JP7272676B2 - 尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法及びその使用 - Google Patents
尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7272676B2 JP7272676B2 JP2020558010A JP2020558010A JP7272676B2 JP 7272676 B2 JP7272676 B2 JP 7272676B2 JP 2020558010 A JP2020558010 A JP 2020558010A JP 2020558010 A JP2020558010 A JP 2020558010A JP 7272676 B2 JP7272676 B2 JP 7272676B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urothelial
- cells
- cell
- tumor
- bladder
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0685—Bladder epithelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
補助免疫療法またはすべての肉眼で見える膀胱腫瘍(TURBT)の経尿道的切除術後の化学療法によって治療されるが、再発率は依然として高い[7]。高リスクの表在性膀胱癌の再発を治療するためにマイコバクテリウム・ボビスの弱毒化形態の生菌を使用する嚢内BCG免疫療法は、何十年にもわたって標準的な治療アプローチである[8]。BCGの嚢内注入の正確な抗腫瘍メカニズムは不明であるが、CD4 T細胞浸潤の誘導など、様々な局所的免疫応答が数ヶ月間持続し、腫瘍抑制効果と相関していると考えられ得る[9,10]。生きた細菌が導入されるため、BCGにより重度の膀胱炎が引き起こされ得、BCG敗血症による死亡さえ引き起こし得る[9]。さらに、根治的膀胱切除術及び全身化学療法を行う筋肉浸潤性膀胱癌(MIBC)の場合、これらの膀胱癌患者の少なくとも50%は、依然として診断から2年以内に転移により死亡する[2]。さらに悪いことに、化学療法による治療は、転移性膀胱癌患者の5年生存率が10%未満の患者の95%において奏功しない[2]。その理由は、すべての治療法が癌細胞を終結させ、同時に正常細胞に損傷を与え、炎症を刺激するため、癌細胞がより悪い形態であっても成長して元の状態に戻る機会をもたらすためであり得る。米国では、膀胱癌の再発率が高いため、患者1名あたりの費用は96,000~187,000ドル(診断から死亡まで、すべての癌の中で最も高い)に達し[11]、2010年の推定費用は39.8億ドルであった[12]。これらの負担は、膀胱癌に対する現在の治療法(手術、免疫療法、及び化学療法)が不適格であるためである。膀胱炎または膀胱の炎症は、膀胱及び/または尿管の粘膜表面の炎症を誘発する化学的、生物学的または物理的刺激によって引き起こされる[13]。膀胱炎の患者は、切迫感、少量の頻尿、及び排尿による痛みを伴う灼熱感を経験し得る。さらに、患者は恥骨上痛、脇腹痛または背中痛も受け得る。膀胱炎のこれらの症状は、生活の質に深刻な悪影響を有する。膀胱炎には、出血性膀胱炎(HC)など、いくつかの主要な種類が存在する。この種類の膀胱炎は、高用量の化学療法を受ける癌患者([14]など)によく見られ、重症の場合は、致命的となり得る。化学療法誘発性膀胱炎では、HCは、シクロホスファミドの肝代謝物であるアクロレインの尿中排泄によって引き起こされ、結果として、進行性粘膜損傷となる。さらに、放射線療法による前立腺癌または子宮頸癌などの骨盤新生物の治療中の電離放射線もまた、尿粘膜を損傷させることによって出血性膀胱炎となり得る。しかし、膀胱炎に対して現在利用可能な治療法は、効果的ではあるが、部分的な解決策であり、緩和をもたらすのみであり、したがって、最適な治療アプローチはない。
PUCの単離及び培養
尿路上皮細胞を単離するためのブタ膀胱は、地元の食肉処理場から入手した。膀胱組織を1~2cm2の組織片に解剖し、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS;Gibco、Carlsbad、CA、USA)に溶解したディスパーゼIIで治療して、尿路上皮を剥取した。剥取した尿路上皮を細分化し、HBSS(100U/ml)中のVI型コラゲナーゼ(Worthington,Lakewood,NJ,USA)を含む細胞分離溶液でインキュベートして、細胞の解凝集を行った。ブタ上皮細胞を単離し、抗生物質(ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100mg/ml、アンホテリシンB5mg/ml)、10%ウシ胎児血清(FBS)、成長因子、またはシグナル伝達経路の阻害剤を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/ハムF12培地を含むマトリゲル(登録商標)コーティングディッシュで培養した。継代2~10の細胞を実験に使用した。
雌のC3H/HeJ9週齢のマウスは、Lasco(Taipei、Taiwan)から得た。化学的損傷誘発性膀胱炎を誘発するために、マウスに、300mg/kgのCPP(Cayman,Ann Arbor,MI,USA)を含む100mlのPBS溶液を腹腔内注射した。CPP誘発性膀胱炎マウスは、ランダムに2つの群(溶媒治療対照及びCPP注射の4時間後のPUC治療群)に分けた。溶媒治療群には、マウスに溶媒の膀胱内注入を行い、PUC治療群には、106個の細胞(継代1~継代5)を膀胱に膀胱内注入した。簡潔に述べると、カテーテルチューブを尿道を介して膀胱に導入し、シリンジを使用して溶媒またはPUC細胞を膀胱に注入し、50分間放置して、PUC細胞を付着させた。治療20時間後にすべてのマウスを安楽死させ、膀胱を迅速に除去して、体重を量り、10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定させた。組織を縦方向に切断し、通常はパラフィンに包埋し、切片化し、組織病理学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。尿路上皮の完全性を評価するために、尿路上皮グリコサミノグリカン(GAG)層のアルシアンブルー染色も行った。浮腫スコアは、膀胱炎の重症度を反映するように各膀胱の切片を調べることによって決定した。スコアは次のとおり決定した:0=浮腫の明らかな兆候はない;1=固有層の拡大が正常サイズの2倍未満である軽度の浮腫;2=正常と比較して、固有層サイズの2倍である中等度の浮腫;3=正常と比較して、固有層サイズが3倍である中等度の浮腫;4=固有層の重度の浮腫、及び排尿筋の固有層の拡大が正常サイズの3倍以上である。動物プロトコルは、China Medical Universityのinstitutional IACUC committeeによって承認された。
雌のC3H/HeJ 9週齢マウスを使用して、壁内同所性モデルを確立した。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するMBT-2マウス尿路上皮癌細胞(MBT-2-luc)をマウス膀胱壁に筋肉内注射し、Xenogen IVIS200によって画像化した腫瘍を週に1回捕捉した。生物発光イメージングで、腫瘍が総フラックス約1x105p/sに達したときに、マウスを対照群及び実験群に分ける。担腫瘍マウスは、4つの治療群に分けた:(i)溶媒対照、(ii)異種尿路上皮細胞:異種尿路上皮細胞(1x106細胞)の膀胱内注入、週に1回、3日目から4週間、(iii)ゲムシタビン及びシスプラチン(GC)の化学療法:ゲムシタビン(6mg/マウス、1日目及びシスプラチン(0.12mg/マウス、2日目)の腹腔内注射(IP)を週に1回、4週間及び(iv)併用治療。すべてのマウス実験は、China Medical UniversityのInstitutional Animal Care and Use Committees (IACUC) review boardによって承認された。正常な異種尿路上皮細胞の膀胱内注入では、サブコンフルエントな細胞がトリプシン処理され、トリパンブルー排除法によって、90%を超える細胞生存率が確認される。雌のC3Hマウスは、イソフルランで麻酔する。腹部に軽度の圧力を加えることによって、膀胱から尿を排出させる。24ゲージのカテーテルは、尿道内を通して膀胱の内腔に導入させる。次に、1x106異種尿路上皮細胞を含む100μlの懸濁液を膀胱に注入する。異種尿路上皮細胞の排出を防ぐために、注射シリンジを取り付けた状態でカテーテルを少なくとも40分間所定の位置に保持する。マウスが麻酔から回復する前に、カテーテルを抜去する。マウスの応答は、ベースラインからのBLI総フラックス強度の変化について分析する。次に、マウスの無憎悪生存率(腫瘍体積が20%増加)及び全生存率(死亡時またはヒトのエンドポイント:13匹の動物が重篤な罹患の兆候を呈する)をすべて、カプランマイヤー法によって分析する。
BBN誘発膀胱腫瘍を形成するために、濃度0.05%のBBN(TCI America,Portland,OR)を飲料水に溶解させ、膀胱腫瘍形成の兆候として、血尿スコアが2+(Arkray Aution Sticks尿試験紙)を超えるまで、暗色ボトルに入ったBBN含有水を8~10週齢の雌C57BL/6マウスに10~20週間自由に与えた。BBN誘発腫瘍担持マウスは、MBT-2-luc腫瘍担持マウスにおける実験スキームに従って治療した。治療後、膀胱を採取し、秤量し、組織学的検査を行った。結果は、6つの独立した実験からプールした。病理学的評価は、膀胱のH&E染色パラフィン切片で実施し、以下のとおり定義した;過形成、浸潤のない上皮肥厚;上皮内癌(CIS)、上皮層に限定された癌細胞;浸潤、粘膜下層または筋層への癌細胞の浸潤。すべてのマウス実験は、China Medical UniversityのInstitutional Animal Care and Use Committees(IACUC) review boardによって承認された。
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA-SE)増殖アッセイの場合、異なる治療を行ったMBT-2-luc担腫瘍マウスの脾臓のリンパ球を、5μMCFDA-SE(Thermo Fisher Scientific,C1157,USA)を含むPBSと共に暗所で15分間インキュベートし、次いで洗浄した。アッセイは、1x105の標的異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞を脾臓由来の5x105のCFDA-SE標識リンパ球(E/T比5:1)と2日間共培養することによって実施した。リンパ球中のCFDA-SE蛍光の強度を測定し、リンパ球は、FACSCaliburフローサイトメータ(BD Biosciences)を使用して測定し、FlowJoソフトウェアで分析した。
標的異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞をCFDA-SEで標識し、24時間プレーティングし、エフェクター/標的(E:T)比=10で異なる治療を行った14のマウスの脾臓から単離させたエフェクターリンパ球と共培養した。4時間のインキュベーション後、エフェクター細胞を除去し、残っている付着性のCFDA-SE標識標的細胞の蛍光強度を蛍光光度計で測定した。エフェクター細胞を共培養しないCFDA-SE標識標的細胞の強度をベースラインとして設定した。異なる治療のマウスからのエフェクターリンパ球の相対的な細胞毒性活性は、3つのサンプルから以下の式(1)を用いて算出し、パーセンテージとして表した。
異なる治療群のマウスから除去したMBT-2-luc腫瘍は、ホルマリンで固定し、パラフィン包理し、パラフィン切片は、自動Leica Bond III-autostainerを使用して、標準的な製造業者の手順により、抗CD4(GTX85525、GeneTex)、CD8(GTX53126、GeneTex、及び抗NKG2D(bs-0938R、Bioss))で染色した。DABを適用してインキュベートし、抗体染色のシグナルを視覚化した。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。染色陽性細胞の計数は、腫瘍切片の4つのランダムな高倍率視野x400倍率で行い、視野あたりの平均細胞数として表わした。
MBT-2-luc腫瘍切片を使用してDNA断片化を検出した。アポトーシス細胞におけるDNA断片化は、製造業者のプロトコルに従って、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)媒介dUTPニックエンド標識(TUNEL)によって検出した。(TUNEL BrightGreenアポトーシス検出キット、Vazyme Biotec,Nanjing,Jiangsu,China)。すべての画像は、CCDカメラが取り付けられている顕微鏡(Nikon Eclipse 80i)を使用して得た。
標的異種細胞またはMBT-2-luc細胞の2日間の共培養によって刺激された、異なる治療群のMBT-2-luc腫瘍担持マウスから単離されたエフェクターリンパ球の培養培地中のIFN-γレベルを、製造業者のプロトコルに従って酵素結合免疫吸着測定キット(BioLegend)を用いて評価した。共培養したエフェクター細胞は、ベースライン対照として機能させた。共培養された標的細胞によって刺激されたエフェクター細胞の相対的なIFN-γ活性化は、以下の式(2)のように算出した:
統計分析は、PASW Statistics18を使用して実施した。グラフは平均値±平均の標準誤差を表す。P値は、2つの群を比較するためのスチューデントのt検定を使用して算出した。生存分析は、ログランク検定によって決定した。P<0.05は、統計的に有意であると見なした。
膀胱内細胞療法のためのバイオミメティック培養法を用いて尿路上皮細胞を単離し、増殖させるための例示的なプロトコルを例解した概略グラフを図1Aに示し、異種尿路上皮細胞を膀胱炎または尿路上皮癌を有する膀胱に注入することによる膀胱内細胞療法に関する本発明の好ましい実施形態の概略図を図1Bに示す。
治療仮説を検証するために、尿路上皮細胞をブタ膀胱尿路上皮から単離し、増殖させた。継代1及び5でのPUCの画像を図2A及び2Bに示した。尿路上皮幹/前駆細胞マーカー:サイトケラチンタンパク質であり、尿路上皮幹/前駆細胞内で共発現するCK5及びCK14を使用して、増殖したPUCの特徴を明らかにした。PUCのウエスタンブロッティングアッセイ(図2C)及び免疫蛍光染色(図2D)により、CK5及びCK14の両方がPUC細胞で発現していることが明らかになった。次に、培地及び環境の異なる成分で培養することにより、UPCの増殖能をさらに調べる。これらの結果は、PUCをマトリゲル(登録商標)コーティングプレート上で培養したときに、増殖倍率が増加することを示した。さらに、マトリゲル(登録商標)コーティングプレート上で培養し、FBS、bFGF、及びY27632で治療された細胞は、最も高い増殖能を示した(図3)。
出血性膀胱炎に対するPUCの膀胱内注入の治療効果を実証するために、CPP誘発性膀胱炎マウスモデルは、尿路上皮損傷及び出血性膀胱炎の動物モデルとして広く使用されている。CPPを注射した雌マウスを2つの群に分け、対照群は溶媒対照を受け、治療群はCPP注射の4時間後に106のPUCを受け、実験のため、CPP注射24時間後にすべてのマウスを屠殺した。溶媒治療対照と比較して、これらの結果は、PUC膀胱内治療により、膀胱出血、鬱血及び体重の減少を伴う、CPP注射によって引き起こされた損傷が救済されたことを示した(図4A及び4B)。さらに、膀胱HE染色切片の組織学的分析では、PUC治療群において、固有層の浮腫がより少なく、剥離がより少ないことが観察されたことも示された(図4C及び4D)。これらの結果は、PUCの膀胱内投与により、有害な化学物質による攻撃から尿路上皮を保護して、尿路上皮の損傷を減少させることができることを示唆している。
尿路上皮におけるKi-67陽性細胞の割合は、CPP注射の24時間後、溶媒治療群と比較してPUC治療群で有意に低かった(図5A及び5B)。このことは、PUCによって基底尿路上皮細胞における損傷誘発性増殖が減少したことを示唆している。CPPによって得た細胞損傷に対するPUCの膀胱内注入の効果を評価するために、TUNELアッセイを使用して、CPPによって引き起こされたアポトーシス細胞を検出した。これらの結果は、CPP誘発アポトーシス細胞が尿路上皮の尿路上皮細胞及び固有層内の間質細胞の両方で観察されたが、PUC膀胱内治療により、溶媒対照と比較してアポトーシス細胞を著しく減少させたことを示した(図5C)。アルシアンブルー染色は、CPP治療によって影響を受けた尿路上皮の完全性を調べるために実施した。これらの結果は、GAGの表層がPUC治療群では保持されていたが、溶媒対照群では存在しないことを示した(図5D)。これらの結果は、PUC膀胱内治療が、CPP誘発性細胞の増殖及び細胞アポトーシスを減少させ、かつ尿路上皮の完全性を維持したことを示した。
同所性MBT-2-luc移植尿路上皮膀胱腫瘍マウスモデルを使用して、治療法として、及び標準的な細胞毒性化学療法と組み合わせて、異種尿路上皮細胞に対する抗腫瘍効果の有効性を評価した。実験スキームを図6Aに示した。これらの結果では、溶媒治療群と比較して、すべての異種尿路上皮細胞、GC、または組み合わせ治療群において、腫瘍成長が有意に減少したことを示した(図6B)。さらに、無増悪生存期間(図6C)及び全生存期間(図6D)が延長された。異種尿路上皮細胞またはその組み合わせで治療された場合は、無増悪生存期間でそれぞれ約30%及び40%の持続的応答を示し、全生存期間でそれぞれ45%及び60%を示した。異種尿路上皮細胞免疫療法またはゲムシタビン及びシスプラチンの化学療法単独では抗腫瘍活性を有するが、異種細胞免疫療法及びGC化学療法の両方で治療されたマウスは、無増悪生存及び全生存において有意な延長を呈し、併用治療では、最も高い生存を有する。無増悪生存及び全生存の両方における異種細胞治療では、すべて曲線の裾が上昇しており、このことは、化学療法よりも異種細胞免疫療法により、より効果が持続することを示唆している。
さらに、異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化学療法、及び併用治療の抗腫瘍効果を実証するために、腫瘍を固定し、Ki-67 IHC染色及びTUNELアッセイのために切片化して、それぞれ細胞増殖及び細胞死を決定した。これらの結果は、すべての治療群において、Ki-67陽性腫瘍細胞が未治療の対照よりも少ないことを示した。さらに、増殖性腫瘍細胞は、併用治療群で最も低かった(図7A及び7B)。それとは対照に、TUNELアッセイの結果は、すべての治療群、特に併用治療群において、腫瘍組織のアポトーシス細胞の増加を呈した。単一の異種尿路上皮細胞免疫療法または化学療法との併用治療に関係なく、腫瘍細胞死を誘発する効果は化学療法よりも良好であった(図7C及び7D)。
腫瘍内免疫細胞組成物に対する異なる治療の影響を評価するために、腫瘍へのT細胞及びNK細胞の浸潤を分析した。腫瘍T細胞浸潤(CD4+及びCD8+エフェクターT細胞)は、異種尿路上皮細胞免疫療法、GC治療、及び併用療法(図8A及び8B)において増加しており、このことは、効果的な免疫療法であることを反映している。定量化の結果は、溶媒治療群腫瘍と比較して、単一及び組み合わせ治療群からの異種尿路上皮細胞治療腫瘍が、エフェクターCD4+T細胞(図8D)、CD4+T細胞(図8E)及びNKG2D+NK細胞(図8F)の腫瘍への浸潤の有意な増加を有することが見出されたことを示した。しかし、NK細胞浸潤の増加は、GC治療単独群の腫瘍では観察されなかった(図8C及び8F)。
腫瘍進行の遅延における化学療法剤と組み合わせた膀胱内異種細胞療法の抗腫瘍効果を試験するために、過形成、上皮内癌(CIS)から浸潤癌までのヒト膀胱腫瘍形成をシミュレートするBBN誘発腫瘍マウスモデルを使用した。BBN誘発膀胱腫瘍担持マウスを4つの治療群に分けた:(i)溶媒対照、(ii)異種尿路上皮細胞:異種尿路上皮細胞の膀胱内注入(1x106細胞)、週に1回、3日目から4週間、(iii)ゲムシタビン及びシスプラチン(GC)化学療法:ゲムシタビン(6mg/マウス、1日目)及びシスプラチン(0.12mg/マウス、2日目)の腹腔内注射(IP)を週に1回、4週間、及び(iv)併用治療。治療群及び対照群におけるBBN誘発膀胱腫瘍の進行は、採取した膀胱の肉眼的及び組織病理学的検査によって評価した。実験スキームを図9Aに示した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞膀胱内免疫療法、GC治療単独または化学療法の組み合わせにより、腫瘍重量が有意に減少したことを示した。さらに、併用治療により、腫瘍重量の最大の減少を得た(図9B及び9C)。この肉眼による差異と一致して、組織病理学的分析ではまた、異種細胞、GC治療群、及び併用療法において浸潤性癌に進行したマウスの割合が有意に低いことを示した(図9D及び9E)。
異種細胞免疫療法の仮説では、異種拒絶による免疫応答を誘発し、副次的に抗腫瘍免疫応答を増加させ得る。異種細胞により治療されたマウスから単離されたT細胞が、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA-SE)ベースの増殖アッセイを使用した混合リンパ球反応(MLR)によって、異種尿路上皮細胞または膀胱腫瘍細胞と共培養されたときに増強された増殖応答を呈することができるかどうかを調べるために、最初に、リンパ球を、異なる治療法によるMBT-2-luc腫瘍を有するマウスの脾臓から単離し、次にCFDA-SEで標識した。標識されたCFDA-SEリンパ球は、付着した異種尿路上皮細胞または腫瘍細胞(エフェクター/標的細胞比5:1)と2日間共培養した。その後、リンパ球を採取し、フローサイトメトリー分析によって分析して、CFDA-SE蛍光の強度を測定した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞との共培養によって刺激されたエフェクターリンパ球が、異種尿路上皮細胞により治療されたマウスのリンパ球の増殖割合(CFDA-SE低)が、溶媒対照で治療されたマウスよりも高いことを示し、このことは、異種尿路上皮細胞により治療されたマウスが、異種細胞に対する免疫応答を発現したことを示唆している(図10A及び10B)。さらに、異種尿路上皮細胞で治療されたマウスのエフェクターリンパ球も、MBT-2-luc膀胱腫瘍細胞で刺激された場合、より高い増殖率を示した(図10C及び10D)。リンパ球増殖の増加は、併用治療マウスでも見られ、このことは、異種尿路上皮細胞治療が、移植された異種尿路上皮細胞及び腫瘍細胞の両方に対して、担腫瘍マウスにおいて免疫応答を誘発することを示唆している。
免疫細胞における抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすエフェクターサイトカイン(IFNγ)の産生を評価した。異なる治療法を受けた担腫瘍マウスの脾臓から単離されたリンパ球を、異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞のいずれかと共培養し、次に、共培養馴化培地において、IFN-γ活性化を決定した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞または腫瘍MBT-2-luc細胞と共培養しても、IFNγ活性化は、異種尿路上皮細胞免疫療法単独及び化学療法との併用治療の両方において、単離されたリンパ球においてより高かったことを示した(図11A及び11B)。これらの治療によるエフェクターサイトカイン産生の増加は、エフェクター細胞の増殖の変化と相関しており、異種尿路上皮細胞の移植がエフェクター細胞機能を調節することを示唆している。それにもかかわらず、マウスでの抗腫瘍応答のための異種尿路上皮細胞誘発性細胞活性化に関与するエフェクター細胞亜集団を決定する必要がある。より多くのT細胞がエフェクター特性を呈したことは、異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞でのin vitroでの再刺激時に、対照治療マウスよりも、T細胞の増殖及びIFN-γの産生がより活性化されたことによって確認された。異種尿路上皮細胞免疫療法がT細胞の細胞毒性活性機能に影響を与え得るかを実証するために、免疫エフェクター細胞媒介の標的細胞の細胞毒性アッセイを実施した。異なる治療の脾臓から単離したエフェクターリンパ球は、異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞であるCFDA-SE標識標的細胞と共培養し、残りのCFDA-SE標識細胞の蛍光強度を測定することによって、T細胞の細胞毒性活性機能を検出した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞のいずれかに対する最も高い細胞毒性活性が、併用治療を受けたマウスの群で認められたことを示した。異種尿路上皮細胞治療では、細胞毒性細胞の有意な活性化を有し、また、GC治療では、異種尿路上皮細胞またはMBT-2-luc細胞の両方を標的とするために、細胞毒性を増加させた(図11C~F)。
Claims (13)
- ヒトを除く哺乳動物源の尿路上皮細胞を培養するための方法であって、前記方法は、前記ヒトを除く哺乳動物源から膀胱組織のサンプルを得ることと;(a)膀胱組織の前記サンプルの粘膜層から尿路上皮を解離することと;(b)膀胱組織の前記サンプルから解離した尿路上皮細胞を単離することと;(c)前記解離した尿路上皮細胞をマトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地に植えることと;(d)前記解離した尿路上皮細胞を前記マトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地で培養することと、を含み、前記解離した尿路上皮細胞は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞、それらの前駆細胞及び成熟細胞を含み、前記マトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地はFBS(ウシ胎児血清)、bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)及びY27632(ROCK阻害剤)を含む、方法。
- 前記ヒトを除く哺乳動物源が、ブタ、ウシ、またはウマの供給源から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記マトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地が、抗生物質及び/または抗真菌剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地が、BMP阻害剤、及び/またはWNT活性化因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マトリゲル(登録商標)コーティングされた培養培地が、細胞外マトリックス分子及び多糖類を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記尿路上皮幹細胞または前記尿路上皮前駆細胞の細胞集団を維持するために、前記解離した尿路上皮細胞を、有効量の成長因子、細胞外マトリックス分子、多糖類、及びシグナル伝達経路モジュレータと接触させることと、前記前駆細胞の細胞集団を増幅して、総細胞数を増加させることと、をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記前駆細胞が、CK5/14+尿路上皮幹細胞、CK5/14+尿路上皮前駆細胞、尿路上皮前駆細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 膀胱炎を患っているヒトを除く対象を治療する薬物を製造するための異種尿路上皮細胞を含む組成物の使用であって、前記異種尿路上皮細胞が、尿路上皮幹細胞、尿路上皮始原細胞、尿路上皮前駆細胞、及び成熟尿路上皮細胞を含み、前記治療は膀胱内細胞療法である、使用。
- 尿路上皮癌または膀胱癌に罹患しているヒトを除く対象を治療する薬物を製造するための異種尿路上皮細胞を含む組成物の使用であって、前記異種尿路上皮細胞が、尿路上皮幹細胞、尿路上皮始原細胞、尿路上皮前駆細胞、及び成熟尿路上皮細胞を含み、前記治療は膀胱内細胞療法である、使用。
- 前記異種尿路上皮細胞が、ブタ、ウシ、ウマの供給源または他のヒトを除く哺乳動物源から選択される、請求項8または9に記載の使用。
- 1つ以上の化学療法薬と組み合わせて、前記異種尿路上皮細胞を含む組成物の有効量を前記ヒトを除く対象に膀胱内投与する、請求項9に記載の使用。
- 前記1つ以上の化学療法薬が、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗薬、アロマターゼ阻害剤、P-糖タンパク質阻害剤及び白金複合体誘導体からなる群から選択される、請求項11に記載の使用。
- 腫瘍増殖が抑制され、腫瘍細胞死が増加する、請求項9に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862671404P | 2018-05-14 | 2018-05-14 | |
US62/671,404 | 2018-05-14 | ||
PCT/CN2019/086782 WO2019218995A1 (en) | 2018-05-14 | 2019-05-14 | Method for biomimetic culture of urothelial cells and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022501006A JP2022501006A (ja) | 2022-01-06 |
JP7272676B2 true JP7272676B2 (ja) | 2023-05-12 |
Family
ID=68540866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020558010A Active JP7272676B2 (ja) | 2018-05-14 | 2019-05-14 | 尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法及びその使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11891628B2 (ja) |
JP (1) | JP7272676B2 (ja) |
CN (1) | CN112105717A (ja) |
TW (1) | TW202003836A (ja) |
WO (1) | WO2019218995A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7122200B2 (en) * | 2000-12-08 | 2006-10-17 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Vitro engineered, regenerated urinary tract tissue compositions and methods for producing same |
CN1638640A (zh) * | 2002-02-12 | 2005-07-13 | 雷文生物技术公司 | 人胎儿膀胱来源的上皮细胞 |
GB201111244D0 (en) * | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
-
2019
- 2019-05-13 TW TW108116427A patent/TW202003836A/zh unknown
- 2019-05-14 US US17/053,667 patent/US11891628B2/en active Active
- 2019-05-14 JP JP2020558010A patent/JP7272676B2/ja active Active
- 2019-05-14 WO PCT/CN2019/086782 patent/WO2019218995A1/en active Application Filing
- 2019-05-14 CN CN201980031532.2A patent/CN112105717A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Am.J.Physiol.Renal Physiol.,2005,289(2),p.F459-F468 |
Cancer Cell Int.,2018-JAN,18:9,p.1-7 |
Inflamm.Regen.,2017,37:3,p.1-7 |
PLoS One,2014,26;9(2),e90006,p.1-12 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022501006A (ja) | 2022-01-06 |
US11891628B2 (en) | 2024-02-06 |
WO2019218995A9 (en) | 2020-08-20 |
WO2019218995A1 (en) | 2019-11-21 |
US20210095255A1 (en) | 2021-04-01 |
TW202003836A (zh) | 2020-01-16 |
CN112105717A (zh) | 2020-12-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6544726B2 (ja) | 大腸上皮幹細胞の単離・培養技術と、これを用いた大腸上皮移植技術 | |
KR102493376B1 (ko) | 청력 손실의 치료를 위해 내이 털세포를 생성하기 위한 조성물, 시스템, 및 방법 | |
KR102656200B1 (ko) | 혈관 오가노이드, 상기 오가노이드의 제조 및 사용 방법 | |
CN109689052A (zh) | 使用GSK-3-α抑制剂的受控增殖干细胞/产生内耳毛细胞的方法 | |
JP2022532926A (ja) | 幹細胞/前駆体の固形器官へのパッチ移植 | |
Wen et al. | Myeloid cell-derived HB-EGF drives tissue recovery after pancreatitis | |
TW202200786A (zh) | 自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法 | |
JP2015134769A (ja) | ヒト胚性幹細胞の微小環境を使用して腫瘍細胞の悪性度を抑制する方法 | |
JP2019507609A (ja) | WNTおよびTGF−β阻害を用いる、前庭幹細胞の制御された増殖/内耳有毛細胞の発生のための方法 | |
TWI772790B (zh) | 前驅調節滋胚內層細胞及其用途 | |
Marchildon et al. | CCAAT/enhancer binding protein beta protects muscle satellite cells from apoptosis after injury and in cancer cachexia | |
Chen et al. | Transformation of SOX9+ cells by Pten deletion synergizes with steatotic liver injury to drive development of hepatocellular and cholangiocarcinoma | |
JP2010506897A (ja) | 脂肪貯蔵と関連した障害を治療する方法 | |
US20150272992A1 (en) | Treatment of Tumors with Activated Mesenchymal Stem Cells | |
JP7272676B2 (ja) | 尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法及びその使用 | |
Balcioglu et al. | CRIPTO antagonist ALK4 L75A-Fc inhibits breast cancer cell plasticity and adaptation to stress | |
Ortega‐Ribera et al. | The hepatic sinusoid in aging and disease: update and advances from the 20th liver sinusoid meeting | |
Ferreira | The Interplay Between Adipose Tissue and Renal Cell Carcinoma: Decoding the Obesity Paradox | |
EP3269732A1 (en) | Therapeutic medium for the treatment of cancer | |
Bertaux-Skeirik | The Role of CD44 Variant Isoforms in Gastric Regeneration and Disease | |
US20210062155A1 (en) | Method for producing insulin-producing cells | |
Wang | Studies of Novel Factors from Fetal Mesenchymal Stem Cell and Their Applications in Bone and Cartilage Repair | |
Ahmed et al. | Collaboration of Epithelial Mesenchymal Transition and Cancer Stem Cells: Sinister Routes for Chemoresistant Recurrent Ovarian Cancer | |
Swidenbank | The role of the CXCR4-CXCL12 chemokine axis in melanoma metastasis to the normal and fibrotic liver | |
WO2008107508A1 (es) | Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de snail1 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificacion de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicacione |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201130 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210525 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220524 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20220613 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20220617 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20220613 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220823 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230303 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230328 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230420 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7272676 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |