediante experimentos de RNA de interferencia (siRNA) sobre cultivos primarios se demostró que al impedir Ia función de SnaiM se impide Ia señalización mediada por el FGFR3 en condrocitos. Esto permite identificar a SnaiM como una diana terapéutica y diagnóstico de condrodisplasias, así como el uso de sus inhibidores como fármacos para el tratamiento de dicha enfermedad.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se enmarca en el campo de Ia biomedicina, y más concretamente en Ia aplicación de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas, y más concretamente de las condrodisplasias relacionadas con el receptor 3 del factor de crecimiento fibroblástico (acondrodisplasias (ACH), displasias tanatofóricas (TD) e hipocondrodisplasias (HCH), en adelante denominadas genéricamente como condrodisplasias).
ESTADO DE LA TÉCNICA El esqueleto está formado por el cartílago y el hueso. El cartílago, a su vez, está formado por los condrocitos, mientras que el hueso está formado por los osteoblastos y los osteoclastos. Los condrocitos y los osteoblastos tienen origen mesenquimático, mientras que los osteoclastos provienen del linaje hematopoyético.
Los condrocitos tienen un papel primordial en Ia formación de Ia mayoría de los componentes esqueléticos. Además de su papel durante Ia osteogénesis, los condrocitos situados en Ia placa de crecimiento controlan el crecimiento longitudinal de los huesos. En el interior de las condensaciones mesenquimáticas, se van diferenciando gradualmente, desde condrocitos proliferativos, hasta llegar a su estadio de diferenciación final, los condrocitos hipertróficos. Esta población celular es rodeada gradualmente por matriz extracelular calcificada, que favorece Ia invasión de vasos sanguíneos provenientes del pericondrio. Es entonces cuando las células del pericondrio empiezan a diferenciarse a osteoblastos, y a formar Ia estructura mineralizada denominada collar óseo (Karsenty y Wagner, 2002; Kronenberg, 2003).
Después de Ia invasión vascular, los condrocitos hipertróficos mueren por apoptosis y los osteoblastos empiezan a depositar Ia matriz extracelular ósea, consistente principalmente en colágeno tipo I. Los condrocitos se ven restringidos a Ia placa de crecimiento, donde junto con los osteoblastos, dirigirán el crecimiento longitudinal del hueso.
En Ia placa de crecimiento, los miembros de Ia familia FGF y sus receptores, principalmente el receptor 3 (FGFR3), regulan Ia proliferación y diferenciación de los condrocitos, inhibiendo el crecimiento del hueso. FGFR3 se expresa en los condrocitos proliferativos. Mutaciones de ganancia de función del Fgfr3 causan hipocondroplasia, acondroplasia y displasia tanatofórica, Ia variante más severa de Ia acondroplasia (Horton, 2006 y Heuertz y cois., 2006). La hipocondroplasia (HCH, OMIM 146000) es Ia forma más leve de este tipo de enanismos, causada en un 65% de los casos por Ia mutación N540K, en el dominio tirosina kinasa 1 del receptor (Bellus y cois., 1995 y Prinos y cois., 1995). La acondroplasia (ACH, OMIM 100800), debida en el 98% de los casos a Ia mutación G380R, en el dominio transmembrana del receptor, es Ia condrodisplasia más común en humanos (Rousseau y cois., 1994; Shiang y cois., 1994; Bellus y cois., 1995b). La displasia tanatofórica presenta un fenotipo letal y se han descrito dos variedades según diagnóstico radiológico: de tipo I y de tipo Il (TD I y TD II, OMIM 187600 y 187601 , respectivamente; Tavormina y cois., 1995). Existen modelos murinos que reproducen las patologías con mutaciones en las posiciones correspondientes (Naski y cois., 1998; Wang y cois., 1999; Chen y cois., 1999 y 2001 y Li y cois., 1999). En todos los casos, el fenotipo de acortamiento de los huesos largos es debido a una desorganización y acortamiento de las columnas de condrocitos proliferativos y por retraso en Ia diferenciación. Los defectos en los condrocitos proliferativos se deben a Ia activación de Stati , responsable de Ia inducción del inhibidor del ciclo celular p21 (Su y cois., 1997; Sahni y cois., 1999; Legeai- Mallet y cois., 2004) y el retraso en Ia diferenciación a Ia activación de Ia cascada de señalización de las MAPKs (Murakami y cois., 2004) provocando Ia reducción de Ia zona de condrocitos hipertróficos, tanto en modelos animales como en humanos. Por el contrario, Ia inactivación de Fgfr3 en ratón, causa un crecimiento endocondral prolongado, con el resultado de un fenotipo de "huesos largos", que va acompañado de una extensión de Ia zona de condrocitos proliferativos en Ia placa de crecimiento (Deng y cois., 1996 y Colvin y cois., 1996). Todos estos datos dan al FGFR3 un importante papel como regulador negativo de Ia proliferación de los condrocitos. Este papel inhibidor de Ia proliferación por parte de Ia vía FGF es único de los condrocitos (Wang y cois., 2001), y está mediado por el factor de transcripción STAT1 , que aumenta Ia expresión del inhibidor del ciclo celular p21 , responsable final de Ia parada de proliferación inducida por esta vía de señalización. Sus niveles pueden considerarse reflejo de Ia activación de Ia vía de señalización mediada por el FGFR3 en Ia placa de crecimiento. Cuando se clonó Snail de ratón (Nieto y cois., 1992) se observó que en día 12 del desarrollo embrionario del ratón, el sitio predominante de expresión de Snail era el pre-cartílago, incluyendo los correspondientes al esclerotomo de Ia cola, las pre-vértebras, las costillas, las extremidades y Ia cabeza. Sin embargo, a partir del día 14 de desarrollo, ya no hay expresión en el pre- cartílago en ninguno de estos sitios, excepto en las falanges distales de las extremidades posteriores, que son los únicos sitios en que sigue habiendo pre- cartílago en las patas a este estadio. Recientemente se ha descrito a SnaiM como un represor directo del colágeno tipo Il (Seki y cois., 2003), característico de condrocitos proliferativos, y que desaparece cuando éstos dejan de proliferar y diferencian a condrocitos hipertróficos, población celular que expresa colágeno tipo X. En un contexto completamente independiente, se observó que Ia presencia de Snail atenuaba Ia proliferación de células epiteliales en cultivo y cursaba con un aumento en los niveles de p21 y un aumento en Ia fosforilación de ERK1 y ERK2 (Vega y cois., 2004).
En resumen, las condrodisplasias humanas (que cursan con retardo e irregularidad en Ia formación del cartílago) y los modelos murinos generados para su estudio, se han asociado con mutaciones que generan mayor actividad del FGFR3, que provoca un retraso en Ia diferenciación y una parada de Ia proliferación de las poblaciones condrocíticas patológicos, impidiendo el correcto desarrollo óseo del individuo. Las aproximaciones terapéuticas para estas condrodisplasias en humanos son varias. Una quirúrgica, muy invasiva y de larga duración (Noonan y cois., 1999), el tratamiento con hormona de crecimiento (Hertel y cois., 2005; Seino y cois., 2000 y Ramaswami y cois., 1999) que resulta poco efectivo en Ia acondroplasia, agrava Ia desproporción entre el tronco y las extremidades y es muy costoso y Ia utilización del péptido natiurético CNP, inhibidor de Ia activación de las MAPKs mediada por los FGFs en Ia placa de crecimiento (Yasoda y cois., 2004) pero que no rescata los defectos de proliferación de los condrocitos.
Otras estrategias persiguen disminuir Ia actividad tirosina kinasa del receptor con agentes químicos o bloquear con anticuerpos Ia unión del ligando al FGFR3 (Aveizer y cois., 2003).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve Un objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia de Ia invención, basado en Ia identificación de Ia presencia de SnaiM en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas: a) identificación de Ia presencia de SnaiM , en una muestra biológica de origen óseo, y b) comparación de Ia presencia de SnaiM observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de Ia existencia de condrodisplasia.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de identificación y evaluación de Ia actividad de compuestos inhibidores de Ia proteína SnaiM útiles para el tratamiento de Ia condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de compuestos de Ia presente invención, que comprende los siguientes pasos: a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de SnaiM que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas, b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e c) identificación de un compuesto inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
Otro objeto de Ia invención Io constituye un sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación de compuestos de Ia presente invención, preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un primate no humano, donde Ia expresión de Ia proteína SnaiM es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular de dicho animal mamífero no humano de Ia presente invención Io constituye el ratón transgénico desarrollado en Ia invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo 2). Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM , en adelante uso de un compuesto inhibidor de Ia presente invención, en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario.
Por tanto, otro objeto particular de Ia invención Io constituye el uso de un compuesto inhibidor de SnaiM en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye Ia expresión del gen codificante de Ia proteína SnaiM humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , b) una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , c) un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , y e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM .
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante composición farmacéutica de Ia presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de Ia proteína SnaiM , junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de Ia invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso de Ia composición farmacéutica de Ia presente invención, consistente en Ia administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de condrodisplasia.
Descripción detallada La presente invención se basa en que los inventores han observado que el gen SnaiM transduce Ia señalización mediada por el receptor 3 de los FGF (FGFR3) responsable de condrodisplasias. Para determinar si el gen SnaiM puede ser responsable de esta vía de señalización, se estudiaron sus patrones de expresión relativos durante el desarrollo embrionario en ratones, cuando ocurren los distintos procesos en los que están implicados durante Ia formación del hueso maduro en ratones sanos (Ejemplo 1 ). Los datos muestran que los patrones de expresión son coincidentes en estadios embrionarios ya que el pico de expresión de SnaiM aparece en Ia población celular que expresa FGFR3. Estos datos son compatibles con que FGFR3 induce Ia expresión del gen SnaiM in vivo.
Además, se estudiaron los efectos de Ia activación patológica de SnaiM en el desarrollo óseo en ratones transgénicos con expresión inducible del gen SnaiM (Ejemplo 2). De esta forma se ha relacionado directamente Ia presencia de SnaiM con Ia parada de proliferación de condrocitos en ratones transgénicos en los que se ha activado SnaiM de manera artificial (ratón transgénico de Ia presente invención, ratón transgSnail1-ER), y al mismo tiempo se ha demostrado que Ia simple activación aberrante de SnaiM es suficiente para reproducir un fenotipo de condrodisplasia. El desarrollo y caracterización de este modelo animal, ratón transgSnail1-ER, permite Ia disponibilidad de modelos animales - este proceso de transgénesis puede ser trasladado por cualquier experto al desarrollo de otros animales mamíferos incluido primates, no humanos- en los que se pueden testar y caracterizar compuestos terapéuticos para el tratamiento de procesos condrodisplásicos veterinarios o humanos, y que hasta Ia fecha no existían.
Así, se observó que SnaiM reprime Ia proliferación celular in vivo, Io cual induce defectos morfológicos en Ia placa de crecimiento de estos huesos (huesos más cortos). Estos cambios aquí descritos son reminiscentes de los observados tras Ia inducción experimental de condrodisplasia en ratones modificados genéticamente que expresaban versiones mutadas de FGFR3 que suponen su activación constitutiva (Chen y cois., 1999 y 2001 ; Li y cois., 1999; Wang y cols., 1999). Igualmente, se ha relacionado a SnaiM con Ia vía de señalización del
FGFR3 mediante experimentos in vitro en cultivos primarios de condrocitos obtenidos a partir de hueso embrionario de ratón, demostrando que Ia señalización mediada por el FGFR3 activa Ia expresión de SnaiM (Ejemplo 3).
Por otro lado, en muestras de pacientes con condrodisplasia, se estudió Ia activación del gen SnaiM (Ejemplo 4). En este sentido, en un no-nato con displasia tanatofórica se confirmó Ia mutación en FGFR3 responsable de esta enfermedad (forma grave de condrodisplasia y de curso siempre letal). Se observó que esta mutación en FGFR3, que produce su actividad constitutiva, provoca una activación aberrante del gen SnaiM .
Finalmente, los experimentos de RNA de interferencia ("small interference", siRNA) realizados en cultivos primarios procedentes de hueso fetal de ratón, demostraron que impedir Ia función de SnaiM es suficiente para impedir Ia señalización mediada por el FGFR3 en condrocitos, revertiendo Ia parada de ciclo celular (medida por Ia expresión de p21) y Ia activación de Ia vía de las MAPKs (reconocida por Ia fosforilación de ERK1/2), incluso en presencia del FGFR3 constitutivamente activo (Ejemplo 3). Por tanto SnaiM es el mediador de Ia señalización de FGFR3. Estos polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita Ia integración de los mismos en las células de un paciente humano. Si Ia sola actividad desregulada de Snail en el cartílago embrionario es capaz de inducir acondroplasia, Ia presencia de SnaiM en etapas donde normalmente está reprimido podría considerarse un marcador del fenotipo acondroplásico del tipo de las asociadas al FGFR3 - acondrodroplasia (ACH), displasia tanatofórica (TD) e hipocondroplasia (HCH) - y, por tanto, utilizar su expresión aberrante como diagnóstico de cualquier fenotipo provocado por Ia ganancia de función del FGFR3. Por otro lado, si Ia activación de SnaiM es suficiente para inducir todas las características de las acondroplasias relacionadas con mutaciones que generan un aumento de actividad del FGFR3, es decir, que existe una relación directa -no sólo una asociación temporal- entre Ia actividad del gen SnaiM y Ia etiopatogenia de esta enfermedad, su inhibición, por ejemplo su inhibición génica, se convertiría en una forma de terapia anti-displásica y SnaiM podría ser de gran utilidad en Ia identificación de nuevos fármacos anti-condrodisplásicos. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos o agentes inhibidores de Ia actividad de dicha proteína SnaiM . De hecho, podrían aparecer casos de condrodisplasia de este tipo aun en ausencia de mutaciones en el FGFR3 y por Ia sola activación patológica de SnaiM durante el desarrollo del sistema cartílago-hueso.
Los experimentos de expresión de SnaiM en embriones de ratón demostraron que los niveles de expresión se correlacionan directamente con Ia gravedad del fenotipo acondroplásico de los ratones, Io cual indica que SnaiM se comporta como un factor de riesgo y confirma su importancia como posible diana de terapias anti-acondroplásicas (Ejemplo 4).
La presencia aberrante de SnaiM en el cartílago embrionario (en un momento en el cual, en condiciones normales, ya no ocurre) induce acondroplasia, de forma independiente de Ia señal que haya inducido esta presencia patológica de SnaiM . La inhibición de SnaiM por siRNA impide Ia parada de Ia proliferación de condrocitos y Ia fosforilación de las ERKs aún en presencia de actividad constitutiva de FGFR3. Por Io tanto, Ia inhibición de SnaiM en Ia placa de crecimiento impedirá los efectos de Ia ganancia de función del FGFR3 inducidos por cualquier mecanismo o las acondroplasias generadas por Ia presencia aberrante de SnaiM independientes el FGFR3. Por Io tanto, un objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia de Ia invención, basado en Ia identificación de Ia presencia de SnaiM en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas: a) identificación de Ia presencia de SnaiM , en una muestra biológica de origen óseo, y b) comparación de Ia presencia de SnaiM observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de Ia existencia de condrodisplasia. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "proceso de condrodisplasia" se refiere a una enfermedad con fenotipo condrodisplásico, preferentemente humana, en Ia que Ia acción biológica de SnaiM sea Ia causa de dicha enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 - como por ejemplo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica(TD) e hipocondroplasia (HCH) - o no. Esta identificación de SnaiM en una muestra biológica de origen veterinario o médico de animales o sujetos humanos puede ser extraída de los mismos y posteriormente ex vivo identificar sobre Ia misma Ia presencia o no SnaiM , que se correlacionaría con el diagnóstico de un proceso condrodisplásico en dicho sujeto, Io que permitiría Ia definición y Ia ejecución de una aproximación terapéutica, veterinaria o médica.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "gen SnaiM" o "proteína SnaiM" se refiere tanto al gen o proteína, de distinto origen animal, preferentemente humano, SnaiM (por ejemplo, SnaiM de ratón: SEQ ID NO1 y NO2, o humano: SEQ ID NO3, NO4, respectivamente), así como a cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aás.) análoga a éstas, respectivamente. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de nucleótidos o aminoácidos mostradas en Ia presente memoria, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos o aminoácidos conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, Ia adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos o aminoácidos en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a Ia secuencia de SnaiM de Ia invención, es decir, sea capaz de inducir condrodisplasia. En general, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. Un objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de Ia invención en el que Ia identificación de SnaiM de a) se refiere a Ia forma humana de SnaiM (hSnaiM , ya sea Ia identificación en forma de un transcrito génico (RNAm) o de Ia forma proteica del gen; SEQ ID NO 3 y 4). La realización de estos análisis de identificación de los niveles de expresión de SnaiM puede ser llevado a cabo por un experto medio del área de Ia biomedicina gracias a Ia información descrita en Ia presente invención y en el estado de Ia técnica por distintas técnicas (Sambrook y cois., 1989; Lambolez y Rossier, 2000; Egger y cois., 2000; FoIz y Nepluev, 2000 y Pfaffl, 2001 ). Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que Ia identificación de SnaiM , se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos de Ia proteína SnaiM , preferentemente hSnaiM (Franci y cois., 2006). Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que Ia identificación de SnaiM se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de SnaiM (ver Figura 1 ).
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que Ia identificación de SnaiM se lleva a cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de SnaiM (Ejemplo 3, Figura 4). Este procedimiento está basado en Ia extracción de RNA polyA+ de una muestra biológica de origen óseo y de un tejido control y Ia amplificación de Ia secuencia codificante de SnaiM con adecuados oligonucleótidos cebadores (Boutet y cois., 2006).
Por otro lado, este procedimiento de diagnóstico de condrodisplasia puede realizarse utilizándose a SnaiM como único marcador o de forma conjunta con otros marcadores de condrodisplasia, por ejemplo formando parte de un microarray de expresión biológica, ya sea en forma génica -a partir de RNAm- o en forma de proteína.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de identificación y evaluación de Ia actividad de compuestos inhibidores de Ia proteína SnaiM útiles para el tratamiento de Ia condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de compuestos de Ia presente invención, que comprende los siguientes pasos: a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de SnaiM que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas, b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e c) identificación de un compuesto inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el procedimiento de identificación de compuestos de Ia invención donde el sistema biológico del punto a) es un animal transgénico donde Ia expresión de Ia proteína SnaiM es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular del procedimiento de identificación de compuestos de Ia presente invención es aquella donde el animal transgénico es el ratón transgénico de Ia presente invención (Ejemplo 2, ratón transgSnail1-ER). Otro objeto de Ia invención Io constituye un sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación de compuestos de Ia presente invención, preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un primate no humano, donde Ia expresión de Ia proteína SnaiM es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular de dicho animal mamífero no humano de Ia presente invención Io constituye el ratón transgénico desarrollado en Ia invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo 2).
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM , en adelante uso de un compuesto inhibidor de Ia presente invención, en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con Ia proteína SnaiM (por ejemplo, SEQ ID NO2, SEQ ID NO4), o con fragmentos funcionales de Ia misma, disminuye o elimina Ia intensidad o Ia duración de Ia actividad biológica de dicha proteína. En esta definición se incluye además aquellos compuestos que impiden o disminuyen Ia expresión del gen codificante de Ia proteína Snail (por ejemplo, SEQ ID NO1 , SEQ ID NO3), es decir, que impiden o diminuyen Ia transcripción del gen, Ia maduración del RNAm, Ia traducción del RNAm y Ia modificación post- traduccional. Un agente inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimine el efecto y/o Ia función de Ia proteína SnaiM .
A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos antisentido específica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , o bien un polinucleótido que codifica una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , o bien un polinucleótido que codifica un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small interference RNA" o siRNA o un shRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM o bien un microRNA (miRNA).
Estos polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita Ia integración de los mismos en las células de un paciente humano. Este objetivo puede conseguirse mediante Ia administración a estas células óseas o de cartílago de una construcción génica que comprende uno de los polinucleótidos mencionados con el fin de transformar dichas células permitiendo su expresión en el interior de las mismas de manera que se inhiba Ia expresión de Ia proteína Snail. Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo Ia vehiculación de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales (Pfeifer y Verma, 2001 ) y su administración puede ser preparada por un experto en Ia materia en función de las necesidades y especificidades de cada caso. Por tanto, otro objeto particular de Ia invención Io constituye el uso de un compuesto inhibidor de SnaiM en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye Ia expresión del gen codificante de Ia proteína SnaiM humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , b) una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , c) un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , y e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM . Con anterioridad se han descrito e incluso protegido mediante patente oligonucleótidos antisentido (Patente US20060003956; Kajita y cois., 2004) y siRNAs que inhiben Ia expresión de SnaiM (Peinado y cois., 2005; Tripathi y cois., 2005). Cualquiera de estas secuencias de nucleótidos descritas en el estado del arte como inhibidoras de Ia expresión de SnaiM se incorporan como realizaciones de Ia presente invención como potenciales compuestos terapéuticos útiles para Ia fabricación de medicamentos para el tratamiento de un proceso condrodisplásico. Por otro lado, estas técnicas de inhibición génica, y más concretamente Ia vehiculización de los compuestos -oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptámeros- puede llevarse a cabo mediante el uso de liposomas, nanopartículas u otros vehiculizantes que incrementan el éxito de dicha transferencia al interior de Ia célula, preferentemente al núcleo celular (Lu y Woodle, 2005; Hawker y Wooley, 2005). En principio, pueden utilizarse inhibidores de Ia traducción del RNAm de SnaiM que se unen tanto a su región codificante como a Ia no codificante, por ejemplo frente a Ia zona 3' no codificante.
Así, una realización particular de Ia invención Io constituye el uso de un siRNA de d) en el que el RNAi se une preferentemente a Ia secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de Ia misma (Patente US20060003956; el uso de los siRNA descritos en esta patente americana se incorporan como realizaciones particulares dentro del alcance de Ia presente patente).
Otra realización particular de Ia invención Io constituye el uso de un RNAi de d) en el que el siRNA está constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO11 ), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO12),
- II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO13), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3'
(SEQ ID NO14), y
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO15), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO16). Las parejas I y Il se unen a Ia región codificante del RNAm de SnaiM , mientras que Ia pareja III se une a Ia zona 3' no codificante). Las tres parejas de secuencias de siRNA que se indican fueron activas, siendo Ia imagen presentada de inhibición de los niveles de SnaiM y p21 representativa de los resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs (Figura 5) ya sea por separado o en combinación.
Las secuencias de nucleótidos a)-e) mencionadas previamente impiden Ia expresión del gen en mRNA o del mRNA en Ia proteína SnaiM , y, por tanto, anulan su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un experto en el sector de ingeniería genética en función del conocimiento existente en el estado del arte sobre transgénesis y anulación de Ia expresión génica (Clarke, 2002; Patente US20020128220; Miyake y cois., 2000; Puerta-Ferández y cois., 2003; Kikuchi y cois., 2003; Reynolds y cois., 2004).
Por otro lado, el origen de estos compuestos inhibidores de Ia actividad de las proteínas Snail puede ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos eucariotas) o sintético. Otro objeto de Ia presente invención Io constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante composición farmacéutica de Ia presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de Ia proteína SnaiM , junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Una realización particular de Ia presente invención Io constituye una composición farmacéutica en Ia que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye Ia expresión del gen codificante de Ia proteína SnaiM humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , b) una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , c) un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de Ia proteína
SnaiM , y e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM .
Otra realización particular de Ia invención Io constituye Ia composición farmacéutica de Ia invención en Ia que el inhibidor de SnaiM es un siRNA que se une preferentemente a Ia secuencia fragmento del RNAm de SnaiM gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de Ia misma (Patente US20060003956; el uso de los siRNA descritos en esta patente americana se incorporan como realizaciones particulares dentro del alcance de Ia presente patente).
Otra realización particular de Ia invención Io constituye Ia composición farmacéutica de Ia invención en Ia que el inhibidor de Snail es un RNAi constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO11 ), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO12), - II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO13), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO14), y
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO15), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO16).
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia y utilizados habitualmente en Ia elaboración de composiciones terapéuticas. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del agente o compuesto inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM , calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo Ia edad, estado del paciente, Ia severidad de Ia alteración o trastorno, y de Ia ruta y frecuencia de administración.
En una realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de Ia composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para Ia obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en Faulí i Trillo, 1993.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de Ia invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso de Ia composición farmacéutica de Ia presente invención, consistente en Ia administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de condrodisplasia.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de Ia invención en el que el proceso de condrodisplasia causado por Ia acción biológica de SnaiM , se acompaña de una activación anómala del FGFR3, perteneciente a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
Finalmente, otro objeto particular de Ia invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de Ia invención en el que el proceso de condrodisplasia causado por Ia acción biológica de SnaiM no se acompaña de una activación anómala del FGFR3.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- SnaiM se expresa durante el desarrollo embrionario del hueso en las poblaciones implicadas en el crecimiento longitudinal del mismo.
Imágenes de secciones de huesos embrionarios en las que se ha detectado Ia presencia del RNAm de SnaiM de ratón mediante Ia técnica de hibridación in situ. En los paneles superiores (A-D) se muestra Ia expresión endógena del gen durante el desarrollo, primero en las condensaciones mesenquimáticas y posteriormente reducido a las poblaciones de condrocitos hipertróficos. En los paneles inferiores (E-I) se compara su patrón de expresión con el de moléculas marcadoras de poblaciones celulares, observando que SnaiM se expresa en el estadio de 18,5 días post-coito (dpc) en las poblaciones hipertróficas, el pericondrio y en los osteoblastos. (J, K) detalle de Ia placa de crecimiento de embriones de 18,5 dpc mostrando Ia expresión de SnaiM y de FGFR3. En esta y en las siguientes figuras, wt, ratón salvaje; tg, ratón transgénico con activación inducible de SnaiM ; -TAM, sin tamoxifeno; +TAM, con tamoxifeno. Figura 2.- Los huesos largos de los embriones que expresan SnaiM transgénico son más cortos. (A-D) tinción cartílago-hueso en Ia que se observa una reducción en Ia zona de cartílago (azul) a costa de las poblaciones de Ia placa de crecimiento en los huesos de los animales con activación de SnaiM inducida por Ia administración de Tamoxifeno. (E-H) secciones histológicas en las que se muestra que el acortamiento anteriormente descrito es a costa de poblaciones de condrocitos proliferativos.
Figura 3.- La presencia de SnaiM en Ia placa de crecimiento inhibe Ia proliferación celular. (A-D) inmunohistoquímica frente a PH3 para marcar células proliferando, dónde se puede observar una drástica disminución del número de células proliferativas en los ratones con expresión inducida de SnaiM . (E-H) en estos mismos ratones, Ia inmunohistoquímica frente a STAT1 revela un aumento en su activación (presencia nuclear de Ia proteína), que viene acompañado de un aumento en los niveles de RNAm de p21 (m). También se puede observar un detalle de Ia co-expresión endógena de STAT1 y SnaiM en condiciones normales en el hueso de ratón (I-L). Figura 4.- SnaiM es suficiente para Ia señalización del FGFR3 en el hueso. La activación de Ia señalización de FGFR3 en cultivos primarios de condrocitos (A-D) de ratón debida a Ia transfección de las versiones mutadas de FGFR3 representativas de las condrodisplasias humanas ACH y TDII K644E y G380R, respectivamente), induce Ia activación de SnaiM valorada mediante sus niveles de RNAm (E), que va acompañada de Ia activación de p21 (G), sin variaciones transcripcionales de STAT1 (F). Además, Ia sola activación de Snail por Ia adición de 4-OHT en estos cultivos (I), provoca Ia fosforilación de ERK1/2, y por tanto, Ia activación de Ia vía de las MAPKs, responsable del retraso en Ia diferenciación de los condrocitos, medible por el mantenimiento en los mismos de Ia expresión de Sox9 (H). Mock, cultivos primarios transfectados con el vector vacío; wt, cultivos primarios transfectados con el FGFR3 humano normal; K644E, cultivos primarios transfectados con el FGFR3 humano con Ia mutación K644E, responsable de Ia mayoría de las displasias tanatofóricas humanas, G380R, cultivos primarios transfectados con el FGFR3 humano con Ia mutación G380R.
Figura 5.- SnaiM es necesario para Ia señalización del FGFR3 en el hueso. Los efectos descritos en Ia Figura 4 se ven impedidos por el tratamiento de dichos cultivos con siRNA de SnaiM . Figura 6.- Los niveles de expresión de SnaiM se correlacionan con Ia gravedad del fenotipo acondroplásico de los ratones. Los fenotipos fueron divididos en tres grupos, bajo (25%, A, B, G), medio (60%, C, D, H) y alto (15%, E, F, I). La severidad del fenotipo está relacionada con los niveles de expresión de SnaiM . Figura 7.- La mutación del FGFR3 responsable de Ia displasia tanatofórica en humanos activa Ia expresión de SnaiM. Los niveles de RNAm de SnaiM están aumentados en cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave de Ia acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético (a). El feto tanatóforo presenta Ia mutación descrita como constitutivamente activa de dicho receptor (b). N, muestra obtenida de un feto sin problemas óseos; T, muestra obtenida de un feto con displasia tanatofórica.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1.- SnaiM se expresa durante el desarrollo embrionario del hueso en las poblaciones implicadas en el crecimiento longitudinal del mismo.
Se procedió a Ia detección de Ia presencia del RNAm de SnaiM en huesos embrionarios de ratón mediante Ia técnica de hibridación in situ. Los embriones de ratón procedieron de Ia cepa C57xCBA y sus edades, establecidas en días post-coitum (dpc) se determinaron considerando el día en el cual se ve el tapón vaginal como el día 0,5. Los huesos se disecaron a estadios comprendidos entre 12,5 dpc y 18,5 dpc respectivamente, se fijaron en paraformaldehido al 4 % en PBS/DEPC toda Ia noche. A continuación se embebieron en gelatina y cortaron con un vibratomo para obtener secciones de 50 m. Las ISH en secciones de gelatina se realizaron como se describe en Blanco y cois., 2002 utilizando las sondas de RNA marcadas con DIG-11-UTP. Después de Ia hibridación, las secciones se procesaron como se ha descrito en Cano y cois., 2000.
Así, se demostró que Ia expresión endógena del gen SnaiM tiene lugar durante el desarrollo, primero en las condensaciones mesenquimáticas y posteriormente reducido a las poblaciones de condrocitos hipertróficos, el pericondrio y en los osteoblastos (Figura 1).
Ejemplo 2.- Ratones transgénicos de Snail1-ER presentan alteraciones del crecimiento óseo
Se utilizó el plásmido pcDNA3-Snail1 correspondiente a Ia secuencia completa del cDNA de SnaiH de ratón insertada en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen; Cano y cois., 2000). pcDNA3-Snail-ER corresponde a Ia secuencia codificante de SnaiM unida a una versión mutada del dominio de unión al agonista del receptor de estrógeno humano que reconoce el ligando sintético 4- OH-Tamoxifeno (Locascio y cois., 2002).
El transgén Snail1-ER fue diseñado como fue descrito anteriormente (Locascio y cois., 2002) y se generó un ratón transgénico (ratón transgSnaiM- ER) para esta construcción según los procedimientos estándares (Hogan y cois., 1994). Para este estudio, se seleccionó una línea de animales cuya expresión de Ia proteína transgénica fue ubicua en el embrión. En este modelo, aunque Ia proteína Snail1-ER esté expresada constitutivamente, su función como factor de trascripción se desarrolla únicamente cuando se trasloca Ia proteína en el núcleo después del tratamiento con el tamoxifeno (Danielian y cois., 1998 y Feil y cois., 1996 y 1997). El transgén se detecta a partir del DNA procedente de Ia cola de los animales por PCR. La localización subcelular de Ia proteína fue analizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti- receptor de estrógeno humano. El mismo anticuerpo sirvió para valorar Ia cantidad de Ia proteína Snail1-ER en los distintos tejidos obtenidos de los ratones transgénicos por Western Blot. El tamoxifeno (Sigma) fue disuelto primero en etanol (10% del volumen final) y luego en aceite de maíz (Sigma) para tener una concentración final de 30 mg/ml. Se realizan dos inyecciones intraperitoneales consecutivas de tamoxifeno a días 12,5 y 14,5 dpc a hembras gestantes. La dosis utilizada fue de 75 g/g peso de Ia hembra (Hayashi y McMahon, 2002).
Posteriormente, y para llevar a cabo los experimentos de tinción de cartílago-hueso los embriones disecados y los ratones post-natales del ratón transgénico transgSnail1-ER se fijaron en formalina tamponada al 10% a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 días. Se evisceraron y se les quitó Ia piel. Se lavaron en agua entre 2 horas y 2 días, dependiendo del tamaño del ejemplar. Se tiñeron en una solución de azul alcian (Sigma A5268) durante 12-48 horas, para teñir los cartílagos. Después de lavar los especímenes en Etanol absoluto durante al menos dos días, se rehidrataron y se incubaron en tripsina (Sigma T4799) hasta Ia completa maceración del tejido. Se transfirieron a una solución de alizarina roja S (Sigma A5533) en KOH 0,5% hasta que los huesos aparecieron teñidos de rojo. Se lavaron los ejemplares en soluciones consecutivas de KOH 0,5%/glicerina 3:1 , 1 :1 y 1 :3, y se conservaron en glicerina pura.
El estudio de los huesos de embriones de los ratones transgénicos transgSnail1-ER permitió observar que éstos eran más cortos que los que no sobre-expresaban SnaiM (Figura 2), debido a una reducción en Ia zona de cartílago a costa de las poblaciones de condrocitos proliferativos. Además, Ia expresión de SnaiM se asoció a una inhibición de Ia proliferación de los condrocitos proliferativos y se acompañó de Ia translocación al núcleo de STAT1 y del aumento Ia expresión de p21 (Figura 3).
Para Ia realización de los ensayos de inmunohistoquímica se analizaron secciones de hueso. En detalle, las secciones fueron obtenidas por cortes en microtomo, se trataron durante 30 minutos en EDTA 1 mM a 1000C, con el fin de desenmascarar el antígeno. Después de retirar los restos de parafina e hidratar, se permeabilizaron durante 30 minutos en 0,5 % Tritón X-100 en PBS a temperatura ambiente y, posteriormente, se bloquearon durante 1 hora en 0,1 % Tween, 10 % FCS en PBS. Las preparaciones se incubaron con los anticuerpos primarios en 0,1 % Tween-20, 1 % FCS en PBS durante 16 horas a 40C y con los anticuerpos secundarios en 0,1 % Tween-20, 1 % FCS en PBS, 2 horas a temperatura ambiente. Las preparaciones se montaron con Mowiol y se conservaron protegidas de Ia luz a 40C hasta su visualización en un microscopio.
Los niveles de RNAm de p21 se analizaron mediante RT-PCR. En este sentido y en el resto de análisis de RNAm de Ia presente invención Ia PCR cuantitativa se realizó con una máquina de PCR cuantitativa ABI PRISM® 7000 siguiendo el método Syber Green®. Los niveles de expresión se calcularon según el método de Ia Ct, usando GAPDH como normalizador y los niveles del ratón salvaje sin ningún tratamiento ni transfección como calibrador. Para estos estudios se utilizaron las secuencias de cebadores (todas 5'-3'): mGapdh, CTGAGCAAGAGAGGCCCTATCC (SEQ ID NO5) y
CTCCCTAGGCCCCTCCTGTT (SEQ ID NO6); mP21, AGGAGCCAGGCCAAGATGGT (SEQ ID NO7) y
GCTTTGACACCCACGGTATTCA (SEQ ID NO8); mSnaiH, CCACACTGGTGAGAAGCCATTC (SEQ ID NO9) y
TCTTCACATCCGAGTGGGTTTG (SEQ ID NO10).
Ejemplo 3.- SnaiM es suficiente y necesario para Ia señalización del FGFR3 en condrocitos.
Los cultivos primarios de condrocitos se obtuvieron a partir de hueso de las patas traseras de embriones de 14,5 dpc de animales C57 que se disecaron en medio de cultivo ( -MEM, 1% BSA, 0,1 % L-Glutamina, 0,1 % penicilina/estreptomicina). Al día siguiente se tripsinizaron y se trataron con colagenasa en DMEM y 10% de suero. Se cultivaron en medio (50% F-12, 50% DMEM, 10% FCS, 0,1 % L-Glutamina, 0,1 % penicilina/estreptomicina) una densidad celular de 1 ,5.106 células/P100 (Woods and Beier, 2006). Después de cinco días en cultivo, se empezó Ia diferenciación con BMP-2 (Figura 4). La activación de FGFR3 en cultivos primarios de condrocitos de ratón con FGF indujo Ia activación de SnaiM valorada mediante el incremento de sus niveles de RNAm (Figura 4E), que fue acompañada de Ia activación de p21 (Figura 4G) y de Ia activación de Ia vía de señalización de las MAPKs, estando aumentados los niveles de fosforilación de ERK1/2 y los niveles de Sox9 (Figura 4H), que fueron medidos mediante Ia técnica de Western Blot; es más, Ia expresión de Ia forma muíante del FGFR3 provoca Ia expresión constitutiva de SnaiM , independientemente de Ia presencia de ligando (Figura 4E). La sola activación de Snail inducida por Ia administración de 4-OHT en cultivos primarios de condrocitos procedentes del ratón transgénico de Ia presente invención (ratón transgSnail1-ER), provoca Ia activación de Ia vía de señalización de las MAPKs, reconocida por el aumento de los niveles de fosforilación de ERK1/2 y los niveles de Sox9 (Figura 4H). Como ejemplo de procedimiento de control de los niveles de SnaiM -y de modelo de tratamiento de un proceso condrodisplásico- se realizó un ensayo de regulación de Ia expresión de SnaiM mediante siRNA específicos, observándose que dichos siRNAs impidieron Ia expresión de SnaiM y los aumentos en Ia expresión de p21 y Sox9 y en Ia fosforilación de ERK1/2 (Figura 5). Se utilizaron tres siRNAs diferentes, dos frente a secuencias de Ia zona codificante y uno frente a zona 3' no codificante, a fin de asegurarnos de Ia especificidad de los resultados. Las secuencias de estos siRNAs son:
- I (codificante): 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO11 ), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU
UCC G-3' (SEQ ID NO12),
- Il (codificante): 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO13), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO14), y - III (zona 3' no codificante): 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA
CUA A-3' (SEQ ID NO15), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO16).
Las tres parejas de secuencias de siRNA que se han indicado fueron activas, siendo Ia imagen presentada de inhibición de los niveles de SnaiM , p21 , Sox9 y de fosforilación de ERK1/2, representativa de los resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs (Figura 5) ya sea por separado o en combinación. Ejemplo 4.- Los niveles de expresión de SnaiH se correlacionan con Ia gravedad del fenotipo acondroplásico de los ratones. Los huesos de embriones de ratón de 18,5 dpc se obtuvieron tal y como se explica en el ejemplo 1. La localización subcelular de Ia proteína de fusión Snail1-ER se analizó según se explica en el ejemplo 2 y Ia tinción histológica de las muestras se llevó a cabo como se indica en el apartado correspondiente de materiales y métodos. Se observó que cuanto mayor era Ia presencia de proteína SnaiM activa en los huesos (Figura 6F, I), más agresivo era el fenotipo acondroplásico, con huesos más cortos y curvos (Figura 6E).
Ejemplo 5.- La mutación del FGFR3 responsable de Ia displasia tanatofórica en humanos activa Ia expresión de SnaiM . Los niveles de RNAm de SnaiM están aumentados en cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave de Ia acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético (Figura 7A). El feto tanatóforo presenta Ia mutación descrita como constitutivamente activa de dicho receptor (Figura 7B).
Materiales y Métodos
Tinción histológica. Las secciones se sumergieron en Hematoxilina (Harris Hematoxylin solution modified, Sigma HHS-16), durante 1 minuto, lavaron en agua del grifo, y posteriormente se sumergieron en Eosina (Eosin Y Counteratain Solution, 0,5% Aqueous, Sigma HT110-2-32), durante 30 segundos. Tras lavar en agua se deshidrataron de nuevo, se pasaron por Histoclear y se montaron con Depex (BDH Laboratoires) para ser analizadas en el microscopio óptico.
Análisis por Western Blot. Extracción de proteínas totales de los cultivos celulares. Se lavaron las células con PBS y se usaron con 150 I de tampón RIPA. Los usados se incubaron durante 30 minutos a 40C y se centrifugaron a 16.000 rpm durante 10 minutos, considerándose que el sobrenadante contenía todas las proteínas solubles. La concentración de los extractos se midió por el método de Bradford. Los sobrenadantes se mezclaron al 50% con 2X tampón de carga y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 8%. Transferencia. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en mini-transblot cell a 110 v durante 25 minutos. Mareaje con anticuerpos. Las membranas fueron bloqueadas con 3% de leche desnatada en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente incubadas con los anticuerpos primarios correspondientes diluidos en 3% de leche desnatada en TBS durante 16 horas a 40C. Después de lavar las membranas en TBS se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios correspondientes acoplados a peroxidasa. Después de lavar el exceso de anticuerpo, las membranas se revelaron por quimioluminiscencia y se expusieron en películas. Como control de carga se utilizó Ia proteína ERK-2 total.
Referencias
- Avizier D, Golembo M and Yayon A (2003) FGFR3 as a therapeutic target for achondroplasia genetic short limbed dwarfism. Curr. Drug Targets 4(5):353-365.
- Bellus, G. A., Hefferon, T. W., Ortiz de Luna, R. I., Hecht, J. T., Horton, W. A., Machado, M., Kaitila, I., Mclntosh, I., and Francomano, C. A. (1995). Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am. J. Hum. Genet. 56, 368-373.
- Bellus GA, Mcintosh I, Smith EA, Aylsworth AS, Kaitila I, Horton WA, Greenhaw GA, Hecht JT and Francomano CA (1995) A recurrent mutation in the tyrosine kinase domain of FGFR3 causes hypochondroplasia. Nat. Genet. 10: 357-359.
- Boutet A, De Frutos CA, Maxwell PH, Mayol MJ, Romero J and Nieto MA (2006) Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney. EMBO J. 25:5603-5613.
- Blanco MJ, Moreno-Bueno G, Sarrio D, Locascio A, Cano A, Palacios J and Nieto MA (2002) Correlation of Snail expression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas. Oncogene, 21 :3241-3246. - Cano A, Pérez-Moreno MA, Rodrigo I, Locascio A, Blanco MJ, del Barrio MG, Portillo and Nieto MA (2000) The transcription factor snail controls epithelial- mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat CeII Biol., 2:76-83. - Chen L, Adar R, Yang X, Monsonego EO, Li C, Hauschka PV, Yayon A and Deng CX (1999) Gly369Cys mutation in mouse FGFR3 causes achondroplasia by affecting both chondrogenesis and osteogenesis. J. Clin. Invest. 104(11): 1517-1525.
- Chen L, Li C, Qiao W, Xu X, Deng C (2001 ) A Ser(365)->Cys mutation of fibroblast growth factor receptor 3 in mouse downregulates Ihh/PTHrP signáis and causes severe achondroplasia. Hum Mol Genet 10, 457-65.
- Clarke, AR (2002) Transgenesis Techniques. Principies and Protocols, 2a Ed. Humana Press, Cardiff University.
- Colvin JS, Bohne BA, Harding GW, McEwen DG, Ornitz DM. (1996) Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nat
Genet., 12:390-397.
- Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH, Michael SK, McMahon AP (1998) Modification of gene activity in mouse embryos in útero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8(24), 1323-6. - Deng C, Wynshaw-Boris A, Zhou F, Kuo A, Leder P (1996) Fibroblast growth factor receptor 3 is a negative regulator of bone growth. CeII 84, 911-21.
- Eggert A, Brodeur GM, lkegaki N (2000) Relative quantitative RT-PCR protocol for TrkB expression in neuroblastoma using GAPD as an internal control. Biotechniques;28:681-682, 686, 688-691. - Faulí i Trillo C (1993) "Tratado de Farmacia Galénica", Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
- Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, D DM, Chambón P (1996) Ligand- activated site-especific recombination in mice. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 10887-10890. - Feil R, Wagner J, Metzger D, Chambón P (1997) Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem. Bioph. Res. Comm. 237, 752-757. - Franci C, Takkunen M, Dave N, Alameda F, Gómez S, Rodríguez R et al (2006) Expression of Snail protein in tumor-stroma interface. Oncogene,25:5134-5144.
- FoIz RJ and Nepluev I (2000) PoIy(A) cDNA-specific (PACS) RT-PCR: a quantitative method for the measurement of any poly(A)-containing mRNA not affected by contaminating genomic DNA. Biotechniques, 29, 762, 764-5, 766-8.
- Hawker CJ and Wooley KL (2005) The convergence of synthetic organic and polymeric chemistries. Science 19 (309): 1200-5.
- Hayashi S and McMahon AP (2002) Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev Biol, 244, 305-18.
- Hertel NT et al (2005) Groth hormone treatment in 35 prepubertal children with achondroplasia: a five-year dose-response trial. Acta Paediatr. 94(10): 1402- 1410. - Heuertz S, Le Merrer M, Zabel B, Wright M, Legeai-Mallet L, Cormier-Daire V, Gibbs L and Bonaventure J (2006) Novel FGFR3 mutations creating Cys residues in the extracellular domain of the receptor cause achondroplasia or severe forms of hypochondroplasia. Eur. J. Hum. Genet. 14(12):1240-1247.
- Hogan B, Beddington R, Constantini F, Lacy E (1994) 'Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual.' (CoId Spring Harbor Laboratory Press)
- Horton WA (2006) Recent milestones in achondroplasia research. Am. J. Medie. Res. 140A: 166-169.
- Kajita M, McCIinic KN, Wade PA (2004) Aberrant expression of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Mol CeII Biol. 24(17): 7559-66.
- Karsenty, G. and Wagner, E. F. 2002. Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development. Dev. CeII, 2, 389-406.
- Kikuchi K, Umehara T, Fukuda K, Hwang J, Kuno A, Hasegawa T and Nishikawa S (2003) RNA aptamers targeted to domain Il of Hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop región. J. Biochem. 133, 263-270.
- Kronenberg HM (2003) Developmental regulation of the growth píate. Nature 423: 332-336. - Lambolez B and Rossier J(2000) Quantitative RT-PCR. Nat Biotechnol, 18, 5.
- Legeai-Mallet L, Benost-Lasselin C, Munnich A and Bonaventure J (2004) Overexpression of FGFR3, Stat2, Statδ and p21 correlates with phenotypic severity and detective chondrocyte differentiation in FGFR-related chondro dysplasias. Bone, 34, 26-36.
- Li C, Chen L, Iwata T, Kitagawa M, Fu XY, Deng CX (1999) A Lys644Glu substitution in fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) causes dwarfism in mice by activation of STATs and ink4 cell cycle inhibitors. Hum Mol Genet 8, 35-44. - Locascio A, Vega S, de Frutos CA, Manzanares M, Nieto MA (2002) Biological potential of a functional human SNAIL retrogene. J Biol Chem 277, 38803-9.
- Lu PV and Woodle MC. In vivo application of RNA interference: from functional genomics to therapeutics. (2005) Adv Genet 54: 117-42.
- Miyake H, Chi and Gleave ME (2000) Antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides chemosensitize human androgen-independent PC-3 prostate cáncer cells both in vitro and in vivo. Clin Cáncer Res, 6, 1655-63.
- Murakami S, Balmes G, McKinney S, Zhang Z, Givol D and de Crombrugghe B (2004) Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Stati- independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fg/ir3-deficient mouse phenotype. Genes and Dev, 18: 290-305.
- Naski MC, Colvin JS, Coffin JD, Ornitz DM (1998) Repression of hedgehog signaling and BMP4 expression in growth píate cartilage by fibroblast growth factor receptor 3. Development, 125:4977-88.
- Nieto MA, Bennett MF, Sargent MG and Wilkinson DG (1992) Cloning and developmental expression of Sna, a murine homologue of the Drosophila snail gene. Development, 116 (1 ): 227 '-237 '.
- Noonan KJ, Leyes M, Forriol F, Canadell J. (1998) Distraction osteogenesis of the lower extremity with use of monolateral external fixation. A study of two hundred and sixty-one femora and tibiae. J Bone Joint Surg Am. 80:793-806. - Peinado H, Del Carmen Iglesias-de Ia Cruz M, Olmeda D, Csiszar K, Fong KS, Vega S, Nieto MA, Cano A, Portillo F (2005) A molecular role for lysyl oxidase- like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression. EMBO J.24(19): 3446- 58.
- Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real- time RT-PCR. Nucle Acids Res. 29, e45. - Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211.
- Puerta-Ferández E et al. (2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools. FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97.
- Prinos P, Costa T, Sommer A, Kilpatric MW and Tsipouras P (1995) A common FGFR3 gene mutation in hypochondroplasia. Hum. Mol. Genet.
4(11 ):2097-2101.
- Ramaswami U, Hindmarsh PC and Brook CG (1999) Growth hormone in hypochondroplasia. Acta Paediatr.Suppl.88: 116-117.
- Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS and Khvorova A (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22
(3): 326-330.
-Rousseau F, Bonaventure J, Legeai-Mallet L, Pelet A, Rozet JM, Maroteaux P, Le Merrer M, and Munnich A. (1994). Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia. Nature 371 , 252-254. - Sahni M, Ambrosetti D, Mansukhani A, Gertner R, Levy D and Basilico C (1999) FGF signalling inhibits chondrocyte proliferation and regulates bone development through the STAT1 pathway. Genes and Dev, 13: 1361-1366.
- Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N. Y
- Seino Y, Yamanaka Y, Shinohara M, lkegami S, Koike M, Miyazawa M, Inoue M, Morizake T and Tanaka H (2000)Growth hormone therapy in achondroplasia. Horm. Res. 53 Suppl 3:53-56.
- Seki K, Fujimori T, Savagner P, Hata A, Aikawa T, Ogata N, Nabeshima Y and Kaechoong L 2003. Mouse Snail family transcription repressors regúlate chondrocyte, extracellular matrix, type Il collagen, and aggrecan. J Biol Chem, 278, 41862-70. - Shiang R, Thompson LM, Zhu YZ, Church DM, Fielder TJ, Bocian M, Winokur ST and Wasmuth JJ (1994). Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia. CeII 78, 335-342. - Su W, Kitagawa M, Xue N, Xie B, Garofalo S, Cho J, Deng C, Horton WA and Fu X (1997) Activation of Stati by mutant FGFR in thanatophoric dysplasia type Il dwarfism. Nature 386, 288-292.
- Tavormina PL, Shiang R, Thompson LM, Zhu YZ, Wilkin DJ, Lachman RS, Wilcox WR, Rimoin DL, Cohn DH and Wasmuth JJ (1995). Thanatophoric dysplasia (types I and II) caused by distinct mutations in fibroblast growth factor receptor 3. Nat. Genet. 9, 321-328.
- Tripathi MK, Misra S, Chaudhuri G (2005) Negative regulation of the expressions of cytokeratins 8 and 19 by SLUG repressor protein in human breast cells. Biochem Biophys Res Commun. 329(2): 508-15. - Vega S, Morales AV, Ocaña O, Valdés F, Fabregat I and Nieto MA. (2004) Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death. Genes Dev. 118:1131-1143.
- Wang Y, Spatz MK, Kannan K, Hayk H, Avivi A, Gorivodsky M, Pines M, Yayon A, Lonai P and Givol D (1999) A mouse model for acondroplasia produced by targeting FGFR3. PNAS 96(8):4455-4460.
- Wang Q, Green RP, Zhao G and Ornitz DM (2001) Differential regulation of endochondral bone growth and join development by FGFR1 and FGFR3 tyrosine kinase domains. Development, 128 (19): 3867-3876.
- Woods A and Beier F (2006) RhoA/ROCK signalling regulates chondrogenesis in a context-dependent manner. J Biol. Chem, 281 : 13134-13140.
- Yasoda A, Komatsu Y, Chusho H, Miyazawa T, Ozasa A, Miura M, Kurihara T, Rogi T, Tanaka S, Suda M, Tamura N, Ogawa Y and Nakao K. (2004) Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia thorugh a MAPK-dependent pathway. Nat Med. 10 (1 ):80-86. - Patente US20020128220, Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter.

Claims

REIVINDICACIONES
1 .- Procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia caracterizado porque se basa en Ia identificación de Ia presencia aberrante de SnaiM en una muestra biológica y porque comprende al menos una de las siguientes etapas: a) identificación de Ia presencia de SnaiM , en una muestra biológica de origen óseo de un mamífero, preferentemente un ser humano, y b) comparación de Ia presencia de SnaiM observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de Ia existencia de condrodisplasia.
2.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 1 caracterizado porque el proceso de condrodisplasia es una enfermedad con fenotipo condrodisplásico de tipo enanismo en Ia que Ia acción biológica de SnaiM sea Ia causa de dicha enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 o no.
3.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 2 caracterizado porque Ia enfermedad pertenece al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
4.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 1 caracterizado porque Ia identificación de SnaiM se refiere tanto al gen o proteína, de distinto origen animal, preferentemente humano, SnaiM .
5.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 4 caracterizado porque SnaiM es el gen o proteína SnaiM de ratón de secuencia SEQ ID NO1 y NO2, respectivamente.
6.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 4 caracterizado porque SnaiM es el gen o proteína SnaiM humana de secuencia SEQ ID NO3 y NO4, respectivamente.
7.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 1 caracterizado porque Ia identificación de SnaiM de a) se refiere a Ia forma humana de SnaiM , ya sea Ia identificación en forma de un transcrito génico (RNAm) o de Ia forma proteica del gen, de secuencias SEQ ID NO 3 y 4.
8.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 7 caracterizado porque Ia identificación de SnaiM se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos, ya sean monoclonales o policlonales, de Ia proteína hSnaiM .
9.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 7 caracterizado porque Ia identificación de SnaiM se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de dicho gen.
10.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 7 caracterizado porque Ia identificación de SnaiM se lleva a cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de dicho gen.
11.- Procedimiento de identificación y evaluación de Ia actividad de compuestos inhibidores de Ia proteína SnaiM útiles para el tratamiento de Ia condrodisplasia caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de SnaiM que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas, b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e c) identificación de un compuesto inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
12.- Procedimiento de identificación y evaluación según Ia reivindicación 11 caracterizado porque el sistema biológico de a) es un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y, más preferentemente, un primate no humano, donde Ia expresión de Ia proteína SnaiM es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia.
13.- Procedimiento de identificación y evaluación según Ia reivindicación 12 caracterizado porque el animal transgénico utilizado es el ratón transgénico transgSnail1-ER.
14.- Sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación y evaluación según las reivindicaciones 11 a Ia 13 caracterizado porque es un animal transgénico preferentemente un mamífero, y, más preferentemente, un primate no humano, donde Ia expresión de Ia proteína SnaiM es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia.
15.- Sistema biológico según Ia reivindicación 14 caracterizado porque dicho animal mamífero no humano Io constituye el ratón transgénico transgSnail1-ER.
16.- Uso de un compuesto o agente inhibidor de Ia actividad de Ia proteína SnaiM en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario.
17.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 16 caracterizado porque es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye Ia expresión del gen codificante de Ia proteína SnaiM humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , b) una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , c) un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , y e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM .
18.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 17 caracterizado porque el siRNA de d) es un RNAi que se une preferentemente a Ia secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de Ia misma.
19.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 17 caracterizado porque el RNAi de d) es un siRNA constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
- I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO11 ), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO12), - II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO13), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO14), y
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO15), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3'
(SEQ ID NO16).
20.- Composición farmacéutica o medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de Ia proteína SnaiM , junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
21.- Composición farmacéutica según Ia reivindicación 20 caracterizada porque el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye Ia expresión del gen codificante de Ia proteína Snail humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de Ia secuencia del gen o del mRNA de Ia proteína SnaiM , b) una ribozima específica del mRNA de Ia proteína SnaiM , c) un aptámero específico del mRNA de Ia proteína SnaiM , d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de Ia proteína
SnaiM , y e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de Ia proteína SnaiM .
22.- Composición farmacéutica según Ia reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) se une preferentemente a Ia secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO17) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de Ia misma.
23.- Composición farmacéutica según Ia reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) es un RNAi constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo: - I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO11 ), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO12), - II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO13), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO14), y
- III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO15), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3'
(SEQ ID NO16).
24.- Uso de Ia composición farmacéutica según las reivindicaciones 20 a Ia 23 en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por un proceso condrodisplásico, consistente en Ia administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de condrodisplasia.
25.- Uso de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 24 caracterizado porque el proceso de condrodisplasia causado por Ia acción biológica de SnaiM se acompaña o equivale a una activación anómala del FGFR3, que pertenece al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
26.- Uso de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 24 caracterizado porque el proceso de condrodisplasia causado por Ia acción biológica de SnaiM no se acompaña de una activación anómala del FGFR3.
PCT/ES2008/070042 2007-03-08 2008-03-07 Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicacione WO2008107508A1 (es)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586482A (zh) * 2012-02-27 2012-07-18 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 高致病性猪繁殖与呼吸征病毒nasba-elisa检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020128220A1 (en) 1999-02-26 2002-09-12 Martin Gleave TRPM-2 antisense therapy
WO2004065602A1 (es) * 2003-01-17 2004-08-05 Universidad Autónoma de Madrid Procedimiento para identificar la transición epitelio-mesenquimal de células mesoteliales (temcm) e identificar compuestos moduladores de temcm, composiciones farmacéuticas y su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con temcm
US20060003956A1 (en) 2004-03-03 2006-01-05 Casadome David O Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter
WO2007082967A1 (es) * 2006-01-19 2007-07-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail en la elaboración de composiciones farmacéuticas, procedimiento de identificación de dichos compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplica

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1636388A2 (en) * 2003-06-06 2006-03-22 Wyeth Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
ES2427046T3 (es) * 2004-06-21 2013-10-28 Galapagos N.V. Métodos y medios para el tratamiento de la osteoartritis
JPWO2006006477A1 (ja) * 2004-07-09 2008-04-24 国立大学法人三重大学 骨疾患又は関節疾患に関与するポリペプチド及びそのｄｎａ
JP2009502159A (ja) * 2005-07-28 2009-01-29 オンコステム ファルマ ソシエダッド リミタード ガン成長ならびにｄｎａ損傷に基づく疾患のマーカーとしてのスネイルの段階的発現

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020128220A1 (en) 1999-02-26 2002-09-12 Martin Gleave TRPM-2 antisense therapy
WO2004065602A1 (es) * 2003-01-17 2004-08-05 Universidad Autónoma de Madrid Procedimiento para identificar la transición epitelio-mesenquimal de células mesoteliales (temcm) e identificar compuestos moduladores de temcm, composiciones farmacéuticas y su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con temcm
US20060003956A1 (en) 2004-03-03 2006-01-05 Casadome David O Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter
WO2007082967A1 (es) * 2006-01-19 2007-07-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Un procedimiento de identificación de un proceso de fibrosis renal, uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail en la elaboración de composiciones farmacéuticas, procedimiento de identificación de dichos compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplica

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUTET A. ET AL.: "Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney''.", THE EMBO JOURNAL ., vol. 25, no. 23, 2006, pages 5603 - 5613, XP008118001 *
See also references of EP2133432A4 *
SEKI K. ET AL.: "Mouse Snail Family Transcriptions Repressors Regulate Chondrocyte, Extracellular Matrix, Type II Collagen, and Aggrecan''.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 274, no. 43, 2003, pages 41862 - 41870, XP008118100 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586482A (zh) * 2012-02-27 2012-07-18 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 高致病性猪繁殖与呼吸征病毒nasba-elisa检测试剂盒

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