TWI772790B - 前驅調節滋胚內層細胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示活體外所生成的前驅調節滋胚內層細胞以及它們的組成物。本發明亦揭示藉由使用本發明所揭示的細胞來治療一障礙或病況的方法。

Description

前驅調節滋胚內層細胞及其用途

本件申請案主張於2019年5月6日提申的美國臨時申請案第62/843,925號的利益，該申請案以其整體被併入本案以作為參考資料。

對於用來治療各種不同疾病或病況的新穎幹細胞療法以作為一種克服現有胚胎幹細胞和iPS細胞一些缺點的替代方法，存在有需求。

發明概要

全部公開案、專利案以及專利申請案在此以參考相同範圍而被併入，如同各個個別的公開案、專利案或專利申請案被特定地以及個別地指明要被併入以作為參考資料。如果此處的一術語與一被併入的參考資料中的一術語之間發生一衝突，此處的術語支配。

於本發明的此概要中所提供的發明具體例僅被意欲為例示性以及提供此處所揭示的選擇性具體例的一概述。本發明的概要，是例示性以及選擇性的，未限制任何申請專利範圍的範疇，未提供此處所揭示或所預期的發明具體例的全部範疇，以及不應被解讀為限制或束縛此揭示內容或任何所請求的發明具體例的範疇。

在一些方面中，此處所揭示的是一種經分離的前驅調節滋胚內層細胞(precursory regulatory cytotrophoblast,prCTB)，其中(i)該prCTB表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(beta-hormone human chorionic gonadotropin,β-hCG)、人類白血球抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)、CD56、胰島素(insulin)、熱休克蛋白(heat shock protein 90,HSP90)、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(interleukin 15,IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1,LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2,LILRB2)、T細胞受體(T cell receptor,TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL4,KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子 (FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(ii)該prCTB表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(glutamate decarboxylase,GAD65)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、可溶性-CD40配位子(sCD40L)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(B cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1,BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(myeloid cell leukemia sequence 1,Mcl-1)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該prCTB表現CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8，或者它們的任何組合。

在一些方面中，此處所揭示的是一種經分離之包含有前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的細胞族群，其中：(i)該細胞族群表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、人類白血球抗原G(HLA-G)、CD56、胰島素、熱休克蛋白(HSP90)、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(ii)該細胞族群表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休 克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40配位子(sCD40L)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合。

在一些情況下，至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs。在一些情況下，至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs。在一些情況下，至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs。在一些情況下，至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs。

在一些方面中，此處所揭示的是一種經分離之包含有前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的細胞族群，其中：(i)至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs；(ii)至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs；(iii)至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs；或(iv)至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs，或者它們的任何組合。

在一些情況下，(i)至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs；(ii)至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs；(iii)至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs；以及(iv)至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs。在一些情況下，該細胞族群所包含有之至少約2%的族群是表現CD16、CD56和CD107的prCTBs。在一些情況下，該prCTB或複數個prCTBs表現介白素15(IL-15)。 在一些情況下，該prCTB或複數個prCTBs表現似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該prCTB或複數個prCTBs進一步表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、可溶性人類白血球抗原G(sHLA-G)、轉變生長因子β1(transformation growth factor β1,TGF-β1)、胞漿素原活化子抑制劑1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、介白素10(IL-10)、CD105、CD146，或者它們的任何組合。在一些情況下，該prCTB或複數個prCTBs缺乏合胞素(syncytin)、計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)或者它們的組合之表現。在一些情況下，該prCTB或複數個prCTBs分泌一趨化因子(chemokine)、一細胞激素(cytokine)、一生長因子(growth factor)或者它們的任何組合，或者一攜帶一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體(exosome)。在一些情況下，該細胞激素包含有趨化因子(C-C要素)配位子5(CCL5)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1,MCP-3)、趨化因子(C-X-C要素)配位子1(CXCL1)、趨化因子(C-X-C要素)配位子2(CXCL2)、趨化因子(C-C要素)配位子11(CCL11)、趨化因子(C-C要素)配位子24(CCL24)、趨化因子(C-C要素)配位子26(CCL26)、趨化因子(C-C要素)配位子22(CCL22)、趨化因子(C-X-C要素)配位子10(CXCL10)、fractalkine、趨化因子(C-C要素)配位子4(CCL4)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該細胞激素包含有介白素1α(IL-1α)、介白素1β(IL-1β)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素4(IL-4)、介白素6(IL-6)、介白素7(IL-7)、介白素8(IL-8)、介白素10(IL-10)、介白素12p40(IL-12p40)、介白素13(IL-13)、介白素15(IL-15)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該細胞激素包含有干擾素α(interferon α,IFN-α)或干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)。在一些情況下，該生長因子包含有血小板-衍生的生長因子同源二聚體AA(platelet-derived growth factor homodimer AA,PDGF-AA)、PDGF同源二聚體BB(PDGF-BB)、PDGF異二聚體AB(PDGF heterodimer,PDGF-AB)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、顆粒球-巨噬細胞群落-刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、纖 維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族蛋白、似FMS-酪氨酸激酶3配位子(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)、可溶性CD40配位子(sCD40L)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)、介白素1β(IL-1β)，或者它們的任何組合。在一些情況下，藉由免疫墨點法(immunoblotting)所測得，相較於活體外(in vitro)分化成經分離的prCTB之祖細胞，該prCTB或複數個prCTBs具有較高之經活化的轉錄信號傳遞子和活化子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些情況下，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞(progenitor cell)，該prCTB具有至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、5、8、10倍高之經活化的信號傳遞子和活化子3(STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些情況下，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞(progenitor cell)，該prCTB表現至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、5、8、10倍高之SOX2蛋白的位準。在一些情況下，該經分離的prCTB是活體外分化自一絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞，其缺乏下列表現：麩胺酸脫羧酶(GAD65)、Ki67、熱休克蛋白70(HSP70)、p53、可溶性CD40-配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該經分離的prCTB是活體外 分化自一絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞，以及其中該絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞和該經分離的prCTB這兩者均表現熱休克蛋白90(HSP90)。在一些情況下，該經分離的prCTB是人類細胞。在一些情況下，該經分離的prCTB是源自於囓齒動物、兔子、牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或猿。在一些情況下，該經分離的prCTBs是經基因工程的。在一些情況下，該經分離的prCTBs包含有一編碼下列的外源性聚核苷酸：一細胞受體、一免疫學檢查點蛋白、一細胞激素，或者它們的任何組合。在一些情況下，該經分離的prCTBs包含有一編碼下列的外源性聚核苷酸(exogenous polynucleotide)：一T細胞受體(T cell receptor,TCR)、一B細胞受體(B cell receptor,BCR)、一嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)，或者它們的任何組合。

在一些方面中，此處所揭示的是一種藥學組成物，其包含有：一藥學上可接受的賦形劑或載體；以及如此處所描述的prCTB或細胞族群。

在一些方面中，此處所揭示的是一種用於治療一疾病或病況的方法，包含對一有此需要的個體投藥如此處所描述的prCTB或細胞族群。

在一些情況下，該方法殺死帶有抗原的目標細胞。在一些情況下，該帶有抗原的目標細胞是癌細胞。在一些情況下，該 癌細胞包含有膀胱癌細胞、骨癌細胞、腦癌細胞、乳腺癌細胞、子宮頸癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃腸道癌細胞、造血系統惡性組織、頭頸部鱗狀細胞癌細胞、白血病、肝癌細胞、肺癌細胞、淋巴瘤、骨髓瘤細胞、鼻癌細胞、鼻咽癌細胞、口腔癌細胞、口咽癌細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、肉瘤細胞、胃癌細胞、黑色素瘤細胞、甲狀腺癌細胞，或者它們的任何組合。在一些情況下，該帶有抗原的目標細胞是一病原體。在一些情況下，該病原體包含有病毒、細菌、原生動物、普里昂蛋白質(prion)、真菌，或者它們的任何組合。在一些情況下，該方法殺死帶有抗原的目標細胞總數的至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約50%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%。在一些情況下，該方法向下調節一發炎途徑。在一些情況下，該方法治療一包含下列的疾病或病況：移植排斥(transplant rejection)、感染(infection)、與感染相關的內毒素性休克(endotoxic shock associated with infection)、關節炎(arthritis)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、全身性幼年型特發性關節炎(juvenile idiopathic arthritis,JIA)、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、氣喘(asthma)、骨盆腔炎症(pelvic inflammatory disease)、阿茲海默氏症 (Alzheimer's Disease)、克隆氏症(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、大腸性激躁症(irritable bowel syndrome)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、皮肌炎(dermatomyositis)、葡萄膜炎(uveitis)、佩羅尼氏症(Peyronie's Disease)、腹腔疾病(coeliac disease)、膽囊疾病(gallbladder disease)、藏毛疾病(Pilonidal disease)、腹膜炎(peritonitis)、牛皮癬(psoriasis)、血管炎(vasculitis)、外科手術沾粘(surgical adhesions)、中風(stroke)、第I型糖尿病(Type I diabetes)、萊姆關節炎(lyme arthritis)、腦膜炎(meningoencephalitis)、免疫媒介之中樞和周邊神經系統的發炎疾病(immune mediated inflammatory disorders of the central and peripheral nervous system)、胰腺炎(pancreatitis)、外科手術創傷(trauma from surgery)、移植物-抗-宿主的疾病(graft-versus-host disease)、心臟病(heart disease)、骨質分解(bone resorption)、燒傷患者(burns patients)、心肌梗塞(myocardial infarction)、柏哲德氏症(Paget's disease)、骨質疏鬆(osteoporosis)、敗血症(sepsis)、肝或肺纖維化(liver or lung fibrosis)、牙周炎(periodontitis)，或者胃酸過多(hypochlorhydria)。在一些情況下，該方法治療自體免疫疾病(autoimmune disease)。在一些情況下，該方法治療第I型糖尿病 (Type I diabetes)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)、修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)、硬皮症(scleroderma)、多發性肌炎(polymyositis)、慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、混合性結締組織病(mixed connective tissue disease)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、惡性貧血(pernicious anemia)、自體免疫甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis)、特發性艾迪生氏病(idiopathic Addison's disease)、白斑症(vitiligo)、麩質敏感性腸疾(gluten-sensitive enteropathy)、葛瑞夫茲氏症(Graves' disease)、重症肌無力(myasthenia gravis)、自體免疫性嗜中性白血球缺乏症(autoimmune neutropenia)、特發性血小板減少性紫斑(idiopathic thrombocytopenia purpura)、類風濕關節炎(rheumatoid arthritis)、肝硬化(cirrhosis)、尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris)、自體免疫性不育症(autoimmune infertility)、古德巴斯捷氏症(Goodpasture's disease)、類天皰瘡(bullous pemphigoid)、盤狀性狼瘡(discoid lupus)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、緻密物沉積病(dense deposit disease)、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease)，或者牛皮癬(psoriasis)。在一些情況下，該方法治療第I型糖尿病。在一些情況下，該方法緩解移植排斥。

此處所揭示的是一種組成物，其包含有包括一胞外體的分泌蛋白體(secretome)，其中該分泌蛋白體包含有或分泌蛋白體攜帶有：一趨化因子、一細胞激素如：一介白素、一生長因子或者它們的任何組合，以及一藥學上或化妝品上可接受的賦形劑，而其中該組成物不含有細胞。

在一些情況下，該分泌體包含有或外泌體帶有：(i)一趨化因子，其包含有CXCL2、MCP-1、Fractalkine、IP-10、MCP-3、伊紅趨素(Eotaxin)、MIP-1β，或者它們的任何組合；(ii)一介白素，其包含有IL-6、IL-8、IL-4、IL-1RA、IL-10、IL-12P40、IL-15、IL-1α、IL-17A，或者它們的任何組合；以及(iii)一生長因子，其包含有PDGF-AA、VEGF、bFGF、G-CSF、Flt-3L、GM-CSF，或者它們的任何組合。在一些情況下，其包含有MCP-1，以及下列的一者、二者、三者或全部：CXCL2、IL-6、IL-8以及VEGF蛋白。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：1至大約2：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約3：1至大約4：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為大約2：1至大約3：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為大約3：1至大約4：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為大約4：1至大約6：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF 的重量比為大約4：1至大約6：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為大約7：1至大約9：1。在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA，而其中MCP-1和PDGF-AA是以大約3：1至大約5：1的重量比而存在。在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA，而其中MCP-1和PDGF-AA是以大約6：1至大約9：1的重量比而存在。在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA和G-CSF。在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA和FGF-2(bFGF)。在一些情況下，該組成物進一步包含有下列蛋白質中的一或多者：IP-10、伊紅趨素、Flt-3L、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1b、IL-1a、IL-1RA、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12P40、IL-13、IL-15、IL-17A、CCL5(RANTES)、MDC、MCP-3、IL-12P70、IFNa、IFNr、PDGF-AB/BB，或者EGF。

在一些方面中，此處所揭示的是一種用於調節皮膚狀況的方法，其包含對一有此需要的個體投藥如此處所描述的組成物。

在一些情況下，該方法治療一疾病或提供一化妝品應用。在一些情況下，該方法使皮膚緊緻。在一些情況下，該方法滋潤皮膚。在一些情況下，該方法使皮膚回春。在一些情況下，該組成物不含有幹細胞。在一些情況下，該組成物被局部地、皮下地、經皮地、肌肉內地或腫瘤內投藥給該個體。在一些情況下，該組成 物是呈下列的劑型：乳液、霜劑、液體、凝膠、乳液、懸浮液、糊劑、棒劑、氣溶膠、泡沫、貼劑、粉末、軟膏、珠粒、面膜、墊、片、傷口敷料、繃帶，或者它們的任何組合。在一些情況下，該個體是哺乳動物。在一些情況下，該個體是靈長類動物。在一些情況下，該個體是人類。

在一些方面中，此處所揭示的是一種用於獲得前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的方法，其包含：藉由令幹細胞與纖維母細胞生長因子與一含有下列的培養基接觸，來使多能幹細胞於活體外分化：核苷酸、L-麩醯胺酸(L-glutamine)、含L-麩醯胺酸的二肽(dipeptide)、血小板溶胞產物(platelet lysate)，或者它們的任何組合。

在一些情況下，該培養基包含有核苷酸、二肽，以及血小板溶胞產物。在一些情況下，該培養基包含有約2mM至約200mM的L-麩醯胺酸。在一些情況下，該接觸持續歷時約24小時至約48小時。在一些情況下，該等幹細胞是絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞。在一些情況下，該方法包含在令該等幹細胞與纖維母細胞生長因子接觸來分化為prCTBs之前，使用培養基來培養該等幹細胞。在一些情況下，該培養基不含有抗生素。在一些情況下，該抗生素是青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)或者它們的任何組合。在一些情況下，該培養基不含有A酸(retinoic acid)。在一些情況 下，該培養基不含有巰基乙醇(mercaptoethanol)、菸鹼醯胺(nicotinamide)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該培養基不含有地塞米松(dexamethasone)、重組型人類抑癌素M(recombinant human oncostatin M)、BMP4、HGF，或者它們的任何組合。在一些情況下，該培養基不含有動物成分。在一些情況下，該培養基不含有人類衍生成分。在一些情況下，該培養基不含有血清(serum)。在一些情況下，該培養基不含有胎牛血清(fetal bovine serum)。在一些情況下，該纖維母細胞生長因子是鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。

發明的詳細說明

一或多種發明具體例的細節被描述於隨文檢附的圖式、申請專利範圍以及本發明的說明中。除非被明確地排除，本發明所揭示與所預期的發明具體例的其他特徵、目的以及優點可被組合以任何其他具體例。

此處所揭示的是一種在活體外所生成之獨特的前驅調節滋胚內層細胞、其組成物及其在治療障礙(例如，癌症、發炎或自體免疫疾病)或改善病況(例如，皮膚狀況)上的用途。該前驅調節滋胚內層細胞不同於滋養層幹細胞。該前驅調節滋胚內層細胞亦不同於胚胎幹細胞。該前驅調節滋胚內層細胞亦不同於初始滋胚內層細胞。該前驅調節滋胚內層細胞亦不同於胎盤滋胚內層細胞。該前驅調節滋胚內層細胞亦不同於絨毛外滋胚內層細胞。在一些實例中，前驅調節滋胚內層細胞不是前驅絨毛滋胚內層細胞。

除非另外有所定義，此處所使用的所有技術性與科學術語具有有如由熟悉所請求的標的物所屬技藝者所共同瞭解的相同意義。要被瞭解的是：前述的一般說明以及下面的詳細說明僅是示範性以及解釋性的並且不受限於任何所請求的標的物。在本件申請案中，除非另外特別被敘明，單數的使用包括複數。必須被注意到的是，除非上下文另外清楚地指明，有如在說明書以及隨文檢附的申請專利範圍中所使用的，單數形式“一(a)”、“一(an)”以及“該(the)”包括複數指涉。在本件申請案中，除非另外被敘明，“或(or)” 的使用意指“和/或(and/or)”。此外，術語“包括(including)”以及其他形式[諸如“包括(include)”、“包括(includes)”以及“被包括(included)”]的使用不受限。

如此處所使用的，範圍以及數量可被表示為“大約(about)”一特定的值或範圍，例如一參考數值的±15%。大約亦包括確切的數量。因此，“大約5μL”意指“大約5μL”以及“5μL”。一般而言，術語“大約(about)”包括一將會被預期在一實驗誤差內的數量。

術語“治療(treating)”、“治療(treatment)”以及類似者在此處被使用來意指獲得一所欲的藥理學的和/或生理學的效用。在一些實例中，一個體(例如，一被懷疑蒙受一肝-關聯性疾病或障礙和/或基因上對於一肝-關聯性疾病或障礙具有得病傾向的個體)是被預防性治療以此處所描述的細胞的製劑並且該預防性治療完全地或部分地預防一肝-關聯性疾病或障礙或者它們的徵兆或症狀。在一些實例中，一個體被治療性治療(例如，當一個體蒙受一肝-關聯性疾病或障礙時)，該治療性治療造成對於該疾病或障礙的一部分或完全治癒，和/或逆轉一可歸因於該疾病或障礙的副作用，和/或穩定該疾病或障礙，和/或延遲該疾病或障礙的進展，和/或造成該疾病或障礙的消退。

將此處所描述的細胞投藥(例如，移植)至有治療需要的 區域是藉由，例如且不受限於，下列方式而被完成：在手術期間的局部滴注(local infusion)、藉由注射(injection)、藉由一導管(catheter)的方式，或藉由一植入物(implant)，該植入物是一多孔性、非孔性或凝膠狀材料，包括膜[諸如矽膠膜(silastic membranes)]或纖維。

“移植(transplanting)”一組成物至一哺乳動物中意指藉由在此技藝中所建立的任何方法來將該組成物導入至哺乳動物的體內。被導入的組成物是“移植物(transplant)”，以及該哺乳動物是“接受者(recipient)”。該移植物以及該接受者可以是同源的(syngeneic)、同種異體的(allogeneic)或異種的(xenogeneic)。此外，該移植可以是一自體移植(autologous transplantation)。

術語“經分離的(isolated)”，當用於涉及一細胞或細胞族群時，意指指該細胞或該細胞族群是與宿主生物分隔開的狀態，其中該細胞或該細胞族群是一般地或天然地被發現。在一些情況下，一經分離的細胞是與其他分離自相同宿主生物的細胞相接觸的。在一些情況下，一經分離的細胞是與任何其他細胞分隔開的。在一些情況下，一經分離的prCTB是於活體外衍生自一祖細胞。在一些情況下，一經分離的prCTB是得自於一宿主生物而被獲得且與該宿主生物分隔開。

一“有效量(effective amount)”是一治療劑足以達到 所欲目的之一數量。一用以治療或改善一障礙的組成物的一有效量是該組成物足以減少或移除該障礙的症狀的一數量。

此處所使用的章節標題僅是用於組織目的並且不是要被解讀為限制被描述的標的物。

細胞與組成物

在一些情況下，此處所揭示是一種活體外經分離的前驅調節滋胚內層細胞(prCTB)，其中該經分離的prCTB表現一或多種蛋白：HSP90、胰島素、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合；或該prCTB分泌一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或者一攜帶一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體；和/或其中該prCTB表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40-配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的 prCTB表現CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8，或者它們的任何組合。

在一些情況下，此處所揭示是一種經分離之包含有前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的細胞族群，其中該prCTBs的族群表現一或多種蛋白：HSP90、胰島素、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；或該prCTB分泌一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或一攜帶一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體；和/或其中該prCTBs的族群表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40-配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些情況下，至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs。在一些情況下，至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs。在一些情況 下，至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs。在一些情況下，至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs。

在一些情況下，此處所揭示是一種經分離之包含有前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的細胞族群，其中：(i)至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs；(ii)至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs；(iii)至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs；或(iv)至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs，或者它們的任何組合。在一些情況下，此處所揭示是一種經分離之包含有前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的細胞族群，其中：(i)至少約10%的族群是表現CD16和CD56的prCTBs；(ii)至少約2%的族群是表現CD4的prCTBs；(iii)至少約2%的族群是表現CD8的prCTBs；以及(iv)至少約5%的族群是表現CD107的prCTBs，或者它們的任何組合。在一些情況下，該細胞族群所包含之至少約2%的族群是表現CD16、CD56和CD107的prCTBs。

在一些實例中，該經分離的prCTB表現介白素15(IL-15)。在一些實例中，該經分離的prCTB表現似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B 細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB進一步表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG或hCG-β)、可溶性人類白血球抗原G(sHLA-G)、轉變生長因子β1(TGF-β1)、胞漿素原活化子抑制劑1(PAI-1)、介白素10(IL-10)、CD105、CD146，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB缺乏合胞素、計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)或者它們的組合之表現。在一些實例中，該經分離的prCTB分泌一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或一攜帶上述的任何者之胞外體，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細胞激素包含有趨化因子(C-C要素)配位子5(CCL5)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-3)、趨化因子(C-X-C要素)配位子1(CXCL1)、趨化因子(C-X-C要素)配位子2(CXCL2)、趨化因子(C-C要素)配位子11(CCL11)、趨化因子(C-C要素)配位子24(CCL24)、趨化因子(C-C要素)配位子26(CCL26)、趨化因子(C-C要素)配位子22(CCL22)、趨化因子(C-X-C要素)配位子10(CXCL10)、fractalkine、趨化因子(C-C要素)配位子4(CCL4)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細胞激素包含有介白素1α(IL-1α)、介白素1β(IL-1β)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素4 (IL-4)、介白素6(IL-6)、介白素7(IL-7)、介白素8(IL-8)、介白素10(IL-10)、介白素12p40(IL-12p40)、介白素13(IL-13)、介白素15(IL-15)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細胞激素包含有干擾素α(IFN-α)或干擾素γ(IFN-γ)。在一些實例中，該生長因子包含有血小板-衍生的生長因子同源二聚體AA(PDGF-AA)、PDGF同源二聚體BB(PDGF-BB)、PDGF異二聚體AB(PDGF-AB)、血管內皮生長因子(VEGF)、顆粒球-巨噬細胞群落-刺激因子(GM-CSF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)家族蛋白、似FMS的酪氨酸激酶3配位子(Flt3L)、可溶性CD40配位子(sCD40L)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、介白素1β(IL-1β)，或者它們的任何組合。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB具有較高之經活化的轉錄信號傳遞子和活化子3(STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB具有至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、5、8、10倍高之經活化的信號傳遞子和活化子3(STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB表現至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、 5、8、10倍高之SOX2蛋白的位準。在一些實例中，該經分離的prCTB是活體外分化自一絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞，其缺乏下列表現：麩胺酸脫羧酶(GAD65)、Ki67、熱休克蛋白70(HSP70)、p53、可溶性CD40-配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞和該經分離的prCTB這兩者均表現熱休克蛋白90(HSP90)。在一些實例中，該經分離的prCTB是人類細胞。在一些實例中，該經分離的prCTB是源自於囓齒動物、兔子、牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或猿。在一些實例中，該經分離的prCTB是存在於藥學組成物，該藥學組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑。

在一些實例中，此處所提供的細胞(例如，prCTBs)，是經基因修飾的。在一些實例中，該細胞經基因修飾以表現一外源基因(例如，轉殖基因)。此處所使用的術語“轉殖基因(transgene)”及其語法等同物，可以意指被轉移至一生物體中的一基因或一遺傳物質。例如，一轉殖基因可以是被引入一生物體中之含有一基因的一段DNA或一DNA片段。當一轉殖基因被轉移至一生物體中，那麼該生物體被稱為轉殖基因生物體(transgenic organism)。一轉殖基因可在一轉殖基因生物體中保有它產生RNA或多肽(polypeptides)(例如，蛋白質)的能力。一轉殖基因可以由不同的核酸(例如，RNA或DNA)組成。一轉殖基因可能編碼一經基因工 程的T細胞受體，例如，一TCR轉殖基因。一轉殖基因可包含一TCR序列。一轉殖基因可包含一致癌基因(oncogene)。一轉殖基因可以包含一免疫致癌基因(immune oncogene)。一轉殖基因可包含重組臂(recombination arms)。一轉殖基因可以包含經基因工程的位址。在一些情況下，一轉殖基因是一致癌基因。在一些情況下，一轉殖基因是一免疫致癌基因。在一些情況下，一轉殖基因是一抑瘤基因(tumor suppressor gene)。在一些情況下，一轉殖基因編碼一直接地或間接地促進蛋白質水解(proteolysis)的蛋白質。在一些情況下，一轉殖基因是一溶瘤基因(oncolytic gene)。在一些情況下，一轉殖基因可以幫助一淋巴細胞標靶腫瘤細胞。在一些情況下，一轉殖基因是一T細胞強化子基因(enhancer gene)。在一些情況下，一轉殖基因是一溶瘤病毒基因(oncolytic virus gene)。在一些情況下，一轉殖基因抑制腫瘤細胞生長。在一些情況下，一轉殖基因是一抗癌受體。在一些情況下，一轉殖基因是一抗血管生成因子。在一些情況下，一轉殖基因是一細胞毒性基因(cytotoxic gene)。例示性轉殖基因包括，但不限於，CD28、誘導型共-刺激物(inducible co-stimulator,ICOS)、CD27、4-1BB(CD137)、ICOS-L、CD70、4-1BBL、信號3(Signal 3)、一細胞激素[諸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、ICAM-1(CD54)、LFA-3(CD58)、第I型HLA基因(HLA class I genes)、B7、CD80、 CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、CD3、CD1d、CD2、膜連型(membrane-bound)IL-15、膜連型IL-17、膜連型IL-21、膜連型IL-2、截斷的CD19(truncated CD19)、VEGF、凋亡蛋白酶(Caspase)]、一趨化因子，或一或多個編碼一針對上述中的任一者之抗體[例如：一單株抗體(monoclonal antibody)]的基因，或者它們的任何組合。在一些情況下，一轉殖基因編碼一參與細胞或組織修復的蛋白質，例如，DNA修復關聯性、免疫反應關聯性的蛋白質(例如：干擾素和介白素)，以及結構蛋白]。在一些情況下，一轉殖基因編碼一生長因子受體。在一些情況下，此處所述的prCTB包含一編碼下列的轉殖基因：一TCR、一B細胞受體(B cell receptor,BCR)、一嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)，或者它們的任何組合。在一些情況下，此處所述的prCTB包含一編碼一致癌基因受體的轉殖基因。

在一些實例中，此處所揭示之一包含細胞的組成物被配製成一用於靜脈內投藥給一哺乳動物(包括人類)的藥學組成物。在一些實例中，用於靜脈內投藥的組成物是呈無菌等張水性緩衝液中的溶液。在必要時，該組成物亦包括一局部麻醉劑以改善注射部位的任何疼痛。當該組成物是藉由滴注來投藥，它可以使用一含有無菌藥學等級水或鹽水的滴注瓶來配藥。當該組成物是藉由注射來 投藥，一用於無菌注射用水或鹽水的安瓿可以被提供，而使得在投藥之前使成分混合。

在一個方面，此處所揭示的是一種組成物(例如，藥學組成物)，其包含此處所揭示的一細胞。在一些實例中，組成物進一步包含一藥學上可接受的載體或賦形劑。該載體包括，但不限於，鹽水、緩衝的鹽水、右旋糖(dextrose)、水，以及它們的組合。在其他實例中，膠體分散系統被使用。膠體分散系統包括大分子複合物(macromolecule complexes)、奈米膠囊(nanocapsules)、微球(microspheres)、珠粒(beads)以及以脂質為基礎的系統(lipid-based systems)，包括水包油乳化液(oil-in-water emulsions)、微胞(micelles)、混合的微胞(mixed micelles)以及脂質體(liposomes)。

分泌蛋白體(Secretome)與組成物

在一些方面中，此處所揭示的是一種組成物，其包含有此處所述之一滋養層幹細胞或prCTB的分泌蛋白體或的。在一些情況下，該分泌蛋白體包含有藉由滋該養層幹細胞或prCTB所分泌的胞外體，以及藉由該滋養層幹細胞或prCTB所分泌的其他可溶性分子(例如，蛋白質、核酸和脂質)。

在一些情況下，此處所揭示的是一種組成物，其包含有一趨化因子、一細胞激素、一生長因子，或者它們的任何組合。 在一些實例中，該組成物包含有一胞外體，其中該胞外體攜帶一趨化因子、一介白素、一生長因子或者它們的任何組合，以及一藥學上或化妝品上可接受的賦形劑。在一些實例中，該組成物不含有細胞。在一些情況下，該組成物包含有或胞外體攜帶有：(i)一趨化因子，其包含有CXCL2、MCP-1、Fractalkine、IP-10、MCP-3、伊紅趨素、MIP-1β，或者它們的任何組合；(ii)一介白素，其包含有IL-6、IL-8、IL-4、IL-1RA、IL-10、IL-12P40、IL-15、IL-1α、IL-17A，或者它們的任何組合；以及(iii)一生長因子，其包含有PDGF-AA、VEGF、bFGF、G-CSF、Flt-3L、GM-CSF，或者它們的任何組合。

在一些情況下，該組成物包含有MCP-1，以及下列的一者、二者、三者或全部：CXCL2、IL-6、IL-8以及VEGF蛋白。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：1至大約2.5：1。例如，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為：大約1.0：1、1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1、2.0：1、2.1：、2.2：1、2.3：1、2.4：1或2.5：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約2.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約3：1至大約4：1或大約3：1至大約5：1。例如，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約3：1、3.1、3.2、 3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.5、5或4.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約3.2。

在一些情況下，該組成物包含有MCP-1，以及下列的一者、二者、三者或全部：CXCL2、IL-6、IL-8以及VEGF蛋白。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：7至大約1：4。例如，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：7.0、1：6.8、1：6.6、1：6.4、1：6.2、1：6、1：5.8、1：5.6、1：5.4、1：5.2、1：5.0、1：4.8、1：4.6、1：4.4、1：4.2或1：4.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的組量比為大約1：5.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：4至大約1：1.5。例如，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：4.0、1：3.8、1：3.6、1：3.4、1：3.2、1：3.0、1：2.8、1：2.6、1：2.4、1：2.2、1：2.0、1：1.8、1：1.7、1：1.6或1：1.5。在一些情況下，該組成物中MCP-1和CXCL2的重量比為大約1：4至大約1：2.5。

在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為從大約2：1至大約3：1。例如，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為從大約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為大約2.3。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比 為大約2.5。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為從大約3：1至大約4：1。例如，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為從大約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為大約3.6。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-6的重量比為大約3.8。

在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為從大約4：1至大約6：1。例如，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為從大約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為大約4.6。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為大約4.4。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為大約4.9。在一些情況下，該組成物中MCP-1和IL-8的重量比為大約4.5。

在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為從大約5：1至大約7：1。例如，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為從大約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為大約5.6。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為大約6.0。 在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為從大約7：1至大約9：1，例如，大約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為大約7.6：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和VEGF的重量比為大約7.3：1。

在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約3：1至大約5：1，例如，大約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約3.5。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約6：1至大約9：1，例如，大約6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約7.8。

在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約1：2.5至大約1：1.5，例如，大約1：2.5、1：2.4、1：2.3、1：2.2、1：2.1、1：2.0、1：1.9、1：1.8、1：1.7、1：1.6或1： 1.5。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約0.6。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約1：1.5至大約1.5：1，例如大約1：1.5、1：1.4、1：1.3、1：1.2、1：1.1、1：1.0、1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1或1.5：1。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約1.2。

在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約3：1至大約5：1，例如，大約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約3.5。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為從大約6：1至大約9：1，例如大約6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0。在一些情況下，該組成物中MCP-1和PDGF-AA的重量比為大約7.8。

在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA和G-CSF。在一些情況下，該組成物進一步包含有PDGF-AA和FGF-2(bFGF)。在一些情況下，該組成物進一步包含有下列蛋白質中的一或多者：IP-10、伊紅趨素、Flt-3L、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1b、 IL-1a、IL-1RA、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12P40、IL-13、IL-15、IL-17A、CCL5(RANTES)、MDC、MCP-3、IL-12P70、IFNa、IFNr、PDGF-AB/BB，或者EGF。

在一些情況下，該組成物進一步包含有核酸，諸如，mRNA、siRNA、shRNA或DNA。在一些情況下，該組成物進一步包含有由prCTB或滋養層幹細胞所分泌的脂質分子。

在一些情況下，此處所揭示的組成物可以是無菌的。在一些情況下，該組成物可以包含有常駐型微生物(resident microbes)。該等微生物可以是病毒、細菌、真核細胞，或者它們的任何組合。在一些情況下，該等微生物可能不是致病的。在一些實例中，該組成物可以包含呈一小於下列的濃度之一種細菌或多種細菌：大約10個菌落形成單位(colony forming units,CFU)/克(g)、50CFU/g、100CFU/g、150CFU/g、200CFU/g、300CFU/g、400CFU/g、500CFU/g、600CFU/g、700CFU/g、800CFU/g、900CFU/g，或者1000CFU/g。在一些情況下，該組成物可以包含呈一為下列的濃度之多種細菌：大約10CFU/g至大約1000CFU/g、10CFU/g至大約50CFU/g、20CFU/g至大約100CFU/g、50CFU/g至約200CFU/g、100CFU/g至大約250CFU/g、200CFU/g至大約500CFU/g、500CFU/g至大約700CFU/g，或者600CFU/g至大約1000CFU/g。在一些實例中，該組成物可實質 上不含有(例如，至少95%沒有)或者不含有：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、假單胞菌屬(Pseudomonas species)、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)，或者它們的任何組合。

在一些情況下，此處所揭示的一種組成物可不含有重金屬(諸如鉛)、雙硫酸醇(bithionol)、氟氯化碳推進劑(chlorofluorocarbon propellants)、亞硝胺(nitrosamines)、氯仿(chloroform)、鹵化水楊酸苯胺(halogenated salicylanilides)、六氯酚(hexachlorophene)、汞化合物(mercury compounds)、1,4-二噁烷(1,4-dioxane)、二氯甲烷(methylene chloride)、禁止的牛材料(prohibited cattle materials)、防曬化合物、氯乙烯(vinyl chloride)、含鋯的錯合物(zirconium-containing complexes)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該等禁止的牛材料可以包含有腦、頭骨、眼睛、三叉神經節、脊髓、椎骨、背根節(dorsal root ganglia)、扁桃腺、小腸迴腸末端，或者它們的任何組合。在一些實例中，該組成物可能包含有位準為10ppm(百萬分之一)或更少的鉛。

在一些情況下，此處的一種組成物不包含有著色添加物(color additive)、香料、對羥苯甲酸甲酯(paraben)、苯二甲酸 酯類(phthalate)、乙醇(alcohol)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該著色添加物、香料、對羥苯甲酸甲酯、苯二甲酸酯類或乙醇以無意義的位準存在於該組成物中，例如小於：5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。在一些情況下，附帶成分(incidental ingredient)在組成物中可沒有技術性/結構性、功能性或者它們的任何組合之效用，例如，不是一活性成分。在一些實例中，該組合物不含此。

在一些情況下，此處所揭示的賦形劑可以包含有水、甘油、鹽水、植物油(例如，種子油)、果油、花萃取物、礦物油、合成油、糖化合物、矽酸鹽(silicate)、鈣鹽(calcium salt)、鎂鹽(magnesium salt)、氯化鈉(sodium chloride)、氯化鉀(potassium chloride)、乳酸(lactic acid)、澱粉(starch)、糖醇(sugar alcohol)、纖維素(cellulose)、活性炭(activated charcoal)、甘油(glycerin)、黃乳油、胺基酸(amino acid)、石蠟、蜂蜜、蠟、蜂蠟、瓊脂(agar)、碳酸鈣(calcium carbonate)、檸檬酸(citric acid)、酒石酸(tartaric acid)、硬脂酸(steric acid)、黃原膠(xantham gun)、苯甲酸(benzoic acid)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、矽(silicon)、它們的衍生物、它們的鹽類，或者它們的任何組合。

使用方法

在一些情況下，一種經分離的prCTB被靜脈內地(intravenously)、皮下地(subcutaneously)、經皮地(percutaneously)、吸入地(inhalationally)、口服地(orally)、肌肉內地(intramuscularly)或腫瘤內地(intratumorally)投藥給個體。在一些實例中，該個體是哺乳動物。在一些實例中，該個體是靈長類動物。在一些實例中，該個體是人類。在一些實例中，該經分離的prCTB表現介白素15(IL-15)。在一些實例中，該經分離的prCTB表現CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB表現似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB進一步表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、可溶性人類白血球抗原G(sHLA-G)、轉變生長因子β1(TGF-β1)、胞漿素原活化子抑制劑1(PAI-1)、介白素10(IL-10)、CD105、CD146，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB缺乏合胞素、計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)或者它們的組合之表現。在一些實例中，該經分離的prCTB分泌一趨化因子、一 細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或者一攜帶一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體。在一些實例中，該細胞激素包含有趨化因子(C-C要素)配位子5(CCL5)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-3)、趨化因子(C-X-C要素)配位子1(CXCL1)、趨化因子(C-X-C要素)配位子2(CXCL2)、趨化因子(C-C要素)配位子11(CCL11)、趨化因子(C-C要素)配位子24(CCL24)、趨化因子(C-C要素)配位子26(CCL26)、趨化因子(C-C要素)配位子22(CCL22)、趨化因子(C-X-C要素)配位子10(CXCL10)、fractalkine、趨化因子(C-C要素)配位子4(CCL4)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細胞激素包含有介白素1α(IL-1α)、介白素1β(IL-1β)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素4(IL-4)、介白素6(IL-6)、介白素7(IL-7)、介白素8(IL-8)、介白素10(IL-10)、介白素12p40(IL-12p40)、介白素13(IL-13)、介白素15(IL-15)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細胞激素包含有干擾素α(IFN-α)或干擾素γ(IFN-γ)。在一些實例中，該生長因子包含有血小板-衍生的生長因子同源二聚體AA(PDGF-AA)、PDGF同源二聚體BB(PDGF-BB)、PDGF異二聚體AB(PDGF-AB)、血管內皮生長因子(VEGF)、顆粒球-巨噬細胞群落-刺激因子(GM-CSF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因 子(FGF)家族蛋白、似FMS的酪氨酸激酶3配位子(Flt3L)、可溶性CD40配位子(sCD40L)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、介白素1β(IL-1β)，或者它們的任何組合。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB具有較高之經活化的轉錄信號傳遞子和活化子3(STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB具有至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、5、8、10倍高之經活化的信號傳遞子和活化子3(STAT3)或轉錄因子c-JUN的位準。在一些實例中，藉由免疫墨點法所測得，相較於活體外分化成經分離的prCTB之祖細胞，該經分離的prCTB表現至少約1.1、1.2、1.5、1.5、2、2.2、2.5、2.8、3、3.5、4、5、8、10倍高之SOX2蛋白的位準。在一些實例中，該經分離的prCTB是活體外分化自一絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞，其缺乏下列表現：p53、麩胺酸脫羧酶(GAD65)、Ki67、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40-配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該經分離的prCTB是人類細胞。在一些實例中，該經分離的prCTB是源自於囓齒動物、兔子、牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或猿。

在一些情況下，此處所揭示的是一種用於殺死帶有抗原的目標細胞之方法，其包含對一有此需要的個體投藥一前驅調節滋 胚內層細胞(prCTB)，其中該經分離的prCTB表現包含有下列蛋白中的一或多者：HSP90、胰島素、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及麩胺酸去羧酶(GAD65)、Ki67、熱休克蛋白70(HSP70)、p53、可溶性CD40配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該帶有抗原的目標細胞是癌細胞。在一些實例中，該癌細胞是固態腫瘤細胞。在一些實例中，該癌細胞是血液癌細胞。在一些實例中，該癌細胞包含有膀胱癌細胞、骨癌細胞、腦癌細胞、乳腺癌細胞、子宮頸癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃腸道癌細胞、造血系統惡性組織、頭頸部鱗狀細胞癌細胞、白血病、肝癌細胞、肺癌細胞、淋巴瘤、骨髓瘤細胞、鼻癌細胞、鼻咽癌細胞、口腔癌細胞、口咽癌細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、肉瘤細胞、胃癌細胞、黑色素瘤細胞、甲狀腺癌細胞，或者它們的任何組合。在一些實例中，該帶有抗原的目標細胞是一病原體。在一些實例中， 該病原體包含有病毒、細菌、原生動物、普里昂蛋白質、真菌，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法殺死帶有抗原的目標細胞總數的至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約50%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%。

在一些情況下，此處所揭示的是一種用於向下調節一發炎途徑的方法，其包含對一有此需要的個體投藥一前驅調節滋胚內層細胞(prCTB)，(i)其中該經分離的prCTB表現一或多種蛋白質，其包含：(a)HSP90、胰島素、CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(b)麩胺酸去羧酶(GAD65)、Ki67、熱休克蛋白70(HSP70)、p53、可溶性CD40配位子(sCD40L)，或者它們的任何組合，以及(ii)其中該經分離的prCTB分泌一趨化因子、一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或者一攜帶一趨化因子、一 細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體，或者它們的任何組合。

在一些實例中，該方法治療一包含下列的疾病或病況：移植排斥、感染、與感染相關的內毒素性休克、關節炎、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎(JIA)、發炎性腸道疾病(IBD)、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、氣喘、骨盆腔炎症、阿茲海默氏症、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、大腸性激躁症、多發性硬化症、僵直性脊椎炎、皮肌炎、葡萄膜炎、佩羅尼氏症、腹腔疾病、膽囊疾病、藏毛疾病、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、外科手術沾粘、中風、第I型糖尿病、萊姆關節炎、腦膜炎、免疫媒介之中樞和周邊神經系統的發炎疾病、胰腺炎、外科手術創傷、移植物-抗-宿主的疾病、心臟病、骨質分解、燒傷患者、心肌梗塞、柏哲德氏症、骨質疏鬆、敗血症、肝或肺纖維化、牙周炎，或者胃酸過多。在一些實例中，該方法治療自體免疫疾病，其包含有：第I型糖尿病、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、修格蘭氏症候群、硬皮症、多發性肌炎、慢性活動性肝炎、混合性結締組織病、原發性膽汁性肝硬化、惡性貧血、自體免疫甲狀腺炎、特發性艾迪生氏病、白斑症、麩質敏感性腸疾、葛瑞夫茲氏症、重症肌無力、自體免疫性嗜中性白血球缺乏症、特發性血小板減少性紫斑、類風濕關節炎、肝硬化、壽常型天皰瘡、自體免疫性不育症、古德巴斯捷氏症、類天皰瘡、盤 狀性狼瘡、潰瘍性結腸炎、緻密物沉積病、發炎性腸道疾病，或者牛皮癬。在一些實例中，該方法治療第I型糖尿病。在一些實例中，該方法改善移植排斥。

在一些情況下，此處所揭示的是一種用於調節皮膚狀況的方法，其包含有對一有此需要的個體投藥一組成物(例如，一藥學組成物)，該組成物包含有一趨化因子、一細胞激素諸如一介白素、一生長因子或者它們的任何組合，或者一攜帶有一趨化因子、一細胞激素諸如一介白素、一生長因子或者它們的任何組合之胞外體。在一些情況下，該方法改善皮膚狀況，藉此相較於施用該方法之前，施用該方法之後皮膚狀況具有一或多種更好的特徵。在一些實例中，該趨化因子包含有GRO、MCP-1、Fractalkine、IP-10、MCP-3、伊紅趨素、MIP-1β，或者它們的任何組合。在一些實例中，該組成物包含有一介白素，其包含有IL-6、IL-8、IL-4、IL-1RA、IL-10、IL-12P40、IL-15、IL-1α、IL-17A，或者它們的任何組合。在一些實例中，該生長因子包含有PDGF-AA、VEGF、bFGF、G-CSF、Flt-3L、GM-CSF，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法提供一化妝品應用。在一些實例中，該方法使皮膚緊緻。在一些實例中，該方法滋潤皮膚。在一些實例中，使皮膚回春。在一些實例中，該組成物是幹細胞繼代後的培養基。在一些實例中，該幹細胞是此處所描述的一經分離的前驅調節滋胚內層細 胞(prCTB)。在一些實例中，繼代的次數為至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實例中，該幹細胞被培養於培養基歷時至少大約：1-3天(諸如1-2天)，例如在收集培養基之前。在一些實例中，該幹細胞被培養於培養基歷時至少大約12-24小時，例如在收集培養基之前。在一些實例中，繼代的次數為5至10次。在一些實例中，該繼代大約每1、2或3天進行。在一些實例中，該傳代大約每2、4、6、8、12、16、20或24小時進行。在一些實例中，該培養基不含有幹細胞。在一些實例中，該組成物是呈乳劑、液體、凝膠、乳液、噴霧、膠囊或面膜的形式。在一些實例中，該方法可以被使用以治療一皮膚疾病。在一些實例中，該皮膚疾病可以是濕疹(eczema)、牛皮癬(psoriasis)、痤瘡(acne)、酒渣(rosacea)、魚鱗癬(ichthyosis)、白斑病(vitiligo)、蕁麻疹(hives)、脂溢性皮膚炎(seborrheic dermatitis)、帶狀皰疹(shingles)、曬傷(sunburn)、燒傷(burn)、接觸性皮膚炎(contact dermatitis)、皮疹(rash)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法可以減少皮膚老化、光老化或者它們的任何組合之出現。在一些實例中，該方法可以減少傷疤的出現。在一些實例中，該方法可以促進傷口癒合。在一些實例中，該方法可以預防、減少或消除瘀傷、良性增長(benign growths)、老年斑、癌性增長(cancerous growths)、潰瘍、感染，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法可以預防、 減少或消除細紋、皺紋，或者它們的任何組合。在一些實例中，該細紋或皺紋可以是魚尾紋(crow’s feet)、微笑紋(smile lines)、皺眉紋(frown lines)、額頭皺紋(forehead furrows)、淚槽(tear troughs)、兔子紋(bunny lines)、鼻唇溝(nasolabial folds)、嘴角紋(marionette lines)、下巴紋(mental crease)、頸紋(necklines)、年齡-相關的皺紋(age-related wrinkles)、皺紋(crinkle lines)、彈性皺紋(elastotic creases)、表情皺紋(expression lines)、引力皺褶(gravitational folds)、動態皺紋(dynamic wrinkles)、靜態皺紋(static wrinkles)、萎縮性皺紋(atrophic wrinkles)、萎縮性壓皺皺紋(atrophic crinkling rhytids)，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法可以預防、減少或消除體積喪失、彈性喪失或者它們的任何組合的皮膚。在一些實例中，該方法可以預防、減少或消除皮膚鬆弛、膚色暗沉、斑駁變色、皮膚粗糙、皮膚乾燥、皮膚瘙癢、薄皮膚，或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法可以促進或改善皮膚狀況、皮膚疾病或者它們的任何組合。在一些實例中，該方法可以使皮膚保濕、緊緻、提拉或回春。在一些實例中，該方法可以恢復或維持健康、光滑、無瑕疵、半透明、有彈性或者它們的任何組合的皮膚。在一些實例中，該方法可以使皮膚的糖胺聚多醣(glycosaminoglycan)、真皮(dermis)、膠原蛋白(collagen)以及 彈性蛋白(elastin)恢復、治療、修補或者它們的任何組合。在一些實例中，經改善的皮膚健康可以藉由下列而被測量：皺紋嚴重性等級量表、穿皮水分散失測量(trans-epidermal water loss measurement)、皮膚顏色測量、皮膚表面形貌測量、Cutometer®的黏彈性測量、組織學檢查(histological examination)，或者它們的任何組合。在一些實例中，經改善的皮膚健康可以藉由診斷圖像[諸如核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)]而被測量。在一些實例中，可以在該組成物投藥之前和之後進行測量值比較。在一些實例中，可以將測量值與標準值進行比較。

在另一個方面，此處所揭示的是一種治療在一個體中的一病況的方法，其包含有將一包含有此處的細胞之藥學組成物以一有效於細胞植入至該個體(例如，至該個體的肝)的數量投藥至一個體。在一些實例中，該細胞是以一藥學上可接受的載體而被投藥。在一些實例中，該藥學上可接受的載體包含有一生理鹽水[例如一磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffer saline)]或胎牛血清(fetal bovine serum)。在一些實例中，該細胞是以一含有下列的懸浮液而被投藥：大約每毫升1×10⁶細胞至大約100×10⁶細胞、每毫升大約1×10⁶細胞至大約250×10⁶細胞、每毫升大約1×10⁶細胞至大約500×10⁶細胞或每毫升大約10×10⁶細胞至大約40×10⁶細胞在一些實例中，該細胞是以下列的體積而被投藥：大約1ml至5ml、1ml 至10ml、1ml至50ml、1ml至100ml或10ml至150ml。在一些實例中，該個體是一人類。在一些實例中，該投藥包含有注射(injection)，例如，靜脈內注射(intravenous injection)。在一些實例中，該注射是於一肝靜脈(hepatic vein)之處而被投藥。在一些實例中，該注射是於一肝動脈(hepatic artery)之處而被投藥。在一些實例中，該病況是一肝-關聯性疾病或障礙。在一些實例中，該病況是一肝衰竭(liver failure)。在一些實例中，該肝-關聯性疾病或障礙包含有阿拉吉歐症候群(alagille syndrome)、α1抗-胰蛋白酶缺乏症(alpha 1 anti-trypsin deficiency)、自體免疫肝炎(autoimmune hepatitis)、良性肝腫瘤(benign liver tumors)、膽道閉鎖(biliary atresia)、肝臟囊腫病(cystic disease of the liver)、脂肪肝疾病(fatty liver disease)[包括與酒精有關的肝疾病(alcohol-related liver disease)以及非-酒精性脂肪肝疾病(non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)]、半乳糖血症(galactosemia)、膽石(gallstones)、捷倍耳氏症候群(Gilbert’s Syndrome)、血色素沉著症(hemochromatosis)、肝臟囊腫(liver cysts)、肝癌(liver cancer)、姙娠肝疾病(liver disease in pregnancy){選擇性地，姙娠急性脂肪肝(acute fatty liver of pregnancy)、姙娠肝內膽汁滯留症(intrahepatic cholestasis of pregnancy)、子癎前症(preeclampsia)或HELLP症候群(HELLP Syndrome)[溶血(hemolysis)、升高的肝指數(elevated liver tests)、低血小板(low platelets)]}、新生兒肝炎(neonatal hepatitis)、原發型膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、吡咯紫質沉著病(porphyria)、雷氏症候群(Reye’s Syndrome)、類肉瘤病(sarcoidosis)、毒性肝炎(toxic hepatitis)、第1型肝醣貯積病(type 1 glycogen storage disease)、酪胺酸血症(tyrosinemia)、病毒性肝炎(viral hepatitis)、威爾森氏症(Wilson disease)，或者它們的任何組合。

此處所揭示的細胞的投藥的模式包括，但不限於：全身性靜脈內注射(systemic intravenous injection)以及直接注射至所意欲的活性位址，例如，內視鏡逆行性注射(endoscopic retrograde injection)。該製劑可藉由任何便利的途徑[例如，藉由滴注或巨量注射(bolus injection)]而被投藥，並且可與其它生物活性試劑(biologically active agents)一起被投藥。在一些實例中，該投藥是全身性定位投藥(systemic localized administration)。

在一些方面，此處所提供的是用於移植此處所揭示的細胞至個體的組成物以及方法。在一些實例中，該個體被注射以細胞[例如，靜脈內地(intravenously)、肌肉內地(intramuscularly)、穿皮地(transdermally)、內視鏡逆行性注射 (endoscopic retrograde injection)或腹膜內地(intraperitoneally)]。在一些實例中，該個體在移植前並沒有以一免疫抑制劑治療。在一些實例中，該個體在移植之前沒有以一免疫抑制劑予以治療。在一些實例中，該方法進一步包含有以一免疫抑制劑[例如，FK-506、環孢靈(cyclosporin)或GAD65抗體]來治療病患。

在一些實例中，此處所描述的細胞是藉由一適合用於將細胞標靶至一特定組織的遞送系統而被遞送至一所標靶的位址(例如，一肝臟的缺損部分)。例如，該等細胞被囊封在一輸送載體(delivery vehicle)中，而允許該細胞(等)在所標靶的位址緩慢的釋出。該輸送載體被修飾而使得它被專一性地標靶至一特定的組織。標靶的遞送系統的表面以各種不同的方式而被修飾。當是一脂質體-標靶的遞送系統(liposomal-targeted delivery system)時，脂質基團(lipid group)被併入至該脂質體的脂雙層(lipid bilayer)中，俾以維持標靶配位子與脂質體雙層呈穩定的相締合。

此處所描述的細胞的投藥是藉由下列方式而選擇性地針對一個體來量身訂作：(1)增加或減少被注射的細胞數量；(2)改變注射的數量；或(3)改變該等細胞的遞送方法。

偵測方法

用於測定上述所描述的生物標記的表現或存在的方法在本技藝中是被熟知的，並且可以藉由例如流動式細胞測量術、免疫組織化學、西方墨點法、免疫沉澱法、磁珠篩選法(magnetic bead selection)以及表現這些細胞表面標記的任一者之細胞的定量而被測量。生物標記RNA表現位準可以藉由RT-PCR、Qt-PCR、微陣列(microarray)、北方墨點法(Northern blot)，或其他相似的技術而被測量。

藉由“偵測表現(detecting expression)”或偵測“表現位準(expression levels)”被意欲用於測定在生物樣品中的一生物標記蛋白質或基因的表現位準或存在。因此，“偵測表現”包括其中一生物標記被測定不會被表現、不會被可偵測地表現、呈一低位準而被表現、呈一正常位準而被表現，或被過度表現的例子。

在一些實例中，此處所描述的一生物標記的表現或存在是在一核酸位準下被測定，使用例如免疫組織化學技術或以核酸為基礎的技術，諸如原位雜交法(in situ hybridization)以及RT-PCR。在一些實例中，一或多種生物標記的表現或存在是藉由一用於核酸擴增的方法、一用於核酸定序的方法、一利用一核酸微陣列(DNA以及RNA)的方法，或一使用專一性標定的探針之用於原位雜交法的方法而被執行。

在一些實例中，一生物標記的表現或存在的測定是經由膠體電泳(gel electrophoresis)而被執行。在一些實例中，該測定是經由轉移至一膜以及雜交以一專一性探針而被執行。在一些實例中，一生物標記的表現或存在的測定是藉由一診斷成像技術(diagnostic imaging technique)而被執行。在一些實例中，一生物標記的表現或存在的測定是藉由一可偵測的固體受質而被執行。在一些實例中，該可偵測的固體受質是以抗體予以功能化的順磁性奈米粒子(paramagnetic nanoparticles)。

在一些實例中，一生物標記的表現或存在是呈一RNA(例如mRNA)位準。在一些實例中，偵測RNA(例如mRNA)位準的技術包括，但不限於：南方或北方墨點分析法、聚合酶鏈反應分析以及探針陣列(probe arrays)。

一用於偵測mRNA位準的方法涉及將經分離的mRNA與一核酸分子(探針)接觸，該核酸分子可雜交至由要被偵測的基因所編碼的mRNA。該核酸探針包含，例如：一全-長cDNA或它的一部分，諸如一長度至少為7、15、30、50、100、250或500核苷酸的寡核苷酸以及足以在嚴格的條件下專一性地雜交至一mRNA或編碼一此處所描述的生物標記的基因組DNA。一mRNA與該探針的雜交顯示出該生物標記或其他感興趣的標的蛋白質要被表現。

在一些實例中，mRNA被固定在一固體表面上並且被接觸以一探針，例如藉由將經分離的mRNA在一瓊脂糖凝膠上進行以及將該mRNA從該凝膠轉移至一膜，諸如硝化纖維素(nitrocellulose)。在一些實例中，例如，於一基因晶片陣列(gene chip array)中，該探針(等)被固定在一固體表面上以及該mRNA被接觸以該探針(等)。一熟習此技藝者容易適應供用於偵測編碼生物標記或其他感興趣的蛋白質的mRNA位準的已知mRNA偵測方法。

一用於測定一樣品中之一感興趣的mRNA的位準的另擇方法涉及核酸擴增的方法，例如，藉由RT-PCR、連接酶鏈反應(ligase chain reaction)、自主序列複製(self-sustained sequence replication)、轉錄擴增系統(transcriptional amplification system)、Q-Beta複製酶(Q-Beta Replicase)、滾環式複製(rolling circle replication)或任何其他核酸擴增方法，繼而使用那些熟習此技藝者所詳知的技術來偵測該等經擴增的分子。如果該等分子是以非常低的數量存在，這些偵測途徑特別可應用於偵測核酸分子。在一些實例中，生物標記表現是藉由定量螢光RT-PCR(quantitative fluorogenic RT-PCR)(例如，TAQMAN系統)而被評估。

一感興趣的RNA的表現位準是使用一膜墨點(membrane blot)[諸如在雜交分析(諸如北方、點以及類似者)中被使用]或微井、樣品管、凝膠、珠粒或纖維(或任何包含有被結合的核酸的固態載體)而被監測。表現的偵測亦包含使用配於溶液中的核酸探針。

在一些實例中，微陣列被用來測定一或多種生物標記的表現或存在。核酸微陣列提供一用於同時測量大量基因的表現位準的方法。各個陣列是由可再現模式之附接於一固態載體上的捕捉探針所組成。經標定的RNA或DNA在該陣列上被雜交至互補探針並且接著藉由雷射掃描而被偵測。針對在陣列上的各個探針的雜交強度被測定以及被轉換至一表示相對基因表現位準的定量值。高-密度寡核苷酸陣列(High-density oligonucleotide arrays)特別可應用於偵測針對在一樣品中的大量RNA的基因表現圖譜。

在一些實例中，一陣列是在一實質上具有任何形狀的表面或甚至多重表面上被製造。在一些實例中，一陣列是一平面的陣列表面。在一些實例中，陣列包括在珠粒上的胜肽或核酸、凝膠、聚合表面、纖維[諸如光纖(fiber optics)]、玻璃或任何其他合適的受質。在一些實例中，陣列以一種能夠供用於一總括式裝置(all-inclusive device)的診斷或其他操作的方式而被包裝。

在一些實例中，此處所描述的一生物標記的表現或存在是呈一蛋白質位準而被測定，使用例如針對對抗專一性生物標記蛋白質的抗體。這些抗體被使用於各種不同的方法，諸如西方墨點法、ELISA、多工技術、免疫沉澱法或免疫組織化學技術。在一些實例中，生物標記的偵測是藉由ELISA而被完成。在一些實例中，生物標記的偵測是藉由電致化學發光[electrochemiluminescence(ECL)]而被完成。

用於專一性鑑定以及定量一在生物樣品中的生物標記的任何方法是被預期的。因此，在一些實例中，在一生物樣品中的一感興趣的生物標記蛋白質的表現位準是藉由一結合蛋白而被偵測，該結合蛋白能夠與該生物標記蛋白質或它的一生物活性變異體專一性地交互作用。在一些實例中，經標定的抗體、它的結合部分，或其他結合夥伴被使用。當此處的術語“標記(label)”被使用時意指一被直接地或間接地綴合至該抗體俾以生成一“經標定的(labeled)”抗體之可偵測的化合物或組成物。在一些實例中，該標記是它本身(例如，放射性同位素標記或螢光標記)可偵測的，或者當是一酵素標記時，催化一可偵測的受質化合物或組成物的化學改變。

用於偵測一生物標記蛋白質的抗體在來源上是單株或多株的，或者是被合成地或重組地產生。複合蛋白質的數量[例如，被聯結以結合蛋白質(例如，一專一性地結合至生物標記蛋白質的抗 體)的生物標記蛋白質的數量]是使用那些熟習此技藝者所知曉的標準蛋白質偵測方法學而被測定。一免疫學的分析設計、理論以及操作程序的詳細的回顧在本技藝的許多教科書中被發現。

被用來標定該等抗體的標記的選擇將端視於應用而變化。然而，該標記的選擇對熟習此技藝者是容易可決定的。這些經標定的抗體被使用於免疫分析法以及組織學應用中俾以偵測任何感興趣的生物標記或蛋白質的存在。該等經標定的抗體是多株的或者是單株的。此外，供用於偵測一感興趣的蛋白質的抗體被標記以一放射性原子、一酵素、一發色或螢光部分，或者如本案別處所描述的一比色標籤。標籤標記的選擇亦將端視於所欲的偵測限制。酵素分析(例如，ELISAs)通常允許一藉由酵素-標籤的複合物與一酵素受質的交互作用所形成的有色產物的偵測。作用為可偵測的標記的放射核種(Radionuclides)包括，例如：1-131、1-123、1-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212以及Pd-109。作用為可偵測的標記的酵素的實施例包括，但不限於：辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)，以及葡萄糖-6-磷酸去氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)。發色部分包括，但不限於：螢光素(fluorescein)以及玫瑰紅(rhodamine)。該等抗體是藉由本技藝中所知曉的方法而被綴合至這些標記。例如，酵素以及發 色分子是藉由偶合劑[諸如二醛類(dialdehydes)、碳化二亞胺(carbodiimides)、二順丁烯二醯亞胺(dimaleimides)以及類似者]而被綴合至該等抗體。另擇地，綴合經由一配位子-受體配對而發生。適合的配位子-受體配對的實例是生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)或生物素-鏈黴抗生物素蛋白(biotin-streptavidin)，以及抗體-抗原(antibody-antigen)。

在一些實例中，在一生物樣品中的一或多種生物標記或其它感興趣的蛋白質的表現或存在是藉由下列而被測定：放射免疫分析法(radioimmunoassays)或酵素-結合免疫分析法(enzyme-linked immunoassays,ELISAs)、競爭性結合酵素-結合免疫分析法、點墨點法(dot blot)、西方墨點法、層析法(chromatography)[諸如高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)]，或者其它本技藝中所知曉的分析。因此，該等偵測分析涉及步驟諸如，但不限於：免疫墨點法、免疫擴散法(immunodiffusion)、免疫電泳法(immunoelectrophoresis)或免疫沉澱法。

獲得前驅調節滋胚內層細胞的方法

在一些具體例中，此處的prCTB(例如，人類prCTB)是在活體外衍生自一多潛能幹細胞，例如，絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞(chorionic villi-derived progenitor cell)。在一些情況下，一 prCTB是在補充有一或多種分化因子的培養基中分化自一多潛能幹細胞。在一些情況下，該幹細胞是絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞。在一些情況下，絨毛膜絨毛-衍生的祖細胞包含有哺乳動物滋養層幹細胞，例如，人類滋養層幹細胞。

在一些情況下，此處所揭示的是一種用於獲得前軀調節滋胚內層細胞(prCTBs)的方法，其包含：藉由令幹細胞與纖維母細胞生長因子在培養基中接觸，來使多能幹細胞於活體外分化。在一些情況下，該培養基包含有核苷酸、L-麩醯胺酸、含L-麩醯胺酸的二肽、血小板溶胞產物，或者它們的任何組合。在一些情況下，該培養基包含有核苷酸、該二肽和血小板溶胞產物。在一些情況下，該培養基包含有大約2mM至大約200mM的L-麩醯胺酸。

在一些情況下，一多潛能幹細胞(例如，一人類滋養層幹細胞)被接觸以纖維母細胞生長因子歷時大約24小時至48小時，藉此產生一prCTB。在一些情況下，該接觸至少大約18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、40小時，或者44小時。在一些情況下，該接觸至多大約20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、40小時、44小時，或者48小時。

在一些情況下，當幹細胞在第5至10代繼代時，一多潛能幹細胞(例如，一人類滋養層幹細胞)被接觸以纖維母細胞生長因 子。在一些情況下，當幹細胞在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15代繼代時，多潛能幹細胞被接觸以纖維母細胞生長因子。

在一些實例中，該方法包含在使幹細胞與纖維母細胞生長因子接觸以分化成該prCTBs之前，以該培養基培養該等幹細胞。

在一些情況下，用於獲得和/或維持prCTBs的培養基不含有抗生素，例如：青黴素、鏈黴素或者它們的任何組合。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTBs的培養基不含有A酸。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTBs的培養基不含有巰基乙醇(mercaptoethanol)、菸鹼醯胺(nicotinamide)，或者它們的任何組合。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTB的培養基不含有地塞米松(dexamethasone)、重組型人類抑癌素M(recombinant human oncostatin M)、BMP4、HGF，或者它們的任何組合。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTB的培養基不含有異種成分(xeno-free)(例如，不含有動物成分)。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTB的培養基不含有人類衍生成分和動物衍生成分(例如，作為一化學限定的培養基)。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTB的培養基不含有血清。在一些情況下，該用於獲得和/或維持prCTB的培養基不含有胎牛血清。

在一些情況下，該纖維母細胞生長因子是鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)。在一些情況下，該幹細胞被接觸以大約1ng/ml至大約100ng/ml的bFGF。在一些情況下，該幹細胞被接觸以大約2ng/ml至大約50ng/ml、大約4ng/ml至大約30ng/ml、大約6ng/ml至大約15ng/ml或大約8ng/ml至大約12ng/ml的bFGF。在一些情況下，該幹細胞被接觸以大約6ng ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml或15ng/ml的bFGF。在一些情況下，該幹細胞被接觸以大約10ng/ml的bFGF。

獲得哺乳動物滋養層幹細胞的方法

在一些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一人類滋養層幹hTS細胞)可以既不干擾亦不破壞胚胎的方式被分離自臍帶(umbilical cord)、羊水(amniotic fluid)、羊膜(amniotic membrane)、花頓氏膠(Wharton’s jelly)、絨毛膜絨毛(chorionic villi)、胎盤(placenta)或子宮外孕。

在一些情況下，此處所描述的哺乳動物滋養層幹細胞在不含有抗生素(例如，青黴素、鏈黴素或者它們的任何組合)的培養基中進行培養。在一些情況下，用於獲得哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有A酸。在一些情況下，該用於獲得和/或繼代哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有巰基乙醇、菸鹼醯胺，或者它們的 任何組合。在一些情況下，該用於獲得和/或傳代哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有地塞米松、重組型人類抑癌素M、BMP4、HGF，或者它們的任何組合。在一些情況下，用於獲得和/或繼代該哺乳動物滋養層幹細胞的該培養基不含有異種成分(例如，不含有動物成分)。在一些情況下，該用於獲得和/或繼代哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有人類衍生成分和動物衍生成分(例如，作為一化學限定的培養基)。在一些情況下，該用於獲得和/或繼代哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有血清。在一些情況下，該用於獲得和/或繼代哺乳動物滋養層幹細胞的培養基不含有胎牛血清。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可被分離自羊膜穿刺生物檢體(amniocentesis biopsies)或分離自羊水。在一個實例中，羊膜穿刺可為一於懷孕期間被用來獲得一圍繞胎兒的羊水的少量樣品之過程。在一個實例中，一羊膜穿刺可被提供給懷孕第15與第20週之間且對於染色體異常(chromosome abnormalities)處於提升的風險下的婦女，例如：在分娩時年齡超過35歲的婦女，或那些曾進行具有異常母體血清(血液)篩檢測試而顯示出對於一染色體異常或神經管缺陷(neural tube defect)有提升的風險者。在一個實例中，一針(例如，一長的、細的、中空的針)可以超音波指引來穿過你的腹部至子宮以及羊膜囊 (amniotic sac)中而被使用。一預定數量(例如，一盎司)的羊水可被吸取至一注射器(syringe)中。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可於著床前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)[例如，連同諸如體外受精(in vitro fertilization,IVF)的生殖治療(reproductive therapies)的著床前基因診斷]期間得自於分裂球生物檢體(blastomere biopsy)。在一個實例中，此處的細胞可藉由用於一囊胚的生物檢體之方法而被產生，其中剩餘的囊胚被著床並且致使一懷孕以及之後致使一活胎，例如，透明層(zona pellucida)從囊胚中被移除以及接著該囊胚被切片檢查。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可得自於產前絨毛取樣術(chorionic villus sampling,CVS)。在一個實例中，CVS可為一產前測試，它涉及從胎盤中取一組織的樣品來測試關於染色體異常以及特定的其他基因問題。在一個實例中，CVS可在懷孕的第10與第12週之間被執行。在一個實例中，CVS操作程序是經子宮頸的，例如：一導管被插入通過子宮頸至胎盤中以獲得組織樣品。在一個實例中，CVS操作程序是經腹部的，例如：一針被插入通過腹部以及子宮至胎盤中以獲得組織樣品。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在足月的懷孕之後從胎盤生物檢體中被獲得。在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在一陰道生產(vaginal delivery)或一剖腹生產(cesarean section delivery)之後從一胎盤中被分離出。

在一些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可從第一孕期絨毛取樣術(例如，8⁺³至12⁺⁰週胎齡)或來自於剖腹生產的全期胎盤(term placenta)中被分離出。絨毛膜組織可從羊膜中被分離出、被切碎和/或被酵素分解(例如，使用0.05%胰蛋白酶EDTA，例如，歷時20分鐘)。細胞隨後被離心(例如，在1500rpm下，例如，歷時5分鐘)、被計數和/或被重塗盤(例如，10⁴細胞/cm²)於一培養基[例如，杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)+10%胎牛血清]中。在一個實例中，經分離的細胞可為塑膠貼附的(plastic adherent)。在一個實例中，該等細胞可在第4-8代繼代下被使用。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可依據下列操作程序而從全期(例如，妊娠的38-40週)胎盤中被分離出。讓臍帶血從胎盤中排除，胎盤接著小心地被切開。所得到的組織切片被清洗數次[例如，在磷酸緩衝的鹽水溶液(phosphate-buffered saline)]中以及接著被切碎(例如，機械性地) 以及被酵素分解(例如，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA)。均質物隨後藉由離心而被沉澱以及被散浮於完全培養基(complete medium)(例如，補充有10%胎牛血清、100U/mL青黴素和/或100g/mL鏈黴素的杜貝可氏改良的依格氏培養基)中。細胞培養物被維持於一適合的條件(例如，37℃伴隨一水-飽和的空氣以及5% CO₂)下。培養基定期地被置換，例如每週一至二次。當細胞達到一所欲程度的匯聚時(例如，超過80%匯聚)，它們被恢復，例如，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA，以及在一稀釋(例如，1：3)下被重塗盤。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在分娩之後依據一如下的操作程序而從人類胎盤中被分離出。絨毛膜是藉由剝開羊膜而從羊膜中被分離出。蛻膜的組織在被切成小片(例如，2×2cm²)之前被敲碎(例如，機械性地)以及被清洗(例如，在杜貝可氏磷酸緩衝的鹽水溶液中)。絨毛膜被切成小片以及被提供至一酵素(例如，0.5%胰蛋白酶-EDTA，歷時例如5分鐘)中，繼而以膠原酶I(collagenase I)(例如，在0.3%下於37℃培養箱中歷時20至30分鐘)來分解。被賦予移動性的細胞接著被收集以及通過一細胞過濾器(cell strainer)(例如，100μm)。經過濾的細胞是藉由離心(例如，在2,500rpm下，歷時例如5分鐘)而被收集。細胞被重新散浮於一培養基(例如，補充有10%胎牛血清和/或1%青黴素-鏈黴素的α-改良的最小必需培養基)中，以及在一 適合的條件(例如，於37℃下和/或5% CO₂)下被培養於一容器(例如，T25培養瓶)中。培養基定期地被置換(例如，每3天)，直到絨毛膜MSCs達到一所欲程度的匯聚(例如，70%匯聚)。

在另一個實例中，絨毛膜絨毛可從帶有子宮外孕的婦女(例如，胎齡：5-7週)中未破裂的著床前胚胎之輸卵管中被獲得。微小的絨毛組織可在一適合的培養基(例如，無血清α-MEM)中被徹底地切碎以及在顯微鏡下被鑑別，繼而胰蛋白酶作用(例如，使用0.025%胰蛋白酶/EDTA)歷時一段時間(例如，15分鐘)以及藉由添加一培養基(例如，含有10% FBS的α-MEM)以終止反應。貼附的細胞可在一適合的條件(例如，在條件α-MEM、10% FBS以及1%青黴素-鏈黴素中，在37℃下，在5% CO₂中)下被獲得與被培養。在繼代2代之後，藉由一商業套組(例如，Dako,Carpinteria,CA)所測量的hCG的位準會變成偵測不到。

套組/製品

此處所揭示的是供用於此處所描述的一或多種方法以及組成物之套組以及製品。該等套組包括一載體、包裝或容器，它被劃分以容納一或多個容器(諸如小瓶、小管以及類似者)，該容器(等)各自包含有要被使用於此處所述的方法之分開的元件中的一者。適合的容器包括，例如：瓶、小瓶、注射器以及試管。在一些實例中，該等容器是由各種不同的材料(諸如玻璃或塑膠)所形成。

此處所提供的製造的物品含有包裝材料。藥學包裝材料的實例包括，但不限於：氣泡包裝、瓶、小管、袋、容器、瓶，以及任何適用於一所選配方以及意欲的使用模式之包裝材料。

例如，該容器(等)包括hTS細胞，並且該等細胞可選擇性地配於一如此處所揭示的組成物中。該等套組選擇性地包括與此處所描述的方法中的用途有關的一鑑定說明或標籤或操作指南。

典型地，一套組包括列示出內含物和/或供使用之操作指南的標籤，以及具有供使用之操作指南的仿單(package inserts)。典型地，一組操作指南亦將被包括在內。

在一些實例中，一標籤是在容器上或與其相締合。在一些實例中，當字母、數字或其它形成該標籤的字元被附著、鑄模或蝕刻到容器本身時，一標籤是在一容器上；一標籤是與一容器相締合的，當它是在一亦可容納該容器的容座(receptacle)或載體中而存在時，例如，作為一仿單。在一些實例中，一標籤被用來指明該等內含物是要被使用於一特定的治療應用。該標籤亦指明關於諸如在此處所描述的方法中的內含物之使用的指引。

本發明之各個方面在隨文檢附的申請專利範圍內中被詳細地描述。藉由參照下列描述例示說明的具體例(其中本發明的原理被使用)的詳細說明以及隨文檢附的圖式將會對本發明的特徵以及優點獲得更佳的理解，其中：圖1A-1D顯示人類滋養層幹(human trophoblast stem,hTS)細胞中胰島素表現的特徵。圖1A是hTS細胞中胰島素合成和分泌的分子機制示意圖。圖1B顯示藉由ChIP-qPCR分析，CREB1和MAFA抗體經由降低CREB1和MAFA位準來抑制胰島素(insulin,INS)基因轉錄。數據表示平均值±SD，n=5；輸入：正 對照組(作為100%)；IgG：負對照組。圖1C顯示藉由在分泌蛋白體的分析(secretomic analysis)中的RIA，葡萄糖(glucose)(Gluc；20mM)和磺醯尿素(sulfonylurea)(Gli，gliclazide；10μM)促進hTS細胞(1x10⁶細胞)中胰島素的分泌；而VDCC抑制劑尼非待平(nifedipine)(Nif；10μM)抑制胰島素的分泌。數據表示平均值±SD，n=3；史徒登氏t-檢定(Student t-test)，與對照相比，*p<0.05具顯著性。圖1D顯示描繪在hTS細胞中的生物學角色之免疫反應性分子代表性成像。比例尺如所示。

圖2A-2M說明在胰島素-表現的hTS細胞中的Gα_q/11/PIP2/IP3/IP3R/CaMKII/CREB1和Gβ/PI3K/AKT/GSK3β/MAFA信號傳遞途徑。圖2A-2C顯示藉由qPCR分析，在hTS細胞中，葡萄糖(20mM)刺激細胞膜上甜味受體T1R2/T1R3的快速暫時活化(圖2A)，藉由墨點法(blotting)分析，隨後活化G蛋白信號，包括Gα_q/11和Gβ(圖2B)，並且在15分鐘內(圖2C)。此作用被T1R2/T1R3抑制劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)(2,4-D；100μg)所抑制(圖2B)。數據表示平均值±SD，n=5。史徒登氏t-檢定：*p<0.05作為統計學顯著性。圖2D-2F說明藉由墨點法分析來建立的Gα_q/11/PIP2/IP3/IP3R/CaMKII/CREB1途徑。活化的Gα_q/11誘導肌醇三磷酸(inositol trisphosphate,IP3)來作用於它在內質網 (endoplasmic reticulum,ER)的膜上受體IP3R，以提升細胞內鈣位準，而隨後活化CaMKII。此作用是藉由連接Gα_q/11和CaMKII分子的shGα而被抑制。CaMKII接著透過磷酸化(phosphorylation,p)活化下游CREB1，其藉由使用CaMKII抑制劑KN93而進一步被證實。圖2G-2I描述了Gβ/PI3K/AKT/GSK3α/β途徑的建立。活化的Gβ藉由AKT在ser473位址上的磷酸化(pAKT)迅速地誘導PI3K/AKT信號傳遞並且透過在ser21/9位址上的磷酸化誘導其下游抑制性GSK3α/β。這些作用藉由PI3K抑制劑LY294002和AKT抑制劑MK2206而被抑制。抑制性pGSKα/β接著促進pMAFA以供細胞核定位，藉由其在細胞核中的存在而被證實，以及pMAFA的表現是藉由GSK3抑制劑SB216763而被抑制。圖2J顯示藉由細胞核細胞質分離證明，pCREB1和pMAFA這兩者皆進入細胞核內。β-肌動蛋白(β-actin)：加載對照組(loading control)；α-微管蛋白(α-tubulin)和H3分別顯示出細胞質和細胞核隔室。藉由qPCR分析，圖2K顯示預處理以CREB1 shRNA顯著降低hTS細胞響應葡萄糖刺激(Glu；20mM)的胰島素表現，而預處理以PDX1 shRNA則無。C作為對照組，shGFP作為正對照組。史徒登氏t-檢定；^*：p<0.05，n=4。圖2L顯示藉由流動式細胞測量術(flow cytometry)，在具有兩種不同抗-胰島素抗體的兩種hTS細胞株中胰島素表現。同型 (Isotype)：對照組。圖2M顯示藉由免疫細胞化學法(immunocytochemistry)，原始(naive)hTS細胞沒有表現壓力蛋白或增生標記Ki67，而有表現HSP90。比例尺：50μm。

圖3顯示prCTBs中與胰島素有關的免疫反應性分子的代表性成像，包括PDX1、HNF-1β、NGN3、SOX9、NKX6.1以及胰島素。帶狀比例尺：50μm。

圖4A顯示hTSCs免疫細胞化學地表現TGF-β1。圖4B顯示藉由西方墨點法(Western blot)分析，bFGF(10ng/ml)向上調節TGF-β1和中間絲蛋白(vimentin)而向下調節E-鈣黏素(E-cadherin)，而圖4D顯示抗-TGF-β1抗體抵銷這些作用。數據表示平均值±SD，n=3，史徒登氏t-檢定：統計學顯著性：*p<0.05，**p<0.001。圖4C顯示藉由免疫細胞化學法，bFGF(10ng/ml)向上調節TGF-β1和中間絲蛋白，而向下調節E-鈣黏素。圖4E顯示在一天的培育之後，bFGF(10ng/ml)誘導hTSCs的形態變化，細胞形狀從細長的紡錘形轉變為胖且短的特徵，而從橢圓狀至更多圓狀細胞核。圖4F顯示藉由在抗β-連接素(β-catenin)的shRNAs存在下FOXA2的減弱，來確認bFGF-誘導的FOXA2活化。經轉染以shGFP(非-特異性shRNA)的細胞被使用作為對照組，而β-肌動蛋白作為加載對照組。

圖5A-5C說明前驅調節滋胚內層細胞(prCTBs)的生物學特性。圖5A顯示在輸卵管子宮外孕(ectopic pregnancy)(妊娠7-8週)的絨毛膜絨毛中，與胰島素表現以及氧化壓力蛋白相關的免疫反應性分子的代表性成像。比例尺：50μm。圖5B顯示藉由成像胰島素和壓力蛋白在正常妊娠(妊娠7-8週)的絨毛膜絨毛中的分佈。比例尺：200μm。圖5C是prCTBs和hTS細胞在壓力蛋白表現上的差異之示意圖，且亦相比於在正常子宮懷孕中之在滋養層細胞分化途徑上的細胞。

圖6A和6B顯示在正常懷孕和萎縮卵(blighted ovum)之間在絨毛膜絨毛中表現壓力蛋白p53和胰島素的合胞體結(syncytial knots)上的比較。壓力的合胞體結是藉由在正常妊娠8週的單一絨毛膜絨毛中之一含有計數超過15個陽性細胞的區域上表現胰島素和p53而被定義(圖6A)；而在妊娠的7-8週具有萎縮卵的患者的絨毛膜絨毛(圖6B)，顯示在圖6B中壓力的合胞體結發生的頻率比圖6A所具者高了1.96倍。合胞體結的數目已由兩個助手獨立地在圖6A的80個視野和圖6B的50個視野中而計算出。而另外圖6B的25個視野是未顯示的。圖6C顯示多潛能轉錄因子(pluripotent transcription factors)在prCTB轉化期間的表現量變化，經由4小時的誘導在DE階段免疫反應性OCT4有成像而CDX2則無。

圖7A顯示下列胞外體的Luminex分析：在含有PLUS的培養基中(上區)的hTS細胞(左側的紅色柱條)和prCTB細胞(右側的綠色柱條)所分泌的胞外體，以及排除在PLUS培養基中所使用之成分的影響之後(下區)，在原始的hTS細胞(左側的紅色柱條)和原始的prCTBs(右側的綠色柱條)中存在的胞外體。圖7B顯示免疫墨點法分析結果，說明hTS細胞(左)和prCTBs(右)中存在著許多受體分子。藉由免疫墨點法分析，圖7C顯示自hTS細胞和prCTBs所釋放的蛋白質之分泌蛋白體分析結果。sHLA-G：可溶性HLA-G。n=3。圖7D顯示藉由FACS分析，hTSCs表現血管生成因子CD105和CD146。圖7E顯示免疫墨點法結果，說明hTS細胞(左)和prCTBs(右)中存在著許多受體分子。圖7F顯示藉由免疫墨點法分析，bFGF(10ng/ml)誘導STAT3、c-JUN和Fas配位子(FasL)向上調節，而Fas向下調節。此作用藉由shFGFR1而被抑制。shGFP被使用作為負對照組。圖7G-7J顯示藉由西方墨點法分析，bFGF(10ng/ml)誘導CREB1信號傳遞的活化。圖7G顯示bFGF活化其受體FGFR1和下游的PI3K信號，其藉由FGFR抑制劑PD166866而被抑制。圖7H顯示PI3K將AKT磷酸化(p)以形成PI3K/pAKT信號傳遞，其藉由PI3K shRNA而被抑制。圖7I顯示pAKT活化其下游CREB1，其藉由使用AKT抗體(包括AKT1 shRNA、AKT2 shRNA和AKT3 shRNA)而被抵銷。圖7J 顯示藉由免疫沉澱(immunoprecipitation,IP)分析，pAKT經由直接交互作用而活化其下游CREB1。圖7K顯示bFGF(10ng/ml)以時間-依賴性方式誘導IL-6(左區)和IL-8(右區)。數據表示平均值±SD，n=3獨立細胞株，史徒登氏t-檢定：統計學顯著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖7L顯示RT-qPCR分析，其顯示IL-6(10ng/ml)向上調節hTSCs中的IL-6R mRNA、CREB1 mRNA和β-hCG mRNA(左區)，以及IL-8(30ng/ml)向上調節CREB1 mRNA和CD56 mRNA，而無常見受體IL-8R(右區)。數據表示平均值+/-SD，n=4，史徒登氏t-檢定，統計學顯著性**p<0.01，***p<0.001。圖7M-7N顯示藉由西方墨點法分析，IL-6產生β-hCG(+)CD56(+)prCTBs。圖7M顯示IL-6(10ng/ml)透過GnRHR和IL-6R而誘導β-hCG，其藉由GnRHR抑制劑Elagolix鈉和CREB1抑制劑666-15而被抑制。圖7N顯示IL-8(30ng/ml)透過CXCR2/STAT3信號傳遞而誘導CD56，其藉由CXCR2抑制劑SB225002和STAT3抑制劑Stattic而被抑制。圖7O顯示IL-8(30ng/ml)透過CXCR2/CREB1和CXCR2/STAT3這兩者信號傳遞途徑而產生CD4(+)prCTBs，其藉由CREB1抑制劑666-15、CRCR2抑制劑SB225002以及STAT3抑制劑Stattic而被抑制。圖7P顯示IL-8(30ng/ml)透過CXCR2/STAT3信號傳遞途徑而誘導Foxp3，其藉由CRCR2抑制劑SB225002和STAT3抑制劑 Stattic(E)而被抑制。數據表示平均值±SD，n=3獨立細胞株，史徒登氏t-檢定：統計學顯著性*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖7Q顯示免疫細胞化學地，bFGF誘導prCTBs中CD4和Foxp3的共-表現。比例尺：50μm。

圖8顯示兩個表格，其列出藉由流動式細胞測量術所測得之在hTS細胞和prCTBs中的CD分子；以及藉由流動式細胞測量術所測得之在hTS細胞和prCTBs中所偵測到的T細胞和NK細胞亞型的標記。

圖9A-9M顯示針對hTS細胞和prCTBs中CD生物標記分佈的代表性流動式細胞測量分析。圖9A-9K顯示在一共8個中的一個代表性樣本上的FACS圖分析，顯示在hTS細胞中(左區)和prCTBs中(右區)無法偵測到CD3和CD45(圖9A)、CD34(圖9B)以及CD3和gdTCR(圖9C)；然而可偵測到CD(16+56)和CD107a(圖9D)、CD(16+56)(圖9E)、可偵測到CD(16+56)而較少CD4(圖9F)、可偵測到CD(16+56)和CD8(圖9G)、可偵測到CD(16+56)而無CD19(圖9H)、可偵測到CD107a而較少CD4(圖9I)、可偵測到CD107a和CD8(圖9J)，以及可偵測到CD107a而無CD19(圖9K)。圖9L和9M顯示在hTS細胞(黑色柱條)以及prCTBs(灰色柱條)族群中CD分子(圖9L)以及NK細胞和T細胞的 亞型(圖9M)之分佈。數據表示平均值±SD，n=8個獨立樣本。圖9N顯示藉由免疫染色，在prCTBs中CD11b和CD49f的表現。

圖10A-10D顯示侵入小室(transwell)侵入和遷移分析的結果。MCP-1(圖10A和10B)和CXCL2(圖10C和10D)以劑量-和時間-依賴性方式顯著誘導hTSCs和prCTBs這兩者的移動。圖10E顯示在妊娠7-8週的正常絨毛膜絨毛中的免疫組織化學法，顯示侵入的EVTs會表現免疫反應性p53(+)、合胞素、β-hCG和HLA-G分子。圖10F-10G顯示CD56(+)prCTBs(圖10F的上與中區，棕色)和β-hCG(+)prCTBs(圖10G的上區，棕色)朝著EVTs方向移動以供著床(紅色箭頭)。蛻膜上皮(decidual epithelium)下方有大量的CD56(+)(圖10F的下區)和β-hCG(+)prCTBs(圖10G的中區)。在母體蛻皮(maternal deciduas)中，藉由β-hCG(+)prCTBs替換動脈內皮細胞，這顯示了SA再成型(SA remodeling)(圖10G的中區)，而蛻膜靜脈腔內的β-hCG(+)prCTBs(圖10G的下區)，亦顯示了靜脈的侵入。圖10H-10K顯示侵入和遷移分析(Invasion and Migration assay)的照片。圖10H-10I顯示MCP-1在hTSCs和prCTBs這兩者(每者4x10³細胞/ml)中皆以劑量-依賴性方式(圖10H)和時間-依賴性方式(圖10I)驅使hTSCs(4x10³細胞/ml)的移動。圖10J-10K顯示CXCL2在hTSCs和prCTBs這兩者(每者4x10³細胞/ml)中皆以時間-依賴性方式(圖10J)和劑量-依賴性方式(圖 10K)驅使hTSCs(4x10³細胞/ml)的移動。藍色表示細胞-染色以含有0.2%的結晶紫(Sigma-Aldrich；115940)。遷移的細胞數量(藍色)藉由使用血球計數器(hemocytometer)或流動式細胞儀而被計數。於每個試驗中n=3個獨立樣本。

圖11A-11E顯示藉由光學顯微鏡，prCTBs(三角箭頭)和PANC-1(箭頭)以2：1(3×10⁴細胞/井)的比例在時間過程中的共培養，顯示被prCTBs所包圍的PANC-1的細胞凋亡變化(圖11A)。免疫細胞化學顯示在共培養中兩種活細胞的交互作用(圖11B)：prCTBs(藍色，CytoCalcein 450染色)和PANC-1(紅色，PKH26染色)。凋亡的PANC-1(綠色，apopxin染色，上方)和完整的prCTBs(藍色，中間)經由交互作用而被觀察到(合併，箭頭，下方)(圖11C)。圖11D顯示，免疫細胞化學揭示prCTBs表現PD-L1(左上欄)而無PD-1(左下欄)；而PANC-1表現PD-1(右上欄)和PD-L1(右下欄)這兩者。圖11E顯示FasL出現在prCTBs(左上欄)中而無在PANC-1(右下欄)中，而Fas是在prCTBs(左下欄)和PANC-1(右上欄)這兩者中。比例尺如所示。

圖11F-11J顯示prCTBs在交互作用下會誘導固態腫瘤細胞的細胞凋亡。圖11F顯示藉由3D細胞探索者-螢光顯微鏡(3D cell explorer-fluo microscopy)，prCTBs(藍色)在交互作用下會誘導乳腺MCF-7細胞(綠色)的細胞凋亡(圖11F)。圖11G顯示 prCTBs表現PD-L1而無PD-1(左柱條)；而PANC-1表現PD-1和PD-L1這兩者(右柱條)。圖11H顯示prCTBs表現FasL和Fas這兩者(左柱條)；而PANC-1表現這兩者(右柱條)。圖11I顯示藉由RT-qPCR分析，prCTBs會顯著向上調節抗-凋亡Mcl-1 mRNA和Bfl-1 mRNA。數據表示平均值±SD，n=4，史徒登氏t-檢定：統計學顯著性：*p<0.05，**p<0.01。圖11J顯示藉由3D細胞探索者-螢光顯微鏡所分析(Nanolive，瑞士)，於共同-培育24小時下，prCTBs會引起Huh7細胞(肝)、H1299細胞(肺)、MKN45細胞(胃)、PA-1細胞(卵巢)和A375細胞(黑色素瘤)的細胞凋亡(apopxin，綠色)。比例尺如所示。

圖12A-12B顯示CD56(+)β-hCG(+)prCTBs自EVT向母體蛻膜遷移的細胞過程。在輸卵管子宮外孕絨毛膜中。左區：表現CD56的prCTBs免疫細胞化學。中區：絨毛基質中CD56(+)prCTBs、絨毛CTBs的內層(黑色箭頭)之零星分佈，且集中在EVT區域。右區：表現β-hCG的滋養層細胞在絨毛表面和EVT區域的分佈。在正常的胎盤絨毛中。左區：藉由H & E染色，定錨的絨毛、EVTs和母體蛻膜組織的組織學鑑定。中區：CD56(+)prCTBs出現在EVT區域和鄰近蛻膜組織。右區：顯著的CD56(+)prCTBs出現在母體蛻膜上。β-hCG(+)滋養層細胞的分佈相似於CD56(+)prCTBs。

實施例

以下實施例是非限制性的，而僅代表本發明的各種不同方面及特徵。

實施例1 人類滋養層幹(human Trophoblast Stem,hTS)細胞在壓力下轉形的特徵

為了研究在輸卵管中胚胎輸送的期間囊胚滋養層如何對抗母體高血糖的威脅，於hTS細胞上測試高葡萄糖(20mM)的作用。被發現的是，葡萄糖迅速誘導細胞膜上的甜味味覺受體T1R2/T1R3暫時活化，隨後活化細胞中G-蛋白信號傳遞，而引起Gαq/11/CaMKII/CREB1和Gβ/GSK3β/MAFA信號傳遞途徑(圖1A)。調節性分子機制描述於補充資訊中(圖2A至2J)。在細胞核中，兩個G-蛋白途徑協同地標靶用於轉錄胰島素基因的啟動子來產生胰島素(圖1A)。經由ChIP-qPCR分析，藉由特異性shRNA來弱化轉錄因子CREB1和MAFA減少了胰島素表現(圖1B)。同時，該活化的T1R2/T1R3信號傳遞誘導了葡萄糖傳感器和運輸蛋白GLUT2，以促使葡萄糖進入細胞。經由放射性免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)而偵測到，葡萄糖增強了ATP生產以開啟L-型電壓-閘控的Ca²⁺通道(voltage-gated Ca²⁺ channels,VGCC)，導致細胞外鈣離子進入細胞，其促進胰島素分泌進入培養基。此反應是藉由以下來確認：經由RIA而測得，磺醯尿素(sulfonylurea)促進了胰島素分泌，而VGCC抑制劑尼非待平(nifedipine)阻斷了胰島素分泌(圖1C)。這些結果顯示葡萄糖能夠控制hTS細胞中之胰島素的合成和分 泌。經由qPCR分析而測得，此胰島素表現可歸因於CREB1信號傳遞，而非常規的胰腺與十二指腸同源匣1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)(圖2K)。

此外，免疫螢光成像研究顯示，在hTS細胞中不僅表現胰島素、CREB1、CaMKII、GLUT2以及MAFA，還有β-hCG、組織相容性抗原HLA-G以及多潛能轉錄因子(pluripotency transcription factor)CDX2，但沒有OCT4[八聚體-結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4)](圖1D)。亦有表現壓力蛋白熱休克蛋白HSP90。然而hTSC也不表現增生標記Ki-67、蛋白折疊活化子HSP70、腫瘤抑制子p53、自體抗原GAD65，以及細胞-細胞融合蛋白Syncytin(圖2M)，這支持了hTSCs站在TE-分化的滋養層之第一位置的概念。

使用鋅-螯合劑雙硫腙(dithizone,DTZ)的陽性染色法(一種用於活體外培養的β-細胞之特異性染色)，葡萄糖對於hTS細胞在形態上的壓力作用進一步被檢測，顯示：高葡萄糖迅速誘導細胞從貼附的纖維母細胞特徵轉變為3D聚集細胞叢。收回高糖導致細胞從從該細胞叢迅速釋放出而重新-貼附於培養皿上，恢復為原始的纖維母細胞特徵。細胞過程藉由一電腦顯微鏡視訊系統(Olympus,IX-81,DP30,MIU-IBC-IF-2)而被記錄並顯示於補充的線上視訊(視訊S1)。此外，細胞叢的超微結構研究顯示出較大的 細胞質核比例以及在兩個細胞之間的胞橋小體連接(desmosomes junction)。各種不同的空囊泡、大量的粒線體以及囊泡中未成熟的顆粒於細胞質區室中被觀察到，相似於胰臟β-細胞中所具者。最後，所證明的是，hTS細胞可具有表現胰島素和壓力蛋白HSP90的能力以應對外部威脅，其中hTS細胞可對葡萄糖刺激具高度敏感性，其可導致hTS細胞的可逆性細胞轉形。

實施例2 活體外誘導前驅調節滋胚內層細胞(Precursory Regulatory Cytotrophoblasts,prCTBs)

bFGF對於滋胚外層-衍生的hTS細胞的影響於此實施例中被檢測。在實驗中，從hTS細胞活體外誘導出prCTBs。

bFGF透過TGF-β1誘導上皮-間質轉變(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)

藉由西方墨點法(Western blot assay)(圖4B)和免疫細胞化學法(immunocytochemistry)(圖4C)所發現的是，bFGF在hTSCs中誘導TGF-β1表現(圖4A)並且向上調節間質細胞標記中間絲蛋白(vimentin)，而向下調節細胞-細胞粘著蛋白E-鈣黏素(E-cadherin)。這些作用藉由預處理以TGF-β1抗體而被抵銷(圖4D)。光學顯微術顯示出細胞形狀從細長的紡錘形轉變為胖且短的 特徵，伴隨著更多圓狀細胞核(圖4E)。這些現象顯示：bFGF誘導EMT，以獲得遷移和侵入的能力。

bFGF透過mRNA-124a促進定型內胚層(definitive endoderm,DE)的特徵

所發現的是，bFGF標靶細胞膜上的受體FGFR1以誘導PI3K/AKT/CREB1信號傳遞途徑的活化。經由DIANA-mirGen2.0的計算檢驗，藉由qPCR分析所證實的是，bFGF-誘導的CREB1標靶在微RNA-124a(miR-124a)的啟動子上一致的CREB結合序列(consensus CREB binding sequence)(TGACGTCA)，而CREB1的弱化(knockdown)會減少miR-124a表現。CREB1與miR-124a的正相關性被觀察到。

為了深入了解miR-124a的下游效應子(effectors)，SMAD4、GSK3β和CDX2的質體是使用pGL4.51載體(Promega,Madison,WI)來構建以用於螢光酵素報導子基因分析(luciferase reporter gene assay)。首先，miR-124a被顯示出標靶SMAD4基因，產生抑制性SMAD4。由於SMAD4可以與SMAD2/3交互作用以結合到MIXL1基因近端啟動子中的序列以進行轉錄，抑制性SMAD4造成抑制性同源區蛋白(homeodomain protein)MIXL1。此是藉由使用SMAD4 shRNA所驗證並且支持了成像研究[顯示與對照組相比，bFGF(10ng/ml)在15分鐘下誘導MIXL1明 顯表現。在4小時誘導下，MIXL1的表現強度降低，顯示是短暫表現]。其次，由miR-124a與抗-miR-124a抗體的預處理所證實，miR-124a被顯示出可以抑制肝醣合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)。結果，藉由使用對抗β-連接素的shRNA之分析而證明，抑制性GSK3β造成下游β-連接素(β-catenin)累積，導致核轉位(nuclear translocation)來標靶於FOXA2基因以進行轉錄(圖4F)。反之，叉頭盒蛋白A2(forkhead box protein A2,FOXA2)控制PDX1的表現，促使促-內分泌轉錄因子(pro-endocrine transcription factor)神經元素3(neurogenin 3,NGN3)去參與內分泌細胞分化的特化。第三，由miR-124a與抗-miR-124a抗體的預處理所證實，miR-124a標靶於CDX2基因來抑制CDX2合成。向下調節的CDX2導致OCT4的向上調節。反之，由成像研究所佐證，OCT4標靶於SOX17基因來進行轉錄以生成SOX17(SRY-Box蛋白17)。綜上，被證明的是，在8小時的誘導下bFGF可以促進miR-124a，從而藉由向上調節SOX17、FOXA2與OCT4以及向下調節MIXL1來獲得定型內胚層(DE)的特徵，其可以進一步促使胰島素的表現。

bFGF誘導prCTBs從hTS細胞生成

在8小時bFGF誘導下，觀察到胰腺祖細胞(pancreatic progenitor)生物標記顯著向上調節，包括PDX1、胰腺轉錄因子1 蛋白(pancreas transcription factor 1 protein,PTF1a)、SOX9以及同源盒1蛋白NKX(NKX6.1)。於20小時的誘導下這些分子信號的出現引發NGN3、前-胰島素C-胜肽以及胰島素的表現。除胰島素外，免疫螢光成像證實了在bFGF-處理的hTS細胞中多種胰腺祖細胞-標記及內分泌細胞-標記的存在，包括PDX1、肝細胞核因子-1-β(hepatocyte nuclear factor-1-beta,HNF1B)、NGN3、SOX9、NKX6.1與胰島素，以及NANOG、SOX2、升糖素、體抑素、GLUT2與多肽(polypeptide,PP)(圖3)。

接著，被發現的是，最初，bFGF-誘導的hTS細胞表現CDX2而非OCT4(圖5C)。於8小時的誘導下，隨著分化的進行，OCT4向上調節而CDX2向下調節，調節DE階段的多潛能性(pluripotency)。於12小時的誘導下，相似於中胚層的階段，在OCT4逐漸向下調節時，NANOG向上調節至高峰。其中，HSP90在分化的滋養層中維持OCT4和NANOG的位準。在12小時的誘導後，隨著分化進入祖細胞的階段，NANOG被向下調節而SOX2持續向上調節直至一天結束，於此形成了表現胰島素的prCTBs。值得注意的是，這些分子過程相似於胰腺中β細胞的發育，但不同於如先前所述之hTS細胞中葡萄糖-誘導的胰島素表現。多潛能轉錄因子的時空變化主要歸因於相互的負向自動調節機制，而SOX2在維持prCTBs的幹細胞特性(stemness)上扮演主要角色。最後，在我們 的實驗中證明的是，bFGF可以有效地誘導經分離的hTS細胞分化朝向一表現胰島素之新穎的胰腺外組織-特異性表現型(phenotype)，其於本文中被稱為前驅調節滋胚內層細胞(precursory regulatory cytotrophoblasts,prCTBs)。如此處所證明的，於活體外滋養層分化期間prCTBs主要可藉由SOX2來維持。

實施例3 來自hTS細胞的prCTB和原始滋胚內層細胞之差異

免疫組織化學顯示大多數的prCTB細胞藉由胰島素、GLUT2、CaMKII、Ki67(一增生因子)、β-hCG和HLA-G而被染色，顯示：prCTBs具有增生的特性(圖5A)。包括GAD65、HSP70、HSP90和p53而不包括合胞素(syncytin)的壓力蛋白亦有表現於prCTBs中，但與hTS細胞中所發現者有所區別(圖2M)。這些結果暗示：細胞外壓力源的作用可以在活體外驅動hTS細胞向prCTBs轉形。

在正常的子宮妊娠中，原始滋胚內層細胞(primitive cytotrophoblasts,pCTBs)會引起：1)絨毛狀CTBs；2)原始融合細胞滋養層(primitive syncytiotrophoblast,pSTBs)和隨後的STBs；以及3)絨毛外CTBs(extravillous CTBs)(EVTs)。被揭露的是，絨毛CTBs表現HSP90和胰島素，而較少/無p53和合胞素(圖5B)。融合細胞滋養層(Syncytiotrophoblasts,STBs)表現胰島 素、p53和合胞素，而較少/無HSP90。EVTs表現明顯的胰島素和p53，而較少/無HSP90和合胞素，顯示出侵入性而無增生的特性。圖5C描繪了此發育過程。

實施例4 來自hTS細胞和prCTBs的分泌蛋白體(secretomes)或胞外體(exosomes)

藉由基於Luminex技術的Milliplex分析，於hTS細胞和prCTBs這兩者的培養基中趨化因子(chemokines)、細胞激素(cytokine)和生長因子的位準被測量。結果顯示：hTS細胞和prCTBs這兩者皆能夠釋放明顯數量的多種分泌蛋白體或胞外體(圖7A，上區)，包括：

1)趨化因子

此群組包括RANTES(亦稱為CCL5)、MCP-1[亦稱為CCL2、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1)]、GROα[亦稱為CXCL1、CXCL2、巨噬細胞發炎性蛋白2-α(macrophage inflammatory protein 2-α)或MIP2-α]、MCP-3(亦稱為CCL7)、IL-8、趨化激素(Eotaxin)(亦稱為CCL11、CCL24與CCL26)、MDC(亦稱為CCL22)、IP-10(亦稱為IFNγ-誘導的CXCL10)、Fractalkine(亦稱為CX3CL1)、 MIP-1β(亦為CCL4)，以及可溶性CD40-配位子(亦為sCD40L、CD154)。

2)細胞激素和生長因子

此群組包括IL-6、IL-10、IL-4、IL-7、IL-15、IL-13、IL-1α、IL-1β、IL-12p40、IL-3，以及IL-2。亦分泌IFN-γ與IFN-α。而生長因子包括：PDGF-AA和PDGF-AB/BB[血小板-衍生的生長因子家族(platelet-derived growth factor family)]、VEGF、EGF[表皮生長因子(epidermal growth factor)]、bFGF、GM-CSF[顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)]、Flt3L[似FMS的酪氨酸激酶3配位子(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)]，以及IL-1β。

3)其他蛋白

此外，藉由分泌蛋白體的分析，hTS細胞和prCTBs這兩者皆能夠分泌可溶性人類白血球抗原G(soluble human leukocyte antigen G,sHLA-G)、轉變生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)、胞漿素原活化子抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)，以及IL-10(圖7B)。

然而，所使用之商業的人類血小板溶胞產物(如：PLUS，Compass)亦分泌胞外體於培養基中。藉由排除PLUS的基 本作用，所發現的是，初始的hTS細胞和prCTBs這兩者實際上皆能夠分泌包括下列的胞外體：主要具有GRO、MCP-1、Fractalkine、IP-10、MCP-3、趨化激素以及少量MIP-1β的趨化因子以及；包括IL-6和IL-8且伴隨著少量的IL-4、IL-1RA、IL-10、IL-12P40、IL-15、IL-1α以及IL-17A之細胞激素(圖7A，下區)。而生長因子包括PDGF-AA、VEGF、bFGF與G-CSF以及少量的Flt-3L以及GM-CSF(圖7A，下區)。這些數據顯示：初始的hTS細胞和prCTBs這兩者皆具有釋放多種分泌體或胞外體的能力以供作用。

圖7C顯示出另外累計之在hTSCs和prCTBs這兩者中的細胞激素IL-6和IL-8；趨化因子MCP-1和CXCL2；以及血管生成因子PDGF-AA與VEGF的生成。prCTBs表現血管生成分子CD105(Endoglin，一個作用於血管生成之TGF-β的受體)與CD146(血管內皮鈣黏素)(圖7D)。這些結果顯示：prCTB具有在胎兒-母體界面的蛻膜組織(decidual tissues)中起作用的能力。

實施例5 prCTBs展現免疫細胞關聯性生物標記

免疫細胞關聯性生物標記的表現是於包括8種獨立細胞株之prCTBs中藉由FACS分析而被檢測，顯示出相似NK和T細胞生物標記的模式。結果顯示：這兩者皆表現包括CD4+、CD8+、CD107a+以及(CD16+CD56)+的CD生物標記，與T細胞和NK細胞 共有相似的CD生物標記。代表性的細胞計數分析(cytometric analysis)顯示於圖8的表以及圖9A-9M中。(CD16+CD56)⁺細胞與CD107(+)細胞在hTSCs和prCTBs這兩者中皆顯示出最高的表現量(圖8和9L)。它們的組合區亦在細胞族群的分布上估大部分(圖8和9M)。這些結果顯示：prCTB具有在胎兒-母體界面上發揮似免疫細胞的功能之能力。

亦由免疫染色所揭露的是，prCTBs表現CD11b和CD49f(圖9N)。

此外，免疫墨點法(immunoblotting assay)確認hTS細胞和prCTBs這兩者皆表現ILT-2[似白血球Ig的受體1(leukocyte Ig-like receptor 1)，亦稱為LILRB1]、ILT-4(亦稱為LILRB2)、TCR[T細胞受體(T cell receptor)]，並且特別地有表現KIR2DL4[似殺手細胞Ig的受體(killer cell Ig-like receptor)]，其是由NK細胞和CD8+T細胞的亞群所表現來抑制胞溶性NK細胞(cytolytic NK cell)功能(圖7E)。它們亦表現PD-L1[計畫性死亡-配位子1(programmed death-ligand 1)]、Fas[細胞凋亡信號傳遞受體(apoptosis signal receptor)，亦稱為APO-1]、FasL(Fas配位子)[其誘導浸潤性淋巴細胞(infiltrating lymphocytes)的細胞凋亡]，以及NKp46(一主要NK細胞-活化的受體)(其參與標的細胞之清除)(圖7E)。令人感興趣的是，bFGF活化 了轉錄信號傳遞子和活化子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和轉錄因子c-JUN，從而促進FasL在prCTBs分化中的表現(圖7F)。藉由shRNA來弱化FGFR1確認了此作用。因此，具有(CD16+CD56)分子的prCTBs生成IFN-γ來刺激PD-L1的生成，從而識別腫瘤細胞中的同源受體PD-1並且向下-調節對抗惡性腫瘤的免疫反應。

bFGF透過prCTBs中的FGFR1/CREB1信號傳遞途徑來誘導IL-6和IL-8

為了探討prCTBs如何生成細胞激素IL-6和IL-8，hTSCs被培育以bFGF歷時1-天以模擬在輸卵管中的短暫停留。機制上來說，bFGF活化其在細胞膜上的受體FGFR1以誘導PI3K/磷酸化的(phosphorylated,p)AKT信號傳遞。接著，pAKT與下游pCREB1[cAMP反應要素結合蛋白1(cAMP responsive element binding protein 1)]交互作用將之磷酸化以活化pCREB1信號傳遞。藉由使用FGFR 1抑制劑PD166866以及用於PI3K和pAKT的特異性shRNA(圖7G-7J)來驗證這些分子過程。在細胞核中，藉由ELISA分析而證實(圖7C)，CREB1標靶該等基因而以時間-依賴性方式來生成IL-6(圖7K，左區)，並且以劑量-依賴性方式來生成IL-8(圖7K，右區)。這些分子過程在時間和空間上與EMT同步發生。綜上所述，bFGF透過自體分泌(autocrine)/旁分泌(paracrine) 的方式誘導hTSCs轉型為prCTBs並且在prCTBs中生成IL-6和IL-8。

在prCTBs中，IL-6誘導滋養層標記β-hCG，而IL-8誘導NK細胞標記CD56

藉由RT-qPCR分析，在prCTBs中，IL-6結合至細胞膜上的受體IL-6R以活化CREB1信號傳遞，導致β-hCG生成(圖7L，左區)。令人感興趣的是，藉由西方墨點分析，IL-6能夠結合至另一受體GnRHR以同步活化CREB1信號傳遞，隨後生成β-hCG(圖7M)。同時，藉由RT-qPCR分析，IL-8誘導CD56(亦被知曉為NCAM)生成，但無經由IL-8R(圖7L，右區)。然而，藉由西方墨點分析，我們發現IL-8能夠選擇地結合至另一受體CXCR2以活化STAT3[轉錄信號傳遞子和活化子3(signal transducer and activator of transcription 3)]信號傳遞；接著，標靶用於轉錄基因以生成CD56(圖7N)。這些分子過程是藉由使用針對β-hCG的表現之GnRHR抑制劑Elagolix和CREB1抑制劑666-15來驗證(圖7L)；而CXCR2抑制劑SB225002和STAT3抑制劑Stattic則是針對CD56表現(圖7N)。這些結果顯示：在prCTBs中，IL-6誘導滋養層生物標記β-hCG；而IL-8同步以自體分泌/旁分泌的方式誘導NK細胞生物標記CD56。最後，我們證明bFGF誘導hTSCs向prCTBs的轉形，導致獨特的β-hCG(+)CD56(+)prCTBs。

IL-8透過prCTBs中的CXCR2/CREB1信號傳遞誘導T細胞標記CD4

同時地，IL-8結合且活化prCTBs細胞膜上的受體CXCR2並透過自體分泌/旁分泌方式來誘導CREB1信號傳遞，而允許其核轉位。藉由西方墨點法分析，在細胞核中，CREB1標靶CD4基因來轉錄生成CD4分子(圖7O)。然而，我們發現IL-8亦能夠結合CXCR2受體從而活化STAT3信號傳遞，導致STAT3的核轉位。在細胞核中，STAT3標靶於CD4基因的不同位點以轉錄生成CD4(圖7P)。這些分子過程是藉由使用CXCR2抑制劑SB225002、CREB1抑制劑666-15以及STAT3抑制劑Static而被驗證(圖7O和7P)。

IL-8誘導Foxp3以形成似CD4(+)Foxp3(+)Treg細胞prCTBs

被發現的是，IL-8-誘導的CXCR2信號傳遞能夠結合從而活化STAT3信號傳遞以供STAT3的核轉位。接著，藉由西方墨點法分析，STAT3標靶於Foxp3基因來轉錄生成Foxp3蛋白(亦被知曉為參與免疫系統反應的scurfin)(圖7P)。這些分子過程是藉由使用CXCR2抑制劑SB225002和STAT3抑制劑Static而被驗證(圖7P)。這些結果顯示：IL-8導致在prCTBs中生成CD4(+)和Foxp3(+)分子，相似於CD4(+)Foxp3(+)Treg細胞。CD4(+)Foxp3(+)標記的免疫組織化學共同-染色在prCTBs中被實現(圖7Q)。

實施例6 胎兒-母體界面上的prCTB障礙

prCTBs在蛻膜組織中表現促進血管生成的因子

藉由Milliplex分析，prCTBs能夠分泌VEGF和PDGF-AA(圖7C)；而藉由ELISA分析，prCTBs能夠分泌纖溶酶原活化子抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)和IL-10(圖7B)；以及藉由FACS分析，prCTBs會表現CD105(+)和CD146(+)標記(圖7D)。所有的這些分子表現顯示：prCTBs具有促進血管新生和血管生成的能力，例如，在胎兒-母體界面的蛻膜組織的SA再成型。

MCP-1和CXCL2協同地驅使prCTBs的移動

穿透小室侵入性和遷移分析(transwell invasive and migration assay)顯示MCP-1以劑量-依賴性方式顯著誘導prCTB的侵入和遷移(圖10A)，且以時間-依賴性方式顯著誘導於hTSCs和prCTBs這兩者的侵入和遷移(圖10B)。然而，CXCL2在prCTBs中亦以劑量-依賴性方式促進細胞遷移(圖10C)，且於hTSCs和prCTBs這兩者中亦以時間-依賴性方式促進細胞遷移(圖10D)。這些結果顯示：MCP-1和CXCL2具有以時間-和劑量-依賴性方式協同地驅使prCTBs移動的能力。

胎兒-母體界面上形成新的prCTB障礙

免疫組織化學成像顯示prCTBs朝向具有Syncytin、p53、β-hCG以及HLA-G的表現之EVT遷移，同時HSP90出現於內部CTBs層(圖10E)。藉由免疫組織化學法，在胎兒-母體界面處，CD56(+)prCTBs以朝向聚集在侵入性EVTs的趨勢零星地分佈在絨毛基質組織(villous stromal tissues)(圖10F，上區和中區)。這些結果顯示：prCTBs分化成表現Syncytin、p53、β-hCG以及HLA-G的EVTs，來協同地侵入母體蛻膜的蛻膜上皮細胞層以供著床。

被發現的是，CD56(+)prCTBs和β-hCG(+)prCTBs這兩者皆定錨並侵入母體蛻膜中(圖10F，中區；圖10G，上區)。相似於蛻膜組織中常見的dNK細胞，經由侵入和遷移，CD56(+)prCTBs估據了大量細胞組分(圖10F，下區)，而β-hCG(+)prCTBs有相似的行為方式(圖10G，中區)。被發現的是，β-hCG(+)prCTB取代了在動脈血管上的內皮細胞之位置(圖10G，中區)，且亦出現於靜脈血管腔中(圖10G，下圖)，顯示出SA再成型以及prCTBs侵入蛻膜靜脈的現象。最後，大量的CD56(+)β-hCG(+)prCTBs在蛻膜側累積以形成細胞障礙，其被稱為在胎兒-母體界面處的“prCTB障礙(prCTB barrier)”。

實施例7 prCTBs於交互作用中誘導固態腫瘤細胞凋亡

胰腺癌細胞(PANC-1，CRL-1469)

胰腺癌細胞(PANC-1)如何與prCTBs交互作用被研究。藉由光學顯微術，prCTBs與PANC-1的共-培養顯示prCTBs能夠遷移以包圍並滲透到PANC-1的細胞群落中，導致PANC-1的凋亡(圖11A)。此凋亡現象進一步藉由使用細胞凋亡/壞死檢測套組(藍色，綠色，紅色)並依據製造商的操作指南(ab176749，Abcam)而被證明。圖11B顯示了兩種活細胞的交互作用，而圖11C顯示交互作用中PANC-1的細胞凋亡。

機制上來說，被發現的是，prCTBs表現蛋白質PD-L1[計畫性細胞死亡-配位子-1(programmed cell death-ligand-1)]，而無PD-1[計畫性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1)](圖11D，左欄)，而PANC-1表現PD-L1和PD-1這兩者(圖11D，右欄)。這意味著prCTBs能夠傳遞PD-L1/PD-1細胞死亡信號至標的PANC-1細胞，導致PANC-1細胞凋亡。然而，由於prCTBs中缺乏PD-1，PANC-1細胞的PD-L-1無法向prCTBs發送死亡信號，說明了prCTBs中並未發生細胞凋亡。當我們處理Fas/FasL細胞死亡信號傳遞途徑時，我們發現prCTBs表現Fas配位子(FasL)和Fas(作為FasL受體)這兩者，而PANC-1表現Fas而無FasL(圖11E)，藉此prCTBs可能傳遞細胞凋亡的FasL/Fas信號至標的PANC-1，而導致PANC-1細胞凋亡。反 之，prCTBs表現Fas但在PANC-1中缺乏FasL，這顯示prCTBs於交互作用時FasL/Fas細胞死亡信號傳遞不會發生。

乳腺癌細胞(MCF-7，HTB22)

藉由3D螢光顯微術而觀察到，prCTBs與乳腺癌細胞(MCF-7)的共培養顯示出吸引和交互作用，而導致MCF-7的凋亡(圖11F)。prCTB所表現出的PD-L1會向其在MCF-7細胞上的受體PD-1發送死亡信號傳遞，導致細胞凋亡反應(圖11G，上區)。MCF-7亦表現PD-L1，但缺乏PD-1受體的prCTBs防止任何細胞凋亡(圖11G，下區)。然而，當我們檢測另一個FasL/Fas細胞死亡軸時，我們發現prCTBs表現FasL而MCF-7表現Fas，而允許在MCF-7中發生FasL/Fas死亡信號傳遞(圖11H，上區)。

prCTBs含有抗-細胞凋亡的蛋白Bfl-1和Mcl-1

令人感興趣的是，prCTBs表現Fas而MCF-7表現FasL(圖11H，下區)。此事實暗示了prCTBs可能發生凋亡，但情況並非如此。為了解釋此情況，我們藉由RT-qPCR分析而發現，prCTBs會顯著表現更高位準的抗-細胞凋亡Bfl-1和Mcl-1 mRNAs於prCTBs中(圖11I)。Bcl-1家族蛋白成員Bfl-1和Mcl-1這兩者皆具有抗-細胞凋亡能力來避免癌細胞的死亡信號傳遞，藉此促進細胞存活。

其他固態腫瘤細胞

因此，prCTBs與一系列固態腫瘤細胞的共-培養被進行並藉由使用免疫細胞化學法與3D螢光顯微術的組合而被檢測。包括肝Huh 7細胞、卵巢PA-1(CRL-1572)細胞、肺H1299(CRL-5803)細胞、胃MNK45(TCP-1008)細胞以及黑色素瘤A375(CRL-1619)細胞的所有固態腫瘤細胞在共-培養期間皆顯示出細胞凋亡(圖11J)。這些結果顯示：prCTBs具有消滅多種固態腫瘤細胞的能力，取決於其所參與的細胞死亡信號傳遞途徑。

實施例8 prCTBs的發育

為了進一步闡明絨毛膜組織中prCTBs與dNK細胞之間的關係，絨毛膜絨毛被研究，其是在同意下得自於同樣8-週胎齡之基於醫學原因而流產的婦女以及子宮外孕的婦女。首先，藉由免疫組織化學法證實prCTBs中CD56生物標記的存在(圖12A，上區)。隨後，在子宮外孕的絨毛膜絨毛上的免疫組織化學法顯示：零星的CD56(+)prCTBs可見於內層絨毛CTBs和絨毛基質(villous stroma)中，而累積於EVT區域中(圖12A，中區)。而β-hCG(+)於絨毛滋養層(villous trophoblasts)中被觀察到且亦累積於EVT區中(圖12A，右區)。

在正常著床下，累積的CD56(+)prCTBs和β-hCG(+)CTBs於EVT區域中被發現且零星地分佈在鄰近的蛻膜 組織中(圖12B，分別於左上區與左下區)。令人感興趣的是，在母體蛻膜組織中表現了大量的CD56(+)prCTBs和β-hCG(+)CTBs(圖12B，分別於左上區與左下區)。這些結果顯示：prCTBs是從絨毛滋養層的內層釋放，透過絨毛基質向EVT區域遷移以供著床。一旦錨定於母體的蛻膜組織上，prCTBs藉由未知的信號傳遞轉形成dNK細胞。經由分泌性胞外體，prCTBs/dNK細胞具有以下能力：遷移至蛻膜組織、與蛻膜基質細胞溝通、調節母體免疫系統，以及最終完成著床。如此，被提出的是，在早期妊娠中，dNK細胞是衍生自與錨定EVTs之經轉形的prCTBs有關的hTS細胞，。

實施例9 用於實施例1-8中所述的實驗之材料和方法

實驗模型與個體細節

人類滋養層幹(hTS)細胞是衍生自滋養層組織。該滋養層組織是以告知同意書(informed consent)得自於妊娠7-8週之已遭受輸卵管子宮外孕的婦女。此研究是由KMUH機構審查委員會(Institutional Review Board of KMUH)所認可。初始的hTS細胞在37℃下於含有5% CO₂潮濕的空氣中在補充有10%(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；SAFC Biosciences)的α-MEM(Thermo Fisher Scientific)中被培養與繼代。每2-3天以1：3-1：6的分配比例來將培養物手動繼代。用於使hTS細胞生長，低接種密 度和新培養基被測試，包括1)含有MesenCult^TM-ACF PLUS 500x補充劑和L-谷氨醯胺(L-Glutamine)之含有或不含有基質[諸如細胞附著基質(Cell Attachment Substrate)]的MesenCult^TM-ACF Plus培養基，以及2)含有或不含有基質之含有核苷的、GlutaMAX^TM補充劑以及10%Stemulate^TM人類血小板溶胞產物細胞培養基補充劑(Human Platelet Lysate Cell Culture Media Supplement)的α-MEM。針對CD分子的流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)，FBS被替代以CMP級PLUS(Compass Biochemical)。包括HLA-G、β-hCG以及CDX2的特徵生物標記以及無法檢測的CD34和CD45穩定地表現。hTSC細胞誘導成prCTBs是藉由在繼代5-10代的hTS細胞中處理10ng/ml bFGF歷時24小時來進行。一些用於誘導的培養基被測試，包括1)含有MesenCult^TM-ACF PLUS 500x補充劑和L-谷氨醯胺之含有或不含有基質(諸如細胞附著基質)的MesenCult^TM-ACF Plus培養基，以及2)含有或不含有基質之含有核苷的、GlutaMAX^TM補充劑以及10%Stemulate^TM人類血小板溶胞產物細胞培養基補充劑的α-MEM。該接種密度大約為10,000細胞/cm²。該培養物不含青黴素、鏈黴素、巰基乙醇和/或菸鹼醯胺。該培養物亦可不含動物成分、血清(諸如胎牛血清)、抗生素、視黃酸(retinoic acid)、地塞米松(dexamethasone)、重組型人類抑癌素M(recombinant human oncostatin M)、BMP4和/ 或HGF。分化的方案是由實證試驗來確定(數據未顯示)。階段-特異性的譜系分化被提及為前述的各種不同細胞生物標記。細胞於所指定的時間下被收取以供不同分析。

轉染實驗(Transfection Experiment)

hTS細胞是使用TransIT-LT1轉染試劑(Mirus Bio LLC)而被轉染以siRNA或shRNA或3'UTR報導子質體(reporter plasmids)。轉染是於100μl OPTI-MEM(Gibco)中以2μg siRNA或shRNA加上4μl轉染試劑來進行。在室溫下培育歷時10分鐘後，轉染混合物被緩慢地添加至細胞中過夜。經轉染的細胞繼而被重新培育以補充有10% FBS的α-MEM以供進一步處理。

質體構築與雙重螢光酵素報導子分析(Plasmids Construction and Dual Luciferase Reporter Assay)

為了構築螢光酵素3’UTR報導子質體，我們從hTS細胞的基因組DNA萃取物擴增出3’UTR片段。針對如下所示的3’UTR報導子建構物，藉由使用具有PsiI位址的前向引子(forward primer)和具有MfeI位址的反向引子(reverse primer)來對3’UTR區域進行PCR擴增：針對Cdx2 3’UTR區域：5’-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3’(序列辨識編號：1)以及5’-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3’(序列辨識編號：2)；針對Smad4 3’UTR區域1：5’-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3’(序 列辨識編號：3)以及5’-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3’(序列辨識編號：4)；針對Smad4 3’UTR區域2：5’-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3’(序列辨識編號：5)以及5’-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3’(序列辨識編號：6)；針對GSK3β 3’UTR區域：5’-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3’(序列辨識編號：7)以及5’-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3’(序列辨識編號：8)。在組合的PsiI和MfeI(NEB)切割之後，藉由使用T4 DNA連接酶(ligase)(Takara)來將該3’UTR插入子(insert)次選殖至pGL4.51質體(Promega)中。

關於雙重螢光酵素分析(dual luciferase assays)，被共-轉染以pGL4.74載體、水母螢光酵素質體(500ng,Promega)與非-專一性對照組miRNA(30pmol)或miR-124a前驅物(30pmol；System Biosciences)之螢火蟲螢光酵素報導子(500ng)或沒有任何3’UTR的空的載體被共-轉染至hTS細胞(各井1.5×10⁴細胞)。在轉染後另外24小時，更換培養基，螢光酵素活性是藉由雙重螢光酵素報導子分析系統(Promega)以及Centro LB 960微盤式冷光儀(Centro LB 960 Microplate Luminometer)(Berthold Technologies)而被分析。用於評估，水母螢光酵素值首先對螢火蟲螢光酵素活性進行標準化，而所算出之各個3’UTR報導子的活性進一步對對照載體所具者進行標準化。數據以平均值±SD(n=8)來 表示，p<0.05作為統計學顯著性。將在細胞溶解緩衝液中所製得的全細胞萃取物拿來進行使用CDX2、SMAD4、GSK3β以及β-肌動蛋白抗體的免疫墨點分析。

分泌蛋白體的分析

hTS細胞培養基(10ml)於80-90%匯聚(confluence)下被收取，繼而進行離心(3,000rpm，30min，4℃)。藉由使用3kDa Vivaspin濃縮器(Sigma)，上清液進一步被濃縮至1ml。經濃縮的上清液進一步藉由免疫墨點法分析針對TGF-β1、HLA-G和PAI-1來進行檢測。IL-10的位準是藉由OptEIA ELISA分析套組並依照供應商的操作指南(BD Pharmingen，聖地亞哥)而被測量。可檢測的IL-10濃度範圍是介於2至2,000pg/ml之間。等分(aliquot)的100μl樣品是以三重複而被測量。上清液的總蛋白是藉由使用Pierce BCA蛋白分析套組(Thermo Scientific)而被測量。為了在葡萄糖刺激試驗中測量C-胜肽和胰島素位準，bFGF處理後，在超過80%匯聚的細胞下，高葡萄糖(20mM)被添加至α-MEM培養基(5ml)中。培養基於不同時間點(5、10、20、30、60以及120分鐘)下被收集，藉由凍乾機(VirTis；Warminster)來進行冷凍乾燥，以及以無菌水(400μl)來進行水合以供放射性免疫分析法(RIA)。於5種分析中，C-胜肽和胰島素位準分別是藉由C-PEP II-RIA-CT(DIAsource ImmunoAssays S.A.)與Coat-A-Count胰島素(Siemens Healthcare Diagnostics)而被測定。

胞外體的分析

細胞培養物上清液被收取自：1)歷時24小時的hTS細胞培養物(1x1.86細胞/10ml)以及2)bFGF(10ng/ml)-處理歷時24小時的hTS細胞(prCTBs)。這些上清液是在台灣國家實驗研究院(National Experimental Research Laboratories,Taiwan)使用Luminex LX 200儀器(R & D系統，美國)而被進行Milliplex分析，以及數據是藉由Milliplex分析軟體(5.1.0.0)而被分析。

穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy)

在高葡萄糖刺激後，在培養皿上hTS細胞-形成的細胞叢是以Wolfram針而被解剖。用於穿透式電子顯微術，細胞叢被固定於含有3%(w/v)三聚甲醛(Merck)、1.5%(w/v)戊二醛(Merck)以及2.5%(w)蔗糖(Merck)的0.1M PBS(Merck；pH 7.4)中在室溫(RT)下歷時1小時或在4℃下隔夜。樣品在4℃下在含有1%(v/v)OsO₄(Sigma)的Palade’s固定劑中進行2小時的鋨酸化(osmication)之前與之後被清洗以PBS，被處理以醋酸鈾醯二水合物(uranyl acetate dihydrate)(Merck)，透過一梯度-系列的乙醇溶液而被脫水，以及使用EMBed-812包埋套組(EMBed-812 Embedding kit)(Electron Microscopy Sciences)而被包埋。超薄切片被染色以醋酸鈾醯以及檸檬酸鉛(lead citrate)(Electron Microscopy Sciences)，並且使用JEM-2000 EXII(JEOL，東京)而被檢測。

西方墨點法

在細胞培養中，hTS細胞被處理以bFGF且於指定的時間被收取，以及被置於補充有蛋白酶(Thermo Scientific)與磷酸酶抑制劑(Cell Signaling Technology)的RIPA溶解溶液(Millipore)中。在30μg溶胞產物於聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳之後，被進行電轉漬至PVDF膜(Millipore)上。藉由在室溫下進行5%脫脂奶(配於PBS中)的封阻(1小時)，標的蛋白質被培育於一次抗體。全部的膜被培育以化學發光劑(Millipore)，而成像是藉由ChemiDoc XRS系統(Bio-RAD)而被拍攝。所使用的抗體被列示於關鍵資源表格(Key Resource Table)中。數據是藉由AlphaEaseFC(版本4.0.0)系統而被分析。

免疫螢光成像(Immunofluorescence Imaging)

關於免疫細胞化學術：簡言之，具有細胞培養物的玻片在室溫下在95%(v/v)乙醇中被固定歷時30分鐘，以PBS清洗3次以及被培育以含有0.05%(v/v)Tween 20(PBST；Sigma)以及5%(v/v)標準驢血清(Millipore)的封阻緩衝液PBS歷時60分 鐘。一次與二次抗體於所指定的封阻緩衝液中被稀釋。一次抗體被培育在4℃下隔夜或在室溫下2小時。培育以配於封阻緩衝液中的專一性一次抗體之後，適當的螢光素異硫氰酸鹽(FITC,Invitrogen)或Alexa Fluor 488、594以及647(Invitrogen)或Dylight 488以及594(BioLegend)綴合的二次抗體在室溫下被添加歷時1小時。藉由使用DAPI的細胞核對比染色，玻片被固定以50%甘油。影像是藉由共軛焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)(LSM700；Zeiss Z1或Olympus FluoView 1000共軛焦雷射掃描顯微鏡)或Countess II FL(Invitrogen)或3D explorer-fluo顯微鏡(Nanolive，瑞士)或TissueFAXS系統(TissueQnostics GmbH)而被拍攝。

關於免疫組織化學：所有步驟於Leica Bond-III自動化系統(Leica microsystems,Bannockburn)上被進行。染色使用來自Bond聚合物精製套組(cat #DS9800，Leica)的二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)和蘇木素(hematoxylin)。完成執行並卸下玻片盤後，將covertiles從頸部小心地向上抬起以移除。在蓋玻片之前，玻片經由95%和100%乙醇各更換2次以及二甲苯(xylene)更換2次而被脫水。

TaqMan miRNA和即時定量PCR分析(Quantitative Real-Time PCR Assay)

依據製造商的操作程序，RNA是使用TRIZOL試劑(Invitrogen)與DNAase I on-column切割(Qiagen)而分離自三重複或五重複樣品中的hTS細胞。總RNA(500ng)是使用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)而被用於反轉錄。PCR是使用每反應1/40th的cDNA以及400nM前向與反向引子而被執行二重複。對於miRNA莖-環qPCR，我們依據製造商的操作指南使用單管TaqMan miRNA分析(Applied Biosystems)。所有RT反應，包括無-模板對照組和RT負對照組，於GeneAmp PCR 9700 Thermocycler(Applied Biosystems)中被進行。比較性即時PCR是使用針對miR-124a或RNU6B的專一性引子(Applied Biosystems)而被進行三重複或五重複，包括無-模板對照組。U6 snRNA(RNU6B；Applied Biosystems)用作為一內部對照組。相對表現量是使用SDS2.2.2軟體(Applied Biosystems)而被計算出，並且被用來進行比較性△Ct分析。

免疫沉澱(IP)分析

bFGF-處理的hTS細胞的細胞溶胞產物被收集。藉由培育以蛋白質G-瓊脂糖(Millipore)歷時30分鐘，總蛋白質(100μg)被處理以所列示的專一性一次抗體過夜。在處理以蛋白質G-瓊脂糖珠粒歷時2小時之後，樣品是使用RIPA溶解緩衝液(Millipore) 而被清洗3次，繼而被添加以蛋白質加載染劑並被煮沸歷時5分鐘。樣品是藉由8% SDS-PAGE而被解析並且被進行免疫墨點分析。

染色質免疫沉澱(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)分析

ChIP分析是藉由使用ChIP-IT表現染色質免疫沉澱套組(Active Motif)依據製造商的操作指南而被執行。簡言之，免疫沉澱的DNA片段是萃取自hTS細胞(1x10⁶)。抗-CREB1或抗-OCT4或抗-β-連接素的抗體被使用。特定的引子被使用來擴增miR-124a或SOX17或FOXA2的啟動子區域上的守恆結合位點，其被列示如下：針對miR124-2的啟動子：前向5’-tctgcggctctttggtttca-3’(序列辨識編號：9)與反向5’-tctgccttcagcacaagagg-3’(序列辨識編號：10)；以及前向5’-gcggctctttggtttcaagg-3’(序列辨識編號：11)反向5’-ctgccttcagcacaagagga-3’(序列辨識編號：12)。針對miR124-3的啟動子：5’-cccgcagttctcaaggacac-3’(序列辨識編號：13)與反向5’-agaagggagccaggcaagtc-3’(序列辨識編號：14)。針對SOX17的啟動子：5’-ttgtagattgctctctctcctcc-3’(序列辨識編號：15)與反向5’-gtgaagccttggctagggg-3’(序列辨識編號：16)。針對FOXA2的啟動子：5’-cccatcattgattcctggat-3’(序列辨識編號：17)與反向5’-ttgggaggctgagatttgtc-3’(序列辨識編號：18)。

胞外體分析

細胞培養物上清液被收取自：1)歷時24小時的hTS細胞培養物(1x1.8⁶細胞/10ml)以及2)bFGF(10ng/ml)-處理歷時24小時的hTS細胞(prCTBs)。這些上清液是在台灣國家實驗研究院使用Luminex LX 200儀器(R & D系統，美國)而被進行Milliplex分析，以及數據是藉由Milliplex分析軟體(5.1.0.0)而被分析。

流動式細胞測量分析(Flow Cytometry)

關於胰島素分析，hTS細胞是藉由刮取或使用1X TrypLE(Thermo Fisher Scientific)的胰蛋白酶化而被收集，並以PBS而被清洗。細胞(5x10⁶細胞/ml)於冰上被培育於封阻緩衝液(外加5%驢血清的PBST)歷時1小時，繼而於4℃下重新散浮於含有AlexaFluor®647綴合的抗-胰島素抗體(9008s，Cell signaling)或未綴合的抗-胰島素抗體(sc-7839，Santa Cruz)的封阻緩衝液中歷時30分鐘。細胞在封阻緩衝液中被清洗兩次，且用以未綴合的抗體與以染色，繼而在冰上於黑暗中被培育以含綴合有AlexaFluor®647的二級抗體之封阻緩衝液歷時30分鐘。在清洗兩次之後，在流動式細胞測量分析(LSR-II flow cytometer；BD Biosciences)之前，使細胞通過具有細胞過濾器蓋(BD Falcon)的聚苯乙烯圓底管。結果是藉由FlowJo軟體而被分析。

關於多潛能轉錄因子分析，hTS細胞被轉染以非-特異性shRNA或者對抗CDX2或OCT4或SOX2或NANOG的shRNA。細胞(5×10⁶細胞/ml)接著被培育於特定的一次抗體歷時30分鐘。藉由在經調整的稀釋下在4℃下培育以適當的螢光染劑-綴合的一次抗體歷時1小時，樣品在流動式細胞測量分析(FACScan,BD Biosciences,San Jose,CA)之前被清洗以及被重新散浮於PBS中，繼而通過具有細胞過濾器蓋(BD Falcon)的聚苯乙烯圓底管。數據是使用Cell-Quest軟體(BD Biosciences)而被分析。

關於CD生物標記分析，hTS細胞或prCTBs(1x10⁵~1x10⁶)被懸浮在240μl的1X FCM緩衝液(Leinco,F1175)中。細胞(30μl)被染色以7-AAD(BD,5599257)、螢光標記的抗體[BD多重測試6色TBNK(BD,337166)+BV421-標記的抗-CD107a(BioLegend,328625)或僅BV421-標記的抗-CD34(BD,562577)或PerCP Cy5.5-標記的抗-CD45(BD,340952)+APC-標記的抗-CD3(BD，555342)+PE-標記的抗-γδTCR(BD,340887]或螢光標記的同型對照組抗體[(FITC-標記的IgG1κ(BD,556649)+PE-標記的IgG1κ(BD,556650)+PE-標記的IgG2bκ(BD,556656)+PerCP-Cy^TM5.5-標記的IgG1κ(BD,552834)+PE-Cy ^TM7-標記的IgG1κ(BD,557872)+APC-標記的IgG1κ(BD,550854)+APC-Cy7-標記的IgG1κ(BD, 557873)+BV421-標記的IgG1κ(BD,562438)或僅BV421-標記的IgG1κ(BD,562438)]。於室溫下培育歷時15分鐘之後，細胞被清洗以1ml 1X FCM緩衝液並重新散浮於200μl 1X FCM緩衝液中。最後，細胞樣品藉由使用FACSVerse流動式細胞測量分析儀(BD,651155)和FACSuite軟體而被分析。

細胞凋亡分析

多種癌細胞(2,000個細胞)[包括PANC-1細胞(胰腺)、MCF-7細胞(乳腺)、H1299細胞(肺)、MKN45細胞(胃)、HepG2細胞(肝)、PA-1細胞(卵巢)、A375細胞(黑色素瘤)和PC-3細胞(前列腺)]是使用35mm玻璃底皿(ibidi；Cat#81158)中的培養基於5%CO₂、37℃下的培育來進行接種與培養。細胞貼附隔夜後，bFGF-誘導的hTS細胞(2x10⁴個細胞)被添加以共同-培養歷時超過24小時。關於凋亡測定，共同-培養的細胞是藉由使用細胞凋亡/壞死套組(Apoptosis/Necrosis kit)(ab176749，Abcam，劍橋，英國)並依據製造商的操作指南而被染色。簡言之，移除培養基之後，細胞藉由使用分析緩衝液而被清洗兩次。藉由添加Apopxin綠色指示劑(凋亡的細胞/綠色)和CytoCalcein 450(健康的細胞/藍色)以供染色，細胞於室溫下被培育大約40分鐘。以緩衝液清洗兩次之後，細胞於3D cell explorer-fluo(Nanolive，瑞士)之下被觀察。

prCTBs和PANC-1細胞在2：1的比例下之共-培養(3×10⁴細胞/井)於12-井培養盤中在37℃下進行歷時6天，並且藉由光學顯微鏡來觀察。關於細胞凋亡測定，共-培養的細胞(在24小時)是以細胞凋亡/壞死套組(ab176749，Abcam，劍橋，英國)並依據製造商的操作指南而被分析。移除培養基之後，細胞藉由使用分析緩衝液而被清洗兩次。接著，各井添加Apopxin綠色指示劑(凋亡的細胞)和CytoCalcein 450(健康的細胞)以於室溫下培育歷時60分鐘。細胞以分析緩衝液而被清洗且藉由螢光顯微鏡而被分析。

穿透小室分析(Transwell Assays)

prCTB(1x10⁶細胞/ml)使用6-井穿透小室插入件(孔徑為8μm，Corring)而被接種，並在37℃和5%CO₂下被培育歷時10分鐘以使細胞沉降。為此，添加細胞外基質(extracellular matrix,ECM)材料於穿透小室薄膜上方，繼而添加細胞於ECM上方。例如，將Matrigel在冰上解凍且液化，接著將30-50μl Matrigel添加至24-井穿透小室插入件中，並於37℃的培養箱中進行固化歷時15-30分鐘以形成一薄凝膠層。將細胞溶液添加到Matrigel塗層上方以模擬通過細胞外基質的侵入。穿透小室細胞遷移分析測量細胞對化學-吸引劑的趨化能力。然而，穿透小室細胞侵入分析測量細胞通過細胞外基質的細胞趨化性和侵入性這兩者，此一過程常見於癌症轉移或胚胎發育。

使用吸量管將600μl所欲的化學-吸引劑非常小心地添加到24-井培養盤的下腔室底部。添加化學-吸引劑而不移動穿透小室插入件且避免產生氣泡。確保底部井中的化學-吸引劑液體與上部井中的薄膜接觸，以形成趨化梯度。培育時間取決於細胞類型和所使用的化學-吸引劑。注意：可能需要進一步測試來決定培育期間。注意：對於貼附性細胞，經遷移的細胞將貼附在該薄膜的另一側^1,8。經遷移的細胞之定量可以依照步驟2.4到2.8而被進行(步驟2.4-2.8不需於無菌環境中進行)。對於非-貼附性細胞，經遷移的細胞會掉入下腔室的培養基中。經遷移的細胞之數量可以藉由使用血球計數器(hemocytometer)或流動式細胞儀(flow cytometer)而被計數⁵。

從培養盤中移除穿透小室插入件。視所需而多次使用棉籤塗抹器，小心地移除培養基以及尚未從該薄膜上方遷移的剩餘細胞而不使其損傷。

將600-1,000μl的70%乙醇添加至24-井培養盤的井中。將穿透小室插入件置於70%乙醇中歷時10分鐘以允許細胞固定。從24-井培養盤中移除穿透小室插入件且使用棉籤塗抹器以去除該薄膜上方殘留的乙醇。使該穿透小室薄膜乾燥(一般10-15分鐘)。

將600-1,000μl的0.2%結晶紫添加至24-井培養盤的一個井中，並將該薄膜置入其中以供染色。於室溫下培育歷時5-10分鐘。

使用吸量管尖管或棉籤塗抹器來從膜的頂部和緩地去除結晶紫。為了避免洗去固定的細胞，非常小心地視所需而將該薄膜浸入蒸餾水中多次以去除多餘的結晶紫。使該穿透小室薄膜乾燥。

在倒立顯微鏡下觀察並計數不同視野中的細胞數量，以得到經由該薄膜而向化學-吸引劑遷移並貼附在該薄膜下側的平均細胞總數。

統計學分析

在免疫墨點法分析、qPCR分析、報導子分析以及胰島素與IL-10分析中的實驗是如所指定的以三重複或四重複而被進行並且被重複2次。p值是藉由以雙尾分佈的史徒登氏t-檢定而被計算，以及p值<0.05被認為具有統計學顯著性。

當適合時，此處所揭露的一或多個具體例、實例或方面可被組合以本文所揭露的任何其它具體例(等)、實例(等)或方面(等)。

當一些具體例已於此處被顯示以及被描述，該等具體例僅被提供作為例示。在不背離本發明下可存在許多的變化、改變以及替換。應被瞭解的是，在實施本發明上可對本文所述之本發明具體例採取各種不同替代方案。

<110> 美商加速生物科學有限公司(Accelerated Biosciences Corporation)

<120> 前驅調節滋胚內層細胞及其用途

<140> TW109114912

<141> 2020-05-05

<150> US62/843,925

<151> 2019-05-06

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Cdx2 3’UTR區域的前向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Cdx2 3’UTR區域的反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Smad4 3’UTR區域1的前向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Smad4 3’UTR區域1的反向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Smad4 3’UTR區域2的前向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增Smad4 3’UTR區域2的反向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增GSK3β 3’UTR區域的前向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增GSK3β 3’UTR區域的反向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-2的啟動子的前向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-2的啟動子的反向引子

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-2的啟動子的前向引子

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-2的啟動子的反向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-3的啟動子的前向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增miR124-3的啟動子的反向引子

<400> 14

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增SOX17的啟動子的前向引子

<400> 15

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增SOX17的啟動子的反向引子

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增FOXA2的啟動子的前向引子

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增FOXA2的啟動子的反向引子

<400> 18

Claims (23)

1. 一種藥學組成物，其包含有：一經分離的前驅調節滋胚內層細胞(prCTB)及一藥學上可接受的賦形劑，(i)該prCTB表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、人類白血球抗原G(HLA-G)、CD56、胰島素、熱休克蛋白(HSP90)、CD4、CD16、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(ii)該prCTB表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40-配位子(sCD40L)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合；以及其中該prCTB缺乏計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)之表現。
2. 如請求項1的藥學組成物，其中該prCTB表現CD4、CD16、CD56、CD107a、CD8，或者它們的任何組合。
3. 如請求項1的藥學組成物，其中該prCTB缺乏合胞素。
4. 如請求項1的藥學組成物，其中該prCTB進一步表現介白素15(IL-15)；似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)；β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、可溶性人類白血球抗原G(HLA-G)、轉形生長因子β1(TGF-β1)、胞漿素原活化子抑制劑1(PAI-1)、介白素6(IL-6)、介白素8(IL-8)、介白素10(IL-10)、CD105、CD146，或者它們的任何組合。
5. 如請求項1的藥學組成物，其中該prCTB是人類細胞。
6. 如請求項1的藥學組成物，其中該prCTB分泌一細胞激素、一生長因子或者它們的任何組合，或者一攜帶上述的任何者之胞外體。
7. 如請求項1的藥學組成物，其包含有一細胞族群，該細胞族群包含複數個prCTB。
8. 如請求項7的藥學組成物，其中至少10%的細胞族群表現CD16和CD56。
9. 如請求項7的藥學組成物，其中至少2%的細胞族群表現CD4；至少2%的細胞族群表現CD8；至少5%的細胞族群表現CD107。
10. 如請求項7的藥學組成物，其中：至少10%的細胞族群表現CD16和CD56；至少2%的細胞族群表現CD4；至少2%的細胞族群表現CD8；及至少5%的細胞族群表現CD107。
11. 如請求項7的藥學組成物，其中至少2%的細胞族群表現CD16、CD56和CD107。
12. 如請求項7的藥學組成物，其中該prCTB表現胰島素、熱休克蛋白90(HSP90)及p53，以及其中該prCTB缺乏合胞素。
13. 一種經基因工程的、經分離的前驅調節滋胚內層細胞(prCTB)，其中：(i)該prCTB表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、人類白血球抗原G(HLA-G)、CD56、胰島素、熱休克蛋白(HSP90)、CD4、CD16、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(ii)該prCTB表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40- 配位子(sCD40L)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合；以及其中該prCTB缺乏計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)之表現。
14. 如請求項13的prCTB，其包含有一聚核苷酸，其編碼下列的外源性蛋白質：一細胞受體、一免疫學檢查點蛋白、一細胞激素、一T細胞受體(TCR)、一B細胞受體(BCR)、一嵌合抗原受體(CAR)，或者它們的任何組合。
15. 一種前驅調節滋胚內層細胞(prCTB)供應用於製備一用來治療一疾病之醫藥品的用途，其中：(i)該prCTB表現β-激素人類絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、人類白血球抗原G(HLA-G)、CD56、胰島素、熱休克蛋白(HSP90)、CD4、CD16、CD107a、CD8、介白素15(IL-15)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員1(LILRB1)、似白血球免疫球蛋白-受體亞家族B成員2(LILRB2)、T細胞受體(TCR)、似殺手細胞免疫球蛋白-受體2DL4(KIR2DL4)、計畫性死亡配位子-1(PD-L1)、細胞凋亡信號受體(Fas)、Fas配位子(FasL)、CD335(NKp46)、CD11b、CD49f、CD3、CD19、CD34，或者它們的任何組合；以及(ii)該prCTB表現p53、Ki67、麩胺酸去羧酶(GAD65)、熱休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD40-配位子(sCD40L)、B細胞白血病/淋巴瘤2關聯性蛋白 A1(BCL2A1或Bfl-1)、骨髓細胞白血病序列1(Mcl-1)，或者它們的任何組合；以及其中該prCTB缺乏計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)之表現。
16. 如請求項15的用途，其中該醫藥品向下調節一個體中的發炎路徑。
17. 如請求項15的用途，其中該疾病包含有一癌症。
18. 如請求項17的用途，其中該癌症包含一固態腫瘤。
19. 如請求項17的用途，其中該癌症包含有一胰腺癌、一乳腺癌、一肝腫瘤、一卵巢腫瘤、一肺腫瘤、一胃腫瘤、黑色素瘤，或者它們的任何組合。
20. 如請求項15的用途，其中該疾病涉及一病原體。
21. 如請求項15的用途，其中該prCTB誘導癌細胞凋亡。
22. 如請求項21的用途，其中該prCTB本身不會因接觸癌細胞而發生細胞凋亡。
23. 如請求項15的用途，其中該prCTB表現胰島素、熱休克蛋白90及p53，以及其中該prCTB缺乏合胞素之表現。

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